Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические и молекулярно-генетические аспекты эшерихий, синтезирующих термозависимые антигены адгезии, и разработка способов получения антифимбриальных сывороток

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологические и молекулярно-генетические аспекты эшерихий, синтезирующих термозависимые антигены адгезии, и разработка способов получения антифимбриальных сывороток"

Московская медицинская академия им.И.Н.Сеченове

На правах рукописи

Попов Евгений Иванович

ЯДК 619:616.901.4о-0?

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И ЫОЛЕКНЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЭЯЕРИХИЙ. СИНТЕЗИРЗДИХ ТЕР1103ЙВИСИННЕ АНТИГЕНЫ АДГЕЗИИ. И РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИФИНБРИАЛЬННХ СЫВОРОТОК

03.00.07-микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1991

Работа выполнена во Всесоизном научно-исследовательском институ те прикладной микробиологии

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Волковой К.И.

кандидат ветеринарных наук,

доцент Светоч Э.А.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Быков A.C.

доктор медицинских наук Лиходед В.Г.

Ведущая организация - Всесоюзный научно-исследовательский инсти вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова, г.Москва

Защита состоится "____1992 г. в _^_часов на заседании специализированного совета Д.074.05.10 в Московской медицинской академии им.И.М.Сеченова по адресу: 119881, Москва, ул.Б.Пироговская, 2/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им.И.М.Сеченова по адресу: Зубовская пл., д.1.

Автореферат разослан "—¡Af-L/ÜU^______1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, канд.мед.наук

А.В.Нироноь

• '-Колидиареи человека и сельскохозяйственных животных, вызываемые r-r-^Hjo'poTOKCHreiiHHHH эиерихиями является острой социальной и экономической проблемой медицины и ветеринарии. Для детей до года удельный вес эперихиозов к сумме острых килечных инфекций составляет от 1,0-до 2,3 У.. Этот показатель превыиает аналогичный для нигеллезов и сальмонеллезов. Летальность' не от эмерихиоза нередко выае летальности от дизентерии и гастроэнтероколитов (А.Н.Касьяненко и со-авт.,1388). Остановлено также, что среди лиц, работающих в сфере животноводства или по переработке продуктов животного происхождения, эиерихиозы диагностируются в 1,5-2,0 раза чаще, чей у остального населения (В.В.Гебен, В.БДевчук, Н.Б.Проскурякова, 1988).

Значительно иире этой инфекции подвержены новорожденные животные, среди которых колидиарея составляет 40-60 7. (Касьяненко A.M..1988: Пирожков И.К..1989), а летальный исход среди заболевиих составляет 40-100 7..

Ведущее значение в развитии колидиари как у человека, так и у животных принадлежит энтеротоксинам и фимбриальным антигенам адгезии (CFA, К88, К99 и др.). Последние обуславливают прикрепление возбудителя к слизистой оболочке тонкого отдела кинечника. последующую его колонизацию, характеризуются хозяйской специфичностью (Host specific adhesion), отличаются между собой серологическими свойствами и морфологическим строением. г

На основе этих антигенов за рубежом сконструированы ветеринарные диагностические и вакцинные препараты (Gyles et al.. 1987; патенты 4311797, 4157390, 42j57115, США). Проведены успеяные опыты на добровольцах с целью создания аналогичных препаратов для человека (цит. по И.В.Далин и Н.Г.Фиж, 1985).

Система серотипирования возбудителей колидиареи, принятая в на-ней стране, основана на определении 0 и К(полисахаридных) антигенов и не учитывает наличия у них факторов адгезии. Вакцины, используемые для профилактики колидиареи животных, в качестве основных иммуноге-нов также содержат 0 и К(полисахаридные ) антигены.

Сложивиееся положение дел в диагностике и вакцино-профилакт колидиареи в навей стране обусловлено, во-первых, крайне медлен накоплением сведений о распространенности энтеротоксигенных ад зин-позитивных эяерихий и, во-вторых - отсутствие« специфических агностических анти-адгезивных сывороток, пригодных для практическ применения.

ЦЕЛЬЮ исследования явилось изучение биологических и молекул но-генетических свойств патогенных эверихий^ синтезирующих терыо висимые антигены адгезии, получение на их основе диагностических вороток и внедрение их в практику.

В соответствии с поставленной целью требовалось реиить следую задачи:

-изучить биологические, молекулярно-генетические и иммунохи; ческие свойства клинических нтаммов E.coli, синтезирующих антип адгезии;

-сконструировать при помочи генетических и генно-инженерных i тодов ноноплазмидные втаммы E.coli, синтезирующие антигены К88 К93;

- исследовать молекулярные и генетические свойства плазмид зн1 ропатогенности, ответственных за синтез фимбриальных антигенов:

- разработать способы изготовления диагностических сыворотс используя для этого лабораторные втакаы E.coli, содержание npnpoÄf и рекомбинантные К88 и К99 плазмиды:

- изучить протективные свойства различных факторов патогенное энтеротоксигенных эиерихий;

- осуцествить поиск новых антигенов адгезии среди втаммов эвер хий, выделенных при колидиареях животных.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Остановлено. что зн ротоксигенные К88+ и К99+ нтаммы различаются по фено- и генотипу первых характерен фенотип К88ав+ ЛТ+ Hly+ Col+ R+ ИРГА +. для вто - К99+CTa+A + Col+R+HPrñ+. К88+ втаммы, в отличие от К99+ вт мов, сбраживают в течение первых суток глицерин, но не сахарозу, в

время как К99+ итаммы сбраживают сахарозу, но не глицерин.

Впервые описаны и изучены новые плазмиды рРЫ1 и рРС1, детернини-руодие соответственно синтез антигенов Ш и К99.

Плазмида рРС1 обладает Тга-Функцией, тогда как плазмида рРМ1 ли-, вена этого свойства, однако она может быть мобилизована на перенос другими конъпгативныык плазмидами, например, Ri или R100, Обязательным условием переноса плазмиды рРМ1 является наличие полноценных половых пилей, кодируемых мобилизующей плазмидой.

Установлено, что плазмида рРМ1 стимулирует образование гемолизина, кодируемого плазмидой pSU212::Тп10. Введение же в итамм РМ1 плазмиды R124 приводит к репрессии синтеза антигена К88. Интродукция плазмиды R40a в итамм РН1 индуцирует потерю им Raf+ и КВ8+ признаков.

С помощью рестриктазы HindiII осуществлено молекулярное клонирование структурных генов плазмиды рРМ1, ответственных за синтез антигена К88, в составе вектора pBR322, а с помощью рестриктазы ВашН! на космидном векторе рНС79 осуществлено молекулярное клонирование структурных генов, ответственных за синтез антигена К99, из клинического нтамма СА124, выделенного на территории Казахстана.

Показано, что из факторов энтеропатогенности эперихий наиболее выраженными протективными свойствами обладают антигены адгезии.

Предложен и успежно реализован метод поиска антигенов адгезии среди клинических нтаммов эверихий. С его помощью у итаммов эиери-хий, выделенных от новорожденных телят с клиникой диареи, впервые идентифицирован новый термозависимый антиген А20. обуславливающий агглютинацию эритроцитов морской свинки в присутствии маннозы. По данным электронной микроскопии этот антиген расположен на поверхности бактериальной клетки в виде нитевидных структур.

На основе использования атаммов. содержащих интактные и рекомби-нантные плазмиды. разработаны оригинальные способы получения диагностических антк-К88 и -К99 сызороток. которые завидены четырьмя авторскими свидетельствами.

- 5 - •

Отработан метод приготовления адсорбированной анти-А20 сыворо

ки.

Разработана норнативно-техническая документация, необходимая д производства диагностических антиадгезивных сывороток: техническ условия, инстрцкция по изготовлении и контролю антиадгезивных сыв роток К88, КЭ9, Э87Р, F41 и А20: наставление по их применению. В; пуск указанных сывороток начат в 198Э году во ВНИИ прикладной ыи] рорбиологии. «

Создана коллекция штаммов. синтезирующих антигены адгезии. Час из них (штаммы КЭ-8, КС-645, КС-421. PMI. СА124, СЙ171, СЙ198, PC: РМ744, РМ750) депонированы в музее бактериальных культур ВГНКИВП используются для производства и контроля специфичности антиадгези! ных сывороток. Другая часть коллекции ( штаммы PMI. РС1, РМ10( РМ200) пригодна для конструирования вивых. инактивированных и субъ( диничпых вакцин.

Разработаны методические указания по диагностике эшерихиозс сельскохозяйственных яивотных, которые утвергдены к применении П СССР.

Методические подходы, предлояенные для конструирования адге зин-позитивных эиерихий и использованные для создания ветеринарии диагностических и вакцинных препаратов, могут быть применены для ре пения аналогичных медицинских проблей, например, для получения сыво роток к фимбриальныы антигенам адгезии группы CFA, встречающихся энтеротоксигенных эшерихий, выделяемых от пациентов с клиникой диа реи.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследований долояены на X Всесоюз ном совещании по программе "Плазмида", Пущино-на-Оке, 1985 г.; X Всесоюзном совещании по программе "Плазмида", Пущино-на-Оке, 198 г.; Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия, в реиени фундаментальных проблем биотехнологии". Тарту-Кяэрйку, 1988 г.; Все союзной конференции "Эпизоотология, эпидемиология, средства диагностики. терапии и специфической профилактики инфекционных болезней

обцих для человека и животных", Львов, 1988 г.: Всесоюзной научной конференции "Совершенствование методов государственного контроля ветеринарных препаратов". Носква, 1991 г.; IV конкурсе-конференции на-.учных работ молодых учоных и специалистов ВНИИПМ, Оболенск, 1981 г.: Конференции молодых ученых ВНИИПМ, Оболенск, 1905 г.; IX Итоговой конференции ВНИИПМ, Оболенск, 1985 г.; X Предытоговой научной конференции ВНИИПМ, Оболенск. 1986 г.; XII Предытоговой научной конференции ВНИИПМ, Оболенск, 1988 г,,; дважды докладывалась на методических комиссиях ВГНКИВП.

Промышленные и опытно-промывленные образцы разработанных антиадгезивных сывороток демонстрировались на выставках: "Химия и научно-технический прогресс". ВДНХ СССР. Москва. 1988 г.: " Биотехнология - агропромыиленному комплексу", ВДНХ СССР, Москва. 1989 г.; "Технологические процессы и оборудование для производства продукции микробиологического синтеза и медицинских препаратов", ВДНХ СССР, Москва, 1989 г.: "Биотехнология сельскому хозяйству", Болгария, февраль 1989 г.

Демонстрировавииеся экспонаты были дважды удостоены серебряных медалей ВДНХ СССР.

ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ. Материалы диссертации опубликованы в восемнадцати печатных работах, семи авторских свидетельствах, выданных Государственным комитетом СССР по делам изобретений и открытий (Я 1277459.'1385339, 1412069, 1405147, 1515684. 1515685. 1597727), нормативно-технической документации по изготовлении, контролю и применению агглютинирующих сывороток к антигенам К88, К99, 987Р, Р41. А20 и методических указаниях по диагностике энерихиозов сельскохозяйственных яивотных.

СТРИКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Работа изложена на 290 страницах нанинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей одну главу материалов и методов и пять глав результатов исследований: обсуждения результатов, выводов, списка литературы и 23-х приложений.

1 ; _ а -

Диссертация иллюстрирована 16-э рисунками и 33-я таблицами, сок литературы содержит 249 названий.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 1. Материалы и методы исследований

В экспериментах были использованы референс-атаммы энерихий, с тезирунщие антигены К88, К99, 98?Р, F41 и различные 0 и К антиге полученные из: ИНГ АН СССР от проф. Хмель И.А.. Института вакциь сывороток им. И.И.Мечникова от проф. 'Голубевой И.В., ВГНКИВП проф. Малахова Ю.А. Клинические К88-, К99- и А20-позитивные вта выделены в хозяйствах РСФСР, Казахстана и Алтайского края.

Наличие антигенов адгезии контролировали в реакциях агглвтина на стекле и диффузионной преципитации в геле агарозы с соответств цими референс-сыворотками, а также при помоци реакции гемагглити ции с эритроцитами морской свинки и барана в присутствии 0,5-1,0 D-маннозы.

Выращивание К88+ и А20+ штаммов энерихий проводили на МП1 агаре Хоттингера, К99+ штаммов - на модифицированной среде Мш (Quinee et al..1976).

Клинические итаммы эаерихий исследовали на ферментации угле! дов, гидролиз мочевины, образование индола и сероводорода, утилиг цию солей цитрата и ацетата, реакцю Фогес-Проскайэра, подвижное! устойчивость к антибиотикам, гемолитические свойства, принадлевнос к различным 0-серогруппам и вирулентность для белых мыией (Стандар СЗВ, 1980; Методы обчей бактериологии, 1984; The virulence Escherichia col i,1985). Синтез энтеротоксина СТа определяли при п мощи интрагастрального введения новорожденным мыиатам надосадочн жидкости исследуемой культуры, а ЛТ - на модели лигированной пет. тонкого кинечника кролика (The virulence of Escherichia col i,1985)

Конструирование моноплазмидных К88 + и К99+ штаммов осучествл;

ли с помощьэ метода бактериальной конъюгации и генно-инзенерных подходов СУиллер. 1976; Методы общей бактериологии, 1984; Девис, Ботс-тайн. !Э84: Birnboia et al.. 1970).

Трансформации рокомбинантных ДНК проводили по методу Cohen et al.. 1973.

Антифимбриальные сыворотки получали в соответствии с A.C. 1385339. 1277459. 1412069.

Защитные свойства факторов патогенности оценивали по коэффициенту защиты, который определяли путем деления величины ЛД50 клинического вирулентного штамма для группы, вакцинированной штаммом, синтезирующим факторы патогенности, на величину ЛД50 этого же штамма для контрольной (невакцинированной) группы животных. Вирулентными штаммами служили КЗ-8СК88+ ЛТ + Н1у+ ). СА124(К99+ СТа+ ) и 0157:К88.

Статистические расчета проводили с использованием критерия Сть-юдента (Ашыарин, Воробьев, 1962) на микро-ЭВМ "Электроника МКВ1" (Дьяконов, 1986).

■ 2. Адгезивные свойства клинических штаммов E.coli

Исследовании были подвергнуты штаммы эшерихий, выделенные в центральных и южных районах РСФСР, Казахстане и Алтайском крае от новорожденных телят и поросят с синдромом диареи. На основании полученных результатов изученные штаммы были разделены на две группы; одна вызывала агглютинации эритроцитов морской свинки в присутствии 0,5-1,0 7. D-маннозы (МРГА), другая этим свойством не обладала. Положительную НРГА вызывали К88- и К99- позитивные штаммы, а также ряд клинических изолятов, выделенных от телят и не реагировавших с сыворотками к К88, К99 и-987Р антигенам. Эти изоляты были подвергнуты более тщательному анализу. Бактерии этой группы высевались из лимфоузлов и содержимого кишечника с частотой 13,3-25,0 X, кроме того, они были обнаруяены также в печени, почках и головной мозге.

После проведения цикла иммунизации мышей с интервалом в 7-8 дней

возрастающими дозами ( 125. 250, 500 и 1000 млн а.к./аивотное) ба риальной взвеси атаммов РМ752 и РМ753. выращенных при 37 °С, кроликов ( 250. 500, 1000 и 1000 млн м.к./животное); и последу адсорбции полученных от них сывороток вначале гомологичной бакт альной суспензией культуры, выращенной при 18 °С, а затем ультра ковым лизатом той же культуры удалось получить монорецепторную с ротку, реагироваввую с термозависимым антигеном, ответственны

ъ

МРГА. Этот антиген обозначен как А20. Сывор'отка 620 проявляет сп фичность в Рй на стекле и в РДП при взаимодействии с родственным тигеном и не реагирует с антигенами К88, КЭ9, 987Р и Р41.

При помощи электронной микроскопии установлено, что антиген расположен на поверхности бактериальной клетки в виде фимбрий. итаммы обнаружены в хозяйствах Московской, Тульской, Калужской ластей и Татарстана. Патогенетическую роль этого антигена преде изучить.

3. Исследования клинических К88+ и К99+ итаммов

В различных регионах страны от новорожденных животных с диа ным синдромом нами выделенны К88Г1" и К99+ итаммы, которые по с морфологическим, биохимическим и тинкториальным свойствам явля типичными представителями эшерихий. В отношении изученных кл ческих итаммов следует отметить следующее. Во-первых, энтерото генные К88+ итаммы, в отличие от энтеротоксигенн'ых КЭЭ"1" итаммо течение первых суток сбраживают глицерин и не ферментируют сахар Во-вторых, как установлено при помощи РДП и торможения РА, в пр лах К88+ и К99+ групп эшерихий клинические итаммы синтези соответственно иммунохимически гомогенные антигены К88ас и Установлено такге, что клинические Н88+ итаммы относятся к се руппан 0141, 0149 и 0119 и синтезируют ЛТ энтеротоксин, а К99+ ляютсм представителями серогрупп 08 и 0101 и синтезируют СТа энт токсин.

- Ii -

3.1. Нолекулярно-генетические свойства К88+ штаммов E.coli

Электрофоретический анализ плазмидной ДНК итаммов РД—17, РД-21. РД-24, РД-25, КЭ-8 и КЭ-10 показал наличие у них плазмид с молекулярными массами от 2,3 до 135 HD. Перенос К88+ признака был изучен в опытах генетических скрещиваний и трансформации плазмидной ДНК в реципиенты С600, C600Nal г, СбООг-н- . Принимая во внимание данные Smith и Parsel1(1975) о сцепленности Raí4" и К88+ признаков, реком-бинантные клоны отбирали по их способности усваивать рафинозу в качестве единственного источника углевода на соответствующих минимальных питательных средах.

Остановлено, что частота переноса Raí4" признака зависела от донора и равнялась 1,6-10"^ и 6,?-10~4 и менее. Доля К88+ клонов среди трансконъюгантов составляла от 18 до 100 У. и также зависела от донора. Помимо К88+ признака, совместно с Raí4" признаком из клинических итаммов в реципиентные клетки с различной частотой могут передаваться ар, са, te и км гены. Одновременный перенос антибиотико-. устойчивости, способности усваивать рафинозу и синтезировать антиген К88 был продемонстрирован также и в опытах по трансформации плазмидной ДНК.

Результаты зтих опытов свидетельствуют о том, что К88 ген расположен на плазмидном репликоне с молекулярной массой более 20 MD; К88+ , Raf+ и R маркеры, по-видимому, могут передаваться по своим каналам генетического переноса. Последнее положение было положено в основу конструирования моноплазмидных К88+ , а затем и К99 + итаммов, предназначенных для исследования иммуногенных свойств соответствующих антигенов и изучения свойств К88 и К99 плазнид. Примёнитель-но к К88. антигену удалось создать два таких втамма. Один из них -нтамм РЙ1 - выделен путем скрещивания донора Shí-2 и реципиента С600. Другой втамы - Кг-10 клон 1 - путем скрещивания атаннов КЭ-8 и CBÖONalт . Плазмиды, ответственные за синтез антигена К88, обозна-

ченн в первом случае pPMl, а во втором - рНК88. Эти плазмиды, к установлено с помощью электронной микроскопии, различаются по мол кулярной массе: плазмида pPMl имела размеры 50 MD, плазмида рНК88 44 MD. Более детальному генетическому исследованию была подвергну плазмида pPlfi.

Установлено, что при скрещивании в жидкой среде донора РМ1 и р ципиентов LE332, J53 и C600Nalr эта плазмида не передается. Одна она мобилизуется на перенос плазмидами R6K.JR1, R100, pSU212::Tnl

1ас::Тп10. Мобилизация происходит независимо от того, находят ли эти плазмиды (R6K, RI, R100) в доноре или реципиенте. Частота п

к

реноса плазмиды pPMl составляла 10 -.10 и зависела от мобил зунщей плазмиды.

Из других свойств плазмиды pPMl следует отметить следующие.

При введении в нтамм РМ1 плазмиды pSU212::TniO прослеживает закономерное увеличение активности hly гена, выражающееся в том, ч средний диаметр зон гемолиза у этих клонов составлял 3,8 + 0,2 мм первом опыте) и 3,7 ± 0,1 мы (во втором), тогда как у клонов изоге ного штамма CG00(pSU212::Тп10) этот показатель в обоих опытах со тавлял 2,2 ± 0,2 мм.

Плазмида pPMl не подавляет функциональную активность F пилей не влияет на их морфологию, что следует из сохранения чувствител ности нтаннов С600СрРМ1, lac : :TnlO ) и HBlOKpPMl, Ft's lac::Tnl к литическому действии фага f2 и способности к переносу плазми, F' 1ас::ТпЮ из указанных биплазыидных итаммов. При совмещении

-С с

одном штамме плазмид R40a и pPMl последняя из них элиминирует, чп вероятно, связано с их принадлежностью к одной Cine С) группе Hecoi местимости.

Введение в итамм РН1, содержащей плазмиду pPMl, плазмиды Rli приводит к репрессии синтеза антигена К88. Элиминация этой плазми] восстанавливает Kee+Raf1- фенотип плазмиды рРН1. Плазмида pPMl, ni мимо кодирований синтеза антигена Ш, обуславливает- такве НР1 эритроцитов морской свинки, протекающую более выраженно при инкуб:

ровании смеси при +4°С.

Из ДНК плазмиды рРМi на векторе pBR322 осуществлено молекулярное клонирование HindiII Фрагмента с молекулярной массой ?.? MD. в результате чего получена плазмида pFF20, несущая структурные гены, необходимые для синтеза антигена И88. Используя частичный гидролиз ДНИ плазмиды pFF20 зндонуклеазой EcoRl, ее размер удалось уменьшить до 4,3 HD, в результате чего получена плазмида pFF120i. Для этих плаз-мид построены физические карты сайтов рестрикции эндонуклеаз (рис.1).

Показано. что, выражение антигена К88 зависит от ориентации HindiII фрагмента' в составе рекомбинантных плазмид. Частота потери плазмиды pFF20 атаммом HB 101 составляла 3,3'Ю-^ , а плазмиды PFF1201 - в 1,3-1,5 раза ниже.

3.2. Молекулярно-генетические свойства К99+ штаммов

В опытах элиминации маркеров антибиотикорезистентности с помощью SDS. а также по их переносу в реципиент C6Q0Nalr установлено, что в выделенных клинических штаммах СА124, СА213, СА222, а также в итамме РС1 ген, кодирушщий синтез антигена К99, локализован на плазмидном геноме. Он может быть сцеплен с маркерами антибиотикоустойчивости и ферментации углеводов'. Выявлено три группы К99 плазмид с фенотипами: а) Cir Raf1" К99 + . б) Sar Raf+'К99+ , в) Sa г Тс r К99 + . Последняя из них, кроме того, является конъвгативной, переносится из итамма E.coli 1407 в реципиент C600Nalr с частотой, оцененной по Тсг маркеру, 1(Г4 -Ю-5 и имеет молекулярную массу более 20 HD.

После проведения клонового анализа трансконъвгантов, выделенных путем скрещивания E.coli 1407 х C600Nalr . удалось отобрать ятамм, содержащий плазмиду рРС1, которая содержит sb, te и Н99 гены.

При помощи рестриктазы ВанН1 на космиднон векторе осуществлено молекулярное клонирование структурных генов, ответственных за синтез-антигена К99, из клинического итамма СА124, выделенного на террито-

Hind III

BaaHl *

_L,

EcoRl EcoRl * i

TT7

4,0 6.0

pFF20

Hind III BaiHi

Hind III EcoRl

4 t

■■■■■■■■■»■■■a

8.0

10,0

Ca:

EcoRl EcoRi Hind III BaaHl EcoRi I t I I Г

ii___ URBiiuaauiu (g )

2Д>4X 6.0

pFF120i

BamHl Bgl II PvuII

Xia I Kpnl I

J_LJ_,_L

BaiHi SalGl |BgI

EcoRU 1 ,

PvuII Bgl II IPvuII

H

2;0

4,0

6,0

Pstl EcoRi EcoRU iBaaHi ■■■■ (в) 8.0

pLK-2

Рис.1. Физическая карта гибридных плазмид рРР20 (а). рРР120: (б) и рЬК-2 (в). Толстой линией выделен вектор рВИ32; Са и б) и рНС7Э (в). Размеры фрагментов указаны, в ме-гадальтонах.

рии Казахстана. Полученная рекомбинантная плазмида pLK-2 имеет фенотип йрг Tcs К99 + и молекулярную массу 8,1 MD. К99 ген расположен н< BaaHi фрагменте ДНК молекулярной массой 4.0 MD. Построена физическа; карта рестрикции этой плазмиды (рис.1 К Стабильность наследована плазмида pLK-2 оценивали путем последовательных пересевов атамм< НВ101С pLK-2) на НПД в присутствии ампициллина и без него. Установлено, что в неселективных условиях после третьего пересева происходил; полная потеря способности итамма синтезировать антиген К99. Присутствие в среде ампициллина несколько стабилизировало выражение антигена К99. Это свойство утрачивалось после 10-ого пересева.

4. Приготовление диагностических агглютинирующих антиадгезивных эшерихиозных сывороток

В основу предлагаемого способа изготовления антиадгезивных сывороток.было положено предположение о том, что использование для иммунизации животных высокоиммуногенных адгезин-позитивных итаммо! E.coli, лишенных других диагностически значимых 0, К и Н антигенов, будет приводить к накоплению в сыворотке крови иммунизированного животного преимущественно антител к поверхностному белку, обладающем; выраженными иммуногенныыи свойствами. Присутствие в сыворотке други> антител к таким итаммам E.coli не будет влиять на специфичность сыворотки.

В реализации возможности такого пути получения сыворотки самы! ответственным моментом является выбор штамма-продуцента антигена, пригодного для иммунизации животных. Такими штаммами, на наш взгляд, могли бы стать сконструированные генетическими методами моноплазмид-ные штаммы РН1(К88+ ). РС1(К99+), а также штаммы РН100(К88+ ), РН200(К88+ ) и НВ101 (pLK-2, К99+ ), создание с помощью методов генной инженерии.

Высказанное продположонио было подтверждено в опытах по инмуни-

зации кроликов взвесью нативных бактериальных клеток этаммов РУ1 РН100 и РС1. В проведенных экспериментах отрабатывали наиболее оптимальную схему иммунизации кроликов с цельа получения высокоспецифичных и активных сывороток оез стадии адсорбции гвтерологичных антител.

Поставленная цель была достигнута посредством четырехкратной внутривенной иммунизации кроликов через 7-8 дней в дозах: для итаммг РМ1 - 2.0: 4.0: 8,0; 12,0 млрд м.к./животное; .для атамма РС1 - 1,0; 1,0; 1,0; 1,0 млрд м.к./животное; для атамма РМ100 - 2,0; 4,0; 8,С млрд м.к./животное.

Полученные сыворотки в разведениях исследовали при помощи Рй на стекле с клиническими и лабораторными референс-итаммами, синтезирующими антигены К88. К99, 987Р и А20. В качестве негативного контроля использовали итаммы E.coli с различными 0 и КСполисахаридными) антигенами, а также Köff*" , К99+ , 987Р+ и А20 + ытаммы, выращенные при 18 0 С.

Результаты опытов показали высокую специфичность сывороток в РА на стекле с гомологичными нтаммами при отсутствии перекрестных реакций с гетерологичными носителями антигенов. Так, сыворотка, полученная при помощи итаммов РМ1 и PM100, реагировала только с К88-пози-тивными итаммами, а полученная при помощи штамма РС1 - только с К99+ итаммами E.coli. Титр анти-К88 сыворотки в РА на стекле с гомологичным ютаммом составлял 1:40 - 1:160, анти-К99 сыворотки - 1:20 - 1:40.

Полученные в производственных условиях сыворотки К88 и К99 характеризовались высокой специфичностьи при проведении исследований в Рй на стекле в разведении 1:10, что позволило рекомендовать их для практического использования. После утверждения соответствующей нормативно-технической документации начат промыиленный выпуск антиадгезивных сывороток.

- 17 -

5. Протективные свойства факторов энтеропатогенности

Протективные свойства отдельных факторов энтеропатогенности или их комбинаций были изучены в опытах экспериментальной колиинфекции на мышах линии СНВ и морских свинках с использованием бесплазмидных штаммов и сконструированных на их основе авирулентных моно(К88+ , Ent+ . Н1у + ) -. би(К88^ Н1у+ ; К88+ Ent+ : Ent + Hly + )-, и три-плазмидных(К88 +Ent + Н1у +) вариантов.

Установлено, что бесплазмидные итаммы С600, HB 101 и J53, использованные в качестве вакцины при иммунизации мыией, не обладают про-тективныни свойствами, а коэффициент защиты находится в интервале от 0,4 до 1,5. Эти же итаммы с Ent или Н1у плазмидами обладают коэффициентом защиты равным 0,6-2,2. Однако наиболее выраженные защитные свойства выявлены для ноноплазмидных штаммов, синтезирующих антигены К88 и К99. В этом случае устойчивость животных к заразенига возрастала в 2,8-9,0 раз по сравнении с контролем. Подобные результаты были получены в опытах по изучению протективных свойств штаммов на морских свинках. Вакцинация животный очищенным антигеном К88 повышала устойчивость- нашей к заражения вирулентным штаммом 0157:К88 в 1,8 - 6,4 раз.

Следовательно, сконструированные нами К88+ и К99+ итаммы можно испдльзовать в дальнейших работах по созданию специфических колибак-териозных вакцин.

ВЫВОДЫ

1. Изучены биологические, ианунохимические и ыолекулярно-генети-ческие свойства клинических К88- и К93-позитивных нтаниов E.coli, выделенных в различных регионах страны от больных колидиареей новорожденных животных. Показано, что К Sit изолятн E.coli принадлежат к

серогруппам 0141, 0149, 0119 и 01. в то время как К99+ штаммы -серогруппам 08, 09 и 0101. К88+ нтаммы продуцируют термозависим! "ас" тип антигена К88, ЛТ энтеротоксин, альфа-гемолизин и колицинь КЭ9+ втаммы - СТа энтеротоксин, в больиинства случаав колицины капсульный А-антиген.

■таммы. обеих групп обладают маннозорезистентной .гемагглютинадо ей, характеризуются множественной лекарственной устойчивостью, вир1 лентны для лабораторных животных.

К88+ нтаммы E.coli, в отличие от К99+ итаммов. в течение пег вых суток сбраживают глицерин и не сбраживают сахарозу.

2. Гены итаммов энерихий, кодирующие синтез антигенов адгези К88 и К99, локализованы на плазмидных репликонах и могут быть сцеп лены с детерминантами сбраживания углеводов (р'афинозы) и устойчивое ти к антибиотикам (хлорамфениколу, тетрациклину, стрептомицину] К88+ и К99+- признаки переносятся среди втаммов эиерихий при помо« конъюгации. Более высоким потенциалом передачи признака синтеза ан тигена адгезии обладают К88-позитивные зиерихии, нежели нтамь E.coli(K99+). Клинические К88+ и К99+ втаммы эиерихий полиплаз мидны.

3. На основе жтамма С600 при помощи конъюгационного скрещивани получены моноплазмидные втаммы Pill и РС1. синтезирующие соответст венно К88 и К99 антигены. Втамм Pill содержит неконъюгативную плазми ду рРЫ1 молекулярной массой 50 HD, итамм РС1 - конъюгативную плазми ду рРС1 молекулярной массой более 20 HD.

4. Плазмида рРМ1 кодирует синтез антигена адгезии К88ас и спо собность утилизировать рафинозу и мобилизуется на перенос плазмидам Rl, R100, pSU212::Tnl0, F^s 1ас::Тп10 и R6K, относящимися к различ ным группам несовместимости плазмид E.coli и образующими полноценны половые пили. Плазмида рРМ1 интерферирует с другими плазмидами: одной стороны, увеличивает образование альфа-гемолизина, кодируемог плазмидой pSÜ212::Tnl0. с другой стороны, сама подвергается феноти

пической репрессии или элиминации со стороны других плазмид. например, плазмид Ri24 и R40a. При скрещивании этанма РН1 с реципиентными клетками эзерихий среди трансконъагантов, отобранных по Raf+ признаку. обнаруживаются клоны с фенотипом Raf+ К88 + и Raf+K88~ .

5. С помощью эндонуклеазы Hindi II в составе векторной плазыиды PBR322 осуществлено молекулярное клонирование структурных генов, ответственных за синтез антигена К88. Получены рекомбинантные плазыиды pFF20 и pFFi201 молекулярной массой соответственно 10,5 и 7.1 MD. С помощью эндонуклеаз HindiII. BaaHl и EcoRl для указанных плазмид построены физические карты. Остановлено, что К88 ген локализован на HindIII фрагменте ДНК размером не более 4,5 MD.

6. На космидном векторе рНС79 при помощи рестриктазы ВашН1 из клинического штамма СА124, выделенного на территории Казахстана от больного диареей теленка, клонированы структурные гены, ответственные за синтез антигена К99. Для К99 рекомбинантной плазмиды pLK-2, имеющей сайты рестрикции для эндонуклеаз BaaHl, Bgl II, PvuII, Xnall.'Kpnl, EcoRU и Sal61, построена физическая карта. Установлено, что детерминанта антигена К99 локализована на ВанШ фрагменте ДНК величиной не болеё 4,0 MB.

7. С помощью моноплазмидных К88+ и К99+ штаммов эшерихий РМ1 и PCI, а также итамма НВ101, несущего рекомбинантную плазмиду pFF20, разработаны лабораторные и промышленные способы получения диагностических агглютинирующих сывороток на К88 и К99 антигены.

8. Генетическими и генно-инженерными методами сконструированы изогенные штаммы эшерихий, синтезирующие как отдельные факторы па-тогенности (K88+,,Eni + , К99Н1у+), так . и их сочетания (К88 + Ent+ : К88+ Ent +Н1у + ).

В опытах на лабораторных животных установлено, что наиболее выраженными протективными свойствами при экспериментальной колиинфек-ции обладают итамни-продуценты антигенов адгезии К88 и К99, а также очищошшо препараты антигена К88. При иммунизации лабораторных жи-

вотных нтаммаыи продуцентами антигенов адгезии и препаратами антигена К88 коэффициент защиты от экспериментальной колиинфекции составлял 2,4 - 9,0.

9. Среди клинических итаммов эиерихий, выделенных от телят с ди-арейным синдромом, обнаружен новый термозависимый антиген адгезии, вызывающий ыаннозорезистентную агглютинацию- эритроцитов морской свинки и отличающийся по иммунохимическим свойствам от антигенов К88, К99 и 987Р. К обнаруженному антигену, обозначенному как А20. получены специфические агглютинирующие и преципитирующие сыворотки.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ И РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПаБЛИКОВАНН В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1.A.С. 1385339 СССР. Способ получения эиерихиозной агглютинирующей К88 сыворотки /Попов Е.И., Светоч З.А., Тугаринов O.A., Малахов Ю.А. и др.

2. A.C. 1277459 СССР. Способ получения агглютинирующей анти-К88 сыворотки / Светоч Э.А., Попов Е.И., Тугаринов O.A., Малахов Ю.А. и ДР.

3. A.C. 1405147 СССР. Способ получения агглютинирующей анти-К99 сыворотки /Светоч З.А., Вулюпин O.K., Попов Е.И., Тугаринов O.A. и ДР.

4. A.C. 1515685 СССР. Мтамм бактерий Escherichia coli - продуцент адгезивного антигена К99 /Тугаринов O.A.. Пирожков М.К., Малахов Ю.А.. Попов Е.И., Светоч З.А.

5. A.C. 1412069 СССР. Способ получения эжерихиозной агглютинирующей К99 сыворотки /Попов Е.И.. Светоч 3.А., Тугаринов O.A.. Малахов Ю.А. и др.

6. A.C. 1515684 СССР. Итамм бактерий Escherichia coli - продуцент адгезивного антигена К88 /Тугаринов O.A., Пирожков М.К., Малахов Ю.А., Попов Е.И., Светоч Э.А.

7. А.С 1597727 СССР. Способ отбора штаммов Escherichia со 1i -продуцентов антигена К88 /Торский С.П.. Баннов В.А.. Светоч Э.А., Попов Е.И.. Тугаринов О.А.

8. Попов Е.И., Светоч Э.А., Павлов В.М. и др. Конструирование штаммов Escherichia coli, продуцирующих К88 антиген //Биотехнология.

- 1989. - Т.5, N 1. - С. 9-14. •

9. Светоч З.А., Попов Е;И., Черепанов П.А. и др. Молекулярное клонирование детерминант, контролирующих синтез антигенов адгезии кияечной палочки и перспективы их использования в практике приготовления диагностических препаратов //Натер. Всес. конф. "Генная и клеточная инженерия в решении'фундаментальных проблем биологии", Тар-ту-Кязрику, 20-22 сент. 1988 г. - Тарту. 1989. - С. 184-188.

10. Попов Е.И., Светоч З.А., Гусев В.В. и др. Изучение протектив-ных свойств факторов патогенности зшерихий при экспериментальной ко-лиинфекции //Сб. Материалы Всес. конф. "Эпизоотология, эпидемиология, средства диагностики, терапии и специфической профилактики инфекционных болезней, общих для человека и животных". - Львов, 1988.

- С. 365.

11. Тугаринов,О.А., Светоч З.А., Попов Е.И. и др. Разработка методических подходов к изготовлении диагностических агглютинирующих эверихиозных К88 и К99 сывороток //Там же, С. 370.

12. Светоч Э.А., Попов Е.Й.. Кулешова Т.И. и др. Изучение транс-миссивности плазмид,' кодирующих синтез антигена К99 у эшерихий //Сб. Молекул.- биология и генетика плазмид. - Пущино, 1986. - С.51.

13. Гаффаров Х.З., Спиридонов Г.Н., Гусев В.В., Светоч З.А., Попов Е.И. Изыскание специфических средств диагностики и профилактики колибактериоза телят в условиях промышленных комплексов Татарской ССР //Сб. Совершенствование методов государственного контроля ветеринарных препаратов. - Москва. 1991. - С. 208-209.

J4. Попов Е.И., Светоч Э.А. Новый антиген адгезии эшерихий -возбудителей колидиарей телят //'Гам же, С. 210-211.

15. Eusev U.U.. Svetoch Е.А., Shulyupin O.K.. Popov E.l. Specific diagnosis of intestinal infections. //In: International Conference on Medical Biotechnology. Innunizatlon and AIDS. June 12-18. 1991. Hotel Leningrad, Leningrad. USSR., June 12-18, 1991. P2-19.

НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКАЯ ДОКУМЕНТАЦИЯ

- временное наставление по применении агглютинирующих сывороток к адгезивным антигенам эиерихий К88., К99, 987Р, F41 и А20. Утверяде-но ГНВ Государственного агропромышленного комитета СССР.

- технические условия "Сыворотки агглютинирующие эшерихиозные" ТУоп 64-15-109-89. Утверждены ГУ "Биопрепарат".-'

- временная инструкция по изготовлению и контролю сывороток агглютинирующих эшерихиозных. Утверждена директором ВНИИПМ. .

- методические указания по бактериологической диагностике коли-бактериоза (знерихиоза) животных. Утверждены к применению ГУВ МСХП СССР, 1991 г.

Набор текста автореферата и его форматирование осуществлено при помощи редактора LEXICON версия 8.92 на персональном компьютере.