Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БИОСИНТЕЗ ИСТИННЫХ ВОСКОВ САПРОФИТНЫМИ МИКОБАКТЕРИЯМИ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "БИОСИНТЕЗ ИСТИННЫХ ВОСКОВ САПРОФИТНЫМИ МИКОБАКТЕРИЯМИ"

<3- г5гч%

На правах рукописи

*

Нина Анатольевна БИСЬКО

БИОСИНТЕЗ ИСТИННЫХ ВОСКОВ САПРОФИТНЫМИ МИКОВАКТЕРИЯМИ

03.00.07 Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических иаук

ИЗДАТЕЛЬСТВО МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА* 1978

Работа выполнена на кафедре микробиологии Биологического факультета ИГУ,

Научные руководители

член-корреспоадеят АН СССР, профессор!

доктор биологических наук, профессор М.В.ГУСЕВ кандидат химических наук Т.В.КОРОНБЛЛЙ

Официальные оппоненты доктор биологических неук, профессор Е. Д. ГУБАН кандидат бвологических наук М.И.МОЛЧАНОВ

Диссертация направлена на отзыв в Институт микробиологии АН УССР, г.Киев.

Автореферат разослен "/197_^г. Защита диссертации состоится ИбЯ^фкЯ, 19"!^?, в часов на заседании специализированного Совета

фи за олого-би охдии че ског о отделения Биолог^че ского факультета Московского Государственного университета им.Ы.£.Ломоносова по адресу: Москва, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Ученые секретарь Совета

■..-л" у. :■.■■-■■. Истинные воска, .то естьэфиры высших спиртов в высших • •• ..; -7 киряых кислот, присутствуют в липидах микобактериа, однако -'• -у' /л": ^ состав этих соединений исследовался до сих пор только у пато-: . : генных мияобактерий. Изучение истинных восков имеет не только - • <САу:л?теоретическое, но и практическое значение. Так, среди восков,.;■ . образуемых угле во доро докасляащими иакосактериями. имеется Г" . практически ценное вещество эфир цетилового- спирта и дал^- - • -митиновой кислоты Iцвталпальмигат)♦ Это соединение' использу-• ;: • ■■. \ . ется в парфюмерной и фармацевтическоЙ^проиыпленности. В аастоя- г

~ ^ щее время цетшшалшвтат, входяпши в состав спермацета, добы-' -;„.; .. веется из мозга.кашалота; Краснлышковнм с соавторами бил вы- ~ ■ делен и описан микроорганизм Н*ео&зЛег1Чл> сегеДь-лат- 3*» - —

. рай при;окисления гексадекааа образ уетдо -125? цетиллалылатата. , . от сухого веса клетки и предетавляе т пректический иятаре с' как . ;

* . продуцент цетилпальштата.■ ^■-■'■■,'. *.': - - '.' -^Л-^"'.'

В настоящей работе рассмотрены следуюсие вопросы, касао- ./ •" * .' ^^ - шиеся биосинтеза цетилпальмитата: Г У.;.

'■■'■.'-'.."'л/-г I* Изучение пугд биосантезавоска культурой-' МяссдасЫпит.>/ ' : ^. . сег-а/йг/пгмх и динанлкл его накопления в клетке; \ - :

:: 2. Исследование локализации воска и воскообразуювих Ч' V ферментов в клетках сею/Ь^/пяю. ■ ••> -• ■,

. • \ " 3."Изучение., распространения способности к воскообразо- . ватю среди'сапрофитянх ыикобактери!!.' ." '•.; ; " - ::1 1. г ;

Исследование влияния субстрата на -строение восков ' .. • Г '..' сапрофитных микобактерив. '.■.■■:■.-■ ¿-'.V.',' ■""Л;':'"-^ , " ^ .. --

-;" : диссертация изложена наШстрааецах,. иллюстрирована' Ю• V ■■;. .-"рисунками и 12 таблицами.'Список'литература включает 102 най- : меповалий.' г -■■..'■■'..'■^ V1 V'-'-: ..:

/У/,:;- гй'литературном обзоре сум«ппо!?анм данные о линлдах угле- ; ,

■ ■л ч-^.'

водородакисляших ьшкоЗактерий и родственных иышкроорганиз-,; мовЧшкаще спиртами альдегида, кирше кислота, кетоны, олефи-ны, 'гляцвриды,.воска, фосфолипиды, дептидо лигшдн и глаколкшадн, школовые кислоты), ^Рассмотрено строение, биосинтез рольи локализация этих соединений в клетках иикобахтерий и родственных : ям форм, использующих нормальные насыщенные углеводороды^ ' •

- ОБЪЕЗДЫ ^ МЕТОДУ ИОСДШЮВАНИЯ

Объектами исследования с луки ли культура Мусо8а<£епит Сёго£йгЬю/?$ 3*. (Красальников и Др., 1971) и коллекция культур : . шшобактерий, выделенных дз различных почв (Умаров, 1972) ; ' -В; опытах использовала одно-, трех- ид яте су точные культуры

- сет^Ьгтвю ' и четырех су то чане культура микобакте- ■ рий аз.коллекции Умйрова. ^льтуры выращивали на двух средах:

А и Б. Среда А содержала: КС1 - 0,50 г," 0,50 г, •

%НР04 - 1,00 г, ?вЭ04 - 0,01 г, (^Н4)2504 - 2,00 г, СаС0э --3,00 г, вода водопроводная до I л, В качестве органического\ субстрата добавляли одно из следующих соединений: н-а лкан( те граде кав, гекоакекая, гедтадекан или октадекан) - до объему; 4 детиловвй спирт, лальмитиновузь кислоту или палшатиноввй альдегид - 1% во^ весу; глзокозу - 2/2 по весу. . — Состав среды Б: • КС1 - 0,50г. %504 - 0,50.Г. ?е304 - 0,01 г, ^Н4)2504 - 2,00 г. фосфатный буфер рН = 7 - 250 мл,, вода-' - ° водопроводная до Г л, я-гелтздевэи - 1% да объему, в опытах

- по изучении ферментативной активноста и; распределению воска / ^ и углеводорода в. клетке культуру . МисобМ., сеы/'ог/тгл*

.взращивали на среде. В и&тза ряда методических трудно с тей,. во з-^ низших ара лолучвний бесклеточках фракций на среде А..'

- ' В опытах по изучению"ферментативной активно ста и распределе-' аи» воска и углеводорода в клетке использовали сару*Г биомассу, • ;.;;:в остальных опытах биомассу сушили при ?Р°С я взвеиявали. Для- ■í-■■'■. яэълечения свободнах липпдов применяли 2-часовую экстракцию ';" смесью хлороформа в метанола в отношения 3:1 вря встряхивании (Вавер.и др., 1965). Для выделения воска смесь очи тоннах липидов ■:хроматографировали препаративно яа лласгивках с силикагелём в . саотемб гексан-вфяр-ледяная уксусная'кислота (89:10:1). Касдота, .входящие г составвоска, исследовали методом га зо-жидко с тн ой

хроматографии. Метано лаз воска проводили по методике-Вавера и 'сотр. (1965), Условия газо-жидкостной хроматографии: прибор ; Хром-2, аеподвнжяая фаза по лиэ тиле нгликольадашат, длина колонка 1,7 "м, газ-носитель - азот, 50 мл/мин, давление-0,4 аты, темперз-тура 1880С." Химический состав восков исследовала методом масс' "*■ спектрометрии. Масс-спектры снимали ва приборе LKB .(ltoearoi при температуре испарения образца 30-50° и энергии нониэируташс ■ электронов 70 алектроиовольт.

Дня получения Сесклеточноа суспензии NucoSoct, ceraformans С использовали пресскаыеру Любимова яЛьвова <1966) тша пресса V ' "фреача.'фракциоиироваадв суспензии проводили путем дифференциал*-ного центрифугирования. Активность воскообразующих .ферментов по- Лученных бесклеточных фракций Mycoiact. ceroformanS измеряли

прямым определением продукта реакции - воска. Ферментативную ' активность,воскообразовааия выражали в микрограммах воска, od~ _ разующегося ва I иг белка за I час. Спектры цитохэомов клеток MycoSacé. oe/-oñrmañs снимали на' спектрофотометре ' " " ;

:.-■.. " HiíacM - 356", кювета 1см. Электрофорез бесклеточных фрак-Z - tSbt • -

г 1Шй проводили при комнагкой темаарагурв в аштрате фириы V, -Г - ^ .'-" "г •'. • ; ' - "йм/г^; " • (Венгрия),-в котором- уголыше алекгроди ¿«ли эа-"'- ,"' '..--. : ^ •; " 1 :; г. мененн яа; алатяаоша. Использовали 7,5^ полиаярилашд/шй^ • • ; • "' "- - ,;{ге л ь.Разделение ооотбилизироваяяого ивтерввла - проводилив -" ■ ' > ' . "мягкой" системе (.Же{г ,1и£гило , Х967). Верхняя и нижний *

. гЛ : ; : .. буферные растворы, а также разделяющий гель содержали О, IX ■ ; тритов; Х-ЮО , "1Э70Ь'

-- - РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ' " • ■

I; Биосинтез - цэтидпальмитата и динамика: его ■ накоаленяя/ культурой ; Мусова^ „ ~ сегаГог'папз

- йз ламра1трных.даш«с.извеетда(.;чтО:«шогиеуаэройн1)в:уг-г: ч -V *. леводородокислящие ьшкойактериия родственнее яы микроорга^. •.'.."• ч,"В13Ш окисляют конце вую'метильную группу углеводорода в лар<5ок- ;.1 -. сильную,ве меняя углеродного скелета молекулы.-;-и Коронелли (1969) било пока заве, что где тишальми таг," ойрадув-^1' ;-ьшй куль турой ■ Мисовас^ с&а/Ьгта»$ из\н-геясаяекаяа, представ— * * ляет собой■ сложный эфир, ; в котором как спиртовая, гак и ^кислот--Л'. ;-

на я честь имеет столько. же углеродныхатоыов,\ сколько асходнш --;угле водород, поэтому- можно предположить, ■ что■данная: культу-~ - ра способна окислять молекулу углеводорода. . не меняя: ее ■ угле^чч;; . . родяого скелета. . -Л ¡.ч -- ' . . : • •; *;• -*;' .

. Мы-исследовали дуть биосинтеза Чцегялпаяьшгата:из"н-гек- ч

ч-ч": са декана Мусобас"£, сегвЯ>*тт$ ,' ащйшавая ее.на-средах;-.-со-^/Г"'

7 держащие' в 'качестве ; суОсгратов продукты последовательного; окйо- чч •V .V ленвд н-гексадекана: детиловай спирт; \ пальмитиновый альдегид . --.V-.-У или. пальмитиновую кислоту. На .средах с гексадеканом и^особеяноч^ч'-;

цетиловым спиртом накопление цетилпальмятата было интенсивным.

В то же время в клетках, выращенных на средах с пальмитиновым

альдегидом для пальмитиновой кислотой воск отсутствовал

С табл.I)» ' ,

- * ■ - 1 Таблица 1

- "Рост и образование цетилпальмитата на среде с ' " / гексадеканом или продуктами его окисления.

. Субстрат ГК£!о^аЯ | Петитовлшятат,

■ { (сухая), в клетках

■ - I ■■-*/* г ■ ■ ■ :- ■ ■

' Гексадекан . ---------------' 4,64 10,8 f

Цетйлояый спирт 2,85 25,6 .

Пальмитиновая кислота 5,38 0,0 - ■ * '■

Пальмитиновый альдегид • 4,15 ■ 0,0 : 1

Полученные результаты свидетельствуя? о том,.что из продуктов последовательного окисления гексадекана - спирта, аль-"деги^а и кислоты - культура Мисова^. сего/Ьг/ггаяз использует для биосинтеза ьоска только цетиловый спирт, и цетнлпальмитат образуется ло схема:

н-С^Н^ —СН3{СН2)14СН20Н :—СН3(СН2)14СООИ

• 1—;—»—:—:——1 ■

СН3(СН2)14 С00СН2(СН2)14СН3 . ■

Динамику накопления воска в клетках сегоГогтапз

, мы изучала на примере образования цетилпальмитата из гексадека-на на среде Л. Было установлено,что основная масса углеводорода потребляется в первые сутки роста (рис.1).Затем количество гек-~ садехана медленно сникзется,приближаясь к нулю. Практически -

\ уже .через двое суток:в среде не остается "свободного";энудьгвро- ; ■ ^ ванного углеводорода; имеицийся гексадекав■ <меяее ! г/л) адсорбв-" - ' розан клетками и может быть извлечен только лутем экстракция. \ ; Максимальнаяклеточная масса образуется на третьи сутки. Оче-'.видно рост культуры, начиная с середины,эксдояенциальяой фаза'. -осуществляется в основном за счет промежуточны! продуктов окис- ' . левая гексадекана.Максаыальное содержание цетилпальылтата ' " ; ; приходится на четвертые сутки, когда клетки находятся в стационарной фазе роста,В последующие сутки'найлэдается уменьшен .••' вне содержания воска в клетках* Но-видимому,. воск. накашшваю-. пвйся в клетках изучаемого микроорганизма,-выполняет фувкщш "-. -запаспого питательного вещэства. - \ ' - '-'■'"'." 4

П. Образование воска культурой Маеобас!:. сегобогталз, -;',*, , -при использовании различных углеводородов 1 .".

Красильииков и соавторы 11971; при описании MycoSuct. . сего^гтопз 3* • доказали, что этот микроорганизм хорошо - -' растет па углеводородах, содержащих а'е менее И С-атомов в "цепи. Однако: накопление и состав воскабали изучены" только на - . среде с н-гексадекаиом. ' ■ . х-

" ■:-_-Мы использовали.в: качестве субстратов другие: нормальные - -'

углеводороды, содержащие 14, 17 и 18 С-атонов. Оказалось.что "способность к интенсивному биосинтезу.воска сохраняется *

;*.' только на средах с гептадеханом или октадеканом ^табл.2). При' '-}, ': росте на среде с тетрадеканом воск образуется в ничтсжпых

количествах. '-г .' .■■"'':':'"■: .'•" .'■■■"

■ Таблица 2

' ■ - ' , Образование воска культурой Масо&а^. сеге^/ттз. на средах с углеводородами :, - ■ : ;

• Источник . -углерода . 1 Биомасса ! г/л - ¡ Воск, % от сухой /'■■-'.-; , биомассы

н-С14 Нуд н-СХ7 Иде Н~СХ8_ н38 2,41 4,69 4,11 следы " 3,3 2,9 ^ " ;■■

V- Кислоты, входящие в состав воска, накопленного па средах.. с гедтадеканоы и октадеканом, исследовали методом газо-жидкостной хроматографии. Было установлено, что в обоих случаях в состав воска входит несколько жирных кислот. При этой преобладает кислота, имеющая столько не углеродных атомов, Сколько .; ' исходный углеводород, то есть маргариновая в опыте с гепта-' деканом и стеариновая в опыте с окта деканом (табл.3).' -'■'

' " - : Таблица 3

Кислотный состав восков Мясо6с?с~£, се/-е?Ьгта/!$- на 1 '■-'■. средах с гептадеканом и октадеканом ■ . ; ■ ;':

Источник углерода Нипные кислом. % .'-■..

С^ц-КИС-! С^у-^ис-! С^-кио-1 С^ Кл с— -

„ - лота > ! лота ( лота [ лота: . -

н~СХ7Н36 нет ■ 60,6 11,4 $> •..... ь 28,0 . -7г:

н-С1ИН38 .60,7 следы 39,3 нет .

Эти кислоты образуются, очевидно, путем окисления концевой т -■ л ■ (■''■■ ■ Л' ■ "

метильной грушщ углеводорода, как это было показано Стюард

..- . юн и др.'<г/ <?/., 195Э) для - ;;г':

: 4 Помимо кислот. -. вмеювих столько ив углеродных атомов, - сколько - .

..' исходный углеводород, в обоих образцах воска найдены кислоты, содержащие на 2 углеродных атома меньше :*~певтадекановая в опыте , ~ • • с гептадекавом и пальмитиновая в опыте с октадеканом. Их присут- ■ • •'•...• --V;; ствве, вероятно, можно объясни» процессами ^Р-окислевия перво- • • •. ■ ■ ._ начально образующихся маргариновой и стеариновой кислот и . : V"':; последующим отщеплением ацетильной группы. Кроме того, в состав воска, накопленного'на гептадвкане, в небольшом количестве вхо-к -■'■■:дит кислота, содержащая ва1 атом углерода меньше, чем исходный -Ч -" .' углеводород, т.е.- пальмитиновая. В воске, полученном из октадсканг • . : •" " " " соответствующая кислота (маргариновая) практически отсутствует.

Такш образом, воск, накопленный культурой . Мусовас^ . ' * . ;; .сего/ог/пал* "' 3* при росте на гептадекаве или октадекаае - ае "V ■

^индивидуальное. вещество, .пак »то наблюдалось в опыте о гексаде- . . ' каном (Красильников,?Коронедли, 1969), а представляет ообой '-Г--/ ; ■ смесь сложных эфиров нескольких жирных кислот, : , -. ' : ",■*,'"■':■■".'.:■.

Ш. Ферментативная активность воскообразования ■ : - V'/;

> бесклеточных'фракций , сег^огталз. . г'"-^''---"'-

В литературе' имеются данные по ферментативной активности '

;г- образования микроорганизмами первичных спиртов и жирных кислот -

. • продуктов. последовательного окисления нормальных углеводородов • :

' : " (СагЖ'ле ;\ ,' 1970; ¿¿. 1973), Однако . ' • - /

,/ изучение ферментов, осуществляющих биосинтез восков, ранее : " -Ч

\ .. . не проводилось. ,-'..": - ■ .....^

- В нашей работе исследовалась ферментативная активность •

_ ■, : воскообразования различных' бесклеточных фракций ^

cero formais $ с целью установи» место локализации; этих ; ментов. Для а того клетки внращивали ва среде Б, отпивали фосфат- ; - яш буфером и разрушала в прессе,Френча. Определение фермеататив-ной актнвйости выделенных фракций показывает, что наиОольпейак-тивностью обладает фракция мембран (табл.4). Л

.. í '/. -i. "*. .. ■ ' ' " ■ ' Таблица 4 ■ . . v ^ ■■■

• ■ Удельная ферментативная активность воскообразоваяия -.-; = - бесклеточшх фракций Ms/coóaci. cero-forws . v

■ -. . Фракции " ; -, Белок '/ иг ■ i Воск 1 иг 1 ! Удельная фер-1 мента тнэная. i активность вос-t кообоазоааям

'""■■ Разрушенные клетки 77,52 9,60 "'■ 123

Еадосадочяая жидкость Í9000<j) 42,30 5,30 125 '. . :

: ыадосадочная жидкое ть(16000j) 29,00 4,21 .151^- "; ' "

■■:■ Клеточные стенки (осадок 16000jУ 10,70 0,90 ; 88 :

1 ; Цитоплазма ( надосадок • 144000$) " ' - ' ■ ^ 19,60 .. 0,00 : ' о '-У1^'^)^

. . ^ Иембраны (осадок 144000j) 10,40 1,81. 182 _>'■:

.. Однако нужно отметить, что восн, образующийся во фракции: : V мембран, составляет всего 43? от воска, образующегося во фрак- : ■ паи надо садочной жидкости (16ООО5), афрашщя цитоплазмы совсем не обладает способность» воскообразоваяия. Такви образом,' хотя , ферменты воскообразования локализована во фракции иеибранных; : . . . фрагментов, во для проявления полной активности ■ требуется,'по-ви- ■

димому, присутствие растворимых компонентов, переходящих в ■ :;надосадок при режиме центрифугирования 144000^.

. — фракция клеточных стенок таив проявляет неболыцую актив- -яостьчтабл.4).'ьюудельная ферментатявядя активность неочжщев-V' ноа фракции клеточных стенод влвое меньше, чем удельная ферментативная активность фракции мембран,- я проявление этой активности мн объясняем только присутствием какой-то части мембранных фрагыентов.не отделившихся от стенок. Нате объяснение согласуй етсяслитерагурвши данными, получеввымя для'утлеводородокисляю-цкх:дрожжаА'(РачияскиЙ в др., 1971). Фракция цитоплазма не содержала.ферментов, осуществляющих биосинтез воска (табл.4). Однако при инкубировании ее с субстратом н-гаптадеканом происходил интенсивный процесс кислотоиаковлешш. Это свидетельствует о том, что в цитоплазме имеются фермента, последовательно окисляющие ■■■ углеводород в спирт и кислоту,, но отсутствуют ферменты. осущес*^ 1 ■ваяющие реакцию ^тарификации. --

- ■ С помощью метода дискового электрофореза в подиакриламидном : геде^нами: были подучены электрофоне тяческив спектры фракций сито-' плазмы и мембран культуры./¿mvAtc'/. cetbforma/is. Во'фрвкции цитоплазма насчитывавгея 18 белковых зов, а во фракции мембран количество их снижается до>12." ... -

1У. Распределение воска и углеводорода в клетках ■ _ -.

Mi/coiaci. eeroformc/ns.

' Проникновение углеводорода в клетку и локализация его бшга азНевы только для угдеводородркисляющих дрожжей ' ( Mutt к ef а£.,Г96Э; ЫеЗсель и др., 1969), локализация же воска в клетках углеводородовделявдих микроорганизмов ранее вообще иб изучалась._

■;■ - *Мы исследовали распределение углеводорода и воска по фракциям клеточных стенок, мембран и цитоплазма, вырагагоая культуру

7сего^огтаяз ; на среде Б. Динами карос та клетокаа сре-дэБ несколько отличается от описапнойранее',на среде А 1рис,2).\": : Отличия ^ заключаются в более, растянутой г на, среде.: Б экспоненциала- Гг вой фазе роста,-значительно меньшим-содержанием'воска в клетках и'резкямего уменьтекиеыпослетрех суток-развитая. -V

Количественное ; определение углеводорода и воска в раздичшсг фазах роста"культуры:показало,' что как во.фракции клеточных сте» ; ной;..! так и во фракции мембран и.датонлазмы^ содержание воска в': -'стацяоНарвой фазе в: несколько раз ниже, чем в аксдоненциальвой. . (табл.5). . : "IV.■:--■".- V. . ':•*.•*".: •. •

, , ' '" - '-' • ~ . • Таблица 5 • -

" Содержание углеводорода и воске в йесклеточннх • .■.--. •■■ , • -" фракциях сего/отат " .:■

Фаза ооёта • ! ' Сточные стенки ;; ■ Мембраны + цитоплазма ^

'" -У • ,'i £ ВОСКВ К су- углеводо-' .л -о 1 хому весу »рода к су-—1 1хомт вест % воска к". \% углеводо-.=■ сухому . -)рода■к,су- ~ •весу,, - 'xomv весу

Экспоненциал*- -v,-. ■--.-.■;■■ ■--' •• • • - .

- ЫЭЯа суток • 24,5 ' • 19,7 Д- 4,7 . : 2.0' •

. Стационарная• , ' ~ :'■■ ■..■"■■■■ - ; -*.Ч. ■ - .

-г::.;;. - 5 суток ;■■■ ..---..0,3 : 12,о ~ 0,1 v.; 0,8 . ,■-.:■

. ..-г'Это уменьшение ми объясняем потреблением воска ' в.процессе . -'развития культуры (рис,2). Углеводород не"используетсяклет— ; коми ftuccSc/ct. ' сего forma/7 s : - "полностью, даже в -..:- стационарной фазе. в.клеточных стенках остается заметное количе^ -ство субстрата Л табл. 5). При исследованиира определения,воска по фракциям в одной фазе развития. культуры оказалось, .что как*в экспоненциальной, так и особенности" в стационарной-фазе,количест-во ' воска'в клеточных стенках значительно ваше,': чем в мембранах '::

. \ Л и цитоплазме. ТЪ же самое относится в к распределению углеводов:

рода. ' /' " ■■ ;/. у.

,*. Полученные результаты показывает, что клеточная стенка .■ МзШяс1, сегойзгштз является местом аккумуляция углеводорода1 . - и'воска.' , ' . ' ■ , Л'*""-'

V У. Цжтохромнвй состав клеток Мусо6ас1. сегоЯ>гтап$. ■■--

Б настоящее время можно считать установленным, что.пернич-, ное' окисление углеводородов аэробными микроорганизмами идет .при участии молекулярного кислорода , 1965). Однако до сих пор

мало данных о ферментах,, реагирующих о молекулярным кислородом, : то есть о 'терыииальных■оксддазах угле водородажаслягадих ыикроорга-у низмов. Известно, что роль терминальных оксида» мору* выполнять: ■ ■ - некоторые цатохромы (СагЖт 1970; Пппег^ е£а£,

1964). ' ' ? '

В нашей работе исследовался цитохромдай состав углеводород-;. " ; ^"окисляющей культуры еего&гтал?. Как видно из рис. 3 -

(а, б, в), дифференциальные спектры поглощения целых клеток . у". ■ , фракций мембран и цитоплазмы идеа- V '

^ тжчны. Максимумы поглощения при 560 нм и 427 нм на этих спектрах у г соответствуют «£ и /'полосам штохрома . СО-спектры целых*

клеток я фракции мембран имеют максимум поглощения при 417 ям . ~и слабые максимумы при 5Э0 нм н 552 нм, а также минимум прк -- : ч - 432 нм. СО-спектр фракции цитоплазмы имеет максимум поглощения ' ^ ' при 420 вм, слабый максимум при 540 нм ж минимум при 433 нм. Та- *

кие СО-спектры характерны для цитохрома 0,лкоторый может '.. функционировать как терминальная окслдаэа \Casior . СЬеепсе:,1959);

s Л ■ -,

. у Г^Таким образом, наш: показано, . что в состав цитохромов клеток Масойас^ сего£сгтвп$ входят цитохромы,я О. Так как авто- : хром о-единствевдый СО-связывающий цитохром фракций мембран в цитоплазмы, обладающих способностью активно окислять углеводород то можно предположить, что'оа.выполняет роль"терминальной оксяда-зы'при окислении углеводорода Мусойа^. сегоЯ>гта»5 . ...

..*'. У1. -Распространение' способности к восвообразюванию . ....

среди'сапрофитных мякобаитерий '■■>.;..V ■■■'.

Анализ имеющейся литература позволяет.заключить, что липаш сапрофитных микобактерай изучены значнтельно;слабее,-чем липиди патогенных и подупатогешшх.форм. Традиционное мнение о том, что в клетках микобактерай содержится шого-воска/ подверглось, сере-_ смотру в отношении патогенных .форм после работ Эслино. {А$ге££леаи

1966) и других исследователей, показавши, .что "воска"• этих микроорганизмов большей часты» не являлись истинными воска-ми, а состояли из мкколовых кислот н их эфиров с пептидами и полисахаридами.

. < - Мы исследовали способность к образованию истинных воеков 7 ыккобактериями, выделенндаи: из разнообразных почв. Для выявления этой;способности использовали среду А с н-гептадаканом.'На этой среда росли 91# изученных штатов, большинство накапливало биомассу от 4-5 г/л до 8-9 г/л (табл.б). При этом активно растущие ' микобактерии; использовали"гептадекан на 87,5-99,7^.' ^ ■■ Качественное и количественное хроматогрефировааие свободных лиаидоа, образованных этими культурами на среде" с гэнталеданом, ■ показало, что воска присутствуют во многих образцах, ко'в чрезвычайно незначительных количествах,, лишь у двух штаммов содержа-

■ - ■' : -•. , Таблица 6 ■ Роет почвенных ыакобактерий на среде ■ с гелтадзканом (четверо суток) • ' . '

- - ■.. ■'■ ■ '■— 1 "I

Грулда ., культур .. по окрас; ке на ИПА

Розовая ; (22 штамма),^

•I , ".- Bi-o.u a о о а , г/л

О ол 1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 6-7 7-8 8-9 9-10 -10-11:11-12

9 - - • 5 5 19 14 29 5 - 5 - 9

Палевая ! "" - ■ . (.32 штамма),

т - 6... - -. 6 24 - 24 21 10-, 3 3 ■-; _ 3 :

Белая и | - . ,■'■ •

: келтая, . " : - :

(8 штаь*- }..... ■

мовУД } - - . - - 14 29 29 14 \ 14 - - '

■ Примечание: Знак „■—" - отсутствие ютаммов,. накашшващих ;■•' ; " данную биомассу. - _ .-.-_'■"•■■-.'-'

нае воска составило несколько процентов (табл,7). V

Сравнивая полученные результаты с опубликованными ранее ^■Данными по воскам'углеводородоквслявдих ыикобактерий (Красиль-- пиков, Боронелли, 1969; Красальников а др., 1974), моино отме-:■тить следующее. Количество истинных во сков у почвенных микобак-терий значительно меньше, чем у углеводородокисляюадей культура ' -■ Мусо$ас£, сегоЛгталз ара одних и тех же условиях рос га. Таким образом, способность к биосинтезу значительных (более 1Й) поди-' честв истинных восяса у почвенных дагобактерий встречается редко.

I.-' *

Таблица 7•

Содержание истинных восков в почвенных ыикобактериях ,■ ■ ' . :■■ (среда с гептадекаяом) ' . *

т а м м ы ; Биомасса,1., г/л ; Воск, '■ % К ■',.'.'."■-биомассе .:

21-22 4.33 ' V - 5,3 •.

• ^ • - ' ' ' 1116 * 3,56 2,5 • -

. ";■ у■ ' Мхсойа^ 28-2 ■ 6,11 о,а ■

• ,ч": - .• •' " '••. - ' ■ . зон ; 6,17 V' 0,6 ; ;

2025 4,51 ;■, ■ 0,4

— 2064 " 5,02 • - 0,4 :

у 2047' , 6,65 0,4 у Л;'-

-'■ 1665 "6,91^

■21 .■ ■ 7,01 0.3' /

■■■ '■■" - - -V : 2040 4,69 "/д.." •• \ .. следы

ШЗ г 4,15 следа

: 2056 .-'. 3.91 ■ следы

к-б 5,27 >г ■ • следы

х)

Биомасса без приме сея исходного углеводорода

ТО. Химический 'состав восков сапрофитных >.'.■■'

мвкобактерий V"'".'

Как было показано ранее, воск,' образованный углеводородокие-ляяоашми микобавтериями (Красильндков, Короаелли, ■ 1969Красиль-; • -няков и Др., 1974) и нокардшшв {Лаптоп/, Ла^, 1960) на среде* с гексадеканом, состоит в основном из цетшшальмитата. - "

\ ч ' • • ' 19 \ ; ; .. . - ■ - . .

' При -росте же' на глюкозе высшие жирнш спирты и кислоты ^ входящие. V.

- в состав носков, .строятся - из шзкомолекулярных фрагментов, - то ' _

- есть веш путем, чеы при использовании длиадоцёпочечеых: углево- ;

, до родов.. Поэтому состав мйкобактериальвш^ восков может бытьлругим. ■ '■„ -"-'-/■: Ыа исследовала'химический состав" во сков, образованных ывко- . ; ■ бактериями Мусо0аЛ.з£. 28-2, 21-22 к. МасоЗа^. Щб • '

■ при росте ва гексадекане или глюкозе. На средах с этима субстра-У тами микобактерии накапливала меньше воска; чем на среде с геп-■ , тадекаяом (табл.8). '.^Я\ I

V ';'■■' .;."■. ■' ■■ '". К . Таблица 3 „

Рост я образование воска на средах с гексадеканом .

" ■'■■.-. или глюкозой'-■■:''-" У-'--'-" ■ ... ■

Е т а м м■

Биомасса, г/л •' Воск,? к биомассе

Среда с {Среда с [Среда с }Среда с .. гексадека(глюкозой¡гексаде-(глюкозой ном | (наном Г

МусобаН; зр 21-22 \ 9,20 1,00 2,8 следы

8,64 . 0,65 1.5 1,5 .

7,99 0,80 7 -■следу 0.4

/¿¿¿¿сс&т 338 •. 3,43 - - ■''■ ■'' — 1 ■ - 0,2

Анализ хроматографдчески чистых восков методом Масс-спектро-:метрии показал, что воска, образованные на среде с гексоде ка- • ном, представляют собой смеси, двух иди трех'... гомологов с гомологической разностью 23, .'причем .в образце нз штамгла 1116 преобладает цетилпаль<литат (молекулярный вес 490), а в.образце из штамма 21-22 содержатся равные количества цетиловых эфиров лальми-

тоновой (W* 480) и стеариновой (ИГ4- 508) кислот (табл.Э). ;

При использовании глюкозы образуются значительно более сложные смеси истинных восков, в масс-спектрах присутствует по 7 молекулярных пиков, гомологическая разность в этих случаях равна 14. Причем в образце из штамма II16 такав преобладает це тилпаль- • штат. Ранее бшщ доказано, что культура MycoSact. £act¿co£um 398 на среде с гексадекаяом образует'воск, состоящий на190% из цетил-пальмнтата (Красильников и др., 1974). Оказалось» что при росте-этой культуры на среде с глюкозой воск также представлен- смесью гомологов, но цетилпальмлтат в нем составляет лшьь 20,9£ (табл.Э). ~ 1

Следовательно, химический состав восков исследованных куль' Tjb микобактериЗ определяется характером окисляемого субстрата.

Воск, образованный разными штаммами HycoSact. с ero formaos при окиелении гексадекана, представляет собой практически чистый цетиллальмитат, примесь гомологов составляет следовые количества ЦСресальников, Коронелля, I969J. Воск, образованный в этих же условиях почвенными микобактериями M¡>cc£act. facfico&im II16 и ' HuccSati. ф- 2122, содержит значительно меньше цетилпальмитата, соответственно 74ÍÍ и 5Q£. Таким образом, из коллекции исследован*

них втадаов микобактерий штамм Mycc¿aetáHum ce/vñrvncrns 3* » ч ■ \ ■ , представляет наибольший интерес как продуцент цетилпальмитата.

; ■'.'-'.' -, '■ ' ■■''■i ; ; : : с.:' •"■■.• ; '-У- ■■.■■ .'v; ■■-f.!-;..' ¡ . ■

У .'■■' .'*'-Д''■■?l'r ■ .Сосмв восков сочвешш макобамераЗ ¡УД ДУ'-';-Д ДДУ''

■ -i..

--—-Г—-1---^-:------'-—

''.,п.:;'Шмш1 ■ УДУ':

Истйчнжя¡ ■"-»■•^■■Иаюждшяий вас Ш+), % от стаын ' У'/У'ДУ

углерода i■■ - у ли--.,-■■■»■■■■■ к*-- ■ гг.. ■■■ ■ ■ ■■■>:■■•—■■■ - ■-...■■.■. -и.-. д»...-.-., 9 среде i, 424 438 .452' -<66 ¡480 494 508 522 5Э6 •• 550 564 592 620 л. • ' •:

■ - v. .".:■■: .. . \ Mgcofàct Wr.-V1 ■ Г ':-'Д^ У:- ■ ДД>ДД '■-.■■■У ^■■ХД/Д.У':-; Д^ А'ДД

■■'■.,'■.■■■ 1. Д.'■'<, v. /- - ; . - . ; — .-50 - 50 , • - ■■ ■ .-г/,;? j'У-V^'-r>-t

^ ■ ' Д-'Д.' ' ■ i " '■! .-.' " 5 Г Д. У Д'"' -'-ii ¡ >Д ,'■'. '-'Д У"- : !'' '■■■, ' ■ Д.Д Vj ■■ ■■. -- .^ч'ДУ

■ "-i MäCoSacf. farftcotum ';• У1 -У - 13.0 • - 73.9 ■/-■■ 13.2 - ' Д-.Ч ^Д^'-^-'Д/^ДДяД

■ .. : ... ч J ' : ' \ - JJJA 1 1 Ï ■.'■-L 1.. L. '-.-.p^ J "I. ..... r nL . . "l-, r 1 : ■■ V - • . /1-. V Tí ' ■ ^ 1, i, л .. -

"У !-'Д i t : ■■'-', ; ■■ Д'-:" >";.У'7 Д -' '■■/■. ;"¡^ >.<■'■'i'-.' ;■ :'■ V-;..

V-H.I-, i: <13Ш9гъ. '2, Ó î*4 13.4 .4,7 75,1 2,0; í,4 - 'Л; . : - ."-.V;' — ' . -^"'¿'.¡K

' ^V - ШсоШ. $p.y-1!- *r. - 1УZi,o -21,о, 5,3' io,5; 7,4 з,2, /:' ;.",•

■ ' :Л;:. i ' M^di&kú¿á<m . 20,9 19,1 'Э0,0 16,7 -1,2'Ч-:'У

■ i ■■'. V v.v ■ - '' :1 Л*. v:f :-:v-vi-."--;.-.т'-"--V-/;-■.V:.' i-.j-V''ï = "I"-f- =-V-.-V-1'^VrAif-. ■■■„иркивчаняе: ; ^ак ' " - * .: - отсугствае совдвЕеаяй с дйнаым молеяулярши

4У.'. -Vv ' víV: : ' :■'■'■* ' ■ ''■■■ ''■■'*■ ■'-''"'¡1;':-"-'." - ■■ 'v-1 У

г. ' ;,:■>/;:■■ у У'У'Уг fr' '-УуУ.: 'УУ-. ' ['':.:У{:У-;'У уу;у^У'.'Уу'у:У(<

вы в о лЫ ' .

■ I* Изучен путь бвосивтеэа немшшлыштата дз н-гексадекааа культурой Мусо&асЁ. 3*. Гекоадекан ло еле лова тельно

. окисляется в клетках,в иетиловнй спирт в'пальмитиновую кислоту, а петилпальмитат образуется в результате »терафикадил.

2* Изучена динамика роста клеток Мусо&7с£. сего/Ъгтстз, потребления ими субстрата и накопления воска па среде с гекса-„декааом. Показано, что максимальное содержание воска наблюдается в стационарной фазе развития культура.

3. Показано, что воск в значительных количествах образуется при окислении углеводородов с длиной ценя более ,

4. Исследован состав во сков, образованных культурой :

сепяРеюпа»*' на средах с гедтадеканом и октадеканоы, В состав восков в обоих'случаяг входит несколько жирных кислот, при этом преобладает кислота, имеющая столько же углеродных, атомов,-сколько, исходный углеводород. ' -

. 5. Исследовано в динамике содержание воска и углеводорода в бесклеточных фракциях й&т&гг/. сегоДг/палз, Установлено,1 что клеточная стенка является местом аккумуляции углеводорода . и воска. ■ .'.

6. Ферменты, образующие воск, связаннее мембранными структурами клеток сегоЯшвяс. Ферменты, содержащиеся в цитоплазме этих клеток, последовательно окисляют углеводород

в спирт я кислоту. ' ч. ■ - ■

7. Показано, что способность к биосинтезу значительных количеств- воска у почвенных микобактерай встречается редко. Из - ,

47 вгешов, образующих воск,? лишь у 2 штаммов содергашю его . в клетках.превысило ES. . :■ .■■* - ^ '.

: .--.:, 8. Химический состав воска почвенных микобактерий определяется'характером окисляемого субстрата. Воска, образованные имя; на среде с ге исадеканоы, • предетавляют собой смеси двух ила трех ' гомологов с гомологической разностью 28. При использовании глюкозы' образуются значительно более сложние'-смеса истинных восков, в масс-спектрах присутствует, по 7 молекулярных пиков, гомологическая разность в этих случаях равна 14. '

■ ~ ' J-' "

Список печатных работ, в которых изложено основное , ■ содержание диссертации: 1 ^ .

1. Коронеяли Т.В., Печников« H.A. ' " '

Образование; воска культурой MyecSactgrium-'eetvfcrmaxs -, . при росте на средах с углеводородами. Вестник МГУ, ■ биология,.почвоведение, 1971, л 4, -98-101. ; -

2. Красильников H.A., КоронеллиТ.В., Островский' Д.Н., Бисьдо \

H.A.О локализации ферментов, образующих воск, в клетках ' MycoBacterium eerefe/miMS : Микробиология, 1973, Х1Л, 5, \ 779-782. : -'. f ". ; ; : . . - - '. V-

3. Красильников'H.A., Коронелли Т.В., Бисько H.A. Биосинтез'

. цетялпальмитата культурой- fUcipärcfrrtt/srT. c#ro/<y-m<r/?s-' Микробиология, 1Э73, XUi. 6, I02S-I03I. ''У; -

4; Коронёлля Г.В», Еисько H.A.,: Розынов'Б.В, Истинные БОска : сапрофитных Mi; ко бактерий. Микробиология, I9?b. XLiy. I,