Биосинтез нуклеиновых кислот в печени и коже при репаративной регенерации, его регуляции поликатионами, аналогами тимина и тимидина (экспериментальное исследование)

Силаева, Светлана Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биосинтез нуклеиновых кислот в печени и коже при репаративной регенерации, его регуляции поликатионами, аналогами тимина и тимидина (экспериментальное исследование)
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез нуклеиновых кислот в печени и коже при репаративной регенерации, его регуляции поликатионами, аналогами тимина и тимидина (экспериментальное исследование)"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ им. И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи УДК: 677.213.6: 678.745.2: 547.854.4i 591.82: 616.38

СИЛАЕВА Светлана Алексеевна

БИОСИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В ПЕЧЕНИ

И КОЖЕ ПРИ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ, ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ ПОЛИКАТИОНАМИ, АНАЛОГАМИ ТИМИНА И ТИМИДИНА

(экспериментальное исследование) (03.00.04 — биохимия)

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва —

1 992

Работа выполнена в Московской медицинской академии имени И. М. Сеченова

Научный консультант — заведующий кафедрой биохимии ММА, доктор биологических наук, профессор А. Я. Николаев

Официальные оппоненты:

— доктор биологических наук О. Ю. Абакумова

— доктор медицинских наук, профессор Т. Д. Большакова

— доктор медицинских наук, профессор Р. Т. Тогузов

Ведущая организация — Университет дружбы народов им. Патриса Лумумбы

Защита диссертации состоится « > ^¿^¿¿.ф^Е- 199 ¿^ г. в 14 часов на заседании специализированного совета Д 074.05.10 при Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова по адресу: 119881, Москва, Б. Пироговская, д. 2/6

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова по адресу: 119811, Москва, Зубовский бульвар, д. 37/1

Диссертация разослана «

Ученый секретарь специализированного совета, к.м.н.

А. Ю. Миронов

..•г,'.

f V !*.". - " ■ '•1 i' ; •5 . ■* '•" 1 •■ •

___...^'„.j i

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. У эукариот репаративная регенерация является универсальным процессом, _ обуславливающим воостановдение органов и тканей после воздействия разного рода повреждающих факторов: травм, ранений, контакта с инфекциями и рдами, а также частичной резекции (Воронцова H.A., 1953; Полежаев Л.В., 1966-1982; Лиознер Л.Д., 19701900; Карлсон Б.П., 1988; Губский Ю.И., 1989; Солопаав Б.II., 1980-1990). Сроки заживления 'зависят от продолжительности воспалительной фазы и интенсивности последующей регенерации, а ходе которой усиливается"биосинтез нуклеиновых кислот (ПК) и белков. В зависимости от природы пораженного органа, этиологии поражения, возраста организма и времени посла нанесения травмы осуществляются следующие типы восстановительных процессов:

1. репликация, рост и деление клеток, обеспечивающие заполнение области повреждении жизнеспособной, специфической тканЬ»;

2. репликация, транскрипция и трансляция, не сопровождающиеся делением клеток, но формирующие популяции полиплоидных, гипертрофированных клеток;

3. из-за низкой пролиферативной потенции :пвциализированных клеток миграция В' область повреждения [тбробластов, их рост и деление, приводящие к заполнению 'частка дефзкта соединительной тканью.

Под влиянием стимулов, побуждающих клетки к Фолиферации, изменяется экспрессия десятков, а может бигь, I сотен генов. Уменьшается количество ткакоспацифкчвских '.олхов и появляются белки и Ферменты, характерный длл ыстрорастущих, о частности, эмбриональных клеток (Гуднни 1., 1968; Нейфах A.A., Тимофеева М.Я., 1970; Гайихики B.C., 960; Георгиев Г.П., 198Э). Возрастает число клеток, ступающих в öi- и S-фаэи клеточного цикля, увеличивается ранскрипционная активность хроматине, сиит«чнруич-сй Ленки и

. ферменты, участвующие в репликации ДНК. •Наблюдается тесная корреляция мехду активностью некоторых ферментов, ответственных за формирование "нутриклеточного фонда дезоксинуклеотидов: тимидинкиназы (ТК) /КФ 2.7.1.21/, НДФ-редуктазы (рибонуклеотидредуктазы (PHP) /КФ 1.17.4.1/, тимидилатсинтазы (ТС) /КФ 2.1.1.45/ и некоторых других, и скоростью синтеза ДНК. Благодаря чему возникает возможность, изменяя активность этих Ферментов в тканях, регулировать биос нтез ДНК, а, измеряя уровень активности, судить о количестве клеток, находящихся в S-фазе (Reichard Р., 1973; Bnnerga R., 1Э76; Комар В.Е., 1980; Колларова М., Лабудова

0.. 1991).

Наиболее объективную картину изменений ДНК в этих случаях дает не столько оценка синтеза суммарной ДНК клетки, но вклад в этот процесс каждой из ДНК-синтезирующих органелл: ядер и митохондрий. Расширение наших знаний об особенностях синтеза НК в ядрах И митохондриях позволит:

1. вести направленный поиск препаратов, которые могут влиять ' на протекание процессов, лежащих в основе продукции

энергии, роста и деления клеток;

2. помочь в изучении молекулярных механизмов действия

г репаратов, которые ухе используются как лекарства или предложены для внедрения в медицинскую практику;

3. более эффективно использовать регенерирующую ткань как

модель для оценки антипролиферативного действия соединений, способных Емешиваться в протекание матричных биосинтезов, таки." как структурные аналоги компонентов НК или поликатионы.

Цель работы. Изучить особенности синтеза нуклеиновых кислот в ходе ропаративной регенерации печени после операции частичной гелатэктомии (ЧГЭ) или токсичного поракония CC1« a полнослойной кожной раны.

Исследовать действие некоторых аналогов тимина у тимилина, природных и синтетического поликатионов не матричные, биосинтезы в хлотках печени и грануляционной

ткани. Выяснить перспективность использовании этик препаратов в регуляции репаративных процессов в исследуышх тканях, для некоторых из них разработать возможные направления использования. Основные задачи:

1. Изучить динамику и особенности синтеза нуклеиновых кислот

в клетках и субклеточных органеллах паренхимы печени и кожной раны в ходе репаративной регенерации.

2. Выяснить взаимосвязь пожду активностью ядирных и

митохондриальных ТК, PHP и нуклеозидфосфотрансферааы /НФТ/ и синтезом ядерной и митохондриальной ДНК в процессе регенерации печени.

3. Определить возможность использования теста на ТК и Hi,T is

сыворотке крови , для оценки интенсивности репаративных процессов у животных посла нанесения травмы и у людей с воспалительными заболеваниями. .

4. IIa модели регенерирующей печени изучить антирепликатиьную

активность новых Фторпиримидинов, яелямщихсг! структурными аналогами тимина и тимидина.

5. Исследовать влияние 4-мотилурацила (4-МУ) - структурного

аналога тимина на процесс восстановления печени по^ло поражения тетрахлорметаном и заживление кожных ран, выявить причины противовоспалительного и

ранозаживляющего действия этого лекарства.

6. В опытах in vivo и in vitro изучить влияние стурннсв Л

и В щелочных белков из класса прптвнипов,

синтетического аналога протаминов - чвтвер-ичной аммонийной соли олигомера-25 конидиня /ЧАС О 2ъ К/ и мышечного дипептида - карноэина на реппрчтивни« прописки в печени и кожных ранах. Научная новизна. 1. На ранних сроках заживления в кожной рана и регенерирующей печени обнаружено усиленно

митохондриогенеза.

2. В ядрах и митохондриях изучены локализация и свойства

PUP, ТК и НФТ печени крыс. Показана взаимосвязь меаду активностью этих Ферментов и синтезом ядерной и иитохондриальной ДНК.

3. Исследованы изоформы ТК и НФТ ядерного, митохондриалыюго

и цитоплаэматического происхождения, обнаружена корреляция между скоростью роста ткани и активностью отдельных изоформ.

4. Г юказана гипотеза о существовании в ядрах и митохондриях

механизма синтеза дезоксинуклеотидов, способного хотя 6ii частично, удовлетворить потребность ропликации яДНК l¡ мтДНК в субстратах. . •

5. Исследована возможность использования тоста на ТК и НФТ ti

сыворотке крови для оценки интенсивности репаративны;: процессов у животных после частичной резекции печени> нанесения кожных ран и у людей с воспалительным!! заболеваниями. Установлено, что динамика изменений активности ТК более информативна и позволяет оценить эффективность используемых методов коррекции состояния больного.

в. Изучен механизм действия некоторых новых аналогов тимина •■ тимидина, поликатионов природного (стуршш Л и В) и синтетического (ЧЛС 0-25 К) происхождения на метаболизм [(К и репаративные процессы в исследуемих тканях. 7. В опытах in vivo и in vitro обнаружена юисокая и практически одинаковая антноксидантнап активность 4-1!У н карноэина, защищающая ткани от активных форм кислорода и перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах. Высказана гипотеза, объясняющая разную способность эти;; веществ стимулировать восстановительные процессы и поврежденных тканях. В. Для лечения ран разработан состав губок и пленок на основе коллагена и карнозина или коллагена и ЧАС 0-25 К. Полученныо лекарственные формг более эффективно, чйн испольчуомые в клинике "г.обутек" или "кэтуракоя" сокращают время заживлении ран.

Практическая значимость. Выполненная работа писвнцвпа исследованию синтеза ПК в ходе репаративной регенерации тканей у животных. На двух моделях (печень и коха) исследована связь между интесивностью синтеза ДИК и Формированием фонда дезоксирибонуклеотидов в ядрах и митохондриях. Сформулировано положение о том, что в этих органеллах существует Ьамостоятелышй механизм образования дПТФ, который сблегчзет и ускоряет синтез новых молекул яД!1К , и мтДНК. Позхе эти данные били подтверхдени и получили дальнейиоо развитие в работах зарубежных и отечественных авторов при выяснении строения ядерного репликативиого комплекса и синтеза мтДНК (Cheng J.-С., 1970; Иотлох H.H., 1078; Куниц Е.В., 1904; Кравецкая Т.П., 1905; Matheus O.K., 10BG; Клойиер Ii., 1038; Крутиков В.M., 1989).

Изучении изменений в активности сывороточной ТК в ходе рогонорации печени у крыс после ЧГЭ и у людей в процессе дотация и стационара воспалительных заболеваний внутренних органоп стало основанием для вывода о том, что определение активности этого форнента может служить ценным показателем интенсивности пролиферативных процессов в тканях человека и ■ ÄiicoTmix, позволяет судить об эффективности используемой методик!: коррекции состояния больного. Эта научная р/чэцаботкл «мл-* ноиол ьэоваиа в Донецком. медицинском институт« и ряде клиник Украины для дифференциальнсй .'•(•■агностики онкологических заболеваний яелудочно- книачног'о трлкта (i:op3C!!i:o С.Г., 10П9-10Я2).

Для некоторых аналогов тпмина, тммидина и поликатиоиоц установлены цовыа -iicxTU, способные илинть на нр.т^соы р-н^фатмвного аосстг-човяения в исслодуеных тканях Так, дал поликатиона - ЧАС 0-25 К наряду с ашигепаринапюй •»кл иьноетьи новое свойство синхронизировать

матричные Сносинтьиы, а в траомиронлнных органах стимулировать транскрипцию, репликацию и попшяпг»-кптотичоскпЯ и ¡¡до. к г., ускоряя заживление «ихних p-iii, носстановленив печени после частичной резекции иди токсического пораженич. Способность ускорять реплр,! гнышм

процессы в поврежденных тканях била исследована длл -4-IJ/ и карнозина. Полученные данные позволили разработать для лечения ран оригинальные композиции пленок и губок на основе коллагена и ЧАС 0-25 К или коллагена и карнозина /получены приорететные справки на изобретения/, которцо способны на 30-35% сокращать сроки окончательной эпителизации ран по сравнению с коллагеновой губкой "кобутек" и на 15.52 по сравнению с губкой "метуракол".

Г фобация работы. Результаты работы докладывались на II Всесоюзном биохимическом съезде (Ташкент, 1969 г.), II Всесоюзн .ом симпозиуме по медицинской знзимологии (Душанбе, 1974 г.), III симпозиуме Советского биохимического общества и биохимического общества ГДР по регуляции клеточного метаболизма (ГДР, Рейнгардсбрунн, 1975 г.), Всесоюзном симпозиуме по медицинской знзимологии (Махачкала, 1986 г.), симпозиуме биохимических обществ СССР-НРБ (София, 1987 г.), III Всесоюзной конференции "Биоантиоксмдант" (Москва, 1909 г.,'), I Всесоюзной конференции "Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств" (Москва, 1989 г.), IV Всесоюзной съезде патофизиологов (Кишинев., 1980 г.). Всесоюзной конференции по местному лечению ран (Москва, 1991 г.). Всесоюзной конференции "Карноэин: биологическая роль и" применение в медицине" (Москва, 1Я92 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 32 работы и оформлены 3 изобретения.

Вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, методических подходов и обобщении полученных результатов. В работах, . выполненных в соавторстве, вклад автора заключается в непосредственной участии на всех этапах исследования от постановки задачи и эксперимента до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах.

Поло&ония, лмпосимив ла защиту.

1. Усиление иитохондриогенеза в регенерирующих тканях на

ранних сроках поело ЧГЭ или нанесения кожной рани.

2. Существование в ядрах и митохондриях механизма синтеза

дезоксирибонуклеотидов из нуклеозидов и рибонуклеотидоа.

3. Присутствие ТК и НФТ и ядрах и цитоплазме п нескольких

молекулярных формам, активность которых зависит от пролиферативной активности ткани.

4. Возможность определения активности ТК в сыворотке крови

для оценки интенсивности пролиферативных процессов в организме и как тост на эффективность методов коррекции состояния больного.

5. Способность некоторых аналогов тимина, тимидина,

карноэина, поликатионов (стуринов А и В, ЧАС 0-25 К) регулировать репаративную регенерацию кожи и печени. Возможные механизмы нх действия.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Динамика и особенности синтеза нуклсиноных кислот в печени и кожо в ходе репаратипной регенерации.

Репаративноо постановление травмированных органон включает три основные фазы: воспаление, регенерацию и реорганизацию рубца (Саркисов Д.С., 1981). Для наружных и внутренних органов продолжительность фаз и интеисиыюегь характерных для них процессов имеют значительные различии. Так, для печени свойственна, очень высокая peí ннер.щноннда способность. Через несколько часов поело химического повреждения паренхимы СС1* (Губский Ю.И., 1939; Соломаов Б.П. , 1990) или резекция 2/3 массы но методу Хиггииса и Андерсона (Higgins G.H., Anderson R.M., 10Э1) в iепагоцигих неповрежденной части органа обнаруживаются прн'лнки пролиферативной фазы: увеличиваются размеры ядер и ядрышек, в цитоплазме нарастает число рибосом и полисом (Mtenaai1 U.J. .Confer .D.H., 19П8), усиливается синтез WIK и ьвчкоь

(Пнапн К.н. et al, 1974). В точение 1-го и 2-го дня после операции клетки паренхимы печени синтезируют ДНК и делятся (Cater D.B. et al, 195B; Siupson G.E.C., 1963; Намкория Т.Г., 1985). Позднее число митозов резко снижается и основным механизмом увеличения массы органа становится клеточная гипертрофия и полиплоидия (Сидорова В.Ф., 1966; •Рябинина З.Д., 1964; Бродский В.Я., Урываева И.В., 1961). Полное восстановление массы v органа завершается к 7-9 сут» IM.

Заживление кожных ран проходит через довольно продолжительную воспалительную фазу (с 1 по 4-5 сутки), в течение которой идет разрушение ■и удаление из зоны повреждения некротиэированной ткани и патогенной микрофлоры (Peacock Е.Е., van Winkle W., 1970; Чернух E.E., 1979; Кузин H.H. , Шимкевич Л.Л., 1981). Ведущую роль В'этом процессе -i- играют лейкоциты, моноциты и макрофаги (Паянский Ä.H.,

Мапнский Д.П., 1989). Пролиферация начинается только поело того, как продукты разрушения ткани будут удалены (Карлсон D.H., 1906). Основными клетками,обеспечивающими формирование нопой грануляционной ткани, являются фибробласты,. количество которых в ране нарастает. Начиная со 2-х суток, оно прои ходит за счет миграции из стенок сосудов эндотелнальлых и адвонтициальных клеток, а также за счет пролиферации и увеличения числа мьуозов фибробластоо, уже имеющихся d ране (Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981; Ильина Т.Н., 1982). В этот период ткань характеризуется высокой способностью к синтезу ДНК, РНК и неколлаге-овых белков. Затем при продолжающемся синтезе РНК биосинтез ДНК приостанавливается, но активно идет синтез коллагена, некоторых белков и гликозамингликаноп межклеточного матрикса (Фенчин K.M., 1979; Ильина Т.Н., 1902). Грануляционная ткань уплотняется и наступает фаза рубцевания. Этот период характеризуется угасанием биосинтетических процессов, прогрессирующим уменьшением числа клеточных элементов на ед. глощади ткани и резорбцией "избыточного коллагена" (Shoshan S., 1979; Саркисов Д.С., 1981).

Особенности течения репаративных процессов наибонее подробно охарактеризовани с патологоанатомических и патофизиологических позиций. В биохимии это направленна исследований представлено довольно слабо. Исключение составляет цикл работ по изучению синтеза ДНК, РНК и белка в печени после ЧГЭ (Simpson Е.С., 1963; Бреслер В.М., 1969; Ниапа К.И., 1974). Но 'дане и в этом случае в начала 70-х годов, хогда было начато это исследование, практически на было сведений о вкладе в пролиферативный процесс каждой из ДНК-синтаэирующих органелл: ядер и митохондрий. В этой связи в настоящей работа была сделана попытка уточнить особенности синтеза нуклеиновых кислот в ядрах и.митохондриях двух типов тканей (паренхиматозной и соединительной) в зависимости от сроков посла нанесения травмы. Эксперименты были проьедины на беспородных белых крысах-самцах массой 180-200 г, которым проводили резекцию 2/3 печени по методу Хиггйнса и Андерсона, вызывали -экспериментальный гепатит под влиянием СС]-«( или наносили полнослойную кожную рану разнером 3 см2 в межлопаточной области. Результаты, биохимических

экспериментов сопоставляли и дополняли морфологическими и гистохимическими исследованиями тех же образцов ткани.

1.1 Синтез нуклеиновых кислот в процессе репаративной i регенерации кожных.ран.

Изучался процесс заживления кожных ран в интервала со 2-х по 11 сутки после нанесения травмы, охватывающий стадии воспаления и регенерации.. Морфологическое исследование изменений клеточного состава рано (рис. 1) показало, что в первые 7 суток наблюдается постепенное увеличение общего числа клеток на ед. площади ткани и нарастание содержания Фнбробяастов в клеточной популяции с 12Х на 2 -е сутки до ti2X к 7 суткам. Нл 2-е сутки содержание подимсрфноядарннх лейкоцитов в рано составляет 30 кл./вд. площади пш «о»ей 75% от общего количества клеток раневой ткани, а ни 3-й сутки их количество снижается примерно на 4ИХ, криви сл-.ц-эп.

Рис. 1. Общая клеточная плотность (1)г плотность фибробластов (2) .и полинорфно-ядерйых лейкоцитов (3) в грануляционной ткани заливающей рани.

По оси ординат: слева - общее число клеток на 1 ед. площади; справа - число фибробластов и полиморфноядерных лейкоцитов на 1 ед. площади. По оси абсцисс - с/тки после нанесения раны.

-I—I__1_1_I_1_[ .1 .1

13 4 } Ю II

Рис.2. Количественное содержание (1) и интенсивность включения Н3-тимидииа (2) л с ДНК грануляционной ткани заживающей раны

Здесь и на рис. 3 по оси ординат: справа -содержание ДНК в мг на 1 г ткани, слева-интенсивность включения Нэ-тикидина (в имп. на 1 мг ДНК в 1 мин). По оси абсцисс - сутки пес э нанесения раны.

клеточной плотности (рис. 1) существенно отличается от профиля кривой количественного содержания суммарной ДНК, на которой обнаруживается два максимума, приходящиеся на 3-й и 8-7 сутки (рис. 2). Зная состав клеток раневой ткани, нетрудно понять, что первый пик принадлежит клеткам воспалительного экссудата, мигрирующим в зону повреждения на

1-2 сутки после нанесенйя раны, а второй - ДНК фибробжастов, количество которых к 8-7 суткам доминирует среди других видов клеток. На 8-11 сутки плотность клеток в ед. площади и

содержание ДНК в г ткани снижаются, так . как клетки переключаются на синтез компонентов межклеточного матрикса: коллагена', гликопротеинов и протеогликанов. В результата 1-е сутки являются критической точкой, после' которой в грануляционной ткани биосинтез белков и полисахаридов начинает преобладать над пролиферативными процессами.

Нз результатов по включению Н3-тимидина в с ДНК гсмогонатов грануляционной ткани в расчете на 1 мг ДНК, приведенных на рис. 2, -видно, что кривая 2 имеет максимум на

2-3 сутки' и плавно снижается к 7-9 суткам. Она суммирует включение Н3-тимидина оо вса ДНК-синтезирующие органеллы и мало информативна. Для получения дополнительных сведений о динамике и интенсивности синтеза ядерной (я) и митохондрналыюй (мт) ДНК методом дифференциального центрифугирования из грануляционной ткани били поручены Фракции ядер и митохондрий. Как видно из рис. 3 кривая зависимости включения Нэ-тимидина в яДНК от срохов заживления прэдстазляат собой ломаную линию с тремя максимумами, приходящимися на 3,0 и 0 сутки. Характер кривой согласуется с морфометрическнми и радиоавтографичоскини данными о 3-х суточной периодичности в появлении максимумов синтеза ДНК и митозов в грануляционной ткани лабораторных животных (Дудникова Г.Ц., .1979; Орехов 0.0. , 1979) и указывает на синхронизацию определенной части Фиброблнстов в осуществлении процессов репликации и деления клаток.

J_I_1_1_1_I_1—1—1—I-

1 > I : I м I » ■

Рис. Э. Содержание я ДНК (1) в 1 г ткани и интенсивность включения Н3-тимидина в яДНК грануляционной ткани в процессе заживления ран.

По оси абсцисс - сутки после нанесения

Рис. 4. Количественное содержание и интенсивность включения С14-оротата в сРНК и яРНК грануляционной ткани р процессе заживления ран.

По оси ординат: справа- содержание РНК (в мг на 1 г ткани), слева - интенсивность включения С1'4-оротата (в имп. на 1 мг РНК в 1 мин). 1 - содержание сРНК;.? -включение С14-оротата в сРНК; 3 - содержание яРНК; 4 - включение С^-оротата в яРНК.

По оси раны.

абсцисс

- сутки посла

нанесения

Сопоставление интенсивности включения метки в сДИК и яДНК показывает, что даже в области максимумов Нэ-тикидин включается в яДНК значительно слабее, чем в сДКК гомогенатов. На 2-5 сутки после нанесения рани только 15-25* метки сДНК обусловлено синтезом яДНК, на 6-9 сутки вклад ядерного материала возрастает до Э4-41Х, а на 11-е сутки снова снижается до 22%."

Эти данные позволяют предположить, что в молодой . грануляционной ткани идет активный митохоидриогенеэ и связанный с ним интенсивный синтез мтДНК. Такое предположение кажется тем более оправданным, что в ятот период значительную часть клеточной популяции составляют юные фибробласты и макрофаги, для которых характерно высокое содержание митохондрий, обеспечивающих энергией фагоцитарные и синтетические процесси этих клеток.

Для проверки этого предположения во Фракции митохондрий определяли содержание мтДНК и интенсивность включения в нее Н3-тимидина. Из табл. 1 видно, что включение метки в мтДНК происходит в 8-15 раз более интенсивно, чем в яДНК, а макималыюе содержание мтДНК наблюдается на 4-5 сутки после нанесения раны <7.5-8.0* от всей ДИК клетки). К 7-м суткам со количество снижается примерно вдвое.

Полученные результаты подтверждают предполоаениа о существовании в молодой грануляционной ткани актирного митохондрио'генеэа, благодаря которому со 2-х по 5-е сутки в раненой ткани основное количество вводимого живопшм IIя-тимндина используется на синтез мтДНК.

Начало регенерации сопровождается усилением

транскрипционной активности клеток грануляционной ткани. Как видно из Pilo. -1, на кривых зависимости содержания с ГШ! н upiU'. от сроков ' после нанесения рани обнаруживаются пики, сднипупт относительно друг друга во прикопи на нйскпхько суток. Характер кривых свидетельствует о том, что при максимальном накоплении cFHK в гомогенате ткани содорданно лГПК становится минимальным. Последнее, видимо, обьнгнногсн выходом ¡:с.лекул зрелой П!К m ядра в иитопдапму Перми! ник

Таблица 1.

Количественное содержание и интенсивность включения нэ -тимидина в яДКК и мтДКК грануляционной ткани, выделенной в разные сроки после.нанесения раны

Сутки после занесения раны Включение нэ-ткэдкка Е Я ДНК Количество яДНК Включение нэ-тями-дина в ытДКХ Количество мтДКК Коэффициент мече ния, нмл. мтДНК имя. яДНК Количество иг ДНК от сДНК в X

число опытов ИМЯ. В МИН на 1мг ДНК число опытов м.тна 1г ткани число опытов ими. на 1мг ДНК а 1 мин число опытов шина 1г ткани

11 1054 13 533 . 4 8 794 5 68 8.3 Б. &

3 • 5 1653 9 465 • 4 12 247 3 73 7.3 5.6

4 6 932 7 429 3 10 043 - 3 78 10.8 7.6

5 9 955 7 520 4 7 839 3 ' 67 8.2 8.0

6 7 1342 а 660 3 11 016 3 65 15.5 3.4

7. - 9 743 12 557 3 7 383 . 3 67 5.5 ав

сРКК наблюдается на 5-6 сутки, а второй - на 10 сутки. Ь'о данным гистохимических и ультраструктурных исследований в это время в фибробласт^х усиливаются биосинтетическио процессы (Шехтер А.Б., 1984). Можно думать, что первый пик РНК обусловлен образованием РНК-матриц для биосинтеза белковых компонентов, протеогликанов и коллагена, накапливающихся в ткани* в этот период, а второй - активной продукции коллагеновой мРЛК. Этот вывод согласуется с данными других авторов (Слуцкий Л.И., 1969; Мазуров В.П., 1974; Parker H.I., 1982) и подтверждается результатами морфологического исследования, согласно которому на 9-10 сутки в грануляционной ткани наблюдается наибольшее

накопление коллагеновых волокон.

1.2 Синтез нуклеиновых кислот в печени после операции частичной гепатэктомии.

1 Изучение динамики изменений массы печени и количественного содержания ДНК в 1 г ткани после операции ЧГЭ по методу Хиггенса и Андерсона показало (рис. 5), что в хода регенерации масса органа быстро .увеличивается о течение первых 7-9 дней, а затем плавно и медленно нарастает, достигая постоянного значения к 40-м суткам. Так как ми работали с молодыми животными, то рост печени с 7-х по 40-а сутки, в течение которых вес органа практически уди=тваатся, очевидно, отражает возрастные изменения общей массы животного. Изменения содержания ДНК от времени обнаруживаю г два максимума на 3-й и 12-15-е сутки, указывая на то, что в печени исследуемых животных пролиферятивные процессы полностью угасают только через две недели после операции.

Поскольку посла ЧГЭ в гепатоцитах сшпеа ДНК и мнюзы происходят, главным образом, в первые 3-е суток, динамнкА синтеза ДНК в ядрах н митохондриях нямн иеследоналась и течение 50 часов после операции Из результатов, представленных на рис. В, видно, что в обоих огг^нмллмд

Рис. 5. Динамика изменений массы печени и содержания ДНК в течение 60 дней после ЧГЭ (удаляли 2/3 печени).

1 .---масса

2. --------содержание ДНК

И,-Л! 1С 2/™лн/мг мтДНК имп/мин/мг я ДНК

рис. 6. включение н3~т1/мид1шл ь яднк и мтднк е теченгн? 50 часов после чгэ. 1.-----я днк

мтДНК

синтез ДНК носит прерывистый характер. За этот период для яДНК наблюдается две волны включения Нэ-тимидина, максимум которых приходится на 20 и 44 часа поело операции. В области максимумов включение меченного предшественника в яДНК превышает его включение в ЯДНК интактных животных в 6-10 раз. Эти результаты согласуются с результатами других авторов, полученными на препаратах и гомогенатах печени (Ннапд K.M., 1974; Reichard Р., 1973; Bello L.I., 1974; Дэвидсон Да., 1976).

В синтозо итДНК обнаруживаются три максимума, наблюдающиеся на 12, 26 и 44 час после ЧГЭ. В области максимумов включение На-тнмидина в мтДНК в 3-5 раз превышает включение предпествениика в мтДНК интактной печени.

Частичная резекция • изменяет матричную активность хроматина гепатоцитов оставшейся части органа. Через в-8 часов поело операции синтез РНК увеличивается примерно на 45% по сравнению с контролем. Затем интенсивность включения С14-оготата в РНК снижается до значений меньших чем в нодмв, и второй пик транскрипции наблюдается через 35-38 часов после ЧГЭ. Полученные рзельтати подтверждают сведения литературы (Dusch 3, 19G2; Hwang K.M., 1074; Arany E., 1Ü91; Tcr.oaki 'Г., 1U01) о том, что одним из наиболее ранних отеотоц на пролиферптивный стимул является повышенно транскрипционной активности хроматина, которое предшествует репликации. При этом экспрессируются гсии, содержащие информацию о белках и Ферментах, участвующих в репликации, росте и делении клеток. К числу таких ферментов относятся PHP и ТК, за счет кооперативного действия которых синтез ДНК снабжается продЕсствоиннкани. Реакция, кпт&хизируомая ТК, представляет собой пусковой механизм, обеспечивающий увеличение концентрации дТТФ до уровня, стимулирующего перахоц PHP' !< конформационное состояние, в котором фермент осучсстэляот восстановление ГДФ и АДФ в дГДФ и ¿Allí. В этих условиях иэменспня активности ТК имеют более выраженный харикт«р, чем TG (Skoog K.L., 1973; Herzfeld А.. П)Ш); Th*l-\nr|<?r. I.. , 1985) .

Поскольку только наличие сбалансированного Фонда дНТФ делает клетку способной к репликации,ТО уровень активности ТК и PHP контролирует биосинтез ДНК и служит индикатором пролиферативной активности, ткани. Зная локализацию и свойства PHP и ТК можно следить и пытаться вмешиваться в течение репаративных процессов в травмированных органах.

II. Изучение локализации и свойств PHP, ТК, ПФТ ядер и митохондрий из интактной и проллферирующей тканой печени.

К началу 70-х годов в литературе не было однозначных сведений о том, как синтез яДНК и мтДНК обеспечивается предшественниками: существует в "ядрах и митохондриях самостоятельный механизм образования дНТФ или предшественники поступают в органеллы из цитоплазмы.

С другой стороны имелись многочисленные сообщения о ' ведущей роли ТК и PHP в формировании сбалансированного Фонда дезоксирибонуклеотйдов, размер которого лимитирует скорость синтеза ДНК'. Были описаны свойства цитоплазматических ТК и PHP из покоящихся, регенерирующих и опухолевых тканей (Ольшанецкая А.Д., 1968;,Harry G.L., 1870; Fujoka S., 1971; Hooper S., 19/2; Machovich R., 1972; Cossu G., 1979; Plafc.mann P.G.W., 1974; Reichard P., 1978). На присутствие этих ферментов в субклеточных органеллах указывала единственная работа А. Ларссон (Larsson А., 1969) об обнаружении РНР-азной активности в ядре и ряд публикаций о митохондриальных формах тимидинкиназы (Berk A.I., 1973; Reiler F., 1984; Kit S., 1973). Основное внимание было уделено строению ферментов, особенностям функционирования, связи активности с синтезом ДНК и делением (Feichard Р., 1976; Sjoberg В.H., 1977; Elford H.L., 1970; Hayfield I.E., 1974).

Для того, чтобы решить могут ли ДНК-синтезирующие органеллы создать самостоятельный фонд дНТФ, необходимо было выяснить следующие вопросы:

1. присутствуют ли в ядрах и митохондриях PHP, ТК, НТФ и как они локализованы в органеллах;

i. kb*{?sí¿ свойства этих ферментов и отличаются ли они от Ферментов цитоплазматическогс происхождения;

3, существует ли корреляция между активностью ядерных, митохоидриадышх PHP, НФТ, ТК и иитесивностью пролиферативных процессов в тканях.

' Первоначально было установлено присутствие PHP в субклеточных органеллах"саркомы М-1 крыс. Помимо цитоплазмы замотная активность фермента определялась в ядрах и митохондриях: 8.7 и 8.8Х соответственно от общей активности фермента в гомогенате. Интересно, что неочищенная ядерная фракция, осаждающаяся из гомогената ткани при 1000 хй, имела в 2-3 раза большую уд. активность: 0.4 - 0.6 нмоль дЦДФ в мин на мг балка, чом цигоплазматический фермент: 0.21 нмоль дЦД$ в мин на мг белка. В.ходе промывки целостность ядер не нарушалась, но активность Фермента снижалась в 6-8 раз, указывая на то, что цитоплазматический фермеит, видимо, распределен в цитозольном содержимом на равномерно и, по крайней мере, часть -его сосредоточена в зоне ядерной мембраны. Возможно ферментный белок удерживается на мембране слабыми связями, которые легко разрушаются а ходе очистки ядер. В Tose время часть ферментативной активности устойчиво определялась в ядерном содержимом и, очевидно, принадлежала собственно ядрам.

По модифицированному методу Катьяра (Katjare S.S., 1Й70) популяция митохондрий била разделена на фракции тнжолих и легких митохондрий, которые различались по ультраструкгурез, седиментационным характеристикам, набору и активности Ферментов, входящих в их состав.

Чтобы выяснить как влияет разная пролифераппжня активность клеток иа степень геторогенности и плотность частиц, были проведены эксперименты, в которых в линейном градиенте плотности сахарозы от 2.0 до 1.0 И изучали седиментограммы -суммарной митохондриальной популяции, тяжелой и легкой Фракций, полученных из клеток интиктмой почини и гопатомц 27.

Было показано, что митохондрии гепатомы имеют большую гетерогенность и меньшую плавучую плотность, чем митохондрии из печени взрослых животных:, максимум плавучей плотности митохондрий тяжелой фракции из гепатоцитов лекал в области 1.305 .И сахарозы, а из клеток гепатомы - при 1.602 М. Среди легких митохондрий, выделенных из интактной печени, частицы с плавучей плотностью менее 1.25 М сахарозы составляли 3-4Х, а в соответствующей Фракции из клеток гепатомы более 20Х.

Тяжелые митохондрии характеризовались интенсивным дыханием и окислительным фосфорилированием, способностью включать С^-аминокислоты в белки и С14-тимидин в ДНК, а легкие митохондрии были почти полностью лишены этих функций. В обоих подфракциях митохондрий определялись активности PHP и ТК, но в Фракции легких митохондрий они были существенно ниже, чем у тяжелых митохондрий. Полученные данные подтвердили высказанные в ряде публикаций предположения (Chin 1.1. , 1969; Katjare S.S., 1970; Ревич Г.Г., Озернюк Н.Д., 1976), что легкие митохондрии "представляют собой предшественники митохондриалыюго генеза. Они являются популяцией юных, несформированных полностью частиц, которые по мере включения в них растворимых митохондриальных белков и ерментов, синтезирующихся под контролем ядра на рибосомах, превращаются в зрелые, стабильные митохондрии тяжелой фракции, способные к генерации энергии, синтезу информационных макромолекул и делению. Кроме того, эти эксперименты показали, что малигниэация гепатоцита и превращение его в популяцию быстроразмножающихся клеток с высокой потребностью в энергии заставляет митохондрии гепатомы включаться в биосинтетические процессы раньше, чем они достигнут уровня зрелости, характерного для митохондрий гепатоцитов покоящейся ткани.

Из паренхиматозных клеток ' с разной степенью диФФеренцировки: интактной, регенерирующей печени, гепатомы 27 и асиитной гепатомы Зайделя получали фракции ядер, тяжелых, легких митохондрий, микросом и цитоплазматических

балков. В лизатах органелл и фракции растворимых белков определяли активность PHP и ТХ.

Из табл. 2 видно, что скорость образования дезоксирибоиукяеотидов в реакциях, катализируемых PHP и ТК , зависит от функционального состояния ткани и в субклеточных структурах быстрорастущих тканей протекает более интенсивно, чем в покоящейся ткани.'Из двух фракций митохондрий наиболее активно на изменения в скорости роста и деления клеток реагируют тяжелыо митохондрии.

Переход от покоящейся ткани к быстрорастущим сопровождается повышением уд. активности ТК в субклеточных органеллах в 2-3 раза, а PHP до 10 раз.

В условиях клеточной пролиферации происходит увеличение внутриядерного и анутримитохондриального фонда

деэоксинуклеотидов (Рович Г.Г., 1973). Поэтому тесная корреляция схорости роста ткани с активностью PHP и. ТК в ядрах и митохондриях очевидно свидетельствует о том, что предшественники синтеза ДНК, хотя бы частично, синтезируыся и самих органеллах.

Во Фракции микросом из клеток ннтактной печени активность исследуемых ферментов практически не определяется, по становится заметной в быстрорастущих тканях наряду с ростом активности зтих Ферментов в цитозояе и субклеточных структурах. Зная роль никросом в снабжении клетки белками, можно думать, что увеличение активности FHF и ТК а микросомальиой Фракции связано с их синтезом на рибосомах и последующим транспортом в ядра, митохондрии и цитоплазму.

При исследовании зависимости деэокситимидин-

фосфор'.1лнрующей активности ot природы доноров фосфата нам удалось показать, что цитоплазматическио белки печени способны катализировать реакцию образования д-TMi, утилизируя различные рибонуклеотиды: АТ1>, АДФ. AMi, ГТФ, ЦП, УТ 1>, УМ£ <см. табя'. 3). Добавки ЛТФ в- инкубационные пробы, где фосфорилирующим агентом является УКФ или All», резко снижают РЫХОД дТМФ.

Таблица 2.

Активность ядерных, митохондриальных и цитоплазматйческих ТК и PHP в тканях печени с различной

скоростью роста и деления клеток

Г-ракция Удельная активность ТК в нмоль -дТМФ/ мг белка, М+м Удельная активность PHP в нмоль дЦДФ/мг белка, М+м

интактнач печень регенерирующая печен ь гепатома -27 АГЗ интактная печень * регенерирующая печень гепатома -27 • АгЗ

белки 6.05±0.24 13.4+0.14 27.3±0.55 36. 4±0.55 0. 55±0.17 1.2±0.17 4. 9±0. 34 9. 2±D. 39

1.35*0.14 3. 3±0.08 0. ÖS±0. Ö03 0. 29±0.14

х/.тсхондрии "тдуйлые" 4.6±0.13 10. 0+0,21 8. 02±0. 21 4.13±0. 9 0.9±0.21 2. 7±0. 24 4. 4±0. 29 8. 7±0. 33

.'/:,:тохокдрии "легкие" 2. 53±0.23 5. 3+0.16 4. 73±0. 27 2. 8±0. 91 0. 5+0.14 1,1"±0. 28 2. 8+0. 24 6. 3±0. 41

;.!пкросомы Следы 1.1+0.19 9. 31+0.18 11. 0±0. 4. Следы . 0.08±0.027 12. 8±0. 93 Ю.'3±0. 3

м го

Полученные данные позволили предположить, что в клеткэх печени существуют два дт-фосфорилирующих фермента: тимидинкиназа, катализирующая образование дТМФ за счет переноса гамма-фосфатного остатка с АТФ на дТ, и НФТ, использующая в качестве доноров фосфата НМФ или НДФ. Тем более, что такой фермент обнаружен в некоторых тканях животных (Haley G.F., Haley F., 1969; Kit S., 1975).

Таблица 3.

Влияние донора фосфата на фосфорилирование дезокситимидиип цитоплазматической фракцией печени крыс

Донор фосфата 15 нМ

АТФ ГТФ УТФ ЦТФ АДФ АМФ УМФ

дТ-фосфорилирующая активность, нмоль дТМ-f на 1 мг белка. Mim

0.31 t 0.02 0.39 0.03 0.33 i. 0.03 0.40 t 0.04 0. 32 i. 0.02 0.20 t 0.02 0.35 i. 0.03

Новый дт-фосфорилируюций фермент реагировал на пролиферативный стимул подбно PHP и ТК: так, в оставшейся доле печени через 20 час после ЧГЭ его активность увеличивалась более чем в 2.5 раза по сравнению с контролем и появлялась в микросомальной Фракции. Эти результат явились косвенным доказательством того, что НФТ, как PHP и ТХ, представляет собой индуцируемый фермент, которой в условиях поступления пролифератиьного сигнала вносит определенный рклад в пополнение фонда да ioki инншдилс>ыга нуклеотидов.

XI.1. Локализация PHP, ТК я НФТ внутри ядер и митохондрий

Чтобы уточнить локализацию исследуемых ферментов в «рал и митохондриях, ядра, очищенные по методу Шаьо (Chavtau I..1056), били разделены над подфракции : глсбулиноьув, ядерных мембрЬн, ДНП и кислых белков (Зверский И. 13 , 195»), а тяжелые митохондрии - на фракции наружных, внугрннмих

мембран и матриксных белков (Sottocasa G.L., .1955). Полученные фракции использовали в качестве ферментных препаратов в РНР-аэной, ТК-азной и НФТ-азной реакциях. Ядерные и субмитохондриальные подфракции получали из клеток интактной и регенерирующей печени. Последнюю для получения ядер выделяли на 20 час, а для получения митохондрий - на 26 час после ЧГЭ. Активность НФТ в митохондриях была очень низкой и ее субмитохондриальное распределение /¡е изучали.

Чз табл. 4 видно, что в ядрах наиболее высокая активность P1IP обнаруживается во фракции ДНП, превышая уд. активность фермента из целых ядер в 2-6 раз. Активность ТК н НФТ почти поровну распределена между фракциями ядерных мембран и ДНП. Обращает на , себя внимание то обстоятельство, что в цитоплазме уровень активности ТК и НФТ почти одинаков, а v ядрах более активно идет синтез дТМФ в реакции, катализируемый НФТ. Соотношение активностей НТФ и ТК в ядрах, ядерных мембранах и ДНП колеблется от 3:1 до 4:1.

В субмитохондриальных фракциях присутствие ТК и PHP обнаруживается во всех компонентах митохондрий, но наибольшая активность отмечается во фракции матриксных <■ белков. Учитывая, что использованный метод фракционирования

не ает полного разделения белков внутренних мембран и матрикса, а картина распределения PHP и ТК по Фракциям совпадает с распределением НАД-зависимых дегидрогенаэ, для которых другими методами доказана матриксноя локализация, то, очевидно, можно говорить о преимущественно матриксной локализации исследуекчх ферментов.

Для ядерных и митохондриалышх ферментов переход от состояния покоя к пролиферации сопровождается приростом активности во фракциях мембран. Это служит свидетельство)! в пользу того, что молекулы PHP, ТК и НФТ синтезируются на рибосомах под контролем ядра и затем транспортируются к местам их функционирования в клетке. Последнее согласуется с современной концепцией биогенез! митохондрий, согласно . которой мтДНК кодирует около 10-20% белков органеллы, о

«5

а ■fi

о :<

0 м

1 Ú tri í-

о, 01 Kl

a; Э" ' v> И.И

...r

£-1 Л

a »i

ж m S

н 'я +

¡U --U

ЗГ

я та

fi В

О ri >> -g

' í>i

' Ь

.a u

С id

а: u;

«j

•j-i

П -ai G; m

лн n n a>

Vs fi

T-l

■a СО io a О

а л c\j |C\i M

g. d

d d о d

a. + + + *

a> a>

ï* a> О) lO <л!

Û w ю cj tri О

и IÍ4

СО

к; cd со a> -г i 8

ai í\¡ T—1 со

fH d

У i о d d

E-< 4- 1 + +-

-S 1 il 1- M" о

[ . О ci c-J ■D d

a о

§ b

c-i :! i

о ^ j

îj T

о о

d d

i t t

-ï ci

d d

3 л; w

CJ d d

t +

■ 'j О

=a i'- lïl>

i\> Ю

о a

d d ci

<м '0 :0

> J

информация о структуре остальных белков содержится п яДНК. К числу таких белков относится преобладающая часть белков наружных мембран и матрикса (Рудин Д., Уилки Д., 1970; Хансон К.II., 1971; Озернюк 11.Д., 1976, 1978; Ito А., 1085).

Результаты наших работ по обнаружению ключевых ферментов синтеза дезоксирибонуклеотидов в ядрах и митохондриях и вывод об их участии в обеспечении синтеза яДНК и мтДНК предшественниками получили подтверждение в более поздних пуб (копиях по выяснению строения репликативннх комплексов < Heddy O.P., 1980, 1983; M iekreroashinge R, G.1983; Куниц E.B. 1984; Mathews C.K., 1988; Крутяков В.Б., 1989).

11.2. Связь изменений активности ядерных и митохондриальных PHP, TR Ii НФТ с синтезом я ДНК »I мтДНК

Сопоставление интенсивности включения Нэ-тимид1ша в яДНК и мтДНК с изменениями активности PHP, ТК и НФТ в ядрах и митохондриях (рис. 7 и 8), выделенных из печени через разные интервалы времени после ЧГЭ, показало, что максимумы 'активности PHP на 2 часа- опережают максимумы синтеза яДНК и мтДНК, а максимумы активности ТК и НФТ совпадают с ними.

Для ферментов, активность которых способна сильно изменяться за короткие промежутки времени, как правило, существуют белковые или пептидные, ингибиторы, которые, подобно антизиму ОДК-карбоксилазы (Fujita R., 1902; Seoly I.E., 1083; Tabor C.W., 1984), способны регулировать количество активных молекул катализатора в клетке. Такие ингибиторы били обнаружены для PHP в экстрактах печени крыс, тимуса теленка и медленно растущей гепатомы Норриса 8999 (Cory 1., 1979; Frikcson S., 1977) Но существование внутриклеточных регуляторов активности PHP указывают также проведенные нами эксперименты по пересчету активности PHP из лизатов ядер и ДШ1 фракции на 1 мг ДНК. Как видно из табл. 5 эта величина для ядер интпктной печени приблизительно в 13 раз нижа, чем для ДНИ фракции тех ко «дор. В ходе

i':'c, 7. Изнсноино aarsiviчасти TX лдчр < t) н HHtijfOH.ii'nt} (3) в ïctwôi/tte 50 ч.-ii'üi' поеяа чястнччой гепзгохнтоннн.

к,

X/ \

t i

!'■ ЛЛ

/ 's

ч\ •

V - ^

и .. - J—:——1. . л ~ л. i. Li t i' i i i j i i

й И I" U> »1 IS 13 20 22 2 i 26 13 JO xi U 30 irt Л» W. . I

;i¿i.ii ,. i.', 'fi' - , -■ i.. i i

i'::c. S. fliHjubUHo . .its j ju<h¡>cí w i 'ip ai.-tp (I) h чч гочпщрт} (2) o t-J4¿Uu. ">{l ¡ ь rtoaa частичной i aiunts^i, юч»н

регенерации разница в активности фермента в ядрах-и ДНП фракции уменьшается и через 20 часов после ЧГЭ становится недостоверной, а через 40 часов снорч возрастает в 8 раз. Те же определения, проведенные для опухолевых клеток саркомы Ml, где базалышй уровень активности ядерной PHP примерно в 20 раз выше, чем в ядрах гепатоцитов интактной печени показали, что переход от препаратов целых ядер к ДНП сопровождается лишь 4-х кратным увеличением активности фор шта. Это свидетельствует о том, что по сравнению с покоящейся печенью в малигнизированных клетках содержание молекул Фермента, связанных с ингибитором ниже. .'

Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что в интактной печени, где синтез ДНК практически не идет, в ядрах сохраняется определенный запас молекул PHP, связанных с тканевым ингибитором'. Можно думать, что при поступлении пролиферативного сигнала Фермент освобождается из этого комплекса и включает систему восстановления рибонуклеотидов в дезоксипроизводние до того, как появятся новые молекулы фермента, синтез которых индуцирует тот же стимул.

Для выяснения природы ингибитора были поставлены еле/ ющие эксперименты: в FIIP-азной реакции фракцию ДНП из ткани печени, полученной через 20 часов после ЧГЭ, использовали в качестве Ферментного препарата, а лизат ядер интактной печени как источник ингибитора. Изучение зависимости активности фермента от количества, добавленного в инкубационную пг~>бу ингибитора показало, что при соотношении в пробе ингибитора к ферменту 1:40 активность Clip снижается в 4-5 раз. Ингибитор локализован в глобулиновой фракции ядер, при диализе не проходит через полупроницаемую мембрану, осаждается при 80% насыщения сульфатом аммония и дает положительную реакцию на белок.

Т-юлица 5.

Активность PHP в ядрах и ДНП-фракции клеток нирмалыюй, регенерирующей печени и саркомы М-1 крыс

Ткани Фракции Активность PHP нмоль дЦД£ в ми на мг ДНК М ± .т>

Интактная печень • Ядра 0.03 i. 0.003

ДНП ^ 0.40 t öote

Печень через 15 часов после ЧГЭ Ядра 0.10 0.010

ДНП 0.24 i. (1.024

Печень через 20 часов после ЧГЭ Ядра 0.29 i 0.014

ДНП 0.30 £ (1.026

Печень через 48 часов посла ЧГЭ Ядра 0.07 i. 0.01

ДНП 0.56 i i) 0 7 __ __; $ - Q -¿¿ i

Саркома Н-1 1 • Ядра

ДНИ 2 . 6 t 0 . 07

Для получения каждой экспериментальной 12-15 определений активности фермента.

очки iii-.ui.' ins

Таким образом из полученных результатов олел/ei, т.

существует четкая корреляция между изменениями а к i иьн ... п> РНР, ТК, НФТ в субклеточных органеллал н ¿ujii-í. м иЦНК л мтДНК;

совпадение или близость во ьременп иа^.синумии »к i _______i

этих Ферментов и включения На--гн>1идин<1 в яД1и; и ni lililí позволяют оценивать интенсивность ркпврл i simiij;. . ¡U' то >-.t-', в тканях на основании определения яктлли: m I Hí' НФТ в травмироианних органах при ерквн-.амнп . нормы;

в ядрах печени обнаружен опродв «ытий jdnai: ti' i.ij'. активность которых заьиеиг иг -:оц*сс<н.-1я "-.i... ингибитора этого ферн^та.

ьЬс. .

i U 1

. .1

IX.3. Некоторые свойства ядерных, мнтохондриалышх и цитоплазматических PHP, ТК и НФТ из интактной и регенерирующей печени.

В опытах in vitro изучали свойства ядерных, митохондриальных и цитоплазматических PHP, ТК и НФТ, используя лизат тяжелых митохондрий, ДНИ- и 105 ООО xg иадсадочную- Фракции в качестве Ферментных препаратов. Выясняли влияние времени инкубации, pH среды и компонентов инкубационных проб на активность исследуемых ферментов.

Установили, что большинство условий, необходимых для проявления максимальной активности PHP из ядер " и митохондрий, сходны с требованиями цитоплазматического Фермента (Moore Е.С., 1967; Larsson A., 1S69; Elford H.L., 1972; Fo1Зшапп П., 1974; Sjoberg В.Н., 1983). Основные различия касаются потребности фермента в АТФ и ионах Mg2*. Цитоплазматическая и ядерная PHP проявляют максимальную активность при концентрации АТФ 9-10 м11, а митохондриальный Фермент - при концентрации 4.4 мМ. Для работы цитоплазматической PHP оптимальная концентрация ионов Kg2» составляет 13 мМ, для работы ядерной PHP - 6.0 мМ, а митохондриального фермента - 10 мМ. Обнаруженные особенности отражают реальное окружение молекул фермента в органеллах: высокие концентрации АТФ в мит<?хондриях и ионов Mg2* Е хроматина (Ревич Г.Г., 1974; Ozawa К., 1974; Мот^ох H.H., 1978; Берлинских Н.К., 1987).

НФТ из клеток печени описана нами впервые, мы изучали свойства фермента ядерной и цитоплазматической локализации, сопоставляли их со свойствами ТК. Установил», что: 1. ТК и НФТ для проявления максимальной активности требуют разные концентрации ионов Hg2» и донора фосфата (синтез дТ1И', катализируемый НФТ наиболее активен при добавлении в пробы эквимолярных количеств УМФ и ионов Hgz* в концентрации 5 мМ, а для синтеза дТНФ в ТК-азной геакции требуются ЛТФ и ионы Нй2<" в концентрации 10 мМ; . по-разному реагируют ферменты на добавки дТТФ и дИДФ (для ТК лТТФ и дНТ-f - мощные" лллоеттичеехмн ингибиторы, f

присутствии которых фермент практически подноси, ю герл>(г активность, а НФТ к ним нэ чувствительна);

3. оба фермента ядерного и цитоплазматического происхождения

при электрофонусироваиии в градиенте pii 3.0-10.U обнаруживают несколько зон активности (дни

' цитоплазматической ТК две зоны с р! 6.5 и 9.0-3.2, г\ ядерной - в интервале значений р! 5.0-6.0 и 7.0-8.0; для НФТ цитоплазматического происхождения три зоны с pl 0.3. 5.3-5.1 и 4;0-3.8, а для фермента из ядер два максимума при pl 7.0-8.0 и 4.5-5.0);

4. ТК и НФТ при фракционировании циготазматических сенксь

из нормальной и регенерирующей печени сульфатом аммонии распределяются в разных зонах насыщения (рис. II). Заметная активность ТК. из интактной печени ощ-ид^ля« ich в зонах I и IV с преобладанием в зоне I., а из регенерирующей печени в зонах II и IV, причин ни сравнению с нормой в зоне II она возрастает почти ьдпоа. тогда как в зоне IV лишь на 12-14Х. В цитоп«азиатиче«. ки:< белках из интактной печени активность HíT огкрыв^чтгя ь зонах I и IV с преобладанием в зоне IV, а ь белк.-it п.* регенерирующей печени - во II и, главным обрядом, в (¡I зонах.

Совокупность подученных экспериментальных данных свидетельствует о том, что в печени 1К и lit" нрод.. ганчаны разными белками, которые в свою очередь iym^ciьугл ь нескольких молекулярных формах, возникающих, как yc:i чнс в»еио для ТК, за счет внутриклеточных химичосгнх ммичик.ып.и (íircbcr Г., 1370; Hohberg I., 1930).

II.3.1. Зависимость активности разных изофсрн цнгипхязмагичкскнх, ядерных и мнтихоидрнплlhijx ТК и tili щ скорости пролиферации.

Л «я тою, чтобы выяснить, кзк и ¿к^мды .-.н лас.ф и активность разных тори ТК и н 5-Т из as-и- шнм/.. n.i¡ t.ñ .i цитоплазмы в условиях разной нрояиф^рнивисм ¡r r.uti, .. ц i епатонигое, ни иоол^логч ли их согтчн г. н т ¡w*. »-. - ir ч , .т. ,

'2,1

I 1.5

1,3

1У

- —lüL

. 2,1

i ■

I 1,9

I.7-I

1.5 1.3

1У

¿0 40 60 80 100

У. насыщения (HH4>2S0*

20 40- 60 80 100

% насыщения (HH4)sS04

¡Ü (1> О

5,1

1У

•Й1.9

►Q

•A E'

1 1,5 i '

2,1

i;'9

i.v

1.5

1У 1

. i

20 40 60 SO 100

% насыщения (ННОяЗО-*

20 <10 n О

% насыщения (HHOaSLU

O v.rrmpie»emie активности ТК (А) и

Семоп и , "^акционировании

(р) печени К/-Ы. ">"

(HfU)sSÜ4

t,t ЦЦЦ* mut Ц10,1 w Iß »f

Рис. 10. Электрофорэтическая подвижность изоформ цнтоплаэнатической ТК из итакт ной (1), регенерирующей (2) печен» и не -цитной гвпатоиы Зайделя <3).

Рис. il. ;t ;.?А jp, форм Ufr ИЗ НН13ХГНОЙ Пь,¿,til неЧ'чругцкй if!! lit-¡си:'

>¿ h *>;!■■ 1 '< Г

электрофореза в ПААГ. После разделения белков в электрическом поле в гелевых столбиках определяли расположение зон, обладающих активностью ТК и НФТ. Как видно из рис. 10 и 11 цитоплазматические белки из интактной и регенерирующей печени обнаруживают три зоны активности ТК и НФТ. Для исследуемых Ферментов положение первых двух зон достоверно различается. Вклад разных изоформ в образование продукта реакции меняется в зависимости от функционального сос- ^яния ткани (табл. 6). В быстрорастущих тканях доминирует медленно мигрирующая форма с Rf 0.15 или 0.06. За счет активности этой формы в ТК и НФТ-азных реакциях образуется более 50% ДТМФ, синтезирующегося совокупностью всех изоформ в образце. Вклад в синтез дТМФ изоформы III с подвижностью 0.85-0.87 не велик (15-20Х) и практически не зависит о пролиферативных потенций ткани.

Расположение зон активности ядерных и митохондриальных Ферментов изучали, используя в качестве источника ТК субмитохондриальные Фракции: наружные, внутренние мембраны и катрикснме белки, а ТК и НФТ из ядер: ДНП-фракцию и фракцию ядерных мембран. Изоферментный состав ТК и НФТ ядер в литературе не описан и исследовался нами впервые. С помощью этой серии экспериментов удалось установить следующее:

1. Основная часть мтТК сосредоточена в матриксном содержимом. Она представлена тремя молекулярными Формами, положение которых на электрофореграмме практически совпадает с расположением молекулярных форм цитоплазматического фермента, что, очевид-'о, еще раз подтверждает предположение о цитоплаэматическом происхождении ТК' в матриксе митохондрий. Белки наружных и внутренних митохондриальных мембран также обнаруживали по три зоны активности, положение Лпук из которых (II и III) не совладает по величина Rf с иэоформами ТК из митохондривльного матрикса и цитоплазмы. Это моквт обьяснятюя лиго тем. что они являются собственно нитохондриальными изоформэми, лр'.о. что более ргроятно, пр^дстяилиют собой цигоплпзматичрсиие

Таблица 6.

Еадичествешый выход дТМФ, образующегося- за счет разных изоформ ТК и НФГ из нормальной и регенерирующей печени крыс и I от общего количества синтезированного дТМЙ

ЙЗО£Х!Р42»: : оЗразукайся в реакции ходе ТК-авной дТШ>, образующийся в реакции ходе НФГ-азной

норма ! ЙГ изооорм. | 20-ч регенерат .норма И" изоформ. 20-ч регенерат

ОП ' с : С. 1-е. 14 | 50 ± 3. 0 18 ± 2.3. 0. 05-0. 07 46 ± 1.1

:: 1 - С. 5-а. 55 1 35 ± 1.6 59 ±2.2 0. 35-0. 39 38 А 1.7

711 ' 20 -г 0. 7 : 0. 85-0. 87 1 13 ^ 2.1 22 ± 1.8 0. 84-0. 86 15 + 1.0

шхол дТ1& за счет активности разных изоформ ТК и Н5Т рассчитывали на основании ойраоотхи результатов 12 электрофореграмм

претерпевшие изменения в связи с особенностями Функционирования в митохондриальных мембранах. В лизатах ядер из интактной и регенерирующей печени обнаружены четыре зоны активности ТК и НФТ со следующей эяектрофоретической подвижностью:

ТК НФТ

Зоны ИГ Зоны ЯГ

I 0.07 ± 0.01 I 0.06 0.02

IX 0.28 ±. 0.02 II 0.33 ±. 0.02

III 0.44 ±. 0.02 III 0.56 ±. 0.04

IV 0.73 ±. 0.03 IV ,0.85 4. 0.02

Для НФТ в ядерных мембранах и ДНП-Фракции обнаруживаются те же 4 изоформы, что характерны для лизата целых ядер, для ТК в ДНП фракции открывается три изоформы: отсутствует активность в зоне II, а в ядерных мембранах - 4 изоформы, свойственные целым ядрам.

Вклад различных изоформ в общую активность ТК и НФТ ядер

1 митохондрий меняется в зависимости от скорости роста тканей. Сохраняется . закономерность, 'характерная для цитоплазматических ферментов - активная пролиферация сопровождается: а> повышением уровня активности всех изоформ ферментов в образце; б) перераспределением активности между отдельными формами ТК и НФТ в ходе которого наибольший вклад в образование дТМФ обеспечивают медленно мигрирующие изоформы.

11.4. Определение активности ТК и НФТ в сыворотке крови у животных после операции ЧГЗ или нанесения ран кожи и у людей с воспалительными заболеваниями.

Патологии, приводящие к нарушению целостности или проницаемости мембран клеток, ' сопровождаются выходом белков и ферментов в кровь. Определение их в сыворотке крови является одним из наиболее быстрых, перспективных методов диагностики болезней и контроля за эффективностью лечения (Николаев Л.Я., 1000; Меньшиков В.П., 1907).,Ножно ожидать,

что у животных поело частичной резекции печени или нанесения полнослойной кожной раны ТК и ИФТ будут ВЫХОДИТЬ Я Кров!.. Чтобы проверить эту возможность была проведена св{ин экспериментов, в ходе которых ежесуточно из двух грят оперированных животных (с удаленной на 2/3 печенью или кожными ранами) забивали по 5 крыс и в сыворотке крови определяли активность ТК и 11ФТ. Как видно из рис. 12 чером 24 часа после операции ЧРЭ в крови животных активность '1К ч НФТ повышается в 3 и 1.5 раза, соответственно по сравнению с контролем, через 2-е суток снижается в 1.5 раза, через 3-е -приближается к уровне нормы. Появление ферментов в сыворотке крови наблюдается также после нанесения животным кожных рэн, причем активность сывороточной ТК почти вдвое выше, чем е./. активность в ткани (рис. ЪЗ). Первый максимум активности 1 К сыворотки крови совпадает по времени с максимумом включении Н;1--гинидина в яДНК грануляционной ткани и первым пикон ия кривой количественного содержания с РНК.

Известно, что процессы сходные с регенерацией частично утраченных тканей наблюдаются в хода репарации патсдогичкскм иэнэн2н!!нх органон. Чтобы выяснить, может ли активность 1К и Н£Т п сыворотке крови служить показателем иигепсипкс.сIи восстановительных процессов при воспалениях, манн было проведено определение активности этих ферментов в У4 образцах сыворотки крови больных с патологией печннм, почек, езрдца и органов язлудочно-килечного тракта, ньходивлмхел ни стационарном лечении о клиниках НМЛ им. 11.11. Сечен>>ь.ч

Нндо показано, что в сыворотке г.р.мщ Солтнш: обнаруживается активность ТК и НФТ В ааяиснмоо ги от получанмих результатов ксрк пациентов можно раздали ь на ¡щ группы: 1л группа - больные < 1в ч«» . > о иацАщие > и. • :кпй удельной активность П'А> ТК щ 2.3 цо 1 . / «ц . И и 1рц|:1м - «о«ы»г» (31 чел. ) со средней У А фъшеш» - 1 »'.(» щ, I .> йд. и трптьч 1 руппч Псдыша (17 чм». ) с (..«ни актчьнчг-гьм ТК от \,! ч<> П н с-ч . и . : »( ,.¡1«!

нормы (41. Ой П М< ей >

■о

о &

fei

И О

и -л л '

Рис. 12. Изменение активности ТК (1) л НФТ (2) в сыворотке крови в течение 72 часов после ЧГЭ.

го М >=:

Гис. 13. Активность TIC и НФТ в с:;горгт::с крови и грануляционной ткани в процессе заживления ран.

I - НФТ; II - ТК гомогената ткани; III - ТК сыворотки

В персу» группу входили болыша хроническим активный гепатитом, пиелонефритом и гломерулонефритом. Болтшистио больных II-ой группы составляли пациенты с циррозом печени, п сыворотке этих больных отмечалась заметная активность Н^'Г.

Наибольший интерес представляют результаты опредепения активности ТК у одних и тех же больных в процессе лечения. В основном это били пациенты, страдающие хроническим нктиышм гепатитом, пиело- и гломерулонефритом. При перлом опродолснии активность ТК в сыворотке крови этих больных колебалась в пределах от 2.3 до 1.6 ед. и превышала норму в 3-4 раза, чзроз 2 надели лечения в стационаре снижалось нринарно з 2 раза и соответствовала значениям активности форалнта у больных ПТ-ен группы.

Активность Н1'Т а сиворотке крови у животных и людей, как правило, ми»е, чем ТК, поэтому в диагностических целях ее оп.'.'С-дзлц.чие кадете:! пало перспективным.

Таким ойрачом, ч этой серии экспериментов удлдось показать,, что нарупзнло целостности органов и пронин^емосгн мембран клоток компилирует с выходом а кроиь 'ГК и ИМ'. Появление в нрези у больных с поражениями внутренних органов 'ГК г су,",'.! I ? об интенсивности м продолжительности

прояиф"ратмвиой стадии при заживлении и нижет шить пр.,.--1,,-н.;г"•'»Ч!?:1|1Ч в терапии различиях заболеваний.

711. Влияние от пуктурных аналогов тшипт и тичндкнп и»

регенерации па-шин коаи.

Полученные оьлг,„цин об особенностях еингвчч нуклчнтч.ьх хисязт С ПОЙОГ.^НХСЯ , ¡'йг^нерирумщих И и11у*<и!1 КЫ». ГКЧ1ШК поз£ол;ют даст;: Цо-опаЛра^даньий поиск щ-ачц-ьт',,,, , „и^ип могут пгяять мс процессы, лежащий а ос.т.ь» р.,.. 1а и .ик»»» к.?"ток .

И 40-и >•!>•■« иоаучичч рчС!!р.""?Т1":ми..чиэ ид-..: ими.:,.:

1' ' '1м н ГрУШК- Ч Н 3 .4 ! 11 (1 Г) Н;!.1!1' !!

азоШстыл осноьпнпй, вчпмм» 1( иц|»'.!Н1ч «¡ч-дот р. зтоГ* концепции *,1.!чи гозянш и Ил.ркн т.,!!,.,,,.!,!,. *

химеотерапии опухолей и лечении вирусных инфекций такие антиметаболиты пиримидинов, как 5-фторурацил (5-КУ), фторафур (Н-2-Фуранидил-5-РУ), цитарабин (1-бета-Д-арабинофуранозилцитозин), 5-трифторметилурацил (5-FaMey), циклоцитидин и некоторые другие (Heidelberger С., 1975; dil Clerq Е., 1978, 1984, 1991; Преображенская H.H., 1904; Шнейдер М.Д., 1SG8; Булкина З.П., 1991;).

Группой Н.В. Лазарева, его учеников и последователей синтезированы и внедрены в лечебную практику ряд производных, обладающих противоспалительным и

ранозаживляющим действием: оротат, 4-метилурацил (6-нетилурацил, 4--МУ), пентоксил (5-ок£и-6-МУ), мерадин (8-иеркагггоаденин) и некоторые другие (Лазарев- Н.В., 1972; '.'ouen, 1975; Федоров H.A., 1974; Билич Г. Л., Колла В.О,: 1970, 1982; Русаков В.И., 1970-1382).

Будучи введенными в организм, азотистые основания, нуклеозиды и их синтетические' аналоги довольно быстро траспортируются в клетки при участии белков-переносчиков (Wotjlhueter R.M., 1980; Plagemarm P.G.W. , 1978-1981). В большинстве случаев в клетках они превращаются в нуклеотиди и активно вмешиваются в синтез ДНК и FHK либо на этапе сборгч биополимеров, либо на стадии образования фонда предшественников (Преображенская -W.H., 1984; Булкина З.П., 1991; Miva М., 1086). Если синтетические аналоги фосфорилирутся с малой скоростью, их влияние на матричные биосинтезы носит опосредованный характер за счет изменения активности форментет метаболизма предшественников ИХ (Яковлев H.H., 1970), стабилизации мембран клеток, обусловленной антиоксидантной активностью (ADA) этих веществ (Мишкин В. A., lifC; Лазарет Д.Н. 1.986) или их иммуностимулирующего дрй^трия, когчро» связано с активацией Фагоцитоза (Русаков Р.И., 197(1; Иванов* Р.Г., 1981; Хисамова U.K., 1985; Чукичер E.H., 19ПР).

Нами изучались сгойства и м^чтннэм действия некоторых инцест» глей группы, аналогов тимшм и тимидннп: 5-5пМсУ и

его бета-Д-ксилофуранозильного производного, 4-тио-Ь- РУ-бета-Д-хсилофураноэида и 4-МУ.

III.1. Изучение влияния Ь-фторзамицонных урацилоп и их кснлофраноэильных производных на синтез тннидилоиых нуклеотидов, ДНК и РНК.

На рис. 14 изображены основные способы превращения 5-Кэанеценных урацилов в нуклеотиды, надежно установленные для 5-FX:

--пяримидинфосфорнбоэилтрансфвраза---------,

ФРДФ H4 Ра О 7

а уридинфосфорилаза уридинкиназа 5-РУ----5-РУрнднн-------^-.г-—S -ГУНФ

рибозо-1-ф АТФ АДФ

тинидинфосфорнжаза ТК

- —-5~рдУрнднн--—-,—с;—л 5~Р>'НФ

/ Ч

дрибозо-1-ф АТФ АИФ

Влияние новых бета-Д-ксилофуранозилыщх производных Ь-КзМеУ, 4-tho-b-Fy, синтезированных группой ?.tl. Казьипной (фармфакультет, НМА), и 5-F3Hey на синтез ДНК, 1 ПК сравнивали с эффектами 5-Fy . Антипролифьративную активность препаратов оценивали после однократндго внутрибрюшннного введения исследуемых пещаств в дозе 4 мг на 101) г m.iccu животного (около 25* от ЬДво). Через 20 часов носам операции ЧГЭ и введения препаратов об изменениях в синтез*} ДНК и РНК судили по интенсивности включения il3 тииидина и С14 о^отата в НК в расчете на 1 мг ДНК или РНК печени или со яп онки } животных опытных и.контрольной групп

Как видно из табл. 7 сильной нш ибировяние mihiîijs суммарной, ядерной и митохондриьлыюй lillK реген^нфУкца« печени и сДНК из села»?нкн ниэива<*г гчл».ко b-t'/. Л-КяНй>, по-видимому, значительно ояибич, ч*и f > РУ yi и ки.шру t.-i ги клетк"А по нуги Л, inni -:му м» обрлчуйИ-л ч-нтти* г.>*ц ieei н

и^-КэМеУМФ, способных ингибировать ТС-азную реакцию и существенно снижать синтез яДНК. По литературным данным (Heidelberger С., 1975; Prusoff W.H., 1978) ферментные системы вирусов способны фосфорилировать 5-FaMey и включать образующиеся нуклеотиды в вирусную ДНК, нарушая продукцию вирусов. Учитывая значительную близость строения митохондриального генома и генома прокариотов, становится понятным большая чувствительность синтеза мтДНК к этому пропрату: 5-FэНеУ ингибирует синтез сДНК селезенки и яДНК печени на 20Х, а мтДНК - на 42Х.

Бета-Д-ксилофуранозильное производное S-Fatley в печени и в селезенке, становится субстратом разных ферментных систем; d результате синтез ДНК в селезенке ингибируется на 41.5%, а и печени активируется в ядрах в 1.5, а в митохондриях в 3.5 раза. Дополнительным подтверждением этого' предположения являются результаты по определению активности 'ГК и НФТ во Фракциях цитоплаэматических белков регенерирующей печени и селезенки. полученных от животных, которым вводили исследуемые препараты. 5-Fy и 5-РэМеУ практически не влийят на активность обоих ферментов из регенерирующей печени и селезенки крыс, тогда как бета-Д-ксилофуранознльныа аналоги тими,гчна, как было установлено в опытах in vitro, конкурируют с субстратом за место-в активном цонтре ТК и НФТ и снижают их активность в цитоплазиатнчсскон фракции Селезенки на 30-47%, практически но влияя на активность тех зе ферментов печени. Меньшая чувствительность клеток печени к синтетическим ан? догам тимина и тнмидшш, видима, объясняется достаточной лабильностью группы -СГз, которая в печени под действием набора ферментов еиотрансформации подвергается быстрону окислению d -С00И группу (','едоров И.П.. 199S). В результате образуется структурный аналог оротатй; который подобно оротату стимулирует синтез ЛИК, РНК и белка.

На разные пути превращения V-Foliey и ого г.ета-Д-ксилофураноэильиого производного в печони и ссдезеико указывают результаты но изучению влияния лрепнро тол нг.

■за

включение С^-оротата в РНК (см. табл. 7). В селезенка 5-FaMe/ как и 5-FY ингибирует синтез РНК на 58»., что, очевидно, связано со способностью обоих азотистых оснований превращаться в НТФ в реакциях 1-го и 2-го пути (рис. 14), включаться во все виды РНК и нарушать функциональную активность этих молекул (Heidelberger С., 1075; Di Clerq Е., 1976-1884; Будкина З.П., 1991). В печени 5-РэИеУ, превращаясь в 5-карбоксиурацил, стимулирует синтез яДНК и мтДНК в 1.5 раза.

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что бата-Д-ксилофуранозидьние производные 5-КаМеУ и 4-тио-5-РУ в отличие от 5-РУ и 5-РэМеУ не оказывают существенного антипролиферативного действия на

эукарнотическив клетки.« б-РэМеУ-бета-Д-ксилофуранозид выгодно отличается от нуклеозида и нуклеотида, которые могут образоваться из 5-РэМеУ а организме по пути 1 и 2, тем, что значительно слабее ■ нарушает синтез РНК в селезенке. Поскольку он не .уступает 5-РзНеуридину по протиьовирусной активности, то, видимо, окажется весьма перспективным в лечении герпетических и аденовирусных инфекций в связи с меньшей токсичностью для клеток эукариотов.

III. 2. Изучение механизма действие 4-МУ на синтез нуклокиопих кислот в кожа и поченн в ходе репарптниной регенерации.

4-МУ стал широко применяться как лечебный препарат н различных областях хирургии и терапии с конца 60-х годом. Было установлено, что он оказывает поливалентное действии нп процесс восстановления поврежденной ткани, стимулируя нормализацию состава крови при кровотечениях, Фагоцитоз при инфекционных заболеваниях, уменьшая прояпжония воспаления, размеры некроза и ускоряя регенерацию (Русаков И.И., Лазарев ii.в. , Билнч г. л. и др., 1969 ■ 19п5) Будучи вийдон в организм, 4-МУ .увеличивает площадь кячгочних яд«р, содержание гликогена, НИ и количество имиуног.онпч'г^мтмнк кл>?ток в лнмфоуз/ган (Гусакин R.K., t9?;i). Однако

о.

S *

ft> «I

Щ 01 p*

« 4>

ОЙ 3£

I Í J Г-. 3

I та I о

^ I

ft) I txi

0J I U u\i

s ю H н 3 о л: er ас tí

i з> -

о V «И CD

i й>

£»1

«g

•7Л

иг

)

И-Г

in К ?

3 |3и

л? I g

■¿ъ

eg p 1

• ♦ i 2

Л I j •--« •»» I 1

О О

t с.) н » " •* i l\ \ ,

го m

a a

CM +1

о »-«

s fc

Гч g

8 3

s §

Я 8

kh m

m -H

8 Hi

S! Я

с- о»

S -ft*

ä+l

С4"

fj t—í

Sü

со F-со

со •

СП

о о |Л »-и о> ш

яд1 &

§ s

со м

вя

о со

- с-

§3

Ol +1

" о Û

о о

& а

«О -И

с £

Я 3

о о to м

со

►M

•V о

СО ci

¡88 , о. »

♦I I CJ +1

8 5 V

f rh/J X O I I с с

I t:í-<

молекулярные механизмы действия препарата на

репаративные процессы изучены недостаточно. Показано, что он легко проходит плазматическую мембрану клеток и в цитозоле с очень малой скоростью превращается в нуклеотиды (Попова О.И., 1981), которые в ДНК не включаются (Русаков В.П., 1977; Чернов В.Н., 1979). В тканях интактных и оперированных .животных 4-МУ ингибирует активность j ридинфосфорилазы, сберегая эндогенный уридин для использования в синтезе ПК (Яковлев H.H., Ореценко H.H., 1970; Русаков В.И., 1977). На основании изучения состава нуклеотидных пулов, митотической активности гепатоцитов и интенсивности синтеза ЛИК и белка ряд авторов пришел к выводу о том, что в нормальной и регенерирующей печени 4-МУ вызывает некоторую активации пиримидинкиназ: ТК, УК и УМФ-киназы, синхронизирует и ускоряет вхождение гепатоцитов в пролиферативную Фазу (Рсвич, 1978; Попова 0. И., 1980, 1981).

II 1.2.1. Влияние 4-НУ на. динамику синтеза IIK в грануляционной ткани ран кожи.

Чтобы получить доказательства того, что 4-МУ аналогичным образом влияет на биосинтетические процессы и з других типах клеток, мы изучали действие препарата на содержание, интенсивность синтеза ДНК и РНК, состав клеток р ткани, образующейся на стадиях травматического воспаления и пролиферации (2-е - 7-е сутки поело нанесения поднослойной кожной раны). У опытной группы жиготних заживление ран проходило под ланолин-вазелиновым покрытием с 5-к> » 4-МУ. Контролем служили две группы животных: у 1-ой заживление шло в условиях открытой раны, а у 2-ой - под покрытием из ллнол,.н-вазелиновой мази.

На рис. 15 показаны изменения з содержании суммарной ДНК, гиделенной из гомогенатов ткани опытных и контрольных жи потных.

С 2-х по 7-е сутки содержание ДНК в тканях открытий р.ч'н (кривая 1) постоянно выше, чем п тканях, фогмигУ'ПИхся под

/Су/Л

Рис. 15. Влияние покрытия с 4-НУ на содержание ДНК в грануляционной ткани.

}-J"

/ГуП

Рис. 16. Влияние покрытия с 4-НУ на включение Н3-тинидина в яДНК грануляционной ткани.

Здесь и но рис.

15: I - ткань,образующая -в открытой рано;

II - ткань,образующаяся под ланолин-вазелиновым покрытием ;

III - ткань,образующаяся под ланолин вазелиновым покрытием с 5* 4-МУ.

мазевым покрытием (кривые 2 и 3). Наиболее значительные различия в характере кривых наблюдаются с 2-х по 5-е сутки. В этом интервале на кривой 1 отмечается большой пик с максимумом на 3-и сутки. На кривых 2 и 3 этот пик сдвинут к более ранним срокам, и содержание ДНК в первой точка измерения в 1.5 раза для животных 2-ой группы и более '¡ем в 2 раза для опытных животных меньше, чем у п> рвой контрольной группы в области максимума.

Различия в содержании ДНК опытной и контрольных групп становятся понятными при сопоставлении с результатами морфометрического анализа клеточного состава грануляционной ткани, полученной от 1-ой контрольной и опытной групп животных. В ткани, где заживление ран шло в условиях открытой раны, первые четверо суток сильно выражена воспалительная реакция: в области повреждения преобладают лейкоциты и махгофаги, рост клеточной плотности фибробластов начинается только после 3-х суток. Покрытие с 4-МУ снижает накопление в ткани поликорфноядерннх лейкоцитов почти здвой, раньше начинается рост числа фибробластов. Благодаря умптьпению продолжительности воспалительной фазы первый пик на кривой количественного содержания ДНК, обусловленный .-:чгрнровап|гими в зону раны лейкоцитами, оказывается см(?1?ентш к 1-2 суткам, а на 4-е сутки на кривой ГЦ появляется дополнительный максимум, существование которого, очевидно, связано с преобладанием роста числа фибробластов над деструкцией клеточных и тканевых элементов. Боле« высокое 'содерхлнне, лейкоцитов в грануляционной ткани открытой рани на протяжении всего периода исследования делает понятиям, почему количество ДНК на кривой 1 постоянно гпч'-э, чем в тканях, образующихся под мазевыми покрытиями !1.?иы,и=а содержание лейкоцитарной ДИК на кривой 2 по сравнению с контролем (кривая 1) свидетельствует о тон, что покрытие рпци мпзьга, содержащей только ланолин и газелин, yficiiLCooT трл пм ттическое воспаление за счет снижения доступа и продотврацения высыхания рани.

Изучение динамики включение На—гимидина в ДНК ядер, выделенных из грануляционной ткани позволяет обнаружить различия в интенсивности синтеза ДНК у опытных и контрольных животных (см. рис. 16).

Ядра из ткани открытой раны (кривая 1) и раны, покрытой ланолин-вазелиновой мазью (кривая 2), имеют два максимума синтеза ДНК с 3-х суточной продолжительностью клеточного цикла. Ядра клеток, формирующих ткань под покрытием с 4-НУ, обнаруживают три максимума, приходящиеся на 2-е, 4-е и 6-е суткй. Эти данные свидетельствуют о том, у животных, леченных 4-МУ,волны синтеза ДНК фибробластов учащаются, имеют 2-х суточную периодичность. Можно думать, что они сопровождаются делением фибробластов, поэтому на 2-е сутки количество фибробластов в ранах, леченных 4-МУ, равно в среднем 8.5 клеткам на ед. площади при 4.8 клетках на ед. площади в контроле. На 3-й сутки эта разница становится трехкратной и составляет 19.0 и 8.5 клеток на ед. площади соответственно.

Показательно, что в условиях покрытия ран мазями скорость синтеза РНК, измеренная по включению С1*-оротата в 1 мг яРНК, возрастает в 1.5-2 раза (см. рис. 170. Это указывает на повышение биосинтетической активности клеток, особенно в присутствии 4-МУ (кривая 3). Гистохимически на срезах ткани наблюдается увеличение числа контактов макрофагов с фибробластами и числа макрофагов, более выраженная пиронинофилия цитоплазмы и ядрыдек Фибробластов, свидетельствующая о повышении содержании РНК в грануляционной ткани животных опытной группы по сравнению с контрольной. В межклеточном веществе вблизи фибробластов увеличивается содержание кислых гликозами11гликанов и коллагена, что лишний раз говорит о том, что в ткани опытной группы раньше, чем в контрольных начинается синтез тканеспецифических белков.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что лечение 4-МУ значительно снижает накопление клеток воспалительного экссудата в ране и ускоряет начало'

пролиферативной фазы. Удалось но только подтвердить справедливость полученного в работе на регенерирующей печени вывода о той, что 4-МУ - синхронизатор клеточной популяции, ускоряющий начало синтеза ДНК в клетках печени, но расширить и уточнить его (Попова О.П., 1980, 1901). Для кожной раны, заживление которой проходит воспалительную фазу в течение 45 суток, а в фазе пролиферации Фибробласти имеют продолжительность клеточного цикла 3-е суток 4-МУ сокращает воспалительную Фазу, укорачивает клеточный цикл фибробластов и способствует синхронизации синтеза ДНК.

Рис. 17. Включение С'->-оротата в РНК грануляционной ткани о процессе заживления ран.

1 - ткань, образующаяся в открытой ране;

2 - ткань, образующаяся под ланолин-вазе-

линовым покрытием;

3 - ткань, образующаяся под ланолин-ваза-

линовын покрытием, содержащим 4-КУ.

_<_I... , I_I_I-1_

/ } 4 } ) /грп

111.2.2. Исследование антиоксидаптншс свойств 4-11У п опытах in vitro и in vivo.

В отдельных публикациях противовоспалительное действие препарата объясняют антиокислительной активностью 4-11У (Лазарева Д.П., 1986; Шишкина Л.II. , 1089), хотя сведения об этом свойстве довольно противоречивы. По данным одних авторов 4-МУ в опытах in vitro не обнаружил антиохсидантную активность, а при введении животным снижал уровень МДЛ в мышечной ткани на 19Х (Лукаш H.A., Русаков В.П., 1002), по сообщениям других 4-МУ является сильным антиоксидантом по эффективности не уступающим альфа-токоферолу, ионолу и цистамину (Мишкин В.А., 1986). В опытах in vitro и in vivo ми сопоставилг антирадикальную активность 4-ИУ, водорастворимого антиоксиданта - карнозина и жирорастворимого - альфа-токоферола. Показали, что в кумодьпоА модели ПОЛ (Кудрин А.Н., 1986) при активном доступе кислорода 4-МУ и карноэин (дипептид мыац - бота-ала:г.:д-1,-гпстпдин) вызывают задержку окисления кумола. При низких концентрациях препаратов (1-2 мМ) 4-МУ вдвое активное защищает купол от окисления, чем карнозин. Продолжительность действий нерпаратов составляет 20 и 10 мин соответственно. При концентрациях 10 мМ и 20 мМ соединении проявляет примерно одинаковое антиоксидантное действие, предохраняв купол ст окисления s течение 44 и 4В мин. IIa основании этих данных нохно сделать вывод о том, что оба вещества способны р-зггнро^йть со свободными радикалами, осразук-цинпси и нспсльзуоноЛ системе,

ti опытах in vivo способность 4-МУ, карнозина и альфа-токоФсрода снижать образование продуктов ПОЛ определяли в Tüüi.ñx р«ны и сыворотке крови оперированных животных. На раиц препараты наносили ежесуточно в течение 3-х дней в эквимолярных количествах. Как видно из табл. 8, лечение животных 4-МУ и карноэином снижает накопление первичных продуктов НОЛ с конъюгированнЫми диеновыми и особенно кетодиеновыми группами (Костюк В.А., ЮвЗ), уменьшая содержание последних в 3-4 раза по сравнению с контролем. На-

Таблица 8.

Образование продуктов своб-днорадикального окисления в грануляционной ткани и сыворотке крови

на 3-ий день лечения ран антиоксидантами.

Продукты СЕОбОДНО- радикзльного окисления Используемые препараты /результаты приведены в X к контролю**/

растит, масло 4-метилурацил карнозин альфа-токоферол

1 2 1 2 1 2 1 2

'ГБК-актиыые продукты 82+13 82±10 63±7 72±.б 61±8 80+5 79+14 82±3

Конъюгированные диены 82+11 76+4 61 ±9 42+11 60±8 50+6 70+9 63±11

Кето диены 60+15 76+15 25±10 30+10 28±12 32±13 50±13 40±16

Перехват радикала 110+10 10+12 150+10 140+12 155+7 "' 145+7 140+8 130+12

1 - в гомогенате ткани

2 - в сыворотке крови

** - за контроль принимали результаты полученные, для животных, которым на раны наносили физиологический раствор.

4U JC снижается образование ТБК-активных продуктов ИОЛ (OhkaHa П., 1978) и В такой же степени возрастает способность гомогенатов ткани и сыворотки крови к перехвату 0а~ аниона (Wishikimi ft.. 1972). Эффективность антиоксидантной защиты ткани, леченных 4-МУ и карноэшюм в условиях этого эхсперинента выше, чем при лечении альфа-токоферол ацетатом.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о тон, что эквииолярные количества 4-МУ и карнозина в опытах in vitro и in vivo обнаруживают очень близкий антиоксидантный эффект. Снижение содержания продуктов свободнорадикального окисления наблюдается не только в тканях раны, но и в сыворотке крови, указывая на генерализованное антиоксидантное действие этих веществ.

Чтобы выяснить, как антиоксидантная активность 4-МУ, карнозина и альфа-токоферола влияет на окончательное заживление раневого дефекта, была проведана серия экспериментов, в которых на участок повреждения 1 раз в сутки в течение Ь дней наносили по 20 мкмолай одного из препаратов, затем удаляли кольца и за ходом заливленип следили с помощью планиметрического метода. Нсиболоо вырагешшй эффехт лечения наблюдали на 10-15 сутки после операции. Так, на 10 сутки при лечении ран 4-ЧУ раонор ран был на 20*, а при лечении карнозином - на 40* меньше, чей у контрольных животных. На более поздних сроках разный« в скорости заживления ран у опытных и -контрольных ви вот них становилась ианыяе, указывая на то, что пптног.сндантныа препараты эффективны главным образом на начальных стадиях процесса. Защищая ткани от активных форм кислород.", и ПОЛ, они снижают интенсивность деструктивных процессоь и ране, сокращают продолжительность фазы воспалении и стимулируют ткань к началу пролиферации в Солае ранние сроки иосяа нанесения травмы {см. табл. 9).

Таблица 9.

Действие 4-МУ, карнозина и альфа-токоФерола на процесс заживления ран

Использованные препараты Размер "ан в 2 после операции Срок полной эпитализации в сутках Ускорение эпитализации в % от контроля

7 сутки 10 сутки 15 сутки

Физиологический заствор п-10 268.6+16 164.2+31 37. 5+14 24.3+1.4 ' -

гастительное масло п_6 265.9+12 152.0+41 37.1+3 26. 0+1. 2 93. 7±15

4-Метилурацид п-6 246. 4+17 140. 3+34 34.7+11 22. 0+2. 2 113.0^0

Карнозин п-9 255. 8+18 100. 7+21 29. 7+6 19.4+1.9 125. 0+9. 7

Альфа-Токоферол "п-5 260. 7±13 126. 3±49 . 35.3+2 23. 0±1. 5 ' 106. 0+5

п - количество животных, использованых в эксперименте

S-!

XII.2.3. Гепатопротекторное действие 4-МУ и карнозина при поражении печени CC1«.

Острие отравления хлорированными углев/родами занимают 2-4 место среди всех отравлений различными химическими веществами (Трехтекгерц М.И., 1964; Скакун Н.П., 1869; Губский Ю.И., 1889). При контакте с CCI* и 1,2-дихлорэтаном больше всего страдают печень и почки. Будучи липотропным соединением CC1« дезорганизует мембраны, нарушает работу ионных каналов, вызывает разобщение биологического окисления и окислительного фосфорилирования. В ходе биотрансформации ксенобиотика в гепатоцитах образуются свободнорадикальные продукты метаболизма CCI* и нарастает гиперлнпопероксидация. Свободные радикалы, и прежде всего СС1э- , связываются с макромолекулами клетки, увеличивая глубину повреждающего действия CCU (Halliwell В., 1984; Косткж В.Д., 1991). В этой связи становится понятным, почему в лечении токсического гепатита, вызванного хлорированными углеводородами, все шире используют антиоксиданты, а поиск новых препаратов этой группы, способных препятствовать развитию тяжелых последствий контакта человека с CCI* остается актуальным. Учитывая результаты, описанные в предыдущем раздело, мы попытались оценить действие 4-МУ и карнозина на печень, поврежденную CC1«, и сравнить его с действием традиционного гепатопротектора - витамина Dia.

Острый токсический гепатит ' вызывали 4-х кратным подкожным введением 50Х-иого масляного'раствора CCI-. 1 раз в сутки в объеме 0.4 мл на 100 г массы животного. 4-МУ и карнозин вводили внутрибрювинно в эквимолярных количьствах в доза 4t мкмолой на 100 г массы животного. Бигамии 5ц вводили по схема и в количествах. обычно используоних в терапии токсического гепатита (Кудрин А.Н., 1DB2). Лочснив проводили в течение 10 дннй ежедневно 1 раз в сутки, парную инъекции - за 2 часа до -первого внпдония 00)«. Ъ экспериментах этой серии использовали 150 крыс-самцов мсой около 20U г, которые били разделены на Ь групп: 2-q

контрольные - интактные животные и животные, получавшие только CCI4 и 3 опытные, в которых животным вводили CCI* и препараты 4-МУ, карнозина и витамина Bia.

На 3-, 6- и 10-е сутки от начала эксперимента 10 животных каждой группы забивали, брали кровь и ткань печени для биохимических и морфологических исследований. В сыворотке крови определяли активность ге атоспецифических Ферментов - аланинаминотрансфераэы (АЛТ) /КФ 2.В.1.2/ (Меньшиков В.В., 1087) и гистидазы /КФ 4.3.1.3/ (Федоров С.М., 1988), содержание билирубина (Меньшиков В.В.6 1987), уровень которого свидетельствовал о состоянии желчеобраэовательной и желчевыделительной Функции печени. Уровень гиперлипопероксидации оценивали по содержанию ТБК-активных продуктов в сыворотке крови и гомогенате печени (Ohkawa H., 1979). На гистологических препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином подсчитывали число митозов для определения митотического индекса (МИ) в а интесивность дистрофических изменений, макрофагальной и Фибробластической реакции, развитие грануляционной ткани оценивали по 5 ба.-.чьной системе, предложенной А.Б. Иехтером (Вехтер А. Б., 1982) .

Морфологические исследования срезов печени животных, получавших только СС1-», на 3-й сутки от начала эксперимента показали выраженные изменения гепатоцитов. Отмечаются очаги некрозов, развивается воспалительная реакция,

сопровождающаяся инфильтрацией ткани лимфоцитами и макрофагами, наблюдаются дистрофические изменения клеток, возрастает количество купферовских кяёток

гепатомакрофагов, часть некротизированной ткани замещается соединительной тканью. Среди неповрежденных гепатоцитов увеличивается число клеток с фигурами митозов (МИ О.рЗХ), указывал на усиление регенерации паренхиматозной ткани.

Как видно из табл. 10, в сыворотке крови возрастает активность АЛТ. и гистидазы в, 8 и 14.7 раза, а количестро билирубина - в 4.6 раза, свидетельствуя о той, что СС1«

Таблица 1С.

Изменив биохимических характеристик сыворотки крови крыс с экспериментальным гепатиток в процессе лечения 4-Ю*, карнозином и витамином вТо

Показатели Время в сут. 1 йнтатаные кивотные Животные с экспериментальным гепатитом

контроль + карнозин + 4-МУ + витамин В12

АЛТ мкмоль/час 3 0. 6+0. 03 5.1±0.24* (834. 8%) 4. 4±0. 3* (724. 62) Ь. 3±0.15* (877. ОХ) 4. 5±0.16* (737. 7%)

6 0. 65±й. 04 3.21 ±0.21* (490.1%) 2. 34±0.16* • (357.91) 2. 64±0. 08* (402.37.) 2. б5±0.23 (435.42)

Ю 0. 63+0.04 1.210. 06* (191.07.) 0. 71±0. 11* (112.81) 1.02±0. 09* (162.12) 0.953±0.07* (151.22)

Гистидаза ныохъ в мин на л 3 0. 05г0. 01 '"'' 0."7&5±0. 06* (1472. 67.) 0. 45*0. 05* (837. 92) 0. 74±0. 02* (1377. 82) 0. 69±0. 05* (1274. 02)

б 0. 05±-0. С04 0. 442+0. 002* (876. 9« 0. 244±0. 02* (444. 4%) 0. 413±0. 02* (819. 42) 0. 3?7±0. 01? (748. 62)

1С 0. 089±0. 07 0. 35+0. 03* • (396. 8%) 0.135±0. 02* (153.17.) ■ 0. 24+0. 02* (274.32) 0. 24±0.02* (253.92)

Билирубин УС/ЦХ. о. б£+о. ой 2. 82+0. 13* (4597.) 1. 82±0.13* (306. ОХ) 2. 30±0.12* (374. 42) 2. 4й±0. Об (389.72)

0 и. 74±0. 04 1.79±0.11* (241.2%) 1. 00+0. 06* (134.8%) 1.19±0. 06* (160.02) 1. 06+0. 03 (142. 82)

ю 0. 53±0. 05 0. 88+0. 05* (150. 72} 0. 65±0. 03* (123. 22) 0. 66±0. 04* (123. 72) 0. 70+0. 04* (131.82)

* - Различия опытнш данных и контроля при р < 0.05

дезорганизует клеточные мембраны и нарушает

желчеобразовательную и желчевыд^лительную Функции печени.■В ткани печени в 2 раза возрастает содержание ТБК-активных продуктоз, включающих малиновый диальдегид (МДА) и другие поздние продукты ПОЛ (см. рис. ltf).

Одновременное введение CC.l<i и препаратов 4-МУ, карноэииа или витамина В12В первые 3-е суток экспе, имента частично защищает животных от токсического действия яда. У крыс этих групп по сравнению с нелеченными животными достоверно уменьшается число очагов некроза, снижается интенсивность дистрофических' изменений. Однако, активность АЛТ и гистидазы, содержание билирубина в сыворотк° крови снижается на 152 по сравнению с теми же показателями у полеченной группы.

Эффективно влияет 4-МУ и карнознн на уровень гиперлипопероксидации. Инъекции препаратов снижают образование ТЕК-активных продуктов на 25-35% ниже значений нормы, еще раз подтверждая ранее полученные результаты о том,, что 4-МУ и карнозин способны' непосредственно в; имодействовать с продуктами свободнорадикального окисления, а, возможно, активировать систему антиоксидантной зашиты.

Введение препаратов на фоне СС14 по разному влияет на скорость репаративной регенерации. У нелеченных животных на 3-й сутки от начала эксперимента повреждение печени вызывает увеличение МИ ткани с 0.03*0.01 (интактные животные) до 0.93*0.1. Для животных, получавших 4-МУ или витамин Biz МИ гепатоцитов практически не отличается от ' значения, характерного для нелеченных крыс, тогда как введение карнозина более чем вдвое увеличивает число делящихся клеток (МИ = 1.93 + 0.4). '

По морфологическим данным после прекращения введения CCI« ткань печени быстро восстанавливается у животных всех групп, н на 6- и 10-е сутки между группами не обнаружираются достоверные морфофункциональные различия.

з/

2G0 --

100

3 сутки

Й i*

20Q--

100--

б сутки

I 2 3

12 3 4

200'

100- -

äl

10 сутки

йг

12 3 4

1 - cci4

2 - CCI^ карнозип

3 - СС14 + -1-1,!У

4 - СС14 + вит. В12

Рис. Iii. Изменение содержание ТРК-вкунв-них продуктов 11 гомогенатах печени крыс с экспериментальным гепатитом в коме лечэ-пи* карноэинон, 4-МУ и витамином Ргз (в tот контроля).

Результаты биохимических исследований позволяют болея тонко диагносцировать состояние печени. Так, если к 30 суткам уровень АЛТ и гистидазы в сыворотке крови нелеченных животных в 1.9 и 3.9 раза превышает норму, то в группе получавшей карнозин, он приближается к значениям, характерным для здоровых животных. Группы, которые получали 4-МУ и витамин В12, занимают промежуточну , позицию, у них активность АЛТ в среднем в 1.6 и 1.5, а гистидазы.- в 2.7 и 2.5 раза выше значений нормы. Желчевыделение быстрее всего восстанавливается у животных, леченных 4-МУ и карнозином. На 10-е сутки содержание билирубина у них выше нормы примерно ну 232. Проведенные эксперименты показали, что лечение 4-МУ р. кожных ранах и печени, поврежденной СС1.», снижает ПОЛ, сокращает продолжительность воспалительной фазы, препятствует окислительной деструкции клеток. Способность 4-МУ пзимодействовать со свободнорадикальными продуктами ПОЛ, измеренная в опытах in vitro и in vivo практически равна антиоксидантной активности карнозина, хотя ранозаживлявщее д^йбтвие последнего выражено значительно сильнее. Учитывая, чт оба вещества обнаруживают свойства неспецнфических иммуностимуляторов, мы пытались выяснить, не связан ли разный терапевтический эффект 4-МУ и карнозина с этим свойством препаратов. Совместно с М.В. Онуфриевым и Г.И. Потаповой исследовали действие 4-МУ и карнозина на начальное звено система иммунитета - активацию макрофагов. На перитониальных макрофагах мышей линии СЗНА показали, что in vit.ro и in vivo оба соединения способны активировать макрофаги, но карнозин действует сильнее и продолжительнее. Активированные макрофаги синтезируют и секретируют ростов эмулирующие факторы, которые побуждают клетки к росту и делению, обеспечивая более раннее восстановление биохимических и морфофункциональных характеристик органа (Бабаева А.Г., 1985; Маянский А.Н., 1989; Маянский Д.Н., 1992). Думается, что разную эффективность 4-МУ и карнозина в чочрнии повреждений можно хотя бы частично объяснить различной спссобноот-гЯ к активации макрофагов.

ьи

IV. Исследование участии поликатионов в регуляции синтеза ДНК и РНК в печени и ранах кожи.

Поликатионы играют ведущую' роль в процессах хранения и реализации генетической информации. В эукариотических организмах природные поликатионные белки, такие как гистоны и протамины, нейтрализуя множественный отрицательный заряд фосфатных групп полинуклеотидных цепей, определяют характер укладки ДНК хроматина соматических и половых клеток (Буш Г., 1967;. Isenberg I. , 1979; Kornberg R.D.,1981; Courtens I.L., 1988; Zang D.E., 1988). С другой стороны низкомолекулярные поликатионы: спермин, спермидин и путресцин представляют собой митогенны«» полиамины и участвуют в передаче пролиферативного сигнала в клетку (Pegg А.Е., 1982-1988; Tabor C.w.; 1984; Бердинских 11.К., 1987; Ярыгин К.Н., 196.). Взаимодействуя с ДНК ядра, те и другие непосредственно включаются в регуляцию репликации и транскрипции.

Из всего набора поликатионов природного и синтетического происхождения в медицине особое место принадлежит протаминам. Они не оказывают аллергического действия и способны легко транспортироваться в клетки, так как для них проницаемы плазматическая и ядорная мембраны (Буш Г., 1987; Брауде А.И., 1968). Протамины используют в лечебной практике как вещества, пролонгирующие действие лекарственных препаратов и как гемостатнческов средство для отмены антикоагулянтного действии гепарина, который широко используется в клинике при экстракорпоральных вмешательствах (Маяковский М.Д., 1ÖG6; Струкова С.П., 1091; Saliba П., 1990).

В процессе сперматогенеза протамины, прочно связываясь с яДНК вытесняют гистоны из ДНП хроматина и переводят ДНК в компактную, биологически инертную форму (НоаЬ В., 1974; Maruatiige К., 1985; Hecht К.В., 1985; Кадура Г.Д., 1006). Это свойство прогаминов привлекло внимание онкологов. Появился ряд работ, в которых показана их способность тормозить рост некоторых опухолей и даже вызывать регрессию (Hughes L.E., 1964; Muggleton R.M., 1974). Полученные

результаты позволяли надеяться, что применение протаминов как таковых или в комбинации с синтетическими противоопухолевыми препаратами . молет оказаться перспективным в химиотерапии опухолей.

В целях поиска препаратов этой группы сотрудниками химического факультета МГУ были выделены и охарактеризованы белки класса протаминов из молок кас .нйского осетра Acipenser ßi iIdenstadti , названные стуринами А и В. ' Для обоих белков была установлена первичная структура (Юликова Е.П., 1976; Буланова А.И., 1976; Рыбин В.К., 1980). Показано, что они имеют одинаковую молекулярную массу, но качественно различный аминокислотный соста- Полнпептидные .цени состоят из 27 аминокислот, из которых 20 представлены аргинином, лизином и гистидином. По количеству основных аминокислот стуринн не отличаются от других протаминов, но длина их полнпептидной цепи на 3-5 остатков короче, благодаря чему они представляют самые щелочные белки этой группы.

Чтобы оценить перспективность стуринов А и. В п качестге нн лбпторов синтеза ДНК, мы п опытах in vivo и in vitro изучали влияний этих белков на синтез ядерной и митохондриальной ДНК в гепатоцитах регенерирующей печени и на активность ТК и PHP.

XV.1. Влияние стуриноп А и В на синтез ДИК, активность ТК и PHP в регенерирующей печени крыс.

Однократное внутривенное введение стуринов Д и В в максимально допустимой терапевтической дозе (6 мг на 100 г массы «цветного) сразу после операции ЧГЭ замедляет процесс регянордшш печени. Как видно из табл. 11 по сравнению с контролем стурины снижают включение Нэ-тимидина в HifllK на 20-30% и в мтДНК на 40-502 во временных точках спотротстг-укщпх максимумам волн- синтеза ДНК п ядрах и митохондриях.

Табли:' i 11.

влияние стуринов Л и В на включение Нэ-тимидина во фракции ядер и митохондрий регенерирующей печени крыс в опытах in vivo (в имп. в мин на мкг ДНК)

Фракция Регенерируцая печень

контроль + стурин Л . + стурин В

Ядра, 18 ч после ЧГЭ 350 i 50 28ü t 42 270 i. 37

Михондрии, 26 ч

после ЧГЭ 218 i 32 122 i. 21 111 i. 20

Ингибировапие синтеза ¡'ДНК сопровождается снижением активности ядерной TK примерно на 45-55% и PHP на 20-30», тогда как активность митохондриальных ферментов практически не снижается.

В опытах in vitro препараты стуринов А и В в интервала концентраций 10-ц - 10~3 M ингибируют активность обоих Ферментов как ядерного, так и митохондриального происхождении <см. рис. 19). При добавлении к инкубационным пробам стуринов в концентрации 10~3 - Ю-4 И мтТГ. и мтРНГ теряют 70-90% активности, а я'ГК и яРНР - только 30-40%. Диализ литературных данных показал, что и опытах in vitro при добавлении про-гаминов к хроматину соматических клеток происходит их неспецифичеокое связываание с ДНК с образованием хромзтии-протэминовых комплексов (Wuiig Т.К., llJö-'.; Кадурц С.Н., 19В6). 3-4 спиральных сегмента (по числу :;ло,;оь основных аминокислот) укладываются в большую бороздку J!i!t о одной молекулы ДНК, либо разнух, В результат« возможно оорйзог-ание сшивок между соседними молекулами н Формирование оччнь плотной упаковки генетического материала,

НоРмегьоримого при низкой и умеренной ионной силе. Поскольку ь »i.p« TK н PHP скорее всего входят в р^плисимный кимиикко, структур« которого под действием стуринов А И В изменяется с условиях in vivo и in vitro сходным образом, то в экспериментах обоих вариантов активность этих Ферментов

снижается в равной степени. По-другому ведут себя

ммтохендриальние Ферменты:' & опытах in vivo tut пика синтеза

мтДНК активность ТК и PHP высока, и введение стуриноп сразу поело операции ЧГЭ ее не снижает; в опытах in vitro поликатионы вызывают почти полную инактипацига обоих Ферментов. Объяснить эти результаты сложно, и, возможно, они связаны с особенностями строения митохондриальних мембран.

Обращает на себя внимание то, что ингибирующео влияние стурина А на синтез ДНК и активность ферме..тов сильнее, чем стурина В. Это, очевидно, является следствием различий в первичной структуре белков: в стурине Л среди основных аминокислот наряду с аргинином входит 5 остатков лизина и 3 гнетидина, а ■ в стурине В все основные аминокислоты представлены аргинином. Эти различия сказываются на способности стуринов связываться с ДНК, обеспечивают стурину Л более прочное связывание с ДНК (Рыбин В.К., 1980) и более значительное снижение скорости репликации при введении яивотным.

Рис. 13. Влияние стуринов А( 1.3) и В(2, 4)г"Г актив"**.-"*. ннтохондриалыюй (1,2) и ядерной (3,4) ТК (А) ,7 PHP (D) в регенерирующей печени

.г рис.

Таким образом ,н этом разделе работи было устаное оно, что стурины Л и В новые белки из класса протаминов обладают умеренной антипролиферативной активностью и способны ингибировать активность TK и PHP, уменьшая размер Фонда предшественников ДНК. Однако, можно полагать, что применение этих белков в химиотерапии опухолей будет сдерживаться из-за побочных эффектов: введение протамин сульфата для отмены антикоагулянтного действия гепарина иногда сопровождается развитием "rebound"-реакции, нарушениями со стороны сердечно-сосудистой системы, а при нысоких дозах - собственным антикоагулянтным действием (Vullmar В., 1989; Nuttall G.А., 1991; Habbhahn I.,1891).

В то же вреьл создание теории нейтрализации гепарина открыло широкую перспектиьу поиска аналогов протаминов 6o.ee селективного действия.

IV.2. Влиянии синтетического антагониста гепарина - четвертичной аммонийной соли ositroичрл 25 коиндина (ЧАС 0-25 К) на синтез НК в печени и r.oso и ходе репаратишюй рогенерации.

С конца 50-х годов начали испытнватьсн и нашли

клиническое применение синтетические полипари, посуши,

положительный заряд: ионенк, полибрены, молииинплг.иримилини

и др. (Koroson H., 19/1, 1975; Rembnua A.., 1973; Ефциоь

b.c., 106'J, 1974, 1070, 1983; Кнсьнненко В.Б., 1975).

Ли гиг епаринатная" активность этих соединений, как правило,

выше, чем у протпшш сульфата, потому что они обладают бол««

высокой специфичностью связывания с гепарином, и » отличиу от протамннос почти ье уступают в соединении с ^елками плазмы. R то >,о >.реии для большинства этих соеднпоцш' :;г.ра;порна Соле« высокой токсичность.

В ,:ьта системагич^ских исследований ксподнспсрсныз; uJHivHupob час Хинидина был найден активный и и лотокенчцый актигепаринат, у которого функциональное звено повторяете.« 25 раз. а положительный заряд обусловлен четвертичный атоном азота конидии» - ЧАС 0-25 К (Некрасов A.B., 19В1; Ефимов B.C., 1983). Посла процедуры гемосорбции и других

экстракорпоральных вмешательств рассчитанной дозой ЧАС 0-25 К мо,sho восстановить свертываемость кропи в течение 5 мин. Это соединение выгодно отличается от протамин сульфата и других препаратов того же назначения тем, что не увеличивает тромбоцитопению, которая является одним из серьезных осложнений экстракорпоральных воздействий на гемостаз. Суцественным недостатком препарата является то, что в животном организме он не подвергается биотрансформации, накапливается преимущественно в печени и медленно выводится с мочой в течение 3-х месяцев (Ефимов B.C., 1983 ).

Принимая во внимание поликатионную приводу ЧАС 0-25 К можно предполагать, что подобно протаминам он может связываться с НК, 1 мембранами и белками и менять их функциональную активность. В этой связи главными задачами,

определяющими возможность применения ЧАС 0-25 К р

медицинской практике становится выяснение его локализации в основных структурах гепатоцитов, характера взаимодействия с внутриклеточными компонентами, влияния на репликативные и тр." чскрипиионние процессы в органе.' Другими словами необходимо получить данные, которые прогнозирсралн бы возможные последствия длительного пребывания преппрата в печени.

IV.2.1. Изучение локализации ЧАС 0-25 К и гепарина п субклеточных Фракциях печени.

Через 20 ч после операции ЧГЭ и внутриренного пведения С14-ЧЛС 0-25 К в клетках печени обнаруживается значительное содержание радиоактивности. Во фракции цитозоля определяется 75-80% общей радиоактивности, в митохондриях - 10-12%, микросомах - 1.0-2.5% и ядрах - 8-10%. В митохондриях (!»■«-ЧАС 0-25 К накапливается в матриксе (922), в ядрах - в ДНП Фракции (до 45%). В мембранах ядер и глобулиновой фракции обнаруживается в значительно меньших количествах: 27.8 и 17.2% соответственно. Аналогичные результаты получены при последовательном введении гепарина и С14-ЧЛС 0-25 К. Они подтверждают пр^дполс■ ;ние о том, что ЧАС 0-25 К, подобно

протаминам, проходит через плазматическую, ядерную и митохондриальную мембраны гепатоцитов.Попадая в'митохондрии, поликатион образует, видимо, прочные полимер-полимерные комплексы с мтДНК, а проходя через ядерную мембрану - с ДНК хроматина. О прочности взаимодействия противоионов свидетельствует тот факт, что метка С14-

ЧАС 0-25 К остается частично связанной с ДНК даже после процедуры выделения ДНК по модифицированному методу Шмидта и Тангаузера (Трудолюбова М.Г., 1977). С РНК С^-ЧАС 0-25 К связывается менее прочно и препараты РНК, выделенные из тканей для количественного определения, не содержат радиоактивности.

Исследовали |зменеиия в распределении ЧАС 0-25 К и гепарина в клетках и субклеточных органеллах в течени' 6 суток после внутривенного введения обоих полнэлоктролитов. Как видно из табл. 12 радиоактивность, принадлежяз1ая Б30-гепарину, в гомогенатах печени и селезенки животных, получавших 53®-гепарин или 5за-гепарин и ЧАС 0-25 К, снижается медленно: и гомогенатах печени к 8-м суткам примерно на ЗОХ, а в гомогенатах селезенки сохраняется на уровне первого дня. За этот же период метка С1-1-ЧЛС 0-25 К в тканях животных, которым вводили только С1-1-ЧАС 0-25 К или гепарин и С1,4-ЧАС 0-25 К, перераспределяется следующим образом: в гоиогонато селезенки снижается на 40Х, а в гомогенате печени на 2-е сутки .- на 20Х с последующим увеличением к 8-м суткам до исходного уровня.

Важным для понимания механизма транспорта полиэлектролитов является тот факт, 'что- при

последовательном введении 530-гепарина и ЧАС 0-25 К количество поступающего в ткани гепарина увеличивается в 2-3 раза, тогда ка количество С14-ЧАС 0-25 К, включающегося в клетки самостоятельно или при комбинированном введении с гепарином, остается практически одинаковым. Это указывает на способность ЧАС 0-25 К подобно протаминам и полндизииу увеличивать поступление в клетки полианионоь (Сиуаги В.,1988).

Таблица 12.

Включение 5ЗЬ.-гепарина и с14-ЧАС 0-25 К в селезенку и регенерирующую печень крыс

/в 7. от дозы радиоактивности/

Объект исследования Время после введения /сутки/ Распределение радиоактивности после введения препаратов

Бэо-гепарин 535,-гепарин+ ЧАС полико-нидин гепарин+ЧАС Ст'-поликонидин . ЧАС с",- поликони- дин

Гомогенат селезенки 1 1 1. 3510. 25 П-9 35±0.37 п-8 1. 26±0. 27 п-7 1. ¿5±0.05 п-7

2 1. 28±0. 005 п-4 3. 57±0. 18 п-4 1.18±0.1 п-6

8 1/28*0. 006 п-4 ' 2.9310.10 п-4 0. 77±0.13 п-6

Гомогенат печени 1 9. 03+2. 6 п-9 26. 18±3. 08 п-8 9. 84±1. 76 п-7 10.91+1.20 п-7

2 5. 50+0. 21 п-4 - 10. ё5±0. Об п-4 7. ¿3±1.2? п-6

а б. 04±0. 49 п-4 16.8+1.5 ' п-4 9. 5+2.03 п-6

п - количество использованных в эксперимента животных

Наблюдающиеся различия в скорости выведения гепарина и ЧАС 0-25 К объясняются, очевидно, тем, что гепарин, будучи природным метаболитом подвергается в организме гидролитическому расщеплению, поэтому распределение S30-метки на 8-е сутки после введения скорее всего отражает локализацию не столько самого гепарина, сколько продуктов его 'деградации /по литературным данным период полужизни гепарина в плазме крови колеблется от 0.5 до 1.5 суток (Ульянов A.M., 1977)/. ЧАС 0-25 К напротив метаболически стабилен, накапливается в печени и выводится медленно.

К 8-н суткам содержание моченных препаратов в митохондриях и ядрах печени снижается в среднем на 30», а во Фракции цитоплазм .тических белков количество С14-ЧЛС 0-25 К возрастает примерно в 2.5 раза, около половины с1'1-ЧАС 0-25 К, поступающего в ядра, связывается с ДНП и за 8 суток количество препарата, присутствующего в хроматине, достоверно не уменьшается. За то же время метка 23=-гепарина выводится из ядерной фракции активно, и к 8-м суткам ее содержание в этих.органеллах снижается в 3-4 раза.

Таким образом в течение 8 суток у животных, получавших ЧАС 0-25 К происходит его перераспределением в организме с преимущественным накоплением в печени.

IV. 2.2. Связывание С14-ЧАС 0-25 К и S3n-renapiiHn с белками постмитохондриальной фракции печени.

Чтобы выяснить, существует _ ли связывание

полиэлектролитов с белками цитозоля и как оно меняется, от сроков после введения препаратов, с помощью голь-фнльтрацяи изучали распределение радиоактивности . на профиле элюции белков постмитохондриальной фракции, выделенной из печени животных, которым вводили С14-ЧАС 0-25 К или гепарин и С14-ЧАС 0-25 К. Обнаружили 3-4 пика радиоактивности, один из которых располагается в области надмолекулярных структур с М.и. 170000 кД, второй - в области белков с Н.м. 200-230 кД, а третий .- в области свободного С^-ЧАС 0-25 К (см

постннтохондриаяьной фракции белков печени

По оси абсцисс - отношение объема элюата К общему объему колонки.

По оси ординат: слева - белок (в 1й мг), и радиоактивность (в им9'мнн*103) соответст-но; справа - белок (в мг/мл).

I - кривая элюции белков, Егоо;

II - кривая распределения С1/,-ЧАС 0-25 К во фракции белков от животных, получавших С14-ЧАС 0-25 К только; х

III - кривая распределения СЧ-ЧАС 0-25 К среди белков от животных, получавших С14-ЧАС 0-25 К и гепарин;

IV - калибровка колонки соединенийми с из-ве-тной молекулярной массой;

1 - диннтрофенилаланин; 2 - витамин 131а; 3 - альбумин; .4 - каталаза; 5 - ферритин; б - голубой декстран,-

рис. 20). Для фракций, полученных от животных, которым препараты вводили за 1.2 и в суток до забоя, ризультаты хорошо совпадали. У животных, которым вводили только С14-ЧАС 0-25 К, около 50Х препарата выходило с колонки в свободном виде, тогда как последовательное введение гепарина и С14-ЧАС 0-25 К увеличивало связывание метки с белками.

На профиле элюции белков, полученных от животных, которым вводили Бзв-гепарин и ЧАС 0-25 К за 1 и 2 дня до забоя, более 50Х радиоактивности определялось во фракции неорганических сульфатов, а остальная часть связывалась с белками разной молекулярной массы. На кривой элюции среди радиоактивных фракций обнаруживался пик с М.м. 200 кД, соответствующий lгорому пику на кривой рис. 20. Содержание в нем метки было невелико при введении только Бэ0-гепарина но возрастало более чем вдвое при сочетанием введении S3e-гепарина и ЧАС 0-25 К. Это указывает на существование в составе цитоплазматических белков фракций, обладающих сродством к полиэлектролитам и поликатион-полианиошшн комплексам. Полученные результаты согласуются с литературными данными о том, что сильное сродство гепарина к протаминам и гистонам обеспечивает его транспорт в ядра (Bayard D.,1986). Очевидно, в организме образование высокомолекулярных комплексов, объединяющих две

противоположно заряженные молекулы, служит для нейтрализации, тарнспорта и деградации полиэлокторлитов.

IV.2.3. Влияние ЧАС 0-25 К на синтез ДНК в печинн и селезенке крыс после ЧГЭ и химического поражения, »ыэванногс

CCI«

Для того, чтобы проверить как влияет длитолыюе присутствие препарата в организме на процесс репарации, был; изучена динамика регенерации печени после ЧГЭ и однократногс пвед&ния ЧАС 0-25 К в тачание ВО дней. Как видно из кривы; рис. 21 между 8-ми и 25-ми сутками поликатион обеспечивав-болев быстрое увеличение массы печени по сравнению контролем. До 9-х суток содержание ДНК в 1 г нассы печеш

опытных животных достоверно выше, чем в Контрольной. К 20-му дню эти различия нивелируются и содержание ДНК на г ткани снижается. Регенерация заканчивается и печень переключается-на выполнение тканеспецифических функций. По мере прекращения роста органа количество цитоплазматического компонента клетки возрастает, а содерхение ДНК в 1 г ткани убывает.

сутки

Рис. 21. Влияние ЧАС 0-25 К на массу печени и содержание ДНК в ходе регенерации после ЧГЭ.

А - содержание ДНК; В - изменение массы органа.

- опыт; ---------- контроль.

Изучали влияние гепарина, ЧАС 0-25 К и их г следовательного введения в • организм на интенсивность синтеза сДНК селезенки и печени, а также на синетз яДНК и мтДНК гепатоцитов в . течение первых 8-ми суток от начала эксперимента. Как видно из табл. 13 введение гепарина за сутки до забоя снижает включение Нэ-тимидина в ДНК

Таблица 13.

Влияние ЧАС 0-25 К и гепарина на включение н=Чтимидина в ДНК печени и селезенки после ЧГЭ •

Исследуемые вещества Время после введе-/сутки/ ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ

Гомогенат селезенки Гомогента печени Митохондрии Ядра

Гепарин 1 54.1±1.1 п-5 43. 7-5. б п-5 71. 7±7.1 п-8 64. 5±23.1 п-8

ЧАС С14-П0ЛИ-коякдиш. 1 101. 5±10. б п-7 130. 3±12. 4 п-5 103. ±10. 2 п-5 111. 4±15.1 п-6

Гепарин + чад С1-: по- ЛЙКОНИДИН. . 1 83. 7x14. 1 г>-8 57. 3±7. 8 п-8 95. 95±6. 4 п-8 93. 6*18.1 п-8

2 5 94. 3±5.1 п-в 86.5+10.97 п-7 154. 7±16. 5 п-6 129. 2±9. 4 п-7

89. 9±0.1 п-8 122. £±16. 4 п-5 122.0+24.1 п-5 144. 8±14.1 п-8

п,- количество шьотных г, эксперименте

гомогенатов печени и селезенки д<? 43.7 и 54. IX соответственно от контроля. Результаты согласуются. - с имеющимися сведениями о том, что гепарин снижает включение Нэ-тимидина в клетки кульгуры А-1, тормозит митотнческую активность нормальных и опухолевых тканей, блокируя переход из поздней телофазы к интерфазу следующего цикла (Плючкин В.П., 1976; Tessari F. , 1939; Williams S..1., 1991; Clowes A.W., 1991). Неханизм действия на репликацию и деление клеток пока но вполне ясен. Полагают, что ведущую роль в реализации этого эффекта играет взаимодействие гликозамингликана с хроматином.

Последовательное введение гепарина и ЧАС 0-25 К увеличивает поступление антикоагулянта в клетки (см. табл. 12), но усиления ингибирования синтеза ДНК при этом не происходит, более того, на 2-е и 8-е сутки отмечается некоторая стимуляция включения Нэ-тимидина в ДНК по сравнению с контролем (табл. 13). Это дает основания полагать, что ннгибирование синтеза ДНК через 24 часа после внутривенного введения гепарина и ЧАС 0-25 К' обусловлено ге-зриновым компонентом. Гепарин быстро десулъфэтнруется, теряет свои биологические свойства и шггибируK>>>;es действие препаратов исчезает. Введение животным только ЧАС 0-25 К вызывает даже некоторую активацию включения С14-тимидина в ДНК. Из полученных результатов следует, что действие ЧАС 025 К на синтез ДНК отличается от действия протаминов и больше напоминает влияние на генетический аппарат клетки другой группы поликатионов - полиаминов.

Для того, чтобы лучие понять причины различий в функциональной активности ДНК хроматина из регенерирующей печени животных, получавших ЧАС 0-25 К и из печени крыс, которым вводили стурииы, в' опытах in vitro изучали пространственную организацию и свойства комплексов ЧАС 025 К и ДНК. Сотрудники института молекулярной биологин с использованием физико-химических методов исследования показали, что ЧАС 0-25 К не только связывается с молекулами ДНК, по образует межд- ними "сшивки", обеспечивающие высокую

плотность укладки в пространства. Добавки даже небольших количеств гепарина разрушают структуру комплекса, и молекулы ДНК возвращаются в нативное состояние. Однако, сравнение свойств комплексов ДНК-ЧАС 0-25 К и ДНК-стурины свидетельствует о большой прочности последних.

Думается, что в различиях строения комплексов ЦНК с ЧАС 0-25 К и стуринани могут быть заложены причини разной матричной активности ДНК хроматина животных, получавших поликатионы in vivo. ,

О способности ЧАС 0-25 К стимулировать" репаративную регенерацию тканей свидетельствуют также результаты,' полученные при исследовании действия препарата на восстановление зчани после токсического поражения CCI«. Совместно с В.А. Голенченко и Б.Я. Хацерновой нами гыло показано, что в условиях эксперимента, описанного в разделе III.2.3., однократное введение животным рассчитанной дозы ЧАС 0-25 К уненьшает число очагов некрозов . и интенсивность дистрофических изменений в печени. На 3-и сутки от начала эксперимента количество митозов в гепатоцитах увеличивается в 3-3.5 раза по сравнению с контролем. На 10 сутки основные показатели ткани печени животных, леченных ЧАС 0-25 К, приближаются к значениям, свойственным для . здоровых животных, что выгодно отличает их от групп крыс, которых лечили с помощью инъекций витамина В»2 или 4-МУ.

IV.2.4. Влияние ЧАС 0-25 К на синтез .ДНК и ГНК о печени интактнмх животных.

Чтобы оценить влияние длительного присутствия ЧАС 0-25 К на репликативную и транскрипционную активность ДНК гьпатоцитов ингактных животных, была проведена серия экспериментов, в которых по включению Нэ-тимидина судили об изменениях в синтезе ДНК после однократной дозы поликатиона или гепарина и поликатиона в течение СО дней. Изменения в синтезе РНК в ответ на .введение'полиэлектролитов изучали на срезах печени, полученных от животных на 1-й и 3-й дет после инъекции препаратов (табл. 14). Через сутки после

введения ЧАС 0-25 К интенсивность включения С1*-оротчта и Нэ-уридина в сРНК срезов печени возрастает до 107 и 184Х от уровня контроля, а на 3-й сутки превышает его в 55.6 и 23.1 раза соответственно. При последовательной введении гепарина и ЧАС 0-25 К включение оротата и уридина в РНК нарастает медленнее и к 3-им суткам превышает контроль примерно в 6.5 и 2.8 раза.

Таблица 14.

Включение Нэ-уридина и сч-оротата в РНК срезов печени после введения животным ЧАС 0-25 К или гепарина и ЧАС 0-25 К (в X от контроля)

Сутки от начала экспери мента С14-оротат Нэ-уридин

ЧАС 0-25 К гепарин + ЧАС 0-25 К ЧАС 0-25 К гепарин + ЧАС 0-25 К

1 сутки 106.9t21.2 п=5 119. 21.14.4 п=7 183.9*29.6 п=6 171.31.51.3 п = 8

3 сутки 5560U398.3 п=8 647.3tl75.5 п = 7 2313t£29.7 п = 5 279.2t67.9 п-5

Учитывая результаты, полученные в опытах in vitro при изучении структуры комплексоб ЧАС 0-25 К с ДНК, можно предположить, что поликатион, попадая в ядра и митохондрии, конкурирует с гистонами и полиаминами за место связывания с ДНК. Этот процесс сопровождается разрыхлением

пространственной структуры хроматина и появлением дополнительных участков ДНК, доступных для транскрипции..В присутствии гепарина первоначально образуются комплексы гепарин-ЧАС 0-25 К, и эффект взаимодействия полнкатиона с ДНК оказывается отсроченным. Всплеск транскрипции кратковременен, и внтуриклеточные регуляторные системы сохраняют контроль над процессами синтеза ДНК и делением

на -

| 110 '

1100 м Е

Д 10

со -♦о -

Рис. 22. Включение Н3-тимпдина в ДНК гепатоцитов крис при внутривенном введо-дении ЧАС 0-25 К или гепарина и ЧАС 0-25 К (в X от контроля).

1 - ЧАС 0-25 К; 2 - гепарин + ЧАС 0-25 К. клеток. 06 этом свидетельствует рис. 22, на котором приведены • результаты по изучению динамики включения Н3-тимидина в ДНК в течение 60-ти суток после введения ЧАС 025 К или гепарина и ЧАС 0-25 К. Через 24 часа после введения ЧАС 0-25 К у группы животных, получавших только поликатион, наблюдается небольшая волна репликации. У животных, который вводили -гепарин и ЧАС 0-25 К, из-за иигибируюцего действия гепарина на репликацию, в течение первых дпух- суток включение. Нэ-тимидина в ДНК ниже контроля и первый всплеск репликации, обусловленный присутствием поликатисна, отмечается на 6 сутки. В печени в течение СО суток наблюдаются редкие волны включения Н3-тимидина ч ДНК, па 20-•122 превышавшие включение [предшественника в контрольные группы, ни 1 и 20 день для группы, получавшей только ЧАС 0-К, и на 0 и 35 сутки 'для группы, получавшей оба полиэлектролита. Представленные результаты позволяют предположить, что введение ЧАС 0-25 К вызывает синхронизацию клеточного цикла у части гепатоциго», н результате чего ьне пиков синтеза ДНК уровень включения мотки в ДНК опытных животных ниже, чем в контрольной группе.

Предложения по практическому применению результатов

исследования.

1. В 1970 г. бил разработан И использовался в лабораторией

практике метод получения С14-цитидиловых и уридиловнх нуклеотидов из' С14-цитидина или уридина с помощью Ферментного препарата из саркомы М-1 крыс. Этим способом с помощью ИОХ можно получать препарат" С14-ЦМФ, ЦДФ и ЦТФ (УМФ, УДФ и УТФ) с выходом 10-15, 40-60 и 20-40% соответственно /статья ho.l, ctjjsV.

2. В сыворотке крови животных после ЧГЭ обнаруживается ТК,

активность. которой коррелирует с интенсивностью репаративного процесса в органе. Фермент появляется в крови людей с воспалительными забилеваниями. Это позволяет рекомендовать тест на активность ТК крови в качестве маркера интенсивности пролиферативных процессов в тканях /статья No.12, стрВЙ/-

3. Способность ЧАС 0-25 К легко проникать в ткани организма

и ускорять процессы репаративной регенерации'позволила рекомендовать его в'качестве стимулятора пролиферативных процессов в травмированных органах /Силаера С.А., Хацернова Б.Я., Голенченко В.А., Гаврильчак А.В , Foskjih М.Я., Ефимов B.C., Шехтер Л.Б., Николаев А.Я..Берестецкая Т.З., Голованова П.М., Макарова Л.Р., Иванова A.C./.

Средство для стимулирования репаративной регенерации тканей. /No.5044859/14, приоритет 29.05.1992 г./ Для лечения ран и ожогов разработано раневое покрытие на основе коллагена с 5% ЧАС 0-25 К /Голованова П.М., Макарова Д.Р., ТуэоваН.Н., Малофеева Т.В., Ефимов B.C., Рилкин М.Я., Силаева С.А., Голенченко В.А., Хацернова Б.Я. 'Способ производства коллагенового

материала'У/'Полож. решение по заявке на изобретение Но.4045201/1« от 27.В.1990 г./.

-1. При изучении антнокиедлнтной активности 4-МУ и кчгнозина o-'HRpyy.fH t внсская ранозаяивлятсая способность кчрноз.'Н.-. 'jto ло^ло в основу разработки композиции Дл.1

лечения кожных, ран и ожогов /Шехтер А.Б., Силаева e.h., Абоянц Р.К., Истранов Л.П., Руденко Т.Г., Хацернова Б.Я., Онуфриев М.В., Истраиова Е.В. "Композиция для лечения ран"//Положит. решение по заявке на изобретение Но.491848/14 от 13.2.1991/.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение синтеза HK в печени и коже при восстановлении тканей после частичной резекции или токсического поражения показало, что. травма и последующая воспалительная .реакция стимулируют репаративную регенерацию. Цри этом в клетках наблюдается синх) энизация репликации, в результате чего в обоих тканях синтез яДНК происходит волнообразно : на 20 и 44 час в гепатоцитах регенерирующей печени или на 3.6 и 9 сутки в'фибробластах грануляционной ткани.

На ранних сроках после нанесения травмы в клетках регенерирующей печени (2-50 час после ЧГЭ), фибробластах и макрофагах раневой поверхности (2-5 сутки) увеличивается количество митохондрий' и идет активный митохондриогенез. Об этом свидетельствует возрастание отношения мтДНК/яДНК, увеличение включения Н3-тимидина в мтДНК и . повышение активности мтРНР и мтТК: активность митохондриальных Ферментов регенерирующей печени превышает активность тех же ферментов интактной печени в 2.5-3 .раза, соответственно.

На модели регенерирующей печени крыс, в которой биосинтетические процессы идут с большой скоростью, чем с грануляционной ткани, . установлено, что наиболее ранним ответом на ЧГЭ является увеличение транскрипционной активности хроматина (6-в .ч после ЧГЭ). В клетках наблюдается нарастание активности ГНР, ТК и НЯ. В ядрах и митохондриях максимумы активности PHP па 2 часа опережают пики включения Н3-тимидина в яДНК и мтДНК, а максимума активности ТК и Hî-T совпадают с ними. Динамика изменен»! активности всех трех фернентов коррелирует с синтезом ДНК i органелиах. Результаты становятся понятными пр]

:опоставлении с литературными данными, сЛ-ласно которым ТК и PHP являются индуцируемыми, короткохивуцими белками (ti/-2 -i-3.5 часа), от кооперативного действия которых в первую эчередь зависит образование сбалансированного фонда четырех *НТФ (Hwang м., 1974; Skoog K.L., 1973; Kit S., 1976; *eihard P., 1978; Snyder R.D., 1984). Полученные нами данные зб увеличении активности исследуемых фермен.ов в микросомах, ■(ембранных фракциях ядер и митохондрий регенерирующей печени чозволяют сформулировать гипотезу, согласно которой травма эргана стимулирует в ЭПР неповрежденных клеток синтез новых чолекул PHP и-ТК, которые, поступая в ядра и митохондрии, создают полуавтономную систему обеспечения синтеза яДНК и •(ТДНК субстратами. Позднее гипотеза получила подтверждение в работах по выяснению состава ферментов репликативного комплекса ядер и включению тимидина в мтДНК (Rode W,, 1985; Keller Р., 1984; HathensC.K., 1986).

При фракционировании белков (HH«)2S04, "изофокусированием и диск-электрофорезом для цитоплазматической, ядерной и китохон'дриальиой ТК, ядерной и цитоплазматической НФТ об'-аруживаются три (иногда четыре) ' зоны активности. Изменение скорости пролиферации ткани сопровождается перераспределением ферментативной активности между отдельными формами. Регенерация увеличивает активность всех форм. При этом наибольший вклад в образование дТМФ обеспечивает медленномигрирующая форма ТК и НФТ с Rr 0.08 и 0.15 соответственно. В зарубежной литературе есть сведения о множественных молекулярных формах цитоплазматической и митохондриальной ТК' (Kit S., 1975; Sakamoto S., 1983-1985; Е11 ins Р.Н., 1983; Keller F., 1984), тогда как существование нескольких форм ядерной ТК, ядерной и цитоплазматической НФТ в клетках печени описано нами впервые. ,

У животных после операции ЧГЭ, нанесения кожных ран и у людей с воспалительными заболеваниями наблюдается выход в кровь ТК и НФТ. Сопоставление изменений активности ТК со скоростью пролиферативных процессов в тканях позволяет прийти к выводу, что определение активности сывороточной ТК

tJI

может служить показателем интенсивности этих процессов t прогнозирует эффективность методов корреляции юстошнк больного. Позднее этот тест стал использоваться в клиникам Украины в качестве опухолевого маркера в целя; дифференциальной диагностики заболеваний желудочно-кишечного тракта (Борзенко Б.Г., 1982).

В ходе изучения механизма действия аналогов тимидина v тимина: 5-трифторметилурацила (I), бота-Д-ксилофуранозил-1 (II) и 4-МУ было установлено:

1. в' печени и селезенке после операции ЧГЭ I и II слабее,

чем 5-РУ ингибируют синтез ДНК;

2. в печени 5-трифторметильная группа I и II окисляется в

СООН-группу, возникают структурные аналоги оротата, которые стимулируют репаративный синтез ДНК и РНК;

3. присутствие бета-Д-ксилофуранозы в молекуле II, по-

видимому, делает ее "плохим" субстратом пиримидинкиназ в селезенке и снижает ингибируюиее действие на синтез ДНК и РНК по сравнению с I. Это позволяет надеяться, что II как противовирусный препарат будет иметь большую селективность и меньшую токсичность, чем I;

4. в опытах in vitro и in vivo 4-МУ обнаруживает высокую

антиоксидантную активность, снижая накопление свободнорадикальных продуктов в кожной ране и печени при токсическом гепатите. В области кожного дефекта он уменьшает накопление лейкоцитов, деградацию клеток сокращая Фазу воспаления на 1-2 . суток. При этом у • фибробластов учащаются пики синтезе яДНК и продолжительность клеточного цикла становится равной 2-м суткам вместо 3-х! в контроле. Последнее, очевидно, связано со способностью этого соединения активировать макрофаги и, воздействуя на иммунную систему организма ускорить репаративную регенерацию тканей. Исследуя влияние поликатиоиов из группы протьминов: стуринов А, В и их структурного аналога - ЧАС 0-2Ь К на процессы реализации генетической информации в регенорируюцих тканях показали, что:

1. поликатионы легко проходят плазматическую, ядерную и митохоидриальную мембраны. ЧАС 0-25 К накапливается преимущественно в печени, связываясь с цитоплазматическими белками, а в ядрах и митохондриях -с фракциями ДНП и матрикса, образуя комплексы с яДШС и мтДНК. При совместном введении ЧАС 0-25 К и гепарина, поликатион п 2-2.5 раза увеличш ie-г поступление полианиона в клетки;

2. стурины А и В умеренно иигибируют синтез яДНК и мтДНК,

понижают активность PHP и ТК. ЧАС 0-25 К в интактной печени синхронизует клетки, а в травмированных органах стимулирует репаративиый процесс зг счет усиления транскрипции, увеличения синтеза ДНК и МП клеток.

3. губки и пленки на основе коллагена и ЧАС 0-25 К более

эффективно, чем используемые в клинике губки "кобутек" и "метуракол" сок'рацают. времп заживления кожных рац. Предложена гипотеза, объясняющая раноэадивдяпшее действие ЧАС 0-25 К его способностью изменять пространственную конформацшо хроматина и увеличивать интенсивность транскрипционных и репликатнвных процессов D поврежденных тканях.

D U D О Л U

1. На ранних сроках заживления в регенирирующей печени и

кожной рана увеличивается отноиение мтДНК/яДНК, возрастает включение Н3-тимиднна в мтДНК и псгигачется активность мтРНР и мтТК, что указывает на • активацию митохондриогенеза в клетках, ответственных за репаративноо восстановление органов.

2. Обнаружение в ядрах и митохондриях PHP, ТК и( НОТ, изучение их локализации и свойств, корреляция изменений активности с синтезом яДНК и мтДНК позволяют сформулировать гипотезу о суцествованин в этих органеллах самостоятельного механизма синтеза дазоксинуклеотидгчз, способного, хотя бы частично.

удовлетворять потребность синтеза яДНК и мтДПК в субстратах.

3. Для ТК и НФТ ядер, митохондрий и цитозоля установлено

существование нескольких молекулярных Форм,

различающихся по электрофоретической подвижности. Показано, что изменение скорости пролиферации вызывает перераспределение активности между отдельными Формами.

4. Нарушение целостности и проницаемости мембран клеток в

поврежденных тканях сопровождается выходом в кровь ТК и Н4-Т. Уровень активности сывороточной ТК дает информацию об интенсивности и продолжительности пролиферативпых процессов и может иметь прогностическое значение в терапии различных заболеваний.

5. Ь-РзМеУ в пе зни и селезенке является субстратом разных

метаболических путей. В результате в селезенке он подавляет, а в печени, превращаясь в аналог оротата, активирует синтез НК. Присоединение к 5-Рэ11еУ неприродного углевода - бета-Д-ксилоФуранозы приводит к образованию нуклеозида, который слабее ингибирует синтез ДНК и РНК, чем исходное основание. Это происходит, по-видимому, за счет менее эффективного превращения нуклеозида в пуклеотид и позволяет надеяться, что ксилофуранозид 5-ГзМоУ как противовирусный препарат будот иметь большую селективность и меньшую токсичность, чем ЬГэМеУ.

0. 4-ИУ обладает высокой антиокендантной активностью и способностью стимулировать макрофаги. При репаратиыюй регенерации за счет этих свойств препарат сокращает фазу воспаления, а у Фибробластов кожной рапы учащает пики синтеза яДНК и укорачивает' продолжительность клеточного цикла.

7. Синтетический аналог протаминов - ЧАС10-25 К легке проходит плазматическую, ядерную и митохондриальпу* мембраны, связывается с яДНК и мтДНК и ускоряй-репаративное восстановление тканей. Обсуждаете! возможный механизм ранозаживляющего действия ЧАС 0-25 К

связанный со способностью этого сочинения разрыхлять пространственную структуру хроматина и упеличйвать число участков доступных для транскрипции и репликации. Изучение механизма действия ЧАС 0-7,5 К, 4-МУ и карнозты на процессы восстановления тканей позволило:

1) разработать состав губок и пленок на основе коллагена и карнозина или коллагена и ЧАС 0-25 К;

2) показать, что предлагаемые лекарственные средства более эффективно, чем используемые в клинике "кобутек" и "метуракол" сокращают время заживления ран, а внутривенные инъекции ЧАС 0-25 К животным с токсическим гепатитом вызывают защиту и более быструю регенерацию печени.

По материалам диссертации опубликовано 32 работы, знопное содержание отражают следующие публикации:

Силаева С.А.,Авдеева Л.В.,Дебов С.С. Метод получения 2-014-цитидиловых и уридиловых нуклеотидов с помощью Ферментного препарата из саркомы крыс М 1. //Вопр.мед.химии.-1970.-т.16,No.2.-С.207-212 Шереметьевская Т. Н ., Силаева С. А ., У.ацернова Б. Я., Дебов С.С.. Ядерная рибонуклеотидредуктаза клеток нормальной, регенерирующей печени и саркомы М 1 крыс. //Там же. -1974.-Т.20,Но.4.-С.430-435 Силаева С.А..Данилова H.H.,Дебов С.С. Некоторые свойства рнбонуклеотидредуктазы из митохондрий почепи крыс.// Биохимия.-1975.-Т.40,Но.4.-С.711-715. Силаева С.А..Ветрова Е.Г..Данилова H.H.,Дебов С.С.. Митохондрнальные тимидинкиназа и рибонуклеотидредуктаза из клеток печени и гепатомы 27 крыс.,/./ Там же.-1976,-Т.41,По.8.-С.1367-1372. Силаева С.А.,Исаева Л.В..Николаев' А.Я. ^Некоторые свойства цитоплазматических тимидинкиназы и нуклеознд-фосфотранс феразы из печени крыс .//Там же.-1977.-Т. 12,Но.9.- С.1668-1673

Данилова H.H.,Силаева С.А.,Дебов С.С., Взаимосвязь активности митохондриалыюй рибонуклеотидредуктары и тимидинкиназы с синтезом митохондриалыюй ДНК в печени крыс в процессе регенерации.//Там же.-1977.-Т.42,Но.И.-С.1973-1977 Debov S.S.,Delv ig A.A.,Silaeva S,A.,Tarasov A.P.. Influence of cyclic Adenosine 3'5'monophonphate on the Activity of liver Enzymes. //Ergebn.exp.Hed.-1Q78.-v.28.-p.195-207 Силаева С А.,Данилова H.H., Иэоферменты митохондриальнпй тимидинкиназы из нормальной и пролиферирующих тканей

Н4

печени крыс.// Вопр.мед.химии.-1979.-Т.25,Но.4.-С.415-419

U Силаева С.А.,Хацернова Б.Я..Данилова Н.Н..Шереметьевская Т.И.,Юликова Ё. II. , Буланова А.Н.. Влияние стуринов А и В на синтез ДНК и активность рибонуклеотидредуктазы и тимидинкиназы в регенерирующей печени крыс.//Там жо,-1980.-Т.26,Но.2.-С.255-259

10. Голубев В.П.,Силаева С.А.,Козельцов В.Л. Структура и

биосннтетические функции митохондриальных Фракций печени крас.// Там же.-1980.-Т.26,Но.3.-С.312-318

11. Хацернова Б.Я.., Силаева С.А. Ядерная тимидинкиноэа и

нуклеозндфосфотрансфераза из нормальной и

пролнферирующей ткани печени крыс.//Биохимия.-1983 . -Т.40,Но.3.-С.477-482

12. Силаева С.А.,Хацернова Б.Я.,Шереметьевская Т.Н.

Тимидинкг.наза и нуклеозндфосфотрансфераза в сиворогки крови животных после частичной гепатэктомни и у людей с воспалительн -ш заболеваниями.//Вопр.мед. химии.-1283 . -Т.29,!1о.2.-С.57-60

13. Хацернова Б. Я., Силаева С. А. , Шереметьевская 'I Л.

Взаимосвязь активности ядерной рибонукдеотндредуктази с синтезом ДНК в ядрах гепатоцитов при регенерации печени.//Там же.-1983.-Т.29,Но.2.-С.Gl-G4

14. КФимоь B.C..Чернова 0.В.,Розкин И.Я.,Силаева

С.А.,Хацернова Б.Л. Регуляция свертывания проси четвертичной аммонийной солью олиго;;ера 25 конидина при гемосорбции й его поведение в организме .//¡!зд. ltíílll.-1004.-C.2G-30

15. Силаева С.А..Хацернова Б.Я.,Николаев А.Я..Ефимов

В.С., »оэкцн Н.Я.,Некрасов A.B. Влияние синтетического, антагониста гепарина олнгоыера 25 кои::дш:а на синтез нуклеиновых кислот в клетках регемерируюащи печени . //Бонр. нед . химии . -18В5 . -Т . 31,Но . 4 . - С . 83- 1!!4 10. Силаева С.А.,Хацернона Б.Я.,Берчепко Г. II., Николае:; А.Я.,Иехтер А.Б. Динамика синтеза нуклеиновых кислот в грунуляционной ткани кожных ран крыс.// Тям *ч.-193!5.-T.32,Hi>.3.-C.12G-131

17. Силаепа С.А.,Хацернова Б.Я.,Николаев л.Я. Изменение

активности тимидинкиназы, нуклеозидфосфотрлпсфсрази, синтеза иде£>ной и митохондриальной Д!!К ь грунулицноннсп ткани KOZHUX ран у крнс.//Всосоюп!;. симпозиум по мед.энзимологии, Нахачкала.-19Й6.-С;86-87

18. Хацернова Б.Я.,Силаева С.А.,Николаев А.Я. Влияние

Геплрингч и его синтетического антагонист,-. олигоысрг.-25 г.снидинс на синтез ДНК и регенерирую'деи печени крыс.//Там же.-1913G.-С.229-232. 13. Силаева С.А.,Гуляеза Н.В.,Хацернова Б.Я.Юсков П.В. Влияния препаратов с антирадикалышми свойствами не синтез нуклеиновых кислот в процессе зчжинления кожных ран у лрыс.//Симпозиум биохим.обществ СССР-НРБ,София.-1987.-е.126

20. Силаева С.Л.,Гуляева 11.В. .Хацер'-ова Б.Я. ,Онуфризи Н.В.,Николаев А.Я. Антиокисдантнин активность 4-метилурацила и харнозина стимулирует заживление кожныл

ран у крыс./.'Ill Всьг.иызн . конф. " "Биоантиокинллш Москва. 1909.-т. 1 . Ii. 117-110

21. Хацернова Б.Я.,Силаев« С Ь .Голенченко В.А.,Николас в

A.Я.,Розкин Н.Я.,Некрасов А.Ь.,Берестецкая Т.3.,Ефимов

B.C. Гепарин и его анМгонист - четвертичная аммонийная соль олигомера-25 конидина: распределение но субклеточным органеллам, влияние на синтез ДНК в регенерирующей печени крыс.//Вопр.мед.хими. 1РПН. Т.35,[1о.Э.-С.83-67

22. Силаева С.А..Хацернова В.Я.,Голенченко В. А.,Берченко

Г.II. ,Николаев А .Я. , Иехтер А.Б. Синтез нуклеиновых кислот и динамика морфологических показателей грануляционной ткани кожных ран у крис, леченных 4 матилурацилом.//Вопр.мед.химии.-1990.- т.зп,Но.1.-С.Н2-84

23. Силаева С.А.,Гулпэва Н.В.,Хацернова Б.Я.,Онуфриев

М.В..Николаев А.Я. Влияние 4-метилура ;ив и карнозипа на заживление кохних ран у крыс.//Бюлд.эксп.биологии и медицины.-1990.-Т.109,Но.2.-С.180-182

24. Хацернова П.Я.,Силаева С.А.,Голенченко В.А.,Скуридмн

C.Г.,Розкин И.Я.,Ефимов B.C. Синтез нуклеиновых кислот и пространственная организация ДНК в присутствии гепарина п четвертичной аммонийной соли олнгоморя-25 г.онидпна .//Нрлек .биология. -1991. -Т. 25,По . б. - С, 1 308-1315

25. Силаева С.А., Абоянц Р.К., Иехтер А.Б., Онуфриек

Н.В.,Гаврильчак A.B., Руденко Т.Г., «страной Д.П., Хацернова Б.Я. Использование губок из коллагена и дипептида-220 в лечении ожогов и раи.//сб."Нчстмоз лечение рай",Носква.-1991.-С.231-232 28. Онуфриев И.В..Потапов Г-Н..Силаева С.А..Ннколаеп А.Я. Карнозпн как стимулятор цитостатической и фагоцитарной (функций перитональннх макрофагов.// Биохиинч.-1ЧЯ2.-Т.57,По.0.-С.1352-1359 27, Силаева С.Л.,Голенченко В.А.,Гаврильчак A.B.,Онуфриев М. В. .Хацернова В.Я.,Гулпэпа II. В. , Пехтур А.Б. Ллични» кэриоэтт н 4-нотилугапигв на газвити»

экспоримонталнюго гепатита у крыс.//'. Т>»м so -inn?. Т.57,Но.9.-С.1C0S-1372

Список сокращений

АГЗ - асцитная гепатоиа Зайдаля

кД - килодальтон

мтДНК (РНК) - митохондриальная ДНК (РНК)

аДЛК (РНК) - ядерная ДНК (РНК)

сДОК (РП1С> - суммарная ДНК (РНК)

ИОХ - ионообменная хроматографии

ИДА - малоновый диальдегид

МИ - митотический индекс

мИ - молекулярная масса

4-МУ - 4-метилурацил (В-метилурацил) UK - нуклеиновые кислоты

ЦТ* (дЦТФ) - нуклеЬзидтрифосфат (дазокси-НТФ)

114Т - нуклеозидфосфотрансфераза

ПААГ - полиакриламидный гель

ПОЛ - перекисное окисление лииидов

PHP - рибонуклеотидредуктаза (НДФ-редуктаза)

дТ -деэокситимидин

ТК - тимидинкиназа

ТС - тимидилатсинтаза

УА ~ удельная активность

УК - уридинкиназа

5-Fy - 5-фторурацил

5-РаИоУ - 5-трифторметилурацил

ЧАС 0-25 К - четвертичная аммонийном соль олигомера 25 конидина

ЧГЭ - частичная гепмэктснии ЭПР - эндоплазматический ретикулум

Информация о работе

Силаева, Светлана Алексеевна
доктора биологических наук
Москва, 1992
ВАК 03.00.04

Автореферат

Биосинтез нуклеиновых кислот в печени и коже при репаративной регенерации, его регуляции поликатионами, аналогами тимина и тимидина (экспериментальное исследование) - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы