Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение закономерностей сорбции металлов микроорганизмами

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение закономерностей сорбции металлов микроорганизмами"

ч £

На правах рукописи

КОРЕНЕВСКИЙ Антон Александрович

ИЗУЧЕНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ СОРБЦИИ МЕТАЛЛОВ МИКРООРГАНИЗМАМИ

Специальность 03.00.07.— Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —

1997

Работа выполнена в Институте микробиологии Российской Академии Наук.

Научный руководитель: член-корреспондент РАН,

доктор биологических наук, профессор Г. И. Караванко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Н. Н. Медведева

кандидат геолого-минералогических наук Р. А. Амосов

Ведущая организация: Факультет почвоведения МГУ им.

М. В. Ломоносова

Зашита диссертации состоится «, йг

■В. НИ1 С)С)7 г

п,_(Ч, часов на заседании диссертационного совета'в Институте 'микробиологии РАН по адресу: г. Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН.

Автореферат разослан «. »_-5997 г

Учснын секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Л. Е. Никитин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность_проблемы. Изучение закономерностей

взаимодействия микроорганизмов с металлами важно как для понимания процессов миграции металлов в окружающей среде, так и в связи с разработкой биотехнологических методов очистки сточных вод и извлечения ценных элементов из промышленных растворов.

Известно, что способность концентрировать химические элементы свойственна всем живым организмам. На концентрационную функцию живого вещества как на важнейшую часть его геохимической деятельности указывал В.И. Вернадский.

Достаточно подробно изучена способность микроорганизмов накапливать металлы в клетках за счет процессов транспорта, а также механизмы устойчивости микроорганизмов к тяжелым металлам. Однако способность клеток микроорганизмов к взаимодействию с металлами за счет сорбционных процессов долгое время не находила должного внимания. Такие исследования начали активно проводиться с 80 гг. в связи с поиском альтернативных технологий очистки сточных вод от токсичных металлов и радионуклидов. Эти работы обычно носили выраженную технологическую направленность, оставляя механизмы лежащие в основе этих процессов за рамками исследований.

Целью работы было изучение закономерностей сорбции различных групп металлов клетками микроорганизмов.

Основные задачи исследования:

1. Изучить влияние физико-химических факторов на сорбцию различи?,тх металлов микроорганизмами.

2. Изучить влияние физиологического состояния культуры микроорганизмов на сорбцию металлов.

3. Изучить влияние элементного состава клеток микроорганизмов на сорбцию металлов.

4. Выявить локализацию сорбированных металлов в клетках микроорганизмов.

5. Изучить возможность биосорбционного извлечения ценных элементов из промышленных растворов сложного состава и очистки сточных вод с помощью сорбентов на основе микробных биомасс.

Научная новизна. Изучены закономерности сорбции клетками и биомассой микроорганизмов следующих групп элементов: металлов, образующих анионы (Сг(У1), Мо(У1), металлов, обладающих

высоким (более 700 мВ) электродным потенциалом (Ад, Нд, Аи), катионов переходных металлов Хп, Сс1, №, а также редкоземельных элементов (Бс, У, Ьа, 5т), железа и алюминия.

Впервые дана количественная оценка сорбционной способности широкого круга микроорганизмов различных систематических групп. Обнаружены различия в сорбционной способности не только между различными видами и штаммами микроорганизмов, но и между отдельными клетками популяции. Причем различия в сорбционной емкости отдельных клеток популяции во много раз превышли межвидовые различия.

Установлено, что механизм биосорбции металлов и их локализация в клетках микроорганизмов зависит от формы нахождения ионов металлов в растворе, проницаемости цитоплазматической мембраны и элементного состава клеток. Биосорбция металлов клетками микроорганизмов с неповрежденной ЦПМ осуществляется их поверхностными структурами и в значительной мере определяется значением рН раствора. Сорбируемость катионов металлов увеличивается с ростом рН и степени их гидролизованности. Биосорбция анионов (VI) молибдена, вольфрама и хрома происходит только из кислых растворов.

Показано, что сорбция таких металлов, как серебро, золото и ртуть, а также шестивалентных молибдена, вольфрама и хрома сопровождается повреждением ЦПМ клеток микроорганизмов. Поэтому их аккумуляция происходит как на поверхности клеток микроорганизмов, так п внутриклеточно.

Установлено, что количество внутриклеточно сорбированных РЗЭ , Ре и А1 определяется содержанием фосфора, а количество серебра, ртути и золота - содержанием серы в клетках микроорганизмов дрожжей. Таким образом, элементный состав клеток микроорганизмов может служить показателем их сорбционной способности.

Установлено, что биосорбция молибдена и вольфрама является сложным процессом, включающим сорбцию как их катионных, так и анионных форм, в случае молибдена также происходит его частичное восстановление до пятивалентного сос тояния.

Проведенные исследования показали, что связывание серебра, золота и ртути клетками микроорганизмов происходит • за счет

сия зиваипя металлов сульфгидрим.ными группами, а также, восстановления сортированных мета\лов до элементного состояния. При »том трансформация серебра сопровождается высвобождением активных центров связывания.

Практическое значение_исследований. Разработаны способы

получения биосорбентов, пригодных для использования в промышленности, а также принципы их применения для извлечения ценных элементов из производственных растворов сложного состава и очистки сточных под от токсичных металлов.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на 5-м Европейском бнотехнологическом конгрессе (Дания, 1990), на 4-м Международном симпозиуме «Биотехнологическая переработка топлива» (Италия, 1993), на конференции "Очистка промышленных сточных вод и водоподготовка» (С-Петербург, 1992), в лекции «Биосорбция цветных и благородных металлов» на международных учебных курсах ЮНПП «Виогеометаллургия», Москва, 1991 г. Материалы диссертации представлялись на международных научно-технических выставках в России, Германии, ЮАР, Иране в 1995-1997 гг.

Публикации. По материалам опубликовано 10 работ, в том числе 2 патента.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 254 наименований работ. Содержание работы изложено на ¡72 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 55 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Объекты исследования.

В экспериментах использовали культуры микроорганизмов из коллекции лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов ИНМИ РАН, культуры, полученные из Российской коллекции микроорганизмов (ВКМ), а также штаммы микромицетов, выделенные из хвостохранилищ золотообогатителыюй фабрики (Узбекистан). Культура микроводорослей Chlorella vulgaris шт. А-2 получена в Институте физиологии растений РАН. Использовали мицелиальные отходы производства антибиотиков (АО «Ферейн» г. Москва, комбинат

медпрепаратов, г. Пенза). Кроме того, была использована биомасса пекарских, пивных и кормовых дрожжей.

Методы культивирования микроорганизмов.

Культивирование бактерий, дрожжей и грибов проводили на стандартных средах [Романенко, Кузнецов, 1974].

Дрожжи Candida utilis ВКМ Y-1GG8 выращивали на среде 1, содержащей (г/л) сахарозу - 5,0, (NH^SC^ - 1,0, К2НРО4 - 0,5, MgSC>4'7H20 - 0,1, раствор микроэлементов [Pfennig and Lippert, I960) -0,5 мл, pH = 6,5. Культивирование водорослей Ch. vulgaris проводили на среде Тамийи [Андреева, 1975). Время культивирования С. utilis - 12 часов, микромицетов - 3-5 суток, Ch. vulgaris - 7-14 суток.

Опыты по изучению сорбции и десорбции металлов биомассой микроорганизмов проводили следующим образом. В колбы, содержащие по 20 мл раствора металла или соответствующего десорбента с заданным значением pH, вносили навески биомассы (100200 мг сухого веса), затем колбы помещали на качалку (180 об./мин, 25°С). Через 20-60 мин. биомассу отделяли от раствора центрифугированием, либо, при изучении кинетики процесса, фильтрованием через мембранный фильтр, и определяли в растворе концентрацию металлов. Эксперименты проводили и грех повторностях.

Проведение заводских укрупненных испытаний биосорбентов.

Сорбцию никеля, молибдена, вольфрама и серебра биосорбентом на основе биомассы Actinomyces roscolus проводили в стеклянных колонках высотой 300 и диаметром 35 мм. Высота рабочего слоя 260 мм, что соответствует 250 см3 сорбента. Сорбцию никеля и кадмия биосорбентом на основе Actinomyces Irudiuc проводили в колонках из полистирола, имевших внутренний диаметр 50 мм и высочу 750 мм. Высота рабочего слоя - 600 мм, что соответствует объему 1,18 л.

Подачу растворов в колонки осуществляли с помощью перистальтических насосов.

Измерения электрофоретической подвижности клеток дрожжей проводили на приборе' "l'armokvanl 2" Carl Zeiss lena (Германия) is переменном электрическом поле при напряжении на электродах 25175 В и силе тока 2-12 мЛ. Эгп исследования были проведены в Казанском химико-технологическом институте.

Концентрацию металлов в растворах определяли методом атомной абсорбции на приборе Perkin-Elmer 3100 (Германия). Содержание различных элементов в биомассе микроорганизмов определяли после ее сжигания в растворе концентрированной HNO3 или в царской водке при' нагревании.

Методы получения биосорбентов.

Иммобилизация биомассы в полимерные носители. Эти исследования проводились совместно с НИИ Пластмасс.

Высушенную и измельченную в порошок биомассу заливали смесыо мономеров, растворителя и катализатора и проводили отвержение по общепринятым методам.

По окончании полимеризации бносорбент дробили на гранулы размером 0,25-2,0 мм и обрабатывали острым паром для удаления растворителя.

Твердые биосорбенты с полиэтиленовой матрицей получены путем сплавления полиэтилена с порошком сухой биомассы. Сплавление проводили п процессе вальцевания при 120"С в течение 15 мин., затем массу продавливали через фильеры и разрезали на гранулы размером 1-3 мм.

Получение сухих гранулированных форм без применения полимерных носителей. Эта часть работы была выполнена в Московском агроинженерном университете им. В.П.Горячкина.

Установка для получения гранулированных биосорбентов включала смеситель, экструдер, аппарат для сушки гранул в кипящем слое, термоупрорчнитель.

Проведение рентгеновского микроанализа. Исследования проводили на электронном микроскопе JEOL JEM-100CXII со сканирующей приставкой EM-ASID4D и рентгеновским микроанализатором Link 860 с детектором Е5423. Ускоряющее напряжение 60 keV.

Тонкие спезы получали на микротоме «Ultratome Nova» (LKB Instruments, Швеция). Изучали как неокрашенные срезы, так и окрашенные четырехокнсью осмия, уранилацетатом, и/или цитратом свинца.

Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием программ STATISTICA v.4.3 В (StatSoft Inc.) и Microcal Origin v.3.5 (Microcal Software Inc.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для изучения закономерностей биосорбции металлов были выбраны три группы элементов, существенно различающихся по своим химическим свойствам. Первая группа - металлы, образующие анионы (Cr(VI), Mo(VI), W(VI)). Вторая группа - металлы, обладающие высоким (более 700 мВ) электродным потенциалом (Ад, Нд, Аи). Третья группа -катионы переходных металлов Zn, Ctl, Ni, а также редкоземельных элементов (Sc, Y, La, Sm), железа и алюминия

Скрининг микроорганизмов в отношении их способности сорбировать металлы.

При проведении скрининга было показано, что наибольшие и наименьшие значения сорбционной емкости биомассы микроорганизмов различных систематических групп различались не более чем в 2-3 раза (исследования проводили для Ag, Mo, Cr, Ni, Zn, РЗЭ). Различие в сорбционной способности обнаруживалось не только между разными видами, но между штаммами одного вида. Например, штаммы в пределах видов PenicilHum chrysogcnum, P. verrucosum и Aspergillus nigcr отличались друг от друга по уровню извлечения серебра примерно в 2 раза.

В то же время изучение отдельных клеток микроорганизмов методом рентгеновского микроанализа показало их высокую неоднородность по сорбционной активности. Сорбционные емкости отдельных клеток, как правило, различались в 5-10 раз. В случае сорбции серебра и золота разница в количестве накопленных металлов отдельными клетками С. utilis достигала нескольких десятков раз. Кроме того, при сорбции серебра из растворов, содержащих 5 мг Ag/л, до 40% клеток С. utilis вообще не сорбировали серебро. Таким образом, различия в сорбционной способности отдельных клеток популяции во много раз превышают различия обнаруженные между видами микроорганизмов.

Влияние рН среды на биосорбцию металлов.

Величина рН является важным фактором, определяющим форму нахождения ионов металлов в растворе и степень ионизации функциональных групп биополимеров клеток микроорганизмов.

На рисунке 1 представлены результаты изучения влияния рН среды на биосорбцию Mo(VJ), VV(VI) и Cr(VI). Биосорбция этих элементов наиболее активно протекает в кислой среде. Причем кривые зависимости адсорбции молибдена и хрома от рН имеют выраженный

максимум, лежащий в диапазоне значений рН 1,5-3,0. Повышение рН сопровождается быстрым падением сорбцпонной емкости биомассы в отношении молибдена и хрома. В области рН 6-8 сорбция этих металлов практически прекращается. Причем снижение уровня сорбции хрома (VI) при значениях рН >3 является более резким, чем в случае молибдена и вольфрама. При сорбции вольфрама биомасса сохраняет достаточно высокую сорбционную способность при значениях рН 5-7.

Известно, что при переходе от Cr(VI) к W(VI) кислотные свойства уменьшаются, а склонность к полимеризации возрастает [Назаренко и др., 1979, Зеликман, 1970]. В растворах со значениями рН выше 7,5 шестивалентные хром, молибден и вольфрам существуют в форме анионов (Ме042"), при рН ниже 7,5 появляются протониропанные формы (HMeCV, F^MeCV', и др.). При значениях рН ниже 0,9 - 1,1 молибден и вольфрам представлены преимущественно в виде катионов (Ме022+). В случае шестивалентного хрома даже в сильнокислых растворах (>10 N) существует первый анион НСЮ4", и доля молекулярной формы Н2СЮ4 не достигает 100%.

Таким образом, проведенные нами исследования позволяют говорить, что клетки микроорганизмов сорбируют положительно заряженные, а также протонированные полимерные и мономерные формы металлов, обладающие низким или нейтральным зарядом.

Изучение влияния сорбции молибдена на электрофоретическую подвижность клеток дрожжей показало, что, наряду с положительно заряженными формами молибдена, сорбируются и его анионные формы. При этом катиош/ые формы образуют более прочные комплекс!,I с функциональными группами клеточной поверхности, чем анионные формы.

Процесс биосорбции серебра протекал в широком диапазоне рН (рис. 2). Сорбционная способность биомассы микроорганизмов увеличивалась с ростом рН. Наиболее значительный рост сорбционной способности наблюдался в диапазоне значений рН 1,5-4,0.

Известно, что в области значений рН 1,5-5,0 серебро находится в форме катионов (Ад + ) [Назаренко, 1979]. В этих условиях функциональные группы биополимеров протонизированы. При взаимодействии катионов серебра с потенциальными центрами связывания (карбоксильные, сульфгидрильные группы или аминогруппы) происходит высвобождение протонов. Поэтому при подкислении среды происходит снижение сорбционной способности биомассы.

Сорбированно Cr, %

о G

? ч

£ S

-о. 0

•3 *

о >—

у •

5 го

•с

Сорбировано Mo, %

■а

а s о о о •а с\

J3

s

У

-о

о

0\ s

к 0>

-а

Сорбировано W, %

тз

100

■10

2 4 6 Я

рн

Рисунок 2. Влияние рН на сорбцию серебра биомассой мнкромицетов.

80

V

£40 и

а

л

20 0

2 4 6 8 10

рн

Рисунок 3. Влияние рН на сорбцию цинка, кадмия и никеля биомассой Act. roseolas.

Как видно из рисунка 3, сорбция никеля, кадмия и цинка увеличивалась с ростом р! I. Кривые сорбции металлов имели Б-образную форму. Сорбция металлов биомассой микроорганизмов практически отсутствовала при значениях рН ниже 4. Значения рН, соответствующие точкам перегиба кривых сорбции Хп, Се! и N1, составили соответственно 6,0, 6,5 и 7,8 (рис. 3). Наблюдаемый рост сорбируемости металлов, по-видимому, обусловлен гидролизом их катионов. Значения первой константы гидролиза (рК|,.) увеличиваются в ряду гп2+ (7,7), Сс12+ (7,9) и №2+ (9,0) |Назаренко и др., 1979]. Таким образом, видно, что последовательность сорбции этих металлов совпадает с порядком увеличения их рК1г.

Зависимость бносорбции РЗЭ, железа и алюминия клетками микроорганизмов от рН носит сложный характер. Кривые, отражающие эту ■ зависимость, имеют две точки перегиба, соответствующие двум основным механизмам связывания (рис. 4).

Рисунок 4. Влияние рН на сорбцию скандия и иттрия биомассой 5. Ci.TCVi.siсю.

0

0 1 2 3 4 5

рн

С помощью метода рентгеновского микроанализа было показано, что в кислой среде ведущий механизм - взаимодействие с фосфорсодержащими соединениями, т.е. хемосорбция. Таким образом, первый перегиб кривой обусловлен изменением устойчивости образуемых фосфатных комплексов. Второй перегиб кривой связан с образованием и сорбцией гидролизованных форм металлов. Очевидно что, как и в случае сорбции цветных металлов, чем ниже значения рК), соответствующего трехзарядного катиона, тем в более кислой области значений рН будет лежать вторая точка перегиба кривой.

Десорбция металлов с биомассы микроорганизмов.

Показано, что сорбированные металлы могут быть десорбированы с биомассы микроорганизмов.

Десорбция цветных металлов, молибдена, вольфрама и хрома происходила при значениях рН, неблагоприятных для сорбции этих металлов. Как и в случае ионообменных смол десорбция происходит за счет вытеснения ионов металлов из центров связывания протонами или гидроксил-ионами.

Так, эффективность десорбции цветных металлов (Си, Сс1, Zn, н N1) растворами 1 N серной и соляной кислот достигала 97-99%.

Процесс десорбции молибдена начинался при рН раствора 3-4, а_ при рН 8-10 адсорбированный биомассой молибден практически

полностью переходит в раствор. Хром и вольфрам также полностью десорбируются с биомассы микрооргашимов в щелочной области значений рН. В качестве десорбирующих агентов использовались растворы ЫаОН (рН 10), 0,5 М Ыа2С03 и (ЫН4)2С03. Наилучшие результаты были получены при использовании 0,5 М (ЫН^гСОз.

При сорбции серебра происходило образование прочных комплексов с сульфгидрильными функциональными группами биополимеров, поэтому применение в качестве десорбентов растворов кислот было неэффективным. При использовании растворов аммиака или карбоната аммония серебро легко десорбировалось с биомассы микроорганизмов в виде аммиачных комплексов [Лд(ЫНз)2]+, при этом эффективность десорбции достигала 99,5%.

В случае восстановления благородных меаллов до металлического состояния их извлечение предполагается проводить после сжигания биомассы.

Динамика сорбции металлов биомассой микроорганизмов.

При сорбции Мо, Сг, Ад, Бс, У, Ъг\, Сс1, и N1 биомассой различных микроорганизмов наибольшая скорость процесса наблюдалась в первые 15-20 минут (при этом, наступало практически полное насыщение биомассы), затем, скорость была незначительной. Таким образом, биосорбция металла характеризуется благоприятной динамикой процесса.

Изотермы сорбции' металлов биомассой микроорганизмов.

Показано, что количество сорбированных металлов увеличивалось

с ростом их концентрации в растворе. Для большинства случаев сумма

квадратов отклонений, полученная при аппроксимации

экспериментальных данных уравнением Лэнгмюра, значительно

меньше, чем при аппроксимации уравнением Фрейндлиха. Таким

образом, изотермы сорбции изученных металлов биомассой

микроорганизмов могут быть описаны уравнением Лэнгмюра: (}т-С

() - —-где О - емкость сорбента при концентрации Ссч , От -

С*,

максимальная емкость сорбента, Спч - равновесная концентрация и К5 -константа полунасыщения.

Изотермой назыиа/от зависимость сорбции от концентрации металлов в растворе при прочих постоянных условиях.

Параметры уравнения Лэнгмюра составили: для Ag: Qm 7,4-22,0 мг/r, К, 0,0-2,1 мг/л; для Se: Qm 2,3-10,5 мг/г, Ks 0,18-0,02 мг/л; для Mo: Qm 125-190 мг/г, К, 11-180 мг/л; для Cr Qm 35-65 мг/г, Ks 150-400 мг/л.

Как будет показано ниже, значительную роль в связывании серебра и скандия играют процессы хемосорбции, для которых характерна высокая специфичность связывания металлов, что и определяет низкие значения Ks.

Для понимания механизмов взаимодействия микроорганизмов с металлами важно было количественно оценить различия в способности отдельных клеток сорбировать металлы, а также определить связь с элементным составом клеток, параметром, связанным с их физиологическим состоянием, с сорбционной емкостью. В качестве модельного организма была выбрана культура С. utilis, которая является традиционным объектом, для изучения влияния тяжелых металлов на микроорганизмы.

Было установлено, что в клетках с неповрежденной ЦПМ РЗЭ (Se, Y, La, Sm) связываются поверхностными структурами. Сорбция РЗЭ поверхностными структурами клеток дрожжей становилась заметной с появлением в растворе гидролизованных ионов металлов и отсутствовала при значениях рН ниже 4,5.

Сравнительное изучение тонких срезов дрожжевых клеток до и после сорбции лантана методами просвечивающей электронной микроскопии и рентгеновского микроанализа показало, что аккумуляция лантана клетками дрожжей при рН 7,0 происходила главным образом в пределах маннапового слоя клеточных стенок и на их внешних поверхностях. При этом отложения лантана состояли из мелких {5-50 нм) игольчатых кристаллов.

В наших экспериментах редкоземельные элементы не оказывали повреждающего действия на ЦПМ дрожжевых клеток. Поэтому для изучения характера сорбции РЗЭ клетками с поврежденной ЦПМ клетки С. utilis обрабатывали 40% раствором этанола. Такие клетки сорбировали РЗЭ уже при pli 0,5. Поскольку в кислой среде сорбции

РЗЭ клеточными поверхностными структурами не происходило, то в данном случае имела место только внутриклеточная сорбция.

Изучение тонких срезов показало, что при рН 7,0 аккумуляция лантана клетками С. и(Шв с нарушенной проницаемостью ЦПМ происходила в основном внутриклеточно, в результате чего цитоплазма приобрела зернистую структуру. Наблюдались также отложения лантана на внешней и внутренней поверхностях клеточной стенки и в периплазме.

Корреляционный анализ показал существование прямой зависимости между количеством сорбированных РЗЭ и содержанием фосфора в клетках С. иНИэ с нарушенной проницаемостью ЦПМ (Табл. 1). Количество РЗЭ, сорбированных как из кислых, так и из нейтральных растворов возрастало с увеличением содержания фосфора в клетках дрожжей, обработанных зтанолом. Зависимость между количеством сорбированных РЗЭ и содержанием фосфора в клетках С. и(Шз с ненарушенной ЦПМ отсутствует.

Коэффициенты корреляции между содержанием серы в клетках и сорбированными РЗЭ, хотя и ниже, чем таковые между содержанием фосфора и РЗЭ, все же достигают значений 0,86-0,88 (табл. 1). Однако при обработке клеток 40% этанолом появляется связь между содержанием фосфора и серы (коэффициенты корреляции составляют 0,86-0,91). Для того чтобы установить, насколько связь между •содержанием серы и фосфора влияет на связь между этими элементами и количеством сорбированных РЗЭ, были вычислены частные коэффициенты корреляции [Зайцев, 1973] (Табл. 1). Частные коэффициенты корреляции между содержанием серы и РЗЭ составляют от -0,02 до 0,36, в то время как между содержанием фосфора и РЗЭ, 0,74-0,99. Таким образом, можно предположить, что в этих случаях связь между серой и РЗЭ обусловлена главным образом связью серы и фосфора.

Кроме того, при выдерживании клеток в растворе с низкими значениями рН, а также при сорбции РЗЭ при рН = 2,0, устойчивость связи между содержанием серы и фосфора в клетках ослабевает, и коэффициенты корреляции снижаются с 0,91 до 0,85 в контроле, и с 0,88 до 0,38-0,40 при сорбции лантана и скандия. В то же время, корреляция между содержанием фосфора и РЗЭ не снижается.

Совершенно очевидно, что РЗЭ взаимодействуют с фосфатсодержащими соединениями дрожжевых клеток, такими как фосфаты, полифосфаты, нуклеиновые кислоты, фосфолипиды, фосфорилированные полисахариды.

Изучение сорбции железа (III) и алюминия показало, что механизм их связывания клетками С. иМ« тот же, что и в случае РЗЭ. Сорбция железа (III) клетками дрожжей с неповрежденной ЦПМ происходит при значениях рН выше 1,6-1,7, а алюминия при рН выше 4. Клетки, обработанные этанолом, сорбировали железо (III) уже при рН = 0,5, в то время как алюминий слабо сорбировался при рН 2,0 и не сорбировался при рН = 0,5.

Как видно из таблицы 1, при сорбции железа и алюминия из кислых растворов клетками с поврежденной ЦПМ наблюдается высокая корреляция между содержанием фосфора и количеством сорбированных металлов.

При исследовании1 тотальных препаратов методом электронной микроскопии обнаружено, что сорбция серебра из азотнокислых растворов сопровождалась образованием серебросодержащих гранул, как связанных с клетками, так и находящихся между ними. Размер гранул варьировал от 0,01 до 0,25 мкм. Методом рентгеновского микроанализа в большинстве гранул обнаружено только серебро, хотя и имеются гранулы состава Ад-Б и Ад-С1.

На тонких неконтрастированных срезах клеток С. иИНя, сорбировавших серебро, хорошо видны многочисленные электроноплотные гранулы, располагающиеся во внутриклеточном пространстве, в пределах и на поверхности клеточной стенки. Размер гранул варьировал от 0,001 до 0,15 мкм. С помощью рентгеновского микроанализа показано, что гранулы содержат серебро.

Проведенные эксперименты по биосорбции серебра в динамических условиях показали, что его трансформация до металлического состояния сопровождается высвобождением активных центров связывания.

Таблица 1. Коэффициенты корреляции между количеством сорбированных металлов и содержанием фосфора и серы в клетках С. иННв.

Условия сорбции Вариант обработки Коэффициенты корреляции Частные коэффициенты корреляции

Р : РЗЭ в : РЗЭ Р : в Р : Ме -Б Э : Ме -Р

рН = 7,0 (Контроль) — — — 0.09 — —

рН = 7,0 40% этанол — — 0.91 — —

рН = 2,0 40% этанол — — 0,85 — —

Бс 0,5 тМ, рН = 5,0 — 0,10 0,05 0,58 — —

Бс 0,5 тМ, рН = 5,0 40% этанол 0,99 0,88 0,86 0,94 0,36

Бс 0,5 шМ, рН = 2,0 40% этанол 0,99 0,39 0,40 0,87 0,21

и 0,5 тМ, рН = 7,0 — 0,32 0,13 0,29 — —

Ьа 0,5 тМ, рН = 7,0 40% этанол 0,87 0,85 0,88 0,77 0,10

1_а 0,5 тМ, рН = 2,0 40% этанол 0,95 0,12 0,38 0,99 -0,02

Бт 0,5 тМ, рН = 7,0 — 0,24 0,18 0,08 — —

Бт 0,5 тМ, рН = 7,0 40% этанол 0,98 0,89 0,88 0,74 0,20

У 0,5 тМ, рН = 7,0 40% этанол 0,08 0,15 0,22 — —

У 0,5 тМ, рН = 2,0 40% этанол 0,96 0,38 0,42 0,93 0,09

Ре 0,5 гаМ, рН = 2,0 — 0,12 0,24 0,53 — —

Ре 0,5 тМ, рН=1,0 40% этанол 0,95 0,90 0,93 0,79 -0,18

А1 5,0 тМ, рН = 2,0 40% этанол 0,88 0,40 0,38 0,86 -0,17

С) Критические значения коэффициентов корреляции при уровне значимости 0,05 и объеме выборки 30-35 клеток составляют 0,34-0,36 [Лакин, 1973].

При изучении в сканирующем микроскопе поверхность клеток С. ШШб, сорбировавших ртуть выглядит бугристой, наблюдается также расслоение клеточных стенок. На поверхности клеток видны многочисленные электроноплотные точки и пятна размером 0,02-0,2 мкм. Методом рентгеновского микроанализа установлено, что они содержат ртуть и серу и, по-видимому, представляют собой сульфид ртути.

Поверхность клеток дрожжей, сорбировавших золото, выглядит более ровной по сравнению с клетками, сорбировавшими ртуть. 1 l<i поверхности клеток также наблюдаются электроноплотные точки, хотя и в меньшем количестве, чем в предыдущем случае (при сорбции ртути). С помощью рентгеновского микроанализа показано, что эти точки содержат главным образом золото. По-видимому, золото в этих точках находится в восстановленном, металлическом состоянии.

Особенностью этих металлов является то, что они повреждают ЦПМ и легко проникают внутрь клеток. При этом сорбция серебра, золота и ртути сопровождалась снижением содержания фосфора и особенно калия в клетках. В то же время, содержание серы в клетках С. utilis при сорбции серебра и золота было выше на 15-44%, чем в соответствующем контроле, а при сорбции ртути - в 4 раза. По-видимому, сера связывается сорбированными металлами и удерживается в клетках.

Корреляционный анализ показал, что в большинстве случаев существует связь между содержанием серы в клетках Ch. vulgaris и С. utilis и количеством сорбированных металлов (табл. 2), а именно, количество сорбированных металлов растет с увеличением содержания серы в клетках.

При значительных потерях калия клетками С. utilis появляется связь между содержанием фосфора и серы (коэффициенты корреляции составляют 0,73-0,90). Оценить влияние этой связи на получаемые результаты позволяют приведенные в таблице 2 значения частных коэффициентов корреляции.

Зависимость сорбции серебра и золота элементов от содержания серы в клетках микроорганизмов также получает подтверждение при сравнении сорбционной способности клеток Ch. vulgaris и С. utilis. Клетки Ch. vulgaris, содержащие большее количество серы и фосфора, чем клетки С. utilis. также обладали и большей сорбционной емкостью.

Проведенные исследования позволили выделить два этапа связывания серебра, золота и ртути клетками микроорганизмов. На первом этапе происходит быстрое связывание металлов сульфгидрильными группами, а также, вероятно, за счет ионного обмена и хелатировапия. На втором этапе сорбированные металлы восстанавливаются до металлического состояния. Восстановление может происходить в результате взаимодействия с сульфгидрильными

группами либо с другими восстановленными соединениями клетки (например, компонентами дыхательной цепи).

Таблица 2. Коэффициенты корреляции между количеством сорбированных металлов и содержанием фосфора и сери в клетках С. utilis и Ch. vulgaris.

Микроорганизмы Концентрация металла Коэффициенты корреляции Частные коэффициенты корреляции

Р : Me S : Me Р : S Р : Me -S S : Me -Р

С. utilis Ад 30 мг/л 0,51 0,55 0,90 0,10 0,46

Нд 50 мг/л 0,63 0,91 0,74 -0,09 0,98

Аи 20 мг/л 0,19 0,43 0,70 -0,40 0,75

Ch. vulgaris Ад 5 мг/л 0,10 0,72 0,38 0,14 0,76

Ад 10 мг/л 0,24 0,60 0,21 0,02 0,60

Аи 10 мг/л 0,72 0,59 0,33 0,59 0,38

Изучение клеток С. иИИэ, сорбировавших молибден и вольфрам в сканирующем микроскопе показало, что поверхность клеток покрыта слоем электроноплотного аморфного материала. С помощью рентгеновского микроанализа установлено, что этот материал содержит Мо или и, очевидно имеет состав шМоОз • ПН2О или т\ЛЮз • ПН2О. Также показано, что сорбция молибдена и вольфрама сопровождается практически полной потерей клеточного калия, что свидетельствует о • повреждающем действии, молибдатов и вольфраматов на клеточные мембраны.

Изучение тонких неокрашенных срезов клеток С. иНПв, сорбировавших молибден и вольфрам, показало, что клетки дрожжей заполнены электроноплотным материалом. Причем отложений металлов не наблюдалось ни на поверхности клеточных стенок ни в их толще. Таким образом, можно сделать вывод, что при внутриклеточной сорбции происходит более прочное связывание этих металлов (по-видимому, за счет взаимодействия с фосфор- и серусодержащими соединениями), чем при сорбции на клеточной стенке.

Селективность биосочбции металлов.

Изучение селективности извлечения металлов проводили па модельных растворах, а также на сложных по составу технологических растворах.

Знание механизмов связывания различных групп металлов позволяет обеспечить высокую селективность биосорбционных процессов. Так, селективность извлечения металлов может быть основана на разнице оптимальных значений рН для биосорбции различных металлов.

При изучении влияния ионов металлов на биосорбцию молибдена показано, что Zn2 + , Cu2+, А13+ и Сг3+ при соотношении Мо/Ме в растворе равном 7-10 при рН 2,0 снижали емкость биомассы С. scottii только на 20-30%. В то время как Fe3+ и Cr(VI), сами сорбирующиеся при низких значениях рН, подавляли биосорбцию молибдена в значительной степени (рис. 4).

100

Рисунок 4. Влияние ионов металлов на сорбцию молибдена биомассой С. scottii.

о

Т ' ' I ' I 1 Г-1 I 1 I 1 г

0 2 4 6 8 10 12 14

Концентрация металлов, мМ

Разница оптимальных значений рН для биосорбции различных металлов позволяет разделять и близкие по свойствам металлы, например вольфрам от молибдена, скандий от РЗЭ и алюминия (при сорбции поверхностными структурами клеток).

Различная устойчивость фосфатных комплексов металлов позволяет разделять при биосорбции трехзарядные катионы (скандий от РЗЭ; РЗЭ от А13 + , Сг3 + ) и отделять их от большинства двухвалентных катионов.

Установлено, что селективность извлечения Ag, Аи и Нд обусловлена их высоким сродством к сульф гидр ильным группам и способностью легко восстанавливаться до элементного состояния.

На основе проведенных исследований были установлены условия, обеспечивающие селективность сорбции металлов, что позволило разработать и испытать технологические схемы извлечения молибдена, вольфрама, серебра и цветных металлов из промышленных растворов сложного состава и сточных вод.

Получение биосорбентов из биомассы микроорганизмов.

Для получения биосорбентов пригодных для использования в устройствах колоночного типа (традиционного сорбционного оборудования) были опробованы отходы миробиологической промышленности, а также биомасса кормовых дрожжей.

Разработка способов получения биосорбентов проводилась в двух направлениях:

1. Иммобилизация биомассы в полимерные носители.

2. Получение сухих гранулированных форм без применения

полимерных носителей.

Иммобилизацию биомассы проводили в полимерные носители следующих типов: полиакрилат, полистирол, полистирол гидрофилизированный глицидилметакрилатом, полиэтилен низкого давления, кератин.

Содержание биомассы в сорбентах на основе полиакрилата или полистирола достигало 60%. Увеличение содержания биомассы выше 50% приводило к снижению механической прочности биосорбентов. Максимальное количество биомассы (70%) удалось включить в матрицы на основе кератина и полиэтилена низкого давления. Полученные биосорбенты имели размер зерна 0,5-2 мм, удельный объем в воде 2,7-

3,3 см3/г, насыпную массу 0,4-0,8 г/ см3, сорбционно-обменную емкость по 0,1 N NaOH 0,38-0,9 мг-экв/г.

Получение гранулированных биосорбентов включало следующие этапы: 1) получение гранул размером 1-3 мм на шнековом прессе,

2) сушка гранул в аппарате кипящего слоя при температурах 85-105"С,

3) термоупрорчнение высушенных гранул при температуре 135-140 "С.

Гранулированные биосорбенты имели насыпную массу 0,37-0,42 г/см3 и удельный объем в воде 3,10-3,25 см3/г.

Полученные укрупненные партии (20 кг сухого веса) биосорбентов на основе мицелиальных отходов производства линкомицина, неомицина и рибоксина были использованы в заводских испытаниях по извлечению серебра (Щелковский завод ВДМ), молибдена и вольфрама (НПО «Гранат») и цветных металлов - Zn, Cd и Ni (машиностроительный завод им. М.В.Хруничева).

Укрупненные испытания биосорбционного способа извлечения молибдена и вольфрама из производственных растворов.

В испытаниях использовали производственные растворы ПО «Гранат». Разработанная совместно со специалистами МИСиС технологическая схема предусматривает осаждение основной массы молибдатов и вольфраматов раствором хлористого кальция и последующее биосорбционное извлечение металлов. Содержание молибдена в растворе, поступавшем в сорбционную колонку, составляло 0,3-0,5 г/л, вольфрама 0,02 г/л, кальция 4,8 г/л, натрия 29 г/л. Применение стандартных ионообменных смол для извлечения молибдена и вольфрама из этих растворов было мало эффективным из-за их недостаточной селективности.

В качестве сорбентов использовали гранулированную биомассу Act. roscolus и биомассу Sacchaiomyccs ccrcvisiac ("S. carlsbcrgcnsis"), иммобилизованную в носитель на основе триэтиленгликоль-метакрилата. Уровень извлечения молибдена из раствора достигал 9598%, вольфрама - 99,9%.

После элюирования металлов с биосорбентов из десорбата молибден и вольфрам осаждали раствором хлористого кальция. В результате получен концентрат, содержащий до 47% Мо, 6% W и 22% Са, который может быть использован как легирующая добавка в металлургической промышленности.

Извлечение серебра из производственных растворов Щелковского завода вторичных 'драгоценных металлов.

Эта часть работы была выполнена совместно с МИСиС. Использовали технологический раствор следующего состава: 83 мг Ад/л, 190 г Си/л, 5 г Sn/л, 5 г Cd/л, 5 г Zn/л, 10 г Ni/л, 5 г HNC>3/a (pH 1,0). Существующими традиционными методами серебро из растворов такого сложного состава не извлекается. Биосорбцию проводили в колонках заполненных гранулированной биомассой Act. rosaolus. Уровень извлечения серебра достигал 99,8%, при этом остальные металлы, присутствующие в растворе, не сорбировались.

Таким образом, наблюдается крайне высокая селективность процесса биосорбции, на что указывает вычисленный коэффициент разделения серебра и меди (КАя/си = KpAq/Kpcu. где КрАд и КрСи -коэффициенты распределения соответствующих металлов), который составил 4,2- 106. Селективность биосорбента в данном случае во много раз превосходит селективность ионообменных смол по отношению к благородным металлам.

Очистка промышленных сточных вод от кадмия и никеля.

Укрупненные испытаний биосорбционных методов очистки сточных вод гальванического производтва на заовде им. М.В. Хруничева проводили совместно со специалиствами ВНИИХТ и МИСиС. Очистке подвергали растворы, содержащие (мг/л) кадмия 33,2, никеля 53,4, кальция 50-150, магния 15-45. Наиболее эффективным сорбентом для тяжелых металлов оказалась гранулированная биомасса Act. fradiae. Уровень извлечения никеля и кадмия достигал 97,2 и 99,85% соответственно.

Сорбция кадмия и никеля эффективно протекала в присутствии катионов кальция и магния, а глубина извлечения резко возрастала в щелочной области значений pH. Это указывает на то, что наиболее целесообразно использовать биосорбционные методы ддя доочистки сточных вод после осаждения тяжелых металлов известью на станциях нейтрализации.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что способность сорбировать цветные, редкие, редкоземельные и благородные металлы присуща микроорганизмам, принадлежащим к различным систематическим группам. Сорбционная способность исследованных микроорганизмов определяется в большей мере их физиологическим состоянием (стадией роста, составом микробных клеток, целостностью ЦПМ), чем их систематической принадлежностью

2. Показано, что главными физико-химическими факторами влияющими на биосорбцию металлов являются величина рН, определяющая формы нахождения ионов металла в растворе и степень ионизации функциональных групп биополимеров, а также солевым составом раствора и концентрация сорбируемого элемента.

3. Биосорбция шестивалентных молибдена, вольфрама и хрома наиболее активно протекает в диапазоне рН 1,5-3,0, что связано с процессами протонизации и полимеризации анионов металлов. Показано, что биосорбция молибдена является сложным процессом, включающим сорбцию как его катионных, так и анионных форм, а также его частичное восстановление до пятивалентного состояния.

4. Биосорбция серебра, золота и ртути также происходит в широком диапазоне рН, увеличиваясь с ростом его значений. Проведенные исследования позволили выделить два этапа связывания серебра, золота и ртути клетками микроорганизмов. На первом этапе происходит быстрое связывание металлов сульфгидрильными группами, а также, за счет ионного обмена и хелатирования. На втором этапе сорбированные металлы восстанавливаются до металлического состояния. При этом трансформация серебра сопровождается высвобождением активных центров связывания.

5. Сорбируемость микроорганизмами катионов цветных металлов (цинка, кадмия и никеля) увеличивается с ростом рН и степени их гидролизованности.

6. Биосорбция катионов РЗЭ, Ре и А1 происходит в широком диапазоне значений рН и определяется как степенью их

гидролизованности, так и высокой устойчивостью образуемых комплексов с фосфорсодержищими биополимерами клеток микроорганизмов.

7. Выявлена высокая селективность биосорбционных процессов, которая обеспечивается с одной стороны разнообразием функциональных групп биополимеров, высокой удельной поверхностью микробной биомассы, и содержанием в ней соединений-восстановителей, и с другой стороны различной степенью гидролизованности, протонизированности чи полимеризованности сорбируемых ионов металлов, а также в их различным сродством к фосфатным и сульфгидрильным группам и способностью восстанавливаться до металлического состояния.

8. Разработаны способы получения биосорбентов методами иммобилизации в полимерные носители следующих типов: стирол- дивинилбензольные, глицидилметакрилатные, полиэтиленовые и кератиновые, а также методами грануляции биомассы без применения полимерных связующих.

9. Проведение укрупненных испытаний на машиностроительном заводе им. М.В. Хруничева, ПО «Гранат», Щелковском заводе вторичных драгоценных металлов и Московском заводе полиметаллов показало перспективность использования биосорбентов для селективного извлечения редких, редкоземельных и благородных металлов из сложных по составу растворов, для разделения близких по свойствам элементов (молибдена и вольфрама, РЗЭ), и для глубокой доочистки промышленых сточных вод от цветных металлов .

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кореневскпй А.А., Каравайко Г.И. Сорбция молибдена биомассой микроорганизмов. // Микробиология, 1993, т.62, № 4, С. 709-716.

2. Кореневский А.А., Сорокин В.В., Каравайко Г.И. Взаимодействие ионов серебра с клетками Candida utilis. // Микробиология, 1993, т.62, № 6. С.1085-1091.

3. Кореневский А.А., Сорокин В.В., Каравайко Г.И. Взаимодействие ионов редкоземельных элементов с клетками Candida utilis. // Микробиология, 1997, т.66, № 2 , С. 198-205.

4. Karavaiko G.I., Kareva A.S., Avakian Z.A., Zakharova V.I., and Korenevsky A.A. Biosorption of scandium and yttrium from solutions. // Biotechnology Letters, 1996, V.18, P. 1291-1296.

5. Каравайко Г.И., Авакян ЗА., Карева. А.С., Захарова В.И., Хайрулина Р.Т., Романцева Т.Н., Кореневский А.А., Мешин В.В., Устинов В.К., Фролов А.И., Фомичев Ю.А. // Способ извлечения скандия из разбавленных растворов. Заявка No 4706787.31-13, положит, решение от 28.12.90.

6. Каравайко Г.И., Галицкая Н.Б., Авакян З.А., Кореневский А.А., Захарова В.И., Щербак В.В. // Способ получения твердых биосорбентов. // Заявка на патент No 92-015643/13061554, положит, решение от 23.06.94.

7. Кореневский А.А. Биосорбция цветных и благородных металлов. // Тезисы конференции "Очистка промышленных сточных вод и водоподготовка. С-Петербург, НПО "Радиевый институт", 1992

8. Каравайко Г.И., Авакян З.А., Кореневский А.А., Захарова В.И. Дмитриева Т.В., Бабина Ж.П., Петрик П.М. // Комбинированная технология извлечения металлов из производственных гальванических растворов с использованием биосорбентов на основе микробной биомассы. // Тезисы конференции "Очистка промышленных сточных вод и водоподготовка. С-Петербург, НПО "Радиевый институт", 1992

9. Korenevsky А.А., Karavaiko G.I. Adsorption of molybdenum by biomass of microorganisms. // Proc. of the V-th European Biotechnology congress, V. 1, P. 561-564, Copenhagen, Munksgaard, 1990.

10. Korenevsky A.A. Silver biosorption. // Proc. of the 4-th Int. Symp. on Biological processing of fossil fuels., 1993, Algero, Italy, EPRI, P. P-27-P-28.