Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности роста ткани, синтеза и выделения берберина в культуре in vitro Thalictrum minus L. (василистника малого)

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Скуратова, Елена Валерьевна, Красноярск

¡j. -/ /

Министерство общего и профессионального образования РФ

КРАСНОЯРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ СИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукописи Скуратова Елена Валерьевна

ОСОБЕННОСТИ РОСТА ТКАНИ, СИНТЕЗА И ВЫДЕЛЕНИЯ БЕРБЕРИНА В КУЛЬТУРЕ IN VITRO THALICTRUMMINUS L.

(ВАСИЛИСТНИКА МАЛОГО)

03.00.12 - Физиология растений Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Гольд В.М.

доктор химических наук, профессор Репях С.М.

~ U л-

Красноярск 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение......................................................................................................................4

Глава 1. Культура клеток и тканей растений как источник биологически активных веществ.........................................................................................................................9

1.1 Культуры клеток и тканей растений в решении задач физиологии растений и биотехнологии............................................................................9

1.2 Получение изолированных культур клеток in vitro....................................11

1.3 Питание клеток in vitro..................................................................................13

1.3.1. Минеральное питание.....................................................................13

1.3.2. Углеводное питание........................................................................14

1.3.3. Витамины.........................................................................................14

1.3.4. Регуляторы роста.............................................................................15

1.4 Способы культивирования..............................................................................17

1.4.1. Поверхностное культивирование...................................................17

1.4.2. Глубинное культивирование...........................................................18

1.4.3. Иммобилизованные клетки.............................................................21

1.5 Получение вторичных метаболитов в культуре in vitro..............................28

1.5.1 Особенности и функциональное значение вторичного метаболизма in vivo и in vitro.........................................................................28

1.5.2 Проблема регуляции вторичного синтеза в культуре in vitro.......33

1.6 Образование и метаболизм берберина и протобербериновых алкалоидов.45

1.7 Перспективные методы культивирования клеток растений для получения берберина и протобербериновых адкалоидов.........................................................50

Глава 2. Объект и методы исследования......................................................................53

2.1 Объект исследования..........................................................................................53

2.2 Методы исследования........................................................................................55

2.2.1. Получение исходного материала для каллусогенеза..................55

2.2.2. Получение и субкультивирование каллусной культуры............56

2.2.3. Получение суспензионной культуры............................................58

ределение показателей роста культуры..................................(

ределение жизнеспособности культуры.................................(

ределение берберина в процессе культивирования...............i

леток Thalictrum minus L. как перспективный источг

......................................................................................................(

ультуру in vitro Thalictrum minus L..........................................

2 влияния разных концентраций регуляторов роста

теза берберина в каллусной ткани Thalictrum minus L..........

уляторы роста и накопление биомассы.................................'

Список литературы Приложение............

121 123 137

Введение

Растительная клетка - уникальный источник ценных биологически активных веществ разной химической природы, которые обладают не только широким спектром лечебного действия, но и применяются в парфюмерии, пищевой промышленности, сельском хозяйстве. Химические аналоги данных веществ, как правило, содержат сопутствующие примеси, проявляющие негативное действие на организм человека и животных. Кроме того, многие специфические биологически активные вещества, такие как алкалоиды, являются продуктами отдаленного синтеза у растений и их искусственное получение затруднено в связи с многостадийностью процесса, низким выходом основного продукта и его дороговизной [1,11].

В настоящее время актуальным является поиск альтернативных источников и разработка методов получения биологически активных веществ растительного происхождения, по эффективности сопоставимых или превосходящих использование традиционного сырья. Одним из таких методов является культура клеток и тканей растений in vitro. Культивируемые клетки высших растений способны синтезировать традиционно используемые продукты растительного происхождения, создавать принципиально новые вещества, биотрансфор-мировать дешевые предшественники в ценный продукт. Преимуществами данного метода является возможность получения продукта независимо от внешних климатических, почвенных условий, круглогодично и сохраняя при этом естественные ареалы ценных лекарственных растений [5,6,13].

Основной проблемой метода культуры тканей и клеток высших растений в аспекте получения ценных вторичных метаболитов является низкий конечный выход продукта. Это обусловлено тем, что в условиях in vitro клетки выходят из-под организменного контроля, присущего целому растению, и образуют специфическую биологическую систему с иной, чем в целом организме "сверхзадачей". Актуальным при использовании культур тканей и клеток выс-

ших растений с целью получения ценных вторичных веществ является поиск условий, при которых обеспечивался бы оптимальный рост и оптимальное содержание вторичных веществ в биомассе. Основными факторами, регулирующими эти процессы в культуре in vitro, являются искусственные регуляторы роста и способы культивирования тканей и клеток.

Роль искусственных регуляторов роста в процессах деления клеток in vitro изучена достаточно глубоко. Однако, существенное влияние на выбор вида регулятора, его концентрации оказывает видовая принадлежность, генотип, а также эпигенетические факторы [19]. Поэтому подход к каждой конкретной культуре остается эмпирическим. Данные по влиянию регуляторов роста на процессы вторичного синтеза в разных культурах весьма противоречивы. Этот вопрос требует дальнейшего серьезного изучения [32].

Применение того или иного способа культивирования существенным образом определяет как скорость роста биомассы так и интенсивность биосинтетических процессов. Традиционные методы культивирования (поверхностное и глубинное) имеют ряд существенных недостатков. В связи с этим актуальным является разработка высокоэффективного способа получения вторичных метаболитов. Иммобилизация клеток на инертный носитель и создание клеточных линий, выделяющих экзометаболиты является перспективным подходом для биотехнологического использования культур высших растений. Экзометабо-лизм - достаточно редкое явление в условиях in vitro. В большинстве случаев требуется специальная химическая обработка клеток для индукции освобождения продукта. Проблема экзометаболизма (выделение клетками продуктов метаболизма во внешнюю среду) остается мало изученной как с точки зрения физиологии и экологии растений, так и с точки зрения возможности регуляции процесса экзометаболизма с целью повышения эффективности биотехнологических производств.

В связи с этим большой интерес представляет Thalictrum minus L. (василистник малый), так как клетки этого растения в культуре in vitro способ-

ны выделять продукт вторичного метаболизма, алкалоид берберин в среду культивирования. Берберин представляет интерес как источник новых противоопухолевых препаратов, созданных на основе его химической модификации. Культура Thalictrum minus L. как перспективный объект биотехнологии привлекает внимание как российских, так и зарубежных исследователей [66,115]. Однако актуальным остается дальнейшая разработка таких направлений как регуляция биосинтеза берберина, регуляция и изучение механизмов выделения этого алкалоида в среду, а также получение высокопродуктивных и стабильных клеточных культур и оптимизация условий их культивирования.

Теоретическим основанием работы явились положения об определяющей роли эпигенетических факторов в регулировании вторичных процессов в растительной клетке, разработанные A.M. Носовым [52], Н.И. Запрометовым [32], Г.Б. Бузук [4], В.В. Рощиной [59], а также современные представления о методах культивирования растительных клеток in vitro.

Целью данного исследования являлось - выделение перспективной культуры клеток и тканей растения, способной к экзометаболизму биологически активных веществ, изучение особенностей роста культуры, синтеза и выделения экзометаболитов в зависимости от регуляторов роста и способов культивирования.

В задачи настоящего исследования входило:

1. Получить высокопродуктивную каллу сную культуру Thalictrum minus L. Исследовать влияние регуляторов роста на процессы накопления биомассы, синтеза и выделения берберина в каллусной ткани.

2. Провести сравнительный анализ способов культивирования (поверхностного и глубинного) на процессы накопления биомассы, синтеза и выделения берберина. Исследовать особенности процесса иммобилизации клеток Thalictrum minus L на кубики пенополиуретана.

3. Исследовать возможность двустадийного культивирования со сменой "ростовой" и "продукционной" сред при суспензионном культивировании и с иммобилизацией клеток на кубики пенополиуретана.

4. Исследовать влияние параметров иммобилизации (масса кубиков, плотность инокуляции) на процессы выделения берберина в условиях "продукционной" среды.

Научная новизна исследования:

Культура Thalictrum minus L. является интересным объектом для исследователей в силу способности выделять алкалоид берберин во внешнюю среду. Впервые изучено влияние разных соотношений искусственных регуляторов роста и способов культивирования на процессы перераспределения берберина между клетками и средой, а также на процессы накопления берберина в тканях и клеточный рост в культуре Thalictrum minus L. Выдвинута гипотеза о физиологической и экологической обусловленности процесса экзометаболизма в культурах тканей клеток высших растений на примере культуры Thalictrum minus L.

Впервые изучен процесс иммобилизации клеток Thalictrum minus L. на

кубики пенополиуретана с точки зрения кинетики роста иммобилизованных

#

клеток, изучены особенности роста клеток и выделения берберина при культивировании иммобилизованных клеток в две стадии со сменой сред, исследовано влияние параметров иммобилизации (масса частиц, плотность инокуляции) на процессы выделения берберина в условиях "продукционной" среды.

Научно-практическая значимость исследования:

Полученные результаты имеют как теоретическое значение, расширяя наши представления о регуляции процессов вторичного метаболизма и особенно экзометаболизма в культурах тканей и клеток высших растений, так и огромное практическое значение с точки зрения биотехнологического производства берберина. Из дикорастущего растения была получена каллусная культура Thalictrum minus L., способная синтезировать берберин и выделять его в среду

культивирования. Разработан процесс иммобилизации клеток суспензионной культуры на кубики пенополиуретана и культивирования иммобилизованных клеток со сменой сред. Применение полученных результатов в биотехнологии позволит существенно повысить конечный выход берберина за счет его выделения в среду и многократного использования биомассы.

Положения выносимые на защиту:

Определяющим условием как для роста каллусной ткани Thalictrum minus L., так и для синтеза берберина является присутствие в среде регуляторов роста ауксинового типа - 2,4-Д и НУК. Применение 2,4-Д эффективно для роста ткани, НУК - для активизации синтеза берберина. Кроме того, НУК оказывает влияние на перераспределение последнего между тканью и средой.

Культивирование клеток Thalictrum minus L. в суспензионной культуре является основным условием, обеспечивающим перераспределение берберина между клетками и средой преимущественно в сторону экзометаболизма алкалоида.

Иммобилизация клеток Thalictrum minus L. на кубики пенополиуретана позволяет повысить выход берберина и создает предпосылки для многократного использования биомассы.

Разделение процессов роста и синтеза при культивировании Thalictrum minus L. в две стадии позволяет более эффективно получать берберин за счет большой скорости роста культуры на "ростовой" стадии и стимуляции биосинтеза алкалоида - на "продукционной".

ГЛАВА 1. КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ КАК ИСТОЧНИК БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

1.1 Культуры клеток и тканей растений в решении задач физиологии растений и биотехнологии

Культуры изолированных тканей и клеток растений - относительно молодая и активно развивающаяся сфера исследований, существующая на стыке нескольких областей знаний: физиологии растений, микробиологии и биотехнологии. Клеточные культуры растений могут рассматриваться как микрообъекты, что позволяет применять аппаратуру, методы поддержания стерильности и логику экспериментов, принятых для микроорганизмов. Но в то же время клеточные культуры высших растений сохраняют генетический потенциал и обладают тотипотентностью, что делает их удобной моделью для физиологии и биохимии растений, генетики и молекулярной биологии [9].

Культуры клеток растений широко применяются в физиологии растений как модели для изучения процессов, происходящих в организме растения. Их преимуществами являются: возможность строгого контроля за условиями выращивания, исключение влияния на изучаемые процессы микроорганизмов, доступность экспериментального материала круглый год, возможность использования меченых органических соединений для изучения их метаболизации тканями и клетками [10]. В качестве примеров такого использования культур клеток растений можно привести изучение углеводного метаболизма, изучение устойчивости растений к неблагоприятных факторам, к патогенам, изучение механизма действия фитогормонов, моделирование процессов морфогенеза [9,10].

Культуры клеток и тканей высших растений имеют также большое практическое значение. Поскольку растительная клетка обладает тотипотентностью, то есть способностью реализовать свой генетический потенциал разви-

тия, из одной клетки можно регенерировать целое растение. Это означает расширение возможности для селекции и размножения растений. Еще одним направлением биотехнологии на основе культур растительных клеток является их использование с целью получения биологически активных веществ [21,96].

Традиционно БАВ растений получают на основе использования природного сырья. Из сотен тысяч лекарственных средств, применяемых в мировой медицинской практике, лечебные препараты из растений составляют свыше 30 % [46]. Препараты из растений по сравнению с синтетическими лекарствами имеют ряд преимуществ. Будучи сложными по составу, они содержат много ингредиентов, которые придают им ценные свойства и обеспечивают многостороннее действие на организм, более сильное, чем действие каждого в отдельности. Кроме того, препараты растительного происхождения, обладающие стойким терапевтическим эффектом, как правило малотоксичны и редко оказывают побочное действие [97]. В связи с этим актуальным является поиск альтернативных источников растительного сырья, поскольку природные запасы сырья катастрофически сокращаются, исчезают виды редких лекарственных растений. При этом следует принять во внимание сложность перевода дикорастущих растений на полевое выращивание.

Основанием для использования культивируемых клеток высших растений в биотехнологии является их способность а) синтезировать традиционно используемые продукты растительного происхождения; б) создавать принципиально новые продукты, превосходящие традиционные или открывающие новые области применения; в) биотрансформировать дешевые предшественники в конечный ценный продукт [1,11,12]. Преимуществами клеточных культур по сравнению с традиционным растительным сырьем (дикорастущие или выращиваемые на плантациях растения) являются: 1) возможность получения продукта независимо от климата (привлечение клеток тропических растений), сезона, погоды, почвенных условий; 2) оптимизация и стандартизация условий выращивания; 3) перспективы полной автоматизации и компьютеризации про-

цессов. 4) Культивирование изолированных протопластов растений открывает возможности для генной и клеточной инженерии, направленных на создание новых растительных организмов с заданными свойствами. Возможны ассоциации растительных клеток с микроорганизмами [14,20].

1.2. Получение изолированных культур клеток in vitro

Каллусообразование — это результат дедифференциации клеток, их последующего активного деления и неорганизованного роста, возникающее в природе при ранениях. Каллусы могут образовывать не только активно растущие меристематические клетки, но также и клетки паренхимы листьев, стеблей, флоэмы корнеплода, лепестков и трихом цветка, эндосперма и пыльцы. Способность к каллусообразованию у многих видов растений, прежде всего двудольных, это реакция на травму, которая на�