Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические свойства штаммов Bacillus Subtilis и разработка на их основе эффективного биопрепарата

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства штаммов Bacillus Subtilis и разработка на их основе эффективного биопрепарата"

НАШОНАЛЬНА АКАДЕМЫ НАУК УКРАШИ ШСТИТУТ М1КР0Б10Л0Ш I ВЕРУСОЛОГЙ' La. Д.К.ЗАВ0Л0ТН0Г0

Р Г Б ОД

• innr Яа правах рукотюу

! h

САФРОНОВА ЛАРИСА АНАТОЛШНА

i ь ш

ВЮЛ0ПЧН1 ВЛАСТИВОСИ ЫТАМШ BACILLUS SUBTILIS I I Р03Р0БКА НА ВС OCHOBI ЕФЕКТИВНОГО БЮЯРЕПАРАТУ

03.00.07 - -*1|сро51олое1я

Автореферат дисертаци на зЭоБуття наукоЬово ступени кандидата Шолоешних наук

Ku'ib - 1995 р.

ДисертаЩею б рукоша

Робота виконана у в1дд1л1 антиб!отик1в 1нституту Шк-poöioüorii i в1русолог11 iw.Д.К.Заболотного HAH Укра-1ни

Науковий кер1вник - доктор медичних наук, акадекйк HAH Укра1ни, професор В.В.Смирнов

OiiqiÜHi опоненти - доктор СюлоПчних наук, професор С.М.Харченко

Пров!дна орган!вац1я - Дн1пропетровський державний ун1верситет

Захист В1дбудеться 17 травня 1995 р. о 10 годин1 на зас!данн1 спещал1вовано1 вчено! ради Д 016.05.01 по по присудженню наукового ступеня доктора бюлоПчних наук у ¡нститут! м!кроб!олог!! 1 в1русологИ 1м. Д.К.Заболотного HAH Украйни /252143, Ки!в-143, вул.Заболотного, 154, ¡нститут MiKpoßioiori'i i blpycoaoril HAH Укра!ни, вал застань-/.

3 дисертац!вю можна ознакомится в науков1й б1бл1отед1 1нотитуту м!кроб!ологП та в1руоолог11 HAH УкраХни

Автореферат роз1сланий "__"_1995р.

Вченкй секретар спед!ал!аовано! вчено! ради

доктор С10Л0г!чнкх наук. Н.К.Коваленко

Л.М.Пурш

ЗАГАЛЪНА ХАРАКТЕРИСТИКА FOEOTH

Актуадьн1сть теми Earaepi! роду Bacillus широко розпов-сюджен1 в навколишньому середовищ!: в грунт!, вод!, noBiTpi, кормах, харчових продуктах та 1нших субстратах. Як наслодок цього, в травний тракт, дихалыи шляхи та piani eKOHimi теплокровное тварш1 регулярно надходять анаши к1дькост1 аероб-них бацил. При цьому 61льш1сть э них не виявляють несприят-ливо1 д!1 на организм людини та тварин.

Аеробн! спороутворююч1 6aKTepi"i характеризуются висо-кою i piaHo6i4HDD б1олог1чною активн1стю, яка проявляеться, зокрема, в продукцП бюлог1чно активних речовин, таких як ферменти, атнокислоти, в тому числ1 i неаамХнн!, в!там1ни, антиб1отичн1 речовини, псипсахариди i iHmi сполуки. KpiM того, бактерП роду Bacillus при введены! ix в орган!ам теп-локровних, в певнш кiлькocтi, стимулюють aaxHCHi реакцП орган1зму - активац!ю макрофагов, 1ндукд1ю,ендогенного iH-терферону, гпдеилення синтезу 1муноглсбул1н1в.

Бактериям роду Bacillus притаманна також висока антаго-HiciiWHa активн1сть у в1дношенн1 абуднюйв р!зних аахворю-вань. 0дн1ею з таких труп захворювань s широко розповсюджен1 п1оляпологов1 ендометрити велико! рогато! худоби. EiioiponHi заооби, що застосовуються для л!кування ендометрит!в - анти-GioTHKH, сульфан1лам1ди, н1трофуранов1 та imni лгкувальн! препарата - часто не дають бажаяого ефекту. Багато з них яв-ляються деф1цитними та дорогими для використання в тварин-ництв1 та ветеринар!I. Тому розробка нових ефективнкх етЮт-ропних aacoöiB в необх1днога i свовчасною.

В медицин! та ветеринар!! успшно застосовують ряд 6io-дог!Чних npenapaTiB, що базуються на висогай б!олог1чн1й ак-

- г -

TüBHOOTi живих Шкробних культур. 0дн1вю в таких таксоном1ч-них труп MiKpoopraHiBMiB s бактерП роду Bacillus.

Мета та завдання досл1джень Метою дано! роботи було вивчення б!олог1чних властивостей штам1в аеробних спороутво-рюючих Сактер1й роду Bacillus та створення на ix основ! ефективного б!опрепарату для профилактики i л!кування ендо-метрит!в с1льськогосподарських тварин. При цьому були поставлен! так! завдання:

1. Досл1дити м1крофлору при ендометритах велико! рогато! худоби та виэначити ochobhI ет!олог1чн1 фактори дано! патологil.

2. Вивчити антагслпстичн! властивост1 бактер1й роду. Bacillus в1дносно эбудник1в ендометриИв та отримати високо-активн! штами-антагоШсти.

3. Досл1дити С1олог1чн1, в тому чиол1 патогенна влао-тивост! штам1в-антагон1ст1в 'з метою виэначення Ix перспек-тивност! як оонови для б!опрепарату.

4. Отримати штами-антагон1сти, найб!льш придатн1 для конотруювання Cionpenapaiy.

5. Дослгдити потреби в живлешп, ростов! властивост! Bi-дЮраних штам!в бацил, продукуванйя ними öioaorimfo активних речовин та в!дпрацювати продес Ix глибинного культивування.

6. Досл1дити вплив штам!в, в1д1браних для конотруювання биопрепарату, на показники iw/HiTeiy макроорган1вму .

7. Отримати лабораторн! араэки б!опрепарату та провести полередн! досл1дження його л!кувально1 та проф!лактично"1 ефективностЬ

Наукова новизна Вид!лено широкий спектр шжливих абуд-ник!в ендометриИв с!льськогосподарських тварин i вперше у в!д1юв1дяостх в сучасними уявденнями про систематику бакте-

р1й проведена Ix 1дентиф1кац1я.Визначена еИолог1чна роль асоц1ац!й вид1лено! патогенно! та умовно патогенно! м!кроф-лори у роэвитку ц1в! патологИ i вперше показано, що спектр бактер1адьних збудникгв мае тенденцш до розширення. Щлгсп-рямовано отркман! штами аеробних бацил, антагон!стично актив^ в1дносно збудник!в ендометрит!в.

Доол1джено комплекс б1слоПчних властивостей активних антагон1ст1в, необх1днкх при кокструюванн! бюпрепарату для терапП запальних акушерсько-г1неколоПчних патолог1й.

Для культур Bacillus subtilis, що являються основою 6i-опрепарату, розроблен1 дешеве, без харчових компокент1в, р1дке похивне середовище i спос!б високопродукуивного nepio-дичного глкбинного культивування при отришшй проб1отика. .

Отримаш досл!дн1 лабораторн! cepii CionpenapaTy з титром 1,0 * 1010 - 1,0 * 1011 гшттвздатнйх кл1тин i спор до 30-50 7. на грам сухого препарату.

Вперше показано, що отрицаний С1опрепарат при 1нтрава-Пнальному та внутричеревному введеши стимулов кеспециф!чну резистентн1сть оргашзму лабораторних тварш, пхдвищ/в функ-Ц10нальну активн1оть фагоцийв.Лндукув продукщю ендогенно-го 1нтерферону.

В доол1дженнях, проведение в господарствах, вперше встановлена висока профхлактична i терапевтична ефекглзнхсть препарату на основ! щлеспрямовано отриманих живих культур Bacillus subtilis при шсляпологових ендометритах велико! рогато! худоби.

ГГрактичне значения роботи Розроблено CionpenapsT для профилактики i терапИ надзвичайно широко розповсюджених захворювань с1льськогосподарських тварин, щр проявляб анти-MiKpoöHi властивост1, а також позитивно впливав на 1ыуноло-

. - 4 -

г1чний статус макрооргашзму.

Матер1али досл!джень включен! до Регламенту виробницт-ва, Техн1чних умов, Настанови до застосування б1опрепарату.

Апробацгя роботи Матер1али дисертац!! буди поданi на YII э"!зд! Укра1нського'м1кроб1олог1чного товариства /Чер-н!вц1, 1989/, на IY Всесоюзна конференцП "Шкрооргашзми в с1дъсъкаму господарствх"/ Пущино, 1992,/ на I установчому ЛШ/ э"!зд1 УМТ /Одеса, 1993/.

Пубд1кац11. За темою дисертацИ опубл1ковано 12 друко-ваних робИ.

Структура та о6"бм роботи. Матер!али дисертац!! викла-ден! на 200 сторшках машинописного тексту 1 складаються 3i вступу, 2 глав огляду л1тератури, експериментально! час-тини, що включав опис матер1ал1в 1 методiE роботи, та 4 глав власти досл1джень,обговорення результатов, списку латерату-ри, що _BMimys 309 джерел, з них 121 на 1ноземн1й мов1. Робота 1люстрована 29 таблицями та 17 малюнками.

3 М I С Т РОБОТИ

Матер1али та методи доол!джевь. 0б"вктами дослдаень буди штами аеробних спороутворюшчих бактер1й, одержан! з ко-лекцП в!дд1ду антиб!отик1в ¡нституту м^робЮлогП i Bipy-canorii HAH Укра!ни, як1 були 1золгьован! в орган1зму дюдини, тварин, грубих KopMiB, грунту та деяк! музекн! культури /всього 247 штам1в 14 вид!в/, а також асоц1ативна м1крофло-ра, вид1лена при ендометритах велико! рогато! худоби в кШ-коот1 284 шташв, з яких 117, що найчастше зустр1чаються при дан1й патологи, були одержан! в чиот1й культур! для по-далыаих доаШджекь.

Як тест-культури для вивчення антагон1стично! дП бацил

використовували 31 штам патогенних та умовно патогенних м!к-роорган1зм1в р1зних таксожтчних грул, як1 були одержан! в музе!в Ки!вського медичного университету, Ки!вського 1нсти-туту еп1дем1ологП i 1нфеюдйних захворювань, а також 1золь-ован1 Bifl хворих тварин. 1дентиф1кац1ю видхлених в1д тварин бактер!й вели по багатьох культурально-морфолог1чних та ф1-з1олого-б!ох1м1чних властивостях /Биргер, 1982/. В основу 1дентиф1кац1'! покладен! дан1 кдасиф1кацП, викладен1 в 9 ви-данн1 визначника Берги /1984/ та монографП "The Prokaryotes" /Starr et al., 1986/.

Ферментативн1 активност1 аеробних спороутворюючих бак-тер1й вивчали загалъновизнаними методами. Кааешазну, жела-тиназну, елаотазну та лецит!назну активносП визначали за величиною зон г1дрол1зу в1дпов1дного субстрату навкруг колонн культури.

Л1зоцимну активн1сть досл!джували методом Haviger /1968/.

Антагон1стичну активн!сть вивчали методом в1дсроченого антагон1зму /Егоров,1986/.

Токсигенн1, токсичн1 та в1рулентн! властивост1 аеробних бацил досл!джували по Биргер/1982/.

Чутлив1оть до антиб!отик1в вивчали методом дифуаП в агар з використанням атандартних 1ндикаторних диск!в.

Спороутворения досл1джували при м1кроскоп1! забарвлених за Грамом маэк1в 2-7- добових культур.

Титр бактер1й визначали шляхом ряду посл1довних роэве-день та вис1ву на агаризован1 поживн1 середовища в посл1дую-чим п1драхунком колонш, що виросли.

Вм1ст вiльних ам1нокислот в культуральн1й р1дин! /КР/ вивчали на ам1нокислотному анал1затор1 LC 5001 ф1рми

"Biotronic" /ФРН/ niojm в1дпов1дно! обробки проб сульфасад1-циловою кислотою за методикою, описаною Смирновим в сп!вав-торами /1983/.

ЕкзополЮахариди вид!ляли з КР пЮля в1докремлення кл1тин за допомогою центрифугування та осадженням 96° етано-лом, переосадженням з водного розчину та висушуванням до nocTiiíHoi ваги /Захарова, Носенко, 1982/.

KiübKicTb ам1нного азоту в КР визначали методом фор-мольного титрування /Великая, Суходол, 1983/.

0пттазац1ю складу поживного середовшца зд1йснювали за допомогою методу математичного планування експерименту /Бирюков, 1975/.

Вплив на продукц!ю ендогенного 1нтерферону аооц1ац1"1 культур /B.subtílis 39 i B.subtilis 51/ визначали за загаль-новизнаним методом /Эммрих,1987/. Визначення фактору гальму-вавня м1грац1! макрофагiв /MIF/ проводили в кап!лярах за методикою Фр1мелля /1987/.

Вплив асоц}ацП культур /B.subtilis 39, B.subtilis 51/ на бактерицидну активн!сть макрофаг1в перитонеального екоу-дату визначали методом люм1нол-залежно'1 хем1люм1несценцП. /Маянсьюш та íh. , 1987/

Б1опрепарат одержували двома методами: поверхневим способом i шляхом глибинного культивування, розробленого нами для даних культур.

Проф1лактична 1 л1кувальна ефектквнхсть лабораторних зразк!В одержаного препарату досл1джувалась разом si сШвро-б1тниками факультету ветеринарно! медицини Укра1нського на-цЮнального аграрного ун1верситету /УНАУ/ в píbhhx вар!антах досл!д1в на коровах при внутриматочному та внутриваг бальному введенн1 препарату.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛ I ДЕЕНЬ

1. М1крофдора при ендометритах велико! рогато! худоби

1.1. Вид1лення та 1дентиф1кац1я м1крофлори при ендометритах велико! рогато! худоби. •

0ск1льки мета дано! роботи припускала створёння на основ! спороутворюючих бактер1й б1опрепарату для профилактики 1 л!кування ендометрит!в с1льськогосподарських тварин, по-чатковим етапом наших досл1джень було виявлення спектру мс:л-ливих бактер!альних збудник!в дано! п1сляполово! патологП.

Результата показали, щр ет!олог!чним фактором гн!й-но-катаральних ендометрит1в е асоц1ац11 бзктерхй. В асоц1а-ц!ях, вис1яних з 107 проб, виявлено 284 штамп бактер!й, що в1дносяться до р1зних таксоном1чних труп /табл.1/.

Кишкова трупа була найб!льш чисельною / 42,6 7. серед зареестрованих в аооц1ац1ях штам!в. В чист!й культур! 1э асоц!ац!й' було 1зольовано 117 штам1в. Вивчен! !х морфоло-го-культуральн! та б!ох!м1чн! власгивост! 1 проведена ' 1ден-тиф!кац1я вид!лених вид1й у в!дпов!дност! э сучаоними уяв-леннями систематики бактер1й /Вегееу,1984/.

1.2. Характеристика м1крофлори, вид!лено! при ендометритах велико"! рогато! худоби.

Досл1джен1 патогенн1сть ! чутлив1сть в1д!браних 117 чистих культур до широкого набору антиб!отик!в з метой э"ясування 1х ет!слог1чного значения та прогностично! оц!нки можливо! ефективност! сучасних терапевтичних ! проф!лактич-них засоб1в-, як! застосовуються в ветеринар!!.

Близько 60Х штам1в бактер1й викдикали у досл!дних мишей

Таблица l

Шкрофлора, вид1лена при гоотрих пЮляпологових ендометритах велико! рогато! худоби

1 1 Група ■ Всього штам!в| BHflH CaraepiH 1 1 1 Чист! 1

1 бактер1й в асощащях | B acouiaitfHX 1 кудьтури 1

к!льк. 7. 1 1 |к1дьк. 1 1 1 ■ I

|Грамнегатив- E.coli 48 41 1

1THBHi аероб- Proteus vulgaris 6 5,2 1

1 Hi 1 факуль- P.mirabilis 7 6 1

тативно-ана- 121 42,6 P.morgani 1 0,9 1

1epoöHi пали- Salmonella sp. 6 5,1 1

|чки Serratia sp. 3 2,5 I

1Неферментую- P.aeruginosa A X 0,9 1

|4i та iH. Pseudomonas sp. ■ 4 3,5 1

1грамнегатив- 31 10,9 Moraxella sp. • 3 2,5 1

1 Hi палички A.calcoacetious 5 4,2 1

A.faecalis 3 2,5 1

|Грампозитив- B.subtilis 16 13,6 1

1н1 аеробн1 B.cereus 1 0,9 1

|палички 79 27,8 Mycobacterium sp. г 1,7 1

|Грашозитиа- Micrococcus sp. i 0,9 1

|н1 aepoGHi i S.aureus 4 3,5 1

1факультатив- S.faecalis 1 0,9 1

|вно анаероб- 50 17,6 S.faecium 2 1,7 1

1 Hl коки S.pyogenes 1 0,9 I

|Др1жджепод1-

|бн! КЛ1ТИНИ-

3 1,1 Candida sp. 3 2,5 1

|Всього 284 100 117 41,2 1

аахворювання. Сорок п"ять процентов культур в!д аагалыю! к1лькост1 досл!джуваних, викликали не лише оанаки аахворювання, але i загибель досл1дних тварин. Найб1льшу хворобот-ворну д1га на мишей виявляли б актер! I з родини Enterobacteriaceae. Патогенн1 властивост1 виявляли б!лъппсть штам1в кишково! палички i Boi доол1джуван1 штами бактерш ia род!в Proteus, Salmonella, Serratia. Разом з тим, б1л! миш1 виявились нечутливими в уыовах досл!д1в до предотавник1в ро-д1в Moraxella, Aoinetobacter, Alcaligenes, а також до штаы1в грампозитивних кок1в, др1жджепод1бних гриб1в i аеробних ба-цил.

Одержан! дан1 св1дчать про те, щр б!льша к1льк1сть ви-д1лених при ендометритах Сактер1й р1зних вид1в мають пато-генн1 властивост1.

Результата доэволяють роаглядати вид1лен1 види бакте-pin, аа невеликим винятком, як можливих збуднюйв ендометри-TiB велико! рогато! худоби. При досл!дженн!г вид!лених бакте-pift на чутлив!сть до широкого спектру антибЮтшйв, переваж-на 61льш1сть штам1в виявилися ст1йкими до багатьох досл1дже-них антиб!отик1в. Найб1льша к1льк1сть штатв во!х вид1в /б1льше 40%/ виявшш чутлив!сть до гентам1цину i левомщети-ну. Ст!йк!сть до Bcix антиб1отик1в встановлена у 30 штам1в, тобто, у б1льш, н1ж 25%.

Таким чином, жоден э 11? штам!в досл1джених нами вид!в не був чутливим до BCix 18 випробуваних антиб! отшив. Сто одинадцять шташй були сИйкими до 5 i б1льше антиб1отик!в, тобто були пол1резистентними.

Встановлена пряма аалежшсть м1ж ст1йк1стю до антиб1о-тик1в бактер1й-эбудник1в гоотрих ендометрит1в 1 !х в1рулент-Н1стю. Bei в!рулентн1 штами були практично ст1йкими до вс1х

антибЮтик!в.

2.БактерП роду Bacillus - антагон!оти збудник1в ендо-

метрит1в

2.1.Антагон1стична активность штам!в Bacillus у в1дно-шенн1 збудник!в ендометрит1в.

Наш показано, щр ы1кробний фактор е одним з ведучих в ет!ологп захворювань.щр розглядаються. Тому необх1дна роз-робка нових високоефективних ет1отропних засоб1в.

0ск1льки феномен антагон1зму лежить в ochobI Boix' вико-риотовуваних на практид! проб1отик1в, наступним етапом робо-ти був в!дб!р активних штам1в-антагон1ст1в в1дносно вбудни-к!в. Перш за все антагон1стичн1 властивост! штам1в аеробних спороутворюючих бактер1й Сули досл1джен! у в1дношенн1 до му-зейних гновтворних тест-культур. Були в1д1бран1 найб1льш актив^ антагон1сти. НайбШшу антагон!отичну активн1сть вияв-ляли штами B.subtilis. Досл1джена Ix активн!сть у в!дношенн! м!крофлори, 1еольовано1 в1д хворих тварин. 3 загадь но! К1ль-KooTi вид1лених.збудник1в, як теот-культури були ваят1 так1, як! найчаст!ше вис1валися при даному з^хворюванн!, з вираже-ними патогенними властивостями 1 множинною ст1йк1стю до ан-тиб!отик1в.

Одержан! результата дозволили вважати практично весь спектр мажливих збудник1в гн!йних ендометрит!в чутливим до антагон!стично1 дП багатьох штам1в досл1джених аеробних ба-цил. Ряд штаШв проявляв цей антагон1зм в висок!й Mipl.

CTiiKioTb гновтворних бактер!й до антиСЮтик1в не впли-вала на ix чутлив!сть до антагон1стично! дН аеробних бацил.

- 11 -

2.2. Б1олог1чн1 властивост! штам!в-антагон!ст!в.

Для б!льш повно'1 характеристики виявлено! групи штам1в аеробних спороутворюючих Сактер1й-активних антагон!ст1в Сули досл!джен! i imni ïx б!олог!чн! властивост1. Bel птами вияв-ляли властив!сть г!дрол!зувати желатин, казегн, еластин, крохмаль. /табл.2/. Наявн1сть ферментативно! активност! важ-лива, оск1льки одним з фактор!в, як1 визначають л1ку'вальну д!ю препарат1в э живих м!кробних культур, може бути ïx здат-н1сть до утворення високоактивних фермент1в, зокрема, проте-аз /Павлова та iH., 1092; Ng-ok.1968/.

Для одержання додаткових в!домостей про антш1кробн! властивост! в1д!браних штам!в вивчена ïx л1зоцимна актив-н1сть. Штами аеробних бацил були також досл!джен! на можли-BioTb продукц1ï.ними гемол1аин1в, лецитиназ та коагулаз. Ц! речовини належать до ознак патогенноот1 бактер1альних культур, тому штами, як! утворшть ïx, не варто викориотовувати як основу для препарату / табл.2/.

Таблиця 2.

Ферменти, цо продукуються штамами-антагон!стами роду Bacillus

Ферменти К1льк1сть штат в бацил

B.subtilis В.lichenifoimis B.îirmus

желатиназа KaseïHasa еластаза ам1лаза гемол!зин коагулаза лец!тиназа л1зоцим ■ 46 2 1 46 3 1 46 2 0 46 3 1 34 2 0 0 0 б 2 0 0 44 3 1

Загальна к!ль-кЮТь штам1в' 46 3 1

ТаСдиця 3.

Спектр та ступ1нь антагон!зму високоактивних штам!в B.subtilis

1 |Тест-культури 1 ■ — - ... | | Номери i aKTHBHiCTb штатв в мм зон затримки росту тест культур |

| 39 51 60 87 99 107 1

|S.aureus 209 24 10 28 22 23 14 I

|S.aureus К 13 25 10 28 28 25 26 1

|E.coli 070 20 12 25 19 16 18 I

|E.coli К 125 15 8 19 22 26 22 |

|Р.vulgaris 4-8 28 16 28 26 28 25 |

IP.morgani К 92 21 10 19 24 28 17 |

IP.mirabilis К 77 28 15 12 25 20 17 |

1 К. pneumonias Х-24 3 0 ' 8 2 4 3 I

|S.sonnei 659' 27 15. 28 17 28 19 |

|S.typhi 11 18 12 20 12 20 14 I

I Salmonella sp. К 106 12 5 10 12 7 10 I

IC.michiganense 37 0 12 • 5 15 4 0 I

|C.albicans 690 30 10 28 26 28 26 |

lAcinetobacter sp. К 73 г 10 4 4 0 2 1

[Pseudomonas sp. К 16 10 20 14 20 2 10 I

I P. aeruginosa 4141 5 20 8 6 10 2 I

I P.aeruginosa К 135 2 10 2 4 3 6 I

IMoraxella sp. К 3 0 10 4 3 5 4 | 1

В1рулентн1сть була вивчена в досл1дах на лабораториях тваринах, оск1льки пряме визначення yiei властивост! най-б1лыпе характеризуе патогенетичний потенщал бактер!й.

3 урахуванням ряду " коркснкх бхолог1чних властивостей, високо! SHTaroHicTireHoi активкост! i в!дсутносг1 в!рулент-hootí були BifliCpaHi ш1сть штач1в бацил /табл.3/. Проведене б1льш глибске досл!дження "ix tokcikhootí та в1рулен^ност1 при внутр!иньочеревному та пероральному введенн1. Досд1ди in vivo показали в1дсутн!сть у них латогенних властивостей.

Результата досл!дження ввав много антагон!зму в!д!браних високоактивних штам1в Bacillus subtilis показали, щр деякх з них можуть виявляти Бкутр1шньовидовий антагон1эм,. щр непри-пустимо для 1х стильного використання, як основи биопрепарату.

Табл.4.

Б1олог1чн1 властивост! в!д1браних кташв-антагон1ст1в i íx ,асоц1ацП

Штам Б1одог1чна активн!сть

Зона затримки росту /мм/ Зона г!дрол1ау, íiзису /мм/

St.au-E.co- P.rnor-Aci- Р.ае-reus li gani neto-rugi-К13 К125 К92 bao- nosa ter K135 же- казе- елас- кро- кл1-ла- 1ку т!ну хма- тин ти- моло- лю М.lu-ну ка teus 2655

В. subtilis 39 В. subtilis 51 асоц1- ац1я штам!в 27 20 21 S 2 5 6 7 14 12 22 20 18 14 10 6 8 4 8 25 5 11 3 10 0 6 10 4 8 24

- 14 -

В остаточному Шдсумку, проведен! досл!дження дозволили в!д!Срать два штамп, щр характериэувалися повною нешйдли-в!стю i комплексом властивостей, щр дають п1дставу для вико-ристання 1х як основи л1кувально-проф!лактичного препарату /табл.4/.

Досл1дження б1олог1чно1 активност! асоц1ацП показали, щр жодна з властивостей, характерних для кожно! з бактер!-алъних культур B.subtllls 39 1 B.subtllls 61, .при 'ix зм1шу-ванн! не втрачаеться.

3. Ф1з1олого-б1ох1м1чн1 характеристики активних шта-м1в-антагон1ст1в

3.1. Потреби в живленн! i ростов! властивост1.

Досл1джено вплив р1зних джерел азоту i вуглецо на píct 1 розвиток в глибинних умовах культивування штам!в B.subtilis 39 i B.subtilis 51 з метою створення найб!льш оптимального середовища для одержання препарату:

0д1нку джерел живлення проводили по накопиченню б1омаси штамами 1 зм1ною рН середовишд в к!нц1 ферментац!!.

Контролем було модиф1коване нами /Кудрявцев та íh. , 1991/ середовище Sato /Sato.Anaquchi, 1984/, що вм1щувало сульфат амон!ю, як джерело азоту i глюкозу, як джерело вуглецо.

Найб!льш висок! 1 отаб!льн1 реэультати по стимулювашш росту бактер1й з максимальною к1льк1стю OioMacu 1,9 - 4,09 г/л i чисельн1стю живих кл1тин 81,7 - 321,9 млн юйтин в 1мл середовища, одержан! на середовищах, щр м1стять др1ждж! або кукурузний екстракт. Одержан! в даному випадку -показники в 3,5 -4,0 раз перевищують р1вень контрольного середовища /без .орган1чного азоту/. На цих середовищах кращий ефект давали

добавки кукурузного екстракту в концентрацП 50 мгХ за ам!н-ним азотом.

Найб1дьш ефективними з випроОуваних джерел вуглевод!в в меласа 1 зелена патока. Р1вень оптично! щ1льноот1, що рееот-рувться, складае 3±0,БЗ i 3,55±0,71 в!дпов1дно кожному штаму 1 перевищув на 170Х 1 б1льше р1вень контрольного сере-довшца.

На р1ст 1 метайол1зм бактер1й впливав концентратя 1 сп1вв1дношення джерел вуглецр i азоту, як1 входить до сере-довища.Коректировка концентрац!й компонент1в, що входять до середовища i забезпечують б!осинтетичну активн!сть штаы!в, зд Основалась з викориотанням математичного методу пдануван-ня експерименту. Це дозволило одержати максимальний вих1д б!омаси з виооким титром життездатних кл!тин /1*109 - 1*1010 кл/мл, щр утворюють за 24 години ферме нтацП в глибинних умовах 507. i б!льше спор.

Таким чином, розроблене нами середовшце /джерело азо-ту-кукурузний екстракт, вуглецю - зелена патока/ б!льш спри-ятливэ, н1ж контрольне, для глибинного культивування штам!в B.subtilis.

3.2. Синтез 61олог1чно активних речовин.

В1домо, шр механ1зми л1кувально-проф!лактично1 дП про-б1отик1в is бацил мають багатофакторний характер /Смирнов 1 1н., 1993/. 0дн1бю а ланок цього механ1зму е здатн1оть бак-тер!й роду Bacillus до синтезу ряду б1олог1чно активних субстрат1в. До таких субстраИв належать ам1нокислоти 1 по-л1сахариди, можлив!сть синтезу яких штамами B.subtilis 39 i B.subtilis 61 i його регуляц!ю ми досл1джували в ово!й робо-Ti.

- 16 -

Встановлено, що досл1джуван1 штами здшснюють прямий синтез 1 накопичення позаклИинних ам1нокислот на простому глюкоао-м3.неральному середовипй, оптим1зованому нами. Цей процео можливо регулювати шляхом створення оптимальних умов культивування, зокрема, тдбором джерел вуглеводного та азотного живлення..Нами будо випробувано 11 джерел вуглеводного 1 22 джерела азотного живлення /органичного 1 неорга-н1чного/. Так, на середовищах, що м1стять зелену патоку, продукування атнокисдот зб!льшилась на 43,0-271% у пор!в-нянн1 з контролем, меласу - на 38,0 - 247%, ксилозу - на 12-53%.

Однак, вир шаль ним фактором для синтезу 1 екскрецП алнокислот в середовище б джерела органичного азоту. Так, при внесенн! в поживне середовице кукурузного екстракту, продукування ам1нокислот зб1льшилооь в 2,6 раз, др1жджово-го екстракту - в 5,1-18,4 рази, а др1жджового автол!зату - в 10,2 -27,8 рази.

Таким чино^, можна констатувати, що досл1джуван! штами е активними продуцентами таких важливих для макроорган!зму в1льннх ам1нокислот, як глутам1нова, що складае в1д 15 до 76,4% в!д загального вм1сту ам1нйкислот в утворенЬму пул1, вал¿ну - до 63X6 прол1ну -54,5, що залежить з1д умов культивування. Ароматичних аминок1слот --триптофану, тирозину, Пс-тидину, фен1лалан!ну - може бути у створеному препарат! воь-ого 45,5; 25,5; 8,5; 7% в1дпов!дно. Але вса вони мають важ-ливе значения для орган!зму теплокровных.

Нами встановлено, що штами В.зиЬНИз 39, В.БиЫпИз 51 синтевують екаопол1сахариди /ЕПС/ в глибинних уыовзх культивування на середовмц! г зеленою патокою, як джерелом ьугле-ир, 1 кукурузним екстрактом, як джерелом органхчного азоту.

-I rt - 11 -

Еивчення синтезу пол1сахарид!в досл!джуваними штамами в динам!д1 IX роэвитку показало, цо надвжца !нтенсивн1сть про-дукування ЕПС совпадав з експонешцальною фазою росту i за часом настае вже на 6-ту годину культивування.

Показана моклизЮтъ регулюваняя б!ссинтезу ЕПС шляхом зм!ни piBHH аерацП / 1,8 -5,8 г 0<> /л.год./. Найб1лышш pi-вень накопиченза полЮахаркд1з в середовид1 в1дм1чэний при аерацП, в1дпов!дк1й 4,4 г Ог /л.год./. При дьому ростов! показники дослдауваких продудент!з збер!гаються на по-передньому piBHi, але максимально досягнутий в цих умовач ви-х1д пол1сахарид!в р1знкй за абсолютною величиною i складав для B.subtilis 39 11,8 г/л, B.subtilis 51 - 9,2г/л.

3.3. Вплив на показники 1мун1тету.

Ще одн1ею важлиБою характеристикою штам1в, призначених для конструюванкя л1кувально-проф1лактичних OionpenapaTiB, s 'ix вплиз ' на захисн1 реакцП макроорган!зму, що визначають його 1мунореактивк1ся>.

Одержан! дак! сз!дчагь про те, щр !нтраваг!нальне аОо внутричеревне введения в органам досл!дно! тварини acoyla-ц! 1 культур B.subtilis 39, B.subtilis 51 стимулгав бактери-цидну i поглкяальну активяЮть макрофзПв перитонеального ексудату мишей /МШПЕ/. Це може мати велике позитивне значения у визначекн1 Н£сл1дк1з взавмодП збудника з факторами за-хисту макрооргзк1зму, наприклад, при гнглпй 1нфекцП.

Характерного осоСлизастю функц1онально1 активност! фаго-цит1в s тачож 'ix здатн!сть до м1грацИ / вих1д з мхсця лока-л1эацП до Mi едя заталення/. Встановлено, е,о введения асоц1-ацП штам1в B.subti- lis 39, B.subtilis 51 веде до стиыуля-цП ы!грац1йно1 активностi ЮПЕ i леккоцит!в кров!. Вдавлено

також, щр у в1дпов1дь на введения досл!джуваних бактер!аль-них культур стимулюЕться 1ндукц1я а-1нтерферону в орган1вм! тварин з максимальним значениям через 6 годин. В1домо, що сиотема 1нтерферон1в чинить р1зн1 д11: 1муномодулюючу, анти-бактер1альну, против1русну i iHmi /Dahl, Degre, 1983/.

Отже, досл1джуваним штамам аеробних спороутворшючих бактер1й притаманна здатн!сть до виражено! стимуляцП захио-них сил орган1зму теллокровних.

4. Б1опрепарат на основ! штам!в Bacillus subtllis 1 його спецюЫчна активн!сть

S числа досл1джених 247 штам!в р!зних вид!в аеробних спороутворюючих бактер1й оптимальною для створення ßionpena-рату одержана комб!над1я двох. штам1в B.subtilis 39,B.subtills 51, як1 б вираженими антагонЮтами можливих збудник1в п!сляпологових ендометрит!в велико! рогато! худоби 1 доповнюють один одного за спектром антагон1стично! та 1н-ших б!олог1чних активностей.

Д1 штами адатн! до продукт ! ряду ферментiB, ам1-нокислот 1 пол!сахарид1в, щр послужило п!дставою для включения Ix в склад 6ionpenapaiy а жив их м1кробних культур, прианаченого для етЮтропно! терапП ендометрит1в.

Для одержання б1опрепарату в лабораториях умовах проведен! досл!ди по розд1льному культивуванню штам1в B.subtilis 39, B.subtilis 51 в колбах i ферментерах. Культури виропува-ли на р!дкому поживному середовиш,!, роаробленому наш ран1-ше. На даному псяшвному середовшЦ було досягнуто максимально! для обох штам!в к!лькост1 життездатних кл1тин в!д 10э до 1010 в 1ыл i утворення спор в1д 30 до 502 аагально! к1лькос-т! кл!тин.

Таблица 5.

Б1олог1чво активн1 речовини в сер1ях б1опрепарату

1' ■ БЮлоПчна активнЮть 1 1

Зона г!дрол1зу, л1зису , ш 1 1 |позакл1тинн1 ашноккслоти, »¿г/л | екзо- |

(мм 1 * 1

11Ч1Ч 1 ПОЛ1" |

|пп препарату леци- еритр. жела- елас- казе- кл1- | Г1С- про- ва- глу- ала- л1- | оаха- |

тину кров1 тину тину 1ну тин | ти- л!н л1н та- Н1Н 31Н 1 риди, |

М. 1и-. 1 ДИН ы1н т/л I

1

• 2665 1 « I

1 1. 10290 0 0 6 3 9 26 25 38 30 28 45 12' 5,2 |

1 2. 20390 0 0 5 2 11 26 35 40 28 ■35 58 11 6.7 I

1 з. 30490 . 0 0 6 4 10 25 38 42 35 40 61 15 8,3 I

1 4. 41090 0 0 4 3 11 24 30 47 26 42 49 19 7,4 |

1 5. 50291 0 0 6 4 . 9 24 31 50 41 39 41 20 9,0 |

1 6. 60591 0 0 4 4 9 26 39 52 24 41 60 10 7,8 |

1 7. 70991 0 0 5 2 10 25 26 48 31 29 42 12 8,5 |

1 8. 80192 0 0 3 2 11 25 28 41 36 43 51 18 5,0 |

1 э. 90292 0 0 5 3 9 26 32 36 .40 30 49 13 7,7 |

110. 100793 0 0 4 4 11 24 35 53 38 38 57 10 6,1 |

- 20 -

Виготовлен! 10 лабораториях cepiit препарату, hki дос-лдаували на нешк1длив1сть в доел 1дах in vivo 1 bmiot бЮло-ri4Ho активних речовин.

Встановлено, що одержаний б1опрепарат söepiras власти-вост1 культур, як1 складають його /табл. 5/, непшдлмвий■ для макрооргаапзму, характеризуемся позитивною д1ею на 1муноло-гхчний статуо оргатзму теплокровних.

Виконан! досл1дження по розробд1 б1опрепарату дозволили сп1льно з сп1вроб1тниками факультету ветеринарно! ыедицини УНАУ досл1дити ефективн1сть С1опрепарату при проф!лактиц1 та л!куванн! ендометрит1в велико! рогато! худоби в умовах гоо-подарства. Акти про проведения цих дослав подан! в дисер-тацП. Результата викориотання б1опрепарату з живих м!кроб-них культур показали його виражену терапевтичну дш при гострих п!сляпологових ендометритах i затримажЛ посл1ду, а також як ефективного профалактичного засобу. При цьому яки-хось ускладнень, виражених клгн1чно, не спостер!галось. Зни-ження продуктивном! молока, пог1ршення його яксют! не в!д-М1чено.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено, що ет1олог1чними факторами п!сляполого-вих гн1йно-катаральних ендометрит1в s асохцацП патогенно! та умовно патогенно! гноетворно! кЛкрофлори, яка в 61лыгост1 сво5й в антиб1отикорезистентною.-

2. Найб1льшу питому вагу в асоц1ац1ях при гострих ендометритах велико! рогато! худоби складають бактерП кишково! групи, грампозитивна кокова мхкрофлора . При дач in патолог1! waoTime вшпваються нокард1опод1бн! бактер1!, бактерП родгв Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter, Alcaligenes.

3. Вперше показана висока антагон1стична активность бактер!й роду Bacillus в^носно м!крофлори, вид!лено! при ендометритах велики! рогато! худоби. Найб1лыпа активность притаманна штамам Bacillus subtilis.

4. Вивчення бЮлогочних властивостей 247 штамов 14 ви-д!в бактер1й роду Bacillus дозволило в1д1брати два штамп Bacillus subtilis як основу для нового биопрепарату.'

5. Вдобраш штами продукують в середовище комплекс протеснйтичних фермент1в, ам1нокислот i екзопол1сахаридов.

6. Оптижзоваш вар1анти поживних серэдовищ, п1д1бран1 умови високопродуктивного пер1одичного глябинного культизу-вання штам1в Bacillus subtilis,в1дпрацьозано способ одержак-ня б1опрепарату.

7. Одержан! лабораторн1 cepi! б!опрепарату, як1 вм!щу-ють життездатн! клхтини в к1лькост! 1,0'* 101а - 1,0 * 1011, а спори - до 30-50% в rpaui сухого препарату.

8. Розроблений биопрепарат характеризуешься високою ак-тагонютичною активн1стю у в1дноленн1 до м1крофлори, вдале-но! при' ендометритах. При iHTpaaarовальному та внутрШаоче-ревнсму введешп препарат стшулюв неспеци$1чну резистент-н1сть орган1зму лабораториях тварин.

9. Биопрепарат заявляв виракену терапевтичну i npo©i-лактичну ефективнЮть при шсллпологових ендометритах велико! рогато! худоби.

С1ЖС0К P0EIT, 0ПУБЛ1К0ВАКЖ ЗА ТВииВ ДКСЕРТАЦП

1. Кудрявцев В.А., Сафрокова Л.А., ЧуркинаЛ.Н., Вьюницкая В.А. К . вопросу о плазмокоагулазе бактерии рода Bacillus //Микробиол.журн. -1S88. -50, N4. -с.51-53.

2. Кудрявцев З.А., Сафронова Л.А.Дозачко H.A.- и др.

Микрофлора при гнойно-катаральных эндометритах крупного рогатого скота //Микробиол.журн.-1991. -53,N2. -с.3-9.

3. Кудрявцев В.А., Сафронова Л.А., Осадчая А.И., Ковачко И.А. Подбор состава среды для оптимизации аминосинтетической активности аэробных бацилл //Микробиол.журн. -1991. -53, N4. -с.68-73.

4. Сафронова Л.А..Кудрявцев В.А., Осадчая А.К. Характеристика микрофлоры, выделенной при эндометритах крупного рогатого скота //Микробиол.журн. -1991. -53, N6. -0.71-77.

Б. Смирнов В.В., Резник С.Р., Кудрявцев В.А., Осадчая А.И. Сафронова Л. А. Внеклеточные аминокислоты аэробных спорообразующих бактерий //Микробиология. -1992. -61, N5. -с.65-72.

6. Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Резник С.Р., Вьюницкая В.А., Сафронова Л.А., Смирнов В.В. Влияние условий аэрации на синтез и экскрецию полисахаридов бактериями рода Bacillus при их глубинном культивировании //Биотехнология. -N3.

-с.12-15.

7. Кудрявцев.В.А., Сафронова Л.А., Осадчая А.И. и др.Антагонизм аэробных спорообразующих бзктерий к возбудителям эндометритов крупного рогатого скота //Микробиол.журн.-1993.

-55, N2. -с.74-82.

8. Смирнов В.В., Осадчая А.И., Кудрявцев В.А._, Сафронова Л.А. Рост и спорообразование Bacillus subtilis в различных условиях аэрации //Микробиол.журн. -1993. -55, N3. -с.38-43.

9. Сафронова Л.А..Кудрявцев В.А..Осадчая А.И. Перспективность аэробных спорообразующих бактерий для терапии и профилактики гнойносептических послеродовых заболеваний сельскохозяйственных животных: Материалы 1 Установочного /YII/ съезда Укр.микробиол.о-ва //Микробиол.журн.-1994. -56, N4. -с.86.

10. Кудрявцев В.А., Сафронова Л.А. Синтез внеклеточных аминокислот спорообразущими аэробами на синтетической питательной среде //Тез.докл.YII съезда Укр.микробиол.о-ва -Киев-Черновцы: Наукова думка. -1989. -с.67.

11. Kudryavtsev V.A., Osadchaya А. I., Safronova L.A., Kosach-ko I.A. Extracellular aminoacids of aerobic sporo-forming1 bacteria /IUMS CongTess:Bacteriology, mycology /Osaka, IB-22 September 1990/.-Osaka, 1990. -p.92.

12. Сафронова Л.А., Осадчая А.И., Кудрявцев В.А. Перспективность аэробных спорообразущих бактерий для терапии и профилактики гнойносептических послеродовых заболеваний сельскохозяйственных животных //Микроорганизмы в сельском хозяйстве: Тез.докл.IY Всесоюзн.науч.конф. /Пущино, 20-24 января 1992 г./-Пущино, 1992. -с.180-181.

Сафронова Л.А. Биологические свойства штаммов Bacillus subtiiis и разработка на их основе эффективного биопрепарата.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07-микробиология .-Киевский институт микрцбиологии и вирусологии им.Д.К.Заболотного HAH Украины,Киев,1995.

РЕЗЮМЕ

Изложены результаты экспериментальных исследований биологических свойств штаммов аэробных спорообразующих бактерий. Из их числа отобраны высоко активные и безвредные для теплокровных с выраженным антагонизмом по отношению к исследованным возбудителям послеродовых эндометритов сельскохозяйственных животных.Показано,что отобранные культуры отиму-. лируют неспецифическую резистентность макроорганиама.С целью разработки эффективного пробиотика,отработан процесс их глубинного куль тив^ования. Исследования лабораторных серий биопрепарата показали его выраженное лечебное и профилактическое действие при эндометритах.

Ключов1 слова: aepoöHi спороутворюкт бактерП, ендомет-рити о1льськогосподарських тварин, антагонЮТична актив-н!сть,глибинне культивування,показники амун а те ту,б i опрепа-рат.

- 25 -

Safronova L.A. Biological properties Bacillus subtllis

strains and development of the effective biopreparation on their base.

The Candidate Thesis for Philosophy Doctor Degree, the Speciality 03.00.07.-Microbiology-Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine,Kiev,1S95.

SUMMARY

The experimental investigation rezults of the biological properties of the aerobic sporeforming bacteria have been expounded.High-active and harmless for hot-blood with a pronounced antagonism on pathogenic agents have been selected from their number.It is shown that selected strains stimulate. nonspecific resistance ot the macroorganism.High-productive process of the deep cultivation was perfected with the aim to development of the effective probiotic.The laboratory investigations of the biopreparation series showed pronounced treatment-prophy -lactic action with endometrites.

ГЦдписйно до друку 04.04.95p формат 60x84/16 ПапРс друк. Умов, друк. л. 1.0. Тираж 100 прииГряик. Заказ Ш90

Надруковано ЦУОП ДНПП "Плодвкнконеерв" и. Ки1в , Саксагвнського ,1