Биологически активные вторичные метаболиты-пептиды, образуемые термофильными штаммами бацилл

Темиров, Юрий Витальевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биологически активные вторичные метаболиты-пептиды, образуемые термофильными штаммами бацилл
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биологически активные вторичные метаболиты-пептиды, образуемые термофильными штаммами бацилл"

На правахрукописи

ТЕМИРОВ ЮРИЙ ВИТАЛЬЕВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВТОРИЧНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ-ПЕПТИДЫ, ОБРАЗУЕМЫЕ ТЕРМОФИЛЬНЫМИ ШТАММАМИ БАЦИЛЛ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Пущино, 2004 г.

Работа выполнена в лаборатории организации белковых структур филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Ю.Б. Ал ахов

кандидат химических наук Л.М. Винокуров.

Официальные оппоненты: доктор химических наук Ю.Н. Уткин,

кандидат биологических наук М.В. Донова.

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Защита состоится « 10 » НОЯБРЯ_ 2004 г. 42 2ы а заседании

Специализированного совета Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А Овчинникова РАН.

Автореферат разослан _£_ ОКП^ЯЕРЛ . 2004 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета доктор химических наук

¿GOb-f //////

Характеристика работы

Актуальность проблемы. Поиск и изучение новых природных биологически активных веществ остаётся одним из важных направлений современной биологии и биотехнологии. Из многих вторичных метаболитов, образуемых микроорганизмами, наибольшее практическое значение по-прежнему имеют антибиотики, широко применяемые в медицине. В то же время распространение антибиотикорезистентных форм микроорганизмов ограничивает эффективность традиционных антибиотических препаратов и требует разработки новых. В связи с этим всё большее внимание привлекают к себе низкомолекулярные пептиды, в том числе природного происхождения, нередко обладающие высокой антибактериальной, антифунгальной и противовирусной активностью. Микроорганизмы, населяющие биотопы с экстремальными условиями (высокой температурой, солёностью, сильнокислой или щелочной средой), могут оказаться источником необычных по структуре и свойствам метаболитов. Однако сведения о продукции экстремофильными бактериями и, в частности, термофилами, биологически активных низкомолекулярных соединений - антибиотиков, сидерофоров и компонентов сигнальных систем (феромонов) - к настоящему времени весьма немногочисленны, а сам вторичный метаболизм термофильных прокариот до сих пор остаётся малоизученным. Таким образом, весьма интересной научной и актуальной практической задачей является комплексное исследование термофильных и терморезистентных бактерий как продуцентов низкомолекулярных пептидных метаболитов, выделение и анализ этих соединений, а в перспективе — установление генетических и биохимических механизмов их биосинтеза и закономерностей его регуляции, изучение взаимодействия путей первичного и вторичного метаболизма у прокариот-экстремофилов.

Цель и задачи исследования. Представленная работа имела целью поиск, выделение, изучение свойств и установление структуры биологически активных вторичных метаболитов-пептидов — антибиотиков и сидерофоров, образуемых термофильными (терморезистентными) бактериями из рода Bacillus. В ходе исследования решались следующие задачи:

1) скрининг штаммов бактерий-термофилов для выявления среди них продуцентов антибактериальных соединений и хелаторов железа (сидерофоров);

2) идентификация штаммов-продуцентов;

3) изучение условий образования ими вторичных метаболитов;

4) очистка (в том числе в препаративных масштабах) пептидных антибиотиков и сидерофоров, образуемых термофильными бациллами, изучение свойств этих соединений;

1 CUC. НАЦИОНАЛЫ!Alt I

Б»бЛИ0ТеКА ]

5) определение активности выделенных антибиотиков в отношении различных видов микроорганизмов;

6) установление структуры изучаемых пептидных метаболитов с использованием современных методов анализа.

Научная новизна и практическая ценность работы. Обнаружено, что ряд терморезистентных штаммов, идентифицированных как Bacillus licheniformis, образуют секретируемые антибиотики, подавляющие рост широкого круга грамположительных микроорганизмов. Разработан подход к выделению комплекса антибиотических метаболитов, продуцируемых штаммами В. licheniformis VK2 и VK21 при росте на различных углеродных и азотных субстратах. Изучена активность трёх антибиотиков штамма VK21 в отношении ряда бактерий, в том числе условно патогенных Staphylococcus aureus и Micrococcus luteus, установлен синергический эффект при совместном действии этих веществ. Анализ выделенных соединений показал, что они являются низкомолекулярными катионными пептидами, обогащены гидрофобными аминокислотами и, скорее всего, относятся к бактериоцинам, а не к продуктам внерибосомного пептидного синтеза. Определение N-концевой последовательности одного из бактериоцинов, VK21-A, не выявило его сходства с какими-либо ранее описанными антибактериальными пептидами бацилл. Изучение структуры и свойств выделенных антибиотиков является важным для последующего определения их практической ценности, в том числе возможности фармакологического использования этих соединений. Установлено, что термофильные бациллы способны к продукции сидерофоров при росте в условиях дефицита растворимого железа, а у В. licheniformis VK2 и VK21 наличие в среде марганца индуцирует три процесса: споруляцию, образование бактериоцинов и биосинтез катехольных соединений. Сидерофор, образуемый штаммом VK21, был выделен и идентифицирован как 2,3-дигидроксибензоил-глицил-треонин; сходный с ним метаболит известен у мезофильного вида В. subtilis, родственного В. licheniformis. Полученные результаты позволяют сделать вывод о перспективности поиска новых ценных природных соединений в экологической группе термофильных микроорганизмов, ранее практически не являвшейся объектом подобных исследований.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на XIII и XIV зимней международной молодёжной научной школе (Институт биоорганической химии РАН, Москва, 2001 и 2002 г.г.), на 5-й Пущинской конференции молодых учёных (2001 г.) и на отчётных конференциях филиала Института биоорганической химии РАН (1999 - 2004 г.г).

Структура и объём диссертации. Работа изложена на 144 страницах печатного текста (редактор Word, шрифт Times New Roman, кегль 12, интервал

1.5), включает в себя введение, обзор литературы, экспериментальную часть, объединяющую разделы «Материалы и методы» и «Результаты и обсуждение», выводы и список литературы из 334 ссылок. Диссертация содержит 18 таблиц и 24 рисунка.

Объекты и методы исследования

Бактериальные штаммы с обозначениями VK1, VK2, VK3, VK4, VK5, VK6, VK19 были предоставлены лабораторией биотехнологии Института биоорганической химии (ИБХ, Москва); VK17 и VK21 - группой молекулярной биологии Института белка (Пущино); штамм В2101 и штаммы В. megaterium VKM41, Bacillus licheniformis B431, В432, В433 и Micrococcus luteus B1314 -отделом Всесоюзной коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ, Пущино); штаммы Escherichia coli C600 и Agrobacterium tumefaciens A281 - лабораторией биотехнологии растений филиала ИБХ (Пущино); Pseudomonasputida 1-97, P. aeruginosa PAO1, Rhodococcus sp. SSI - лабораторией биологии плазмид ИБФМ; штаммы Mycobacterium smegmatis 1171 и М. phlei 1291 - лабораторией микробиологической трансформации органических соединений ИБФМ, штамм Staphylococcus aureus 209P - кафедрой микробиологии Кубанской медицинской академии (Краснодар); штаммы В. subtilis 1621, В. pumilus 2001, В. amylolyquefaciens I - Институтом пушного звероводства и кролиководства (Москва).

Условия культивирования. Мезофильные бактерии выращивали на полноценных средах с оптимальным составом при температутре 30°С или 37°С. Термофильные и терморезистентные штаммы культивировали: в ходе тестирования их антибактериальной активности - на полноценной среде Луриа-Бертани и на минимальной солевой среде на основе фосфатного буфера (рН 7.3) с казаминовыми кислотами и сахарозой при 45°С или 55°С; в ходе изучения условий образования пептидных метаболитов и для их выделения - при 45°С. Для выявления продукции метаболитов, связывающих железо, использовали минимальную среду, содержащую краситель хром-азурол S (CAS).

Идентификацию термофильных штаммов по совокупности физиолого-биохимических признаков проводили, используя стандартные диагностические среды и методики, описанные в руководствах [Практикум по микробиологии (под ред. Н.С. Егорова), 1976; Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 1994].

Антибактериальные свойства термофильных штаммов определяли методами агаровых блоков и штриховых посевов в соответствии с руководством [Практикум по микробиологии (под ред. Н.С. Егорова), 1976]. Блоки диаметром 9 мм, вырезанные из агаризованной среды с суточной культурой бактерий-термофилов, помещали в углубления в агаре с клетками мезофильного

тест-микроорганизма (2-5* 105 в 1 мл); чашки инкубировали при оптимальной для тестерных бактерий температуре до формирования плотного газона. Штриховой посев тест-микроорганизмов делали после 24 ч. роста терморезистентных штаммов-продуцентов на чашках.

Антибиотическую активность образцов культуральной жидкости, продуктов её ферментативной обработки и фракций, полученных на этапах выделения антибиотиков, определяли стандартным методом диффузии в агаризованную среду, содержащую клетки соответствующего тестерного штамма. При тестировании образцов в 96-луночных плашках опытные пробы содержали по 60 мкл ростовой среды, 12 мкл суспензии экспоненциальной культуры тест-бактерий и до 120 мкл смеси минимальной ростовой среды с культуральной жидкостью в разном количестве. Каждый вариант теста ставился в трёх повторностях. Средние значения оптической плотности каждой серии и их стандартное отклонение (SD) вычисляли с помощью программы Microsoft Excel.

Бактериолитическую активность супернатантов культур Bacillus licheniformis VK2 и VK21 и их фракций после ацетонового осаждения определяли в 96-луночных плашках; каждая проба содержала по 60 мкл суспензии живых либо прогретых (95°С, 15 мин.) бактериальных клеток и соответствующие аликвоты тестируемых образцов. Каждый вариант теста ставился в трёх повторностях. Плашки инкубировали в течение 30 мин. при 37°С (в термостате, без перемешивания), измеряя перед этим оптическую плотность (при Я,=630 нм) в лунках с контрольными пробами относительно пробы с оптическим стандартом, а после выдерживания - плотность во всех лунках, определяя изменение её значений в опытных образцах относительно контрольных. Средние значения оптической плотности в каждой серии и их стандартное отклонение (SD) вычисляли с помощью программы Microsoft Excel.

Для ферментативной обработки антибиотически активных бутанольных экстрактов штаммов В. lichemiformis VK2 и VK21 к высушенным образцам, растворённым в 10 мМ Трис-HCl буфере (рН 7.8), добавляли растворы трипсина, химотрипсина (Calbiochem, Англия) и проназы (Serva, Германия) до конечной концентрации белка 1 мг/мл. Смеси инкубировали при 37°С, через 3, 6 и 9 ч. из них отбирали аликвоты по 100 мкл для определения антибактериальной активности методом диффузии в агар. Перед тестированием пробы прогревали 5 мин при 80°С для полной инактивации ферментов. В качестве контрольных использовали пробы, не содержащие ферментов и обработанные аналогичным образом, а также исходные образцы экстрагированных веществ.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) при

выделении антибиотиков проводили на обращено-фазовом носителе в системе буферных растворов: 30%-й ацетонитрил в 30 мМ ацетате аммония, рН 5.6

(стартовый) - 80%-й ацетонитрил в 30 мМ ацетате аммония (элюирующий), концентрация которого линейно возрастала на 2% в минуту при скорости потока 4 мл/мин. При выделении сидерофора ВЭЖХ проводили в градиенте концентрации метанола в 0.1%-й ТФУ при скорости потока 5 мл/мин, в режиме: 30-45% метанола в течение 15 мин., далее до 65% в течение 60 мин.

Минимальные ингибирующие концентрации (MIC) антибиотических пептидов VK21-A, VK21-B и VK21-C определяли тестированием в 96-луночных плашках серий двукратных разведений растворов веществ в 20%-м метаноле. Каждый вариант теста ставился в четырёх повторностях. За MIC антибиотика для данного штамма принимали ту величину, при которой отмечалась задержка роста бактерий (10% и более) по сравнению с контрольными лунками (содержали 20%-й метанол) при сопоставлении средних значений оптической плотности во всей серии проб.

Тесты с CAS-реактивом на наличие веществ, связывающих ионы Fe3+, проводили, как описано в работе [Anal. Biochem. 1987. V. 160 (1). P. 47 - 56]. Реактив содержал 150 мкМ хром-азурола S, 15 мкМ FeCb и 600 мкМ цетавлона, растворённых в 0.5 М буфере шшеразин-НС1, рН 5.6.

При тонкослойной хроматографии (ТСХ) для проявления пептидных соединений использовали свободный хлор (продукт реакции НС1 с КМпО4) с последующей обработкой пластинок раствором смеси крахмала и KJ (по 1%), а для окрашивания катехолов - свежеприготовленную смесь (1:1) 1%-х растворов цитрата железа-аммония и гексаферроцианида (III) калия.

Для колориметрического измерения концентрации катехольных соединений в культуральной жидкости использовали реакцию с цитратом железа-аммония и 1,10 фенантролином [Anal. Biochem. 1983. V. 133 (1). P. 163 - 169]. Поглощение проб измеряли при длине волны 510 нм на спектрофотометре Ocean Optics с программным пакетом OOI Base (США). В качестве стандарта для построения калибровочных графиков и определения молярного коэффициента экстинкции использовали 2,3-дигидроксибензойную кислоту (Fluka, Швейцария).

Биологический тест сидерофора на восстановление им роста клеток штамма-продуцента проводили методом диффузии в агар. В чашку Петри заливали 10 мл агаризованной минимальной среды, содержащей 300 мкг/мл этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) и 2-4*106/мл клеток штамма В. lichemiformis VK21. Раствор сидерофора SVK2I ДЛЯ теста готовили в 20 мМ калий-фосфатном буфере (рН 6.5). В лунки наносили проверяемые образцы объёмом по 50 мкл. Чашки инкубировали при 45°С. Функциональную активность железосвязывающих метаболитов выявляли по наличию роста бактерий в зонах вокруг лунок.

Результаты и их обсуждение

Штаммы бактерий-термофилов и образование ими метаболитов с антибиотическими свойствами.

Штаммы облигатно-термофильных и терморезистентных бактерий из коллекции лаборатории организации белковых структур филиала Института биоорганической химии РАН первоначально были охарактеризованы по их основным характеристикам: морфологии клеток, типу клеточной стенки (Грам-тест), способности к образованию спор, отношению к кислороду, оксидазной и каталазной активности; также был изучен рост этих бактерий при различной температуре (табл. 1). Полученные результаты позволили с полной определённостью отнести терморезистентные штаммы VK2, VK21, VK17, VK19, В2101 и облигатно-термофильные штаммы VK1 и VK4 к роду Bacillus, многие представители которого образуют антибактериальные метаболиты; для выявления возможных продуцентов антибиотиков все они были тестированы на антимикробную активность в отношении различных видов бактерий. При скрининге, проведённом методом агаровых дисков с выращиванием термофилов в толще полноценной агаризованной среды при 55°С, восемь штаммов терморезистентных бацилл подавляли рост грамположительных бактерий, но не проявляли активности в отношении грамотрицательных тест-штаммов (табл. 2). Антибиотически активные штаммы Bacillus spp. VK2, VK21, VK17, VK19, В2101 и В. licheniformis B431 были тестированы также методом перпендикулярных штрихов при росте на агаризованной минимальной среде с казаминовыми кислотами и сахарозой. В этом варианте бациллы показывали те же антимикробные свойства, хотя и менее выраженные. В итоге два наиболее активных штамма - Bacillus spp. VK2 и VK21 - были отобраны для изучения образуемых ими антибактериальных продуктов. Видовую принадлежность всех терморезистентных бацилл - продуцентов антибиотиков - определяли с помощью стандартных физиолого-биохимических тестов (табл. 3). По совокупности полученных результатов штаммы VK2, VK21, VK17 и В2101 были отнесены к виду В. licheniformis, а отличавшийся от них штамм VK19 - предположительно к В. subtilis.

Закономерности продукции антибиотиков при различных условиях культивирования штаммов-продуцентов.

В предварительных экспериментах штаммы В. licheniformis VK2 и VK21 выращивали в пробирках с жидкой минимальной средой на основе фосфатного буфера (рН 7.3), содержащей различные источники азота и углерода (табл. 4); отмечали особенности роста бактерий, уровень антибактериальной активности в супернатантах их культур и образование ими эндоспор после 24 ч. культивирования. При росте на сахарозе без добавления микроэлементов оба штамма

Основные характеристики термофильных и терморезистентных штаммов бактерий, использованных в работе

Штаммы Грам-тест Споры Анаэробный рост Оксидаза Каталаза Рост при температуре

30° 45° 50° 60° 65°

УК1 + + - + - - - + + +

УК2 + + + + + + + + + -

УК3 + - - + - - - + + +

УК4 + + - + + - - + + +

УК5 - + - + + - - + + +

УК6 + + - + - - - + + +

УК19 + + + , слабый + + + + + + -

УК17 + + + + + + + + + -

УК21 + + + + + + + + + -

В2101 + + + + + + + + + -

БасШш licheniformis В431* + + + + + + + + + -

БасШт licheniformis В432* + + + + + + + + + -

БасШш licheniformis В433* + + + + + + + + + -

АУказанные штаммы использовали в качестве контрольных.

ограниченно использовали аммонийный и нитратный азот, хотя активность в этих культурах была неожиданно высокой, сравнимой с активностью бактерий, выращенных на сахарозе с казаминовыми кислотами в качестве азотного субстрата (табл. 4). Эффект стимуляции биосинтеза вторичных метаболитов у

микроорганизмов в условиях лимита по основным элементам питания - углероду, фосфору и особенно азоту - хорошо известен, хотя механизмы этого явления во многом остаются неясными до сих пор. Рост продуцентов на казаминовых кислотах при замене сахарозы на глицерин был весьма слабым; антибиотически активной при этом была только культуральная жидкость штамма "УК21 после 24 ч. культивирования. В культурах штаммов УК2 и УК21 на гидролизате казеина антибиотические продукты отсутствовали. Уровень активности в ранних стационарных культурах (8 ч.) на ацетате и цитрате был относительно высоким у В. tichemformis УК21 и довольно низким - у штамма УК2. Было также отмечено, что при выращивании на углеводных субстратах бактерии-продуценты почти не образовывали спор, тогда как рост на ацетате сопровождался споруляцией у обоих штаммов, на цитрате же более активное спорообразование наблюдалось у штамма УК2.

Таблица 2

Антагонистические свойства терморезистентных штаммов

Тест-бактерии Зоны подавления роста1*

VK2 VK21 В2101 VK17 VK19 В431 В432 В433

Escherichia coli С600 - - - - - - -

Pseudomonas putida 1-97 + +/- +/- +/- - - - -

P. aeruginosa PAO1 - - - - - - - -

Agrobacterium tumefaciens A281 - - - - - - нд -

Bacillus megaterium VKM41 ++ ++ ++ ++ - + - +/-

Rhodococcus sp. SSI + +/- + + ++ + + +

Micrococcus luteus В1314 ++ ++ ++ ++ - ++ нд ++

"Термофильные бактерии культивировали в толще агаризованной среды Луриа-Бертани при 55°С в течение суток. (++) - диаметр зоны лизиса больше 15 мм; (+) - от 13 до 15 мм; (+/-) - меньше 13 мм; (-) - зона лизиса отсутствует; (нд) - тест не проводили.

Идентификация терморезистентных штаммов - продуцентов антибиотиков

Штаммы

Виды тестов УК2 УК21 УК17 УК19 В2101 БасШт licheniformis В433*

Образование кислоты из Б-глюкозы + + + + + +

Ь-арабинозы + + + + + +

Б-ксилозы + + + + + +

Б-маннитола + + + + + +

Гидролиз крахмала + + + + + +

желатина слабо слабо слабо + слабо слабо

казеина + + + + +

Рост на 5% ШС1 + + + + + +

7%ШС1 + + + + + +

10%ШС1 + + + + + +

Восстановление ЩУ до N0," + + + + + +

Утилизация цитрата + + + + + +

пропионата + + + - + +

Реакция Фогеса-Проскауэра (У-Р) + + + + + +

рН культуры в реакции У-Р >6 >6 >6 >6 >6 >6

"Штамм использовали в качестве контрольного

Для нормального формирования бациллами эндоспор необходимы двухвалентные катионы, в особенности Мп2+. Добавление в среду сульфата марганца (60 мкМ) способствовало интенсивному росту В. Ис1чет/огт1$ УК2 и УК21 насреде с (N114)2804 и КЫОз, но на уровень продукции ими антибиотиков в этих условиях существенно не влияло. Споруляция в присутствии Мпг+ была отмечена в культуре штамма УК21 на нитратном азоте (5 -10%); у В. licheniformis УК2 в этих условиях споры не обнаруживались, а на аммонийном азоте оба

Уровень роста (А«<ь O.e.) и антибактериальной активности (диаметр зон подавления роста тест-штамма, мм) супернатантов культур Bacillus licheniformis VK2 и VK21 в минимальной среде без добавления микроэлементов

Источники азота / Штамм VK2 Штамм VK21

8 ч. 24 ч. 8 ч. 24 ч.

рост активность рост активность рост активность рост активность

Казаминовые кислоты / сахароза 2,29 12,75 2,01 12,75 2,18 16,08 2,09 13,58

Гидролизат казеина / сахароза 2,00 н/а** 1,72 н/а 1,80 н/а 1,10 н/а

/сахароза 0,84 15,50 1,52 15,75 0,88 17,00 1,40 16,5

КЖ)з / сахароза 0,34 13,75 0,84 16,13 0,46 н/а 0,69 15,75

Казаминовые кислоты / глицерин 0,68 н/а 0,70 н/а 0,66 н/а 0,76 14,25

Казаминовые кислоты / ацетат 0,92 12,25 2,12 14,75 1,24 16,50 1,24 14,75

Казаминовые кислоты / цитрат 2,04 9,00 1,30 9,75 1,60 17,25 0,96 13,00

♦Основной состав среды (г/л): К2НР04'ЗН20 - 3; КН2Р04 - 1; КС1 - &fgS(2-7P2© -о°-б pH 3.3;л я л и (г/л): казаминовые кислоты (Difco) - 1.5; гидролизат казеина (Sigma) - 1.5; сахарозу - 4; глицерин - 4.3; ацетат калия (безводный) -6.93; цитрат калия (дигидрат) - 7.35. Антибиотический тест культуральной жидкости проводили методом диффузии в агар с клетками Bacillus megaterium VKM41. По обоим параметрам приведены усреднённые данные из двух независимых экспериментов; стандартное отклонение (SD) во всех случаях не превышало 0.05. ** (н/а) - нет активности.

Уровень роста (Аюо» О-в.) и антибактериальной активности (диаметр зон подавления роста тест-штамма, мм) супернатантов культур Bacillus licheniformis VK2 и VK21 при выращивании в минимальной среде с добавлением 60 мкМ MnS04

Источники азота / Штамм VK2 Штамм VK21

углерода* 8 ч. 24 ч. 8 ч. 24 ч.

рост активность рост активность рост активность рост активность

Казаминовые кислоты / сахароза 2,11 14,75 2,12 14,08 2,70 17,38 1,83 13,58

Гидролизат казеина / сахароза 3,84 17,50 3,12 14,75 2,80 17,00 2,70 12,50

(N114)2804 / сахароза 4,04 15,75 2,80 17,25 2,40 18,50 2,24 18,00

/сахароза 0,91 17,25 2,36 16,25 0,80 11,00 1,27 14,75

Казаминовые кислоты / глицерин 2,08 15,00 2,00 14,00 1,24 10,5 2,16 13,50

Казаминовые кислоты / ацетат 1,68 9,00 2,24 11,25 1,36 17,00 1,78 14,50

Казаминовые кислоты / цитрат 2,36 11,75 1,90 12,00 2,32 17,25 1,04 11,75

*Состав сред и метод теста антибиотической активности соответствуют указанным в табл. 4. По обоим параметрам приведены усреднённые данные из двух независимых экспериментов; стандартное отклонение ^Б) во всех случаях не превышало 0.05.

продуцента практически не образовывали спор после 24 ч. культивирования с марганцем. В то же время в средах, содержащих глицерин с казаминовыми кислотами и сахарозу с гидролизатом казеина, наличие марганца не только усиливало рост бактерий, но и стимулировало продукцию ими антибактериальных метаболитов (табл. 4 и 5) и спорогенез. Последний эффект также был отмечен в культурах штаммов-продуцентов на сахарозе с казаминовыми кислотами: при культивировании на этих субстратах в присутствии марганца уровень споруляции возрастал примерно на порядок (табл. 6). В культурах с ацетатом и цитратом спорообразование происходило достаточно интенсивно вне зависимости от добавления в среду.

Активация биосинтеза некоторых антибиотиков у бацилл тесно связана с начальными этапами дифференцировки бактериальных клеток, в завершение которой формируется зрелая эндоспора. Культуры В. tichemformis УК2 и УК21 в среде с сахарозой и казаминовыми кислотами показали наибольшее сходство между собой по интенсивности роста и уровню антибактериальной активности, причём значения обоих этих параметров были достаточно высоки как при отсутствии МпБО^, так и при его добавлении в среду. Однако ионы марганца в таких условиях явно стимулировали спорообразование у обоих штаммов. Была дополнительно изучена корреляция между ростом бактерий на указанных субстратах (в колбах) и образованием ими антибиотиков. Без марганца активность

Таблица 6

Относительное содержание зрелых спор в суточных культурах штаммов Bacillus licheniformis VK2 и VK21 в минимальной среде с казаминовыми кислотами и сахарозой, содержащей и не содержащей марганец

Содержание эндоспор, % от общего числа клеток*

№ опыта Штамм VK2 Штамм VK21

без MnSO4 + 60 мкМ MnSO4 без MnSO4 + 60 мкМ MnSO4

1 1,9 9,0 1,0 10,0

2 1,3 25,0 1,4 12,0

"Определяли сравнением числа колоний, выросших в посевах разведённых суспензий суточных культур бацилл, исходно прогретых (15 мин. при 95°С) и не подвергавшихся прогреву. Приведены усреднённые данные из трёх подсчётов.

супернатантов культур продуцентов достигала максимального уровня в начале стационарной фазы роста и далее на её протяжении оставалась практически неизменной (рис. 1, А, Б). Количество спор после суток культивирования не превышало в этом случае 1 - 3%. Добавление M11SO4 не оказывало выраженного влияния на характер роста бактерий, но существенно изменяло динамику антибиотической активности в их культурах: содержание активных метаболитов в культуральной жидкости достигало выраженного максимума при переходе продуцентов к стационарной фазе роста. В ходе созревания спор уровень активности постепенно снижался (рис. 1, В, Г), значительно уменьшаясь к периоду массового появления в культурах спорующихся клеток. После 24 ч. роста в этих условиях культуры обоих штаммов-продуцентов содержали 50 - 60% зрелых спор.

Определение бактериолитических свойств штаммов В. licheniformis VK2 и VK21.

Антибактериальная активность некоторых бактерий, в том числе термофильных, нередко обусловлена продукцией ими комплекса ферментов, лизирующих стенки живых клеток других видов микроорганизмов. Супернатанты культур В. licheniformis VK2 и VK21, выращенных без добавления M11SO4 до начала стационарной фазы роста, были тестированы на литические и антибиотические свойства в отношении грамположительных и грамотри-цательных бактерий. Живые и прогретые (95°С, 20 мин.) суспензии клеток тест-микроорганизмов инкубировали с образцами культуральной жидкости; о степени лизиса судили по изменению оптической плотности проб в сравнении с контрольными. Было установлено, что ни живые, ни убитые прогревом клетки Micrococcus luteus не лизировались супернатантами культур термофильных бацилл, а клетки Bacillus megaterium лишь в малой степени подвергались лизису культуральной жидкостью штамма VK21, но не VK2 (рис. 2, А, Б). В то же время культуральная жидкость штамма VK21 при тестировании её антибиотической активности эффективно подавляла рост микрококка и немногим слабее - рост В. megaterium (рис. 2, В). Супернатант культуры В. licheniformis VK2 также оказывал антибиотическое действие на эти бактерии, хотя его ингибирующая концентрация была более высокой (рис. 2, В). С другой стороны, прогретые клетки грамотрицательных штаммов, Pseudomonas putida 1-97 и Escherichia coli С600, активно лизировались пробами культуральной жидкости продуцентов, тогда как на рост живых культур этих бактерий она не влияла (данные не приведены). Полученные результаты показали, что исследуемые термофильные бациллы действительно секретируют ферменты, гидролизующие компоненты бактериальных клеток, однако антагонистические свойства штаммов в основном обусловлены продукцией ими антибиотических метаболитов.

Рис. 1. Динамика роста (А620) и образования активных продуктов в культурах Bacillus licheniformis VK2 (А, В) и VK21 (Б, Г) в минимальной среде без микроэлементов (I) и в среде с добавлением 60 мкМ MnSO4 (II). Приведены усреднённые данные из трёх независимых экспериментов, г2 - квадрат радиуса зон подавления роста тест-штамма Bacillus megaterium VKM41.

Рис. 2. Результаты определения литической активности супернатантов культур Bacillus licheniformis VK2 (А) и VK21 (Б) в отношении грамположительных тест-бактерий; (В) — подавление роста этих же бактерий культуральной жидкостью штаммов-продуцентов. В литическом тесте: К - контрольные пробы (суспензии живых или прогретых клеток в минимальной ростовой среде); в опытные пробы вносили культуральную жидкость до: 1 - 2.5%; 2 - 5%; 3 - 10%; 4 -20% от общего объёма (120 мкл). В антибиотическом тесте: К - 0% культуральной жидкости; 1 - 1.25%; 2 - 2.5%; 3 - 5%; 4 - 10%; 5 -20% от общего объёма пробы (120 мкл). Тесты и измерение оптической плотности проводили в стандартных 96-луночных плашках. Значения стандартного отклонения (SD) во всех случаях не превышали 0.05.

Анализ супернатантов культур и выделение индивидуальных антибиотиков.

Антибактериальные продукты В. licheniformis VK2 и VK21 выделяли из концентрированных супернатантов их культур в среде с казаминовыми кислотами и сахарозой (как без марганца, так и с добавлением 60 мкМ MnS04), снятых в начале стационарной фазы роста. После однократной экстракции н-бутанолом антибиотические метаболиты полностью переходили в органическую фазу, а добавление к культуральной жидкости ацетона осаждало из неё высокомолекулярные компоненты. Эти осадки проявляли высокую литическую активность, тогда как антибактериальная активность оставалась в надосадочных растворах. Образцы исходной культуральной жидкости и их бутанольные экстракты сохраняли своё антибиотическое действие после кипячения в течение 15 мин. Экстрагированные метаболиты были также устойчивы в растворах с диапазоном значений рН от 2.2 до 9.0, но инактивировались в сильнощелочной среде. Обработка трипсином и химотрипсином не влияла на антибиотические свойства экстрактов, тогда как инкубация с проназой почти полностью инактивировала их. Было предположено, что антибиотики штаммов

B. licheniformis VK2 и VK21 являются низко молекулярными пептидами, структурные особенности которых могут защищать их от протеолиза.

Компоненты смеси разделяли обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с последующим тестированием антибактериальной активности собранных фракций; общая схема выделения приведена на рис. 3. Неожиданным оказалось то, что у двух штаммов наличие в среде Мп стимулировало не только споруляцию, но и образование ими сходных либо даже идентичных антибиотических соединений, судя по характеру хроматографических профилей и высоте пиков, соответствующих индивидуальным антибиотикам (рис. 3). При этом влияние марганца на соотношение между уровнем роста и общей активностью в культурах обоих термофильных штаммов в целом не было существенным - бациллы секретировали сложную смесь антибактериальных продуктов, из которых лишь несколько удалось выделить описанным методом.

Антибиотические свойства метаболитов штамма В. licheniformis VK21.

Спектр активности соединений, обозначенных как VK21-A, VK21-B и VK21-

C, определяли методом диффузии их растворов в плотную среду с клетками тестируемых бактериальных штаммов. В концентрации 200 мкг/мл каждый из антибиотиков подавлял рост грамположительных бактерий: Bacillus subtilis 1621, В. pumilus 2001, В. megaterium VKM41, В. amyloliquefaciens I, Staphylococcus aureus 209P, Micrococcus luteus В1314. Ha Rhodococcus sp. SSI, Mycobacterium smegmatis 1171 и М. phlei 1291 действовал только антибиотик VK21-A, а штамм В. licheniformis B431 был устойчив ко всем трём веществам. Было обнаружено

Культуральная жидкость (1 л)

Концентрирование на роторно-вакуумном

испарителе до 50 мл. Добавление

2-х объёмов ацетона, центрифугирование

Супернатант Осадок

Упаривание. Растворение сухого остатка в 50 мл воды, экстракция равным объемом н-бутанола

Экстракт антибиотиков Водная фаза

ВЭЖХ на ШочирЬеге-Оау!, 10x250 мм в системе: 30 мМ ацетат аммония (рН 5.6) - ацетонитрил.

Рис. 3. Схема выделения антибиотических метаболитов В. Искет/огт1$ УК2 и УК21 и хроматограммы экстрактов культуральной жидкости продуцентов, выращенных в среде с 60 мкМ Мпв04 (верхние профили на каждом рисинке) и без него (нижние профили). А, В и С - антибиотически активные фракции.

Штамм УК2

0.25

20 30 40 Время удержания, мин

Аио 0.5

0.25

0.0

Штамм УК21

;1 *

} \ ,» Л .д. Л^.Л-^ ^

%СНзСЫ 80

70 .60

10 20 30 40

Время удержания, мин

также синергическое действие антибиотика VK21-A с VK21-B, либо же с VK21-C: смеси их растворов с конечной концентрацией по 20 мкг/мл каждого показывали высокую активность в отношении В. megaterium VKM41 и особенно Micrococcus luteus В1314, а смеси этих метаболитов в концентрации по 100 мкг/мл эффективно подавляли рост остальных перечисленных тест-штаммов. На рост грамотрица-тельных бактерий - Е. coli C600, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Ps. putida 1-97, Agrobacterium tumefaciens A281 — антибиотики не влияли. Значения их минимальных ингибирующих концентраций для наиболее чувствительных микроорганизмов приведены в табл. 7.

Структурный анализ соединений VK21-A, VK21-B и VK21-C.

Тонкослойной хроматографией (ТСХ) очищенных метаболитов штамма В. licheniformis VK21 с проявлением хлором и смесью растворов крахмала и KJ было подтверждено, что выделенные вещества являются пептидами. При проявлении раствором родамина 6G пятна флуоресцировали в ультрафиолете, свидетельствуя о гидрофобном характере соединений, однако красителем Судан чёрный В они не окрашивались, что позволило предположить отсутствие в составе этих антибиотиков липидных групп.

По данным MALDI масс-спектрометрии, соединение VK21-A имеет молекулярную массу 3253±2 Da; соединение VK21-B - 3020±1 Da; VK21-C -3038+1 Da. Аминокислотный анализ1 антибиотиков показал, что все они являются пептидами, обогащенными гидрофобными аминокислотами, а также содержат катионные остатки - аргинин и (или) лизин, причём соединения VK21-B и VK21-С весьма сходны между собой по составу, но отличаются от VK21-A (табл. 8). Все эти данные указывали на то, что выделенные метаболиты, вероятно, относятся к бактериоцинам - пептидам, имеющим собственные гены, а не к продуктам ферментов, осуществляющих внерибосомный пептидный синтез (пептидил-синтетаз). Автоматическим секвенированием по Эдману2 удалось определить N-концевой фрагмент соединения VK21-A как GNNGYLKEKMPPS, но далее эта последовательность не прочитывались, а два других антибиотика не поддавались секвенированию. Анализ приведённой последовательности с использованием программы BLAST и баз данных первичных структур антимикробных пептидов не выявил её гомологии с какими-либо известными пептидными антибиотиками; также не удалось обнаружить опубликованных сообщений об антибактериальных пептидах бацилл, сходных по составу и по свойствам с исследованными в данной работе. Не исключено, что метаболиты, образуемые терморезистентным штаммом В. licheniformisVK21, являются неизвестными ранее бактериоцинами, комплекс

'Аминокислотный анализ проводили в лаборатории химии пептидов Института биоорганической химии РАН.

2Секвенирование проводили в Учебно-научном центре ИБХ РАН.

Антибактериальная активность пептидных метаболитов, образуемых штаммом Bacillus licheniformis VK21

Тестируемые Минимальные ингибирующие концентрации (MIC) антибиотиков и их смесей*, мкг/мл

бактериальные штаммы VK21-A VK21-B VK21-C А+В А+С

Bacillus subtilis 1621 60 60 60 поЗ поЗ

В. amyloliquefaciens I >8 8 >8 по 0,2 по 0,4

В. pumilus 2001 >60 30 30 по 6 по 6

В. megaterium VKM41 12 3 6 по 0,375 по 0,375

Micrococcus luteus B1314 4 2 2 по 0,013 по 0,013

Staphylococcus aureus 209P 60 30 30 поЗ поЗ

Rhodococcus sp. SSI 20 нд нд по 0,5 по 0,5

* Одинаковые весовые концентрации в смесях веществ соответствуют их эквимолярным соотношениям; (нд) - определение не проводили.

которых подавляет развитие широкого круга грамположительных микроорганизмов.

Образование катехольного сидерофора штаммом В. licheniformis VK21.

Облигатно-термофильные и терморезистентные штаммы бацилл из лабораторной коллекции (см. табл. 1), растущие на агаризованной минимальной среде с комплексом красителя хром-азурола S (CAS) и Fe3+ с цетавлоном, изменяли окраску индикатора, что говорило о секреции ими соединений, специфически связывающих ионы железа - сидерофоров. При добавлении в среду 60 мкМ MnSC>4 цветные зоны вокруг колоний В. licheniformis B431, В432 и VK21 заметно увеличивались, у остальных штаммов существенно не изменялись. Культуральную жидкость В. licheniformis VK2 и VK21, выращенных в жидкой минимальной среде (в ходе изучения продукции ими антибиотиков), тестировали также CAS-реактивом на присутствие сидерофоров. Положительную реакцию

Аминокислотный состав антибиотических метаболитов штамма Bacillus licheniformis VK21

Аминокислоты VK21-A (MW=3250 Da) VK21-B (MW=3020 Da) VK21-C (MW=3038 Da)

Gly 3 3 3

Ala 1 6 6

Val 1 4 4

Leu 5 2 2

Ile 2 2 2

Ser 2 4 4

Lys 3 2 2

His 1 1 1

Arg - 3 2

Thr - 3 4

Туг 1 - -

Met 1 - -

Asx 5 - -

Glx 2 - -

Pro 2 - -

Всего остатков 29 30 30

Расчётная молекулярная 3165 2974 2919

масса пептида (Da)

давали только супернатанты культур, содержавших марганец. Все образцы культуральной жидкости экстрагировали этилацетатом с подкислением НС1 (до 0.2 н.) либо без этого; органическую фазу анализировали тонкослойной хроматографией. Экстракты супернатантов с \lnSO4 содержали вещества, которые связывали железо в составе CAS-реактива, давали синее окрашивание с солями железа (III) и флуоресцировали в ультрафиолете (табл. 9). Все эти свойства характерны для катехольных сидерофоров, образуемых многими видами бактерий, но не описанных прежде у В. Искет/огт1$. Пятна с голубой флуоресценцией, слабо проявляемые CAS-реактивом, соответствовали по величине Яг и свечению 2,3-дигидроксибензойной кислоте (DHB). Другое катехольное соединение, флуоресцировавшее зелёным светом, предположительно было сидерофором

ТСХ-анализ* метаболитов штаммов Bacillus licheniformis VK2 и VK21, экстрагированных этилацетатом из подкисленных образцов культуральной жидкости

Штаммы-продуценты Rf Флуоресценция в УФ** Окрашивание пятен***

CAS-реактив Цитрат железа-аммония+ гексацианоферрат (III) калия С12с проявлением крахмалом -KJ

Рост без марганца VK2 0,83 - - - -

VK21 0,97 светло-голубая - +/- +

0,84 - - - -

Росте добавлением MnSO4 VK2 0,90 + , голубая +/- + -

0,83 - - - -

VK21 0,97 светло-зелёная + + +

0,90 +, голубая +/- + -

0,84 - - - -

* Хроматографию проводили на пластинках Cellulose (Merck) в системе: н-бутанол CHjCOOH - Н20, 12:3:5;

**(-)- пятна выглядят темными в УФ-свете; *** (+/-) - окрашивание пятен слабое.

В. licheniformis "УК21, образование которого зависело от наличия Мп804 в культуре продуцента. Колориметрическим анализом образцов культуральной жидкости было показано, что катехольные соединения накапливались в ходе активного роста штамма УК21, достигая максимальной концентрации к началу стационарной фазы. В среде, содержавшей 50 мкМ РеС13, уровень продукции сидерофора сильно снижался (рис. 4), что подтверждалось и тестом с СА8-реактивом, указывая на контролируемый механизм биосинтеза метаболита-хелатора. Активное образование катехолов В. licheniformis VK21 было возможно

0123456789

Время роста, ч

Рис.4. Рост штамма Bacillus Hcheniformis VK21 в минимальной среде и образование им катехольных метаболитов. А«2о - рост бактерий в С2Мп без железа (1) и с добавлением 50 мкМ FeCb (2). А5и> образование катехолов в среде без железа (3) и с добавлением 50 мкМ FeCl3 (4). 5 - уровень продукции катехолов при росте бактерий в отсутствие марганца. Приведены усреднённые данные из трёх независимых экспериментов.

при наличии в среде как минимум 50 нМ Мп2+ и полностью ингибировалось растворимым железом в концентрации от 2 мкМ и выше. Увеличение концентрации Мп304 (до 200 мкМ) не оказывало влияния на уровень продукции сидерофора и не уменьшало ингибирующий эффект Ее3+.

Выделение, анализ и установление структуры сидерофора В. Hcheniformis УХ21.

Схема препаративного выделения железосвязываюгцего метаболита, условно названного Вук21> приведена на рис. 5. Полученный препарат был очищен обращёно-фазовой ВЭЖХ с элюцией градиентом концентрации метанола в 0.1%-й трифторуксусной кислоте. Проба с CAS-реактивом показала наличие хелатора железа во фракции, соответствующей пику, выходящему со временем удержания 45 мин. (рис. 5). Дополнительный анализ очищенного вещества с использованием ТСХ на целлюлозных и силикагельных пластинках в различных системах растворителей подтвердил его принадлежность к классу катехольных сидерофоров, а проявление пятна при обработке хлором и смесью растворов крахмала и КГ позволило предположить наличие пептидной связи в его молекуле.

Функциональная активность метаболита Бую как компонента системы активного транспорта железа у его продуцента была подтверждена тестом, в котором вещество восстанавливало рост клеток самой В. Hcheniformis "УХ21 при подавлении их хелатором ЭДТА.

Культуральная жидкость (1 л)

Подкисление 12 н. HCl до 0.2 н. Перемешивание с 40 г BioBeads SM2 (Bio-Rad, США)

Адсорбция катехольного метаболита на смоле BioBeads SM2

Отмывание носителя 0.2 н. HCl. Элювия мтехола 3 х 100 мл CHjOH

Метаиольный расгвор катехольного метаболита

Высушивание, растворение в 30 мл 0.1 н. HCl, экстракция 3 х 30 мл этилацетата

Раствор сидерофора в этнлацетате Водная фаза

Упаривание до 10 мл, переосаждение 4 объёмами н-гептана

Осадок Супернатант

ВЭЖХ на Zoibax С18,21x250 мм, в системе: 0.1% трифторуксусная кислота - метанол

30 ' 35 ' 40 ' 45 ' 50

Время удержания, мин

Рис. 5. Схема выделения сидерофора Bacillus licheniformis VK21 с очисткой обращённо-фазовой ВЭЖХ. SyK2i - фракция железосвязывающего метаболита.

Рис. 6.

сидерофора

УФ-спектр Буки в

метаноле. Концентрация вещества - 55 мкМ.

Рис. 7.

сидерофора

Структура $УК21 по

данным спектроскопии ЯМР.

Измерение оптического спектра сидерофора в метанольном растворе показало наличие максимумов поглощения при Х=248 и 315 нм (рис. 6), а сам вид спектральной кривой Буки соответствовал характеру спектров известных катехольных сидерофоров, где присутствие остатка 2,3-БЫВ также обусловливает поглощение в областях длин волн в районе 320 нм и 250 нм.

Определение аминокислотного состава показало наличие в молекуле метаболита остатков глицина и треонина в соотношении, близком 1:1. На основании анализа ЯМР-спектров3 COSY, TOCSY, NOESY, ('Н-|3С) HMQC, и ('Н- С) НМВС было проведено полное отнесение сигналов образца SvK2b которое соответствовало формуле соединения, приведённой на рис. 7. Титрующаяся группа исследуемого вещества имела значение рК, равное 3.22 ± 0.02, что дополнительно указывало на её принадлежность С-концевому остатку треонина. Таким образом, сидерофор В. licheniformis VK21 отличался по структуре от ранее описанного бациллибактина В. subtilis, в котором три аналогичных звена 2,3-дигидроксибензоил-глицил-треонина формируют лактонный цикл.

1 Спектроскопию ЯМР проводили в лаборатории инструментальных методов анализа ИБХ РАН.

Выводы

1. Исследованные термофильные бациллы способны к продукции антибактериальных и железосвязывающих метаболитов. Штаммы В. licheniformis VK2 и VK21 при росте на разных источниках углерода и азота активно секретируют комплекс низкомолекулярных антибиотиков, подавляющих рост грамположительных бактерий. Добавление к культуре солей марганца индуцирует споруляцию у этих штаммов, а также продукцию ими катехольных сидерофоров и трёх антибиотических пептидов. Экзоферменты, образуемые бациллами, практически не лизируют живые бактериальные клетки.

2. Пептидные антибиотики В. licheniformis VK2 и VK21 относительно устойчивы к высокой температуре, низкому рН среды и к ферментному протеолизу. Показана активность метаболитов штамма VK21 в отношении широкого круга микроорганизмов, в том числе Staphylococcus aureus и Micrococcus luteus. Антибиотик VK21-A действует в синергизме с VK21-B и VK21-C, при этом минимальные ингибирующие концентрации индивидуальных веществ снижаются на 1-2 порядка в их смесях.

3. Метаболиты VK21-A VK21-B и VK21-C являются гидрофобными катионными пептидами и относятся к группе бактериоцинов. Частично определённая аминокислотная последовательность соединения VK21-A не обнаруживает аналогов с известными у бацилл пептидными антибиотиками.

4. Сидерофор, образуемый штаммом В. licheniformis VK21, представляет собой 2,3-дигидроксибензоил-глицил-треонин, сходный по структуре с известным сидерофором мезофильного штамма В. subtilis - бациллибактином, но не идентичный ему.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Темиров Ю.В., Есикова Т.З., Алахов Ю.Б. Скрининг термофильных штаммов рода Bacillus, продуцирующих вторичные метаболиты с антибактериальной активностью. Доклад на отчётной конференции ФИБХ, Пущино, 1999 г.

2. Темиров Ю.В., Есикова Т.З., Соколов С.Л., Евдокимова Е.Г., Алахов Ю.Б. Термофильные штаммы рода Bacillus - продуценты вторичных метаболитов с антибактериальной активностью. Стендовый доклад на XIII зимней международной молодёжной научной школе, ИБХ РАН, Москва, 2001 г.

3. Темиров Ю.В, Есикова Т.З., Соколов С.Л., Евдокимова Е.Г., Алахов Ю.Б. Синтез вторичных метаболитов антимикробного действия термофильными штаммами рода Bacillus. Стендовый доклад на 5-й Путинской конференции молодых учёных, 2001 г.

4. Темиров Ю.В., Есикова Т.З., Соколов С.Л., Захаров М.В., Кашпаров И.А., Винокуров Л.М., Алахов Ю.Б. Выделение и характеристика катехольного сидерофора, продуцируемого термофильным штаммом Bacillus licheniformis VK21. Доклад на отчётной конференции ФИБХ РАН, Пущино, 2001 г.

5. Темиров Ю.В., Есикова Т.З., Кашпаров И.А., Винокуров Л.М., Алахов Ю.Б. Вторичные метаболиты-пептиды, продуцируемые термофильным штаммом Bacillus licheniformis VK21. Стендовый доклад на XIV зимней международной молодёжной научной школе, ИБХ РАН, Москва, 2002 г.

6. Есикова Т.З., Темиров Ю.В., Соколов С.Л., Алахов Ю.Б. Вторичные метаболиты антимикробного действия, продуцируемые термофильными штаммами Bacillus spp. VK2 и VK21 // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т. 38. №3. С. 261-267.

7. Темиров Ю.В., Есикова Т.З., Кашпаров И.А., Балашова Т.А., Винокуров Л.М., Алахов Ю.Б. Катехольный сидерофор, продуцируемый терморезистентным штаммом Bacillus licheniformis VK21 // Биоорганическая химия. 2003. Т. 29. №6. С. 597-604.

8. Темиров Ю.В., Винокуров Л.М., Овчинникова Т.В., Кашпаров И.А., Алахов Ю.Б. Низкомолекулярные пептидные бактериоцины, образуемые термофильными штаммами Bacillus licheniformis. Доклад на отчётной конференции ФИБХ РАН, Пущино, 2004 г.

Р18 3 2 1

РНБ Русский фонд

2005-4 14377

Подписано в печать 18 июня 2004 г. Заказ 410. Формат 60 х 90/16. Тираж100 экз.

Отпечатано в салоне оперативной печати АртПолиграф. Москва, Б. Якиманка, 13, оф. 410. Тел. 778-97-47

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Темиров, Юрий Витальевич

Введение.

Обзор литературы

1. Термофильные прокариоты: общая характеристика, положение в системе микроорганизмов, видовое разнообразие

2. Антибиотически активные вторичные метаболиты

2.1. Антибиотики-полипептиды: общий обзор.

2.2. Бактериальные антибиотики - продукты рибосомного синтеза.

2.2.1. Бактериоцины класса I.

2.2.1.1. Субтилин.

2.2.1.2. Эрицины.

2.2.1.3. Субланцин 168.

2.2.1.4. Мерсацидин.

2.2.2. Бактериоцины класса II

2.2.2.1. Коагулин.

2.2.3. Субтилозин А.

2.2.4. Другие бактериоцины, образуемые бациллами.

2.3. Пептидные и другие антибиотики, образуемые бактериями-термофилами, не относящимися к бациллам.

3. Железосвязывающие метаболиты микроорганизмов - сидерофоры.

3.1. Образование железосвязывающих метаболитов.

3.2. Транспорт ферросидерофорных молекул и их утилизация бактериями.

3.3. Контроль продукции сидерофоров. Бактериальные белки-металлорегуляторы.

Экспериментальная часть

4. Материалы и методы.

5. Результаты и обсуждение

5.1. Штаммы бактерий-термофилов и образование ими антибиотических метаболитов.

5.2. Закономерности образования антибиотиков при разных условиях культивирования штаммов-продуцентов.

5.3. Бактериолитическая активность штаммов В. licheniformis VK2 и VK21.

5.4. Анализ свойств антибактериальных метаболитов в смесях и выделение индивидуальных антибиотиков.

5.5. Структурный анализ соединений VK21-A, VK21-B и VK21-C.

5.6. Антибиотические свойства метаболитов штамма В. licheniformis VK21.

5.7. Образование катехольных сидерофоров термофильными штаммами бацилл.

5.8. Выделение, анализ и установление структуры катехольного сидерофора штамма В. licheniformis VK21.

Выводы.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологически активные вторичные метаболиты-пептиды, образуемые термофильными штаммами бацилл"

Поиск и изучение новых природных биологически активных веществ по-прежнему остаётся одним из актуальных направлений современной биологии и биотехнологии. Временное снижение интереса к получению лекарственных препаратов на основе природных соединений, в том числе открываемых новых антибиотиков, наблюдавшееся со второй половины 60-х годов XX века, в последние 20 лет вновь сменилось вниманием со стороны фармацевтической индустрии к таким соединениям. Свойства многих из них позволяют использовать их для разработки эффективных средств против вирусных инфекций, злокачественных опухолей, микозов, паразитических инвазий, для создания иммуносупрессорных препаратов, а также в качестве хелаторов металлов и специфических ингибиторов определённых ферментов и гормонов [Demain, 1999]. «Побочные», но весьма ценные биологически активные свойства были обнаружены у некоторых ранее известных антибиотиков, считавшихся неперспективными для медицинского применения [Donadio et al., 2002]. В последнее время усиленно разрабатываются новые технологии массового анализа природных соединений, их модифицированных производных и химически синтезированных веществ на наличие у них различных видов биологической активности. С другой стороны, создаются библиотеки соединений, получаемых комбинаторным химическим синтезом, нередко сочетаемым с компьютерным молекулярным дизайном. Внедрение методов широкомасштабного высокоэффективного скрининга (high-throughput screening) позволяет анализировать до 2-3 миллионов образцов в год с небольшими затратами средств [Bevan et al., 1995]. Тем не менее, важнейшее место в области разработки новых лекарственных препаратов (drug discovery) продолжают занимать соединения из природных источников, в целом уникальные как по своему структурному разнообразию, так и по спектру биологических свойств [Nisbet, Moore, 1997].

К настоящему времени охарактеризовано около 100 тысяч низкомолекулярных природных продуктов и ежегодно описываются примерно 500 новых - большей частью вторичных метаболитов различных организмов [Demain, 1999]. Наиболее значимыми из них по-прежнему остаются антибиотики, столь широко применяемые в медицине и в пищевой промышленности. К 1995 году было известно примерно 12 000 антибиотически активных природных соединений, большей частью - бактериальных продуктов; из них более 2 000 относятся к группе пептидов и депсипептидов. Пептидные антибиотики не получили широкого распространения в медицинской практике, в основном из-за свойственных им сильных побочных эффектов. В последнее время, однако, эта группа всё более привлекает к себе внимание, поскольку основной проблемой антибиотикотерапии по-прежнему остаётся появление и распространение патогенных штаммов, устойчивых к широко используемым лекарственным средствам. Всё более многочисленными становятся мультирезистентные варианты таких важных патогенов, как стафилококки, энтеробактерии и микобактерии, что требует новых средств борьбы с ними [Cohen, 1992; New, 1992]. Перспективными для применения признаются антибиотические препараты на основе синергически действующих катионных пептидов, взаимодействующих как с компонентами бактериальных мембран, так и с нуклеиновыми кислотами и белками внутри клеток. Особого внимания заслуживает тот факт, что длительное использование пептидных антибиотиков мембранолитического действия (к примеру, пептидов молочнокислых бактерий в качестве пищевых консервантов) не привело к возникновению резистентных к ним штаммов бактерий [Bush, 1997; Walsh, 2000]. Проблемы, связанные с токсичностью и побочным действием полипептидов и их производных, с трудностью (или невозможностью) либо чрезмерной затратностью промышленного культивирования их продуцентов и с ограниченностью самого разнообразия природных антибиотиков данной группы зачастую могут быть разрешимы с применением современных подходов к поиску биологически активных природных продуктов, их модификации и разработке эффективных методов получения и очистки необходимых соединений в препаративных количествах. Альтернативой традиционной химической модификации ныне являются случайный и направленный мутагенез генов, кодирующих пептидные антибиотики либо ферменты их биосинтеза с получением набора структурных вариантов исходного метаболита, клонирование генов и целых кластеров в геномы других микроорганизмов для создания эффективных штаммов - продуцентов искомых метаболитов, биологическая трансформация веществ с применением иммобилизованных ферментов либо бактериальных клеток. В целом все эти (и подобные им) методы дают возможность разрабатывать эффективные фармакологические препараты на основе таких природных соединений, которые сами по себе непригодны для использования в медицине, но являются исходными структурами, аналоги которых могут обладать изменёнными в желаемом направлении свойствами [Verdine, 1996].

По-прежнему значимым остаётся и традиционный подход - поиск новых биологически активных продуктов, важнейшим источником которых являются микроорганизмы. Из многочисленных антибиотиков, образуемых разнообразными бактериями, наибольшая доля приходится на вторичные метаболиты актиномицетов, чрезвычайно разнообразные по химическому строению; в частности, это поликетоны (к ним относятся макролиды, тетрациклины, антрациклины), аминогликозиды, и в сравнительно небольшом числе -пептиды и их производные типа актиномицинов. В то же время грамположительные эубактерии, формирующие эндоспоры (бациллы) и неспорогенные (молочнокислые бактерии, стрептококки и стафилококки), образуют преимущественно антибиотически активные полипептиды либо белки [Егоров и др., 1987; Strohl, 1997]. Необычные по структуре и по активности соединения могут быть найдены у микроорганизмов, населяющих малоисследованные биотопы, в том числе с экстремальными условиями - высокой температурой или солёностью, сильнокислой или щелочной средой. Однако, насколько можно судить по имеющимся публикациям, систематические исследования вторичного метаболизма микроорганизмов-экстремофилов не проводились совсем - при том, что именно представители этой экологической группы могут быть перспективными продуцентами не только ценных ферментов, но и низкомолекулярных веществ антибактериального, антифунгального, антипротозойного, противовирусного и противоопухолевого действия [Verdine, 1996; Shiraldi, De Rosa, 2002; Phobe et al., 2001].

Представленная работа имела целью поиск, выделение, изучение свойств и установление структуры биологически активных вторичных метаболитов-пептидов -антибиотиков и сидерофоров - специфических хелаторов железа, - образуемых термофильными (терморезистентными) бактериями из рода Bacillus. В ходе исследования решались следующие задачи: скрининг штаммов бактерий-термофилов для выявления среди них продуцентов антибактериальных соединений и хелаторов железа (сидерофоров); идентификация штаммов-продуцентов; изучение условий образования ими вторичных метаболитов; очистка (в том числе в препаративных масштабах) пептидных антибиотиков и сидерофоров, образуемых термофильными бациллами, изучение свойств этих соединений; определение активности выделенных антибиотиков в отношении различных видов микроорганизмов; установление структуры изучаемых пептидных метаболитов с использованием современных методов анализа.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Темиров, Юрий Витальевич

Выводы

Благодарности

Представленная работа состоялась благодаря помощи и участию многих людей. Автор глубоко признателен своим научным руководителям: покойному профессору Юлию Борисовичу Алахову, интерес которого к низкомолекулярным антибиотическим пептидам термофильных бактерий вызвал к жизни исследования по этой теме, проводимые в лаборатории организации белковых структур филиала ИБХ (Пущино), а также Леониду Михайловичу Винокурову, нынешнему руководителю этой лаборатории, который поддерживал исполнителей данной работы на всём её протяжении. Автор чрезвычайно благодарен всем сотрудникам лаборатории ОБС, которые постоянно помогали ему в работе: Ольге Ильиничне Сокольской, Андрею Юрьевичу Гороховатскому, Наталье Васильевне Руденко, Ирине Александровне Ахапкиной, Людмиле Николаевне Пановой, Антонине Ильиничне Благовой, Максиму Александровичу Аржанову, Виталию Сергеевичу Скосыреву, Константину Александровичу Луста, Любови Анатольевне Шалойко; сотрудникам Учебно-научного центра Института биоорганической химии (Москва), в особенности его руководителю Татьяне Владимировне Овчинниковой, а также Андрею Азизовичу Тагаеву, Ларисе Леонидовне Заваде, Людмиле Юрьевне Филипповой, Татьяне Тимофеевне Орловской, Юлии Фёдоровне Леоновой, Марине Павловне Качалиной, Леоне Генриховне Снежковой, Зое Александровне Якименко и другим, за неоценимую помощь в проведении работы, в том числе при изучении структуры антибиотических метаболитов; сотрудникам группы пептидного синтеза ФИБХ, в особенности её заведующему Игорю Леонидовичу Родионову и Алексею Чулину за поддержку советами и за материальное обеспечение исследований на всём их протяжении; сотрудникам Института белка (Пущино) Ивану Андреевичу Кашпарову, Наталье Богатырёвой, Алексею Сурину за бескорыстную помощь на отдельных этапах данной работы; сотрудникам лаборатории инструментальных методов анализа ИБХ Тамаре Андреевне Балашовой и Александру Сергеевичу Арсеньеву (зав. лабораторией) за проведение ЯМР-анализа сидерофора; сотрудникам лаборатории химии пептидов ИБХ Борису Викторовичу Васьковскому и Сергею Константиновичу Гаранину за проведение аминокислотного анализа антибиотиков; сотрудникам лаборатории биотехнологии растений ФИБХ, в особенности Елене Борисовне Рукавцовой, Екатерине Геннадьевне Семенюк, Валерии Витальевне

Алексеевой, Наталье Сергеевне Захарченко, Александре Павловне Жуковой, помогавшим реактивами, посудой и разными весьма нужными мелочами; сотрудникам Института биохимии и физиологии микроорганизмов (Пущино): Светлане Борисовне Петрикевич - за постоянную поддержку, научную консультацию и помощь в оформлении диссертации; Татьяне Васильевне Финогеновой - за ценные советы по работе с микроорганизмами; сотрудникам отдела Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ, в особенности Екатерине Гавриш - за материальную поддержку и консультации на этапах работы, связанных с микробиологией; Борису Петровичу Баскунову - за помощь при печати автореферата;

Аркадию Викторовичу Кривошеину (Cornell University, США) - за ценные советы, которые весьма способствовали успеху всей работы;

Любови Фёдоровне Марковой (ФИБХ) - за проведение аминокислотного анализа сидерофора;

Татьяне Зигфридовне Есиковой (ИБФМ) - за совместную работу в ходе исследований;

Сергею Львовичу Соколову (ИБФМ) - за участие в скрининге и идентификации штаммов термофильных бактерий;

Фёдору Александровичу Бровко и Александру Георгиевичу Ламану (ФИБХ);

Михаилу Владимировичу Захарову (ФИБХ);

Валерию Анатольевичу Поройко и Сергею Вячеславовичу Чернышову (ФИБХ);

Игорю Владимировичу Назимову и Татьяне Ивановне Костроминой (ИБХ);

Владимиру Анатольевичу Широкову, Наталье Яковлевне Кашпаровой, Татьяне Михайловне Попковой, Александру Ивановичу Васину (Институт белка);

Татьяне Фёдоровне Бобылёвой (Институт фотосинтеза, Пущино);

Любови Ивановне Поповой (Институт фотосинтеза);

Эмме Викторовне Карасёвой (Кубанский Государственный университет, Краснодар);

Татьяне Павловне Кроличенко (Кубанская государственная медицинская академия);

Олегу Задворному (Институт фотосинтеза);

Артёму Якимову (Институт почвоведения, Пущино);

Андрею Шутову и Дмитрию Довбня (ИБФМ);

Константину Шестибратову, Вадиму Лебедеву, Александру Пущину, Михаилу Филиппову (ФИБХ).

Особая благодарность - Марине Викторовне Доновой (ИБФМ) и Юрию Николаевичу Уткину (ИБХ), согласившихся оппонировать эту диссертацию, а также Валерию Михаиловичу Липкину (ИБХ) и сотрудникам отдела аспирантуры этого института, в особенности Ольге Ивановне Ворониной - за помощь в подготовке диссертации к защите.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Темиров, Юрий Витальевич, Пущино

1. Бауэр Г., Энгельгардт X., Хеншен А. и др. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. М.: «Мир», 1988. 687 с.

2. Боровикова В.П., Аксеновская В.Е., Лавренова Г.И., Кислухина О.В., Калунянц К.А., Степанов В.М. Выделение и характеристика литического фермента из Bacillus subtilis 797 // Биохимия. 1980. Т. 45 (8). С. 1524-1533.

3. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Лизоцимная активность микроорганизмов // Антибиотики. 1981. Т. 26(10). С. 782-793.

4. Гельфанд М.С. Компьютерный анализ последовательностей ДНК // Молекулярная биология. 1998. Т. 32 (1). С. 103-120.

5. Головачёва Р.С., Каравайко Г.И. Sulfobacillus новый род термофильных спорообразующих бактерий // Микробиология. 1978. Т. 47(5). С. 815-822.

6. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. 582с.

7. Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках. М.: Высшая школа, 1986. 448 с.

8. Егоров Н.С., Баранова И.П. Бактериоцины. Образование, свойства, применение // Антибиотики и химиотерапия. 1999. Т. 44 (6). С. 33-40.

9. Егоров Н.С., Силаев А.Б., Катруха Г.С., Орлова Т.И., Полин А.Н., Ломакина Н.Н., Бердникова Т.Ф., Юрина М.С., Зенкова В.А. Антибиотики-полипептиды. М.: Изд-во МГУ, 1987. 263 с.

10. Есипов С.Е., Жиркова Л.Л., Воронкова В.В. Новый математический подход при определении концентрации антибиотиков методом диффузии в агар // Антибиотики и химиотерапия. 1998. Т. 43 (2). С. 14-19.

11. Каравайко Г.И., Головачёва Р.С. Исследование филогенетического положения аэробных умеренно-термофильных бактерий рода Sulfobacillus, окисляющих Fe2+, S° и сульфидные минералы // Микробиология. 2000. Т. 69(6). С. 857-860.

12. Кокряков В.Н., Стефанов В.Е., Алёшина Г.М., Шамова О.Е., Корнеева Г.А., Харвиг С.С., Лерер Р.И. Дефензины и родственные им антибиотические пептиды в эволюции защитных систем животных // Ж. Эвол. Биохим. Физиол. 1997. Т. 33 (1). С. 109-123.

13. Космачёв А.Е. Термофильная микромоноспора и образование ею антибиотика Т-12 в условиях поверхностной и глубинной ферментации при 50-60°С // Микробиология. 1962. Т. 31. С. 66-71.

14. Космачёв А.Е., Хохлова A.M., Калмыкова Г.Я. Условия выращивания и выделения антибиотика из термофильного актиномицета Т-12/3 // Микробиология. 1965. Т. 34. С. 437441.

15. Котельникова Е.А., Гельфанд М.С. Выработка бактериоцинов грамположительными бактериями и механизм транскрипционной регуляции // Генетика. 2002. Т. 38(6). С. 758-772.

16. Лукин А.А. Защитная функция пептидных антибиотиков бацилл // Антибиотики и медицинская биотехнология. 1987. Т. 32 (7). С. 538-541.

17. Лукин А.А., Пермогоров В.И. Роль пептидных антибиотиков в регуляции клеточной дифференциации у бактерий // Антибиотики. 1983. Т. 28(6). С. 406-409.

18. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: «Мир», 1984. -440 с.

19. Методы общей бактериологии. В 3-х томах. Под ред. Ф. Герхардта и др. М., «Мир», 1983-1984, Т. 1, 3.

20. Нетыкса Е.А., Смирнова Т.Н., Миненкова И.Ф., Азизбекян P.P. Бактериоцино-подобный фактор Bacillus thuringiensis II Микробиология. 1979. Т. 48 (4). С. 716-722.

21. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М.: «Просвещение», 1987. 815 с.

22. Павлова И.Н., Тиньянова Н.З., Жолнер Л.Г. Антимикробные свойства некоторых термофильных бацилл // Микробиол. Ж. (Украина). 1991. Т. 53 (1). С. 84-89.

23. Практикум по микробиологии. Под ред. Н.С. Егорова. М.: изд-во МГУ, 1976. 308 с.

24. Практическая химия белка. Под ред. А. Дарбре. М.: «Мир», 1989. 621 с.

25. Смирнов В.В., Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова Л.А. Рост и спорообразование Bacillus subtilis в различных условиях аэрации // Микробиол. Ж. (Украина). 1993. Т. 55 (3). С. 38-47.

26. Феофилова Е.П. Пигменты микроорганизмов. М.: «Наука», 1974. 218 с.

27. Химическая энциклопедия. В 5 томах. Под ред. И.Л. Кнунянца. М.: «Советская энциклопедия», 1988. Т.2.

28. Хмель И.А. Микроцины пептидные антибиотики энтеробактерий: генетический контроль, синтез, структура, механизм действия II Генетика. 1999. Т. 35(1). С. 5-16.

29. Шемякин М.М., Хохлов А.С., Колосов М.Н., Бергельсон Л.Д., Антонов В.К. Химия антибиотиков. М.: Изд-во АН СССР, 1961. Т. 1, 2. 1550 с.

30. Abee Т. Pore-forming bacteriocins of Gram-positive bacteria and self-protection mechanisms of producer organisms // FEMS Microbiol. Lett. 1995. V. 129(1). P. 1-10.

31. Achouak W., Normand Ph., Heulin T. Comparative phylogeny of rrs and nifH genes in the

32. Bacillaceae // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. V.49. P. 961-967.

33. Achenbach-Richter L., Gupta R., Stetter K.O., Woese C.R. Were the original eubacteria thermophiles? // Syst. Appl. Microbiol. 1987. V. 9 P. 34-39.

34. Ahern M., Verschueren S., van Sinderen D. Isolation and characterization of a novel bacteriocin produced by Bacillus thuringiensis strain B439 // FEMS Microb. Lett. 2003. V. 220(1). P. 127-131.

35. Aktypis A., Kalantzopoulos G., Huis in't Veld J.H., ten Brink B. Purification and characterization of thermophilin T, a novel bacteriocin produced by Streptococcus thermophilus ACA-DC 0040 // J. Appl. Microbiol. 1998. V. 84(4). P. 568-576.

36. Altena K., Guder A., Cramer C., Bierbaum G. Biosynthesis of the lantibiotic mersacidin: organization of a type В lantibiotic gene cluster // Appl. Env. Microbiol. 2000. V. 66 (6) P. 25652571.

37. Andrews S.C., Robinson A.K., Rodriguez-Quinones F. Bacteria iron homeostasis II FEMS Microbiol. Rev. 2003. V. 27(2-3). P. 215-237.

38. Andrighetto C., De Dea P., Lombardi A., Neviani E., Rossetti L., Giraffa G. Molecular identification and cluster analysis of homofermentative thermophilic lactobacilli isolated from dairy products // Res. Microbiol. 1998. V. 149(9). P. 631-643.

39. Ash C., Farrow J., Wallbanks S., Collins M. Phylogenetic heterogeneity of the genus Bacillus revealed by comparative analysis of the small-subunit ribosomal RNA // Lett. Appl. Microbiol. 1991. V. 13. P. 202-206.

40. Ash C., Priest F.G., Collins M.D. Molecular identification of rRNA group 3 bacilli (Ash, Farrow, Wallbanks @ Collins) using PCR probe test // Antonie van Leewenhoek. 1993. V. 64. P. 253-260.

41. Babasaki K., Takao Т., Shimonishi Y., Kurahashi K. Subtilosin A, a new antibiotic peptide produced by Bacillus subtilis 168: isolation, structural analysis, and biogenesis // J. Biochem. (Tokyo). 1985. V. 98(3). P. 585-603.

42. Bagg N., Neilands J.B. Ferric uptake regulation protein acts as a repressor, employing iron (II) as a cofactor to bind the operator of an iron transport operon in Escherichia coli II Biochemistry. 1987. V. 26. P. 5471-5477.

43. Baichoo N., Wang Т., Ye R., Helmann J.D. Global analysis of the Bacillus subtilis Fur regulon and the iron starvation stimulon // Mol. Microbiol. 2002. V. 45(6. P. 1613-1629.

44. Barnum D.W. Spectrophotometric determination of catechol, epinephrine, DOPA, dopamine and other aromatic vic-diols // Anal. Chem. Acta. 1977. V. 89. P. 157-166.

45. Bascaran V., Sanchez L., Hardisson C., Brana A. Stringent response and initiation of secondary metabolism in Streptomyces clavuligerus И J. Gen. Microbiol. 1991. V. 137 (7). P. 16251634.

46. Bassler B. Small talk: cell-to-cell communication in bacteria // Cell. 2002. V. 109. P. 421424.

47. Beare P., For R., Martin L., Lamont I. Siderophore-mediated cell signalling in Pseudomonas aeruginosa: divergent pathways regulate virulence factor production and siderophore receptor synthesis // Mol. Mocrobiol. 2003. V. 47(1). P. 195-207.

48. Beeder J., Torsvik Т., Lien T. Thermodesulforhabdus norvegicus gen. nov., sp. nov., a novel thermophilic sulfate-reducing bacterium from oil field water // Arch. Microbiol. 1995. V. 164(5). P. 331-336.

49. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 1994, 9nd ed., Williams@Wilkins, Baltimor.

50. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. V. 1. 2001, 2nd ed., Springer-Verlag, NY-Berlin-Heidelberg.

51. Berner I., Konetschny-Rapp S., Jung G., Winkelmann G. Characterization of ferrioxamine E as the principal siderophore of Erwinia herbicola (Enterobacter agglomerans) II Biol. Met. 1988. V. 1(1). P. 51-56.

52. Bevan P., Ryder H., Shaw I. Identifying small-molecule lead compounds: the screening approach to drug discovery// Trends Biotechnol. 1995. V. 13(3). P. 115-121.

53. Bierbaum G., Brotz H., Koller K.-P., Sahl H.-G. Cloning, sequencing and production of the lantibiotic mersacidin // FEMS Microbiol. Lett. 1995. V. 127 (1-2). P. 121-126.

54. Bierbaum G., Sahl H.-G. Induction of autolysis of staphylococci by the basic peptide antibiotics Pep 5 and nisin and their influence on the activity of autolytic enzymes // Arch. Microbiol. 1985. V. 141(3). P. 249-254

55. Bizani D., Brandelli A. Characterization of a bacteriocin produced by a newly isolated Bacillus sp. Strain 8A II J. Appl. Microbiol. 2002. V. 93(3). P. 512-519.

56. Bohg A., Ristow H. Tyrocidine-induced modulation of the DNA conformation in Bacillus brevis II Eur. J. Biochem. 1987. V. 170(1-2). P. 253-258.

57. Boman H. G. Peptide antibiotics and its role in innate immunity // Annu. Rev. Imunol. 1995. V. 13. P. 61-92.

58. Boris S., Jimenez-Diaz R., Caso J.L., Barbes C. Partial characterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis U0004, an intestinal isolate with probiotic potential //J. Appl. Microbiol. 2001. V. 91(2). P. 328-333.

59. Boyd J., Oza M., Murphy J. Molecular cloning and DNA sequence analysis of a diphtheria toxin iron-dependent regulatory element (dtxR) from Corynebacterium diphtheriae II Proc. Nat. Acad. Sci. 1990. V. 87. P. 5968-5972.

60. Brahmachary M., Krishnan S.P., Koh J.L., Khan A.M., Seah S.H., Tan T.W., Brusic V., Bajic V.B. ANTIMIC: a database of antimicrobial sequences // Nucl. Acids Res. 2004. Jan 1;32 Database issue: D586-9.

61. Braun V., Pilsl H., Gross P. Colicins: structures, modes of action, transfer through membranes, and evolution // Arch. Microbiol. 1994. V. 161(3). P. 199-206.

62. Breukink E., Wiedemann I., van Kraaij C., Kuipers O.P., Sahl H-G., de Kruijff B. Use of the cell wall precursor lipid II by a pore-forming peptide antibiotic // Science. 1999. V. 286(5448). P. 2361-2364.

63. Brock. T.D. Thermophilic microorganisms ahd life at high temperatures. 1978, 2nd ed., Springer-Verlag, NY-Berlin-Heidelberg.

64. Brotz H., Bierbaum G., Reynolds P., Sahl H.-G. The lantibiotic mersacidin inhibits peptidoglycan biosynthesis at the level of transglycosylation // Eur. J. Biochem. 1997. V. 246(1). P. 193-199.

65. Brotz H., Josten M., Wiedemann I., Schneider U., Gotz F., Bierbaum G., Sahl H.-G. The lantibiotic mersacidin inhibits peptidoglycan synthesis by targeting lipid II // Ant. Agents Chemother. 1998. V. 42(1). P. 154-160.

66. Brown J.R., Doolittle W.F. Archaea and the prokaryote-to-eukaryote transition // Microb. Mol. Biol. Rev. 1997. V. 61(4). P. 456-502.

67. Bsat N., Helmann J. Interaction of Bacillus subtilis Fur (ferric uptake repressor) with the dhb operator in vitro and in vivo // J. Bacteriol. 1999. V. 181(14). P. 4299-4307.

68. Bsat N., Herbig A., Casillas-Martinez L., Setlow P., Helmann J. Bacillus subtilis contains multiple Fur homologues: identification of the iron uptake (Fur) and peroxide regulon (PerR) repressors // Mol. Microbiol. 1998. V. 29(1). P. 189-198.

69. Budzikiewicz, H., Bossenkamp A., Taraz K., Pandey H., Meyer J.-M. Corynebactin, a cyclic catecholate siderophore from Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 (Brevibacterium sp. DSM 20411) H Z. Naturforsch. (C) 1997. V. 52. P. 551-554.

70. Budzikiewicz H. Secondary metabolites from fluorescent pseudomonads // FEMS Microbiol. Rev. 1993. V. 10(3-4). P. 209-228.

71. Burbulis D., Trach K., Hoch J. Inintiation of sporulation in B. subtilis is controlled by a multicomponent phosphorelay // Cell. 1991. V. 64. P. 545-552.

72. Bush K. Antimicrobial agents // Cuit. Opin. Chem. Biol. 1997. V. 1(2). P. 169-175.

73. Caccamo D., Maugeri T.L., Gugliandolo C. Identification of thermophilic and marine bacilli from shallow thermal vents by restriction analysis of their amplified 16S rDNA II J. Appl. Microbiol. 2001. V. 91(3). P.-.520-524.

74. Caldwell D.E., Caldwell SJ, Laycock J.P. Thermothrix thioparus gen. et sp. nov., a facultatively anaerobic facultative chemolithotroph living at neutral pH and high temperature // Can. J. Microbiol. 1976. V. 22(10). P. 1509-1517.

75. Chakravarty S., Varadarajan R. Elucidation of factors responsible for enhanced thermal stability of proteins: a structural genomics based study // Biochemistry. 2002. V.41(25). P. 81528161.

76. Challis G.L., Ravel J. Coelichelin, a new peptide siderophore encoded by the Streptomyces coelicolor genome: structure prediction from the sequence of its non-ribosomal peptide synthetase // FEMS Microbiol. Lett. 2000. V. 187(2). P. 111-114.

77. Chan W.C., Dodd H.M., Horn N. Maclean K., Lian L.Y., Bycroft B.W., Gasson M.J., Roberts G.C. Structure-activity relationships in the peptide antibiotic nisin: role of dehydroalanine 5 // Appl. Env. Microbiol. 1996. V. 62(8). P. 2966-2969.

78. Chander M., Setlow В., Setlow P. The enzymatic activity of phosphoglycerate mutase from gram-positive endospore-forming bacteria requires Mn2+ and is pH sensitive // Can. J. Microbiol. 1998. V. 44 (8). P. 759-767.

79. Chater K.F. Multilevel regulation of Streptomyces differentiation // Trends Genet. 1989. V. 5. P. 372-377.

80. Cherif A., Ouzari H., Daffonchio D., Cherif H., Ben Slama K., Hassen A., Jaoua S.,

81. Boudabous A. Thuricin 7: a novel bacteriocin produced by Bacillus thuringiensis BMG1.7, a new strain isolated from soil // Lett. Appl. Microbiol. 2001. V. 32(4). P. 243-247.

82. Claus D., Berkeley R. Genus Bacillus Cohn 1872. In: Bergey's manual of systematic bacteriology. V.2. / Eds Sneath P. et al. Baltimor: Tne Williams&Wilkins Co. 1986. P. 1105-1140.

83. Cohen M. Epidemiology of drug resistance: implications for a post-antibiotic era // Sciense. 1992. V. 257(5073). P. 1064-1073.

84. Cordovilla P., Valdivia E., Gonzalez-Segura A., Galvez A., Martinez-Bueno M., Maqueda ^ M. Antagonistic action of the bacterium Bacillus licheniformis M-4 toward the amoeba Naegleriafowled //J. Eukaryot. Microbiol. 1993. V. 40(3). P. 323-328.

85. Corvey C., Stein Т., Dusterhus S., Karas M., Entian K.D. Activation of subtilin precursors by Bacillus subtilis extracellular serine proteases subtilisin (AprE), WprA, and Vpr // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 304(1). P. 48-54.

86. Crichton R.R., Charloteoux-Wauters M. Iron transport and storage // Eur. J. Biochem. 1987. V. 164. P. 487-506.

87. Cromwick A.M., Gross R.A. Effects of manganese (II) on Bacillus licheniformis ATCC 9945A physiology and gamma-poly(glutamic acid) formation // Int. J. Biol. Macromol. 1995. V. 17(5). P. 259-267.

88. Crosa J.H. Genetics and molecular biology of siderophore-mediated iron transport in bacteria // Microbiol. Rev. 1989. V. 53(4). P. 517-530.

89. Crosa J.H. Signal transduction and transcriptional and posttranscriptional control of iron-regulated genes in bacteria // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997. V. 61(3). P. 319-336.

90. Crosa J.H., Walsh C.T. Genetics and assembly line enzymology of siderophore biosynthesis in bacteria // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. V. 66(2). P. 223-249.

91. Davies J. What are antibiotics? Archaic functions for modern activities // Mol. Microbiol. * 1990. V. 4(8). P. 1227-1232.

92. Davies M.J., Donkor R., Dunster C.A., Gee C.A., Jonas S., Willson R.L. Desferrioxamine (Desferal) and superoxide free radicals. Formation of an enzyme-damaging nitroxide // Biochem. J. 1987. V. 246(3). P. 725-729.

93. De Voss J., Rutter K., Schroder В., Barry III C. Iron acquisition and metabolism by mycobacteria//J. Bacteriol. 1999. V. 181 (15). P. 4443-4451.

94. Demain A.L. Pharmaceutically active secondary metabolites of microorganisms // Appl. Microb. Biotech. 1999. V.52. P. 455-463.

95. Dhillon A., Teske A., Dillon J., Stahl D.A., Sogin M.L. Molecular characterization of sulfate-reducing bacteria in the Guaymas Basin // Appl. Env. Microbiol. 2003. V. 69(5). P. 27652772.

96. Donadio S., Carrano L., Brandi L., Senna S., Soffientini A., Raimondi E., Montanini N. Sosio M., Gualerzi C.O. Targets and assays for discovering novel antibacterial agents // J. Biotechnol. 2002. V. 99(3). P. 175-185.

97. Donahue Т., Bernlohr R. Properties of the Bacillus licheniformis A5 glutamine synthetase purified from cells grown in the presence of ammonia or nitrate // J. Bacteriol. 1981. V. 147 (2). P. 589-601.

98. Dorenbos R., Stein Т., Kabel J., Bruand C., Balhuis A., Bron S., Quax W., van Dijl J.M. Thiol-disulfide oxidoreductases are essential for the production oh the lantibiotic sublancin 168 // J. Biol. Chem. 2002. V. 277 (19). P. 16682 16688.

99. Drechsel H., Jung G. Peptide siderophores // J. Pept. Sci. 1998. V. 4 (3). P. 147-181.

100. Drechsel H., Thieken A., Reissbrodt R., Jung G., Winkelmann G. Alpha-keto acids are novel siderophores in the genera Proteus, Providencia, and Morganella and are produced by amino acid deaminases // J. Bacteriol. 1993. V. 175 (9). P. 2727-2733.

101. Dubrac S., Touati D. Fur positive regulation of iron superoxide dismutase in Escherichia coli: functional analysis of the sodB promoter // J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 3802-3808.

102. Dussurget O., Rodriguez M., Smith I. An ideR mutant of Mycobacterium smegmatis has derepressed siderophore production and an altered oxidative-stress response // Mol. Microbiol. 1996. V. 22 (3). P. 535-544.

103. Eisenstadt E., Fisher S., Der C., Silver S. Manganese transport in Bacillus subtilis W23 during growth and sporulation // J. Bacteriol. 1973. V. 113(3). P. 1363-1372.

104. Ennahar S., Sashihara Т., Sonomoto K., Ishizaki A. Class Ila bacteriocins: biosynthesis, structure and activity // FEMS Microbiol. Rev. 2000. V. 24(1). P. 85-106.

105. Entian K.D., de Vos W.M. Genetics of subtilin and nisin biosyntheses: biosynthesis of lantibiotics // Antonie Van Leeuwenhoek. 1996. V. 69(2). P. 109-117.

106. Escolar L., Perez-Martin J., de Lorenzo V. Opening the iron box: transcriptional metalloregulation by the Fur protein // J. Bacteriol 1999. V. 181 (20). P. 6223-6229.

107. Eymann C., Mittenhuber G., Hecker M. The stringent response, oH-dependent gene expression and sporulation in Bacillus subtilis II Mol. Gen. Genet. 2001. 264. 913-923.

108. Fiedler H.P., Krastel P., Muller J., Gebhardt K., Zeeck A. Enterobactin: the characteristic catecholate siderophore of Enterobacteriaceae is produced by Streptomyces species // FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 196(2). P. 147-151.

109. Field L.H., Headley V.L., Payne S.M., Berry L.J. Influence of iron on growth, morphology, outer membrane protein composition, and synthesis of siderophores in Campylobacter jejuni II Infect. Immun. 1986. V. 54 (1). P. 126-132.

110. Fikes J.D., Crabtree B.L., Barridge B.D. Studies on the mode of action of a bacteriocin produced by Bacillus stearothermophilus II Can. J. Microbiol. 1983. V. 29(11). P. 1576-1582.

111. Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dismutases // Annu. Rev. Biochem. 1995. V. 64. P. 97-112.

112. Friedman S.M. Thermophilic microorganisms. In: Encyclopedia of microbiology.1.derberg J., ed. 1992, Acad. Press, NY. V. 4. P. 217-229.

113. Fuangthong M., Herbig A., Bsat N., Helmann J. Regulation of the Bacillus subtilis fur and perR genes by PerR: not all members of the PerR regulon are peroxide inducible // J. Bacterid. 2002. V. 184(12). P. 3276-3286.

114. Giangaspero A., Sandri L., Tossi A. Amphipathic a-helical antimicrobial peptide // Eur. J. Biochem. 2001. V. 268. P. 5589-5600.

115. Goh E.B., Yim G., Tsui W., McClure J., Surette M.G., Davies J. Transcriptional modulation of bacterial gene expression by subinhibitory concentrations of antibiotics // Proc. Nat. Acad. Sci. 2002. V. 99(26). P. 17025-17030.

116. Goldman S.J., Lammers P.J., Berman M.S., Sanders-Loehr J. Siderophore-mediated iron uptake in different strains of Anabaena sp. // J. Bacteriol. 1983. V. 156 (3). P. 1144-1150.

117. Guedon E., Moore C., Que Q., Wang Т., Ye R., Helmann J.D. The global transcription response of Bacillus subtilis to manganese involves the MntR, Fur, TnrA and aB regulons // Mol. Microbiol. 2003. V. 49(6). P. 1477-1491.

118. Guerinot M.L. Microbial iron transport // Annu. Rev. Microbiol. 1994. V. 48. P. 743-772.

119. Guder A., Schmitter Т., Wiedemann I., Sahl H.-G., Bierbaum G. Role of the single regulator MrsRl and the two-component system MrsR2/K2 in the regulation of mersacidin production and immunity // Appl. Env. Microbiol. 2002. V. 68 (1). P. 106-113.

120. Haag H., Fiedler H.P., Meiwes J., Drechsel H., Jung G., Zahner H. Isolation and biological characterization of staphyloferrin B, a compound with siderophore activity from staphylococci. // FEMS Microbiol. Lett. 1994. V. 115 (2-3). P. 125-130.

121. Halle F., Meyer J.M. Ferrisiderophore reductase of Pseudomonas purification, properties and cellular location of the Pseudomonas aeruginosa ferripyoverdine reductase // Eur. J. Biochem. 1992. V. 209. P. 613-620.

122. Hancock R.W.E. Peptide antibiotic // Lancet. 1997. V. 349. P. 418-422.

123. Hancock R.W.E., Chappie D. Peptide antibiotics // Ant. Agents Chemother. 1999. V. 43(6). P. 1317-1323.

124. Hansen J.N. Antibiotic synthesized by posttranslational modification // Annu. Rev. Microbiol. 1993. V. 47. P. 535-564.

125. Hantke K. Cloning of the repressor protein gene of iron regulated system in Escherichia coli K-12 // Mol. Gen. Genet. 1984. V. 197. P. 337-341.

126. Hantke K. Selection procedure for deregulated iron transport mutants (fur) in Escherichia coli K-12: Fur not only affects iron metabolism // Mol. Gen. Genet. 1987. V. 210. P. 135-139.

127. Harwood C.R., ed. The genus Bacillus. 1989, Plenum-Press, NY-London. 414 pp.

128. Hechard Y., Sahl H.-G. Mode of action of modified and unmodified bacteriocins from Gram-positive bacteria // Biochimie. 2002. V. 84(5-6). P. 545-557.

129. Henriques A., Melsen L., Moran C. Involvement of superoxide dismutase in spore coat assembly in Bacillus subtilis II J. Bacterid. 1998. V. 180(9). P. 2285-2291.

130. Hill P.J., Cockayne A., Landers P., Morrissey J., Sims C., Williams P. SirA, a novel iron-dependent repressor in Staphylococcus epidermidis II Infect. Immun. 1998. V. 66. P. 4123-4129.

131. Hoch J. Regulation of the phosphorelay and the initiation of sporulation in Bacillus subtilis II Annu. Rev. Microbiol. 1993. V. 47. P. 441-465.

132. Huang H. Action of antimicrobial peptides: two-state model // Biochemistry. 2000. V.39(29). P. 8347-8352.

133. Hyronimus В., Le Marrec C., Urdaci M. Coagulin, a bacteriocin-like inhibitory substance produced by Bacillus coagulans UII J. Appl. Microbiol. 1998. V. 85 (1). P. 42 50.

134. Ireton K., Jin S., Grossman A., Sonenshein A. Krebs cycle function s required for activation of the SpoOA transcription factor in Bacillus subtilis // Proc. Nat. Acad. Sci. 1995. V. 92. P. 2845-2849.

135. Jack R.W., Bierbaum G., Heidrich C., Sahl H.-G. The genetics of lantibiotic biosynthesis // BioEssays. 1995. V. 17(9). P. 793-802.

136. Jenny K., Kappeli O., Fiechter A. Biosurfactants from Bacillus licheniformis: structural analysis and characterization // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1991. V. 36 (1). P. 5-13.

137. Karatas A.Y., Cetin S., Ozcengiz G. The effects of insertional mutations in comQ, comP, srfA, spoOH, spoOA and abrB genes on bacilysin biosynthesis in Bacillus subtilis // Biochim. Biophys. Acta. 2003. V. 1626 (1-3). P. 51-56.

138. Kashefi K., Lovley D. Extending the upper temperature limit for life // Science. 2003. V. 301(5635). P. 934.

139. Katz E., Demain A.L. The peptide antibiotics of Bacillus: chemistry, biogenesis, and possible functions // Bacteriol. Rev. 1977. V. 41(2). P. 449-474.

140. Kehres D.G., Maguire M.E. Emerging themes in manganese transport, biochemistry and pathogenesis in bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 2003. V. 27 (2-3). P. 263-290.

141. Killian J.A. Synthetic peptides as models for intrinsic membrane proteins // FEBS Letters. 2003. V. 555. P. 134-138.

142. Kirsch D.R., Lai M.H., McCullough J., Gillum A.M. The use of beta-galactosidase gene fusions to screen for antibacterial antibiotics // J. Antibiot. 1991. V. 44(2). P. 210-217.

143. Klaenhammer T.R. Genetics of bacteriocins produced by lactic-acid bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 1993. V. 12. P. 39-86.

144. Kleerebezem M., Quadri L. Peptide pheromone-dependent regulation of antimicrobial peptide production in Gram-positive bacteria: a case of multicellular behavior // Peptides. 2001. V. 22. P.1579-1596.

145. Klein C., Kaletta C., Entian K.D. Biosynthesis of the lantibiotic subtilin is regulated by a histidine kinase / response regulator system // Appl. Env. Microbiol. 1993. V. 59(1). P. 296-303.

146. Klein C., Kaletta C., Schnell N., Entian K.D. Analysis of genes involved in biosynthesis of the lantibiotic subtilin // Appl. Env. Microbiol. 1992. V. 58(1). P. 132-142.

147. Kleinkauf H., von Dohren H. Nonribosomal biosynthesis of peptide antibiotics // Eur. J. Biochem. 1990. V. 192. P. 1-15.

148. Kleinkauf H., von Dohren H. Peptide antibiotics, P-lactams, and related compounds // Crit. Rev. Biotechnol. 1988. V. 8(1). P. 1-23.

149. Konings W.N., Albers S.V., Koning S., Driessen A.J. The cell membrane plays a crucial role in survival of bacteria and archaea in extreme environments // Antonie Van Leeuwenhoek. 2002. V. 81 (1-4). P. 61-72.

150. Konisky J. Colicins and other bacteriocins with established mode of action // Annu. Rev. Microbiol. 1982. V. 36. P. 125-144.

151. Kordel M., Benz R., Sahl H.-G. Mode of action of the staphylococcin-like peptide Pep5: voltage-dependent depolarization of bacterial and artificial membranes II J. Bacteriol. 1988. V. 170(1). P. 84-88.

152. Koster W. ABC-transporter-mediated uptake of iron, siderophores, heme and vitamin В12 // Res. Microbiol. 2001. V. 152. P. 291-301.

153. Kumar S., Tsai C., Nussinov R. Factors enhancing protein thermostability // Protein Eng.2000. V. 13. P. 179-191.

154. Ladenstein R., Antranikian G. Proteins from hyperthermophiles: stability and enzymatic catalysis close to the boiling point of water // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1998. V. 61. P. 37-85.

155. Lamont I., Beare P., Ochsner U., Vasil A., Vasil M. Siderophore-mediated signaling regulates virulence factor production in Pseudomonas aeruginosa II Proc. Nat. Acad. Sci. 2002. V. 99(10). P. 7072-7077.

156. Lazazzera B.A. The intracellular function of extracellular signaling peptides // Peptides.2001. V. 22. P. 1519-1527.

157. Lebbadi M., Valdivia E., Galvez A., Martinez-Bueno M., Maqueda M. Cocultivation of the amoeba Naegleria fowled and the amoebicin-producing strain Bacillus licheniformis M-4 // Appl. Env. Microbiol. 1995. V. 61(4). P. 1649-1652.

158. Lee K.-Y., Weinberg E. Sporulation of Bacillus megaterium: roles of metal ions // Microbios. 1971. V. 3 (12). P. 215-224.

159. Lee S.G., Littau V., Lipmann F. The relation between sporulation and the induction of antibiotic synthesis and of amino acid uptake in Bacillus brevis И J. Cell. Biol. 1975. V. 66(2). P. 233-242.

160. Leoni L., Ciervo A., Orsi N., Visca P. Iron-regulated transcription of the pvdA gene in Pseudomonas aeruginosa: effect of Fur and PvdS on promoter activity // J. Bacterid. 1996. V. 178 (8). P. 2299-2313.

161. Levy A., Shomer-Weisman P., Fry M. Distamycin paradoxically stimulates the coping of• oligo(dA)-poly(dT) by DNA polymerases // Biochemistry. 1989. V. 28(18). P. 7262-7267.

162. Lin S.-C., Minton M.A., Sharma M.M., Georgiou G. Structural and immunological characterization of a biosurfactant produced by Bacillus licheniformis JF-2 // Appl. Env. Microbiol. 1994. V. 60(1). P. 31-38.

163. Malkhosyan S.R., Panchenko Yu.A., Rekesh A.N. A physiological role for DNA supercoiling in the anaerobic regulation of colicin gene expression // Mol. Gen. Genet. 1991. V. 225(2). P. 342-345.

164. Marahiel M.A., Danders W., Krause M, Kleinkauf H. Biological role of gramicidin S in spore functions. Studies on gramicidin-S-negative mutants of Bacillus brevis ATCC9999 // Eur. J. Biochem. 1979. V. 99(1). P. 49-55.

165. Marahiel M.A., Nakano M.M., Zuber P. Regulation of peptide antibiotic production in

166. Bacilus II Mol. Microbiol. 1993. V. 7(5). P. 631-636.

167. Marahiel M.A., Zuber P., Czekay G., Losick R. Identification of the promoter for a peptide antibiotic biosynthesis gene from Bacillus brevis and its regulation in Bacillus subtilis // J. Bacterid. 1987. V. 169(5). P. 2215-2222.

168. Marciset O., Jeronimus-Stratingh M.C., Mollet В., Poolman B. Thermophilin 13, a nontypical antilisterial poration complex bacteriocin, that functions without a receptor // J. Biol. Chem. 1997. V. 272(22). P. 14277-14284.

169. Martirani L., Varcamonti M., Naclerio G., De Felice M. Purification and partial characterization of bacillocin 490, a novel bacteriocin produced by a thermophilic strain of Bacillus licheniformis 11 Microb. Cell Factor. 2002. V. 1(1). P.

170. Matsushita O., Okabe A., Hayashi H., Kanemasa Y. Lincomycin increases the half-life of beta-lactamase mRNA // Antimicrob. Agents Chemother. 1989. V. 33(6). P. 805-809.

171. McAuliffe О., Ross R., Hill C. Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action // FEMS Microbiol. Rev. 2001. V. 25(3). P. 285-308.

172. McCafferty D.G., Cudic P., Yu M.K., Behenna D.C., Kruger R. Synergy and duality in peptide antibiotic mechanisms // Curr. Opin. Chem. Biol. 1999. V. 3 (6). P. 672-680.

173. Miller M., Bassler B. Quorum-sensing in bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 2001. V. 55. P. 165-199.

174. Modest В., Marahiel M., Pschorn W., Ristow H. Peptide antibiotics and sporulation: induction of sporulation in asporogenous and peptide-negative mutants of Bacillus brevis И J. Gen. Microbiol. 1984. V. 130 (4). P. 747-755.

175. Moeck G., Coulton J. TonB-dependent iron acquisition: mechanisms of siderophore-mediated active transport // Mol. Microbiol. 1998. V. 28 (4). P. 675-681.

176. Moll G.N., Konings W.N., Driessen A.J. Bacteriocins: mechanism of membrane insertion and pore formation // Antonie Van Leeuwenhoek. 1999. V. 76 (1-4). P. 185-198.

177. Mootz H.D., Marahiel M.A Biosynthetic systems for nonribosomal peptide antibiotic assembly // Curr. Opin. Chem. Biol. 1997. V. 1 (4). P. 543-551.

178. Msadek T. When the going gets tough: survival strategies and environmental signaling networks in Bacillus subtilis И Trends Microbiol. 1999. V. 7(5). P. 201-207.

179. Mukheijee P., Paulus H. Biological function of gramicidin: Studies on gramicidin-negative mutants // Proc. Nat. Acad. Sci. 1977. V. 74(2). P. 780-784.

180. Mullis K.B., Pollack J.R., Neilands J.B. Structure of schizokinen, an iron-transport compound from Bacillus megaterium II Biochemistry. 1971. V. 10. P. 4894-4898.

181. Nakamura L.K. Phylogeny of Bacillus sphaericus-like organisms // Int. J. Syst. Evol. Microb. 2000. V. 50. P. 1715-1722.

182. Nakano M.M., Corbell N., Besson J., Zuber P. Isolation and characterization of sjp: a gene that functions in the production of the lipopeptide biosurfactant, surfactin, in Bacillus subtilis II Mol. Gen. Genet. 1992. V. 232. P. 313-321.

183. Nakano M.M., Zuber P. Molecular biology of antibiotic production in Bacillus II Crit. Rev. Biotechnol. 1990. V. 10(3). P. 223-240.

184. Neilands J. B. Methodology of siderophores // Structure and Bonding. 1984. V.58. P. 1-24.

185. Neilands J.B. Siderophores: structure and function of microbial iron transport compounds // J. Biol. Chem. 1995. V. 270 (45). P. 26723-26726.

186. Nes I.F., Diep D.B., Havarstein L.S., Brurberg M.B., Eijsink V., Holo H. Biosynthesis of bacteriocins in lactic acid bacteria // Antonie Van Leeuwenhoek. 1996. V. 70(2-4). P. 113-128.

187. Nesemann G., Prave P., Sukatsch D., Vertesy L. Ein Polyen-Antibiotikum aus Bakterien // Naturwissenschaften. 1972. V. 59 (2). P. 81-82.

188. Nissen-Meyer J., Holo H., Havarstein, L, Sletten, K., Nes, I. A novel lactococcal bacteriocin whose activity depends on the complementary action of two peptides // J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 5686-5692.

189. Nisbet L.J., Moore M. Will natural products remain an important source of drug research for the future? // Curr. Opin. Biotech. 1997. V. 8(6). P. 708-712.

190. Niu W., Neu H.C. Activity of mersacidin, a novel peptide, compared with that of vancomycin, teicoplanin, and daptomycin // Ant. Agents Chemother. 1991. V. 35(5). P. 998-1000.

191. Norris J.R., Berkeley R.C.W., Logan N.A., O'Donnel A.G. The genera Bacillus and Sporolactobacillus. In: The Prokariotes. Starr M., Stolp H., Trtiper H.G., Balows Slegel H.G., eds. 1981, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-NY. V. 2. P. 1711-1742.

192. Novotny J., Perry J. Characterization of bacteriocins from two strains of Bacillus thermoleovorans, a thermophilic hydrocarbon-utilizing species // Appl. Env. Microbiol. 1992. V. 58(8). P. 2393-2396.

193. Ochi K., Ohsawa S. Initiation of antibiotic production by the stringent response of Bacillus subtilis Marburg // J. Gen. Microbiol. 1984. V. 130(10). P. 2473-2482.

194. Oh Y, Freeze E. Manganese requirement of phosphoglycerate phosphomutase and its consequences for growth and sporulation of Bacillus subtilis II J. Bacteriol. 1976. V. 127 (2). P. 739746.

195. Oscariz J.C., Lasa I., Pisabarro A.G. Detection and characterization of cerein 7, a new bacteriocin produced by Bacillus cereus with a broad spectrum of activity // FEMS Microb. Lett. 1999. V. 178(2). P. 337-341.

196. Oscariz J.C., Pisabarro A.G. Characterization and mechanism of action of cerein 7, a bacteriocin produced by Bacillus cereus Bc7 // J. Appl. Microbiol. 2000. V. 89(2). P. 361-369.

197. Oscariz J.C., Pisabarro A.G. Classification and mode of action of membrane-active bacteriocins produced by gram-positive bacteria // Int. Microbiol. 2001. V. 4 (1). P. 13-19.

198. Page W., von Tigerstrom M. Aminochelin, a catecholate siderophore produced by Azotobacter vinelandii // J. Gen. Microbiol. 1988. V. 134. P. 453-460.

199. Paik H.D., Bae S.S., Park S.H., Pan J.G. Identification and partial characterization of tochicin, a bacteriocin produced by Bacillus thuringiensis subsp tochigiensis // Ind, Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 19(4). P. 294-298.

200. Parente E., Ricciardi A. Production, recovery and purification of bacteriocins from lactic acid bacteria // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 52(5). P. 628-638.

201. Peters W.J., Warren R.A.J. Itoic acid biosynthesis in Bacillus subtilis // J. Bacterid. 1968. V. 95(2). P. 360-368.

202. Pettersson В., de Silva S. K., Uhlen M., Priest F.G. Bacillus siralis sp. nov., a novel species from silage with a higher order structural attribute in the 16SrRNA genes // Int. J. Syst. Evol. Microb. 2000. V. 50. P. 2181-2187.

203. Phobe C., Combie J., Albert F.G. Extremophilic organisms as an unexplored source of antifungal compounds // J. Antibiot. 2001. V. 54(1). P. 56-65.

204. Pigott P.J. Spore development in Bacillus subtilis II Curr. Opin. Gen. Dev. 1996. V. 6 (5). P. 531-537.

205. Piret J., Demain A. Sporulation and spore properties of Bacillus brevis and its gramicidin S-negative mutamt // J. Gen. Microbiol. 1983. V. 129. P. 1309-1316.

206. Potvin C., Leclerc D., Tremblay G., Asselin A., Bellemare G. Cloning, sequencing and expression of a Bacillus bacteriolytic enzyme in Escherichia coli II Mol. Gen. Genet. 1988. V. 214 (2). P. 241-248.

207. Pradella S., Hippe H., Stackebrandt E. Macrorestriction analysis of Desulfurella acetivorans and Desulfurella multipotens. II FEMS Microbiol. Lett. 1998. V. 159(1). P. 137-144.

208. Priest F.G. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus II Bacteriol. Rev. 1977. V. 41(3). P. 711-753.

209. Priest F.G., Goodfellow M., Todd C. A numerical classification of the genus Bacillus II J. Gen. Microbiol. 1988. V. 134 (7). P. 1847-1882.

210. Pschorn W., Paulus H., Hansen J., Ristow H. Induction of sporulation in Bacillus brevis. 2. Dependence on the presence of the peptide antibiotics tyrocidine and linear gramicidin // Eur. J. Biochem. 1982. V. 129 (2). P. 403-407.

211. Pugsley A.P. The ins and outs of colicins. Part I: Production, and translocation across membranes // Microbiol. Sci. 1984. V. 1 (7). P. 168-175.

212. Quadry L.E.N. Assembly of aryl-capped siderophores by modular peptide synthetases and polyketide synthases //Mol. Microbiol. 2000. V. 37(1). P. 1-12.

213. Que Q., Helmann J.D. Manganese homeostasis in Bacillus subtilis is regulated by MntR, a bifunctional regulator related to the diphtheria toxin repressor family of proteins // Mol. Microbiol. 2000. V. 35(6). P. 1454-1468.

214. Rainey F,, Fritze D., Stackerbrand E. The phylogenetic diversity of thermophilic members of the genus Bacillus sa revealed by 16S rDNA analysis // FEMS Microbiol. Letters. 1994. V.115 (23). P. 205-212.

215. Ratnayake-Lecamwasan M., Serror P., Wong K.-W., Sonenshein A. Bacillus subtilis CodY represses early-stationary-phase genes by sensing GTP levels // Gen. Dev. 2001. V. 15. P. 1093-1103.

216. Raymond K.N., Dertz E.A., Kim S.S. Enterobactin: an archetype for microbial iron transport//Proc. Nat. Acad. Sci. 2003. V. 100(7). P. 3584-3588.

217. Reimmann C., Serino L., Beyeler M., Haas D. Dihydroaeruginoic acid synthetase and pyochelin synthetase, products of the pchEF genes, are induced by extracellular pyochelin in Pseudomonas aeruginosa //Microbiology. 1998. V. 144 (11). P. 3135-3148.

218. Riley M. Molecular mechanisms of bacteriocin evolution // Annu. Rev. Genet. 1998. V. 32. P. 255-278.

219. Rioux C., Jordan D., Rattray J. Colorimetric determination of catechol siderophores in microbial cultures II Anal. Biochem. 1983. V. 133(1). P. 163-169.

220. Ristow H., Paulus H. Induction of sporulation in Bacillus brevis. 1. Biochemical events and modulation of RNA synthesis during induction by tyrocidine // Eur. J. Biochem. 1982. V. 129(2). P. 395-401.

221. Ristow H., Schazschneider В., Bauer К., Kleikauf H. Tyrocidine and the linear gramicidin. Do these peptide antibiotics play an antagonistic regulative role in sporulation? // Biochim. Biophys. Acta. 1975. V. 390(2). P. 246-252.

222. Rowland B.M., Grossman Т.Н., Osburne M.S., Taber H.W. Sequence and genetic organization of a Bacillus subtilis operon encoding 2,3-dihydroxybenzoate biosynthetic enzymes // Gene. 1996. V. 178(1-2). P. 119-123.

223. Rowland B.M., Taber H.W. Duplicate isochorismate synthase genes of Bacillus subtilis: regulation and involvement in the biosyntheses of menaquinone and 2,3-dihydroxybenzoate // J. Bacteriol. 1996. V. 178(3). P. 854-861.

224. Sahl H-G., Jack R.W., Bierbaum G. Biosynthesis and biological activities of lantibiotics with unique post-translational modifications // Eur. J. Biochem. 1995. V. 230. P. 827-853.

225. Saris P.E., Immonen Т., Reis M., Sahl H.-G. Immunity to lantibiotics // Antonie Van Leeuwenhoek. 1996. V. 69(2). P. 151-159.

226. Sarkar N., Langley D., Paulis H. Biological function of gramicidin: selective inhibition of RNA polymerase // Proc. Nat. Acad. Sci. 1977. V. 74(4). P. 1478-1482.

227. Schaffer P. Sporulation and the production of antibiotics, exoenzymes, and exotonins // Bacteriol. Rev. 1969. V. 33(1). P. 48-71.

228. Schneider R., Hantke K. Iron-hydroxamate uptake systems in Bacillus subtilis: identification of a lipoprotein as part of a binding protein-dependent transport system // Mol. Microbiol. 1993. V. 8(1). P. 111-121.

229. Schone R. An antibiotic which inhibits Corynebacterium diphtheriae produced by the S form of Streptomyces thermophilus II Ant. Chemother. 1951. V. 1. P. 176-180.

230. Schroder I., Johnson E., de Vries S. Microbial ferric iron reductases // FEMS Microbiol. Rev. 2003. V. 27(2-3). P. 427-447.

231. Schuller F., Benz R., Sahl H.-G. The peptide-antibiotic subtilin acts by formation of voltage-dependent multi-state pores in bacterial and artificial membranes // Eur. J. Biochem. 1989. V. 182(1). P. 181-186.

232. Schuurmans D., Olson В., Clemente C. Production and isolation of thermoviridin, an antibiotic produced by Thermoactinomyces viridis n. sp. // Appl. Microbiol. 1956. V. 4(2). P. 61-66.

233. Schwyn В., Neilands J.B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores // Anal. Biochem. 1987. V. 160 (1). P. 47-56.

234. Shai Y. Molecular recognition between membrane-spanning polypeptides // Trends Biochem. Sci. 1995. V. 20. P. 460-464.

235. Shai Y., Oren Z. From "carpet" mechanism to de-novo designed diastereomeric cell-selective antimicrobial peptides // Peptides. 2001. V. 22. P. 1629-1641.

236. Sharman G.J., Williams D.H., Ewing D.F., Ratledge C. Isolation, purification and structure of exochelin MS, the extracellular siderophore from Mycobacterium smegmatis II Biochem. J. 1995. V. 305. P. 187-196.

237. Sharp R.J., Bown K.J., Atkinson A. Phenotypic and genotypic characterization of some thermophilic species of Bacillus II J. Gen. Microbiol. 1980. V. 117(1). P. 201-210.

238. Shen J., Meldrum A., Poole K. FpvA receptor involvement in pyoverdine biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. 2002. V. 184(12). P. 3268-3275.

239. Shida O., Takagi H., Kadowaki K., Komagata K. Proposal for two new genera, Brevibacillus gen. nov. and Aneurinibacillus gen. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. V. 46(4). P. 939-946.

240. Shin S.Y., Yang S.T., Park E.J., Eom S.H., Song W.K., Kim Y„ Hahm K.S., Kim J.I. Salt resistance and synergistic effect with vancomycin of alpha-helical antimicrobial peptide PI 8 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 290 (1). P. 558-562.

241. Shiraldi C., De Rosa M. The production of biocatalysts and biomolecules from extremophiles // Trends Biothechnol. 2002. V. 20(12). P. 512-521.

242. Stein Т., Heinzmann S., Kiesau P., Himmel В., Entian K.-D.The spa-box for transcriptional activation of subtilin biosynthesis and immunity in Bacillus subtilis II Mol. Microbiol. 2003. V. 47(6). P. 1627-1636.

243. Stetter K.O. Extremophiles and their adaptation to hot environments // FEBS Lett. 1999. V. 452. P. 22-25.

244. Stevens K.A., Sheldon B.W., Klapes N.A., Klaenhammer T.R. Nisin treatment for inactivation of Salmonella species and other gram-negative bacteria // Appl. Env. Microbiol. 1991. V. 57(12). P. 3613-3615.

245. Stintzi A., Barnes C., Xu J., Raymond K. Microbial iron transport via a siderophore shuttle: A membrane ion transport paradigm // Proc. Nat. Acad. Sci. 2000. V. 97(20). P. 1069110696.

246. Stojilkovic I., Hantke K. Functional domains of the Escherichia coli ferric uptake regulator protein (Fur) // Mol. Gen. Genet. 1995. V. 247. P. 199-205.

247. Strohl W.R. Industrial antibiotics: today and the future. In: Strohl W.R., ed. Biotechnology of antibiotics, 2nd ed. Marcel Dekker, NY, 1997. P 1-47.

248. Stroud R., Reiling K., Wiener M., Freymann D. Ion-channel-forming colicins // Curr. Opin. Struct. Biol. 1998. V. 8. P. 525-533.

249. Studholme D.J., Jackson R.A., Leak D.J. Phylogenetic analysis of transformable strains of thermophilic Bacillus species // FEMS Microbiol. Lett. 1999. V. 172(1). P. 85-90.

250. Symons D.C., Hodgson B. Isolation and properties of Bacillus brevis mutants unable to produce tyrocidine // J. Bacteriol. 1982. V. 151(2). P. 580-590.

251. Tamehiro N., Okamoto-Hosoya Y., Okamoto S., Ubukata M., Hamada M., Naganawa H., Ochi K. Bacilysocin, a novel phospholipid antibiotic produced by Bacillus subtilis 168 // Antimicrob. Agents. Chemother. 2002. V. 46 (2). P. 315-320.

252. Tomashow L. S., Weller D.M. Role of a phenazine antibiotic from Pseudomonas fluorescens in biological control of Gaeumannomyces graminis var. tritici // J. Bacteriol. 1988. V. 170. P. 3499-3508.

253. Touati D. Iron and oxidative stress in bacteria // Arch. Biochem. Biophys. 2000. V. 3731.. P. 1-6.

254. Touzel J.P., O'Donohue M., Debeire P, Samain E., Breton C. Thermobacillus xylanilyticus gen. nov., sp. nov., a new aerobic thermophilic xylan-degrading bacterium isolated from farm soil // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. Y. 50 (1). P. 315-320.

255. Tsuge К., Ano Т., Shoda M. Isolation of a gene essential for biosynthesis of the lipopeptide antibiotics plipastatin B1 and surfactin in Bacillus subtilis YB8 // Arch. Microbiol. 1996. V. 65(4). P. 243-251.

256. Vasantha N., Freeze E. The role of manganese in growth and sporulation of Bacillus subtilis И J. Gen. Microbiol. 1979. V. 112 (2). P. 329-336.

257. Vasil M., Ochsner U. The response of Pseudomonas aeruginosa to iron: genetics, biochemistry and virulence // Mol. Microbiol. 1999. V. 34(3). P. 399-413.

258. Verdine G.L. The combinatorial chemistry of nature // Nature. 1996. Suppl. to v. 384(6604). P. 11-13.

259. Vielle C., Zeikus G. Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability // Micr. Mol. Biol. Rev. 2001. V.65(l). P. 1-43.

260. Villani F., Pepe O., Mauriello G., Salzano G., Moschetti G., Coppola S. Antilisterial activity of thermophilin 347, a bacteriocin produced by Streptococcus thermophilus И Int. J. Food Microbiol. 1995. V. 25 (2). P. 179-190.

261. Vining L.C. Functions of secondary metabolites // Annu. Rev. Microbiol. 1990. V. 44. P. 395-427.

262. Vining L.C., von DOhren H. Peptide and peptide-derived antibiotics // Biotechnology. 1995. V. 28. P. 121-127.

263. Walsh С. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance // Nature. 2000. V. 406 (6797). P. 775-781.

264. Walsh B.L., Warren R.AJ. The iron-uptake system of Bacillus subtilis II Can. J. Microbiol. 1971. V. 17. P. 175-177.

265. Weinberg E. Manganese requirement for sporulation and other secondary biosynthetic processes in Bacillus II Appl. Microbiol. 1964. V. 12(5). P. 436-441.

266. White D., Sharp R.J., Priest F.G. A polyphasic taxonomic study of thermophilic bacilli from a wide geographical area // Antonie Van Leeuwenhoek. 1994. V. 64(3-4). P. 357-386.

267. White S.H., Wimley W.C., Selsted M.E. Structure, function, and membrane integration of defensins // Curr. Opin. Struct. Biol. 1995. V. 5(4). P. 521-527.

268. Wieprecht Т., Dathe M., Krause E., Beyermann M., Maloy W.L., McDonald D., Biernet M. Modulation of membrane activity of amphipathic, antibacterial peptides by slight modifications of the hydrophobic moment // FEBS Letters. 1997. V. 417. P. 135-140.

269. Wishart D.S., Bigam C.G., Yao J., Abildgaard F., Dyson H.J., Oldfield E., Markley J.L., Sykes B.D. 'H, 13C and N chemical shift referencing in biomolecular NMR // J. Biomol. NMR. 1995. V. 6 (2). P. 135-140.

270. Woese C.R., Kandler O., Wheelis M.L. Phylogenic structure of the prokaryotic domain: the primary kingdoms // Proc. Nat. Acad. Sci. 1990. V. 87. P. 4576-4579.

271. Wu M., Maier E., Benz R., Hancock R. Mechanism of interaction of different classes of cationic antimicrobial peptides with planar bilayers and with the cytoplasmic membrane of Escherichia coli II Biochemistry. 1999. V. 38(22). P. 7235-7242.

272. Xu D., Cote J.C. Phylogenetic relationships between Bacillus species and related genera inferred from comparison of 3' end 16S rDNA and 5' end 16S-23S ITS nucleotide sequences // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53(3). P. 695-704.

273. Yakimov M.M., Lunsdorf H., Golyshin P.N. Thermoleophilum album and Thermoleophilum minutum are culturable representatives of group 2 of the Rubrobacteridae (Actinobacteria) // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53(2). P. 377-380.

274. Yakimov M.M., Timmis K.N., Wray V., Fredrickson H.L. Characterization of a new lipopeptide surfactant produced by thermotolerant and halotolerant subsurface Bacillus licheniformis BAS50 // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61(5). P. 1706-1713.

275. Yang C.C., Leong J. Production of deferriferrioxamines В and E from a ferroverdin-producing Streptomyces species // J. Bacteriol. 1982. V. 149(1). P. 381-383.

276. Yu S., Fiss E., Jacobs W.R. Analysis of the exochelin locus in Mycobacterium smegmatis: biosynthesis genes have homology with genes of the peptide synthetase family // J. Bacteriol. 1998.

277. V. 180 (17). P. 4676-4685.

278. Yule R., Barridge B. Isolation and characterization of a bacteriocin produced by Bacillus stearothermophilus strain NU-10// Can. J. Microbiol. 1976. V. 22(12). P. 1743-1750.

279. Zahrt T.C., Song J., Siple J., Deretic V. Mycobacterial FurA is a negative regulator of catalase-peroxidase gene katG // Mol. Microbiol. 2001. V. 39(5). P. 1174-1185.

280. Zakrzewska-Czerwinska J., Nardmann J., Schrempf H. Inducible transcription of the dnaA gene from Streptomyces lividans 66 // Mol. Gen. Genet. 1994. V. 242 (4). P. 440-447.

281. Zamyatnin A.A. EROP-Moscow: specialized data bank for endogenous regulatory oligopeptides // Protein Seq. Data Anal. 1991. V. 4 (1). P. 49-52.

282. Zhang L., Benz R., Hancock R.W.E. Influence of proline residues on the antibacterial and synergistic activities of alpha-helical peptides // Biochemistry. 1999. V. 38(25). P. 8102-8111.

283. Zhang L., Rozek A., Hancock R.W.E. Interaction of cationic antimicrobial peptides withmodel membranes // J. Biol. Chem. 2001. V. 276 (38). P. 35714-35722.

284. Zheng G., Hehn R., Zuber P. Mutational analysis of the sbo-alb locus of Bacillus subtilis: identification of genes required for subtilosin production and immunity // J. Bacteriol. 2000. V. 182(11). P. 3266-3273.

285. Zheng G., Yan L.Z., Vederas J.C., Zuber P. Genes of the sbo-alb locus of Bacillus subtilis are required for production of the antilisterial bacteriocin subtilosin // J. Bacteriol. 1999. V. 181(23). P. 7346-7355.

286. Zou P., Borovok I., Ortiz de Orue Lucana D., Muller D., Schrempf H. The mycelium-associated Streptomyces reticuli catalase-peroxidase, its gene and regulation by FurS // Microbiology. 1999. V. 145 (3). P. 549-559.

Информация о работе

Темиров, Юрий Витальевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Биологически активные вторичные метаболиты-пептиды, образуемые термофильными штаммами бацилл - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы