Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосорбция тяжелых металлов и биоформирование наночастиц серебра устойчивыми к металлам микроорганизмами

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биосорбция тяжелых металлов и биоформирование наночастиц серебра устойчивыми к металлам микроорганизмами"

На правах рукописи

шг

Тюпа Дмитрий Валериевич

Биосорбция тяжелых металлов и биоформирование наночастиц серебра устойчивыми к металлам микроорганизмами

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 - ЯНВ 2015

Москва - 2014

005558290

005558290

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева»

Научный руководитель: Калёнов Сергей Владимирович

кандидат технических наук, доцент

Официальные оппоненты:

Хижняк Татьяна Владимировна,

доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук», и.о. зав. лабораторией экологии и геохимической деятельности микроорганизмов

Сироткин Александр Семенович,

доктор технических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский национальный исследовательский технологический университет», декан факультета пищевых технологий, заведующий кафедрой промышленной биотехнологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук»

Защита состоится 24 февраля 2015 года в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп. 12, Биологический факультет, ауд. М-1. Тел.: 8(495)939-54-83, эл. почта: npiskunkova@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУ и на сайте биологического факультета МГУ http://www.bio.msu.ru/

Автореферат разослан « »_2015 г.

Ученый секретарь /

диссертационного совета ^си/ Пискункова Нина Федоровна.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Микроорганизмы, устойчивые к действию токсичных металлов (тяжелых, благородных и радиоактивных металлов) незаменимы в очистке сточных вод и почв, загрязненных металлами, биоизвлечении ценных металлов и биоформировании металлических наночастиц (НЧ). Процессы биосорбции металлов и формирования НЧ с участием жизнеспособных, устойчивых к действию металлов клеток протекают интенсивнее, чем в присутствие мертвой биомассы.

Извлечение металлов из промышленных стоков — проблема огромной важности. Соли Си2+, гп2+, №2+, А§+, и(У1) и других металлов снижают качество очистки сточных вод, угнетая культуры микроорганизмов активного ила водоочистных сооружений, разрушают водные и почвенные экосистемы. Воды, не прошедшие надлежащую очистку от солей тяжелых металлов, представляют угрозу для человека, металлы вызывают заболевания различных тканей и органов. Проблема биосорбции тяжелых и благородных металлов важна как с экологической, так и с экономической точек зрения. Извлечение драгметалла из сточных вод сереброперерабатывающих предприятий и биосорбция ионов Си2+, 2п2+ и №2+ из гальванических отходов являются дешевой альтернативой применения традиционных сорбентов - ионообменных смол и активированных углей.

Активный ил очистных сооружений представляет собой незаменимое звено процесса очистки стоков от тяжелых металлов. Еще более эффективные биосорбенты металлов получены в настоящей работе на основе выделенных из ила чистых культур микроорганизмов, которые наиболее устойчивы к металлам и накапливают их в максимальном количестве.

Толерантные к металлам микроорганизмы необходимы в биоформировании НЧ, производство которых активно расширяется. НЧ Ag применяются в катализе, электронике и приборостроении, обладают антимикробной, противогрибковой и противовирусной активностью, используются в производстве медицинского оборудования, дезинфицирующих

средств, бытовых товаров, фильтров воды и воздуха. Перспективность биологического метода формирования НЧ обусловлена его простотой и дешевизной, отсутствием токсичных реагентов и стабильностью продукта. Его недостатки (невысокая скорость процесса и низкий выход НЧ), обусловленные гибелью клеток при контакте с ионами металлов, устранены в данной работе путем подбора устойчивых к металлам продуцентов НЧ.

Цель работы - нахождение легкодоступных устойчивых к действию тяжелых металлов микроорганизмов, способных быстро и эффективно осуществлять извлечение металлов из растворов, накопление их в биомассе и биоформирование металлических НЧ, не теряя при этом жизненной активности. В ходе работы решались следующие основные задачи:

- Выделение из активного ила водоочистных сооружений наиболее стойких к металлам культур, их идентификация и изучение токсическою воздействия тяжелых металлов на данные чистые культуры и на активный ил в целом.

- Моделирование на основе выделенных культур искусственного активного ила с заданным составом и структурой гранул, устойчивого к действию высоких концентраций токсичных металлов.

- Исследование сорбционных свойств культур активного ила, создание на их основе сорбентов тяжелых металлов и оптимизация процесса биосорбции.

- Изучение способности к активному формированию НЧ Ag ряда культур микроорганизмов, принадлежащих к различным таксономическим группам (бактерий, дрожжей, микромицетов и микроводорослей).

- Оптимизация процесса формирования НЧ Ag иловыми культурами, повышение стабильности частиц, их выхода и скорости формирования.

- Организация непрерывного процесса формирования НЧ А§ жизнеспособными клетками с высоким выходом продукта.

Научная новизна. При изучении токсического воздействия солей Ag+, Си2+, 2пг+, №2+ и и(У1) на аэробный активный ил водоочистных сооружений, выделены в чистом виде и идентифицированы наиболее устойчивые иловые культуры, оптимизированы методики их культивирования. Разработан метод создания искусственного активного ила с контролируемым составом, структурой и свойствами, устойчивого к высоким концентрациям тяжелых металлов. Толерантность ила к металлам повышена вследствие его грануляции и симбиотического взаимодействия культур, локализующихся в различных слоях гранулы. На основе выделенных из активного ила, наиболее устойчивых к металлам культур созданы эффективные сорбенты А§+, Си:+, Хп2+, №2+ и Ч(У1); подобраны оптимальные условия процесса биосорбции. Проведен скрининг ряда бактерий, дрожжей, микромицетов и микроводорослей, способных к эффективному формированию НЧ Ag. Выявлены наиболее активные продуценты наносеребра, подобраны условия, обеспечивающие максимальный выход НЧ. Показано, что ключевую роль в этом процессе играет устранение связывающих А§+ ионов СГ, 8042", НРО42". Установлен состав органической оболочки НЧ, предотвращающей их агрегацию. Впервые разработан метод непрерывного биоформирования НЧ Ag живыми клетками.

Практическая значимость. Получены многослойные гранулы искусственного активного ила, устойчивые к высоким концентрациям токсичных металлов (до 70 мг/л Ag+). На основе иловых культур созданы дешевые и высокоэффективные сорбенты тяжелых металлов, не уступающие по сорбционной емкости лучшим мировым аналогам и накапливающие до 35 мг №2+, 70 мг 2п2+, 400 мг Си2+, 500 мг и 330 мг и(У1) на грамм биомассы. Разработан быстрый, экологически чистый метод формирования НЧ Ag с участием жизнеспособных клеток микромицетов активного ила, позволяющий в течение суток получить стабильные НЧ с выходом до 65%. Впервые организован процесс непрерывного микробного формирования НЧ А§.

Личный вклад автора заключается в выполнении всех этапов работы, включая постановку ее цели и задач, обзор литературы, планирование и проведение экспериментов, анализ результатов, формулирование выводов, написание статей и участие в научных конференциях.

Апробация работы. Результаты работы представлены на международных и всероссийских конференциях: VII московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2013 г); XXVI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2014 г); международная научно-практическая конференция «Биотехнология и качество жизни» (Москва, 2014 г); XIII международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2014 г); X международный конгресс молодых ученых по химии и химической технологии (Москва, 2014).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ: 3 статьи в международных журналах и 7 тезисов докладов на научных конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов и списка литературы, изложена на 197 страницах, содержит 17 таблиц и 59 рисунков. Список литературы включает 156 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы ее цель и задачи, научная новизна и практическая значимость.

Глава 1. Обзор литературы.

В литературном обзоре описаны области применения НЧ, методы их формирования, детекции, характеристики и выделения. Отражены преимущества микробиологического формирования НЧ перед физико-химическими методами и его недостатки, устраненные в данной работе. Освещена проблема устойчивости микроорганизмов к металлам, проблемы биосорбции драгметаллов и микробного извлечения тяжелых металлов из загрязненных почв и стоков.

Глава 2. Объекты исследования и методики экспериментов.

В методической части описаны исследуемые культуры микроорганизмов, процессы их культивирования и филогенетической идентификации. Основные объекты исследования - наиболее устойчивые к Ag+ культуры активного ила очистных сооружений {Pénicillium glabrum, Fusarium oxysporum и Fusarium nivale), активно сорбирующие ионы металлов и образующие НЧ Ag. Приведены методики определения порогов токсического воздействия тяжелых металлов на микроорганизмы активного ила, и создания устойчивого к металлам искусственного активного ила. Затем описаны методики изучения процессов сорбции Ni2+, Zn2+, Cu2+, Ag+ и U(VI) культурами активного ила и влияния концентраций металлов, времени их контакта с клетками, температуры, pH, и фазы роста организмов на эффективность биосорбции.

Далее приведены методики формирования НЧ Ag с участием различных микроорганизмов. Описаны процессы отделения НЧ от клеток с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗГ 13-0.1/22, очистки НЧ зональным центрифугированием и снятия характеристик продукта. Концентрацию НЧ определяли при помощи спектрометра UV-Vis Mini 1240 («Shimadzu», Япония), форму и размер частиц оценивали с помощью светового микроскопа Nikon Eclipse ТЕ2000-Е (Япония), трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100СХ2 («Jeol», Япония) и лазерного анализатора размеров частиц Nanotrac Ultra 253. Наличие белковой оболочки на поверхности НЧ определяли на ИК-фурье спектрометре Nicolet 380. Элементный состав НЧ выявляли с помощью атомно-абсорбционного спектрометра КВАНТ-2А (Россия), аминокислотного анализатора и CHNS/0 анализатора Thermo Flash 2000 (Италия, Швейцария).

Глава 3. Устойчивость культур активного ила к тяжелым металлам

В целях создания искусственного активного ила, устойчивого к металлам, рассмотрено влияние токсичных металлов на аэробный активный ил водоочистных сооружений и выделенные из него наиболее стойкие к металлам культуры. Воздействуя на природный ил ионами Ag+, наиболее токсичного для

микроорганизмов металла, отобрали самые устойчивые культуры: P. glabrum, F. oxysporum и F. nivale. Для оценки диапазона концентраций, в которых культуры могут эффективно сорбировать металлы и образовывать НЧ Ag, определили пороги токсического воздействия на данные культуры Ni2+, Zn2+, Cu2+, Ag+ и U(VI) - металлов, в больших количествах присутствующих в промышленных стоках (таблица 1). Показано, что Ag+примерно на два порядка токсичнее остальных металлов, и устойчивость культур к нему может свидетельствовать об их устойчивости к металлам вообще. Наиболее стойкая к Ag+ культура F. nivale способна развиваться при 100 г/л Ni2+ или Zn2+ в среде.

Таблица 1. Концентрации тяжелых металлов, вызывающие стопроцентную гибель культур активного ила

Культура [Ni2+], г/л [Zn2+], г/л [Cu2+], г/л [U(VI)], г/л [Agi, г/л

P. glabrum 12 10 3 1.4 0.04

F. oxysporum 1.2 1 30 1.1 0.025

F. nivale >100 >100 10 1.5 0.05

На основе трех устойчивых к металлам культур созданы гранулы искусственного ила различного состава и строения: F. nivale - F. oxysporum (ядра гранул представлены чистой культурой F. nivale, а их оболочки -культурой F. oxysporum)', F. oxysporum - F. nivale (F. oxysporum в ядре гранулы и F. nivale в оболочке); F. oxysporum - P. glabrum - F. nivale (ядро F. oxysporum, промежуточный слой P. glabrum и оболочка F. nivale) и др. (рис. 1, 2). Модели ила, в которых более стойкая к Ag+ культура F. nivale составляет защитную оболочку гранулы, устойчивее к Ag+, чем чистые культуры и нативный ил (таблица 2); модель ила F. oxysporum — P. glabrum - F. nivale наиболее перспективна для очистки стоков с высоким содержанием токсичных металлов.

Создание искусственного активного ила

Выживаемость микроорганизмов при 20 мг/п Ад*. %

Аэробный активный ил

F. nivale

о-

F. oxysporum

F. oxysporum- F. oxysporum P. glabrum P. glabrum -F. nivale

P. glabrum

Наиболее устойчивые микроорганизмы

Искусственный активный ил

О

Q.

12

13

15

Рис. 1. Схема создания искусственного активного ила (слева) и выживаемость культур / моделей ила при 20 мг/л Ag+ (справа)

24

10 мм

Рис. 2. Одно- (P. glabrum), двух- (P. glabrum - F. nivale) и трехслойные (F. oxysporum — P. glabrum - F. nivale) гранулы (A) и двухслойные (F. oxysporum - F. nivale) гранулы (В), окрашенные серебром

Таблица 2. Концентрации Ag+, вызывающие стопроцентную гибель чистых культур и моделей активного ила

Культура / модель активного ила [Ag+], мг/л

Нативный активный ил 25

F. oxysporum 25

F. nivale 50

F. nivale - F. oxysporum 30

F. oxysporum — F. nivale 60

F. oxysporum — P. glabrum — F. nivale 100

Глава 4. Микробная сорбция тяжелых металлов.

Активный ил является эффективным биосорбентом тяжелых металлов, но выделенные из него наиболее устойчивые к металлам культуры извлекают металлы еще более активно, так как жизнеспособны при их высоких концентрациях. Опыты показали, что биомасса микромицетов активного ила -высокоэффективный биосорбент Ag+; сорбционная емкость F. oxysporum составляет 380 мг/г. F. nivale, F. oxysporum и P. glabrum в течение 3-5 мин извлекают свыше 90% Ag+ из раствора с исходным содержанием Ag+ 100 мг/л, характерным для стоков сереброперерабатывающих комплексов. Процесс сорбции Ag+ оптимизирован путем подбора фазы роста культур (поздняя экспоненциальная стадия для F. nivale и F. oxysporum, поздний стационар - для P. glabrum), рН среды (9 для F. nivale и F. oxysporum, 8 - для P. glabrum) и температуры среды (40°С для всех культур), что позволило создать сорбенты, накапливающие до 50% серебра от сухой массы мицелия (таблица 3).

Культуры активного ила использовались в качестве сорбентов Ni2+, Zn2+, Cu2+ и U(VI). Установлено, что оптимальное для извлечения металлов значение рН составляет 3.5 для U(VI), 5.5 - для Zn2+, 7 - для Ni2+ и 9 - для Си2+. Наиболее эффективным сорбентом Ni2+ и Zn2+ является P. glabrum, Cu2+ — F. oxysporum, a U(VI) - F. nivale (таблица 4, рис. 3, 4).

Рис. 3. Гранулы F. nivale до (слева) и после (справа) сорбции U (VI)

Рис. 4. Гранулы F. oxysporum до (слева) и после (справа) сорбции Си2+

Таблица 3. Сорбционная емкость мицелия выделенных из активного ила микромицетов до и после оптимизации процесса биосорбции Ag+

Культура F. nivale F. oxysporum P. glabrum

Сорбционная емкость, мг/г 227 383 140

Емкость после оптимизации, мг/г 330 497 192

Таблица 4. Сорбционная емкость мицелия выделенных из активного ила микромицетов при извлечении различных тяжелых металлов

Культура Niz+, мг/г Zn2+, мг/г Cu2+, мг/г U(VI), мг/г

F. nivale 28 45 388 340

F. oxysporum 10 58 476 282

P. glabrum 37 92 363 272

Глава 5. Биоформирование наночастиц серебра.

Проведен скрининг имеющих практическое биотехнологическое значение микроорганизмов, способных к активному формированию НЧ Ag. Наиболее стойкие к А§+ культуры активного ила являются самыми эффективными из изученных продуцентов НЧ Ag (таблица 5). При контакте клеток с раствором Ag+ количество образующихся частиц Ag, их размер и окрашивание биомассы специфичны для каждой культуры (даже для штаммов внутри одного вида), что позволяет ввести дополнительный идентификационный признак в определители микроорганизмов (рис. 5).

Рис. 5. Биомасса после суточного пребывания в среде, содержащей 100 мг/л Ag+: А - T. cutaneum; В - F. nivale; С -P. glabrum; D - F. oxysporum; Е-A. tumifaciens; F - A. mysorens; G — S. cerevisiae SL-100; H - S. cerevisiae TM-985

Таксон Микроорганизм Выход НЧ, %

В. subtilis 3

L. acidophilus 4

L. delbrueckii 2

A. tumifaciens 9

Бактерии A. mysorens 3

H. halobium 353П 29

Я. salinarum KCK-03307 31

A. platensis 4

О. agardhii 10

F. oxysporum 44

Грибы F. nivale 39

P. glabrum 34

S. cerevisiae SL-100 3

Дрожжи S. cerevisiae TM-985 2

T. cutaneum 13

Водоросли D. salina 7

P. viridis 4

В целях повышения выхода НЧ и их стабильности подобраны оптимальные для культур активного ила условия биоформирования: ранняя стационарная фаза роста, устранение связывающих Ag+ ионов СГ, S042" и НР042", pH 5, концентрация ионов Ag+ 50-70 мг/л, время их контакта с клетками 25-30 ч, скорость перемешивания и интенсивность освещения. С 65%-ным выходом получены НЧ Ag размером 70-100 нм, покрытые оболочкой предотвращающих агрегацию микробных белков (рис. 6, 7, 8). Устранены недостатки микробного метода формирования НЧ - длительность процесса и низкий выход продукта. С участием F. oxysporum в реакторе проточного типа впервые организован долговременный непрерывный процесс биоформирования НЧ Ag живыми клетками. Подбор оптимальных условий формирования (20 мг/л Ag+, скорость протока 200 мл/ч при рабочем объеме реактора 400 мл, концентрация биомассы 2 г/л) позволил повысить выход НЧ до 80% и получать раствор, содержащий 16 мг/л НЧ Ag.

Рис. 6. НЧ Ag, образованные F. nivale (A), F. oxysporum (В) и P. glabrum (С)

; ; ; /

ÎÎ'.:"j 1 ' ' ---- -Т - ;—- |___

; L---; . ...........

Î !

! ! 1

-

п î î 111 пи î fî • ......

Size(Nanometers)

Рис. 7. Данные лазерной дифракции: распределение НЧ Ag по размеру (F. nivale). Наряду с НЧ образуются крупные (2-4 мкм) частицы, склонные к осаждению

Рис. 8. ИК-спектр покрытых белковой оболочкой НЧ Ag (Р. glabrum). Пики поглощения при 1650 и 1550 см"1 соответствуют I и II амидным группам белков

Выявлен состав полученных частиц. Данные элементного анализа НЧ и аминокислотного анализа их органических оболочек свидетельствуют о том, что частицы Ag покрыты практически чистым белком, составляющим от 7 до 73% массы НЧ (таблица 6). Электрофорез показал, что НЧ культуры P. glabrum в основном покрыты белками массой 25, 28 и 40 kDa, НЧ F. oxysporum - 38, 42 и 62 kDa, a F. nivale - 62 kDa. Также везде присутствуют примеси тяжелых белковых ассоциатов массой 100-200 kDa (рис. 9).

Таблица 6. Элементный состав биогенных НЧ

Культура Содержание элементов в НЧ, % масс.

Ag С H N S О

P. glabrum 27 37.3 5 13 1.5 16.2

F. oxysporum 35 34 4.6 11 1.4 14

F. nivale 93 3.6 0.5 1.2 0.2 1.5

210 kDa, 190 kDa' 170 kDa'

,210 kDa •190 kDa ■170 kDa

62 kDa

w

62 kDa

40 kDa"*-

kDa-*. kDa*

• 42 kDa 138 kDa

Рис. 9. Схема электрофореза белков, смытых с поверхности НЧ Ag, образованных P. glabrum (A), F. oxysporum (В) и F. nivale (С)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе определены пороги токсического воздействия солей Ag+, Cu2+, Zn2+, Ni2+ и U(VI) на культуры активного ила водоочистных сооружений. Наиболее устойчивые к действию металлов культуры, перспективные для биосорбции металлов и биоформирования металлических НЧ, выделены в чистом виде и идентифицированы как Fusarium nivale, Fusarium oxysporum и Pénicillium glabrum. Культуры выносят до 40 мг/л Ag+; F. nivale развивается при 100 г/л Ni2+ и Zn2+. Ag+ значительно токсичнее других металлов (летальные дозы Ni2+, Zn2+, Cu2+, U(VI) и Ag+ для P. glabrum составляют 12, 10, 3, 1.4 и 0.04 г/л соответственно). Показано, что по устойчивости культур к Ag+ можно оценивать их устойчивость ко всем прочим металлам.

Разработан метод создания искусственного активного ила, устойчивого к действию токсичных металлов. Метод основан на отборе наиболее устойчивых к Ag+ культур гранулирующегося аэробного активного ила очистных сооружений и создания на их основе многослойных иловых гранул, в которых менее стойкие к металлам культуры защищены слоем наиболее стойких микроорганизмов. Создан искусственный ил, превосходящий стойкостью к Ag+ исходный ил и выделенные из него культуры. При 20 мг/л Ag+ выживаемость микроорганизмов составляет 7% для исходного ила 9, 13 и 12% - для чистых культур F. oxysporum, F. nivale и P. glabrum, и 24% - для трехслойных гранул, созданных на их основе. Искусственный ил продолжает развиваться при 75 мг/л Ag+, тогда как исходный активный ил вымирает при 25 мг/л Ag+.

На основе культур активного ила получены сорбенты Ag+ с сорбционной емкостью до 380 мг/г; при 100 мг/л Ag+ степень извлечения равна 95%, за 3 мин сорбируется 85% Ag+. Найдены оптимальные для сорбции фаза роста культур, pH и температура. Сорбционная емкость возрастает на 20% при нагревании среды от 25 до 40°С, на 50% - при изменении pH от 3 до 9 и на 30 % - при переходе от экспоненциальной фазы роста к стационарной. Полученные биосорбенты накапливают до 50% серебра от сухой массы клеток.

Исследован процесс сорбции солей Cu2+, Zn2+, Ni2+ и U(VI) культурами активного ила. Для сорбции Си2+ целесообразнее использовать F. oxysporum, ее сорбционная емкость по Си2+ достигает 400 мг/г. U(VI) наиболее эффективно накапливается культурой F. nivale — более 330 мг/г. Zn2+ и Ni2+ активнее всего поглощает культура P. glabrum, сорбируюя до 35 мг/г Ni2+ и до 70 мг/г Zn2+. Время сорбции составляет от 2-3 минут в случае Си2+ до 20-30 минут при извлечении U(VI). Оптимальное для сорбции значение рН среды составляет 3.5 для U(VI), 5.5 - для Zn2+, 7 - для Ni2+ и 9 - для Си2+.

Проведен скрининг ряда имеющих практическое биотехнологическое значение культур бактерий, грибов, дрожжей и микроводорослей, способных к активному формированию НЧ Ag. Выявлены активные продуценты НЧ: Н. salinarum, P. glabrum, F. oxysporum и F. nivale. Подобраны оптимальные для формирования НЧ условия: концентрация Ag+70-100 мг/л, продолжительность процесса 25-30 ч. Снижение концентрации Ag+ и ограничение времени контакта ионов с клетками способствует стабилизации НЧ белковыми оболочками, предотвращая их агрегацию. Устранение связывающих Ag+ ионов СГ, S042" и НР042" в случае культуры F. oxysporum на порядок повышает выход НЧ. Предложен метод идентификации микроорганизмов, основанный на формировании разных типов частиц Ag при контакте клеток с раствором Ag+.

Процесс формирования НЧ Ag иловыми культурами оптимизирован путем подбора фазы роста микроорганизмов, рН среды, ее органического и солевого состава, скорости перемешивания и интенсивности освещения. Реализовано извлечение НЧ из биомассы действием ультразвука. Разработан метод формирования НЧ Ag, позволяющий за 24 ч получить с 65%-ным выходом стабильные частицы размером 80-100 нм, покрытые оболочкой микробных белков, предотвращающих агрегацию. Впервые организован непрерывный процесс биоформирования НЧ Ag живыми клетками. При 20 г/л Ag+ возможно в течение длительного времени получать раствор, содержащий 16 мг/л НЧ, со скоростью 200 мл/ч при рабочем объеме реактора 400 мл и выходе НЧ 80%.

выводы

1. Определены пороги токсического воздействия Ag+, Cu2+, Zn2+, Ni2+ и U(VI) на культуры активного ила очистных сооружений. Наиболее стойкие к металлам культуры выделены в чистом виде и идентифицированы как Fusarium nivale, Fusarium oxysporum и Pénicillium glabrum.

2. Разработан метод создания искусственного активного ила, устойчивого к металлам. Искусственный ил сохраняет жизнеспособность при 75 мг/л Ag+, тогда как исходный активный ил вымирает при 25 мг/л Ag+.

3. На основе культур активного ила получены биосорбенты тяжелых металлов, накапливающие до 35 мг никеля, 70 мг цинка, 400 мг меди, 330 мг урана и до 500 мг серебра на грамм сухой биомассы.

4. В результате скрининга имеющих практическое биотехнологическое значение культур микроорганизмов выявлены активные продуценты НЧ Ag: H. salinarum, P. glabrum, F. oxysporum и F. nivale. Предложен метод идентификации микроорганизмов, основанный на формировании разных типов частиц Ag при контакте клеток с раствором Ag+.

5. Разработан метод формирования НЧ Ag культурами активного ила. За 24 ч получены с 65%-ным выходом частицы размером 80-100 нм. Установлено, что до 70% массы частиц приходится на оболочку из микробных белков, предотвращающих агрегацию НЧ.

6. Впервые организован непрерывный процесс биоформирования НЧ Ag живыми клетками F. oxysporum, позволяющий в течение длительного времени получать стабильные НЧ 80%-ным выходом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК РФ

1. Khokhlachev N.S., Kalenov S.V., Zanina O.S., Tyupa D.V.. Baurina M.M., Kuznetsov A.Ye. The role of stress agents as operating factors in formation and functioning of granular aerobic activated sludge at model domestic wastewater treatment // Bioprocess Biosyst. Eng. - 2014. Vol 37. No 9. - P. 1771-1779.

2. Tyupa D.V.. Kalenov S.V., Skladnev D.A., Khokhlachev N.S., Baurina M.M., Kuznetsov A.Ye. Toxic influence of silver and uranium salts on activated sludge of wastewater treatment plants and synthetic activated sludge associates modeled on its pure cultures // Bioprocess Biosyst. Eng. - 2014 (article online).

3. Tyupa D.V.. Kalenov S.V., Baurina M.M., Panfilov V.I., Kuznetsov A.Ye., Skladnev D.A. A facile method for formation of synthetic activated sludge granules with enhanced tolerance to metal ion toxicity // J. Chem. Technol. Biotechnol. - 2014 (article online).

Другие издания

1. Тюпа Д.В.. Калёнов С.В., Складнев Д.А., Кузнецов А.Е. Токсическое воздействие тяжелых металлов на активный ил // Биотехнология: состояние и перспективы развития: VII московский международный конгресс (Москва, 1922 март. 2013 г.). - М. 2013. - С. 45.

2. Тюпа Д.В.. Калёнов С.В., Складнев Д.А., Кузнецов А.Е. Многофакторная оптимизация процесса биосорбции серебра гранулообразующими грибами // Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии: XXVI зимняя молодежная научная школа (Москва, 10-14 февр. 2014 г.). - М. 2014.-С. 135.

3. Тюпа Д.В., Калёнов С.В., Складнев Д.А., Кузнецов А.Е. Моделирование активного ила, устойчивого к действию токсичных металлов // Биотехнология и качество жизни: международная научно-практическая конф. (Москва, 18-20 март. 2014 г.). - М. 2014. - С. 451.

4. Тюпа Д.В.. Калёнов C.B., Алексеева JI.C., Складнев Д.А., Кузнецов А.Е. Воздействие солей серебра на сообщество азотфиксаторов активного ила // Биотехнология и качество жизни: международная научно-практическая конф. (Москва, 18-20 март. 2014 г.). - М. 2014. - С. 453.

5. Тюпа Д.В.. Калёнов C.B. Повышение устойчивости активного ила к металлам методом микробного капсулирования // Пищевые технологии и биотехнологии: XIII международная конференция молодых ученых (Казань, 1517 апр. 2014 г.). - Казань, 2014. - С. 79.

6. Алексеева Л.С., Тюпа Д.В.. Калёнов C.B., Панфилов В.И. Выделение и идентификация компонентов азотфиксирующего сообщества гранулированного аэробного активного ила, адаптированного к стрессу // X международный конгресс молодых ученых по химии и химической технологии (Москва, 28-31 окт. 2014 г.). - М. 2014. - Т. 28, №4, С. 121-124.

7. Тюпа Д.В.. Алексеева Л.С., Калёнов C.B., Кузнецов А.Е. Поиск наиболее активных микробных продуцентов наночастиц серебра // X международный конгресс молодых ученых по химии и химической технологии (Москва, 28-31 окт. 2014 г.). - М. 2014. - Т. 28, №5, С. 74-77.

Формат 60x90/16. Заказ 1786. Тираж 100 экз. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96