Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние четвертичной аммонийной соли олигомера 25 конидина на синтез нуклеиновых кислот в регенерирующих тканях

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние четвертичной аммонийной соли олигомера 25 конидина на синтез нуклеиновых кислот в регенерирующих тканях"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ им. И.М.СЕЧЕНОВА

ой

1 4' На правах рукописи

УДК: 677.213.6:678.745.2:547.354.4:501.82:616.36

ГОДЕНЧЕНКО Вера Александровна

ВЛИЯНИЕ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ АММОНИЙНОЙ СОЛИ ОЛИГСМЕРА 25 ШЗДИНА НА СИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В РЕГЕНЕРИРУЮЩИХ ТКАНЯХ.

ь

\

(03.00.04 - биохимия)

Автореферат

.л,*" диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. ,

МОСКВА - 1994

Работа выполнена в Московской медицинской академии имени И. М. Сеченова

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии ЫМА А.Я.Николаев

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук О.Ю.Абакумова

- доктор биологических наук С.С.Шишкин

Ведущая организация - Российский Университет Дружбы народов

Защита диссертации состоится "/1" 199 У г.

в 14 часов на заседании специализированного совета Д 074.05.10 при Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова по адресу. 119881, Москва, Б.Пирогоговская.д. 2/6 бульвар, д.37/1

С диссертацией Можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова по адресу: 119811, Москва, Зубовский бульвар, д. 37/1. Диссертация разослана "//" 199 ^г.

Учений секретарь специализированного совета, к.м.н.

А.Ю.Миронов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Проблема регенерации тканей принадлежит к числу актуальных в медицине и биологии. Необходимым условием регенерации после травмирования тканей является поддержание еысокой скорости репликации, транскрипции и трансляции. В регуляции этих процессов принимает участие множество биологически активных веществ (Л.П.Лебедева,1980; М.С.Богданова, 1990; С.Р.МаМ1ап,1987; О.Р.Моопеу, 1990).

Действие эндогенных стимуляторов регенерации сопровождается увеличением интенсивности матричных биосинтезов в результате воздействия на генетический материал клетки. Среди описанных и изученных соединений существенное значение имеют вещества катионной природы: гистоны, протамины, полиамины (М.5е11ег,1988; Т.К.«опе,1985; А.Генейтис, 1988).

Накопленные к настоящему времени научные данные о биологических регуляторах этой группы веществ и механизме их влияния на метаболические процессы в клетках позволяют вести поиск новых ^ соединений синтетической природы - аналогов эндогенных регуляторов, влияющих на репликацию, транскрипцию и трансляции и тем самым стимулирующих интенсивность восстановительных процессов.

Обращают на себя внимание четвертичные аммонийные соли синтетических полимеров. Одними ив перспективных представителей этой группы являются четвертичные аммонийные соли (ЧАС) олигомеров конидина. Разработка и исследование биологической активности ЧАС-олигомеров конидина были вызваны поиском новых антагонистов гепарина (В.С.Ефимов.1981). Синтетические анти-гепаринати обладают более высокой специфичностью связывания с гепарином и не вступают во взаимодействие с белками плазмы подобно протаминам (О.В.Чернова,1983).

Работами Р.В.Петрова и Р.М.Хаитова (1988-1991г.) установ-

лено, что ЧАС олигомеров и полимеры конидина проявляют также

Рис Л. Общая структурная формула мономерного звена конидина.

иммуностимулирующую активность. Поликатионы оказывают многофункциональное воздействие на иммунную систему. Показано, что они частично выполняют функцию Т-хелперов, важнейшим действием которых является подача сигнала В-лимфоциту. Установлено, что поликатионы также воздействуют на функции макрофагов, усиливая продукцию ими Интерлейкина-1. Таким образом, иммуностимулирующее действие поликатионов складывается из усиления функциональной активности макрофагов и активации лимфоцитов.

Исследованиями В.С.Ефимова и О.В.Черновой (1981-1983) с радиоактивной четвертичной аммонийной солью олигомера-25 конидина (ЧАС-0-25К) было установлено, что она обладает высокой селективностью к гепарину и наименьшей, по сравнению с другими синтетическими антигепаринатами токсичностью. После однократного внутривенного введения поликатион кумулируется главным образом в печени, не подвергается биотрансформации и медленно выводится в неизменном виде из организма животного в

течение 3-х месяцев.

Накопление и задержка в печени ЧАС-0-25К, которая может связываться с нуклеиновыми кислотами, мембранами и белками вызвали ряд вопросов: будет ли ЧАС-0-25К, подобно другим регуляторам - полиаминам, оказывать влияние на матричные биосинтезы и менять их функциональную активность, каковы возможные последствия длительного пребывания препарата в печени, и окажут ли они воздействие на регенерацию органа. Решению этих вопросов посвящена настоящая работа.

Цель рабом. Целью данной работы было изучение влияния четвертичной аммонийной соли олигомера 25 конидина (ЧАС-0-25К) на синтез нуклеиновых кислот в регенерирующих тканях. В ходе выполнения этого исследования решались следующие задачи: 1. Проследить динамику распределения ЧАС-0-25К по субклеточным органеллаы гепатоцитов и связывания ее с белками постмикросомальной фракции печени. 2. Изучить влияние ЧАС-0-25К на интенсивность транскрипции и репликации в ин-тактной и регенерирующей печени крыс. 3. Выяснить характер воздействия ЧАС-0-25К на течение репаративных процессов:

1) в печени животных после частичной гепатэктомии;

2) при токсическом гепатите, вызванном ССЦ;

3) на процесс восстановления свертывающей системы крови после ее повреждения синкумаром;

4) при заживлении кожных ран. Научная новизна.

1. Впервые в динамике, in vivo исследовано влияние ЧАС-0-25К на интенсивность репликации в течение 60 дней, а также показаны изменения активности синтеза и количественное содержание РНК в течение первых суток пребывания препарата в организме животного.

2. Проведено исследование распределения по субклеточным фракциям печени крыс радиоактивного ЧАС-0-25К и гепарина при раздельном и совместном введении, а также установлено измене-

ние содержания меченых веществ в соответствующих фракциях в течение 8 суток и показано их связывание с белками постми-кросомальной фракции печени животных.

3. Изучено влияние длительного присутствия ЧАС-0-25К на течение регенерации печени после частичной гепатэктомии.

4. На модели токсического гепатита, вызванного подкожным введением ССЦ, исследовано воздействие разных доз ЧАС-0-25К на митотическую активность клеток печени и нормализацию всех исследуемых биохимических показателей.

5. При гипокоагуляции, вызванной введением антагониста витамина К - синкумара, установлено активирующее влияние ЧАС-0-25К на восстановление свертывающей системы крови.

6. Использование созданных новых композиций коллагеновой пленки и коллагеновой губки с разным содержанием ЧАС-025К для лечения полноелойных кожных ран у животных позволило установить ранозакивляющее действие ЧАС-0-25К, и показать, что ЧАС-0-25К более эффективно сокращает время заживления ран, чем применяемый в клинике "Метуракол".

Практическая значимость. Полученные данные позволяют считать, что ЧАС-0-25К в травмированном органе стимулирует транскрипцию, репликации, повышает митотический индекс, ускоряет восстановление печени после частичной гепатэктомии. Это зещество влияет на восстановление .активности протромбинового комплекса, а также ускоряет заживление кожных ран. Полученные данные позволили разработать для лечения ран новые композиции пленок и губок на основе коллагена и ЧАС-0-25К.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, получено одно авторское свидетельство и подана заявка на изобретение.

Вклад автора. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования от постановки задачи и эксперимента до обсуждения результатов.

- 5 -

Положения, выносиыые на защиту.

1. [14С] ЧАС-025К, попадая в гепатоциты, частично проникает в клеточные органеллы. 50Х меченого вещества, поступившего в ядра включается в ДНП фракцию, образуя комплекс с ДНК.

2. In vivo, ЧАС-0-25К вызывает волнообразное изменение интенсивности включения [3Н]-тимидина в ДНК гепатоцитов интакт-ных животных.

3. Присутствие ЧАС-0-25К в печени стимулирует репликацию и транскрипцию, вызывает повышение содержание ДНК на грамм ткани у животных после частичной гепатэктомии.

4. ЧАС-0-25К способствует ускорению регенерацию печени и кожи, а также восстановлению активности протромбинового комплекса.

Материалы и методы исследования.

Все эксперименты проводились на белых крысах, массой 150-200 г. Исследовалась ткань печени, селезенки, кровь и грануляционная ткань интактных животных и ткань печени после повреждения химическим или хирургическим путем. Частичную ге-

патэктомию у крыс проводили под эфирным наркозом, по методу

i,

Хигинеа и Андерсена (1931) полностью удаляли центральную и левую доли печени с предварительным наложением лигатуры у их основания. В экспериментах использовалась ткань печени крыс на разных сроках после частичной гепатэктомии и однократного внутривенного введения в хвостовую вену гепарина фирмы "Рихтер" в дозе 5 мг/кг, либо [35S]-гепарина фирмы "Amersham" в дозе 5 мг/кг (уд. радиоактивность 13.7 мкКи/г) и ЧАС-0-25К в дозе 3.8 мг/кг, либо [14ГЛ-ЧАС-0-25К (А.В.Некрасов, 1983) в дозе 3.8 мг/кг (уд. радиоактивность 730 мкКи/f).

В каждом эксперименте параллельно с опытными группами животных исследовалась контрольная группа, состоящая из 5-6 интактных крыс. Для получения каждого экспериментального результата проводили 2-6 серий опытов, на каждую эксперимен-

тальную точку ставили по 3 параллельные пробы.

Для получения ядерной, митохондриальной и микросомальной фракций ткань печени измельчали и гомогенизировали в 9 объемах среды, содержащей 0.25 М сахарозу, 0.03 мМ трис-HCl рН 3.0. 0.25 мМ КС1 и 0.25 мМ М?(СНзС00)г в гомогенизаторе с тефлоноЕЫм пестиком.

Гомогенат центрифугировали в рефрижераторной центрифуге при 600? для осаждения грубой ядерной. Фракции. Очищенные ядра получали по методу Шаво (1956).

Митохондрии выделяли из надосадочной жидкости после удаления ядер центрифугированием в течение 10 минут, при 6500g в.' центрифуге "Spinco" (модель L, ротор 30) по модификационному методу Катьяна (1970). Фракции микросом и цитоплазматических белков получали из постмитохондриальный жидкости центрифугированием при lOSOOQg в течение 90 минут в той же центрифуге (Модель L).

Для определения включения [эН]-тимидина, in vivo, в кисло-тонерастворимую ядерную фракцию из ткани интактной печени и печени после гепатэктомии, за 2 часа до декапитации в хвостовую вену животному вводили С3Н1-тимидин из расчета 100 мкКи на 100 г веса животного. После декапитации крыс, ткань печени гомогенизировали в 4-х объемах буфера, а ядра осаждали центрифугированием при 600? на центрифуге "Snlnco".

К суспензии ядер добавляли равный объем холодного 107. раствора ТХУ, содержащего 0.44 М пирофосфата натрия, затем еще 2 мл 5% Ш, содержащего 0.024 М пирофосфата натрия. Выпавший осадок центрифугировали, делали промывку до тех пор, пока в надосадочной жидкости не исчезали следы радиоактивности. Затем кислотонерастворимый осадок растворяли в 0.5 мл 0.3 н раствора КОН при нагревании. Для подсчета радиоактивности содержимое проб количественно вносили в сцинтиляционные стаканчики с жидкостью Брея. Радиоактивность полученных проб измеряли на счетчике 1215 Rack Beta фирмы LKB (Швеция).

Белки постмикросомальной фракции разделяли методом гель-фильтрации на колонке 251.5 мм с TSK-гелем HW-60 Fine.

В модельных опытах на колонку наносили препараты [14С]-ЧАС-0-25К ми гепарина и [14С]-ЧАС-0-25К в оптимальных нейтрализующих соотношениях.

Для определения интенсивности транскрипции животным за 1,5 часа до декалитации внутрибрюшинно вводили [14С]-оротат (50 мкКи на 100 г).

Количественное определение ДНК и РНК проводили по методу Шмидта и Тангаузера в модификации М.Г.Трудолюбовой (1977). Радиоактивность полученных проб в имп/мин измерялась на счетчике 1215 Rack Beta фирмы LKB (Швеция). Для исследуемых образцов определяли включение [14С]-оротата в имп/мин в пересчете на 1 мг РНК.

Интенсивность синтеза ¡ЦК находили по включению (эШ-тими-дина в кислотонерастворимую фракцию в пересчете на 1 мг ДНК. Оценку радиоактивности и определение содержания нуклеиновых кислот проводили в тех же пробах.

Принцип определения активности факторов свертывания крови заключается в измерении времени свертывания активности нитратной плазмы в присутствии Ca-Thromboplastin (фирмы DiaMed), Actin (Activated Ceplastin Reagent фирмы Dade) и СаС1г после добавления в нее реагентов содержащих все плазменные факторы, кроме определяемого.

Исследования активности Акторов свертывания проводили с использованием коагулометра Sehniger und Gross (Швейцария) и наборов стандартных реагентов фирмы DiaMed.

У крыс экспериментальный гепатит вызывали подкожными инъекциями 50Х масляного раствора тетрахлорметана (ССЦ) один раз в сутки в объеме 0.4 мл на 100 г массы животного в течение 4-х дней подряд. Лечение проводили внутривенным введением ЧАС-0-25К в дозе 2 мг/кг или 4 мг/кг (в объеме 0.5 мл) или витамином В12 (0.5 мл на 100 г массы животного) внутримышечно

в дозе 50 мкг на 1 кг.

На третьи, шестые и десятые сутки от начала эксперимента десять животных каждой группы забивали, брали кровь и ткань печени для биохимических и морфологических исследований.

Для определения динамики заживления послойных кожных ран при использовании губок и пленок, животным под эфирным наркозом в межлопаточной области делали концентрическим разрез, удаляли участок кожи с подкожной клетчаткой. Стандартизацию размеров раны обеспечивали введением в нее тефлоноврго кольца, которое прочно фиксировалось окружающей тканью. Получали раны со стандартной площадью 300 мм . Однократно внутрь коль- .' ца накладывали коллагеновую пленку или губку с разным содержанием ЧАС-0-25К.

На 5-е сутки тефлоновые кольца удаляли. Измеряли площадь ран на 7, Ю, 12, 14 сутки после операции. Статистическую обработку проводили на персональном компьютере "М-240" ("Olivetti", Италия). Достоверность различий определяли по критерию Стьюдента.

Результата исследования и обсуждение.

Работой С.А.Силаевой и Б.ЯДацерновой (1985) было установлено, что после введения крысам гепарина и С14С]-ЧАС-0-25К, меченый препарат самостоятельно или в составе комплекса с гепарином легко проникает из кровотока в клетки и субклеточные органеллы гепатоцитов и оказывает влияние на процессы репликации и транскрипции.

Нами проведено исследование динамики распределения (14С1-ЧАС-0-25К и [35S]-гепарина в селезенке и печени через 1, 2, 8 суток после проведения операции частичной гепатэктомии. Через сутки после внутривенного введения [14СЬЧАС-0-25К и [с>53]-гепарина в клетках печени обнаруживается значительное накопление меченых препаратов. ЧАС-0-25К увеличивает поступление [35о]-гепарина в селезенку и печень, выведение его происходят довольно медленно и к 8-м суткам содержание t35Sl-re-

парина снижается на 3С*, а а селезенке сохраняется на уровне первого дня.

За тот же период содержание олигомера С14СЗ-ЧАС-С-25К по метке з гомсгенате селезенки уменьшается на 4С%, аз гемоге-нате печени на 2-е сутки на 2С* с последующим увеличением к 3-м суткам.

Наблюдающиеся различия а выведении гепарина и ЧАС-0-25К, видимо объясняются тем, что гепарин, будучи природным метаболитом, может подвергаться гидролитическому расщеплению, а поэтому распределение метки может отражать локализацию не только самого гепарина, но и продуктов его деградации. ЧАС-0-25К метаболически стабильна, накапливается в печени и со скоростью 11 в сутки выеодится из организма в течение двух месяцев (О.Е.Чернова, 1983).

Результаты изучения распределения [-^З)-гепарина и [14СЬЧАС-0-25К по субклеточным фракциям печени на 1, 2, 3 сутки после введения препаратов приведены в таблице 1.

Во фракции цитозоля обнаружено 24.7 7, общей радиоактивности [14С1-ЧАС-0-25К, в митохондриях - 6.1 7.. Около половины меченых полиэлектролитов, поступающих в ядра, связываются с Фракцией ДНП. На 2-е сутки содержание [14С]-ЧАС-0-25К, увеличивается во всех исследуемых Фракциях клеток печени, кроме ядерной. К о-м суткам содержание [14С1-ЧАС-0-25К и [^ЗЬгепарина в митохондриях и ядрах снижается в среднем на 307., а зо фракциях цитоплазматических белков степень включения [14С]-ЧАС-0-25К возрастает приблизительно в 2.5 раза. Сохраняется на прежнем уровне содержание [14С1-ЧАС-0-25К в ДНП Фракции ядер. Таким образом, в течение 3 суток у животных, получавших ЧАС-0-25К, происходит перераспределение поликатиона з клетках печени с преимущественным накоплением в цитозоле и ДНП фракции ядер.

3 постмикросомалыюй Фракции С14С]-ЧАС-0-25К связывается с белкам», сбраэуя комплексы молекулярной массы - 170СС0

Таблица 1.

Распределение [З553-гепарина и [14С1-ЧАС-0-25-конидина по субклеточным фракциям печени крыс.

1 |Объект Время [355]- [352Ь 1 Iгепарин+ 1 1 |[14СЬ |

после гепарин гепарин+ |[14СЗ- |ЧАС-0-25К|

I исследования ВЕед. ЧАС-0-25К 1ЧАС-025К

сутки

|Микросомы+цито- 1 2^,6+3,6 26,7+1,0 124,7+5,2 140,9+4,1 |

|золь,в% от общей 2 28,141,0 25,8+1,5 139,3+3,2 1* • [

|радиоактивности 8 34,2±1,3 34,3+2,8 154,4+1,4 1 ' 1

| в гомогенате

|Митохондрии, 1 10,7+2,5 8,2+1,5 I 6,1+1,2 I 5,9+0,5 |

|в 7. от общей 2 14,0+0,4 15,6+1,2 I 7,5+2,2 1 * 1

|радиоактивнос- 8 7,3+0,3 9,7+1,1 I 4,2+1,0

ти в гомогенате

|Ядра,в£ от общей 1 51,1+4,7 55,2+1,4 162,1+2,6 137,1+2,2 |

|радиоактивности 2 46,7+2,4 51,6+5,1 152,3+5,1 1 * 1

|в гомогенате 8 34,2+2,2 43,6+3,9 141,2+3,0

|ДНП, в X от 1 аз,3+5,3 49,6±5,8 147,2+2,1 |64,6+13,3|

|радиоактивности 2 13,2+2,4 16,7+0,6 155,6+9,7 1 * 1

|во фракции ядер 1 8 8,7+2,7 16,6+2,8 146,2+8,6 | I 1

Примечание: * - на 2-е и 8-е сутки исследование распределения [иС]-ЧАС-0-25К не проводили.

кЯа, а также массой - 20000 кДа.

В связи с тем, что большая часть попадающего в ядра [14С1-ЧАС-0-25К обнаруживается в ДНП-фракции ядер, совместно

с сотрудниками Института Молекулярной биологии РАН были проведены исследования влияния ЧАС-0-25К на пространственную конформацию ДНК в системе In vitro и установлено образование комплексов ДНК - ЧАС-0-25К, изменяющих пространственную укладку ДНК.

ото дало ocHOf.iHüé предположить, что синтетический поликатион з ядрах и митохондриях гепатоцитов способен, вытеснять более слабые природные лолиамины из их естественного комплекса с ДНК, менять функциональную активность хроматина.

Для проверки этого предположения в опытах in vivo изучалось влияние ЧАОО-25К на интенсивность матричных процессов у интактных животных по включению [3Ш-тимидина и [1;Ч:]-оротата в ДНК и РНК гепатоцитов после однократного внутривенного введения препарата.

Исследование регенерирующей печени животных в течение 20 часов после получения ими поликатиона показало, что ЧАС-0-25К вызывает увеличение интенсивности синтеза РНК, превышающе контроль на 20-40Х (рис.2).

Наблюдение за синтезом ДНК на протяжении 60 дней после однократного введения ЧАС-0-25К, показало появление редких волн включения ["'HI -тимидина, чередующихся с периодами, в которые синтез ДНК у животных опытных групп был ниже, чем в контроле. Полученные данные позволяют считать, что ЧАС-0-25К вызывает синхронизацию клеточного цикла части гепатоцитов (рис.3).

Гистологические исследования срезов печени, выполненные в лаборатории НИЧ ША им.И.М.Сеченова (рук.А.Б.Шехтер), показали, что присутствие ЧАС-0-2.5К в органе снижает гипертрофию и дистрофию гепатоцитов в группах животных, получавших поликатион, которые чаще наблюдались у животных контрольных групп.

Опираясь на результаты наших исследований и литературные данные (Р.В.Петров, Р.М.Хаитов; 1986-1991). о способности природных и синтетических поликатионов из группы ЧАС конидина стимулировать рост ткани, была сделана попытка на моделях:

кожных ран, регенерирующей печени после частичной гепатэкто-

■ .300 г ;зо -200 -150 • 100 ■ 50 о

о

Рис.2. Включение [14С]-оротата в РНК регенерирующей печени, (имп на 1 мг РНК).

Примечание: кривая 1 - без введения ЧАС-0-25К; кривая 2 -однократное внутривенное введение ЧАС-0-25К.

мии или после воздействия' гепатотропным ядом - ССЦ, а также на модели стойкой гипокоагуляции, вызванной антикоагулянтом непрямого действия - синкумаром, изучить воздействие поликатиона на репаративное восстановление тканей.

Наблюдение в течение суток за скоростью синтеза РНК в печени животных после частичной гепатэктомии, получавших ЧАС-0-25К показало, что интенсивность включения [14С1-орота-та, в исследуемые 20 часов, меняется волнообразно, максимальное значение отмечено через 12 и 16 часов после операции и составляет 37.4% от контроля (контроль-ЧГЭ, без препарата) (рис.г). Изучение интенсивности репликации, в регенерирующей после ЧГЭ печени, по включению [3Н]-тимидина в ДНК, а также

12

16

20 част

изменение количества ДНК на 1 грамм ткани, показало, что ЧАС-0-25К стимулирует, по сравнению с контролем, синтез ДНК в

Рис.3. Интенсивность включения [3НЬтимидина в ДНК гепато-цитов интактных животных при внутривенном введении ЧАС-0-25К (кривая 1), или гепарина и ЧАС-0-25К (кривая 2).(% от контроля).

печени. Так в течение первых 8 дней после операции содержание ДНК на грамм ткани в опытной группе превышает соответствующие показатели в контрольной группе на 25-30% (рис.3), на третьи сутки отмечается выраженное увеличение числа митозов (МИ-1.2Х). Нам удалось показать, что ЧАС-0-25К ускоряет восстановление массы печени у животных, которым была проведена частичная гепатзктомия (рис.4), по мере регенерации и выведения препарата из организма животного эффект стимуляции уменьшается.

Восстановление печени после воздействия CCI4 контролирова-

ли по изменению активности гепатоепецифических ферментов ала-нинаминотрансферазы и гистидазы, активности перекисного окисления липидов и содержанию билирубина, гистохимическими и морфологическими показателями. Результаты исследований позво-

су

Рис.4. Влияние ЧАС-0-25К на регенерацию печени и содержание ДНК после частичной гепатзктомии. Примечание: В - содержание ДНК; А - изменение массы;

-- животные не получавшие ЧАС-0-25К;

----- животные получавшие ЧАС-0-25К.

ляют сделать вывод о том, что ЧАС-0-25К, введенный за 2 часа до первой инъекции ССЦ, на 3-й сутки вызывает увеличение числа делящихся гепатоцитов, ускоряет нормализацию всех исследуемых биохимических и морфологических показателей (табл.2). Выяснение дозо-эффектной зависимости действия препарата показало, что оптимальной дозой для успешного восстановления печени после повреждения ее ССЦ является 2 и 4 мг ЧАС-0-25К на 1 кг веса животного (табл.3).

UjMviHiiiuirt биохимических характеристик сиворотки крови крыс с экспериментальным гепатитом в процессе лечения ЧАС-0-25К и витамином Е1г

Таблица 2

Биохиинч. пок-ли

АЛ'Г

мкмоль/ч на 1 м л

Гистида -.а

ммоль/мии на 1 л

£|1Л1фУОН1|

мг/дл

Bf'tiMSi от

начала

icnepn-

меита

сутки

3 6 10

3 6 10

3

в 10

иигактныс

0,60 £ 0,03 0 , 65 £ U,04 0,63 t 11,04

0,05 г и,01 0,05 < 0.004 0,Cl83t 0,007

0,62 t 0,03 0,7 4 i 0,04 0,53 £ 0.05

получавшие получавшие получаьшие

cciv СС1чи ЧАС-0-25К ССЦн ЧНС-0-25К

2 мг/кг 4 мг/кг

5, 10 ± 0,24' 4,63 ± 0,18* 4,14 t 0,21 '

(834.8) (759,4) (67а,9)

3,21 ± 0,21* 1,77 ± 0,11" 2,34 £ 0,19'

(490,1) (270,3) (357.1)

1,20 £ 0,06' 0.02 £ 0,3 » 0,64 i 0,1Г/

(191,0) ( 97.3) (132,5)

0,705± 0,06' 0,46 t 0,04 * 0.5.» Г 0,04 +

С 1472,6) (346,3) CJUY.O)

0,44 t 0.02" 0,23 £ 0,17 0,27 £ 0,02

(876,9) (462,3) (533.7)

0,35 £ 0,03* 0.1138* 0,007* 0,19 1 0,02

(396,3) ( 99.8) (213,2)

2,82 £ 0,13 " 2,04 t 0,09 * 1,63 t 0, 13 '

(459,0) (331,0) (2i.5,5)

1,79 £ 0,11* 1,00 ± 0,05 0,99 i (1,06

(241,2) (134,8) (133,0)

0,88 £ 0,05* 0,59 t 0,05* 0,51 ± 0,01 *

(150.7) (111.9) ( 95.1)

Пплучаеиио i.'Ci^n ипт.

1,49 i 0, 16 (737,7) 2.t>5 1 0.23

(435.4) ii.i.'b .1 11,07-» (151.2)

II. I 0,00

(i274.0) U . 30 £ 0,02 '

(718,0) 0.L2 t 0.02 (253.J)

2,in i 0,0b

(38J.7) 1,06 i 0,03

(1 12.3) 0.70 i 0,04 (131,3)

i

и в

г н

LI

Примечаний: в скобках % от контроля;

* - различия опытных данных и контроля при р 0.05

Таблица 5

Влияние ЧАС-0-25К на степень поражения печени в условиях экспериментального гепатита, вызванного СЩ ( У. от контроля)

Биохимические показатели Кивотние, получавшие СС1 Шивотные, получавшие ЧАС-0-25К через 6 часов после введения ССЦ ----------- ----------- ---------------— ------- ■ т......- Мивотние, получавшие ЧАС-0-25К за сутки до введения СС1^

2 мг/кг 4" 'мг/кг 6 мг/кг 8 мг/кг 2 мг/кг 4 мг/кг 6 мг/кг • 8 мг/кг

А/ГГ 182,5+ 5,1 122,4+ 1.8 138.8+ 3.5 160,3+ 2,9 186,3+ 9.7 118,3+12,1 139.1+ 5.3 159,2+ 9,9 188,3+10,8

"истидаза 315,3+ 3,9 250,8+ 8.1 249,0+10,3 285,7+ 9,9 310,9+12,2 242,3+ 5,9 245.5+10.1 289,4+ 4,1 3^19,4+20,4

Общий Зилирубин 148,3+16,8 108,2+ 8,8 115,7+ 4,3 130,1+ 8,3 150,3+15,9 110,9+ 4.8 114,9+ 7,6 135,4+ 5.5 147,8+ 6,9

Прямой Зилирубин 50,7+ 8,2 59,3+ 4,3 60.3+ 2.1 61,0+ 5,7 68,2+ 6,4 71.9+ 0.9 74,0+ 5.2 75.9+ 3.9 77.8+ 7.0

Непрямой Зилирубин 49,3+ 5,9 40,7+ 1.9 39.?+ 2,4 39,0+ 3,4 31,8+ 1,8 28.1± 2.2 26,0+ 1.9 24.1+ 2.8 22.2+ 4.1

Примечание; - в качестве контроля взяты интактные вивотные;

- прямой и непрямой билирубин даны в процентах от общего' билирубина, принятого за 100 7.

Нарушение свертываемости крови у крыс вызывали введением антикоагулянта непрямого действия - синкумара, который тормозит восстановление оксида витамина К в активную форму. Это в свою очередь блокирует посттрансляционные модификации факторов II, VII, IX, X. Однократная инъекция опытным животным ЧАС-0-25К ускоряет восстановление свертывающей системы крови, стимулируя возрастание активности витамин К-зависимых факторов и сокращает время свертывания по йвику в 2.3 раза по сравнению с контролем (введение синкумара, без инъекций ЧАС-0-25К) (табл.4).

Влияние препарата на процесс заживления кожных ран контролировали планиметрически, гистологическими и гистохимическими методами. Авторадиографическое исследование поступления в ткани [14С1-ЧАС-0-25К из губок, содержащих препарат, показа-

Таблииа 4.

Изменение времени свертывания плазмы крови по Квику (сек) после введения синкумара ( 0,2 мг/кг ) и ЧАС-0-25К

Время от начала эксперимента (сутки) Животные

интактные получавшие ЧАС-0-25К получавшие синкумар получавиие синкумар и ЧЯС-0-25К

1 27,2 ± 0,02 25,9 ± 0,32 (105,9) 195,6 ± 13,3 (13,9) 141,9 ± 10,1 ( 19,2)

2 37,3 ± 0.12 31,7 * 0,9 (117.7) 133,9 ± 2,1 (27,9) 110,2 ± 3,9 ( 33,3)

«'' 3 32,7 ± 0,03 29,3 ± 1,2 (109,7) 534,5 ±12,5 ( 1.3) 143,0 ± 7,4 ( 22,1)

4 30.1 ± 1,02 27,3 ± 0,5 (110,3) 133,9 ± 11,2 (22,5) 24,2 ± 0,81 (124,2)

Примечание: в скобклх - активность протромбированного комплекса.

ло, что поликатион частично задерживается на плазматической мембране и внутри фибробластов и макрофагов грануляционной ткани, но большая его часть с кровью доставляется в ткани печени и селезенки.

Из коллагеновых губок и пленок с разным содержанием ЧАС-0-25К наиболее выраженным терапевтически)«! эффектом обладают коллагеновые губки, содержание 2-52 ЧАС-0-25К (рис.5).

Так при лечении коллагеновыми губками с Ы ЧАС-0-25К - индекс ускорения заживления составил '35,2% по сравнению с кол-лагеновой губкой без препарата и 202 по сравнению с использу- . емой в хирургической практике - губкой "Метуракол" (табл.5). .•1

О механизмах активирующего действия ЧАС-025К на течение восстановительных процессов, пока можно высказать лишь самые общие предположения. ЧАС-0-25К, по-видимому, задерживаясь на плазматической мембране, связывается с мембранными белками, фосфолипидами, с отрицательно заряженными группами гликопро-теинов. Такое многоточечное взаимодействие поликатиона приводит к изменению свойств мембран, и прежде всего их проницаемости для ионов и других низкомолекулярных веществ. На-

Рис.5. Ускорение заживления ран на 12-е и 14-е сутки после нанесения пленок с разным содержанием ЧАС-0-25К (2 от контр.)

Таблица 5"

ч

Динамика зажиэления^ран под влиянием композиций коллаген - ЧАС-0-25К

I_____

Серия Нспитуемий Кол-во хивотних Плоцадь рани 8 кн2 (М + ) Срок окончат, захивле-ния Индекс ускорения заживления

препарат 7 суток 10 суток 14 суток

1 Контроль I (коллагеновая губка) 20 284,3+ 43. б 238.6+ 24, 0 89 .01 22 8 30,1+ 1.24

2 Контроль II (губка "Метуракол") 20 244,5+ 18, 7 132,6+ 14, 3 71 .31 12 1 24,01 1,0

3 Коллагеновая губка с 2,5% ЧАС-0-25К 20 247,11 25. 0 221,31 18, 2 66 .31 12 8 21.01 1.3 I II - 30.2% - 12.5%

4 Коллагеновая губка, с 5% ЧАС-0-25К 20 257,11 25, в 208,6+ 32. 1 48 ,7+ 1 8 13.21 1.5 I II - 36,2% - 20 %

5 Коллагеновая губка с 103С ЧАС-0-25К 20 285,71 35. б 256.41 13. 0 147 .3+ 47 4 32,51 2,7 I II - 7.9% - 35.4%'

Примечание: Г - индекс ускорения заживления в отношении контрольной серии I;

II - индекс ускорения заживления в отношении контрольной серии II.

рушение гомеостаза клетки, в сзою очередь, вызывает цепь молекулярных событий, активирующих синтез нуклеиновых кислот и деление клеток. Кроме того, проникая з ядра гепатоштов ЧАС-0-25К воздействует, видимо, на хроматин, увеличивая интенсивность транскрипционных и решшкатизных процессов в травмированных тканях.

С другой стороны, ЧАС-0-25К, попала в макрофаги, количество которых в области повреждения ткани, как правило, возрастает (Г.Н.Берченко,1990), вызывает ах активацию, стимулируя к синтезу и секреции многочисленных ыакрофагальных факто-

>

ров, которые в свою очередь активируют днфференцировку и созревание Т- и В- лимфоцитов (Р.М.Хаитов, 1992), повышая тем самым иммунный ответ.

В совместной работе с М.В.Онуфриевым (Институт биохимии им.А.Н.Баха) установлено, что ЧАС-0-25К такхе оказывает влияние на перекисное окисление липидов, снижает уровень ТБК-активных продуктов в сыворотке крови травмированных животных. Возможно, это связано с прямым взаимодействием ЧАС-0-25К со свободными радикалами и замедлением интенсивности радикальных реакций, также нельзя исключить вероятность активирующего влияния ЧАС-0-25К на систему антиоксидантной защиты.

ВЫВОДЫ

1. Четвертичная аммонийная соль олнгомера 25 конидина накапливается преимущественно в печени, частично адсорбируется на клеточной мембране, а частично проходит через плазматическую и ядерную мембраны. ЧАС-0-25К связывается с цитоплазмати-ческими белками, а также в ядрах и митохондриях с Фракцией ДНП.

2. В печени интактних животных ЧАС-0-25К оказывает волнообразное влияние на интенсивность транскрипционных и реплика-тивных процессов и, возможно, вызывает синхронизацию клеточного цикла части гепатоцитов.

3. У крыс, после частичной гепатэктомии, однократное вве-

. V

дение ЧАС-0-25К стимулирует репаративный процесс, при этом наблюдается усиление транскрипции, увеличение синтеза ДНК.

4. При поражении печени ССЦ ЧАС-0-25К ускоряет восстановление морфофункциональных и биохимических характеристик клеток печени.

5. При нарушении свертывающей системы синкумаром, ЧАС-0-25К стимулирует регенерацию коагуляционной активности протромбинового комплекса.

6. Губки и пленки на основе коллагена и. ЧАС-025К более эффективно, чем исцользуемые в клинике губки "Метуракол" сокращают время заживления кожных ран.

По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Основное содержание диссертации отражают следующие публикации:

1. Хацернова Б.Я., Силаева С.А., Голенченко В.А., Николаев А.Я.,Розкин М.Я., Некрасов A.B., Берестецкая Т.3.,Ефимов B.C. Гепарин и его антагонист - четвертичная аммонийная соль оли-гомера-25 конидина: распределение по субклеточным органеллам, влияние на синтез ДНК в регенерирующей печени крыс. WBonp.мед.химии.-1989.-т.35, N 3.-с.83-87.

2. Силаева С.А., Хацернова Б.Я., Голенченко В.А., Берченко Г.Н., Николаев А.Я., Шехтер A.B. Синтез нуклеиновых кислот и динамика морфологических показателей грануляционной ткани кожных ран у крыс, леченых 4-метилурацилом. WBonp.мед.химии. -1990. -т.36,N 1. -с.82-84.

3..Хацернова Б.Я., Силаева С.А., Голенченко В.А., Скуридин С.Г., Розкин М.Я., Ефимов B.C. Синтез нуклеиновых кислот и пространственная организация ДНК в присутствии гепарина и четвертичной аммонийной соли олигомера-25 конидина. \\Mo-лек.биология.-1991. -t.25.N 5.-с.1308-1315.

4. Силаева С.А., Голенченко В.А., Гаврильчак A.B., Онуфри-

евМ.В., Хацернова Б.Я., Гуляева Н.В., Шехтер А.Б. Влияние карнозина и 4-метилурацила на развитие экспериментального гепатита у крыс. \\Биохимия.-1992.-т.57, N 9.-с.1366-1372.

5. Максудова Г.Т., Голенченко В.А., Ефимов B.C. Влияние поликатиона на основе алкалоида лупинина-антигеполина и его комплекса с гепарином на синтез ДНК в гепатоцитах крыс. \\Еюлл.эксперим.биологии и медицины. -1994.-N 6.-с.627-629.

Список сокращений АлТ - аланинаминотрансфераза ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота, ДНП - дезоксирибонуклеопротеин ПОЛ - перекисное окисление липидов РНК - рибонуклеиновая кислота ТБК - тиобарбитуровая кислота ЧАС-0-25К - четвертичная аммонийная соль олигомера 25 конидина

ЧГЭ - частичная гепатэктомия