Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Биологические свойства возбудителя сосудистого бактериоза капусты и меры защиты

ВАК РФ 06.01.07, Плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства возбудителя сосудистого бактериоза капусты и меры защиты"

На правах рукописи

М-

ВО ТХИ НГОК ХА

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВОЗБУДИТЕЛЯ СОСУДИСТОГО БАКТЕРИОЗА КАПУСТЫ И МЕРЫ ЗАЩИТЫ

Специальность: 06.01.07 - защита растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 7 МАЙ 2015

005569400

Москва-2015

005569400

Работа выполнена на кафедре защиты растений ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Джалилов Февзи Сеид-Умерович

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией защиты растений ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет - МСХА. имени К.А. Тимирязева»

Балашова Ирина Тимофеевна

доктор биологических наук, и.о. заведующей лабораторией селекции и семеноводства цветочных культур и новых технологий селекции ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур»

Ведущая организация:

Политыко Вера Аршаковна

кандидат биологических наук, старший научный

сотрудник лаборатории бактериальных болезней

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии»

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт овощеводства»

Защита диссертации состоится «24» июня 2015 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.04 на базе ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева» по адресу: 127550, г. Москва, ул. Прянишникова, д.19, тел/факс: 8(499) 976-21-84, e-mail: dissovet@timacad.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова ФГБОУ ВО РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева и на сайте университета: http://www.timacad.ru

Автореферат разослан « -fЛ- » Ы-CCtJi-_2015 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

А. Н. Смирнов

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Россия занимает третье место в мире по производству капусты после Индии и Китая, что составляет около 6% валового мирового сбора - 3,528 млн. т, но по урожайности лишь 47-е место с показателем 28,6 т/га (Пивоваров, Бондарева, 2013).

Во Вьетнаме общая площадь под овощными культурами составляет 635,8 тысяч га. Из них растения семейства капустных занимают 70 - 80% от общего объема производства и площадей. В основном выращиваются листовые капусты (японские и китайские), а также белокочанная, цветная и кольраби (http://wwv.sonongnghiep.hochiminhcity.gov.vn/). Урожайность капусты составляет 20-25 т/га.

Одной из причин низкой урожайности капусты является поражение болезнями, среди которых ведущее значение имеет сосудистый бактериоз (возбудитель — Xanthomonas campestris pv. campestris). Это заболевание распространено всех странах мира и всех регионах Российской Федерации, где возделывают капусту, и приводит к снижению урожайности капусты, ее качества и ухудшению лежкости кочанов в период хранения. Особую актуальность эта проблема имеет для Вьетнама, где сочетание высокой температуры, высокой влажности воздуха и обилие осадков приводит к частым эпифитотиям сосудистого бактериоза (http://trongraularnvuon.com).

В системе защиты капусты от этого заболевания большое значение имеют диагностика зараженности семян возбудителем молекулярно-генетическими методами, использование биологических препаратов на основе антагонистических бактерий и антибиотиков, выведение и выращивание устойчивых к заболеванию сортов и гибридов.

Степень разработанности темы. Данной проблеме посвящены многочисленные работы Schaad, Vicente, Матвеевой, Игнатова, Мазурина и др. Тем не менее, остаются нерешенными многие вопросы, касающиеся биологии патогена и мер защиты. Слабо изучена сравнительная эффективность многих биопрепаратов, рекомендованных для защиты капусты от бактериозов. Весьма перспективным представляется использование для этой цели растительных эфирных масел и бактериофагов. В отношении устойчивости гибридов капусты нет достоверных сведений о том, к каким расам патогена они устойчивы. А для правильного размещения этих гибридов необходимы сведения о расовом составе возбудителя. На семенах капусты могут встречаться различные патовары X. campestris. Для точной диагностики зараженности семян молекулярно-генетическими методами

необходимы маркеры, способные различать эти патовары и выявлять X. сатрех/пз ру. сатрезМя.

Цель и задачи. Целью работы являлось усовершенствование методов защиты от сосудистого бактериоза на основе использования экологически безопасных препаратов, устойчивых гибридов р[ капусты и разработки молекулярно-генетических методов диагностики возбудителя.

Для достижения этой цели планировалось решение следующих задач:

1. Выявить расовый состав коллекции изолятов патогена различного географического происхождения.

2. Изучить генетический полиморфизм коллекции штаммов X. сатрезпчх ру. сатревгпв методом мультилокусного анализа для поиска специфичных для этого патовара молекулярных маркеров.

3. Провести оценку устойчивости к заболеванию ряда современных гибридов Р] капусты.

4. Изучить эффективность биопрепаратов в защите капусты от сосудистого бактериоза.

5. Провести скрининг антибактериальной активности эфирных масел различных растений по отношению к X. сатреяМз ру. сатрезМз.

6. Оценить эффективность бактериофагов в защите от сосудистого бактериоза.

Научная новизна. Уточнен расовый и генетический состав возбудителя сосудистого бактериоза капусты. Показано несовершенство существующего набора растений-дифференциаторов. Установлены степени связи между оценками нерасоспецифической устойчивости растений капусты к бактериозу при использовании различных методов инокуляции. Получены новые данные о сравнительной биологической эффективности биопрепаратов в защите капусты от сосудистого бактериоза. Выявлены видоспецифичные и патовар-специфичные праймеры для молекулярно-генетической диагностики возбудителя.

Теоретическая и практическая значимость работы. Уточнен период защитного действия ряда зарегистрированных биологических препаратов. Выявлены гибриды капусты, проявляющие расово-специфическую устойчивость к отдельным изолятам возбудителя. Определена оптимальная инфекциониая нагрузка для создания искусственного инфекционного фона при оценке устойчивости селекционного материала. Установлена высокая биологическая эффективность эфирных масел тимьяна обыкновенного, душицы обыкновенной и чабера горного в борьбе с семенной инфекцией. Показана перспективность использования бактериофагов X. сатреШпх ру. сатрея^я для обеззараживания семян.

Методология и методы диссертационного исследования. Работа выполнена с использованием современных фитопатологических, микробиологических и молекулярно-генетических методов, разработанных ведущими учеными в этой области (Schaad, Kamoun, Vicente, Игнатов и др.).

Положения, выносимые на защиту:

1. Возбудитель сосудистого бактериоза в Российской Федерации представлен расами 1, 3, 4 и 6. Это необходимо учитывать при районировании гибридов капусты с расоспецифической устойчивостью и при создании искусственных инфекционных фонов в селекции на устойчивость.

2. Нерасоспецифический тип устойчивости зависит от нескольких факторов, выявляемых разными методами инокуляции, использующих различные пути проникновения возбудителя в растение-хозяина.

3. Эфирные масла тимьяна обыкновенного, душицы обыкновенной, чабера горного, а также бактериофаги X. campestris pv. campestris показывают защитное действие, не уступающее лучшим из зарегистрированных биопрепаратов с бактерицидным действием.

Степень достоверности и апробация результатов. Работа выполнена с использованием современных методик и оборудования. Выводы подтверждены результатами статистической обработки экспериментальных данных методами, включающими дисперсионный, корреляционный и факторный анализы. Результаты исследования были представлены на Международной научной конференции молодых учёных и специалистов, посвященной 170-летию со дня рождения К.А. Тимирязева (Москва, РГАУ-МСХА, 5-6 нюня 2013 г.), Международной научной конференции молодых учёных и специалистов, посвященной созданию объединённого аграрного вуза в Москве (Москва, РГАУ-МСХА, 3-4 июня 2014 г.), Международной научно-практической конференции «Бактериальные и фитоплазменные болезни сельскохозяйственных культур: научные и практические аспекты» (Московская область, ВНИИФ, 15-18 октября 2014 г.).

Публикации. По результатам работы были опубликованы 8 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 3 глав экспериментальной части, заключения включающего выводы и практические рекомендации, списка цитируемой литературы и приложения. Объём работы составляет 145 страниц. В диссертации содержится 19 рисунков и 37 таблиц. Список использованной литературы содержит 237 источников, в том числе 194 иностранных авторов.

Автор искренне признателен директору Селекционной станции им, H.H. Тимофеева, к.с-х.н Г.Ф. Монахосу; заведующему лабораторией молекулярной фитопатологии Центра "Биоинженерия" РАН, д.б.н. А.Н. Игнатову за большую помощь в работе, а также к.б.н. П.А. Иванову и к.б.н. И.В. Петруне - за методическую помощь в электронномикроскопическом исследовании бактериофагов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обоснована актуальность темы исследования, описана степень разработанности темы, сформулированы основная цель и задачи исследования, научная новизна, обоснована теоретическая и практическая значимость работы, описаны методология и методы диссертационного исследования, основные положения, выносимые на защиту, отражены степень достоверности и апробация результатов.

Глава 1. Обзор литературы

В главе рассмотрены биологические свойства возбудителя сосудистого бактериоза капусты, особенности патогенеза. Приведены сведения об источниках первичной инфекции, 'путях распространения, методах диагностики возбудителя, мерах защиты.

Глава 2. Материалы и методы

Работа была выполнена в 2012 — 2015 гг. на кафедре защиты растений и в лаборатории защиты растений РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева. Отдельные эксперименты проводили в Центре "Биоинженерия" РАН, Селекционной станции им. H.H. Тимофеева, МГУ им. М.В. Ломоносова.

Материалом служила коллекция из 86 изолятов и штаммов X. campestris pv. campestris, выделенных из различных регионов России и разных стран мира. Основная часть коллекции изолятов была выделена нами осенью 2012 года. Расовую идентификацию изолятов патогена проводили с помощью набора растений-дифференциаторов, включающих сорта турнепса (В. rapa), Seven Top Green (STS1 и STS2) и Just Right Turnip (ЖТ), гибрид турнепса Tokyo Cross Hybrid (TCH), линию абиссинской капусты В. carhiata PI 199947 и сорт рапса (В. napus) Cobra (Kamoun et al., 1992; Vicente et al., 2001), восприимчивым контролем служил сорт цветной капусты Гарантия.

При изучении устойчивости к сосудистому бактериозу использовали сорта и гибриды российской и зарубежной селекции, а также линии селекции Селекционной станции им. H.H. Тимофеева. Оценку корневого, листового и стеблевого типа

устойчивости этих гибридов проводили методом заражения через корни, гидатоды, травмированные жилки и стебель методами, описанными А.Н. Игнатовым (2006).

Была проведена оценка биологической эффективности следующих известных и перспективных биологических препаратов: Витаплан, СП; Гамаир, СП; Фитолавин, ВРК (1 и 2); Фитоплазмин, ВРК; Фармайод, ВРК и Стрекар, ПС. Для этого растения капусты выращивали в теплице и в стадии 4-5 настоящих листьев проводили опрыскивание препаратами в рекомендованных концентрациях. Через сутки после обработки проводили инокуляцию методом укола в жилку, как было описано выше. Учеты поражения проводили с 5-го по 14-й день после инокуляции путем измерения длины некроза. Опыты проводили в 8 повторностях по 4-6 растений в каждой. Эксперименты с каждым сортом повторяли дважды. При инокуляции через гидатоды учеты проводили в баллах по принятой шкале (Студенцов, 1971).

Для проведения оценки эффективности предпосевной обработки различными средствами (биопрепараты, эфирные масла, бактериофага) семена предварительно заражали в вакууме (Мазурин, 2009). После обработки семена подсушивали на фильтровальной бумаге и высевали в 49-и ячеечные рассадные кассеты. Повторность опыта 2-х кратная по 49 семян в каждой. Учет проводили в стадии 2-3 настоящих листьев, визуально оценивая наличие типичных симптомов на листьях.

Выделение бактериальной ДНК проводили СТАВ-методом. ПЦР проводили с помощью набор реактивов «Диалат» (Диалат Лтд, Россия) или «Encyclo» (Evrogen, Россия) согласно рекомендации производителя.

После окончания амплификации 5 мкл амплифицированных продуктов разделяли в 1,5% агарозном геле окрашенном бромистым этидием и фотографировали при помощи UV Transilluminator (Великобритания). Целевые PCR-фрагменты были очищены от остатков нуклеотидов и праймеров при помощи набора «Clean up standard» (Evrogen). Для постановки реакции секвенирования для каждого образца была приготовлена смесь в объеме 6 мкл следующего состава: 1,6 пкмоль праймера; 3,2 нг ПЦР-ампликона. После этого образцы были переданы для секвенирования на автоматическом ДНК-анализаторе ABI3700 (Applied Biosystems,USA). Филогенетический анализ проводили с помощью программы Mega 5.0 (http://www.rnegasoftware.net/).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методами корреляционного и факторного анализа, а также дисперсионного анализа со сравнением средних по критерию Дункана при помощи пакета программ STATIST1CA 6.0 ® (StatSoft, США).

Глава 3. Расовый состав возбудителя и устойчивость сортообразцов капусты к сосудистом}' бактериозу

3.1. Расовый состав популяции патогена

Анализ вирулентных свойств коллекции из 86 штаммов и изолятов X. сатре$1г\$ ру. сатрез^я показал, что изучаемые штаммы представлены расами 1 (22,7%), 3 (59,1 %), 4 (9,1%) и 6 (9,1%). Не выявлены расы 2 и 5. Штаммы, выделенные в 2006-2007 гг., были более изменчивы но признаку вирулентности по сравнению со штаммами, выделенными в 2012 г.

3.2. Оценка устойчивости различных гибридов капусты к сосудистому бактериозу

Наиболее радикальный путь борьбы с сосудистым бактериозом — выращивание устойчивых сортов и гибридов. Рядом селекционных фирм предлагаются устойчивые к заболеванию гибриды капусты. Однако при этом отсутствуют сведения о типе устойчивости (расо-специфическая либо полевая). А в случае расоспецифической устойчивости, неизвестно к каким расам она эффективна.

Нами была проведена оценка устойчивости ряда коммерческих Б] гибридов белокочанной капусты зарубежной селекции (Б] Церокс, Браксан, Агрессор, Бронко, Зенон, Тайфун, Таурус, Синтекс). Стандартом восприимчивости служил сорт цветной капусты Гарантия.

Результаты искусственного заражения этих сортообразцов 66 изолятами X. сатрап ру. сатре$ич$ показали, что растения гибрида белокочанной капусты Зенон были восприимчивы ко всем испытанным штаммам патогена, так же как стандарта восприимчивости - сорта цветной капусты Гарантия. В связи с этим гибрид Зенон был исключен из программы дальнейших исследований. Относительно высокий уровень расоспецифической устойчивости показали Б! гибриды Браксан (устойчивость к 33% штаммов), Бронко и Синтекс (устойчивость к 29% штаммов), Таурус (устойчивость к 27% штаммов), Тайфун и Агрессор (устойчивость к 26% штаммов).

Следует отметить, что растения гибридов Циркон, Бронко, Тайфун, Агрессор, Таурус и Синтекс различно заражались штаммами, принадлежащими согласно реакции дифференциаторов к расе 3. Растения гибрида Церокс отличались по реакции на инокуляцию изолятами расы 6. Растения гибрида Браксан отличались по реакции на инокуляцию изолятами расы 1 и 3. По нашему мнению, у этих гибридов имеются гены устойчивости, которые дифференцировали изоляты одной расы по признаку вирулентности. Это свидетельствует о несовершенстве существующего набора растений-дифференциаторов дм X. сатрез/га ру. са/ярел/га.

Для оценки относительной (нерасоспецифической) устойчивости растения гибридов капусты инокулировали совместимыми расами. Результаты учета развития сосудистого бактериоза на 9 гибридах капусты после инокуляции четырьмя различными методами с различными путями проникновения патогена в растение представлены в таблице 1.

При инокуляции через гидатоды высокую устойчивость показали гибриды Браксан, Бронко и Синтекс. Эти же гибриды показали высокую устойчивость при проникновении через травмированные корни. При заражении через корни восприимчивыми были гибриды Экспресс и Тайфун. Выделились очень высокой стеблевой устойчивостью и устойчивостью при инокуляции травмированных жилок гибриды Браксан и Синтекс.

Таблица 1. Относительная устойчивость Б] гибридов капусты при разных методах инокуляции.

Р1 гибриды Методика инокуляции

Через гидатоды, балл (1) Через корни, балл (2) В стебель, балл (3) В жилку, мм (4)

Яат 1-1 276 №. Кат 1-1 276 Ж Кат 1-1 276 NZ Кат 1-1 276 №

Экспресс 3,3с 3,2с<1 1,8е 1,9с З.ОсЫ" 3,2сс1 17,7 «1 18,4 с

Таурус 3,3с 4,0с 0,7аЬс 1,1Ь 2,7с1е 3,2с<1 11,9 аЬс 15,ЗЬс

Браксан 1,4а 1,2а О.баЬ 0,3 а 0.2а 0а 10,1 аЬ 8.2 а

Бронко 1,5аЪ 1,2а 0,6аЬ 0,6аЬ 1,4Ьс 1,2 Ь 12,8 аЬс 15,9Ьс

Агрессор 3,2с 3,2с<1 1,4сс1е 0,7аЬ З.беГ 3.2сс1 12,7 аЬс 12,8аЬ

Циркон 1,9аЬ 2.0аЬс 1,4с(1е 1.2Ь 2,1с(1 2.7 с 14,8аЬсс1 17.2Ьс

Синтекс 1.6аЬ 1.2а 0,1а 0.2а 0,5аЬ 0.3 а 9,5 а 8.1а

Тайфун 2,6Ьс 2,8Ьс(1 1,4сс1е 2,1с 3,7 { 3,8 а 19,1 й 14,4Ьс

Церокс 3.5с 4,0 с 0,9Ьс<1 0.4а 1,7 с 0,5 аЬ 15,8 Ьсс1 15,2Ьс

Таким образом, при всех методах оценки устойчивости в группу высокоустойчивых попали гибриды Браксан и Синтекс. Представляло интерес выявить степень связи между оценками устойчивости гибридов капусты полученными при использовании различных путей проникновения возбудителя в растения.

Статистический анализ показал тесную прямую корреляционную связь между оценками при инокуляции через корни и через стебель (Таблица 2). Коэффициент корреляции при этом составлял 0,82 при ошибке коэффициента корреляции 0,13. Вероятно, при этих методах инокуляции оцениваются сходные механизмы устойчивости.

Не было обнаружено статистически значимой связи между оценками устойчивости, полученными при инокуляции через гидатоды и корни, а также между

заражением через гидатоды и травмированные жилки. Полученные данные показывают существование, по меньшей мере, двух контрастных механизмов

Таблица 2. Корреляционный анализ взаимосвязи между различными методами

Взаимосвязь Коэффициент корреляции, г Ошибка коэффициента корреляции, тг I- кригерий Коэффициент детерминации, г2

1x2 0,43 0,21 2,028 0.187

1x3 0,57 0,19 2.974* 0,329

1x4 0,53 0,20 2.635 0,278

2x3 0,82 0,13 6,081* 0.674

2x4 0,67 0,17 3.829* 0.449

3x4 0,65 0.18 3,589* 0,417

Примечание: 1 — метод заражения через гидатоды, 2 — через корни, 3 — в стебель, 4 - в травмированную жилку; * - существенность коэффициента корреляции при 99%-ном уровне значимости

устойчивости в изученных гибридах, один коррелирующий с реакцией тканей мезофила листа (инокуляция через гидатоды), а второй — с реакцией растения на инокуляцию стебля. Интересно, что для обоих факторов складывается отрицателыю-коррелирущие пары признаков (реакция мезофила листа - реакция растения на инокуляцию корня; реакция на инокуляцию стебля - реакция на инокуляцию жилки листа). Полагаем, что применение комплексной оценки устойчивости разными методами инокуляции позволит выявить в растении различия не только по общему уровню устойчивости/восприимчивости, но и по механизму устойчивости, что открывает возможность подбора родителей для получения трансгрессивных форм растений.

3.3. Проявление симптомов сосудистого бактериоза у капустных растений с различными генами устойчивости в зависимости от концентрации ииокулюма X. сатре.ч1ги ру. сатрехтх

Успешность селекции на устойчивость во многом определяется выбором метода инокуляции растений и оценки поражения.

Для создания устойчивых гибридов Рь необходим скрининг коллекций исходного материала, выявление устойчивых генотипов и изучение характера наследования устойчивости. При этом знание особенностей влияния концентрации инокулюма на проявление устойчивости у генотипов с различным типом генетического контроля позволит оптимизировать иммунологическую оценку.

При заражении 35 сортообразцов расами 0, 1 и 3 возбудителя установлено, что растения гибрида Таурус Б] устойчивы к расе 3, а растения гибрида Б! Агрессор к расе 0. У гибрида Церокс выявлены растения, устойчивые ко всем трем расам, а

также растения устойчивые к двум или только к одной расе. Полную устойчивость к расам 1 и 3 показала линия абиссинской капусты Р1 199947. Отсутствие расоспецифической устойчивости отмечено у гибрида Б, Колобок, сорта Офелия и большинства изучаемых линий. Полную устойчивость ко всем трем расам показала линия Цр2-1. В селекционных линиях Цр1-1, Цр1-2 и С110ф]-17 также имеются растения с устойчивостью к трем расам. То есть в этих линиях возможен отбор растений с устойчивостью к трем расам. Результат анализа потомства от скрещивания высоко восприимчивой линии Мег2ф2 с устойчивой к трем расам линией Цр2-1 показал, что устойчивость является рецессивной, так как все растения потомства были поражены всеми четырьмя расами (0, 1, 3,4).

С целью усовершенствования методики оценки устойчивости селекционного материала были проведены эксперименты по уточнению оптимальных инфекционной нагрузки и сроков проведения учетов на восприимчивых и устойчивых гомозиготных линиях с различными генами расоспецифической устойчивости.

При инокуляции линии абиссинской капусты (В. сагтШа) Р1 199947 разными концентрациями установлено, что действие доминантного гена ЯЬ, контролирующего устойчивость этой линии, не зависит от концентрации бактериального инокулюма. При заражении совместимой расой проявление симптомов начиналось уже на 7-ые сутки после инокуляции даже при самой низкой концентрации патогена (10! КОЕ/мл).

При заражении устойчивой линии удвоенного гаплоида ЦрЫЫ на 7-ой день после инокуляции симптомы отсутствовали даже при высокой концентрации патогена (109 КОЕ/мл). На 15-ые сутки симптомы появились при инокуляции расами 1 и 3 только при высокой инфекционной нагрузке - 108 и 109 КОЕ/мл. При инокуляции расами 0 и 4 симптомы обнаруживались при более низкой концентрации 10° и 105 КОЕ/мл соответственно.

У линии Цр 2-1 на 7-й день симптомы отсутствовали при инокуляции всеми расами даже при максимальных инфекционных нагрузках (109 КОЕ/мл). На 15-ые сутки при инокуляции расой 4 симптомы проявлялись уже при концентрации патогена 104 КОЕ/мл, расами 3 и 0 при концентрации 106 КОЕ/мл, а расой 1 только при концентрациях 108 и выше.

У восприимчивого стандарта - линии Мег2ф2 при инокуляции 4-ой расой симптомы появились, начиная с концентрации патогена 104 КОЕ/мл на 7-й день, и продолжали развиваться до конца периода учета, при более слабой концентрации патогена 103 КОЕ/мл, симптомы не обнаруживались даже на 15-ые сутки. При инокуляции расами О, 1 и 3 симптомы наблюдали на 7-ые сутки только при

инфекционной нагрузке свыше 107 КОЕ/мл. На 15-ые сутки при инокуляции расами О и 1 симптомы появились даже при самой низкой инфекционной нагрузке патогена 103 КОЕ/мл (Таблица 3).

Таблица 3. Проявление симптомов сосудистого бактериоза у восприимчивой линии капусты Мег2ф2 при различных инфекционных нагрузках X. сатре$1г!х р\\ ___сотрешь__

Расы Период после инокуляции, сут Концентрация бактерий (КОЕ/мл)

10 104 103 10" 10' ю8 10у

1 7 - - - + -г + +

15 + + + -f + +

3 7 - - - - + + +

15 - + + + + + +

4 7 - + + + 4- + +

15 - + + + + + +

0 7 - - - + + +

15 + + + + + + +

Примечание: "+" - наличие симптомов,"-" - отсутствие симптомов

В связи с тем, что четкие симптомы поражения у восприимчивого стандарта -линии Мег2ф2 обнаруживаются при концентрации бактерий 104 КОЕ/мл и выше, для более надежного скрининга исходного селекционного материала целесообразно проводить инокуляцию концентрацией 104-10' КОЕ/мл с обязательным использованием восприимчивого стандарта и с проведением учетов с 7-го дня после искусственного заражения.

Глава 4. Оценка эффективности средств зашиты капусты от сосудистого бактериоза

4.1. Оценка эффективности биопрепаратов на основе бактерий-антагонистов и антибиотиков

Известно что, химические средства защиты растений от болезней малоэффективны в отношении бактериальных болезней. Наиболее перспективными в защите от бактериозов растений являются биологические препараты на основе бактерий-антагонистов и антибиотиков (Agrios, 2005).

Нами были испытана биологическая эффективность следующих известных и перспективных биологических препаратов: Витаплан, СП; Гамаир, СП; Фитолавип, ВРК (1 и 2); Фитоплазмин, ВРК; Фармайод, ВРК и Стрекар, ПС.

В первом эксперименте с гибридом Валентина достоверные различия с контролем были выявлена у всех испытанных препаратов через 7 суток после обработки, а через 9 суток у препаратов кроме Фармайода. Во втором эксперименте -достоверно отличались от контроля через 5 суток — Фитолавин, через 8 суток —

Фитолавин и Стрекар, через 10 суток - Фитолавин, Фитоплазмин и Стрекар. Не было существенных различий у опытных вариантов с контролем с 11 и 12 суток после обработки.

В эксперименте с обработкой листьев гибрида Экспресс через 7 суток достоверно отличались от контроля Фитоплазмин, Фитолавин, Гамаир, Фармайод. При учете через 9 дней достоверные различия обнаружены у всех препаратов. Не было существенных различий с контролем с 12 суток после обработки.

У сорта цветной капусты Гарантия в первом эксперименте через 5 и 7 дней после обработки не было существенных различий между вариантами. Через 9 суток все препараты кроме Фармайода показали достоверные различия с контролем, через 11 суток все варианты показали достоверные отличия. Во втором эксперименте -через 6 суток после обработки не было существенных различий между вариантами. Через 8 и 10 суток все препараты показали достоверные различия с контролем. Через 8 суток лучшие результаты показал Фитолавин. Не было существенных различий с контролем с 12 и 13 суток после обработки.

Зараженность рассады достоверно снижалась при предпосевной обработке семян этими препаратами. Наивысшая биологическая эффективность (95,2 %), была получена при обработке семян Фитолавином-1, тогда как при обработке вегетирующих растений она была на уровне 40-45%. Между эффективностью биопрепаратов при обработке вегетирующих растений и предпосевной обработкой семян выявлена прямая корреляционная связь средней силы ( г = 0,636; mr= 0,002; р >99%).

4.2. Антибактериальная активность эфирных масел и их использование для обеззараживания семян капусты от сосудистого бактериоза

Как показано в предыдущем разделе, ни одно из рекомендованных средств не обеспечивает полного обеззараживания партий семян с высокой зараженностью возбудителем сосудистого бактериоза. Поиск таких препаратов продолжает оставаться актуальной задачей.

В настоящее время эфирные масла многих растений находят применение в медицине и пищевой промышленности ввиду наличия у многих из них антигрибной, антибактериальной н антивирусной активности (Маланкина, 2007; Петрушина, 2012; Nevas et al., 2004). Есть сведения об их перспективности для защиты растений от бактериальных инфекций (Nguefack et al., 2005; Pradhanang et al., 2003).

В нашей работы проводился поиск эфирных масел, способных эффективно подавлять зараженность семян сосудистым бактериозом.

Для тестирования использовали эфирные масла 31 вида растений производства ООО «Сириус» (Белгородская обл.), ООО «ТОССА» (Москва) и «Стикс натуркосметик» (Австрия).

Первичный скрининг эфирных масел на антибактериальную активность проводили методом дисков. Из всех испытанных эфирных масел при тестировании методом дисков лишь масло сантала белого и табака обыкновенного не дали стерильной зоны (она была равна 6мм, т.е. диаметру самого диска). У остальных масел размер стерильной зоны варьировал от 10,2 мм у шалфея лекарственного до 52,4 мм у чабера садового.

Для более детальной оценки антибактериальных свойств масел показавших диаметр стерильной зоны более 6 мм, определяли минимальную ингибирующую концентрацию (MIC) в тесте с резазурином (Marina et ah, 2010). У тестированных образов эфирных масел MIC варьировала от 1,0% до 0,125%. Для оценки эффективности обработки семян были отобраны масла с минимальной ингибирующей концентрацией по отношению к Хсс равной 0,125%. К этой группе были отнесены эфирные масла чабера горного, тимьяна обыкновенного и душицы обыкновенной. Учет содержания КОЕ патогена в экстрактах семян после обработки показал, что эффективность испытанных эфирных масел была достоверно выше эталонного варианта, т.е. содержание жизнеспособных клеток патогена на семенах после замачивания их в эмульсиях эфирных масел тимьяна обыкновенного, душицы обыкновенной и чабера горного было существенно ниже, чем варианте с обработкой семян фитолавином, ВРК и положительным контролем. Между эффектами трех видов масел в трех испытанных концентрациях не было установлено существенных различий.

4.3. Выделение и испытание эффективности бактериофагов против сосудистого бактериоза

Первое упоминание об использовании бактериофагов против болезней растений относится к 1926 г. (Бактериофаги: биология и практическое применение, 2012). Как показано в обзоре литературы, последние десятилетия характеризуются возрастанием интереса к этой проблеме. Мы не обнаружили публикаций об эффективности применения бактериофагов для защиты капусты от сосудистого бактериоза.

В задачу нашей работы входило выделение бактериофагов, специфичных к X. campestris pv. campestris, их характеристика и оценка эффективности при обеззараживании инфицированных семян.

Анализировали пробы почвы для выделения бактериофагов собранные летом 2014 г. из различных хозяйств в полях, где в текущем или предыдущем году наблюдалось сильное развитие сосудистого бактериоза на капусте.

Пробы были получены из следующих мест: экспериментальное поле лаборатории защиты растений РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева; Московская область, Луховицкий район, КФХ "Соин"; Московская область, Быково, ВНИИ овощеводства; Молдова, ПМР, Тираспольский НИИСХ.

Выделение бактериофагов и изучение их свойств проводили традиционными методомами. Всего было выделено 11 изолятов. Два изолята R2 и R4 по непонятным причинам потеряли жизнеспособность через 30 суток хранения. Остальные 9 бактериофагов были использованы в дальнейшей работе.

Изоляты бактериофагов различались по специфичности действия по отношению к различным штаммам возбудителя сосудистого бактериоза. Ни один из изолятов фагов не взаимодействовал со штаммами X. arboricola и X. campestris pv. raphani, Изоляты бактериофагов были способны к инфицированию от 46,2 до 68,8% штаммов X. campestris pv. campestris. Причем, группа штаммов X. campestris pv. campestris не поражались ни одним из изолятов бактериофагов. Этот факт указывает на то, что для создания «коктейля» фагов с целью практического применения необходимо выделение бактериофагов специфичных к этой группе.

Электронномикроскопическое изучение морфологии бактериофагов показало, что они имеют форму хвостатых фагов с диаметром головки 46,6 ± 2,2 и длиной хвоста 134,7 ± 8,3нм. На основании этих данных эти фаги были отнесены к семейству Siphoviridae с длинными несократимыми хвостами (Бактериофаги: биология и практическое применение, 2012).

Для проведения оценки биологической эффективности бактериофагов в борьбе с семенной инфекцией был проведен вегетационный эксперимент. Обработка зараженных семян капусты бактериофагами привела к снижению содержания жизнеспособных клеток возбудителя в экстракте семян и зараженности рассады (Таблица 4).

Так, посев семян инфицированных штаммом патогена Tir 2 привел через 50 дней в контроле (без обработки) к значительной зараженности рассады - 86,9%, а при обработке семян бактериофагом DB1' зараженность была 21,4%. При этом биологическая эффективность обработки бактериофагом составляла 75,4%. Аналогичные данные получены и при инокуляции штаммом 276NZ.

На наш взгляд, использование бактериофагов позволит свести к минимуму накопление резистентных к сельскохозяйственным антибиотикам изолятов возбудителя.

Таблица 4. Концентрация клеток X. сатрехП15 ру. сатреьй-Ь в семенном экстракте и зараженность рассады сосудистым бактериозом после обработки _зараженных семян бактериофагами_

Штамм Изоляты Концентрация Зараженность рассады, %

патогена фагов патогена в через ЗОдней через 40дней через 50дией

экстракте семян после посева после посева после посева

(КОЕ/мл, х 104)

Tír 2 Tir2' 34, ОЬ 30,2с 30,2de 36,0bc

Tir2Xl 42,5Ь 26,7Ьс 31,le 44,4cd

Tir2X2 45,ОЬ 16,6abc 23.3bcde 33,3 abe

TiréDBl 55,5Ь 12,9ab 26,1 cde 33.1 abe

DB1' 32,5ab 10,8ab 15,Sabed 21,4ab

контроль 650,Od 67,9е 81,lg 86,9e

276NZ Tir2' 40,5b 6,50а 9,2ab 14,1a

Tir2Xl 8,0а 9,8ab 9,8ab 23,0ab

Tir2X2 42,5b 9,8ab 9,8ab 14,6a

Tir2DBl 43,5b 7,7а 12,2abc 14,4a

DB1' 48,b 7,9а 7,9a 16,1a

конгроль 106,5c 51,8d 51,8h 57,9d

Глава 5. Оценка генетического разнообразия штаммов Xanthomonas campestris и молекулярно-генетическиг маркеров патовариантов этого вида

5.1. Оценка диагностических маркеров для патовариантов вида Xanthomonas campestris

Точная идентификация патоварианта X. campestris pv. campestris в посевном материале имеет важное значение при анализе зараженности семян, так как семена могут нести на поверхности или внутри бактерии других патоваров данного вида или других видов рода, не вызывающих сосудистого бактериоза, и не регулируемых стандартами на качество семян.

Анализ результатов ПЦР с диагностическими праймерами для вида X. campestris, патовариантов X. campestris pv. campestris и X. campestris pv. raphani. показал, что большинство из 86 штаммов дали положительную реакцию с праймерами на мишени Xcc007-tonB, wxcO, cytl86 (cytP450). ПЦР с праймерами на ген эффектора avrXccC также не выявил различий между штаммами. Только 75 штаммов из 86 дали положительную реакцию со специфичными праймерами для патоварианта Xanthomonas campestris pv. campestris. Десять штаммов X. campestris pv. campestris, вместе с типовым штаммом патовара X. campestris pv. raphani АТСС3343, дали положительную реакцию со специфичными праймерами для патоварианта X. campestris pv. raphani. Вместе с тем, 21 штамм X. campestris pv. campestris не показал какого либо соответствия между присутствием продуктов амплификации гена ХорАГ) и локуса Xcrl4fi'14r.

Специфичный маркер фрагмента участка Хсс007-ТопВ остается основным для диагностики штаммов до уровня вида X. campestris. Вьивлено, что большинство штаммов коллекции показали положительную реакцию на ген синтеза липополисахарида (ген wxcO), поэтому можно рекомендовать применять этот праймер как диагностический маркер вида.

Вьивлено, что можно использовать пары праймеров Xcc2f72r и Xcrl4f/14r в смеси мультиплексной ПЦР для быстрого выявления и различения некоторых штаммов патовариантов campestris и raphani. Различия получаемых фрагментов позволяют разделять их в агарозном геле. Размер фрагмента у патоварианта campestris 200 п.о., а у raphani - 277 п.о.

5.2. Генетическое разнообразие возбудителя сосудистого бактериоза в России в 2006-2012 гг.

Для ПЦР-фингерпринтинга с независимыми (BOXA, ERIC) консервативными (JEL1/2, iaaH) и специфичными праймерами были выбраны 83 штамма. В совокупности для всех использованных праймеров и штаммов был получен 71 полиморфный фрагмент. Результаты ПЦР фингерпринта всех изученных штаммов были переведены в двоичный вид (есть фрагмент-нет фрагмента) и проанализированы формальными методами кластерного анализа (метод минимальной эволюции).

Построенное по всей совокупности полиморфных ПЦР маркеров филогенетическое дерево показало достоверное различие штаммов, выделенных в 2012 г. в нескольких регионах РФ (группа 1) от штаммов, выделенных в 2006-2007 гг. в тех же регионах, и типовых штаммов международного происхождения. Кроме того, штаммы группы 1 были наиболее близки к представительным штаммам рас Xanthomonas campestris pv. campestris, полученным от компании Nickerson Zwaan (Нидерланды) в 2009 г. (NZ276; NZ276a; NZ277; NZ306; NZ306a).

5.3. Мультилокусный анализ последовательностей ДНК штаммов X. campestris

По результатам предварительного ПЦР анализа (Разделы 5.1. и 5.2) были отобраны 16 штаммов, включая Tir 2, Tir 1, XY 1-2, XY 1-1, DK 2, DK 1, В 2, В 1, Ram 2-3, Ram 2-2 (собраны в 2012 г.), NZ276, NZ 277, Lix 16, Lix 16А, 11392, 11392А (собраны до 2012 г.) и использованы для мультилокусного анализа (MLST/MLSA).

Для проведения MLST/MLSA анализа были выбраны фрагменты 4 генов: gyrB (В субьединица ДНК-гиразы), rpoD (РНК полимераза, сигма фактор), avrXccC, cytP450.

Для сравнения последовательностей гена cytP450 семейства ВЗ/В4 были использованы фрагменты гомологичного гена ранее секвенированных 43 штаммов X.

campestris, 4 штаммов X. arboricola C-3, 5-4, 3, 26 и штамма^ gardneri GA2 длиной 655 п.о. (50% всей нуклеотидной последовательности гена cytP450 оперона).

Все последовательности были предоставлены А.Н. Игнатовым (ВНИИ фитопатологии и ФИЦ Фундаментальные основы биотехнологии ФАНО).

Филогенетический анализ показал четкие межвидовые различия штаммов X. campestris. В результате проведения мультилокусного анализа было выявлено от 5 (cytP450,) до 20 (rpoD) аллельных вариантов последовательностей. Анализ последовательностей генов gyrB, cytl33 и avrXccC не позволил выделить группу штаммов 2012 года и родственных им по другим признакам штаммов с бутстрепом более 67%.

Последовательности rpoD штаммов, выделенных в 2012 г. были сгруппированы с фрагментами гена штаммов ICMP6541, В100, FBI403, NZ276, NZ277 с бутстрепом 83%. При BLAST анализе последовательностей гена rpoD было обнаружено то, что все штаммы X. campestris, выделенные в 2012 г. и ряд родственных им имеют аллели гена наиболее близкие к штаммам другого вида (X. arbiricola). В тоже время, дендрограммы, построенные по другим генам, помещали штаммы, выделенные в 2012 г. вместе с типовыми штаммами видаХ campestris.

Выравнивание фрагментов последовательности гена avrXccC типового штамма Хсс АТСС 33913) и последовательностей гомологичного гена штаммов Tirl, Tir2, DK1, I)K2, В2, Ram 2-3, Ram 2-2 показало наличие инверсии фрагмента гена в районе 517-840 п.о. в координатах гена типового штамма. Инвертированная часть отличалась значительной изменчивостью (расстояние 0,3) по сравнению с остальной частью гена (максимум 0,02), что предполагает сохранение экспрессии гена, несмотря на его мутацию.

Появление в 2012 г. новой доминирующей генетической группы бактерии, возможно, указывает на наличие адаптации бактерий рода Xanthomonas к новому кругу растений-хозяев или условиям существования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биологические особенности X. campestris pv. campestris обусловливают необходимость комплексного подхода к защите капустных культур от сосудистого бактериоза. Размещение гибридов капусты с расово-специфической устойчивостью предполагает знание преобладающих в регионах рас возбудителя. В нашем исследовании при анализе 86 изолятов различного географического происхождения было показано, что возбудитель представлен расами 1, 3, 4 и 6. Эти сведения такж важны при создании искусственного инфекционного фона при селекции н' устойчивость. Полигенная устойчивость включает различные механизмы

выявляемые методами инокуляции, использующими разные пути проникновения возбудителя в растение. Нами, при факторном анализе полученных данных, показано наличие как минимум 2 факторов устойчивости, при сочетании которых в одном генотипе растения возможен эффект трансгрессии. Особое значение в защите капусты от заболевания имеет использование биологических препаратов. В работе на основе многочисленных вегетационных экспериментов дана сравнительная оценка биологической эффективности многих рекомендованных и перспективных биопрепаратов. Большим резервом средств защиты растений являются эфирные масла растений. Удалось выявить некоторые эфирные масла, не уступающие по эффективности рекомендованным средствам защиты растений. Эти вещества, вероятно, займут свое место в безпесгицидных технологиях, однако для этого необходимо решить некоторые технологические вопросы, в первую очередь создание препаративных форм, обеспечивающих стабильные эмульсии этих веществ. Нами выделены изоляты бактериофагов, способные подавлять семенную инфекцию возбудителя сосудистого бактериоза. Однако с учетом специфичности этих фагов в отношении штаммов бактерии-хозяина, работа в этом направлении должна быть продолжена для создания «коктейлей» фагов, эффективных против всех штаммов патогена.

Предложенные нами подходы к различению патовара сатрея^я от других патоваров X. сатреяМя, которые могут встречаться на капусте, молекулярно-генетическими методами будут способствовать повышению достоверности тестирования зараженности семян.

Проведенная экспериментальная работа позволила сделать следующие выводы:

1. Изучение вирулентных свойств коллекции изолятов патогена показало, что они представлены расами 1, 3, 4 и 6. Не выявлено рас 2 и 5. Штаммы, выделенные в 2006-2007 гг. были более изменчивы по признаку вирулентности по сравнению со штаммами, выделенными в 2012 г.

2. Среди испытанных гибридов капусты относительно высокий уровень расоспецифической устойчивости показали гибриды Браксан, Бронко и Синтекс.

3. Растения гибридов Циркон, Бронко, Тайфун, Агрессор, Таурус и Синтекс различно заражались штаммами, принадлежащими согласно реакции дифференциаторов к расе 3. Растения гибрида Церокс отличались по реакции на инокуляцию изолятами расы 6. Растения гибрида Браксан отличались по реакции на инокуляцию изолятами расы 1 и 3. Это свидетельствует о несовершенстве существующего набора растений-дифференциаторов для X. сатрвх!г1я ру. сатрезРк.

4. При использовании различных методов оценки нерасоспецифической

устойчивости в группу высокоустойчивых попали F] гибриды Браксан и Синтекс. Установлена тесная прямая связь между оценками при инокуляции через корни и через стебель (г=0,82). Не было обнаружено статистически значимой связи между оценками устойчивости, полученными при инокуляции через гидатоды и корни, а также между заражением через гидатоды и травмированные жилки.

5. Установлено, что доминантный ген Rb у линии PI 199947 В. carinata является сильным и устойчивость к расам 1,3 и 4, контролируемая им не зависит от концентрации патогена.

6. Устойчивость линии Цр2-1 является рецессивным признаком и ее проявление зависит от концентрации бактериального инокулюма. Для надежного скрининга селекционного материала целесообразно использовать плотность бактериальной суспензии 104-105 КОЕ/мл с обязательным использованием восприимчивого стандарта.

7. Показано, что опрыскивание листьев капусты препаратами Фитолавин, Фитоплазмин, Гамаир, Стрекар и Витаплан снижало зараженность сосудистым бактериозом. Наиболее выраженный и стабильный защитный эффект наблюдали при обработке 0,2%-м Фитолавином. Период защитного действия биологических препаратов не превышал 10-11 дней. Это следует учитывать при определении периода между обработками.

8. При предпосевной обработке семян защитный эффект показали Фитолавин, Фитоплазмин, Стрекар и Фармайод. Наивысшая биологическая эффективность (95%) была при обработке 0,2%-м Фитолавином.

9. Скрининг в условиях in vitro антибактериальной активности эфирных масел 31 вида растений по отношению к X. campestris pv. campestris показал высокую активность масел тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.), душицы обыкновенной (Origanum vulgare L.) и чабера горного (Satureja montana L.). Биологическая эффективность предпосевной обработки инфицированных семян капусты этими маслами в концентрациях 0,15.. .0,90 % составляла 55,9-86,5%.

10. Из образцов почвы, полученных с полей, где наблюдалось сильное развитие сосудистого бактериоза капусты, выделено 9 изолятов бактериофагов X. campestris pv. campestris. Установлено, что изоляты бактериофагов оказывали литическое действие на 46,2 - 68,8% испытанных штаммов фитопатогена. Использование фагов для предпосевной обработки семян привело к значительному снижению концентрации жизнеспособных клеток патогена в экстракте семян и к уменьшению зараженности рассады сосудистым бактериозом в 2,0-4,1 раза по сравнению с контролем.

11. Выявлено, что изоляты патогена, выделенные в 2012 г. представляют

особую генетическую группу и отличаются от изолятов, выделенных в предыдущие годы последовательностью гена грой.

12. Показана применимость праймеров на мишени Хсс007-ШВ, н'.гсО, суИ86 в качестве видоспецифичных маркеров, а праймеров Хсс 2172г и Хсг14Ш4г - в качестве патовар-специфичных для дифференциации эпидемических (эпифитотийных) штаммов возбудителя сосудистого бактериоза (2012 г выделения) и штаммов, вызывающих листовые пятнистости капустных.

Исходя из результатов диссертационного исследования, можно сделать следующие практические рекомендации:

1. Рекомендуется проведение производственных испытаний обработки семян с целью обеззараживания от сосудистого бактериоза эфирными маслами тимьяна обыкновенного, душицы обыкновенной и чабера горного в концентрации 0,15...0,90 % с экспозицией 30 мин.

2. При скрининге исходного материала капусты на расоспецифическую устойчивость следует использовать концентрацию инокулюма X. сатре$&1$ ру. сатре$№$ 104-10ь КОЕ/мл. В селекционные программы по созданию устойчивых Б] гибридов включить линию Цр2-1, обладающую устойчивостью к четырем расам патогена. При селекции на расонеспецифическую устойчивость следует использовать инокуляцию гидатод и корней, выявляющие различные механизмы устойчивости.

Список опубликованных работ по теме диссертации

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Джалилов Ф.С. Защита капусты от болезней в период вегетации / Ф.С. Джалилов, Во Тхи Нгок Ха // Картофель и овощи. - 2014. - №1. - С.20-23.

2. Во Тхи Нгок Ха. Антибактериальная активность эфирных масел и их использование для обеззараживания семян капусты от сосудистого бактериоза / Во Тхи Нгок Ха, Ф.С. Джалилов // Известия ТСХА. - 2014. - Выпуск 6. - С. 59-68.

3. Монахос Г.Ф. Проявление симптомов сосудистого бактериоза у капустных растений с различными генами устойчивости в зависимости от концентрации инокулюма Хапйютопак сатрез^гч р\\ сатреШп.ч / Г.Ф. Монахос, Во Тхи Нгок Ха, Ф.С. Джалилов // Известия ТСХА. - 2015. - Выпуск 1. - С. 26-34.

Статьи в прочих изданиях:

4. Во Тхи Нгок Ха / Сосудистый бактериоз капусты, симптомы и меры защиты // Сб. ст. науч. конф. мол. учён, и спец., посвященной 170-летию со дня рождения К.А. Тимирязева. - М„ 2014. - С. 83-84.

5. Во Тхи Нгок Ха. Использование эфирных масел для обеззараяшвания семян капусты от сосудистого бактериоза / Во Тхи Нгок Ха, Ф.С. Джалилов // Защита картофеля. - 2014. - № 2. - С. 19-20.

6. Во Тхи Нгок Ха. Генетическое разнообразие возбудителя сосудистого бактериоза в России: Полиморфизм 1ТЦР фрагментов / Во Тхи Нгок Ха, Ф.С. Джалилов, C.B. Виноградова, У.И. Кырова, А.Н. Игнатов // Защита картофеля. -2014,-№2.-С. 21-25.

7. Во Тхи Нгок Ха. Генетическое разнообразие возбудителя сосудистого бактериоза в России: реакция растений / Во Тхи Нгок Ха, Ф.С. Джалилов, C.B. Виноградова, У.И. Кырова, А.Н. Игнатов // Защита картофеля. - 2014. - № 2. - С. 2628.

8. Во Тхи Нгок Ха. Распространение нового генотипа Xanthomonas campestris pv. campestris в России в 2012 / Во Тхи Нгок Ха, Ф.С. Джалилов, Е.С. Мазурин, Е.И. Кырова, C.B. Виноградова, II.B. Шаад, Д. Ластер, А.Н. Игнатов // Защита картофеля. -2014,-№2.-С. 28-30.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Подписано в печать 6.05.2015 г. Формат 60x84'/16. Усл.печ.л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 272.

Издательство РГАУ-МСХА 127550, Москва, Тимирязевская ул., 44 Тел. (499) 977-00-12,977-40-64