Биотехнологические основы производства и переработки маточного молочка

Сокольский, Сергей Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Биотехнологические основы производства и переработки маточного молочка
ВАК РФ 06.02.04, Частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические основы производства и переработки маточного молочка"

На прайса рукописи

РГВ ОД

1 0 Май Ш

СОКОЛЬСКИЙ Сергей Сергеевич

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПРОИЗВОДСТВА И ПЕРЕРАБОТКИ МАТОЧНОГО МОЛОЧКА

06.02.04 - частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственых наук

Дивово Рязанской области - 2000

Работа выполнена в ОПППХ «Краснополянское» НИИ пчеловодства РАСХН и на кафедре физиологии и биохимии человека и животных Нижегородского г ~ударственного университета им. Н.И. Лобачевского.

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Крылов В.Н.

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук, проф. Р.Б.Козин доктор с.-х. наук Н.Н.Гранкин доктор биол.нрроф. Л.Г.Каширина

Ведущая организация - Московская с.-х. академия им. К.А.Тимирязева

Защита состоится « 23 » мая 2000 г. на заседании диссертационного совета Д 020.55.01 в Всероссийском Научно-исследовательском институте коневодства (ВНИИК) Адрес института: 391105, Рязанская обл., Рыбновский район, пос.Дивово, ВНИИ коневодства

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского Научно-исследовательского института коневодства.

Диссертация в виде научного доклада разослана 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

М.М.Готлиб

/7 1)9^^6,0

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Пчеловодство, как отрасль народного хозяйства России, имеет важное значение в обеспечении населения ценными продуктами питания, эффективными пищевыми добавками и лекарственными средствами, изготавливаемыми из пчелопродуктов. Однако перечень отечественных препаратов весьма скуден и составляет единицы наименований. Между тем в мире сегодня имеются сотни наименований лекарственных средств и пищевых добавок из пчелопродуктов, успешно использующихся для оздоровления, профилактики и лечения многих заболеваний человека. Мы объясняем такое отставание неразвитостью промышленных технологий получения и переработки ряда продуктов пчеловодства. Особенно это относится к получению пчелиного маточного молочка. Пчелиное маточ'ное молочко - секрет глоточных и мандибулярных желез рабочих пчел, выделяющийся ими для кормления личинок и матки - является уникальным продуктом пчеловодства. Обладая высокой и одновременно сбалансированной концентрацией органических и минеральных компонентов, необходимой для форсированного выкармливания расплода и функциональной активности матки, маточное молочко пчел находит все большее применение в диетологии и терапии организма человека (Вахонина,1992; Dustmann, 1995; и др.). Высокая физиологическая активность этого пче-лопродукта обусловила его массовое производство за рубежом. Так, по данным Билаша и Кривцова (1998), Wen-Cheng (1989) и др., Китай ежегодно производит более 1000 тонн, а Япония импортирует не менее 500 тонн маточного молочка в год как сырья для нужд пищевой, фармацевтической и. косметической промышленности. Из материалов последних съездов Апимондии видно, что многие страны Европы и Америки все больше внимания уделяют промышленному получению на пасеках маточного молочка.

В отличие от этого, в России получением маточного молочка до сих пор занимаются, в основном, пчеловоды-любители. Единственной крупной производственной базой, традиционно занимающейся получением молочка пчел в промышленных количествах, является опытно-производственное племенное пчелоразведенческое хозяйство (ОПППХ) "Краснополянское" (г.Сочи) - структурное подразделение НИИ пчеловодства РАСХН. Основной производственной направленностью ОПППХ является разведение плодных племенных маток и пчелосемей с устойчивыми продуктивными признаками. Вместе с тем, хозяйство, располагая 60 стационарными пасеками, способно производить дополнительно ряд продуктов пчеловодства. В настоящее время, с целью стабилизации и роста финансовой и производственной частей хозяйственного механизма, оперативного внедрения в народное хозяйство новых видов продукции, с учетом новых рыночных условий, нами разрабатывается

комплекс прогрессивных технологий получения и переработки продуктов пчеловодства. Ведущий акцент в этом плане делается на промышленное производство маточного молочка пчел и его переработку, для удовлетворения нужд населения страны в ценном природном продукте.

Основной проблемой при получении -маточного молочка на промышленных пасеках является выбор оптимальных методов стимулирования пчелосемей к кормлению искусственно прививаемых в маточники личинок и вопросы, связанные с технологией этого процесса. Несмотря на большие объемы производства молочка за рубежом, данная проблема отражена в литературе весьма скудно. При этом имеющиеся данные часто противоречивы и не отражают технологию получения молочка в крупных хозяйствах.

Другой важный вопрос технологии заключается в сохранении на-тивных свойств молочка и оценка его качества. Необходимо учесть, что, по сравнению с другими продуктами пчеловодства, маточное молочко является наиболее лабильным продуктом. Существующие методы сохранения биологической активности молочка, в том числе и имеющиеся рекомендации НИИ пчеловодства РФ , весьма трудоемки и не всегда выполнимы в условиях промышленных пасек.

Еще одной проблемой при обосновании промышленной технологии получения маточного молочка является его переработка и изготовление готовых к употреблению биологически активных препаратов на его основе. Выпускающиеся сегодня в России таблетки с маточным молочком Апилак и диетические продукты Апитонус и Апиток (2% смесь молочка с медом) представляют весь перечень зарегистрированных препаратов. Несомненно, расширение этого списка позволит более эффективно насыщать потребительский рынок уникальным продуктом пчеловодства.

Цель и задачи работы. В работе ставилось целью обоснование и разработка биотехнологических основ производства маточного молочка пчел на промышленных пасеках, его переработки как сырья для пищевой и медицинской промышленности. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Оптимизация способов формирования семей-воспитательниц при промышленном получении маточного молочка;

2. Разработка условий и способов переработки маточного молочка как сырья для пищевой и медицинской промышленности;

3. Разработка методов анализа качества маточного молочка и его препаратов;

4. Разработка новых препаратов на основе маточного молочка и изучение их биологической активности.

Научная новизна. Впервые научно обоснована и разработана технология получения пчелиного маточного молочка в условиях крупных пчеловодческих хозяйств. Установлено, что оптимизированный метод "неполного осиротения" пчелиной семьи , заключающийся в изоляции матки в семье-воспитательнице, является наиболее продуктивным и технологичным. Показано, что получаемое по названной технологии молочко удовлетворяет требованиям ГОСТ и содержит все основные компоненты. Впервые сочетанием методов ГЖХ и масс-спектрометрии в маточном молочке обнаружен ряд жирных кислот, не описанных ранее. Доказана возможность хранения и переработки полученного продукта при плюсовых температурах в течение года без потери биологической активности по отношению к млекопитающим и человеку. Показано, что такое молочко сохраняет основные физико-химические и физиологические свойства - свойства пептидов и окси-деценовых кислот и влияет на скорость перекисного окисления лилидов миокарда крыс. Разработаны новые методы анализа качества маточного молочка и препаратов на его основе. Предложены экспресс-методы стандартизации молочка методами тонкослойной хроматографии и фотометрии. Разработаны и изготовлены новые биологически активные препараты на основе маточного молочка и изучена их биологическая активность. Подана заявка на получение патента «Ингаляционное средство Апингалин», разработаны и утверждены ТУ-9358-014-40301533-99, получено регистрационное удостоверение №001226.Р.643.10.99 на пищевую добавку «Апитал».

Практическая значимость. Обоснована и разработана оптимизированная технология получения маточного молочка пчел на промышленных пасеках, позволяющая производить ценный продукт в необходимых количествах для нужд пищевой и медицинской промышленности без ущерба при производстве других продуктов пчеловодства и осуществлении селекционно племенной работы. Проведенные исследования позволяют применять способы "неполного осиротения" семей-воспитательниц в условиях крупных пчеловодческих хозяйств с высокой рентабельностью. Предложенные условия хранения, переработки и анализа получаемого продукта обеспечивают возможность производства и переработки массовых количеств молочка в полевых условиях без потери его биологической активности. Разработанные биологически активные препараты позволяют расширить список применяемых в народном хозяйстве пищевых добавок и лекарств на основе пчелиного маточного молочка - ценного природного продукта.

Полученные данные использованы в опубликованных практических рекомендациях по получению, хранению и оценке качества маточного молочка на промышленых пасеках. Внедрена в промышленное производство новая пищевая добавка с маточным молочком «Апитал»

(ТУ 9358-014-40301533-99). Монография «Маточное молочко пчел» удостоена золотой медали лауреата ВВЦ в 2000 г.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на 2-й - 6-й) конференциях по апитерапии ( 1974 - 1999), Международном симпозиуме по разведению пчел (Хорватия,1995), 34-м, 35 и 36 Международных Конгрессах по пчеловодству (Лозанна, 1995, Антверпен, 1997, Ванкувер, 1999), а также заседаниях кафедры физиологии и биохимии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского и в НИИ пчеловодства.

Публикация результатов исследований. Основные положения диссертации опубликованы в монографиях" Обоснование технологии получения маточного молочка на промышленных пасеках и изготовление биологически активных препаратов на его основе" (1995), «Маточное молочко пчел: свойства, получение, применение» (2000), «Технология получения продуктов пчеловодства» (2000), в практических рекомендациях "Технология получения и анализа маточного молочка пчел" (1998), а также в информационных листках, тематических журналах, материалах международных съездов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Краткий обзор литературы.

При анализе литературных данных (Брайнес, 1958; Вахонина, 1992; Rembold, 1965; Tseng Chin-yin et al.; и др.), с учетом региональных и возрастных колебаний состава, различия методов анализа, - в натив-ном молочке пчел содержится 60-70% воды, соответственно , 30-40% сухого остатка, в котором основная часть приходится на белки (10-52%), углеводы (12-30%) и липиды (5-12%). Кроме того, в значительном количестве содержатся свободные органические и аминокислоты (7-32%), а также минеральные вещества (до 2%) и неидентифицированные компоненты (до 16%).

Пчелиное маточное молочко в плане его назначения в биологии пчелиной семьи представляет набор пищевых, стимулирующих, управляющих и регулирующих компонентов, которые в сочетании с другими факторами определяют направление развития личинок - морфогенез и кастообразование в пчелиной семье (Кожевников, 1905; Брайнес, 1958; Скиркявичус, 1984; Кривцов, 1994; Ardry, 1956; Rhein, 1956; Beet-sma, 1989; Meng Xian-zuo, 1993). С другой стороны, маточное молочко с успехом применяется человеком в качестве диетического и терапевтического продукта. Учитывая, что физиологические и биохимические процессы в животных организмах принципиально одинаковы, следует полагать, что указанный сбалансированный набор элементов молочка, эволюционно сконструированный для форсированного развития и роста организма пчел, закономерно будет

способствовать проявлению профилактических и терапевтических эффектов при потреблении человеком. Данное утверждение базируется на многочисленных данных, описанных разными авторами, применяющими маточное молочко пчел в качестве лечебного и профилактического средства.

По аналогии с биологическим назначением маточного молочка, как необходимого фактора роста и развития личинок пчел (растущий, развивающийся организм), его давно и с успехом применяют в педиатрии -при назначении больным и ослабленным детям с гипотрофиями, дистрофиями, анемиями, недоношенным и т.д. (Лебедева, 1959; Фатеева, Рошаль, 1960; Судакова, 1962; Цвеер, 1962; Дещекина, Ильяш, 1974; Васильев, 1990; Дмитриева, 1994; Гузюкина с соавт., 1998; МаИатапс! е! а!., 1997). Целесообразность применения маточного молочка как природного анаболика прослеживается при разных формах ослабленности человеческого организма - в результате заболеваний или старости. Из данных литературы следует, что молочко действует как естественный и очень эффективный биостимулятор ( Лудянский, 1994; Резнет, 1956; Саугкин, Узбекова, 1993). Анаболические и энергофорсирующие свойства маточного молочка установлены не только при использовании его больным организмом, но и для повышения работоспособности и выносливости у здоровых людей и спортсменов (Никулин, Лупачев, 1976; Неделька, Головкин, 1990; Рачков с соавт., 1993).

Вместе с общеизвестными данными о неспецифической физиологической активности маточного молочка, вполне объясняющей его полифункциональность при терапии разных заболеваний и состояний, в литературе имеются многочисленные данные об его избирательном действии в отношении определенных органов и систем. Так, подчеркивается высокая терапевтическая эффективность маточного молочка при лечении сердечно-сосудистых заболеваний - гипертонии и гипотонии, стенокардии и атеросклероза и т.д. (Неманова, 1959; Мищенко, 1962; Люсов, 1983; Люсов, Мещеряков, 1994; Окороков с соавт., 1994-1999). Высоко оценивается эффективность молочка при лечении глазных заболеваний (Максименко, 1975; Неделька с соавт, 1990; Рореэси et а!., 1997) заболеваний желудочно-кишечного тракта (Попова, 1960; Мищенко, 1974; Лудянский, 1990; Кудрявцева с соавт., 1993), инфекционнных процессов (Александрова, 1962; Главинская, Курников, 1988,1990; Дмитриева с соавт., 1994; \Л/Шзоп, 1956).

На основании вышеприведенных и других данных литературы следует заключить, что маточное молочко пчел, являясь эволюционно выработанным комплексом физиологически активных веществ, оказывает стимулирующее, общетонизирующее действие, влияя на обменные процессы в органах и тканях человеческого организма. Оно проявляет корригирующий и нормализующий эффекты при патологии

различных органов, стимулирует регенерацию пораженных органов и тканей. В связи с этим маточное молочко может с успехом использоваться как неспецифический биостимулятор в комплексной и монотерапии многих заболеваний - анемий, атеросклероза, бронхиальной астмы, гипертонической болезни, заболеваний центральной и периферической нервной системы, сердца, болезнях глаз, печени, почек, язвенной болезни, эндокринной патологии и ряда других. Очевидно, что получение маточного молочка в промышленных масштабах и изготовление на его основе различных медикаментозных препаратов и пищевых добавок открывает широкие перспективы как для пчеловодства, так и для потребителей - в лице предприятий пищевой, фармацевтической и косметической промышленности.

Между тем технология получения молочка на пасеках, позволяющая производить его в достаточных для народного хозяйства количествах, в нашей стране не разработана. До сих пор она базируется на известных принципах стимулирования закладки маточников и (или) кормления личинок в искусственных маточниках путем изъятия матки из семьи — "полное осиротение" (Буртов, 1974; Таранов, 1987; Кривцов, Лебедеву 993). В то же время за рубежом сегодня практикуются способы частичной изоляции матки - "неполное осиротение", позволяющие получать существенно большие объемы маточного молочка без ущерба для получения других медопродуктов ( Wen-Cheng, 1989; Chen Shi-bi, 1993; и др.). В последнее время ряд отечественных исследователей делает акцент на изучении качества подкормки на выход молочка (Гиниятуллин, Имануилов, 1995; Василенко, 1998; Еремия, Белиогло, 1998; Гуржеев, 1999; Савушкина, 1999), но оставляет без внимания изучение методов формирования семей-воспитательниц.

Кроме того, недостаточно отработана технология оценка качества и стандартизации молочка, а также условия его переработки. При сравнительно достаточной изученности химического состава и физико-химических свойств молочка зарубежными исследователями, в России этому вопросу уделяется мало внимания. Существующие ТУ и ГОСТ на маточное молочко и некоторые его препараты основываются на давних исследованиях Брайнеса (1958,1962,1974), Вахониной (1962,1970) , недостаточно объективны и в то же время трудоемки при стандартизации и сертификации качества получаемого продукта. Это также сдерживает развитие прогрессивных технологий промышленного производства маточного молочка и биологически активных препаратов на его основе.

Из изложенного следует, что весьма скудный перечень отечественных препаратов медицинского и диетического применения с маточным молочком обусловлен недостаточной научной обосно-

ванностью вышеназванных технологических аспектов получения и переработки пчелиного маточного молочка.

Материал и методика. Исследования проводились в 1991 - 2000 гг. на производственной базе ОПППХ "Краснополянское" (г. Сочи), а также на кафедре физиологии и биохимии человека и животных Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского. Отдельные этапы работы выполнены при участии Л.В. Ошевенского (разработка методов анализа молочка), C.B. Горелой и И.Б.Улитина (изучение биологической активности препарата Апингалин), A.A. Николаевой (изучение радиозащитного действия .молочка) - сотрудников и аспирантов ННГУ.

При организации и проведении работы использовали "Основные требования к постановке экспериментов в пчеловодстве" (ВАСХНИЛ,1971). Для исследования оптимизации технологии получения молочка опытные и контрольные группы формировали из 10-20 пчелосемей, подбирая их по принципу семей-аналогов (Лебедев, 1993).

Для определения биологической активности маточного молочка при его хранении использовали образцы молочка, хранившиеся в течение 1 года при температуре +5 С в сравнении с нативным маточным молочком со сроком хранения 1-5 дней. При анализе активности молочка в отношении развития личинок те и другие образцы закладывали в прививочные мисочки с однодневными личинками в разных вариантах - ежедневно или разово - до запечатывания ячеек. Для изучения активности молочка при его воздействии на организм млекопитающих использовали крыс с регистрацией основных физиологических параметров и их математической обработкой общепринятыми методами (Плохинский, 1970; Рокицкий, 1978; и др.).

При разработке методов анализа качества маточного молока были использованы стандартные и модифицированные физико-химические тесты (бумажная и тонкослойная хроматография, газо-жидкостная хроматография, фотоколориметрия и др.) на определенные компоненты исходного сырья с применением соответствующей аппаратуры и реактивов.

При исследовании физиологической активности полученных образцов молочка и разработке новых биологически активных препаратов с маточным молочком руководствовались общепринятыми методиками физиологических исследований и требованиями соответствующих комитетов МЗ РФ, предъявляемых к новым лекарственным средствам и пищевым продуктам и добавкам.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оптимизация способов формирования семей-воспитательниц при промышленном получении маточного молочка.

Основные принципы получения маточного молочка в условиях промышленного производства те же, что и в любительском пчеловодстве, при искусственном выводе маток: пчелиная семья, оставшись без удаленной из нее матки, немедленно приступает к выращиванию новых, молодых маток. Однако стимулирование формирования маточников и интенсивного выкармливания в них личинок маточным молочком в массовых количествах имеет ряд особеностей. Для повышения рентабельности производства маточного молочка на промышленых пасеках необходимо иметь реальный, поэтапный план работы, зависящий от климатических условий, очередности цветения медоносов, периодичности главного взятка, породы пчел и др. Так, нами выявлено, что в условиях Черноморского побережья Кавказа наиболее продуктивной в плане промышпеного получения молочка оказалась серая горная кавказская порода, а не кубанская желтая, как считает Таранов (1974). Так, в сезоне 1995 года нами было установлено, что в среднем от одной семьи горной кавказской породы было получено в мае - 313 г, в июне - 300 г, в июле - 270 г. Наименьший выход в этих условиях оказался в семьях приокской породы: 247, 230, 205 г соответственно. При дальнейших исследованиях нами было показано, что в одинаковых условиях наибольшее количество молочка было получено в семьях помесей серой горной и карпатских пород 1-го и 2-го поколений.

Одним из ключевых моментов технологии является выбор способа формирования семьи-воспитательницы. Нами были рассмотрены и проанализиованы способы, разработанные и применяемые в ОПППХ и предложены их модификации, заключающиеся в следующем.

Способ 1. При получении молочка этим способом пчелосемья лишается матки (полное осиротение). При этом из семьи формируется пакет, который вместе с маткой может поставляться на продажу. В семье остается достаточное количество молодой и летной пчелы, печатного расплода. Сюда, между открытым разновозрастным расплодом помещается прививочная рамка, имеющая 3 планки с 60-90 мисочками, в которых прививаются 12-24 -часовые личинки. Через 3 дня из мисочек отбирается молочко, после чего процесс повторяют до 5 раз, но не более, чтобы не допустить отрутовения семьи. На протяжении всего периода, при изъятии из улья прививочных рамок

необходимо производить осмотр всего гнезда семьи-воспитательницы и своевременно удалять отстроенные свищевые маточники. После последней прививки и окончания работы по получению молочка было выявлено, что пчелиная семья начинает быстро развиваться. Этому обычно способствует обильный медосбор (май-июнь). К зимовке из 2 кг пчел, оставшихся после последней прививки, семья увеличивается до 3,5 кг и дает дополнительно 10-15 кг товарного меда. В таком модифицированном способе важно отслеживать количество печатного расплода в семье-воспитательнице: в июне-июле его должно быть не менее 5-6 рамок, в августе - 4 рамок.

Способ 2. С весны наращиваются сильные семьи. Далее от них отбирают маток с открытым расплодом на 2-3 рамках и формируют отводок (карман). В оставшуюся семью, где сохранено много расплода и разновозрастных пчел, ставят поочередно между рамок с открытым расплодом прививочные рамки с личинками. После последней (4-й прививки) сюда переносят матку из кармана, а в кармане приступают к постановке прививочных рамок. Важно отметить, что при обильном взятке, необходимом при данном способе, пчелы хорошо принимали ранее отсаженную матку обратно. Таким образом, данный способ позволяет получать молочко в течение всего сезона. При этом, в семьи-воспитательницы можно ставить одновременно до 90 мисочек с привитыми личинками.

Способ 3. Этот способ зарекомендовал себя как наиболее эффективный в условиях неустойчивой медово-кормовой базы. Разработанный нами и в течение ряда лет применяемый в ОПППХ "Краснополянское", способ предполагает "неполное осиротение" пчелиной семьи и заключается в том, что, в отличие от вышеописанных способов, матка не изолируется полностью от семьи. Для этого семью делят пополам, матку отсаживают за диафрагму, в которую вмонтирован блок ганимановской решетки площадью в 16 ячеек. Указанная площадь и ее расположение (внизу диафрагмы) подобраны нами экспериментально и создают физиологические условия имитации неполного осиро-тения. В отсеке с маткой формируют рамки, сверху ставят две кормушки - как для семьи воспитательницы, так и для маточного отделения. При хорошем взятке открыты оба летка, а при поддерживающем взятке, в маточном отсеке леток закрывают. В отделенную семью-воспитательницу последовательно ставят прививочные рамки. При этом, по мере выхода молодой пчелы, печатный и открытый расплод берут из маточного отсека, пополняя семью-воспитательницу в течение всего периода получения молочка. Поэтому, как силу семей-воспитательниц, так и разновозрастный состав пчел необходимо поддерживать, систематически переставляя в семью-воспитательницу рамки с печатным и открытым расплодом. При указанном способе с каждой прививочной рамки, на которой прикреплено 60-90 мисочек,

в течение сезонов 1993-1995 получали 12-15 г маточного молочка. В среднем, за один отбор с 50 прививочных рамок было получено 600-750 г нативного продукта. При сопоставлении с другими способами было выявлено, что указанный способ неполного осиротения является наиболее продуктивным (табл.1). Кроме того, уход за семьями-воспитательницами при данном способе оказался менее трудоемким, чем при других.

Способ удачен еще и тем, что к окончанию сезона можно с минимальными затратами получать из одной две семьи. Для этого необходимо закрыть окно перфорации в диафрагме и подсадить матку в семью-воспитательницу.

Таблица 1

Производство маточного молочка при разных способах _формирования семей-воспитательниц_

Спосо б Число семей Число привитых личинок (%) Количество маточного молочка (мг/мис)

1 12 80+5 170+20

2 16 82+6 185+15

3 10 88+5 190+20

4 12 95+8 210+30

Способ 4. Так же, как и предыдущий - способ неполного осиротения, но отличающийся тем, что матка из семьи отсаживается в однора-мочный изолятор, куда помещается одна соторамка. Изолятор ставится посередине гнезда сформированной для получения молочка семьи. К преимуществам этого способа относится удобство прививки на прививочные рамки одновозрастных личинок, получаемых из яиц, засеянных маткой в изоляторе. В семьях-воспитательницах в таком случае осматриваются оба отделения - для уничтожения свищевых маточников. Как один из вариантов данных способов неполного осиротения, нами предложено отсаживать маток не в карман или изолятор, а в пересылочную клеточку, которую прикрепляли к медовой рамке за диафрагму. В этом случае очевидно "простаивание" матки, которая не сеет яйца, но также очевиден и выигрыш во времени, связанный с перестановкой и переноской рамок, формированием карманов и т.д. в условиях крупной пасеки.

Обсуждая физиологические механизмы эффекта неполного осиротения, при котором пчелы также эффективно выкармливают личинок в мисочках, можно предположить, что матку "чувствуют" только часть пчел - видимо, это летные пчелы, т.к. именно они прони-

кают сквозь участок диафрагмы, выполненный ганимановской решеткой, и участвуют в полноценной жизнедеятельности пчелиной семьи. Основная же часть пчел в этих условиях - пчелы-воспитательницы в том числе, не воспринимают эффекта присутствия матки за перфорированной диафрагмой и интенсифицируют выкармливание личинок на прививочных рамках. Следует полагать, что различия чувствительности органов чувств летных и молодых пчел связаны с возрастными и функциональными изменениями организма пчел.

При рассматривании преимуществ того или иного способа формирования семей-воспитательниц на промышленных пасеках необходимо оценивать все компоненты технологии пчеловодства, учитывая, что производство маточного молочка не должно уменьшать или ухудшать производство других пчеловодческих продуктов. Поэтому, при реализации выбранного способа необходимо руководствоваться не только его эффективностью в плане получаемого объема маточного молочка, но и имеющихся условий материально-технической базы хозяйства, кормовой базы, резерва времени, периодов главного медосбора и т.д.

Одним из существенных моментов технологии получения молочка, независимо от выбранного способа, является выбор оптимального интервала времени между прививкой личинок и отбором молочка из маточника. На основании проведенных исследований нами установлено, что наиболее рентабельный интервал времени составил 72-75 часов после прививки 12-24 -часовых личинок. Так, если через 1 сутки количество молочка в мисочке составило 35+5 мг, через 2 суток - 90+9 мг, то через 3 суток - 260+15 мг. В дальнейшем прирост молочка становится относительно меньшим в сравнении с приростом массы личинки. Укажем, что, в отличие от любительских пасек, для промышленного производства молочка прививка конкретно 12-часовых, или 24-часовых личинок менее рентабельна, чем прививка всего спектра: от 12 до 24-часовых личинок.

2. Хранение и переработка маточного молочка

Отбор маточного молочка из мисочек-маточников производится в том же помещении, , где прививались личинки. В соответствии с существующим ГОСТом на маточное молочко (ГОСТ 28888-90), помещение по его переработке должно удовлетворять основным санитарно-экологическим нормам, применяемым для изготовления лекарственных веществ - продезинфицированным, с соответствующей влажностью и температурой. Весьма важной является проблема сохранения биологической активности полученного маточного молочка. Дело в том, что по условиям названного ГОСТа хранение и транспортирование молочка должно осуществляться в интервале минусовых температур -

(от минус 6 до минус 10 С). В ряде случаев это создает значительные трудности, особенно в условиях неэлектрифицированных пасек. Кроме того, неоднократные процедуры замораживания и размораживания, неотъемлемые в этом случае в условиях летнего сезона при транспортировке молочка с пасек до приемных пунктов, снижают исходную биологическую активность полученного продукта. В связи с этим, а также учитывая данные мировой практики, где рекомендации по хранению более реальны (от 0 до+6 С), мы провели специальные исследования по выяснению этого вопроса. Для анализа биологической активности мы использовали основной метод, рекомендованный ГОСТом - определение количества выживших личинок и их массу после выкармливания маточным молочком, хранившимся при температуре +6°С 3 месяца, 1 год и нативного - свежеполученного.

В опытах было установлено, что прививка личинок на каплю такого молочка, так же как и добавление его по 50-100 мг в мисочки перед их запечатыванием приводили к высокому проценту привитых личинок, росту их массы и нормального окукливания после запечатывания мисочек и выхода жизнеспособных маток во всех трех сериях. При этом разность результатов между опытными и контрольными группами (свежеполученное маточное молочко) была недостоверна (Р>0,05). На основании полученных результатов можно заключить, что хранение маточного молочка в течение года при температуре + 6°С не привело к инактивации его биологической активности , оцениваемой по тестам роста и развития личинок.

При продолжении сравнительных исследований оценки биологической активности свежеполученного маточного молочка и продукта после годичного хранения при плюс 6°С нами был модифицирован способ, рекомендуемый ГОСТом. В нашей модификации функцию термостата выполнял пчелиный улей с рабочей пчелосемьей, где естественно и жестко стабилизированы необходимые влажность и температура. Вместо разборного лабораторного оборудования (чашки Петри, крышки, мисочки и др.) мы использовали серийно выпускаемые планшеты для иммунологических реакций однократного применения (ТУ 64-2-278-79). Указанный планшет имеет жесткий каркас из прозрачной пластмассы с вмонтированными в него ячейками, по глубине и диаметру близкими к трутневым ячейкам. Ячейка может вместить до 300 мг маточного молочка, т.е. столько, сколько требуется по ГОСТ суммарно для выкармливания личинок в течение 6 дней. Шкала из букв и цифр планшета, обозначающая каждую ячейку, создает дополнительные удобства для анализа выращиваемых личинок, а его прозрачность позволяет проводить инструментальный анализ процес-

са выращивания личинок без изъятия их из ячеек (микроскопия, иммунологический, биохимический и др. анализы)

Перед испытанием в ячейки наливается (шприцем с насадкой) исследуемое молочко, после чего на него прививаются однодневные личинки. Планшет закрывают собственной крышкой и помещают в улей на рамки гнезда под холстик. В зависимости от цели исследований, такой планшет можно вынуть из улья для анализа в любое время суток. Нами предложено оценивать биологическую активность маточного молочка как по выживаемости, так и по приросту массы личинки через 3 дня, по аналогии с технологией получения маточного молочка от трехдневных личинок. За этот период накапливается информация, достаточная для суждения о качестве и свойствах исследуемого маточного молочка, личинки закономерно прибавляют в массе, потребляя одноразово данный корм. Таким образом, не требуется ежедневного кормления личинок с их неотъемлемым травмированием.

В названных условиях было установлено, что при выращивании личинок, как на свежеполученном маточном молочке, так и на молочке после его годичного хранения , через 3 суток все личинки были живы. Их масса составила 120-150 мг без существенных различий между группами.

На основании полученных результатов нами был сделан вывод о возможности хранения и транспортирования маточного молочка при плюсовых температурах (до +6 С) без существенной потери его биологической активности в течение 1 года. Это во многом упрощает технологию промышленного получения и переработки маточного молочка при изготовлении лекарственных, диетических и косметических продуктов.

Для доказательства вышевысказанного утверждения нами были проведены сравнительные эксперименты на животных, которым скармливалось молочко после 2-х годичного хранения при плюсовых температурах и молочко, хранившееся 1 год по ГОСТу - при минусовых температурах. При этом важно отметить, что в данных экспериментах был получен ответ на возможность достижения цели, ради которой и производится маточное молочко - может ли такое молочко иметь пищевую и терапевтическую ценность для человека. Дело в том, что вышерассмот-ренный, рекомендованный ГОСТом, тест выращивания личинок пчел не полностью отражает его ценность для человека, с его метаболизмом, отличающимся от метаболизма личинок. Отсюда, вероятны случаи, когда, забракованный по данному тесту, препарат молочка может быть эффективным для терапии или профилактики тех или иных заболеваний, тем более для пищевых добавок. Поэтому более важными могут быть тесты определения активности на теплокровных животных, еще важнее - на моделях определенной патологии.

Нами изучена возможность оценки физиологической активности маточного молочка на общепринятой в патофизиологии модели одного из распространенных и грозных заболеваний сердца - миокардите, вызываемом у крыс инъекцией токсической дозы адреналина- • гидрохлорида. При этом мы оценивали наиболее важный показатель переживаемое™ клеток миокарда - перекисное окисление липидов (ПОЛ), резко активирующееся при их ишемии, вызванной миокардитом. Опыты были проведаны на 4 группах животных, из которых 1-я была интактной, 2-я - контрольная, 3 и 4 - опытные группы, которым внутри-желудочно через рот ежедневно, через 1 сутки после введения 0,6 мл адреналина (максимальное развитие миокардита), вводился раствор маточного молочка 1995 и 1994 года сбора. Укажем, что молочко 1995 года хранилось до опытов при температуре минус 6°С, тогда как молочко 1994 года сбора - при + 5° С.

Таблица 2

Концентрация МДА (нМоль/г ткани) в сердце крыс при лечении адреналинового миокардита пчелиным маточным молочком (доза 10

мг/кг)

_сбора 1994 (А) и 1995 (Б) гг._

Стат. показатель Интактные Контроль А Б

м . 1,94 4,21 1,48 1,65

+ т 0,26 0,78 0,33 0,23

п 6 14 7 6

Р <0,05 <0,05 <0,05

В опытах было установлено, что введение токсичных доз адреналина животным контрольной группы приводило к значительному увеличению интенсивности ПОЛ в миокарде, что сопровождалось повышением концентрации малонового диальдегида (МДА) - по сравнению с миокардом крыс интактной группы - в 1,9 раза. Содержание МДА в сердечной мышце крыс, прошедших курс терапии пчелиным маточным молочком, снизилось, по сравнению с концентрацией МДА в сердце контрольных животных, в 2,4 раза. При этом не было обнаружено существенных различий (Р>0,05) между показателями для опытных групп животных, получавших маточное молочко разных условий хранения (Табл. 2)

Из приведенных результатов следует, что применение маточного молочка на фоне повышенного уровня ПОЛ в ишемизированном

миокарде существенно снижает его уровень, приводя данный показатель к уровню интактных животных. Отсюда следует сделать два вывода. Во-первых, показано выраженное лечебное действие маточного молочка на течение адреналинового миокардита млекопитающих, что подтверждает ценность маточного молочка как биологически активного продукта. Во-вторых, показано, что терапевтические свойства маточного молочка на модели данной патологии проявляются после его хранения в течение 2 лет при температуре +5 С и не отличаются от таковых для молочка, хранившегося по существующему ГОСТу. В связи с выщеиз-ложенными данными следует заключить, что хранение маточного молочка может осуществляться и при плюсовых температурах без потери его биологических свойств в отношении организма человека.

Биохимический анализ маточного молочка

Оценивая качество получаемого молочка в сравнении с его качеством при хранении, кроме выявления биологической активности в отношении органов и систем живого организма, важно выявить основные компоненты молочка, определяющие эту активность. Для этого нами были апробированы современные методы анализа, позволяющие определить сохранность данных компонентов в процессе переработки и хранения молочка.

Учитывая, что специфическая активность молочка во многом определяется набором жирных кислот и липидов, мы разработали условия их выдедения и идентификации методом газо-жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии

(исследования проведены в Институте питания АМН РФ совместно с Медведевым и Лупинович). После исчерпывающей экстракции липидов и их метилированию определялось содержание жирных, в том числе и деценовых кислот.

Газохроматографический анализ проводили на хроматографе Био-хром-1 с пламенно-ионизационным детектором. Хромато-масспектрометрический анализ проводили на хромато-масс-спекгрометре Филлиган-3200 (США) с автоматической системой обработки данных.

Полученные результаты представлены на рис. 1 и в табл. 3. Как видно, сочетание методов газовой хроматографии и ХМС позволило выявить содержание в маточном молочке не только известных жирных кислот, но и существенно расширить их список. Мы полагаем, что неизвестные ранее жирные кислоты присутствуют не только в молочке, полученном в Краснодарском крае, но и в молочке из других климатических и географических зон. Видимо, ранее практиковавшиеся методы их идентификации, с меньшим разрешением, не позволяли их обнаружить.

Как и следовало ожидать, наибольшее представительство в образцах занимает 10-окси-транс2-деценовая кислота - около 27%. Вместе с тем в большом количестве также выявились производные или предшественники этой кислоты (децендиоат, этил-диоат и др.), которые в доступной нам литературе ранее не были показаны. Кроме того, были выявлены минорные количества (в таблице не указаны) 4-оксидекановой (10:0), 11-оксидодекановой (12:0), 3-окситетрадекановой и 3,13-диокситетрадекановой (14:0), 11-оксипальмитиновой (16:0) и додекан-дикарбоновой (С 12) кислот с суммарным содержание 1,5-2%. На хро-матограмме можно также видеть выявленные при данной методике экстрагирования небольшие количества стеринов (в том числе холестерина) в сумме 0,7-0,9% (пик Н-С23) и нормальных парафинов в сумме около 0,8% (пик Н-С24).

100%

(ГОДК)

'1Н! Л*1 *

ЧлА

С 17:0 (вн.ст.)

Н-С23 Н-С24

100

200

300

400

50 0

Рис. 1. Реконструированная хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот маточного молочка

По оси абсцисс - номера масс-спектров, по оси ординат - относительная интенсивность МЭЖК: 2-3-окси-декановой, 3-додекановой, 4-10-оксидекановой, 5-себациновоц, 6 -10-окси-транс2-деценовой, 7-2-децендиоата, 8 - этил-2-децендиоата, 9 - тетрадкановой, 10 - 9-оксо-2-децендиоата, 11 - пальмитолеиновой, 12 - пальмитиновой,

13 - линолевой, 14 - линоленовой, 15 - олеиновой, 16 - стеариновой, 17 -тетракозановой кислот.

Важно отметить, что при старении маточного молочка относительное представительство жирных кислот молочка претерпевает изменения (табл. 3). Так, в результате 5-летнего хранения почти вдвое уменьшается содержание Ю-ГОДК, но возрастает содержание ее диме-ра - 2-децениоата. Мы полагаем, что эти естественные превращения жирных кислот во времени хранения хотя и весьма существенны по ряду кислот, однако не носят принципиального значения при оценке терапевтической ценности молочка в целом. Поэтому можно предположить, что питательная и терапевтическая ценность молочка для человека хотя и убывает со временем хранения, но остается по-прежнему высокой.

Таблица 3

Жирнокислотный состав маточного молочка (относительное содержание в %) - нативного (1) и после 5 лет хранения при 8 С (2), идентифицированный методом хромато-масс-спектрометрии.

метиловые эфиры жирных кислот 1 2

янтарная 2,00 4,41

3-окси-декановая 4,38 12,30

додекановая 0,37 1,77

10-оксидекановая 14,33 , 17,54

себациновая 10,19 16,70

10-окси-транс 2-деценовая 16,96 10,85

2-децендиоат 8,78 16,39

этил-2-децендиоат 7,87 2,76

тетрадекановая 1,20 1,80

9-оксо-2-децениоат 10,88 2,13

пальмитолеиновая 0,24 0,09

пальмитиновая 6,41 3,80

линолевая 1,22 1,34

линоленовая 1,15 2,62

олеиновая 3,04 3,92

стеариновая 0,79 1,34

тетракозановая 0,43 0,24

При анализе качества молочка, важно выявить сохранность и протеиновой фракции, несущей, так же, как и липидной, специфическую роль в проявлении физиологической активности. В наших исследованиях мы определили динамику их сохранности в процессе хранения молочка методом электрофореза на ацетатной пленке. Было показано, что белки маточного молочка в этих условиях элекгрофоретически разделяются на 5-8 фракций, которые в основном представлены альбуминами и глобулинами при соотношении, сходном с таковым белков плазмы крови человека. В процессе хранения уменьшению в большей мере подвергается фракция альбуминов, при сохранности глобулиновой фракции (рис. 2).

12 3

Рис.2. Электрофореграмма белков сыворотки крови человека (1) и маточного молочка пчел 4-годичного (2) и 2-месячного (3) хранения при ЮС.

Кроме проблемы сохранения собственно молочка, имеются проблемы при его сохранности при смешивании с другими продуктами пчеловодства. Так, широко применяется смешивание молочка с медом с получением смеси, которая имеет преимущество в том, что

сразу может употребляться как готовый продукт. В России сегодня выпускается одна из разновидностей такой композиции - Апитонус, содержащий 2% концентрацию маточного молочка (разработка НИИ пчеловодства). Оценивая качество Апитонуса, так же как и других композиций, при первичной переработке молочка мы выявили его новые качества, не описанные в доступной нам литературе - высокие буферные свойства. Было установлено, что коэффициент стабильности маточного молочка по концентрации водородных ионов более, чем в 2 раза превышает воду по отношению к закислению среды, и более, чем в 14 раз - при за-щелачивании. Полученные результаты позволяют более дифференцированно подходить к переработке маточного молочка. Дело в том, что практически все предлагающиеся композиции имеют определенные значения рН, не всегда совпадающие или близкие к концентрации водородных ионов молочка. При их смешивании рН молочка изменяется, что может приводить к нарушению нативных свойств и, соответственно, биологической активности последнего. Так, нами показано, что, если свежесобранное молочко в водном растворе в концентрации 0,2-2,0% при фотометрии (длина волны 630-690 нм) ведет себя как двухкомпо-нентная система (вода-белок), то, при сдвиге рН раствора на 0,5 единиц его прозрачность уменьшалась в 1,5-2 раза, то есть, раствор становился многокомпонентным из-за агрегирования белковых молекул и появления в нем дополнительных компонентов. Мы полагаем, что в такой ситуации теряются гидратные или лило-гликопротеиновые оболочки сложных компонентов молочка с соответствующим их агрегированием и денатурацией.

При определении буферной емкости меда, как основного компонента смеси при переработке маточного молочка, было установлено, что она еще выше, чем для маточного молочка. Отсюда следует, что основные условия поддержания постоянства среды в системе мед - маточное молочко будут определяться медом. Поэтому при изготовлении смеси важно определение исходной рН меда. Из полученных результатов следует считать целесообразным, чтобы рН меда и молочка были близки. Лишь в этом случае сдвиг рН молочка будет минимальным, соответственно его буферные свойства и стабильность будут сохранены. Учитывая, что рН разных отечественных медов составляют от 3,2 до 5,2, а молочка 3,5-3,8, при переработке молочка в продукт Апитонус необходимым правилом должно быть определение рН медов и их подбор с величинами, соответствующими рН маточного молочка.

3. Анализ качества маточного молочка и разработка методов его контроля

Одним из важнейших вопросов промышленного получения и переработки маточного молочка является сертификация и стандартизация

последнего. Существующие методы анализа предусматривают оценку как его физико-химических свойств, так и биологической активности. Указанные методы вошли в соответствующие ГОСТы и ТУ на маточное молочко и его препараты. Однако, количество и объективность оценки в данных документах находятся в обратной пропорции от содержания молочка в препаратах. Так, если тест биологической активности на личинках пчел является обязательным при сертификации сырого молочка, то его нет ни в одном ГОСТе или ТУ на лиофилизированное, адсорбированное молочко или их препараты, а оценка суммы протеинов или деценовых кислот (основные действующие компоненты) проводится только в спорных случаях. Вместе с тем, указанные методы достаточно трудоемки и выполнимы только в крупной лаборатории.

Нами разработаны и предложены методы экспресс-анализа маточного молочка, которые могут быть воспроизведены как в лаборатории с минимальным обеспечением, так и в полевых условиях пасек. В основу одного из методов положено обнаружение в получаемом продукте 10-окси-2-деценовой кислоты, являющейся специфической для маточного молочка пчел. Способ осуществляется путем распределительного хро-матографирования молочка в тонком слое адсорбента на пластинах "Силуфол". Указанные пластины подвергаются предварительной подготовке и далее могут быть использованы в полевых или стационарных условиях.

Подготовка пластин осуществляется следующим образом: стандартные пластины "Силуфол УФ-254" нарезают на полосы и активируют при температуре 105 С, после чего помещают в герметичный сосуд для хранения и транспортировки. Экстракцию липидной фракции из 200 мг маточного молочка осуществляют диэтиловым эфиром. Эфир испаряют, а оставшийся осадок растворяют в 1 мл хлороформа. На стартовую линию подготовленной пластины наносят хлороформный экстракт липи-дов молочка, после чего пластину ставят в хроматографическую камеру. На дно камеры наливают растворитель. Для тонкослойной хроматографии липидов маточного молочка наиболее эффективным оказался следующий растворитель: гексан - диэтиловый эфир - хлороформ - ледяная уксусная кислота в соотношении 75:25:25:2. Для насыщения воздуха камеры парами растворителя внутри сосуда укрепляют вдоль стенки фильтровальную бумагу, смоченную растворителем. Камеру закрывают крышкой.

При прохождении фронта растворителя в восходящем направлении 10 см от линии старта, что длится 10-15 мин, пластину вынимают и, после просушивния на воздухе, помещают в камеру с проявителем. Эффективным проявителем 10-окси-2-деценовой кислоты маточного молочка явились пары йода. Кроме своей специ-

фической реакции - с двойными связями ненасыщенных жирных кислот - указанный галоген удобен тем, что из металлического состояния возгоняется уже при комнатной температуре. Поэтому, было достаточно в герметично замкнутый сосуд поместить несколько крупинок металлического йода, чтобы создать атмосферу, насыщенную его парами. Через 10-15 с после помещения в сосуд пластина окрашивалась в светло-фиолетовый фон, на котором проявлялись пятна липидов маточного молочка. При этом, во фракции 1 (считая от линии старта) обнаруживалась 10-окси-2-деценовая кислота, имеющая отличный от других пятен липидов ярко-желтый цвет при Р^=0,06. При помещении проявленной таким образом пластины в УФ-свет, указанное пятно давало насыщенный темно-синий цвет (рис. 3).

Контроль положения и окраски искомой кислоты в названных условиях проводился путем параллельного хроматографирования на той же пластине собственно 10-окси-2-деценовой кислоты, выделенной из липидной фракции маточного молочка по методике, описанной А.Ви1епапсИ, Н-ИетЬок) (1957). В этом случае на хроматограмме проявлялась только названая кислота, имеющая соответствующие ярко-желтый цвет и величину ЯГ

фронт

1 2

Рис. 3. Тонкослойная хроматография липидов маточного молочка (1) и 10-окси-2-деценовой кислоты (2).

Другая методика была разработана для определения маточного молочка в его композиции с медом в препарате Апитонус. Методика

выполняется в два этапа и предусматривает - на первом этапе - обнаружение маточного молочка, а на втором - - определение его количества относительно основы препарата - меда.

Этап 1. В первую химическую пробирку (контроль) помещают 5 г меда и 10 мл дистиллированной воды, получая раствор меда в воде. Во вторую пробирку (опыт) помещают 5 г препарата Апитонус, добавляют дистиллированную воду, перемешивают и получают прозрачный раствор Апитонуса в воде. В обе пробирки приливают по 3 мл неполярного растворителя (гексан или гептан). Смеси интенсивно встряхивают в течение 1 мин. Оставляют расслаиваться в течение 1 часа. После отстаивания и расслаивания визуально просматривают водную фазу в пробирке на фоне текста, применяемого для определения прозрачности растворов и размещенного за пробирками. Было показано, что во второй пробирке (опыт), содержащей маточное молочко в меде, происходит стойкое помутнение раствора, из-за которого текст не читается. В первой пробирке раствор остается прозрачным, текст читается. Важно отметить, что помутнение во 2-й пробирке не исчезает в течение не менее 2 суток.

Этап 2. Для количественного определения содержания маточного молочка в препарате Апитонус готовят калибровочные растворы. Для этого готовят смеси мед - маточное молочко с содержанием последнего от 0,25% до 2,50% с интервалом 0,25 (всего 10 смесей). По 5 г каждой смеси растворяют в 10 мл дистиллированной воды, после чего добавляют по 3 мл гексана (гептана). Встряхивают 60 с и дают смесям отстояться 1 час. Водную часть раствора отбирают в кювету с расстоянием между рабочими гранями 5 мм и фотометрируют относительно раствора меда (5 г меда с 10 мл воды и 3 мл гексана) на ФЭКе при длине волны 590-650 нм (оранжевый или красный светофильтр). Показания заносят в таблицу и строят калибровочный график. По графику определяют содержание маточного молочка в исследуемом препарате Апитонус.

В основе разработанной методики лежат известные физико-химические процессы, приводящие к появлению при обработке неполярными растворителями в прозрачном растворе препаратов, содержащих маточное молочко пчел, светопоглощающих агрегатов. Мы полагаем, что этими агрегатами могут быть белковые компоненты маточного молочка, лишенные части липидной матрицы, на которой они находились в естественных условиях - до обработки неполярным растворителем. После растворения в гексане или гептане части липидной фракции, оставшаяся ее часть не в состоянии удержать протеиновые компоненты •в нативном состоянии - они агрегируются до светопоглощающих устойчивых комплексов и создают мутность раствора, пропорциональную их содержанию в маточном молочке.

Еще большие затруднения возникают при оценке биологической активности маточного молочка

4. Изучение активности маточного молочка как диетического и фармакологического средства.

Важным элементом технологии производства и переработки маточного молочка является изучение его специфической активности как диетического и фармакологического средства. При проведении данного раздела исследований нами были изучены различные варианты композиций молочка с другими физиологически активными веществами, позволяющими сохранить активность молочка в той или иной форме разрабатываемого средства. Учитывались как проблемы поиска стабилизаторов молочка, так и их ценность, как компонентов разрабатываемых композиций. При этом важно было учитывать и возможность создания таких композиций непосредственно после получения молочка на пасеках или в хозяйствах без дополнительных условий переработки (нагрев до высоких температур, лиофилизация, экстракция и др.).

В качестве одного из таких компонентов нами была подобрана смесь полиэтиленоксидов (полиэтиленгликоли, ПЭО, ПЭГ) с разной молекулярной массой, применяющихся в фармации при изготовлении мягких лекарственных форм. Мы исходили из ряда свойств ПЭГ, удовлетворяющих вышеперечисленным условиям. Важно отметить, что при смешивании ПЭГ различной молекулярной массы можно получить основу, легко застывающую при комнатной температуре, но также легко разжижающуюся при незначительном ее повышении - например, при нанесении на кожу в виде мази - до 37 С. В наших опытах были подобраны такие составы, причем оптимальным оказалось сочетание ПЭГ 1500 и ПЭГ 400 в соотношении 45:55.

При анализе фармацевтической совместимости и сохраняемости маточного молочка в смеси с ПЭГ стандартными и разработанными нами методами было установлено, что молочко не теряет своих качеств в течение не менее 6 месяцев, при хранении при комнатной температуре.

Разработка и изучение биологической активности средства «Апитал»

Биологически активный продукт на основе маточного молочка был разработан нами, исходя из известных и технологичных способов консервации молочка при адсорбировании на сахара (Л.Н.Брайнес, 1974) и его выраженных иммуномодулирующих свойств. Нами было разработано и утверждено (ТУ 9358-014-40301533-99 ) новое профилактическое общеукрепляющее средство, содержащие маточное молочко - таблетки АПИТАЛ. Учитывая, что в осенне-зимний период организм особенно

остро нуждается в усилении иммунного статуса, и наличие в маточном молочке деценовых кислот и гаммаглобулинов, ответственных за имму-номодулирующее действие (Буня, 1988), мы сочли целесообразным разработать состав, обладающий иммуномодулирующей активностью со свойствами антибиотика. Как видно из вышеприведенного состава препарата маточного молочка Апилака - он во многом подходит для этих целей. Вместе с тем известно, что одним из действенных средств профилактики от инфекционно-воспалительных заболеваний является аскорбиновая кислота-витамин С (Машковский, 1985). Поэтому является вполне закономерным композиция маточного молочка с аскорбиновой кислотой. Необходимо указать, что в самом молочке обнаружены лишь следы этого витамина. Кроме того, объединяя маточное молочко с аскорбиновой кислотой, мы исходили из широкого спектра физиологической активности последней, необходимой для более полного проявления эффектов маточного молочка. Доказательством того, что аскорбиновая кислота может потенцировать активность апилака, служат примеры аналогичного действия витамина С в комплексе с другими биологически активными веществами. Так, установлено, что тормозящее влияние витамина Р на проницаемость кровеносных сосудов усиливается под влиянием аскорбиновой кислоты, а превращение фолиевой кислоты в тетра-гидрофолиевую (антианимический фактор) может происходить только в присутствии витамина С (Харкевич, 1980; Машковский, 1985).

В качестве вспомогательных веществ для формирования таблетки нами был подобраны сахара - лактоза и сахароза. При этом мы исходили из практики выбора аналогичных веществ при производстве таблеток, а также учитывая органолептические свойства - нахождение таблеток кисло-сладкого вкуса в ротовой полости до полного рассасывания. Остальные вещества-наполнители - стеарат кальция, крахмал — подобраны в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи (XI издание) на таблетки сублингвального применения. Ниже мы приводим состав в расчете на одну таблетку в 300 мг:

Маточное молочко пчелиное нативное (мг) 45

Кислота аскорбиновая (мг) 30 Сахар молочный .сахароза,

крахмал, стеарат кальция (всего в мг) 265

Как видно из приведенного состава, в таблетках содержится средняя суточная доза (потребность) витамина С. Таблетки белого цвета, сладко-кисловатого вкуса, без запаха. Соответствуют требованиям ГФ Х1, с. 154. -

Для качественного и количественного определения подлинности и активности разработанного средства нами, наряду с известными и

общепринятыми, были разработаны новые методы, позволяющие оценить активность некоторых ингредиентов маточного молочка. Специфическую биологическую активность средства с антибиотическим действием определяли путем оценки бактериостатической активности при воздействии на посевы бактериальных культур. Совместимость ингредиентов препарата оценивали в процессе хранения через 6 месяцев. Как было установлено методом газовой хроматографии при определении содержания суммы деценовых кислот, после полугодичного хранения их содержание весьма незначительно уменьшалось по сравнению с исходным продуктом - нативным маточным молочком. Это доказывает хорошую фармацевтическую совместимость аскорбиновой кислоты и основных лабильных компонентов маточного молочка.

При анализе антибиотической активности было установлено, что как нативное маточное молочко, так и таблетки после 6 месячного хранения, в разведении 1:10 г:мг без существенных различий между собой значительно тормозили прорастание микроорганизмов.

Испытание таблеток Апитал было проведено также на студентах-добровольцах (30 человек) в зимний период. Предварительно у них анализировалось состояние иммунологических показателей крови. Через 30 дней приема таблеток (3 раза в день) кровь вновь забиралась для анализа. Было выявлено, что у части испытуемых, не имеющих отклонений в иммунном статусе видимых его изменений не оказалось и после приема препарата. С другой стороны, у испытуемых, иммунный фон которых был снижен, после проведенного курсового приема он нормализовался до средних величин, характеризующих восстановления соотношения альбуминов и глобулинов плазмы крови, содержание А, В и С-иммуноглобулинов.

На основании проведенных исследований мы рекомендуем Апитал как биологический стимулятор, повышающий энергетический и пластический обмен, обладающий тонизирующими и восстанавливающими свойствами. Препарат повышает аппетит, уменьшает вялость, - стимулирует кроветворение, нормализует иммунологическую реактивность организма и артериальное давление. Соответственно препарат рекомендуется в качестве общеукрепляющего средства при состояниях организма, сопровождающихся усталостью, астенией, отсутствием аппетита, анемиях, физическом и нервном утомлении, в периоды распространения сезонных инфекционно-воспалительных заболеваний, в период выздоровления, послеоперационный период.

На основании вышеизложенного следует заключить, что в разработанном средстве основным действующим компонентом является нативное маточное молочко в комплексе с аскорбиновой кислотой. Такое сочетание создает хороший фон окислительно-восстановительных

реакций организма, на котором более полно проявляются иммуномоду-лирующие свойства компонентов маточного молочка.

С целью расширения списка препаратов - пищевых добавок, содержащих маточное молочко и предназначенных для профилактики заболеваний, укрепления здоровья, повышению выносливости и силы и т.д., нами совместно с ПО «Конверсия» недавно разработан спектр таких препаратов. Вместе с молочком пчел они.содержат также и различные растительные экстракты, тонизирующее действие которых на организм человека проверен временем. Так, «АПИ-СПЛАТ» - натуральный комбинированный препарат на основе маточного молочка с добавлением экстрактов микроводоросли спирулина платензис и женьшеня (ТУ 9284-01240301533-99). Очевидно, что вместе с компонентами маточного молочка действующим началом является также сумма сапонинов (панаксозиды) корня женьшеня, сумма витаминов и гликозидов спирулины (все витамины группы В, бета-каротин, токоферолы, хлорофилл, фикоцианин и др.). Другой препарат - «СПЛАТ-ТОНУС» (ТУ 9284-011-40301533-99) - отличается от апи-сплата тем, что вместо женьшеня в него входит экстракт элеутерококка.

Из приведенного состава следует, что сочетание свойств маточного молочка и растительных экстрактов позволяет существенно потенцировать адаптогенное, общетрофическое и стимулирующее действие препарата на организм человека. Поэтому мы полагаем, что указанные препараты будут особенно полезны при физической и умственной усталости, пониженной работоспособности и быстрой утомляемостью здорового организма или для восстановления здоровья больного.

Разработка и изучение средства «Апингалин»

Применение маточного молочка в медицине осложняется трудностью их парентерального введения в организм. Анализ применяемых лекарственных форм показал, что для введения молочка в организм наиболее приемлемая аэрозольная форма введения (Комарова, Егорова, 1994) с неразрушающим способом создания аэрозоля ультразвуковым методом.

С этой целью мы разработали технологию лабораторного производства комплексного препарата прополиса с маточным молочком, его лекарственной формы, суспензии для аэрозольтерапии . Для усиления лечебного эффекта, а также стабилизиции и консервации молочка в растворе для ингаляций нами был использован еще один продукт пчеловодства - прополис (вытяжка прополиса на спирте, ГОСТ 5962-67 96. Для приготовления водных суспензий прополиса использовали растворитель (вода дистиллированная) и стабилизаторы:

растворы сахарозы, меда., растворы полиэтиленоксида (ПЭО-400 -ПЭО-4000), растворы альбумина, раствор пчелиного маточного молочка. Суспензию получали методом конденсации. Размер частиц определяли методом микроскопирования. Концентрацию аэрозоля определяли фотометрированием при длине волны 540 нм. Дополнительно к стандартным требованиям, предъявляемым к суспензиям, были проведены исследования полученых суспензий к воздействию ультразвука. Биологическую активность препарата исследовали на белых крысах при продувании аэрозоля через затравочную камеру, а также на людях-добровольцах как противовоспалительное средство при воздействии на кожу. Полученные данные показали, что суспензии при различных концентрациях прополиса в дистиллированной воде без стабилизаторов не удовлетворяли условиям ресуспендированности, их агрегатная устойчивость нарушалась в течение 3-7 суток. Взбалтывание выпавшего осадка не приводило к восстановлению суспензии. Суспензии с применением стабилизаторов (сахарозы меда альбумина) обладали высокой устойчивостью, но требовали дополнительно консерванта ,т. к. через 3 суток подвергались действию микроорганизмов. Растворы, приготовленные на основе ПЭО 400 - ПЭО 4000, были устойчивы как к ресуспендированности, так и к действию микроорганизмов, но при 30-минутном воздействии ультрозвука образовывали творожистые осадки в камере ингалятора, что резко снижало эффективность аэрозолеобразования. Проведенные исследования показали, что суспензия , где в качестве стабилизатора испольуется пчелиное маточное молочко, является наиболее предпочтительной в сравнении с ранее нами изучеными. Пчелиное маточное молочко по своей природе является эмульсией, в составе которой имеются белки, аминокислоты, жирные кислоты, углеводы и липиды, что приводит к образованию суспензий с разнородной высокой агрегативной устойчивостью, где проявляются стабилизирующие свойства всех компонентов молочка. Полученная суспензия имела следующие параметры: размер частиц составил от 2 до 5мкм. Ресуспендируемость суспензии составила 10-15 секунд после 20-30 суток хранения. Время расслаивания составляет не более 0.1-0.05 мм/час.

Таким образом, повышение лечебного эффекта средства происходит за счет образования мелдкодисперсной системы при ингаляции и возможности оказывать непосредственное бронхорасширяющее действие. Это позволяет действующим компонентам средства достигнуть уровня средних бронхов легких и оказать на них непосредственное лечебное действие.

Результатом работы явилось создание средства «Апингалин» (подана заявка на изобретение) при следующем соотношении компонентов, мас.%:

маточное молочко 0,5- 5 прополис 0,2- 5

спирт 0,8-25

вода остальное.

В разработанном средстве пчелиное маточное молочко, кроме специфической биостимулирующей активности, играет роль природного эмульгатора за счет имеющихся в нем протеинов и липидов, а также липопротеинов. Кроме того, маточное молочко играет также роль стабилизатора и консерванта за счет присутствия в нем насыщенных жирных кислот, например, таких, как 10-гидроокси 2-деценовая и др.

Испытания биологической активности показали, что токсичность при ингаляции с концентрацией аэрозоля 1.4 мг/м3 (Ш100 для крыс) составляет 55,125 мг/кг. Анализ противовоспалительной активности показал, что воспалительный процесс (при нанесении тест-штриха на предплечье добровольцев (Царфис, 1991) исчезает через 2-5 часов после нанесения суспензии (в контроле признаки воспаления наблюдались до 24 часов). Было показано, что наряду с уменьшением признаков воспаления кожи иногда проявлялась "излишняя" интенсификация местного кровотока, проявляющаяся в просвечивании через кожу элементов периферического сосудистого русла. Указанные недостатки снимались подбором действующей концентрации.

При изучении Апингалина на изолированных препаратах трахеи и тонкого кишечника крысы наблюдали двухфазную реакцию действия: кратковременное повышение тонуса гладкой мускулатуры при введении препарата в дозе 0.38 мг/мл. В фазе расслабления реакция на введение ацетилхолина (тест-реакция), проявляющаяся сокращением изолированного препарата в ответ на введение дозы 510"8 г/мл, отсутствовала. Отсутствие реакции на ацетилхолин свидетельствует о блокировании Апингалином холинорецепторов, что может быть одним из механизмов его действия на гладкую мускулатуру исследуемых органов.

Из анализа полученных данных следует, что суспензия апингалин соответствует среднедисперсной системе, поэтому может применятся в виде аэрозоля для воздействия на мелкие, средние и крупные бронхи, для лечения пневмоний и бронхитов. Спазмолитическое свойство Апингалина, способность блокировать действие ацетилхолина, интенсификация капиллярного кровотока, улучшение кровоснабжения слизистой оболочки дыхательных путей приводит к ее регенерации,

увеличивает жизненную емкость легких, улучшает бронхеальную проводимость.

Изучение радиозащитного действия Апингалина при лучевом поражении крыс

Высокая биостимулирующая активность Апингалина была показана нами при изучении его радиозащитного действия.

В экспериментах на крысах проводилось тотальное однократное гамма-облучение в дозах 3 и 5 Гр (мощность облучения 1 Гр/мин), что вызывало развитие костно-мозговой формы острой лучевой болезни средней и тяжелой степени (Бурназян, 1978).

Рис. 4. Динамика изменения количества эритроцитов в крови облученных животных (3 Гр) при терапевтическом применении продуктов пчеловодства.

Результаты исследований показали, что Апингалин, ингалируе-мый животным ежедневно по 10 мин в течение 10 суток после облучения, обладает выраженными защитными свойствами на систему красной и белой крови крови. Во всех опытных группах общее количество эритроцитов и гемоглобина восстанавливалось быстрее, чем в контрольной (рис. 4).

Восстановление системы белой крови в группах леченных животных также шло более активно, чем в контрольной. Применение маточного молочка с прополисом или с медом способствовало восстановлению общего количества лейкоцитов. При лечении лучевой болезни обеих степеней тяжести "Апингалин" достоверно повышал количество

лейкоцитов на протяжении всего периода наблюдений (рис. 5).

100 1--80 -i---

I ис

60 т--

40 I - -

20----

0--

11 18 25

сутки после облучения

□ контроль НАпингалин □ маточное молочко с медом

Рис. 5. Изменение общего количества лейкоцитов в крови облученных (5 Гр) животных при терапевтическом применении пчелопродуктов.

Различные формы лейкоцитов обладают разной радиорезистентностью (Белоусова и др., 1978; Umansky, 1982). Для лучевой болезни характерна очень сильно выраженная лимфопения, так как лимфоциты, несмотря на то, что они являются зрелыми элементами, очень чувствительны к воздействию ионизирующего излучения и гибнут в первые же часы после облучения (Жербин, Чухповин, 1980; Хансон, Комар, 1985). Иммунологическая реактивность организма поддерживается за счет более резистентных гранулоцитов, уровень которых повышается в силу созревания неповрежденных клеток в костном мозге и выхода из тканевых депо (Груздев, 1979; Denecamp, Rojas, 1989).

Наши экспериментальные данные подтверждают литературные (табл. 4): во всех опытных группах количество лимфоцитов было выше контрольных значений на протяжении всего эксперимента (на 0,220,6%), также как и общее количество нейтрофилов (на 14,3%), причем терапевтический эффект был более выражен в группе с ингаляцией. Следует отметить, что основную массу нейтрофилов в этой группе составляли молодые палочкоядерные формы, что свидетельствует об эффективной защите кроветворения от разрушительного действия радиации. При лечении тяжелой формы лучевой болезни ингаляционное применение смеси маточного молочка с прополисом также способствовало более быстрому восстановлению белой крови.

Таблица 4.

Влияние продуктов пчеловодства на лейкоцитарную формулу облученных животных (3 Го) при их терапевтическом применении.

Показатель Интактные животные Сутки после облучения

Группа 11 18 25

М + m М + m М + m М + m

Контроль лимфоциты 57.4+4.61 50.8+2.059 37.6+1.72 49.2+2.33

(нелеченные нейтроф. (всего): 39.4+4.45 40.0+1.82 53.6+1.42 44.0+3.16

животные) сегментоядерные 34.2+4.95 28.8+3.93 42.3+1.67 36.4+2.31

палочкоядерные 5.2+1.25 11.2+2.06 11.3+1.17 7.6+0.6

лимфоциты 57.4+4.61 52.0+1.41 49.4+2.04* 56.0+1.17*

"Апингалин" нейтроф. (всего): 39.4+4.45 38.0+1.09 59.2+1.15* 45.0+2.23

сегментоядерные 34.2+4.95 25.6+1.12 45.6+1.6* 34.8+2.58

палочкоядерные 5.2+1.25 12.4+0.98 13.6+1.17 10.8+0.49*

лимфоциты 57.44+.61 51.8+1.49 37.7+2.64 52.8+1.62

маточное нейтроф. (всего): 39.4+4.45 45.6+0.75* 59.0+3.69 38.8+1.15*

молочко с сегментоядерные 34.2+4.95 31.2+0.8 48.0+2.58* 28.4+1.6*

медом палочкоядерные 5.2+1.25 14.4+1.17 11.0+1.29 10.4+2.48

Примечание: * - р<0,05 по отношению к контролю.

Результаты анализа красного костного мозга крыс также свидетельствуют о стимулирующем действии исследуемых продуктов пчеловодства на гемопоэз. Как известно, стволовые и бластные клетки, находящиеся в процессе пролиферации, являются самыми радочувствительными элементами системы крови (Филиппович и др., 1985; Radford, 1986; Мазурик, Михайлов, 1999). При дозе облучения 3 Гр к 10 суткам после воздействия ионизирующего излучения кроветворная функция красного костного мозга во всех группах начинала восстанавливаться. Грануло-цитопоэз в группе с "Апингалином" был наиболее интенсивным. В этой группе общее количество гранулоцитарных элементов в костном мозге было на 16,8% выше контрольного значения (р<0,05). Лимфопоэз, по нашим данным, также наиболее эффективно стимулировался "Апингалином". В этой группе общее количество лимфоцитов в костном мозге было на 22,9% выше, чем в контрольной. Этот эффект, по всей видимости, связан с иммуно-модулирующими свойствами маточного

модулирующими свойствами маточного молочка (Матушевский и др., 1972; Пейчев, Димитров, 1972; Матушевский и др., 1982) Стимуляция лейкопоэза также может быть связана с усилением молочком интенсивности синтеза белка и энергетического обмена (Никулин, Якушева, 1989; Козловцев, 1990).

На основании полученных результатов можно заключить, что маточное молочко (средство Апингалин) является эффективным терапевтическим средством при действии "сублетальных" доз у-излучения, облегчают течение лучевой болезни, позитивно влияя как на эритро-, так и лейко-поэз.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и апробированы в полевых условиях крупного пчелоразведенческого хозяйства биотехнологические основы производства и переработки маточного молочка пчел. Научно обоснован оптимальный технологический цикл по получению маточного молочка, его анализу и переработке для пищевой и медицинской промышленности.

2. Обоснованы оптимизированные методы формирования семей-воспитательниц. Показано, что наиболее технологичны способы "неполного осиротения" в модификациях изоляции матки внутри ульев семей-воспитательниц, позволяющие получать необходимые для промышленной переработки количества маточного молочка без уменьшения выхода других продуктов пчеловодства.

3. Выявлены оптимальные режимы и методы сбора, хранения и переработки получаемого продукта. Показано, что полученное в этих условиях маточное молочко полностью удовлетворяет требованиям действующих нормативных документов, характеризующих качество маточного молочка.

4. С применением комплексных методов газовой хроматографии и хромато-масс-спектрометрии выявлены новые компоненты в ли-пидной фракции молочка, неизвестные ранее. Установлена динамика содержания основных биологически активных компонентов липидной и протеиновой фракции молочка в процессе его хранения.

5. Установлено, что хранение маточного молочка в течение 1 года при температуре +6°С не приводит к уменьшению его физиологической активности. Указанная активность проявлялась как при выращивании личинок пчелиных маток, так и при терапии экспериментального миокардита теплокровных животных.

6. Разработаны методы экспресс-анализа маточного молочка и пищевых продуктов на его основе. Показано, что тонкослойная хроматография липидов маточного молочка является объективным методом оценки содержания наиболее важной фракции - 10-окси-2-деценовой кислоты, а фотометрическое измерение реакции маточного молочка с неполярным растворителем (гексан, гептан) позволяет оперативно определять содержание молочка в пищевых добавках «Апитонус» и «Апиток».

7. Разработан метод определения биологической активности маточного молочка и его препаратов, заключающийся в определении активности перекисного окисления липидов (ПОЛ) при моделировании миокардита у теплокровных животных, что позволяет предложить этот тест для оценки качества маточного молочка.

8. Разработана НТД на ряд новых биологически активных композиций на основе маточного молочка, являющееся завершающей стадией биотехнологического цикла. Показана хорошая совместимость маточного молочка с полимерной водорастворимой основой - смесью по-лиэтиленоксидов и аскорбиновой кислотой, а также стабильность и биодоступность изготовленных композиций маточного молочка с прополисом.

9. Разработана новая пищевая добавка с маточным молочком «Апитал». При изучении биологической активности установлено, что «Апитал» обладает биостимулирующим и иммуномодулирующим действием.

10. Разработана и изучена композиция маточного молочка и прополиса для ингаляционного введения в организм. Показано, что она характеризуется высокой степенью дисперсности, потенцирует в себе эмульгирующие свойства маточного молочка и консервирующие - прополиса, их физиологические эффекты, оказывает радиозащитное действие при терапии экспериментального лучевого поражания.

Предложения производству

1. Для оптимизации промышленного получения на пасеках пчелиного маточного молочка необходимо руководствоваться комплексом технологических компонентов, включающих в себя как блок пчеловодных мероприятий (выбор методов формирования семей воспитательниц, разводимую породу пчел, возраст прививаемых личинок, условия материально-технической базы хозяйства, кормовую базу, резерв времени, периоды медосбора), так и блок переработки молочка (резерв времени для доставки заказчику, лаборатория контроля качества, фасовка, хранение, возможность изготовления готовых форм пищевых добавок и лекарственных средств с маточным молочком).

2. Для оценки качества получаемого маточного молочка непосредственно на пасеках руководствоваться разработанными экспресс-методами.

3. Внести изменения в ГОСТ «Маточное молочко пчелиное» в разделе условий его хранения и переработки, заключающиеся в возможности его доставки на перерабатывающие предприятия пищевой и медицинской промышлености, и хранения при плюсовых (до +6°С) температурах, при герметизации тары от влаги, кислорода воздуха и защите от солнечного света.

4. При разработке новых препаратов с маточным молочком для нужд пищевой и медицинской промышлености использовать изученную возможность создания суммарных препаратов молочка на сахарной и полиэтиленоксидной основе с добавлением различных физиологически активных компонентов.

5. При внедрении в народное хозяйство пищевых добавок и лекарственных средств с маточным молочком использовать разработанную НТД на препарат «Апитал» (ТУ № 9358-014-40301533-99) и «Апингалин» и результаты изучения их биологической активности.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сокольский С. С., Билаш Г.Д. Сохраним для отрасли Краснополян-ское пчелохозяйство // Пчеловодство,-1995.-№ 2.-С. 6-9.

2. Сокольский С.С. Оптимизация технологии производства маточного молочка // Апитерапия сегодня (сб.4): Матер. 4 научно-пракг. конф. по апитерапии.-Рыбное, НИИ пчеловодства,1995.-С.29-31.

3. Сокольский С.С., Ошевенский Л.В., Бурмистрова Л.А. Лизунова A.C. Тонкослойная хроматография при анализе пчелопродуктов, применяемых в апитерапии // Там же. С. 43-44.

4. Крылов В.Н., Сокольский С.С., Улитин И.Б. Комбинированный препарат с пчелиным маточным молочком и витамином С // Там же,-С.121-122.

5. Сокольский С. С. Способы получения маточного молочка в пчеловодческих хозяйствах// Информационный листок № 293-95.-Серия Р.68.39.43.-Краснодарский ЦНТИ.1995.

6. Сокольский С.С., Ошевенский Л.В., Крылов В.Н. Экспресс-анализ подлинности маточного молочка пчел // Информационный листок № 294-95.-Серия Р.68.39.43.-Краснодарский ЦНТИ, 1995.

7. Сокольский С.С., Ошевенский Л.В., Крылов В.Н. Методика определения маточного молочка пчел в препарате Апитонус// Инфор-

мационный листок №292-95.-Серия Р.68.39.43.-Краснодарский ЦНТИ, 1995.

8. Сокольский С.С., Ошевенский Л.В., Крылов В.Н. Способ определения биологической активности маточного молочка пчел// Информационный листок № 291-95.-Серия Р.68.39.43.-Краснодарский ЦНТИ,

1995.

9. Сокольский С.С. Технология получения и анализа маточного молочка пчел/ Методические рекомендации - Краснодар: Изд-во Агро-промполиграф.-1995.-16 с.

10. Сокольский С.С. Обоснование технологии получения маточного молочка на промышленных пасеках vi изготовление биологически активных продуктов на его основе. Краснодар: Изд-во Агропромполи-граф.-1995. 62 с.

11. ОнищукФ.Д., Сокольский С.С., Мельник В.Н., ЛозюкЛ.В. Изатизон и его лекарственные формы при заболеваниях пчел 1 Методические рекомендации/ Краснодар. Агропромполиграфист,-1996 г. - 10 с.

12. Сокольский С.С. Высокое качество маточного молочка - решающий фактор при изготовлении композитных препаратов / Пчеловодство,-

1996. №1,- С. 54-55.

13. Сокольский С. С., Ошевенский Л. В., Хруст М.В. Новые методы анализа маточного молочка и его препаратов // Апитерапия сегодня/Матер. 5 научн.-пракг. конф. Рыбное. 1997. - С. 59-62.

14. Крылов В. Н., Сокольский С. С. Мазь с маточным молочком «Унгапилак» //Тамже. С. 187-188.

15. Сокольский С.С., Сырескин И.Г)., Крылов В.Н. Экологическая характеристика продуктов пчеловодства // Там же. С. 192-195.

16. Sokolsky S.S., Syreskine I.P., Krylov V.N. Les caractéristiques écologiques des produits de la ruche // XXXV Congres international d' apiculture. Anvers, Belgique. 1997.: Ed.: Apimondia. Bucarest-Romanie.

1997. P. 115.

17. Krilov V.N., Sokolskiy S.S. Nouvelle preparation pharmaceutique a la gelee royale et a la vitamin С // Там же. P. 466.

18. Крылов В.H., Сокольский С.С., Ошевенский Л.В., Пономаренко A.A. Алингалин - универсальное фармакологическое средство //Апитерапия сегодня / Матер. 6 научн.-пракг. конф. Рязань, 1998.-С.151-154.

19. Вахонина Т.В., Сокольский С.С., Бурмистрова Л.А. Заготовка, хранение, контроль качества и подлинности молочка маточного пчелиного / Методические рекомендации. Сочи. 1998. 16 с.

20. Билаш Н.Г., Сокольский С.С. Новые заменители углеводного корма у медоносных пчел / Материалы международной научной конференции «Современные проблемы повышения протеиновой (аминокислотной) витаминной и минеральной питательности кормов

и кормления сельскохозяйственных животных и птицы». Краснодар КГАУ 1998.-С. 221.

21. Крылов В.Н., Ошевенский Л.В., Сокольский С.С., Рыбина Е.К. Теория и практика апимониторинга // Проблемы экологии и развития пчеловодства в России / Матер, научн.-практ. конф. Рыбное, 1999. С. 12-16.

22. Крылов В.Н., Ошевенский Л.В., Сокольский С.С., Горелая C.B. Технология препарата Апингалин И Там же. С. 147-151.

23. Л.В.Ошевенский, С.С.Сокольский, В.Н.Крылов. Взаимодействие гиа-

луронидазы пчелиного яда с веществами И Апитерапия сегодня / Матер. Всеросс. конф. Рязань. 1999. С. 15-16.

24. Крылов В.Н., Сокольский С.С. Пчелиный кладезь здоровья. Краснодар: Изд-во «Агропромполиграфист», 1999. - 92 с.

25. Ошевенский Л.В., Сокольский С.С., Крысова H.A., Крылов В.Н. Маточное молочко пчел - уникальный адаптоген // Матер. Всеросс. на-учн. конф. с межд. участием, посвящ. 150-летию со дня рожд. И.П.Павлова. С.-П.: изд. СПбГМУ. 1999. С.246.

26. Sokolskiy S., Krylov Vasily. Combined agents for inhalations H Congres XXXVI d'apimondia..ancouver, Canada. 1999. Proceedings. P. 224.

27. Krylov V., Medvedev F., Lupinovitch, Sokolsky S. Determination of de-cen acids in royal jelly and its commercial preparations // Там же. P. 298.

28. Крылов B.H., Сокольский С.С. Волшебная сила пчелы. Сочи. Изд-во «Агропромполиграфист», 2000,-108 с.

29. Крылов В.Н., Сокольский С.С. Маточное молочко пчел: свойства, получение, применение. Краснодар: Изд-во «Агропромполиграфист», 2000. 216 с.

30. Сокольский С.С., Кривцов Н.И., Лебедев В.И. Научно обоснованная технология получения продуктов пчеловодства. Краснодар: Изд-во «Агропромполиграфист,. 2000.- 18 0 с.

Информация о работе

Сокольский, Сергей Сергеевич
доктора сельскохозяйственных наук
Дивово, 2000
ВАК 06.02.04

Автореферат

Похожие работы