Биосинтез микроцина C и механизмы устойчивости клеток к антибиотику

Новикова, Мария Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биосинтез микроцина C и механизмы устойчивости клеток к антибиотику
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез микроцина C и механизмы устойчивости клеток к антибиотику"

На правах рукописи

Новикова Мария Владимировна

БИОСИНТЕЗ МИКРОЦИНА С И МЕХАНИЗМЫ УСТОЙЧИВОСТИ КЛЕТОК К АНТИБИОТИКУ

Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003484214

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН и в группе регуляции экспрессии генов мобильных элементов прокариот Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Северинов Константин Викторович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Гельфанд Михаил Сергеевич

доктор биологических наук Колб Вячеслав Адамович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится 27 октября 2009 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан 2.5" сентября 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета канд. фарм. наук г-^. Грабовская

С.1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность паботм. С открытия и выделения пенициллина в 30-40-х годах XX века началось массовое применение антибиотиков в качестве медицинских препаратов для лечения заболеваний, вызываемых микроорганизмами. К сожалению, практически в то же время было обнаружено, что постоянное использование одних и тех же антибактериальных соединений может приводить к появлению устойчивости к их действию у микроорганизмов. Ученые предполагают, что в недалёком будущем существующие антибиотики могут исчерпать свой потенциал, так как патогенные микроорганизмы приобретут резистентность к широкому спектру антибактериальных соединений. В связи с этим открытие и исследование новых антибиотиков, а также изучение механизмов устойчивости клеток к ним являются крайне актуальными вопросами современной микробиологии.

В настоящее время широко изучаются микроцины - антибактериальные вещества, продуцируемые энтеробактериями. В отличие от большинства антибиотиков, синтезируемых специальными ферментами без участия рибосом, микроцины - это пептиды, закодированные в ДНК (чаще всего их гены располагаются на плазмидах) и синтезируемые на рибосомах. Характерной особенностью микроцинов является низкая молекулярная масса, не превышающая 10 кДа. Наибольший интерес в последние годы привлекают микроцины, подвергающиеся сложным посттрансляционным модификациям, в результате которых могут образовываться самые необычные структуры. К таким посттрансляционно модифицированным микроцинам и относится микроцин С (МсС), а также два других микроцина - микроцин В и микроцин .Г. Специфический ингибитор ДНК-гиразы микроцин В - богатый остатками глицина пептид, содержащий четыре тиозольных и четыре оксазольных кольца. Микроцин I - пептид, состоящий из 21 аминокислоты и имеющий необычную структуру «протянутого лассо». >1-концевой глицин микроцина I образует лактамовую связь с карбоксильной группой остатка глутаминовой кислоты в восьмом положении. В результате образуется кольцо, через которое пропущен С-конец молекулы. Микроцин I ингибирует транскрипцию, связываясь с аминокислотными остатками вторичного канала бактериальной РНК-полимеразы и предотвращая доступ субстратов (рибонуклеозидтрифосфатов) к каталитическому центру.

МсС является нуклеотид-гептапептидом, который ингибирует синтез белка в чувствительных клетках. Его структура и механизм действия были открыты сотрудниками Института молекулярной генетики РАН и Института биологии гена РАН. Мишенью МсС является одна из аминоацил-тРНК-синтетаз - аспартил-тРНК-синтетаза (АврЯЗ). Сам нуклеотид-гептапептид является неактивной транспортной формой антибиотика; для перехода в активное состояние МсС должен подвергнуться процессингу внутриклеточными пептидазами. В

результате высвобождается активная часть - негидролизуемый аспартил-аденилат (процессированный МсС), который и ингибирует AspRS.

Такой необычный механизм действия по аналогии со стратегией, использованной древними греками для захвата Трои, получил название стратегия Троянского коня. Подобный механизм действия также описан для ряда других антибиотиков (альбомицина, агроцина 84, фосфонопептидов).

Следует отметить, что к моменту начала данной работы МсС являлся наименее изученным антибиотиком в группе посттрансляционно модифицированных микроцинов. Кроме его структуры и открытого недавно механизма действия, оставались не до конца изученными синтез МсС, его процессинг, регуляция экспрессии микроцинового оперона mccABCDE, транспорт антибиотика в чувствительные клетки, а также механизмы клеточной устойчивости клеток к МсС. В рамках настоящей работы были получены новые данные по некоторым из вышеперечисленных вопросов.

Цели и задачи исследования. Основной целью данной работы являлось изучение механизма созревания МсС, а также определение механизмов устойчивости клеток к антибиотику.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Выяснить роль продуктов генов mccD и тссЕ микроцинового оперона mccABCDE в синтезе МсС.

2. Исследовать роль МссЕ в обеспечении устойчивости клеток к антибиотику.

3. Идентифицировать систему транспорта МсС в клетку.

Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе работы получены новые данные по механизму синтеза МсС. Впервые установлена роль продуктов генов mccD и тссЕ микроцинового оперона в созревании антибиотика и определены интермедиатные формы МсС, образующиеся в процессе синтеза.

Открыт и изучен один из механизмов устойчивости клеток к МсС за счёт действия МссЕ. Доказано, что С-концевой домен МссЕ ацетилирует процессированный МсС и тем самым нейтрализует его ингибирующее действие.

Идентифицирован ABC транспортёр YejABEF, который является единственным комплексом внутренней мембраны Е. coli, отвечающим за транспорт антибиотика из периплазматического пространства в цитоплазму клетки.

синтеза МсС и МсС-подобных соединений или для создания более эффективных антибактериальных препаратов на основе МсС.

Публикации и апробация работы. По результатам диссертационной работы опубликовано 3 статьи. Основные положения и результаты работы были представлены на следующих конференциях: 1) «АТР-Binding Cassette (ABC) Proteins: From Multidrug Resistance to Genetic Diseases», March 1 - 8, 2008, Innsbruck, Austria; 2) «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», 11-15 мая, 2008, Новосибирск, Россия; 3) «FEBS Practical Course on Protein interaction modules», April 18- 25, 2009, Split, Croatia; 4) «VIII European Symposium of The Protein Society», June 14 - 18, 2009, Zurich, Switzerland; 5) IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», 23 - 27 июня, 2009, Казань, Россия; 6) 3rd Congress of European Microbiologists: «Microbes and Man - interdependence and future challenges», June 28 - July 2, 2009, Gothenburg, Sweden.

Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждений, заключения, а также выводов, приложений и списка литературы. Работа изложена наШЧ страницах машинописного текста, включая 2 таблицы, рисунков. Список цитируемых литературных источников включает 148 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Биосинтез МсС

Гены, отвечающие за синтез зрелой формы МсС, или МсС1178 (молекулярная масса 1178 Да) (Рис. 1а), а также за устойчивость клетки-продуцента к синтезируемому антибиотику, образуют оперон mccABCDE (Рис. 2). тссА кодирует гептапептид-предшественник МсС; продукт гена тссВ присоединяет к С-концевому аминокислотному остатку гептапептида аденозинмонофосфат; продукт гена тссС - трансмембранный белок, который экспортирует зрелый МсС из клетки-продуцента. Для определения функций продуктов генов mccD и тссЕ нами были получены плазмиды тссАВСЕ и mccABCD на основе плазмиды pUHAB (плазмида pUHAB содержит полный микроциновый оперон mccABCDE), несущие амбер-мутации, соответственно, в начале mccD и тссЕ, и выделены и охарактеризованы производные МсС, продуцируемые клетками, содержащими полученные плазмиды.

В)

»vO^. ° { X

Г)

Д)

Me!-Arg-Thr-G!y-Asn-Ala-HN

Y о

VVi-o.

I н II

Рисунок 1. Структуры форм МсС и синтетических аналогов антибиотика: а) МсС1178; б) МсС1120; в) процессированная форма МсС1178; г) синтетические аналоги процессированного МсС, где R - Asp, Glu или Leu; д) синтетические аналоги зрелого МсС, где R - Asp, Glu или Leu.

тссА тссВ тссС mccD rnccE

Рисунок 2. Структура микроцинового оперона mccÂBCDE.

Формы МсС, продуцируемые клетками, содержащими тссАВСЕ, и клетками, содержащими mccABCD. Анализ препарата МсС, выделенного из культуры клеток Е. coli дикого типа, содержащих плазмиду тссАВСЕ (в отсутствии функционального гена mccD), показал, что зрелый антибиотик не продуцируется, а основным продуктом синтеза является производное МсС, обладающее антибактериальной активностью, с молекулярной массой 1120 Да (МсС 1120).

Ранее было обнаружено, что клетки дикого типа, содержащие плазмиду с микроциновым опероном в отсутствии тссЕ, не синтезируют МсС, в то время как клетки pepApepBpepN, лишённые трёх аминопептидаз широкой специфичности - РерА, РерВ и PepN, продуцируют антибиотик (клетки pepApepBpepN устойчивы к МсС: в их цитоплазме процессированная форма антибиотика (Рис. 1в) не образуется; причины, по которым экспрессия микроцинового оперона в отсутствии тссЕ зависит от культуры клеток, неизвестны). Поэтому для выяснения роли МссЕ в созревании антибиотика была использована культура клеток pepApepBpepN.

При контрольном выделении антибиотика из клеток pepApepBpepN, содержащих плазмиду с полным микроциновым опероном, было показано, что в препарате выделенного МсС присутствуют два мажорных масс-пика, соответствующие МсС 1178 и МсС 1149 - производному МсС 1178, не содержащему формильной группы на N-концевом остатке Met в составе гептапептида. Количество МсС 1149, выделяемого из клеток дикого типа, содержащих полный микроциновый оперон, в несколько раз меньше, чем количество МсС 1178 (было выдвинуто предположение, что в клетках pepApepBpepN повышена активность деформилазы). Анализ выделенного МсС из клеток pepApepBpepN, содержащих плазмиду с микроциновым опероном с мутацией в гене тссЕ, показал, что основными продуктами синтеза также являются две формы МсС - МсС1120 и его деформилированное производное - МсС1092.

Таким образом, главным продуктом, синтезируемым клетками, содержащими плазмиды с микроциновым опероном как в отсутствии продукта гена mccD, так и тссЕ, является форма МсС с молекулярной массой 1120 Да - МсС1120.

МсС1120: структура и антибактериальная активность. Структура МсС1120 была определена методом ЯМР. Оказалось, что МсС1120 представляет собой микроцин, который состоит из гептапептида и аденозинмонофосфата, в составе которого отсутствует аминопропильная группа (Рис. 16). Было показано, что МсС 1120 так же, как и МсС 1178, не подавляет рост клеток pepApepBpepN, а его антибактериальное действие на рост клеток чувствительной культуры дикого типа в несколько раз слабее, чем МсС 1178 (Рис. 3). На основании результатов опытов по ингибированию реакции аминоацилирования tPHKAsp in vitro было установлено, что наличие аминопропильной группы может влиять на сродство антибиотика к ферменту-мишени. Так, концентрация МсС1120, необходимая для 50%-ного ингибирования AspRS, в 10 раз выше, чем соответствующая концентрация МсС дикого типа. Кроме того, в отличие от МсС 1178, даже при насыщающих концентрациях МсС 1120 не наблюдалось полного ингибирования AspRS. Таким образом, наличие аминопропильной группы существенно увеличивает сродство процессированного МсС к ферменту-мишени.

Объяснение полученным экспериментальным данным было найдено с помощью структурного моделирования комплекса молекулы процессированного МсС и AspRS Е. coli, более точно, докинга этой молекулы в аспартил-аденилат-связывающий сайт белка (моделирование было проведено с помощью разработанного ранее программного обеспечения для молекулярного докинга '). Результаты докинга (Рис. 4) показывают, что положительно заряженная аминогруппа аминопропильной группы предположительно находится вблизи двух отрицательно заряженных карбоксильных групп AspRS Asp475 и Glu482. Электростатическое

1 Ramensky, V., A. Sobol, Zaitseva N., Rubinov A., and V. Zosimov. 2007. A novel approach to local similarity of protein binding sites substantially improves computational drug design results. Proteins 69: 349-357.

притяжение должно увеличивать сродство процессированной формы МсС 1178 к ферменту, а также может изменять структуру комплекса фермент-ингибитор, снижая скорость его диссоциации.

концентрация МсС, рМ

Рисунок 3. Сравнение антибактериальной активности МсС1178 и МсС1120. На газон чувствительных клеток Е. coli наносили образцы МсС в различных концентрациях. После нескольких часов инкубации измеряли диаметр образующихся зон ингибирования роста клеток.

Рисунок 4. Структурное моделирование комплекса молекулы процессированного МсС и AspRS Е. coli.

Таким образом, МсС1120 - это предшественник зрелого МсС, у которого отсутствует аминопропильная группа. Аминопропильная группа в составе МсС1178 повышает антибактериальную активность соединения за счёт улучшения взаимодействия с ферментом. Возможно, что наличие аминопропильной группы также влияет на эффективность транспорта и процессинга антибиотика.

На основании полученных нами данных, а также данных исследователей 2 можно предложить следующую схему синтеза МсС. МссВ, используя в реакции две молекулы АТР, присоединяет аденозинмонофосфат к гептапептиду, образуя МсС 1120. После МссВ-зависимой модификации гептапептида MccD и МссЕ осуществляют присоединение аминопропильной группы.

2. Ацетилтрансферазная активность МссЕс™ обеспечивает устойчивость клеток к МсС и аналогам процессированного МсС

Продукты микроцинового оперона mccABCDE не только обеспечивают синтез МсС, но и отвечают за резистентность клетки-продуцента к нарабатываемому антибиотику. Считается, что МссС - это помпа, находящаяся в цитоплазматической мембране Е. coli, которая экспортирует зрелый антибиотик из клетки в окружающую среду. Вторым белком, который обеспечивает «иммунитет» клетки-продуцента к антибиотику, считался продукт тссЕ.

К моменту начала экспериментов по изучению роли МссЕ в «иммунитете» к МсС было показано, что в экстракте, содержащем все продукты микроцинового оперона, имеется активность, нейтрализующая ингибирование AspRS процессированным МсС. Нами было предположено, что МссЕ участвует в этом процессе.

Клетки, продуцирующие МссЕ и МссЕс™, устойчивы к МсС и аналогам его процессированной формы. Из результатов биоинформатического анализа следует, что МссЕ -это двудоменный белок. N-концевой домен МссЕ - MccENTD - имеет гомологию с декарбоксилазами, С-концевой домен - МссЕСТ0 - гомологичен ацетил-КоА-зависимой ацетилтрансферазе RimL, которая осуществляет ацетилирование рибосомного белка L12.

В настоящей работе были получены экспрессионные плазмиды (на основе вектора рЕТ28), содержащие ген тссЕ и отдельно его N-концевой и С-концевой домены - рЕТ-тссЕ, рЕТ-тссЕчт и рЕТ-тссЕСТ0. Были подобраны условия экспрессии рекомбинантных белков. Для получения МссЕ и его доменов в растворимом состоянии в клетки Е. coli BL2!(DE3) была введена дополнительная плазмида pG-KJE8 (dnaK-dnaJ-grgE, groES-groEL (Takara BIO Inc.,

2 Roush, R. F., E. M. Nolan, F. Löhr, and С. T. Walsh. 2008. Maturation of an Escherichia coli ribosomal peptide antibiotic by ATP-consuming N-P bond fonnation in microcin Cl. J Am Chem Soc. 130:3603-3609.

Лрап)), содержащая несколько генов, кодирующих шапероны. Использование шаперонов -белков, которые обеспечивают правильное сворачивание полипептидных цепей, - является одним из известных способов получения белков в растворимой форме.

Для проверки устойчивости МсС наносили на мягкий агар с газоном тестируемой культуры и после роста клеток в течение нескольких часов измеряли диаметр образующихся зон ингибирования роста. Кроме МсС, дополнительно была проанализирована устойчивость клеток к тетрациклину (Тс), канамицину (Кт) и хлорамфениколу (Ст) (рЕТ28 содержит ген устойчивости к Кт, а рО-ИЕ8 - к Ст). Из полученных результатов (Рис. 5) видно, что клетки, в которых происходит продукция МссЕ и МссЕств устойчивы к действию МсС. Клетки, продуцирующие МссЕмто, чувствительны к антибиотику. Продукция МссЕ и его двух доменов не оказывает влияние на устойчивость к Тс. Все тестируемые культуры были устойчивы к Кт и Ст (данные не показаны).

250i

рЕТ МссЕ MccENTD МссЕСТ0 МссЕстомут

Рисунок 5. Проверка устойчивости клеток, продуцирующих МссЕ и его домены, к МсС и аналогам процессированного МсС. В качестве контроля использовались клетки, содержащие вектор без вставки. На газон тестируемых культур было нанесено 5 мкл МсС (300 мкМ), 10 мкл AspSA (6 мМ), 5 мкл LeuSA (3 мМ).

Для того чтобы выяснить, способен ли МссЕ обеспечивать устойчивость к процессированному МсС, мы использовали его синтетический аналог -аспартилсульфамоиладенозин (AspSA), а также другой аналог процессированного МсС -лейцилсульфамоиладенозин (LeuSA) (Рис. 1г) (получить процессированный МсС в количествах, необходимых для исследований, на данный момент невозможно). В системе in vitro AspSA и LeuSA ингибируют соответствующие аминоацил-тРНК-синтетазы с константами ингибирования - 8,0 пМ и 8,4 пМ, соответственно 3. Концентрация этих соединений, необходимая для

3 Van de Vijver, Р, G. H. Vondenhoff, T. S. Kazakov, E. Semenova, K. Kuznedelov, A. Metlitskaya, A. Van Aerschot, and K. Severinov. 2009. Synthetic Microcin С Analogs Targeting Different Aminoacyl-tRNA Synthetases. J Bacterid. Accepted for publication.

ингибирования роста бактериальных клеток in vivo, составляет около 0,5 - 5 мМ (в зависимости от штамма).

Проверка устойчивости клеток, продуцирующих MccE, MccENTD и МссЕСТ0, к аналогам процессированного МсС проводилась аналогично проверке на действие МсС. Оказалось, что клетки, продуцирующие MccENTD, так же, как и клетки, содержащие вектор без вставки, чувствительны к используемым концентрациям AspSA и LeuSA. Клетки, продуцирующие МссЕ, были устойчивы к AspSA, но частично устойчивы к LeuSA, в то время как продукция MccENTD приводит к полной устойчивости клеток к этим соединениям (Рис. 5).

Таким образом, МссЕсп>, по-видимому, обеспечивает устойчивость к МсС, функционируя на уровне процессированной формы антибиотика. Кроме того, действие МссЕ, вероятно, не зависит от аминокислотного остатка в структурах негидролизуемых аминоациладенилатов. МссЕств обладает ацетилтрансферазной активностью. На основании гомологии МссЕств с RimL было сделано предположение, что МссЕСТ0 обладает ацетилтрансферазной активностью, и эта активность необходима для нейтрализации ингибирующего действия процессированного МсС. Мы проверили наличие ацетилтрансферазной активности у С-концевого домена МссЕ в системе in vitro. В качестве донора ацетильной группы использовали ацетил-КоА (АцКоА), в качестве возможных субстратов - AspSA, LeuSA, МсС1178, МсС1149, а также GluSA (глутамилсульфамоиладенозин (Рис. 1г), который является ингибитором глутамиловой тРНК-синтетазы (константа ингибирования 2,8 пМ 4), но в концентрации 5-10 мМ не подавляет рост клеток in vivo) и свободные аминокислоты - Asp, Leu и Glu. На основании данных колорометрического метода, в основе которого лежит определение количества свободного КоА, образующегося в ходе реакции, были посчитаны скорости ацетилирования белком тестируемых соединений. Оказалось, что МссЕсто ацетилирует аналоги процессированного МсС (максимальная скорость реакции ацетилирования AspSA - 19,8 ± 0,9 мин"1; LeuSA - 47,3 ± 3,0 мин"'; GluSA - 40,0 ± 3,2 мин"'), а зрелый МсС, МсС1149 и свободные аминокислоты не являются субстратами фермента.

Для локализации сайта ацетилирования аналогов процессированного МсС белком МссЕ продукты реакции были проанализированы методами гидрофильной HILIC-хроматографии (Hydrophilic interaction liquid chromatography) и тандемной масс-спектрометрии в лаборатории А. Van Aerschot (Rega Institute for Medical Research, Бельгия). Оказалось, что все три соединения -ацетилированные AspSA, LeuSA и GluSA - имели ацетильную группу, которая располагалась на a-аминогруппе аминокислотного остатка.

4 Van de Vijver, Р, G. H. Vondenhoff, T. S. Kazakov, E. Semenova, К. Kuznedelov, A. Metlitskaya, A. Van Aerschot, and K. Severinov. 2009. Synthetic Microcin С Analogs Targeting Different Aminoacyl-tRNA Synthetases. J Bacteriol. Accepted for publication.

Для доказательства того, что ацетилтрансферазная активность МссЕстс необходима для обеспечения устойчивости к МсС методом сайт-направленного мутагенеза был получен МссЕстсмут - MccEctd, несущий двойную замену остатков Ser553 и Glu572 на остатки Ala (на основании данных по структуре активного сайта RimL предполагалось, что эти аминокислоты являются ключевыми остатками активного сайта МссЕ). Было показано, что максимальные скорости ацетилирования AspSA, LeuSA и GluSA мутантным белком составляют, соответственно, 0,8 ± 0,1 мин"1, 2,4 ± 0,3 мин'1 и 4,0 ± 0,5 мин"1, что в 10-25 раз ниже скорости реакции, катализируемой белком дикого типа. Кроме того, клетки, продуцирующие мутантную форму МссЕСТ0, чувствительны к МсС и его процессированным аналогам (Рис. 5).

Для того чтобы определить, необходима ли ацетилтрансферазная активность МссЕСТ1> для синтеза антибиотика, мутации, приводящие к заменам Ser553 и Glu572 на остатки Ala, также были введены в последовательность гена тссЕ в составе полного микроцинового оперона. Анализ антибиотика выделенного из культуры клеток pepApepBpepN, содержащих полученную плазмиду, показал, что основным продуктом синтеза является зрелый МсС. Таким образом, ацетилтрансферазная активность МссЕстс необходима для обеспечения устойчивости клеток к МсС, но не играет роли в созревании МсС. По-видимому, в синтезе антибиотика участвует N-концевой домен белка, гомологичный декарбоксилазам.

Ацетилированные аналоги процессированного МсС не ингибируют реакцию аминоацилирования in vitro. На основании полученных данных мы предположили, что устойчивость клеток-продуцентов к МсС обусловлена тем, что ацетилированный аналог процессированного МсС - ацетил-AspSA - не ингибирует AspRS, а устойчивость к аналогам процессированного МсС связана с тем, что продукты ацетилирования - ацетил-LeuSA и ацетил-GluSA - не ингибируют соответствующие аминоацил-тРНК-синтетазы.

Ацетилированные AspSA, LeuSA и GluSA были проверены на способность ингибировать реакцию аминоацилирования in vitro. Из результатов (Рис. 6) видно, что добавление в экстракт клеток немодифицированых ингибиторов или аминоацилсульфамоиладенозинов, проинкубированных с MccENTD, подавляет реакцию аминоацилирования соответствующих тРНК, в то время как продукты, образующиеся в ходе ацетилтрансферазной реакции в присутствии МссЕСТ0, - ацетилированные LeuSA, AspSA и GluSA - не влияют на активность тРНК-синтетаз.

Таким образом, ацетилированные аналоги процессированного МсС не ингибируют тРНК-синтетазы.

Рисунок 6. Реакция аминоацилирования в присутствии XSA (AspSA, LeuSA или Glu-SA) и ацетилированных XSA. Продукты реакции ацетилирования белком МссЕст" (XSA+AuKoA+MccEtTD) добавлялись к S30 экстрактам Е. coli. После чего к экстрактам были добавлены радиоактивные аминокислоты, соответствующие аминокислотным частям ингибиторов, а затем определялось количество аминоацилированной т-РНК по включению радиоактивно меченой аминокислоты (аспартата, лейцина или глутамата) во фракцию осадка, нерастворимого в холодной ТХУ. Для проверки были взяты XSA, а также эти же соединения, которые инкубировались с MccEntd (XSA+AuKoA+MccEntd). За 100% было принято количество аминоацил-тРНК, образуемое в отсутствии инкубации с каким-либо из соединений (контроль).

На основании результатов наших экспериментов, выполненных с использованием AspSA -аналога процессированного МсС, можно заключить, что С-концевой домен МссБ является адетилтрансферазой, которая переносит ацетильную группу на NH2-rpynny остатка Asp процессированного МсС, и что ацетилированная форма антибиотика не ингибирует клеточную мишень - AspRS. Мутации, приводящие к снижению ацетилтрансферазной активности МссЕ, приводят к чувствительности клеток к антибиотику.

3. Система транспорта МсС

Механизм действия МсС предполагает, что появление устойчивости к антибиотику может быть обусловлено тремя типами мутаций - нарушениями транспорта МсС, его процессинга, а также повреждениями гена, кодирующего фермент-мишень.

Поскольку АзрЯЭ - жизненно важный фермент, то мутации в гене, кодирующем мишень, скорее всего, будут для клетки летальными. Однако не исключено, что мутации в регуляторной последовательности этого гена, например, повышающие его экспрессию, могут повлиять на

уровень устойчивости. Действительно, было показано, что сверхпродукция AspRS приводит к устойчивости клеток к действию МсС 5.

Получение мутаций устойчивости, связанных с нарушением процессинга МсС маловероятно, так как в деградации пептидной части молекулы участвуют несколько взаимозаменяемых клеточных пептидаз. Было обнаружено, что клетки, лишенные одновременно трёх генов, кодирующих пептидазы широкой специфичности РерА, РерВ и PepN, устойчивы к антибиотику.

Наконец, устойчивость к МсС может возникать вследствие нарушения проникновения его в клетку. В предварительных исследованиях, проведенных в лаборатории И. А. Хмель, была проверена коллекция штаммов Е. coli с мутациями различных компонентов транспортных систем. Было показано, что, одним из белков, участвующим в транспорте МсС в периплазму, является OmpF 6, так как клетки, несущие мутацию в этом гене, были частично устойчивы к антибиотику. Однако вопрос о системе, необходимой для транспорта антибиотика в цитоплазму, оставался неисследованным.

Для идентификации системы транспорта МсС была использована библиотека клеток Е. coli SG289, несущих случайные инсерции транспозона TNSC189 1, - SG289(Tn) (была любезно предоставлена Sean Garrity (Harvard Medical School, США)). Инсерция транспозона делает клетки SG289(Tn) устойчивыми к канамицину (Km).

Отбор клеток Е. coli, устойчивых к МсС, и проверка сцепленности устойчивости к Km и

МсС. Из библиотеки клеток SG289(Tn) были отобраны 7 независимых колоний, устойчивых к МсС. Для экспериментального доказательства того, что устойчивость к МсС отобранных колоний действительно вызвана инсерцией транспозона, были проведены опыты по трансдукции фагом PI,,,-,.. Для каждого из 7 штаммов было получено 10-20 колоний-трансдуктантов, устойчивых к Km. Наличие инсерции транспозона у полученных трансдуктантов TnSC289 было подтверждено методом ПЦР. Все трансдуктанты были устойчивы к МсС (ко-трансдукция -100%). Таким образом, можно заключить, что устойчивость к МсС у исследуемых колоний, действительно, обусловлена вставкой транспозона.

Определение нуклеотндной последовательности в районе вставки транспозона. Одним из ключевых моментов данной работы части было определение генов, в последовательность

5 Metlitskaya, A., Kazakov T„ Kommer A., Pavlova 0., Praetorius-Ibba M., Ibba M., Krasheninnikov I., Kolb V., Khmel I., and Severinov K. 2006. Aspartyl-tRNA Synthetase is the target of peptide nucleotide antibiotic microcin C. J. Biol. Chem. 281: 18033-18042.

6 Khmel, 1. A., V. M. Bondarenko, I. M. Manokhina, E. I. Basyuk, A. Z. Metlitskaya, V. A. Lipasova, and Y. M. Romanova. 1993. Isolation and characterization of Escherichia coli strains producing microcins of B and C types. FEMS Microbiol Lett. Ill: 269-74.

7 Chiang S.L. & Rubin E.J. 2002. Construction of a mariner-based transposon for epitope-tagging and genomic targeting. Gene 296: 179-185.

которых произошла инсерция транспозона. Определение локализации транспозона проводили с помощью метода ПЦР с одним праймером в реакционной смеси и со сменой температур отжига праймера в течение опыта8. Было установлено, что у пяти трансдуктантов вставка транспозона произошла в различные места гена yejA, а у двух трансдуктантов 1 и 6 - в ген yejB. Оба этих гена находятся в составе оперона yejABEF. На основании данных биоинформатического анализа можно утверждать, что гены оперона yejABEF кодируют белки олигопептидного транспортёра ABC-семейства: продукт гена yejA - это периплазматический белок, отвечающий за связывание субстрата, YejB и YejE - трансмембранные белки, a YejF - белок, обладающий АТФ-азной активностью. Данных о специфичности транспортной системы YejABEF не имеется. yej мутанты, полученные методом направленного мутагенеза, устойчивы к МсС и к его синтетическим аналогам, но чувствительны к аналогам процессированного МсС. Методом направленного мутагенеза9 в лаборатории д. Wanner (Purdue University, США) были получены четыре штамма Е. coli, не содержащие генов yejA, yejB, yejE или yejF, и нами была определена их чувствительность к МсС. Оказалось, что все эти штаммы устойчивы к антибиотику (Рис. 7). В экстрактах клеток каждого из мутантов - yejA, yejB, yejE и yejF - так же, как в экстрактах клеток дикого типа, наблюдалось полное ингнбированне реакции аминоацилирования tPHKAsp при добавлении МсС (Рис. 8), что указывает на то, что и процессинг МсС и фермент-мишень остались неизмененными. Таким образом, продукты генов оперона yejABEF действительно необходимы для обеспечения чувствительности клеток к МсС и, скорее всего, действуют на стадии проникновения антибиотика в клетку.

Нами была проверена устойчивость yej мутантов к химическим аналогам зрелого МсС и соответствующим аналогам процессированного МсС (синтетические аналоги МсС содержат остатки Asp, Leu или Glu в 7 положении гептапептида и ингибируют соответствующие аминоацил-тРНК-синтетазы; кроме того, в структуре этих соединений отсутствует аминопропильная группа (Рис. 1 д)). В качестве контроля использовались клетки дикого типа. Из рис. 9 видно, что клетки чувствительны ко всем аналогам процессированного МсС, но устойчивы к синтетическим аналогам МсС.

На основании полученных данных можно заключить, что YejABEF необходим для транспорта МсС и его аналогов, но не участвует в транспорте аналогов процессированного МсС. Природа аминокислоты в 7-ом положении гептапептида не важна для узнавания транспортёром.

8 Ducey, T. F. & D. W. Dyer. 2002. Rapid identification of EZ:TN™ transposon insertion sites in the genome of Neisseria gonorrhoeae. EPICENTRE Forum 9:6-7.

' Datsenko, K.A. & Wanner B. L. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. PNAS 97:6640-6645.

Время роста культуры клеток, мин

Рисунок 7. Рост клеток уе]А в жидкой среде в присутствии зрелого МсС (10 мкг/мл). За скоростью роста клеток следили по увеличению оптической плотности среды при 600 нм (СЮбоо). В качестве контроля использовали клетки дикого типа (дт). Аналогичная картина наблюдалась и для клеток уе]В, уе]Е и уе]Р.

гЬ

ДТ

yejA

- МсС нМсС

ь.

yejB yejE yejF

Рисунок 8. Реакция аминоацилирования в экстрактах клеток, мутантных по генам оперона YejABEF. S30 экстракты клеток инкубировали с интактным МсС в течение 1 часа (времени, достаточного для процессинга) при 37 °С, после чего в эту смесь добавляли компоненты для реакции аминоацилирования, включая радиоактивную аминокислоту Asp. Количество образовавшейся аминоацилированной тРНКАяр измеряли по включению радиоактивной метки во фракцию осадка, нерастворимого в холодной ТХУ.

а) 140

120

_ 100

НО

я со 60

£ Ю 40

X X 20

о о 0

10 100 1000 Концентрация (рМ)

■ [X]-AspSA

- [X]-LeuSA

- [X]-GluSA -McC

AspSA • LeuSA GluSA

[X] = MRTGNA

140' 120 100 80 60" 40* 20

Д-Д-Д fr : - ■ ■-л-

10 100 1000 Концентрация (pM)

—McC —*— [X]-AspSA —<^[X]-LeuSA [X]-GluSA - ■«- - AspSA -••-- LeuSA GluSA [X] = MRTGNA

Рисунок 9. Проверка устойчивости клеток дикого типа (а) и уе]А (б) к аналогам зрелого МсС и аналогам процессированного МсС. На газон клеток были нанесены растворы тестируемых соединений и после инкубации в течение нескольких часов измерены диаметры ингибирования зон роста. Аналогичная картина наблюдалась и для культур клеток уе]В, уе]Е \iyejF.

Предсказание функций продуктов генов оперона yejABEF методами биоинформатики. Для

получения дополнительной информации об опероне yejABEF был проведён биоинформатический анализ аминокислотных последовательностей YejA и YejB. Поскольку периплазматические белки известных олигопептидных транспортёров суперсемейства ABC схожи с периплазматическими белками АВС-транспортёров ионов никеля, было построено общее филогенетическое дерево периплазматических белков семейства АВС-транспортёров, отвечающих за транспорт олигопептидов и ионов никеля (включая Yej). Анализ филогенетического дерева показал, что YejA и его гомологи лежат на отдельной ветке.

Анализ филогенетических деревьев, построенных на основании аминокислотных последовательностей гомологов YejA и YejB позволил выявить белки, имеющие с ними общее эволюционное происхождение. В исследованных геномах гомологи YejA, как правило, соседствуют с гомологами YejB, и предположительно входят в состав одного оперона. Структура содержащего эти гены локуса в целом консервативна в пределах типа Proteobacteria и включает, помимо гомологов генов yej Л и yejB, гомологи генов уе/£ ayejF.

Предполагалось, что бактерии, которые содержат оперон yej в геноме, должны быть чувствительны к действию МсС. Однако, несмотря на то, что Pseudomonas aeruginosa PAOl имеет два оперона, кодирующих транспортные системы, родственные комплексу Yej, этот организм оказался устойчивым к микроцину (Н. Курепина, личное сообщение). Мы предполагаем, что поскольку AspRS - высоко консервативный фермент у бактерий и система клеточных пептидаз, в целом, консервативна, то устойчивость должна быть связана со свойствами транспортной системы. Поэтому устойчивость к МсС Pseudomonas может быть объяснена как изменениями специфичности транспортёра к МсС, так и низким уровнем экспрессии оперонов yej в данном штамме. Также возможно, что на транспорт МсС влияют другие, в настоящее время неизвестные рецепторные системы внешней мембраны.

Таким образом, в результате исследования были обнаружены и идентифицированы мутации, приводящие к устойчивости к МсС. Картирование мутаций методом однопраймерной ПЦР показало, что у отобранных нами мутантов устойчивость к МсС определяется повреждением генов ABC транспортёра, расположенного во внутренней (цитоплазматической) мембране бактериальной клетки. Гены, кодирующие четыре субъединицы транспортёра,-периплазматический белок (YejA), два трансмембранных белка (YejB и YejE) и белок, обладающий АТФ-ной активностью, (YejF) (на основании данных биоинформатического анализа) - находятся в опероне yejABEF. Опыты по проверке устойчивости к МсС клеток, лишённых отдельных генов оперона yejABEF, показали, что каждый из белков транспортёра необходим для транспорта МсС.

Механизм транспорта и структура комплекса YejABEF неизвестны. Однако есть ряд экспериментальных данных, указывающих на его функцию в клетке. Так, для патогенных штаммов Salmonella enterica показано, что мутации в yej понижают их вирулентность и повышают чувствительность к антимикробным пептидам10. Предполагают, что Yej участвует в транспорте иммуногенных бактериальных пептидов, тем самым, снижая вероятность их взаимодействия с комплексом МНС I, а также транспортирует антимикробные пептиды для их деградации в цитоплазме клетки.

10 Eswarappa, S. M., Panguluri K. K., Hensel M., Chakravortty D. 2008. The yejABEF operon of Salmonella confers resistance to antimicrobial peptides and contributes to its virulence. Microbiology 154:666-678.

На основе вышеуказанных данных и данных биоинформатического анализа можно предположить, что основная функция этого транспортера связана с транспортом олигопептидов. Но вопрос о специфичности транспортера требует дополнительных исследований.

ВЫВОДЫ

1. Продукты генов mccD и тссЕ микроцинового оперона mccABCDE отвечают за присоединение аминопропильной группы к гептапептид-нуклеотиду МсС.

2. Наличие аминопропильной группы в составе зрелого МсС приводит к увеличению антибактериальной активности соединения за счёт повышения сродства к белку-мишени -AspRS.

3. МссЕ является частью системы, обеспечивающей устойчивость клеток к МсС. С-концевой домен этого белка является ацетилтрансферазой, которая переносит ацетильную группу на процессированный МсС, и такая модифицированная форма антибиотика не ингибирует AspRS. Ацетилтрансферазная активность МссЕ не важна для синтеза антибиотика.

4. АВС-транспортёр YejABEF - это единственный комплекс белков внутренней мембраны Е. coli, ответственный за транспорт МсС через цитоплазматическую мембрану в цитоплазму клетки. Мутации в каждом из генов оперона yejABEF приводят к устойчивости к МсС.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах:

1. Metlitskaya, A., Kazakov T., Vondenhoff G. H., Novikova M.. Shashkov A., Zatsepin T., Semenova E., Zaitseva N., Ramensky V., Van Aerschot A., and Severinov K. 2009. Maturation of Translation Inhibitor Microcin C. J Bacterial. 191: 2380-7.

2. Kazakov, T., Vondenhoff G.H., Datsenko K.A., Novikova M., Metlitskaya A., Wanner B.L., Severinov K. 2008. Escherichia coli peptidase A, В, or N can process translation inhibitor microcin C.J Bacteriol. 190: 2607-10.

3. Novikova. M.. Metlitskaya A., Datsenko K., Kazakov T., Kazakov A., Wanner В., Severinov К. 2007. The Escherichia coli Yej Transporter Is Required for the Uptake of Translation Inhibitor Microcin C. J Bacteriol. 189: 8361- 8365.

Тезисы конференций:

1. Novikova, M.. Metlitskaya A. Z., Kazakov, T. S., Datsenko К., Vondenhoff G.H., Severinov К. Microcin С: biosynthesis, transport, processing of the translation inhibitor. 3rd Congress of

European Microbiologists: «Microbes and Man - interdependence and future challenges», Gothenburg, Sweden, June 28 - July 2, 2009.

2. Новикова M. В.. Метлицкая A. 3., Казаков Т. С., Vondenhoff G. H., Северинов К. В. Разработка нанолекарств на основе антибактериального пептида микроцина С. IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань, Россия, 23 - 27 июня 2009.

3. Novikova. М„ Metlitskaya A. Z„ Kazakov, Т. S., Vondenhoff G.H., Severinov К. Dissecting the functions of the products of microcin С biosynthetic operon. VIII European Symposium of The Protein Society, Zurich, Switzerland June 14-18,2009.

4. Novikova. M„ Metlitskaya A. Z., Kazakov, T. S., Vondenhoff G.H., Severinov K. Microcin C: transport, biosynthesis and mechanism of action. FEBS Practical Course on Protein interaction modules, Split, Croatia, April 18-25,2009.

5. Новикова M. В.. Метлицкая A. 3., Казаков Т. С., Vondenhoff G. H., Северинов К. В. Микроцин С: биосинтез, транспорт и механизм действия. «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», Новосибирск, Россия, 11-15 мая, 2008.

6. Novikova. М.. Metlitskaya A., Datsenko К., Kazakov Т., Kazakov A., Severinov К. The Escherichia coli ABC Transporter Yej Is Required for the Uptake of Antibiotic Microcin C. 2008. ATP-Binding Cassette (ABC) Proteins: From Multidrug Resistance to Genetic Diseases, Innsbruck, Austria, March 1-8,2008.

Заказ № 148-а/09/09 Подписано в печать 23.09.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 (1^)1 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Новикова, Мария Владимировна

Список сокращений

1. ВВЕДЕНИЕ. Общая характеристика работы 6 1.1. Актуальность работы 6 1. 2. Цели и задачи исследования 8 1.3. Научная новизна и практическая значимость работы

1. 4. Апробация работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Транспортные системы Enterobacteriaceae. 10 Микроцин С.

2. 1. Транспортные системы Enterobacteriaceae. 10 2. 1. 1. Строение клеточной стенки грамотрицательных бактерий 12 2. 1.2. Каналы и поры (класс 1)

2. 1. 2. 1. Порины

2. 1.2. 2. Специфичные каналы

2. 1. 2. 3. TonB-зависимые рецепторы

2. 1. 2. 4. Аквапорины

2. 1.3. Первичные переносчики (класс 3)

2. 1.3. 1. Подкласс АТФ-зависимые транспортёры

2. 1.3.2. Транспортные белки, функционирующие за счёт 47 энергии реакции декарбоксилирования

2. 1.4. Вторичные переносчики (класс 2)

2. 1.5. Фосфотрансферазная система (класс 4)

2. 1.6. Транспортёры электронов (класс 5)

2. 2. Микроцин С 58 2. 2. 1. Микроцины 58 2. 2. 2. Структура МсС 59 2. 2. 3. тсс оперон 60 2. 2. 4. Система транспорта МсС 61 2. 2. 5. Механизм действия МсС и его клеточная мишень 61 2. 2. 6. Процессинг антибиотика

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3. 1. Бактериальные штаммы 65 3. 2. Питательные среды

3.3. Отбор бактериальных колоний и их проверка на устойчивость 65 к антибиотикам

3.4. Метод ПЦР

3.5. Электрофорез в агарозном геле 68 3. 6. Извлечение фрагментов ДНК из агарозного геля 68 3. 7. Расщепление ДНК рестриктазами 68 3. 8. Лигирование фрагментов ДНК 69 3. 9. Приготовление химически компетентных клеток Е. coli 69 3. 10. Трансформация компетентных клеток Е. coli

3.11. Получение конструкций рЕТ-тссЕ, рЕТ-тссЕ1 и рЕТmccE°TD, а также введение мутаций в последовательность тсс оперона

3. 12. Трансдукция

3.13. Выделение микроцина

3.14. Анализ антибактериальной активности фракций МсС

3.15. Тест на наличие продукции МсС

3.16. Определение чувствительности клеток к МсС (или другим 73 соединениям)

3.17. Процессинг МсС 73 3. 18. Сверхпродукция белка 74 3.19. Выделение рекомбинантного белка на Ni-NTA-агарозе 74 3. 20. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 75 3.21. Ацетилтрансферазная реакция in vitro 75 3. 22. Реакция аминоацилирования 76 3. 23. ТХУ осаждение белков

3. 24. Биоинформатический анализ нуклеотидных и 77 аминокислотных последовательностей

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

4. 1. Биосинтез МсС 78 4. 1. 1. Формы МсС, продуцируемые клетками, содержащими тссАВСЕ

4. 1.2. Картирование старта тссЕ

4. 1.3. Формы МсС, продуцируемые клетками, содержащими „ . mccABCD

4. 1.4. McCl 120: структура и антибактериальная активность

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосинтез микроцина C и механизмы устойчивости клеток к антибиотику"

С открытия и выделения пенициллина в 30-40-х годах XX века началось массовое применение антибиотиков в качестве медицинских препаратов для лечения заболеваний, вызываемых микроорганизмами. К сожалению, практически в то же время было обнаружено, что постоянное использование одних и тех же антибактериальных соединений может приводить к появлению устойчивости к их действию у микроорганизмов. Ученые предполагают, что в недалёком будущем существующие антибиотики могут исчерпать свой потенциал, так как патогенные микроорганизмы приобретут резистентность к широкому спектру антибактериальных соединений. В связи с этим открытие и исследование новых антибиотиков, а также изучение механизмов устойчивости клеток к ним являются крайне актуальными вопросами современной микробиологии.

В настоящее время широко изучаются микроцины - антибактериальные вещества, продуцируемые энтеробактериями. В отличие от большинства антибиотиков, синтезируемых специальными ферментами без участия рибосом, микроцины - это пептиды, закодированные в ДНК (чаще всего их гены располагаются на плазмидах) и синтезируемые на рибосомах. Характерной особенностью микроцинов является низкая молекулярная масса, не превышающая 10 кДа (Asensio & Perez-Diaz, 1976). Наибольший интерес в последние годы привлекают микроцины, подвергающиеся сложным посттрансляционным модификациям, в результате которых могут образовываться самые необычные структуры. К таким посттрансляционно модифицированным микроцинам и относится микроцин С (МсС), а также два других микроцина - микроцин В и микроцин J. Специфический ингибитор ДНК-гиразы микроцин В - богатый остатками глицина пептид, содержащий четыре тиозольных и четыре оксазольных кольца (Destoumieux-Garzon et al., 2002; Vizan et al., 1991; Li et al., 1996). Микроцин J - пептид, состоящий из 21 аминокислоты и имеющий необычную структуру «протянутого лассо». N-концевой глицин микроцина J образует лактамовую связь с карбоксильной группой остатка глутаминовой кислоты в восьмом положении (Bayro el al., 2003; Rosengren et al., 2003; Wilson et al., 2003). В результате образуется кольцо, через которое пропущен С-конец молекулы. Микроцин J ингибирует транскрипцию, связываясь с аминокислотными остатками вторичного канала бактериальной РНК-полимеразы и предотвращая доступ субстратов (рибонуклеозидтрифосфатов) к каталитическому центру (Adelman et al., 2004; Mukhopadhyay et al., 2004).

McC является нуклеотид-гептапептидом, который ингибирует синтез белка в чувствительных клетках. Его структура и механизм действия были открыты сотрудниками Института молекулярной генетики РАН и Института биологии гена РАН. Мишенью МсС является одна из аминоацил-тРНК-синтетаз - аспартил-тРНК-синтетаза (AspRS). Сам нуклеотид-гептапептид является неактивной транспортной формой антибиотика; для перехода в активное состояние МсС должен подвергнуться процессингу внутриклеточными пептидазами. В результате высвобождается активная часть -негидролизуемый аспартил-аденилат (процессированный МсС), который и ингибирует AspRS (Metlitskaya et al., 2006).

1. 2. Цели и задачи исследования

Основной целью данной работы являлось изучение механизма созревания МсС, а также определение механизмов устойчивости клеток к антибиотику.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Выяснить роль продуктов генов mccD и тссЕ микроцинового оперона mccABCDE в синтезе МсС.

2. Исследовать роль МссЕ в обеспечении устойчивости клеток к антибиотику.

3. Идентифицировать систему транспорта МсС в клетку.

1. 3. Научная новизна и практическая значимость работы

В ходе работы получены новые данные по механизму синтеза МсС. Впервые установлена роль продуктов генов mccD и тссЕ микроцинового оперона в созревании антибиотика и определены интермедиатные формы МсС, образующиеся в процессе синтеза.

Полученные в данной работе результаты расширяют представления о механизме созревания МсС, транспорте антибиотика, а также о механизмах клеточной устойчивости к МсС и могут быть использованы для решения ряда прикладных задач, например, для химического синтеза МсС и МсС-подобных соединений или для создания более эффективных антибактериальных препаратов на основе МсС.

1. 4. Апробация работы

По результатам диссертационной работы опубликовано 3 статьи. Основные положения и результаты работы были представлены на следующих конференциях: 1) «АТР-Binding Cassette (ABC) Proteins: From Multidrug Resistance to Genetic Diseases», March 1 - 8, 2008, Innsbruck, Austria; 2) «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», 11-15 мая, 2008, Новосибирск, Россия; 3) «FEBS Practical Course on Protein interaction modules», April 18-25, 2009, Split, Croatia; 4) «VIII European Symposium of The Protein Society», June 14 - 18, 2009, Zurich, Switzerland; 5) IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», 23 — 27 июня, 2009, Казань, Россия; 6) 3rd Congress of European Microbiologists: «Microbes and Man - interdependence and future challenges», June 28 - July 2, 2009, Gothenburg, Sweden.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Новикова, Мария Владимировна

6. выводы

4. ABC транспортёр YejABEF - это единственный комплекс белков внутренней мембраны Е. coli, ответственный за транспорт МсС через цитоплазматическую мембрану в цитоплазму клетки. Мутации в каждом из генов оперона yejABEF приводят к устойчивости к МсС.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах:

1. Metlitskaya, A., Kazakov Т., Vondenhoff G. Н., Novikova М., Shashkov А., Zatsepin Т., Semenova Е., Zaitseva N., Ramensky V., Van Aerschot A., and Severinov K. 2009. Maturation of Translation Inhibitor Microcin C. J Bacteriol. 191: 2380-7.

2. Kazakov, Т., Vondenhoff G.H., Datsenko K.A., Novikova M- Metlitskaya A., Wanner B.L., Severinov K. 2008. Escherichia coli peptidase A, B, or N can process translation inhibitor microcin C. J Bacteriol. 190: 2607-10.

3. Novikova. M., Metlitskaya A., Datsenko K., Kazakov Т., Kazakov A., Wanner В., Severinov K. 2007. The Escherichia coli Yej Transporter Is Required for the Uptake of Translation Inhibitor Microcin C. J Bacteriol. 189: 8361- 8365.

Тезисы конференций:

1. Novikova, M., Metlitskaya A. Z., Kazakov, T. S., Datsenko K., Vondenhoff G.H., Severinov K. Microcin C: biosynthesis, transport, processing of the translation inhibitor. 3rd Congress of European Microbiologists: «Microbes and Man - interdependence and future challenges», Gothenburg, Sweden, June 28 - July 2, 2009.

2. Новикова M. В., Метлицкая A. 3., Казаков Т. С., Vondenhoff G. H., Северинов К. В. Разработка нанолекарств на основе антибактериального пептида микроцина С. IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань, Россия, 23 - 27 июня 2009.

3. Novikova. М. Metlitskaya A. Z., Kazakov, Т. S., Vondenhoff G.H., Severinov К. Dissecting the functions of the products of microcin С biosynthetic operon. VIII European Symposium of The Protein Society, Zurich, Switzerland June 14-18, 2009.

4. Novikova, M., Metlitskaya A. Z., Kazakov, T. S., Vondenhoff G.H., Severinov K. Microcin C: transport, biosynthesis and mechanism of action. FEBS Practical Course on Protein interaction modules, Split, Croatia, April 18 - 25, 2009.

5. Новикова M. В., Метлицкая A. 3., Казаков Т. С., Vondenhoff G. H., Северинов К. В. Мик'роцин С: биосинтез, транспорт и механизм действия. «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», Новосибирск, Россия, 11-15 мая, 2008.

6. Novikova, М., Metlitskaya A., Datsenko К., Kazakov Т., Kazakov А., Severinov К. The Escherichia coli ABC Transporter Yej Is Required for the Uptake of Antibiotic Microcin C. 2008. ATP-Bhiding Cassette (ABC) Proteins: From Multidrug Resistance to Genetic Diseases, Innsbruck, Austria, March 1-8, 2008.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Открытие и изучение новых антибиотиков имеет большое практическое значение не только для медицины, но и для фундаментальных исследований, поскольку позволяет расширить представления о важнейших клеточных процессах. Наша исследовательская работа была посвящена изучению антибиотика МсС, нового ингибитора синтеза белка. Экспериментальная часть данной работы включала изучение следующих вопросов - биосинтеза МсС, механизма устойчивости клеток к антибиотику за счёт продукта гена тссЕ микроцинового оперона и идентификация системы транспорта МсС.

Нам удалось определить, что продукты генов mccD и тссЕ оперона mccABCDE необходимы -для присоединения аминопропильной группы к нуклеотид-гептапептиду МсС: в отсутствии функционально активного продукта как первого, так и второго гена не происходит синтеза зрелого МсС, а образуется его предшественник - МсС 1120, у которого отсутствует аминопропильная группа. Однако механизмы синтеза аминопропильной группы и её присоединения пока не установлены.

Кроме того, в настоящей работе был открыт интересный механизм устойчивости клеток к МсС, в котором участвует МссЕ. Оказалось, что С-концевой домен белка обеспечивает «иммунитет» к антибиотику не за счёт действия на зрелый МсС, а за счёт ацетилирования процессированной формы антибиотика, что приводит к потери ингибиторных свойств негидролизуемого модифицированного аспартил-аденилата. Продолжая работу по изучению механизмов устойчивости к МсС, интересно будет выяснить механизм устойчивости к МсС за счёт продукта гена mccF оперона МсС7, который отсутствует в опероне МсС51.

В результате данной работы также был выявлен один из участников системы транспорта МсС в клетку - ABC транспортёр YejABEF. Однако на настоящий момент остаются неизвестными белки внешней мембраны, которые вместе с OmpF могут участвовать в транспорте МсС в периплазму клетки. Кроме того, система экспорта зрелого МсС из клетки-продуцента не изучена.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Новикова, Мария Владимировна, Москва

1. Adelman, К., J. Yuzenkova, A. La Porta, N. Zenkin, N. Lee, J. T. Lis, S. Borukhov, M. D. Wang, and K. Severinov. (2004). Molecular mechanism of transcription inhibition by peptide antibiotic Microcin J25. Mol. Cell 16: 753-762.

2. Altschul, S. F., T. L. Madden, A. A. Schaffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller, and D. J. Lipman. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.

3. Asensio, C., and J. C. Perez-Diaz. (1976). A new family of low molecular weight antibiotics from enterobacteria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 69: 7-14.

4. Atlung, Т., and H. Ingmer. (1997). H-NS a modulator of environmentally regulated gene expression. Mol. Microbiol. 24: 7-17.

5. Barrett A. J., N. D. Rawlings, and J. F. Woessner. (1998). Handbook of proteolytic enzymes. Academic Press, San Diego, Calif.

6. Basle, A., G. Rummel, P. Storici, J. P. Rosenbusch, and T. Schirmer. (2006). Crystal Structure of Osmoporin OmpC from E. coli at 2.0 A. J. Mol. Biol. 362: 933-42.

7. Batchelor, E., D. Walthers, L. J. Kenney, and M. Goulian. (2005). The Escherichia coli CpxA-CpxR Envelope Stress Response System Regulates Expression of the Porins OmpF and OmpC. J. Bacteriol. 187: 5723-5731.

8. Bauer, К., M. Struyve, D. Bosch, R. Benz, and J. Tommassen. (1989). One single lysine residue is sresponsible for the special interaction between polyphosphates and the outer membrane porin PhoE of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 264: 1639316398

9. Bayro, M. J., J. Mukhopadhyay, G. V. Swapna, J. Y. Huang, L. С. Ma, E. Sineva, P. E. Dawson, G. T. Montelione, and R. H. Ebright. (2003). Structure of antibacterial peptide microcin J25: a 21-residue lariat protoknot. J. Am. Chem. Soc. 125: 1238212383.

10. Behlau, M., D. J. Mills, H. Quader, W. Kuhlbrandt, and J. Vonck. (2001). Projection structure of the monomeric porin OmpG at 6 A resolution. J. Mol. Biol. 305: 71-77.

11. Berkane, E., F. Orlik, A. Charbit, C. Danelon, D. Fournier, R. Benz, and M. Winterhalter. (2005). Nanopores: maltoporin channel as a sensor for maltodextrin and lambda-phage. J. Nanobiotechnology 3: 3-6.

12. Bode, R., A. M. Thurau, and H. Schmidt. (1993). Characterization of acetyl-CoA: L-lysine N6-acetyltransferase, which catalyses the first step of carbon catabolism from lysine in Saccharomyces cerevisiae. Arch. Microbiol. 160: 397-400.

13. Braun, V. (1995). Energy-coupled transport and signal transduction through the Gram-negative outer membrane via TonB-ExbB-ExbD-dependent receptor proteins. FEMS Microbiol. Rev. 16: 295-307.

14. Braun, V., K. Gunthner, K. Hantke, and Zimmermann. (1983). Intracellular activation of albomycin in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 156: SOS-SIS.

15. Calamita, G., B. Kempf, M. Bonhivers, W. R. Bishai, E. Bremer, and P. Agre. 1998. Regulation of the Escherichia coli water channel gene aqpZ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3627-3631.

16. Chakraborty R., E. Storey, and D. van der Helm. (2007). Molecular mechanism of ferricsiderophore passage through the outer membrane receptor proteins of Escherichia coli. Biometals 20: 263-274

17. Chen, J., G. Lu, J. Lin, A. L. Davidson, and F. A. Quiocho. (2003). A tweezers-like motion of the ATP-binding cassette dimer in an ABC transport cycle. Mol. Cell 12: 651-661.

18. Chen, J., S. Sharma, F. A. Quiocho, and A. L. Davidson. (2001). Trapping the transition state of an ATP-binding-cassette transporter: evidence for a concerted mechanism of maltose transport. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1525-1530.

19. Chen, S., A. Zhang, L. B. Blyn, and G. Storz. (2004). MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. J. Bacteriol. 186: 66896697.

20. Chiang, S. L., and E. J. Rubin. (2002). Construction of a mariner-based transposon for epitope-tagging and genomic targeting. Gene 296: 179-185.

21. Conlan, S., Y. Zhang, S. Cheley, and H. Bayley. (2000). Biochemical and biophysical characterization of OmpG: a monomelic porin. Biochemistry 39: 11845-11854.

22. Cowan, S. W., T. Schirmer, G. Rummel, M. Steiert, R. Ghosh, R. A. Pauptit, J. N. Jansonius, and J. P. Rosenbusch. (1992). Crystal structures explain functional properties of two Escherichia coli porins. Nature 358: 727-733.

23. Cursino, L., D. Smajs, J. Smarda, R. M. Nardi, J. R. Nicoli, E. Chartone-Souza, and A. M. Nascimento. (2006). Exoproducts of the Escherichia coli strain H22 inhibiting some enteric pathogens both in vitro and in vivo. J. Appl. Microbiol. 100: 821-829.

24. Davidson, A. L., E. Dassa, C. Orelle, and J. Chen. (2008). Structure, Function, and Evolution of Bacterial ATP-Binding Cassette Systems. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72: 317-364.

25. Datsenko, K. A., and B. L. Wanner. (2000). One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645.

26. Death, A., L. Notley, and T. Ferenci. (1993). Derepression of LamB protein facilitates outer membrane permeation of carbohydrates into Escherichia coli under conditions of nutrient stress. J. Bacteriol. 175: 1475-1483.

27. Denker, K., F. Orlik, B. Schiffler, and R. Benz. (2005). Site-directed Mutagenesis of the Greasy Slide Aromatic Residues Within the LamB (Maltoporin) Channel of Escherichia coli: Effect on Ion and Maltopentaose Transport. J. Mol. Biol. 352: 534550.

28. Destoumieux-Garzon, D., J. Peduzzi, and S. Rebuffat. (2002). Focus in modified microcins: structural features and mechanisms of action. Biochimie 84: 511- 519.

29. Deutscher, J., C. Francke, and P. W. Postma. (2006). How Phosphotransferase System-Related Protein Phosphorylation Regulates Carbohydrate Metabolism in Bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews 70: 939-1031.

30. Di Berardino, M., and P. Dimroth. (1995). Synthesis of the oxaloacetate decarboxylase Na+ pump and its individual subunits in Escherichia coli and analysis of their function. Eur. J. Biochem. 231: 790-801.

31. Di Bernardino, M., and P. Dimroth. (1996). Aspartate 203 of the oxaloacetate decarboxylase (3-subunit catalyses both the chemical and vectorial reaction of the Na+ pump. EMBO J. 15: 1842-1849.

32. Dfaz-Guerra, L., F. Moreno, and J. L. San Millan. (1989). appR gene product activates transcription of microcin C7 plasmid genes. J. Bacteriol. 171: 2906-2908.

33. Dimroth, P., P. Jockel, and M. Schmid. (2001). Coupling mechanism of the oxaloacetate decarboxylase Na+pump. Biochim. Biophys. Acta 1505: 1-14.

34. Dippel, R., and W. Boos. (2005). The maltodextrin system of Escherichia coli: metabolism and transport. J. Bacteriol. 187:8322-8331.

35. DiRusso, С. С., and P. N. Black. (2004). Bacterial long-chain fatty acid transport: gateway to a fatty acid-responsive signalling system. J. Biol. Chem. 279: 4956349566.

36. Ducey, T. F., and D. W. Dyer. (2002). Rapid identification of EZ:TN™ transposon insertion sites in the genome of Neisseria gonorrhoeae. EPICENTRE Forum 9: 6-7.

37. Dumas, F., S. Frank, R. Koebnik, E. Maillet, A. Lustig, and P. Van Gelder. (2000) (a). Extended sugar slide function for the periplasmic coiled coil domain of ScrY. J. Mol. Biol. 300:687-695.

38. Dumas, F., R. Koebnik, M. Winterhalter, and P. Van Gelder. (2000) (6). Sugar eransport through maltoporin of Escherichia coli. Role of polar tracks. J. Biol. Chem. 275: 19747-19751.

39. Duquesne, S., D. Destoumieux-Garzon, J. Peduzzi, and S. Rebuffat. (2007). Microcins, gene-encoded antibacterial peptides from enterobacteria. Nat. Prod. Rep. 24: 708-734.

40. Dutzler, R., Y. F. Wang, P. J. Rizkallah, J. P. Rosenbusch, and T. Schirmer. (1996). Crystal structures of various maltooligosaccharides bound to maltoporin reveal a specific sugar translocation pathway. Structure 4: 127-134.

41. Eswaran, J., C. Hughes, and V. Koronakis. (2003). Locking TolC entrance helices to prevent protein translocation by the bacterial type I export apparatus. J. Mol. Biol. 327:309-315.

42. Eswarappa, S. M., К. K. Panguluri, M. Hensel, and D. Chakravortty. (2008). The yejABEF operon of Salmonella confers resistance to antimicrobial peptides and contributes to its virulence. Microbiology 154: 666-678.

43. Fajardo, D. A., J. Cheung, C. Ito, E. Sugawara, H. Nikaido, and R. Misra. (1998). Biochemistry and regulation of a novel Escherichia coli K-12 porin protein, OmpG, which produces unusually large channels. J. Bacteriol. 180: 4452^1459.

44. Felsenstein, J. (1996). Inferring phylogenies from protein sequences by parsimony, distance, and likelihood methods. Methods Enzymol. 266: 418-427.

45. Ferguson, A. D., E. Hofmann, J. W. Coulton, K. Diederichs, and W. Welte. (1998). Siderophore-mediated iron transport: crystal structure of FhuA with bound lipopolysaccharide. Science 282: 2215-2220.

46. Fetsch, E. E., and A. L. Davidson. (2002). Vanadate-catalyzed photocleavage of the signature motif of an ATP-binding cassette (ABC) transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 9685-9690.

47. Fomenko, D. E., A. Z. Metlitskaya, J. Peduzzi, C. Goulard, G. Katrukha, L. V. Gening, S. Rebuffat, and I. A. Khmel. (2003). Microcin C51 plasmid genes: possible source of horizontal gene transfer. Antimicrob. Agents Chemother. 47: 2868-2874.

48. Fomenko, D., A. Veselovskii, and I. Khmel. (2001). Regulation of microcin C51 operon expression: the role of global regulators of transcription. Res. Microbiol. 152: 469-479.

49. Fsihi H., B. Kottwitz, and E. Bremer. (1993). Single amino acid substitutions affecting the substrate specificity of the Escherichia coli K-12 nucleoside-specific Tsx channel. J. Biol. Chem. 268: 17495-17503.

50. Fu, D., A. Libson, L. J. Miercke, C. Weitzman, P. Nollert, J. Krucinski, and R. M. Stroud. (2000). Structure of a glycerol-conducting channel and the basis for its selectivity. Science 290: 481-486.

51. Fukami-Kobayashi, K., Y. Tateno, and K. Nishikawa. (1999). Domain dislocation: a change of core structure in periplasmic binding proteins in their evolutionary history. J. Mol. Biol. 286:279-290.

52. Gonzalez-Pastor, J. E., J. L. San Millan, M. A. Castilla, and F. Moreno. (1995). Structure and organization of plasmid genes required to produce the translation inhibitor microcin C7. J. Bacteriol. 177: 7131-7134.

53. Goosen, N., and P. Van de Putte. (1995). The regulation of transcription initiation by integration host factor. Mol. Microbiol. 16: 1-7.

54. Grauschopf, U., J. R. Winther, P. Korber, T. Zander, P. Dallinger, and J. C. Bardwell. (1995). Why is DsbA such an oxidizing disulfide catalyst? Cell 83: 947-955.

55. Guijarro, J. I., J. E. Gonzalez-Pastor, F. Baleux, J. L. San Millan, M. A. Castilla, M. Rico, F. Moreno, M. Delepierre. (1995). Chemical structure and translation inhibition studies of the antibiotic microcin C. J. Biol. Chem. 270: 23520-23522.

56. Hazelbauer, G. L. (1975). Role of the receptor for bacteriophage lambda in the functioning of the maltose chemoreceptor of Escherichia coli. J. Bacteriol. 124: 119126.

57. James K. J., M. A. Hancock, V. Moreau, F. Molina, and J. W. Coulton. (2008). TonB induces conformational changes in surface-exposed loops of FhuA, outer membrane receptor of Escherichia coli. Protein Science 17: 1679-1688.

58. Jeanteur, D., J. H. Lakey, and F. Pattus. (1991). The bacterial porin superfamily: sequence alignment and structure prediction. Mol. Microbiol. 5: 2153-2164.

59. Jensen, M. 0., U. Rothlisberger, and C. Rovira. (2005). Hydroxide and proton migration in aquaporins. Biophys. J. 89: 1744-1759.

60. Jockel, P., M. Di Bernardino, and P. Dimroth. (1999). Membrane topology of the P-subunit of the oxaloacetate decarboxylase Na+ pump from Klebsiella pneumoniae. Biochemistry 38: 13461-13472

61. Kazakov, Т., G. H. Vondenhoff, K. A. Datsenko, M. Novikova, A. Metlytskaya, B. L. Wanner, and K. Severinov. (2008). E. coli Peptidases A, B, or N Can Process Translation Inhibitor Microcin C. J. Bacteriol. 190: 2607-2610

62. Kennedy, K. A., and B. Traxler. (1999). MalK forms a dimer independent of its assembly into the MalFGK2 ATP-binding cassette transporter of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 274: 6259-6264.

63. Kenney, L. J. (1997). Kinase activity of EnvZ, an osmoregulatorysignal transducing protein of Escherichia coli. Arch. Biochem. Biophys. 346: 303-311.

64. Kerr, I. D. (2002). Structure and association of ATP-binding cassette transporter nucleotide-binding domains. Biochim. Biophys. Acta 1561: 47-64.

65. Killmann H., C. Herrmann, A. Torun, G. Jung, and V. Braun. (2002). TonB of Escherichia coli activates FhuA through interaction with the /^-barrel. Microbiology 148: 3497-3509.

66. Koebnik R. (1993). The molecular interaction between components of the TonB-ExbBD-dependent and of the TolQRA-dependent bacterial uptake systems. Mol. Microbiol. 9: 219-225.

67. Koebnik R., K. P. Locher, and P. Van Gelder. (2000). Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Molecular Microbiology 37: 239-253.

68. Koronakis, V., J. Eswaran, and C. Hughes. (2004). Structure and function of TolC: The bacterial exit duct for proteins and drugs. Annu. Rev. Biochem. 73: 467-489.

69. Koronakis V, Sharff A, Koronakis E, Luisi B, Hughes C. (2000). Crystal structure of the bacterial membrane protein TolC central to multidrug efflux and protein export. Nature 405: 914-919.

70. Kullman, L., M. Winterhalter, and S. M. Bezrukov. (2002). Transport of maltodextrins through maltoporin: a single-channel study. Biophys. J. 82: 803-812.

71. Kumar, A., and H. P. Schweizer. (2005). Bacterial resistance to antibiotics: Active efflux and reduced uptake. Advanced Drug Delivery Reviews 57: 1486- 1513.

72. Martin, J. L., J. C. Bardwell, and J. Kuriyan. (1993). Crystal structure of the DsbA protein required for disulphide bond formation in vivo. Nature 365: 464-468.

73. Matsubara, M., and T. Mizuno. (1999). EnvZ-independent phosphotransfer signaling pathway of the OmpR-mediated osmoregulatory expression of OmpC and OmpF in Escherichia coli. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63: 408-414.

74. Metlitskaya, A. Z., G. S. Katrukha, A. S. Shashkov, D. A. Zaitsev, T. A. Egorov, and I. A. Khmel. (1995). Structure of microcin C51, a new antibiotic with a broad spectrum of activity. FEBS Lett. 357: 235-238.

75. Metlitskaya, A., Kazakov Т., Vondenhoff G. H., Novikova M., Shashkov A., Zatsepin Т., Semenova E., Zaitseva N., Ramensky V., Van Aerschot A., and Severinov K. (2009). Maturation of Translation Inhibitor Microcin C. J Bacteriol. 191:2380-7.

76. Misra, R., and S. A. Benson. (1989). A novel mutation, cog, which results in production of a new porin protein (OmpG) of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 171: 4105^4111.

77. Mukhopadhyay, J., E. Sineva, J. Knight, R. M. Levy, and R. H. Ebright. (2004). Antibacterial peptide microcin J25 inhibits transcription by binding within and obstructing the RNA polymerase secondary channel. Mol. Cell. 14: 739-751

78. Nakamoto, H., and J. C. Bardwell. (2004). Catalysis of disulfide bond formation and isomerization in the Escherichia coli periplasm. Biochim. Biophys. Acta. 1694: 111119.

79. Natale, P., T. Briiser, and A. J. Driessen. (2008). Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane—distinct translocases and mechanisms. Biochim. Biophys. Acta. 1778: 1735-56.

80. Nikaido, H. (2003). Molecular Basis of Bacterial Outer Membrane Permeability Revisited. Microbiology and Molecular Biology Reviews 67: 593-656

81. Nikaido, H., and E. Y. Rosenberg. (1983). Porin channels in Escherichia coli: studies with liposomes reconstituted from purified proteins. J. Bacteriol. 153:241-252

82. Nikaido, H., E. Y. Rosenberg, and J. Foulds. (1983). Porin channels in Escherichia coli: studies with beta-lactams in intact cells. J. Bacteriol. 153: 232-240.

83. Oldham, M. L., D. Khare, F. A. Quiocho, A. L. Davidson, and J. Chen. (2007). Crystal structure of a catalytic intermediate of the maltose transporter. Nature 450: 515-521.

84. Overbeeke, N., and B. Lugtenberg. (1980). Expression of outer membrane protein of Escherichia coli K12 by phosphate limitation. FEBS Lett. 112: 229-232.

85. Pawelek, P. D, N. Croteau, C. Ng-Thow-Hing, С. M. Khursigara, N. Moiseeva, M. Allaire, and J. W. Coulton. (2006). Structure of TonB in complex with FhuA, E.coli outer membrane receptor. Science 312: 1399-1402.

86. Phale, P. S., A. Philippsen, T. Kiefhaber, R. Koebnik, V. P. Phale, T.Schirmer, and J. P. Rosenbusch. (1998). Stability of trimeric OmpF porin: the contributions of the latching loop L2. Biochemistry 37: 15663-15670.

87. Postle, K., and R. J. Kadner. (2003). Touch and go: tying TonB to transport. Mol. Microbiol. 49: 869-882.

88. Postle, K., and R. A. Larsen. (2007). TonB-dependent energy transduction between outer and cytoplasmic membranes. Biometals 20: 453-465.

89. Prilipov, A., P. S. Phale, R. Koebnik, C. Widmer, and J. P. Rosenbusch. (1998). Identification and characterization of two quiescent porin genes, nmpC and ompN, in Escherichia coli BE. J. Bacteriol. 180: 3388-3392.

90. Pratt, L. A., and T. J. Silhavy. (1996). The response regulator SprE controls the stability of RpoS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2488-2492.

91. Ramensky, V., A. Sobol, N. Zaitseva, A. Rubinov, and V. Zosimov. (2007). A novel approach to local similarity of protein binding sites substantially improves computational drug design results. Proteins 69: 349-357.

92. Reader, J.S., P. T. Ordoukhanian, J. G. Kim, V. de Crecy-Lagard, I. Hwang, S. Farrand, and Schimmel. (2005). Major biocontrol of plant tumors targets tRNA synthetase. Science 309: 1533.

93. Rosenbusch, J. P. (1974). Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. J. Biol. Chem. 249: 8019-8029.

94. Rosengren, K. J., R. J. Clark, N. L. Daly, U. Goransson, A. Jones, and D. J. Craik. (2003). Microcin J25 has a threaded sidechain-to-backbone ring structure and not a head-to-tail cyclized backbone. J. Am. Chem. Soc. 125: 12475-12483.

95. Roush, R. F., E. M. Nolan, F. Lohr, and С. T. Walsh. (2008). Maturation of an Escherichia coli ribosomal peptide antibiotic by ATP-consuming N-P bond formation in microcin CI. J. Am. Chem. Soc. 130: 3603-3609.

96. Saier M. N. (2000). A Functional-Phylogenetic Classification System for Transmembrane Solute Transporters. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: 354-411.

97. Sansom, M. S., and R. J. Law. (2001). Membrane proteins: Aquaporins channels without ions. Curr. Biol. 11: R71-73.

98. Savage, D. F., P. F. Egea, Y. Robles-Colmenares, J. D. O'Connell, and R. M. Stroud. (2003). Architecture and selectivity in aquaporins: The 2.5 A X-ray structure of aquaporin Z. PLoS Biol. 1: 334-340.

99. Schirmer, Т., Т. A. Keller, Y.-F. Wang, and J. P. Rosenbusch. (1995). Structural basis for sugar translocation through maltoporin channels at 3.1 A resolution. Science 267: 512-514.

100. Schmid, К., R. Ebner, К. Jahreis, J. W. Lengeler, and F. Titgemeyer. (1991). A sugar-specific porin, ScrY, is involved in sucrose uptake in enteric bacteria. Mol. Microbiol. 5: 941-950.

101. Schuelein, K. (1991). The sugar-specific outer membrane channel ScrY contains functional characteristics of general diffusion pores and substratespecific porins. Mol. Microbiol. 5: 2233-2241.

102. Schulein, R., I. Gentschev, H. J. Mollenkopf, and W. Goebel. (1992). A topological model for the haemolysin translocator protein HlyD. Mol. Gen. Genet. 234: 155-163.

103. Schulz, G. E. (1993). Bacterial porins: structure and function. Curr. Opin.Cell Biol. 5: 701-707.

104. Severinov, К., E. Semenova, A. Kazakov, T. Kazakov, and M. S. Gelfand. (2007). The post-translationally modified microcins. Mol. Microbiol. 6: 1380-1394.

105. Shultis, D. D., M. D. Purdy, C. N. Banchs, and M. C. Wiener. (2006) (6). Outer membrane active transport: Structure of the BtuB:TonB complex. Science 312:13961399.

106. Siebold, С., K. Fliikiger, R. Beutler, and B. Erni. (2001). Carbohydrate transporters of the bacterial phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system (PTS). FEBS Lett. 504: 104-111.

107. Slauch, J. M., S. Garrett, D. E. Jackson, and T. J. Silhavy. (1988). EnvZ functions through OmpR to control porin gene expression in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 170:439-441.1. V V

108. Struyve, M., M. Moons, and J. Tommassen. (1991). Carboxy-terminal phenylalanine is essential for the correct assembly of a bacterial outer membrane protein. J. Mol. Biol. 218: 141-148.

109. Takahashi, Y.H., К. Inaba, and К. Ito. (2004). Characterization of the menaquinonedependent disulfide bond formation pathway of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 279: 47057-47065.

110. Thompson, J. D., T. J. Gibson, F. Plewniak, F. Jeanmougin, and D. G. Higgins. (1997). The CLUSTALX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic. Acids. Res. 25: 48764882.

111. Ulmke, C., J. Kreth, J. W. Lengeler, W. Welte, and K. Schmid. (1999). Site-directed mutagenesis of loop L3 of sucrose porin ScrY leads to changes in substrate selectivity. J. Bacteriol. 181: 1920-1923.

112. Van den Berg, В., P. N. Black, W. M. Jr. Clemons, and Т. M. Rapoport. (2004). Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL. Science 304: 15061509.

113. Van Gelder, P., R. Dutzler, F. Dumas, R. Koebnik, and T. Schirmer. (2001). Sucrose transport through maltoporin mutants of Escherichia coli. Protein Eng. 14: 943-948.

114. Verdon, G., S. V. Albers, B. W. Dijkstra, A. J. Driessen, and A. M. Thunnissen. (2003). Crystal structures of the ATPase subunit of the glucose ABC transporter from

115. Sulfolobus solfataricus: nucleotide-free and nucleotidebound conformations. J. Mol. Biol. 330: 343-358.

116. Vetting, M. W., L. P. de Carvalho, S. L. Roderick, and J. S. Blanchard. (2005). A novel dimeric structure of the RimL Nalpha-acetyltransferase from Salmonella typhimurium. J. Biol. Chem. 280: 22108-22114.

117. Vizan, J. L., C. Hernandez-Chico, I. del Castillo, and F. Moreno. (1991). The peptide antibiotic microcin В17 induces double-strand cleavage of DNA mediated by E. coli DNA gyrase. EMBO 10: 467-476.

118. Wang, Y., K. Schulten, and E. Tajkhorshid. (2005). What makes an aquaporin a glycerol channel: a comparative study of AqpZ and GlpF. Structure 13: 1107-1118.

119. Yagur-Kroll, S., A. Ido, and O. Amster-Choder. (2009). Spatial arrangement of the glucoside transporter from Escherichia coli. J. Bacteriol. 191: 3086-3094.

120. Ye, J., and B. Van den Berg. (2004). Crystal structure of the bacterial nucleoside transporter Tsx. EMBO J. 23: 3187-3195.

121. Yildiz, О., K. R. Vinothkumar, P. Goswami, and W. KUhlbrandt. (2006). Structure of the monomeric outer-membrane porin OmpG in the open and closed conformation. EMBO J. 25: 3702-3713.

122. Zaitseva, J., S. Jenewein, T. Jumpertz, I. B. Holland, and L. Schmitt. (2005). H662 is the linchpin of ATP hydrolysis in the nucleotide-binding domain of the ABC transporter HlyB. EMBO J. 24:1901-1910.

123. Zou, H., M. Zheng, X. Luo, W. Zhu, K. Chen, J. Shen, and H. Jiang. (2008). Dynamic mechanism of fatty acid transport across cellular membranes through FadL: molecular dynamics simulations. J. Phys. Chem. B. 112: 13070-130788.

124. Escherichia coli K12 Escherichia coli K12 NP 4158101. NP 418001

125. Wolinella succinogenes DSM 1740 NP907187

126. Wolinella succinogenes DSM 1740np 907185 1

127. Mannheimia succiniciproducens MBEL55Eyp0B765 Escherichia coli K12 np417933v Brucella melitensis 16M np 541? Pseudomonas putida Kt2440 np 74543" Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 2558^p ^-^2331

128. NP 782002Clostridium tetani E88619112 Methanosarcina acetivorans C2A389020 Bacillus subtilis (appA) '618342 Methanosarcina acetivorans C2A

129. NP 782022 Clostridium tetani E881. Metha1. NP 63459L zei Go1

130. Methanosarcina mazei Go1 NP632025 Methanosarcina acetivorans C2A np 61683 Methanosarcina acetivorans C2Anp61684T

131. Methanosarcina acetivorans C2A NP 616838 Yersinia pseudotuberculosis IP 32953

132. Helicobacter hepaticus ATCC 51449

133. NP 415759 Escherichia coli (oppA

134. Methanosarcina mazei Go1 NP 633883 NP 617392 Methanosarcina

135. NP438106Sinorhizobium meliloti 10211. NP 615799acetivorans C2A

136. Pseudomonas syringae pv. syringae B728a yp 23484 Pseudomonas aeruginosa PA01 np250501 Pseudomonas aeruginosa PA01 np250748'

137. Brucella melitensis 16M np 540851'

138. Methanosarcina acetivorans C2A,np3891751. Bacillus subtilis (dppA)

139. Streptococcus pyogenes (dppA) np269 Lactococcus lactis (оррЛ) yp0010320 •1. Bradynp106151

Информация о работе

Новикова, Мария Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.26

Диссертация

Биосинтез микроцина C и механизмы устойчивости клеток к антибиотику - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы