Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологически активные вещества дикорастущих и интродуцированных растений Allium schoenoprasum L. на европейском северо-востоке России

ВАК РФ 03.02.14, Биологические ресурсы

Автореферат диссертации по теме "Биологически активные вещества дикорастущих и интродуцированных растений Allium schoenoprasum L. на европейском северо-востоке России"

На правах рукописи

ооьоьшич

Бешлей Игорь Васильевич

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДИКОРАСТУЩИХ И ИНТРОДУЦИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ Allium schoenoprasum L. НА ЕВРОПЕЙСКОМ СЕВЕРО-ВОСТОКЕ РОССИИ

03.02.14 - биологические ресурсы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

И MAP 2013

Новосибирск 2013

005050704

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии Коми научного центра УрО РАН, г. Сыктывкар.

Научный руководитель

Официальные оппоненты:

Ведущая организация -

кандидат химических наук, доцент Ширшова Татьяна Ивановна

ФГБУН Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии и биотехнологии

Вышегуров Султан Хаджибикарович

доктор сельскохозяйственных наук, профессор ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет», заведующий кафедрой ботаники

Власенко Наталья Григорьевна

доктор биологических наук, профессор член-корреспондент РАСХН, заслуженный деятель науки РФ

Сибирский научно-исследовательский институт земледелия и химизации сельского хозяйства РАСХН,

заведующая лабораторией агроценологии

ГНУ Сибирский научно-исследовательский институт растениеводства и селекции РАСХН

Защита диссертации состоится « ££>> марта 2013 года на заседании диссертационного совета Д 220.048.04 при ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет» по адресу: 630039, Новосибирск, ул. Добролюбова, 160.

Тел./факс: 8 (383) 264-28-00 e-mail: d sovet@nsau.edu.ru

Автореферат разослан « »

Учёный секретарь диссертационного совета

2013 г.

Князев Сергей Павлович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Растения рода Allium - лук, с каждым годом привлекают все большее внимание исследователей, так как обладают присущей высшим растениям уникальной особенностью синтезировать огромное количество разнообразных вторичных метаболитов, обладающих, как правило, биологической активностью. Как было доказано, вещества, входящие в состав лука, ингибируют рост опухолей и микробных клеток, снижают риск заболевания раком, улавливают свободные радикалы и защищают человека от сердечно-сосудистых заболеваний, что связывают с наличием серосодержащих соединений и флавоноидов (Ly et al., 2005). В литературе неоднократно отмечались высокие антиоксидантные свойства многолетних луков, обусловленные как наличием специфических химических форм селена, так и высокими концентрациями витаминов Е, С и флавоноидов (Clark et al., 1996). Давно известны антицинготные свойства представителей этого рода. В официальной медицине существует набор препаратов, созданных на основе экстрактов из лука репчатого Allium сера L и чеснока A. sativum L., влияющих на моторику желудочно-кишечного тракта и сердечно-сосудистую систему (Червяков и др., 1977; Лютомски, 1980; Машковский, 1984). Многие лекарственные свойства луков связывают с присутствием в них стероидных гликозидов (Nuutila et al., 2003; Kawashima et al., 1993).

Согласно современным данным на территории России и сопредельных государств произрастает 332 вида лука (Черепанов, 1995). В Республике Коми (РК) встречаются лишь три вида, среди которых самый широкий ареал распространения имеет Л. schoenoprasum L. (лук скорода, резанец, шнитт), произрастающий практически на всей территории республики. Однако, несмотря на широкое распространение и многовековое иснользоваЕше шнитт-лука в пищу человеком, его химический состав недостаточно хорошо изучен, а сведений о содержании в нем таких важных классов биологически активных веществ, как липиды, высшие жирные кислоты, недавно обнаруженные в некоторых представителях этого рода стероидные гликозиды (СГ), в научной литературе нет. Недостаточно исследовано и содержание макро- и микроэлементов в этом виде лука.

Исследование практически ценных природных соединений в растениях является одной из ключевых задач ботанического ресурсоведения. Известно, что уровень и характер накопления биологически активных веществ в растениях зависит от многих факторов - климатических условий региона выращивания, географического положения, экологических условий произрастания и культивирования, состава и свойств почвы, агротехнических приемов и др. (Казакова, 1978; Черемушкина, 1992; Тухватуллина, 2010). Учитывая обширность

территории республики и широкое разнообразие ее физико-географических условий, можно ожидать большой изменчивости как в компонентном составе биологически активных веществ (БАВ), так и в их количественном содержании. Первостепенное значение при этом имеет изучение динамики накопления БАВ и микрокомпонентов и определение фенофазы, отвечающей за их максимальное накопление. Поэтому всестороннее и детальное изучение химического состава лука А schoenoprasum, высокая антиоксидантная активность которого была обнаружена рядом авторов (Steiner et al., 2004; 2011), имеет важное теоретическое и практическое значение.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является комплексное исследование содержания важнейших групп БАВ и микронутриентов (нейтральных и фосфолипидов, стеринов, высших жирных кислот, протеиногенных аминокислот, СГ, микро- и макроэлементов) в дикорастущих и культивируемых образцах лука Л. schoenoprasum, мониторинг их накопления в растении, а также изучение некоторых аспектов физиологической активности.

В задачи исследований входило:

1. Эколого-ценотическая характеристика местообитаний А. schoenoprasum на территории PK.

2. Определение содержания и компонентного состава важнейших групп БАВ и микронутриентов в дикорастущих и культивируемых растениях А. schoenoprasum L. и мониторинг их накопления.

3. Выявление зависимости содержания и компонентного состава БАВ от происхождения, фазы развития и зколого-географических условий произрастания.

4. Изучение физиологических свойств субстанций из лука Л. schoenoprasum с целью создания фармакологических композиций антиоксидантной и противоопухолевой направленности.

Научная новизна работы. Впервые из лука А. schoenoprasum выделены важнейшие группы БАВ и микронутриентов - нейтральные и фосфолипиды, стерины, высшие жирные кислоты, СГ спиростанолового и фуростанолового ряда, протеиногенные аминокислоты, проведен мониторинг их накопления в растении, выявлена зависимость содержания и компонентного состава БАВ от происхождения, фазы развития, эдафических и эколого-географических условий произрастания.

Проведен сравнительный анализ содержания и компонентного состава макро- и микроэлементов в культурных и природных образцах А. schoenoprasum из географически удаленных районов PK.

Предварительные экспериментальные исследования противоопухолевого потенциала показали, что водный и водно-спиртовый экстракты листьев лука

проявляют тенденцию к ингибнрованию роста подкожно перевиваемой карциномы Эрлиха у мышей-самцов ВВИ на стадии ее интенсивного развития.

Положения выносимые на защиту:

1. Впервые из растения А. ясЬоетюрпкпт выделены НЛ, основными компонентами которых являются стерины и их эфиры, ВЖК и их эфиры, моно-, ди- и триацилглицерины. Эссенциальные ВЖК, входящие в состав НЛ, имеют строго специфическое распределение по частям растения. Доминирующей в семенах, соцветиях, а также в луковицах и корнях является линолевая кислота. Для листьев характерно высокое содержание линоленовой и линоленовой кислот. Олеиновая кислота накапливается в соцветиях, семенах и покровных чешуях.

2. С помощью методов ВЭЖХ и хромато-масс-спектрометрии показано, что основным компонентом стериновоп фракции является ситостерин, в минорных количествах содержатся холестерин, кампестерин и стигмастерин.

3. Впервые из шнитт-лука выделены стероидные гликозиды спиростано-лового и фуростанолового ряда. Методами хроматографии (ТСХ, ВЭЖХ) и хромато-масс-спектрометрнн идентифицированы два фуростаноловых гли-козида - дельтозид и протодиосцин, спиростаноловый гликозид дельтонин и генин большинства стероидных гликозидов диосгешга.

4. Установлено, что лук А. зсЬоепоргаБит является аккумулятором целого ряда важных для человека макро- и микроэлементов с определенными закономерностями распределения их по частям растения. Влияние комплекса эколого-географических условий произрастания и почвенно-климатических факторов экотопов проявляется в большой вариабельности концентрации элементов. Высокое содержание Сг и Бе, антиоксидантным и антиканцерогенным свойствам которого в последнее время уделяется большое внимание, позволяет отнести этот вид лука к чрезвычайно перспективным объектам фармаконутриентологии.

5. Водный и водно-спиртовый экстракт листьев лука проявляют тенденцию к ингибнрованию роста подкожно перевиваемой карциномы Эрлиха у мышей-самцов ВОР на стадии её интенсивного развития.

Практическое значение. Результаты, полученные в работе, вносят вклад в изучение биохимического состава ресурсного вида А. зскоепоргазит и подтверждают его изменчивость от различных биотических и абиотических факторов произрастания. Месторасположения дикорастущих популяций шнитт-лука, определенные в ходе полевых исследований, могут быть использованы при составлении карт ареала данного вида. Выявленная биологическая активность экстрактов лука Л. ьскоепоргаьит позволяет рекомендовать дальнейшие исследования этого растения на онкопротекторное и ранозаживляющее дей-

ствие с целью создания фармакологических композиций противоопухолевой направленности.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийских молодежных научных конференциях «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2005-2009); Четвертой Международной научной конференции «Биологическое разнообразие. Интродукция растений» (Санкт-Петербург, 2007); X Международном симпозиуме «Эколого-популяционный анализ полезных растений: интродукция, воспроизводство, использование» (Сыктывкар, 2008); Международном симпозиуме «Липиды и оксилипины растений» (Казань, 2008); Всероссийской конференции «Новые достижения химии и химической технологии растительного сырья», (Барнаул, 2009); Международном симпозиуме «Экология арктических и приарктиче-ских территорий» (Архангельск, 2010) и 2-й ежегодной Русско-Корейской конференции "Current issues of natural products chemistry and biotechnology" (Новосибирск, 2010).

Публикации результатов исследования. Г1о материалам работы опубликована 21 печатная работа, из них 7 статей в журналах из «Перечня» ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав (обзор литературы, материал и методы, результаты и их обсуждение), выводов и списка используемой литературы. Работа изложена на 169 страницах (из них 133 страницы - собственно текст диссертации и 36 страниц - приложения). Список литературы включает 181 работу из которых 64 иностранных источников. Текст иллюстрирован 17 таблицами и 28 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе приведены сведения о распространении, видовом разнообразии и условиях обитания растений рода Allium, отдельно представлены виды рода из флоры РК. Рассмотрены современные взгляды на систематику рода, основанные на морфологических, анатомических, фенологических, биохимических, цитологических и молекулярных признаках, а также данных молекулярно-генетического анализа. Приведены ботаническая характеристика растения A. sckoenoprasum, его морфологические и экологические особенности, ареал распространения на территории РК. Дано понятие, первичные и вторичные метаболиты, приведена их классификация. Рассмотрены основные гипотезы о функциях вторичных метаболитов в растениях. Проанализированы данные литературы о содержании в растениях рода Allium первичных метаболитов: нейтральных липидов, фосфолипидов и входящих в них высших жирных кислот, углеводов, протеиногенных аминокислот, рассмотрены их значение

для растения, человека и животных. Приведены сведения о содержании в луках биологически активных веществ: стероидных гликозидов, алкалоидов, фенольных веществ, эфирных масел, витаминов а также об их физиологическом действии на организм растений и человека. Дана оценка представителей рода Allium как пищевых и лекарственных растений.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования являлись растения A. schoenoprasum L. из региональной флоры PK и лук-интродуцент из коллекции Ботанического сада Института биологии Коми НЦ УрО РАН (БС) и лаборатории биохимии и биотехнологии (Л ББ). Наряду с видом Л. schoenoprasum исследовались разновидность А schoenoprasum var. major (VM), сортовой образец Л. schoenoprasum cv. Prazska Krajova (P.K.) и форма Л. schoenoprasum f. Roseum (FR). Дикорастущие образцы были собраны из 14 точек в следующих районах PK: Усть-Вымском, Троицко-Печорском, Усть-Цилемском, а также на Приполярном и Полярном Урале. Всего было собрано 43 образца: 25 культивируемых и 18 дикорастущих. Сбор растительного сырья производился с мая по август 2006-2010 г.г. в различные фазы развития. Растения собирали целиком, разделяли на корни с корневищами, луковицы, покровные чешуи, листья, соцветия, измельчали и сушили при комнатной температуре и постоянном вентилировании. Семена собирали в фазе плодоношения, отделяли от соплодий. Для исследований брали не менее 30 растений. Образцы почвы брали из ризосферной зоны исследуемых объектов, используя стандартные методики, сушили, измельчали в фарфоровой ступке, просеивали через сито с диаметром ячеек 1 -2 мм. Пробу для анализа отбирали фарфоровой ложкой, предварительно перемешав почву на всю глубину (ГОСТ 26483-85).

Общие липиды (ОЛ) выделяли по модифицированной методике Фолча (Folchetal., 1957). Фосфолипиды (ФЛ) извлекали путем осаждали хлороформного раствора ОЛ десятикратным объемом холодного ацетона. Осадок ФЛ отделяли цетрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. Нейтральные липиды (НЛ) из растительного сырья извлекали трехкратной экстракцией гексапом при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Для получения метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК), входящих в состав НЛ, осуществляли метилирование по методу (Синяк и др., 1977). Выделение суммы СГ и разделение их на соединения ряда спиростана (СпГ) и фуростана (ФГ) осуществляли по методике (Пасешниченко, Гусева, 1975). Гидролиз суммы СпГ проводили в соответствии с методикой (Кинтя и др., 1972) ТСХ НЛ проводили на пластинах «Silufol» (Чехия), а также фирмы Merck (Darmstadt, DC-Fertigplatten Kieselgel 60 F254, толщина слоя 0,25 мм), используя систем}'

растворителей гексан - диэтиловый эфир - ледяная уксусная кислота = 73:25:5 (v/v/v). Высушенные пластинки обрабатывали 10 %-ным раствором фосфорно-молибденовой кислоты в этаноле с последующим выдерживанием в сушильном шкафу при t=100 °С до появления темно-синих пятен. В качестве стандартов для идентификации Н Л использовал! Lipid Standard, Sigma (Швейцария). Для ТСХ ФЛ использовали систему растворителей: хлороформ - метанол - вода 65:25:4 (v/v/v). Обнаружение ФЛ осуществляли обработкой высушенных после проявления пластин ФМК, ииигидрином с последующим выдерживанием в сушильном шкафу при t = 105°С до появления розовых пятен на белом фоне, раствором родамина 6G с последующим выдерживанием в сушильном шкафу при t = 105°С до появления бледно-розовых пятен на ярко-малиновом фоне. В качестве свидетелей для идентификации ФЛ использовали стандарты фирмы Sigma (Швейцария): L-a-phospliatidylethanolamin, L-a-phosphatidyicholin,

I,2-diacil-sn-glycerol-3-phosphor-L-serine. ТСХ СГ проводили на пластинах «Sorbfil» (Россия, тип сорбента - силикагель ОТХ-1ВЭ, толщина слоя 100 мкм, тип подложки ПЭТФ, размер пластин 10x10 см), "Merck" (Darmstadt, DC-Fertigplatten Kieselgel 60 F254,толщина слоя 0.25 мм, размер пластин 5x10 и 10x10 см) в системах растворителей хлороформ-этанол-вода (v/v/v): 1.65:35:8;

II. 65:23:4; III. 65:12:1,5; IV. 65:1:0,1. Обнаружение компонентов суммы СГосу-ществляли обработкой высушенных пластин ванилин-фосфорной кислотой и реактивом Эрлиха. В качестве стандартов для идентификации СГ и их генинов методом ТСХ и ВЭЖХ использовали диосгении (Diosgenin (25R)-5-spirostcn-3ß-ol, чистота 95 %, фирма Sigma - Aldrich Chemie Gmbp., Germany), смила-генин (Fluka, USA), ФГ дельтозид и протодиосцин и СГ дельтонип, любезно предоставленные д.х.н. В.А. Пасешниченко (Институт биохимии им. А.Н. Баха, РАН, г. Москва) и д.б.н. A.M. Носовым (Институт физиологии растений РАН, г. Москва). Для выделения стеринов из НЛ была использована колоночная хроматография на силикагеле марки L 11/250 р (Чехия). В качестве элюепта использовали гексан и смесь гексана с возрастающим градиентом диэтилового эфира. Разделение суммы СГ проводили на стеклянных колонках различного диаметра и объема в зависимости от количества разделяемого вещества. В качестве адсорбентов использовали силикагель марки L 100/250 р (Чехия) и нейтральную окись алюминия II степени активности по Брокману (Будапешт, Венгрия). В качестве элюепта использовали хлороформ с возрастающим градиентом метанола (0—400 %), а на заключительном этапе хроматографии - насыщенный водный бутанол.

ВЭЖХ-анализ осуществляли в изократическом режиме на оборудовании Smartline (Knauer, Германия). Анализ стеринов, генинов, фуростаноловых и

епиростаноловых гликозидов проводили на колонке Диасфер 110-С18,5 мкм, 4x250 мм (БиоХимМак, Россия), петля дозирования 20 мкл, детектор Smartline 2600 на диодной матрицей, длина волны для генинов и гликозидов 207 нм, для стерииов - 214 нм. В качестве элюента для генинов использовали метанол, расход подвижной фазы 1 см3/мин. Для ФГ использовали смесь ацетони-трил - вода 27:73 v/v, расход 0,5 см3/мин; для СпГ - смесь ацстонитрил- вода -конц. Н3РО4 = 80 : 20 : 0.02 v/v/v, расход 0,5 см3/мин; для стерииов -смесь (метанол-вода 99:1) / ацетонитрил 9:1 v/v, расход подвижной фазы 1,5 см3/мин. Углеводы анализировали на колонке Диасорб-130-Амин, 6 мкм, 4x250 мм, рефрактометрический детектор Smartline RI2300, петля дозирования 20 мкл, элюент ацетонитрил - вода 80:20 v/v, расход подвижной фазы 0,7 см3/ мин, термостатнрование при 30°С. Перед анализом образцы очищали методом твердофазной экстракции на патронах ДИАПАК С16 (стероидные гликозиды и гешпга) и ДИАПАК Амин (углеводы).

Анализы на содержание жирных кислот, азота и протеиногенных аминокислот, макро- и микроэлементов, анализы методом хромато-масс-спектрометрии (ХМС) были выполнены в экоаналитической лаборатории «Экоаналит» Института биологии КНЦ УрО РАИ. Методики описаны в статьях (Ширшова и др., 2008; Ширшова, Бешлей, 2008; Ширшова, Бешлей, 2009).

Исследование противоопухолевого действия экстрактов листьев лука проводили в НИИ канцерогенеза Российского онкологического научного центра (РОНЦ) им. H.H. Блохина РАМИ (г. Москва). Опыты проводили на мышах-самцах BDF, массой 29-30 г. Опухолевые клетки карциномы Эрлиха КЭ перевивали подкожно методом инокуляции в правую паховую область. Мышей разделили на 4 группы по 10 животных в каждой: 1 -ая группа - мыши с перевитой КЭ - контроль; 2-ая группа - мыши, получали пероралыю с частотой 5 раз в неделю на протяжении 2,5 недели до перевивки КЭ и после нее в течение всего опыта водный экстракт из лука (ВЭЛ) в дозе 1,3 г/кг массы тела животного (м.т.ж.); 3-я группа - мыши, получали ВЭЛ по выше указанной схеме в дозе 1,0 г/кг м.т.ж.; 4-ая группа - мыши, получали пероралыю по такой-же схеме водно-спиртовый (8,0%) экстракт из лука (ВСЭЛ) в дозе 1,3 г/кг м.т.ж. За весь опыт каждая мышь 2-ой группы получила по 1360 мг, 3-ей группы - 1020 мг, 4-ой - 1360 мг вещества.

Ингибирующнй эффект ВСЛ оценивали по торможению роста опухоли (ТРО), определяемому по объему и по массе опухолей у животных опытных групп, по сравнению с контрольной группой. В конце эксперимента (на 52 сутки) мышей усыпляли под эфирным наркозом. После вскрытия животных опухоли выделяли и определяли их массу.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Содержание стероидных гликозидов

Растения рода Allium считаются перспективными в плане поиска сапо-ниноносных представителей флоры. Сумму СГ извлекали из обезжиренного сырья и разделяли их на водонерастворимые СлГ и водорастворимые ФГ. Наибольшее содержание суммы экстрактивных веществ (СЭВ), содержащих СпГ, было получено из корней, соцветий, бутонов и семян (1,79, 1,85,1,28, 2,71 % от сухой массы). Это ожидаемый результат, поскольку, согласно литературным данным, максимальное количество СпГ в растениях рода Allium обнаружено в подземных органах, цветочных корзинках и семенах (Кравец и др., 1990). Суммы СпГ, полученные из разных частей культивируемого образца A. schoenoprasum были исследованы методом высокоэффективной жидкостной хроматографией. По времени удерживания обнаружено наличие в корнях, соплодиях и семенах дельтонина (Табл. 1). В корнях кроме того был обнаружен сапонин А, который был идентифицирован в луковицах и листьях. В СЭВ из листьев и покровных чешуи был обнаружен диосгенин (tn= 7'06" и 7'08" соответственно).

Таблица 1. Результаты ВЭЖХ-анализа суммы спиростаноловых гликозидов A. schoenoprasum (время удерживания tR, мин'сек")

Дельтонин Сапонин А Корни Луковицы Покровные чешуи Листья Соплодия Семена

274" 2'67" 274" - - -

313" - 3'07" - -

- - 5'24" - - -

6'48" 6'48" - - - 6'49" 6'51"

- - - - 8'22" 875"

8'36" 8'36" 8'36" - 8'34" - -

- - 914" - - -

- - - 10'22" -

После разделения полученной суммы СпГ на хроматограф» ческой колонке методом ВЭЖХ были обнаружены: сапогенин диосгенин, строение которого было подтверждено методом ХМС, СпГ дельтонин и сапонин А, структура которого в настоящее время определяется. Для установления структуры гликозидов был проведен кислотный гидролиз полученной суммы СпГ. В эфирных экстрактах гидролизатов методом ТСХ и ВЭЖХ был обнаружен диосгенин, который является важнейшим сырьем для получения стероидных гормональных препаратов. В гидролизатах методом ВЭЖХ были обнаружены

остатки Сахаров - D-глюкозы и L-рамнозы в соотношении 2:1, что характерно для спиростаноловых гликозидов.

Количественное содержание СЭВ, содержащих ФГ, находится в диапазоне от 0,02 до 7,12 % от воздушно сухого сырья. Наибольший выход суммы получен из бутонов (3,6-5,49 %) и соцветий (3,32-7,12 %) всех образцов. Довольно высокое содержание СЭВ ФГ в корнях, где их количество колеблется от 0,69 до 4,68 %.В составе суммы ФГ методом ВЭЖХ были обнаружены два гликозида - дельтозид и протодиосцин.

3.2. Липиды, их компонентный и жирнокислотный состав

Роль липидов в растениях, а также их значение для человеческого организма многообразны и чрезвычайно важны. Как было установлено в последние годы, липиды растений служат индикаторами изменений в окружающей среде в результате антропогенного воздействия (Розенцвет и др., 1999; Minkkinen et al., 1988; Concales et al., 1994; Biernacki et al., 1997; Stephen and Clare, 1997). Максимальное содержание НЛ, как и следовало ожидать, было обнаружено в семенах (4,85-8,2 %), а также в соцветиях (1,25-5,33 %) и бутонах (0,48-7,7%) почти всех образцов. Относительно высокое содержание НЛ в листьях всех образцов (0,53-1,94 %) связано с присутствием в них желтых и зеленых пигментов, которые частично извлекаются при экстракции неполярными растворителями. Наименьшим содержанием НЛ отличались луковицы (0,08-1,23%) и корни (0,11-1,85 %) большинства образцов.

Среди всех разновидностей и сортов набольшим содержанием НЛ характеризовался вид Л. schoenoprasum. Нами было показано, что в более засушливый сезон 2009 года содержание Н Л в исследуемом виде, выше по сравнению с 2008 годом (Рис. 1.). Поскольку Л. schoenoprasum является типичным гигрофитом, произрастание его на почвах с пониженной влажностью является стрессовым фактором, что отразилось в повышении содержания НЛ.

ТСХ-анализ НЛ показал, что их основными компонентами являются стернны (R(=0,18) и ихэфиры (Rf=0,8), свободные жирные кислоты (Rf=0,36) и их эфиры (Rf=0,48), триацилглицерины (ТАГ, Rf=0,57). ТАГ являются основным компонентом НЛ семян. Обнаружены они также в соцветиях, но в менее значительных количествах. В НЛ разных частей лука обнаружены также различные концентрации моно-и ди-ацилглицеринов. Такая картина характерна для всех образцов.

Структурное многообразие липидов, их физико-химические свойства, биологическая активность в основном обусловлены наличием в их составе жирных кислот, которые вовлечены в регуляцию роста и морфогенеза всех живых организмов, включая и растения, поэтому они во многих случаях

I

И _ 12008

№ O2009

12 3 4 1 2 3 4

Рис. 1. Зависимость содержания НА в культурных образцах A. schoenoprasum от погодных условий в разные годы, а — A. schoenoprasum L., б — A. schoenoprasum var. major, 1 — корни, 2 — луковицы, 3 — покровные чешуи, 4 — листья

используются дляхемотаксономии растений как биологические маркеры. Наши исследования показали, что в состав НЛ входят молекулы кислот с цепями Cíe -С20 и четным числом углеродных атомов. Главными по содержанию во всех частях растения всех образцов являются ненасыщенные высшие жирные кислоты (НЖК) олеиновая (С18:1), линолевая (С18:2) и линоленовая (С18:3). В сумме содержание этих кислот составляет 53-85% от общего количества всех кислот, что согласуется с литературными данными по другим видам лука. Наибольшее суммарное количество НЖК накапливается в семенах луков и в среднем составляет около 93 %.

Во всех образцах доминирующей является линолевая кислота (С18:2), содержание которой в семенах достигало 71,6-73,9, в соцветиях 60-68, в корнях 52-64 %. В несколько меньших количествах она содержится в луковицах, однако и здесь ее содержание довольно высокое - от 32,3 до 56,2 %. Линоленовая кислота (С18:3) в максимальных количествах содержится в листьях большинства исследуемых образцов (от 25,4% до 39,9%). В некоторых образцах она конкурирует с линолевой кислотой. Сумма этих двух ненасыщенных кислот превышает 60%. В остальных частях растения ее количество не превышает 10-17 %. Олеиновая кислота (С18:1) накапливается в покровных чешуях, где ее содержание превышает 20%. Из насыщенных кислот преобладает пальмитиновая (С16:0), которая в растениях совместно со стеариновой кислотой (С18:0) участвует в биосинтезе ненасыщенных высших жирных

I I

II

кислот. Наиболее высокое содержание С 16:0 характерно для луковиц почти всех образцов, где оно колеблется в пределах от 29,3 до 56 %.

В распределение ЖК по частям растения нами были обнаружены некоторые закономерности (Рис. 2), Линолевая кислота доминирует в семенах, но является преобладающей и для других частей растения. Основное количество линоленовой кислоты накапливается в листьях, где она конкурирует с линолевой, и их сумма превышает 60 %. Олеиновая кислота в максимальных количествах обнаружена в покровных чешуях и семенах, пальмитиновая кислота - в луковицах.

При помощи метода колоночной хроматографии из I IЛ А. зсЬоепоргазит была выделена стериновая фракция, основным компонентом которой по данным ВЭЖХ-анализа является с.итостерин ^ = 20ЧГ4), наличие которого было подтверждено методом ХМС. Кроме того, этим же методом было обнаружено незначительное содержание других растительных стеринов -кампестерина, стигмастерина, холестерина.

□ Корни ЯЛуковнцы РЛшлья

□ Покровные чешул В Бутоны и соцветия РСемсна

Рис. 2. Распределение высших жирных кислот по частям растения А. 5с1юепорга$ит (р < 0,05)

3.3. Азотистые вещества в составе А. ьскоепоргаьит

Одним из важнейших элементов растений является азот, который входит в состав многих БАВ, в том числе аминокислот и алкалоидов. Результаты анализа показали, что количественное содержание общего азота (ОА) в исследуемых нами образцах шнитт-лука колеблется в довольно широких пределах - от 0,8 до 4,2 %. В большинстве образцов более высокое содержание ОА было обнаружено в листьях.

Для A. schoenoprasum и VM характерна следующая сезонная динамика накопления ОА. Максимальное содержание ОА как в листьях, так и в луковицах обнаружено в более раннюю фазу вегетации, когда идут активные биохимические процессы, а к фазе плодоношения оно снижается. Для Р.К. картина несколько иная - максимальное содержание ОА в листьях накапливается в фазе цветения, а к фазе плодоношения оно снижается до уровня отрастания и бутонизации. В луковицах к фазе бутонизации и цветения содержание ОА незначительно снижается и слегка повышается к фазе плодоношения.

Содержание азота АК во всех образцах A. schoenoprasum значительно превышало приведенные в литературе данные. По данным Х.Б. Шифри-ной (1955) доля азота АК в разных видах многолетних луков составляет 52.6 % общего азота. В большинстве наших образцов содержание азота АК достигало 57-83 %. Доля азота АК в листьях уменьшалась при переходе от фазы отрастания к фазе плодоношения с максимумом в фазе бутонизации. В луковицах наблюдалась обратная картина. Минимальное содержание азота АК наблюдалось в фазе бутонизации, а затем повышалось до максимума в фазе плодоношения.

Лук A. schoenoprasum является источником ценных для организма человека аминокислот. Количественное содержание АК и их компонентный состав в значительной мере зависит от условий произрастания лука, видовых и сортовых различий, части растения. Нами во всех образцах лука были обнаружены 17 АК. Определение триптофана - восемнадцатой аминокислоты, в условиях данного метода не производится. В листьях почти во всех образцах основными по содержанию являются глутаминовая (Glu) и аспарагиновая (Asp) кислоты (Рис. 3). Особенно высокое содержание Glu найдено в культивируемом в Б С шнитт-луке сбора 2009 г. в фазе отрастания, в листьях и луковицах которого содержится, соответственно, - 57,24 и 47,32 мг/г сухого вещества. В среднем содержание этой АК составляет 18,6 мг/г. Содержание в листьях Asp составляет 10,7 мг/г. Третьими по накоплению являются лизин и лейцин (7,08 и 7,31 мг/г соответственно). Наибольшее содержание всех АК было обнаружено в семенах. Причем в этом органе наряду с четырьмя выше названными кислотами обнаружено высокое содержание аргинина (Arg). Если в листьях его количество не превышало 10 мг/г, то в семенах его содержание составляло в среднем около 40 мг/г сухой массы. Способность накапливаться в резервных и зародышевых органах является характерной для Arg, поскольку он выполняет функцию накопления и переноса азота в живых организмах (Биологический..., 1989).

В очень незначительных количествах были обнаружены фенилаланин 0,588,44, гистидина0,2-4,26ицистеина(С1з) 0,02 -1,99 мг/г. Не во всех образцах

обнаружен метионин (Met), количество которого колеблется в пределах от 0,02 до 1,9 мг/г. По данным В.А. Черёмушкиной с сотр. (1992) в шнитт-луке, как и в других видах корневищных луков, Cis в свободном виде не был обнаружен. Результаты наших исследований показали, что в белковых гидролизатах некоторых образцов шнитт-лука содержится Cis. По-видимому, это является особенностью азотистого обмена исследуемого вида. В большинстве случаев количество Cis колеблется от 0,02 до 1,99 мг/г. Гораздо более значительные количества этой АК содержатся в семенах - от 7,8,9 до 14,9 мг/г.

Glu Asp Lys Leu Ile Val Gly Pro Ser Tyr Ala Thr Arg Аминокислоты

Рис. 3. Содержание протеиногенных аминокислот в листьях и семенах лука A. schoenoprasum. Обозначения аминокислот: Glu — глутаминовая,

Asp — аспарагиновая, Lys — лизин, Leu — лейцин, Не — изолейцин, Val — валин, Gly — глицин, Pro — пролин, Ser — серии, Туг — тирозин, Ala — аланин, Thr — треонин, Arg — аргинин

Содержание ПАК в разных частях растения зависит от фазы развития. Если в фазе отрастания максимальные количества ПАК накапливаются в ли-

стьях и луковицах, то в последующие фазы развития наибольшие количества они содержатся в репродуктивных органах - в бутонах и соцветиях. Наибольшее содержание всех ПАК обнаружено в фазе плодоношения в семенах растения. Здесь суммарное содержание всех кислот составило от 295,73 до 346,79 мг/г.

3.4. Содержание макро- и микроэлементов в А. вскоепоргавит

Содержание макро- и микроэлементов наряду с первичными и вторичными метаболитами является одной из важных характеристик пищевой и фармакологической ценности растений. Химический состав зеленой массы лука представлен широким спектром ценных минеральных веществ.

Из макроэлементов к преобладающим нужно отнести калий (Рис. 4.). Количество его колеблется в довольно широких пределах - от 5600 до 44000 мг/кг сухой массы и его концентратором являются листьях.

20000 18000 16000 3 14000 | 12000

1 юооо >

£ 8000

2 6000 4000 2000

0

А

и

Я Лист □ Луковица

К Са S Р Mg

Рис. 4. Содержание макроэлементов в листьях и луковицах A. schoenoprasum (средне арифметическое значения содержания по всем образцам)

При сравнении с хорошо известными лекарственными растениями -продуцентами стероидных гликозидов, Dioscorea deltoidea Wall (диоскорея дельтовидная), Tribulus terrestris L. (якорцы стелющиеся) и Yucca gloriosa L. (юкка славная), можно отметить, что по содержанию К шнитт-лук уступает только якорцам (Ловкова и др., 1997).

Шнитт-лук характеризуется гораздо более высоким содержанием К и Na, по сравнению с репчатым луком, что, возможно, связано со своеобразием обмена веществ у этих видов (Биохимия овощных..., 1961). В отличие от К, который в основном накапливается в листьях, концентратором Na в большинстве исследованных нами образцов, являлись луковицы, При этом

нами была обнаружена такая закономерность: максимальное содержание На было обнаружено в тех образцах, в которых было обнаружено минимальное количество К и, наоборот, в тех образцах, в которых содержание К было максимальным, обнаружено минимальное количество Ш.

Вторым по содержанию макроэлементом являлся кальций (Са), в содержании которого наблюдался значительный разброс - от 4700 до 19800 мг/кг в листьях и от 3300 до 21000 мг/кг в луковицах. Максимальная концентрация Са обнаружена в природных образцах, произрастающих на почвах богатых по содержанию этим макроэлементом.

Важным макроэлементом для растений является Mg. Концентратором этого макроэлемента во всех исследуемых нами образцах лука являются листья. Mg входит в состав молекулы хлорофилла и принимает непосредственное участие в фотосинтезе, поэтому было логично, что его содержание во всех образцах выше в листьях, чем в луковицах. Количество этого макроэлемента колеблется в пределах от 450 до 3800 мг/кг, что значительно ниже, чем в луке, интродуцированном в Новосибирск (Черемушкина и др., 1992). В природных образцах этого элемента содержится почти в два раза меньше, чем в образцах лука-интродуцента и культивируемых луков. В литературе отмечается, что в листьях и стеблях, как правило, Са значительно больше, чем Mg (Ягодин и др., 19896), что подтверждают наши результаты.

По содержанию Са и Р корневищные луки находятся на одном уровне с такими ценными пищевыми растениями, как петрушка, салат, шпинат и щавель. Наибольшее количество Р обнаружено нами для листьев и луковиц лука-интродуцента из БС в фазе отрастания, причем концентратором Р в этом образце является луковица. Во всех остальных исследованных образцах Р накапливался в листьях. По содержанию Р большинство наших образцов значительно уступает луку, интродуцированному в Новосибирске, для которого содержание Р составляет 5500 мг/кг (Черемушкина и др., 1992).

Луковым растения специфический запах придают летучие соединения содержащие серу (5). По данным В.А. Черемушкиной (Черемушкина и др., 1992) в шнитт-луке, интродуцированном в Новосибирске, содержится 10900 мг/кг Б. В исследованных нами образцах содержание Б как в листьях, так и в луковицах, колеблется в очень широких пределах и зависит от многих факторов. Для болынинсва образцов этот показатель колеблется в пределах от 1400 до 17400 в листьях и от 1100 до 14400 мг/кг в луковицах. Максимальное количество Б было обнаружено в листьях и луковицах А. зскоепоргазит из БС в фазе отрастания (17400 и 14400 мг/кг соответственно), а также в листьях его разновидности УМ (13600 мг/кг). Содержание 8 в листьях с Северного Урала собранных на разной высоте различается более, чем в три

раза, что может быть связано не только с различиями в условиях произрастания - разной высотой над уровнем моря, эдафическим фактором, по и с разными фазами развития. Концентратором Б в большинстве исследуемых образцов являются листья. Максимальное содержание 5 как в листьях, так и в луковицах всех образцов приходится на фазу отрастания.

Свойства лука аккумулировать макро- и микроэлементы могут быть охарактеризованы коэффициентом биологического накопления (КБН). При значении КБИ > 1 растения считаются аккумуляторами элемента. Исходя из значений КБН А. зскоепоргшит является аккумулятором всех макроэлементов, кроме Mg. Наибольшую аккумулирующую способность шнитт-лук проявлял по отношению к калию. КБН зависит не только от аккумулирующих свойств растения, но и от содержания элемента в почве. Нами наблюдалось закономерное понижение значения КБН макроэлемента при увеличении его содержания в почве. Ингибирование процесса аккумуляции элементов при повышении их концентрации в почве характерное явление для растений и связывается с буферными свойствами почвы и защитными механизмами растений (Ильин, 2007; Битюцкий, 2010).

Значительные внутривидовые различия были обнаружены нами в аккумулировании микроэлементов луком А. ьскоепортьит. Во многих видах корневищных луков железо (Бе) является главным микроэлементом. В исследованных нами образцах диапазон содержания Бе довольно широкий - от 15 до 360 мг/кг в листьях и от 29 до 540 мг/кг в луковицах. Такой широкий разброс в содержании Ре можно объяснить только комплексным влиянием разных факторов, в том числе различием эколого-географических условий произрастания и состава почв. Высокое содержание этого элемента в почвах РК, неравномерное распределение его и большая изменчивость концентраций влияют на КБН Ре, который имеет очень низкие значения для исследуемого вида. По этим причинам шнитт-лук, который содержит высокие концентрации Ре, не является его аккумулятором.

В литературе отсутствуют сведения о содержании алюминия в шнитт-луке. Вместе с тем количественное содержание это микроэлемента сравнимое с накоплением Ре, а в некоторых образцах даже больше. Разброс в концентрации А1 в наших образцах также очень большой - от 12 до 530 мг/кг. Тем не менее, КБН этого микроэлемента также как у Ре очень низкий (для большинства образцов меньше 0,01). Обнаружена высокая корреляционная зависимость между накоплением Ре и А1 (г2=0,83).

Одним из важнейших микроэлементов является 2п, обладающий высокой антиоксидантной активностью. Содержание его в образцах находилось в пределах от 11.3 до 50 мг/кг. Природные образцы отличаются более низким содержанием '¿п по сравнению с луком-интродуцентом.

Концентраторы среди образцов А. ьскоепорганит являлись и концентраторами меди (Си), которая наряду с Ре принимает активное участие в окислительно-восстановительных процессах. Содержание Си в наших образцах колебалось от 1,5 до 7,1 мг/кг.

Значения КБН позволяют считать лук А. зскоепоргазит и Р.К. аккумуляторами Си, 1п, Мп и N1. Вид А. $скоетрга$ит можно также считать аккумулятором молибдена. В листьях и луковицах его содержание достигает 0.54 мг/ кг, в то время, как в ночве этот микроэлемент не обнаружен. Кроме того, наши результаты показали, что шнитт-лук является аккумулятором таких токсичных элементов как Сс], Ва, Бг. Однако по абсолютным значениям содержание этих микроэлементов не превышает предельно допустимых концентраций.

В литературе неоднократно отмечались высокие антиоксидантные свойства многолетних луков, обусловленные как высокими концентрациями витамина С и флавоноидов, так и наличием особых органических форм селена (Эе), который с недавнего времени стал считаться эссенциальным элементом в питании человека. Нами было показано, что шнитт-лук является аккумулятором этого мироэлемента. Содержание 5е в наших образцах варьировало от 49 до 217 мкг/кг сухой массы. Образцы почвы, отобранные из ризосферной части растений, отличались очень низким содержанием 5е. Тем не менее, для большинства образцов значения КБН выше или равно единице (Рис. 5). При этом концентратором Бе в этом виде лука является ложный стебель (луковица).

Номер образца

Рис. 5. Коэффициенты биологического накопления (КБН) селена листьями и луковицами культивируемых и дикорастущих образцов А. зсЬоепоргаэит: 1,2 — интродуценты, БС, сбор 2008 и 2009 гг. соответственно; 3 — Троицко-Печорский район, берег р. Илыч, сбор 2008 г.; 4 — Усть-Вымский р-н, с. Гам, сбор 2008 г.; 5 - г. Воркута, берег р. Уса, сбор 2009 г,

В целом можно отметить, что культивируемые образцы накапливаю больше Бе, чем дикорастущие. По содержанию 8е в листьях все наши образцы А. ясИоепоргахит значительно уступают как узколистной, так и широколистной форме этого вида из Подмосковья (Голубев, Голубкина, 2003). УМ и Р.К. имеют довольно низкие значения КБН по сравнению с видом А. зскшторпшт. Исследование сезонной динамики изменения содержания Яе показало, что максимальное его накопление как в луковицах, так и в листьях происходит в фазе плодоношения.

На примере лука-интродуцента нами было исследовано содержание селена во всех частям растения. Наибольшее количество Бе было обнаружено в бутонах (140 мкг/кг). Несколько ниже оно в луковицах и листьях (126 и 116 мкг/кгсоответсвенно). Способность 5е накапливаться в репродуктивных органах является характерной для всех растений (Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989), что и подтверждают наши данные.

3.5. Исследование противоопухолевой активности экстрактов А. вскоеиргавит

Результаты испытаний показали, что водный и водно-спиртовый экстракты листьев лука проявляют тенденцию к ингибированию роста подкожно перевиваемой карциномы Эрлиха у мышей-самцов ВОР на стадии ее интенсивного развития (Табл. 2). Как видно из приведенных данных, опухоль была наиболее чувствительна к введению ВЭЛ (группа 2) и В СЭЛ (группа 4) в дозе 1,3 г/кг м.т.ж. У мышей этих групп отмечали умеренный ингибирующий эффект, определяемый по объему опухоли, который проявлялся только на 12 сутки после перевивки КЭ, и поддерживался в дальнейшем на всех сроках развития опухоли. Замедление роста опухоли было более устойчивым и продолжительным при пероральном введении мышам ВСЭЛ. Показатель ТРО в этом случае составлял от 10,2 до 38,4 %, но не был статистически достоверным. Ингибирующий эффект при введении мышам ВСЛ в дозе 1,3 г/кг м.т.ж. был менее продолжительным, на контрольные сроки от 12 до 22 сутки роста КЭ он варьировал от 26,1 до 38,4 % (р>0,05), на более поздних сроках роста КЭ ингибирующий эффект убывал. Что касается группы животных, которым вводили ВСЛ в дозе 1,0 г/кг м.т.ж., то с учетом показателей ТРО на всех контролируемых сроках и погрешности измерения объема опухоли можно отметить отсутствие потенцирующего эффекта ВСЛ в этой дозе на рост КЭ. Взвешивание опухолей у мышей на 35-е сутки после инокуляции опухолевых клеток выявило отсутствие (группа 2) или незначительное (3,3 % и 8,6 %, соответственно, в группе 3 и в группе 4) снижение этого показателя в сравнении с контролем.

Таблица 2. Влияние водных и водно-спиртовых экстрактов листьев А. ьскоепоргаяит на рост подкожно перевитой карциномы Эрлиха (КЭ) у мышей-самцов

Группа, действующее вещество (доза, г/кг м.т.ж.) Объем опухоли, мм3, М+БО, (изменение объема, %) Масса опухоли, г, 35 сутки

Сутки после перевивки опухоли

5 8 12 15 19 22 28 33

1 (КЭ) 41,6+18,1 п=10 195,5+88,7 п=10 844,5+419,4 п=10 960,7+538,7 п=10 1189,6+824,9 п=10 1946,7+1286,4 п=9 2624,3+937,2 п=8 4258,8+1405 п=8 4,21+1,81 п=8

2 КЭ+БЭЛ (1.3) 43,4+21,2 п=10 (•4,3) 201,1+172,6 п=10 (+2,9) 577,7+463,3 п=10 (-31,6) 592,2+429,8 п=10 (-38,4) 878,9+638,1 п=10 (-26,1) 1283,3+957,8 п=10 (-34) 2230,8+1048,3 п=10 (-15,0) 3869,6+1391,9 п=10 (-9,1) 4,19+1,40 п=10

3 кэ+вэл (1,0) 38,6+13,6 п=10 (-7,2) 265,9+301,2 п=10 (+36,0) 964,4+473,0 п=10 (+14,2) 1161,1+619,8 п=10 (+20,9) 1284,9+873,2 п=10 (+8,0) 1683,6+1103 п=10 (-13,5) 2284,6+870,7 п=10 (-13,0) 3470,2±969,5 п=10 (-18,5) 4,07+1,15 п=10 (-3,3)

4 кэ+всэл (1,3) 30,4+11,6 п=10 (-26,9) 282,2+183,9 п=10 (+44,4) 584,7+166,6 п=9 (-30,8) 592,2+429,9 п=9 (-38,4) 1068+455,5 п=9 (-10,2) 1332,9+658,3 п=9 (-31,5) 1892,2+727,8 п=9 (-27,9) 3203,8+1431,9 п=9 (-24,8) 3,85+1,13 п=9 (-8,6)

Примечания: результаты выражены как среднеарифметические значения + стандартные отклонения (ЗБ);

в скобках приведены значения в % потенцирования (+) или ингибирования (-) роста опухоли;

м.т.ж. - масса тела животного;

ВЭЛ- водный экстракт листьев лука;

ВСЭЛ - водно-спиртовый экстракт листьев лука.

выводы

1. Дана эколого-ценотическая характеристика местообитаний вида А. зскоепоргстт в разных природных зонах Республики Коми, проведено комплексное химическое исследование культивируемых и природных образцов А. зсИоепоргаят, выделены и идентифицированы биологически активные вещества различной природы, проведен мониторинг их накопления в растении, выявлена зависимость внутривидовой изменчивости их количественного содержания и компонентного состава от различных факторов - происхождения, места произрастания, фазы развития, эколого-географических и эдафических факторов.

2. Впервые из всех частей растения Л. 5 скоепоргатт выделены нейтральные липиды, установлен их компонентный состав, сезонная динамика накопления. Максимальное содержание НЛ обнаружено в семенах (4,85-8,2 %), а также в соцветиях (1,25-5,33 %) и бутонах (0,48-7,7%). Показано, что содержание нейтральных липидов в культивируемых образцах выше, чем в дикорастущих (р < 0,1).

3. Установлено, что доминирующими в нейтральных липидах всех частей лука являются полиненасыщенные линолевая и линоленовая кислота, содержание которых составляет 53-85 % от общего содержания кислот. Показано, что линолевая кислота накапливается в семенах (71,6-73.9 %), соцветиях (60-68 %), луковицах (32,3-56,2 %) и корнях (52-64 %), концентратором линоленовой кислоты являются листья (25,4-39,9 %).

4. Впервые из растения АШит зскоепоргазит выделена сумма стероидных гликозидов спиростаноловой и фуростаноловой природы. Методами тонкослойной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографией и хромато-масс-спектрометрии идентифицированы гликозиды спиростаноловой природы дельтонин и сапонин А и фуростаноловые гликозиды дельтозид и протодиосцин. Установлено, что агликоном спиростаноловых гликозидов является диосгенин.

5. Показана избирательная способность лука А. зсИоепоргазит к накоплению таких ценных микроэлементов, как Си, Ъл и Сг, а также его аккумулирующие свойства по отношению к Бе, который относится к компонентам антиканцерогенной защиты организма.

6. Показано, что водные и водно-спиртовые экстракты листьев лука А. 5скоепорга$ит, проявляют тенденцию к ингибированию роста подкожно перевиваемой карциномы Эрлиха у мышей-самцов ВОБ на стадии ее интенсивного развития, что открывает перспективы для получения фармакологических композиций противоопухолевой направленности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах из перечня ВАК

1. Бешлей И.В. Липиды и высшие жирные кислоты в луке A. schoenoprasum L. (Alliaceae) / Т.И. Ширшова, И.В. Бешлей, И.В. Груздев // Раст. ресурсы, 2008. - Т. 44, вып. 1,-С. 75-81.

2. Бешлей И.В. Содержание азота и протеиногенных аминокислот в луке Allium schoenoprasum (Alliaceae) / Т.Н. Ширшова, И.В. Бешлей // Раст. ресурсы, 2008. -Т. 44. вып. 2. - С. 82-87.

3. Бешлей И.В. Содержание макро- и микроэлементов в A. schoenoprasum L. (Alliaceae) / Т.И. Ширшова, И.В. Бешлей // Раст. ресурсы, 2009. - Т. 45, вып. 2. -С. 97-105.

4. Бешлей И.В. Содержание селена в культурных и дикорастущих луках из флоры Республики Коми / Т.И. Ширшова, И.В. Бешлей, II.В. Матистов, H.A. Голубкина// Раст. ресурсы, 2011. - Т. 47, Вып. 1. - С. 112-118.

5. Бешлей И.В. Макро- и мнкроэлементный состав дикорастущих и интродуциро-ванных растений Allium schoenoprasum (Alliaceae) в Республике Коми / Т.И. Ширшова, И.В. Бешлей, Н.В. Матистов // Раст. ресурсы, 2011. - Т. 47, Вып. 3. - С. 111-122.

6. Бешлей И.В. Селенодефицит и возможности его сокращения. Аккумулирующие свойства некоторых представителей рода Allium L. по отношению к селену / Т.И. Ширшова, H.A. Голубкина, И.В. Бешлей, Н.В. Матистов // Изв. Коми НЦ УрО РАН,

2011. - Т. 7, №3,-С. 48-54.

7. Бешлей И.В. Изучение химического состава листьев A. schoenoprasum L. и ингибирующего действия их экстрактов на опухолевый рост у мышей / Т.И. Ширшова, И.В. Бешлей, В.П. Дерягина, Н.И. Рыжова, Н.В. Матистов // Хим.-фарм. журн.,

2012.-Т.46,№ И.-С. 30-33.

Публикации в прочих изданиях

8. Бешлей И.В. Allium schoenoprasum L. в коллекции ботанического сада Института биологии Коми научного центра / Т.И. Ширшова, И.В. Бешлей, Г.А. Волкова // Биологическое разнообразие. Интродукция растений: Матер. IV междунар. науч. конф. - СПб., 2007. - С-. 413-415.

9. Бешлей И.В. Allium schoenoprasum L. ex situ и in situ / Т.И. Ширшова, И.В. Бешлей, И.Ф. Чадин, В.А. Канев // Биологическое разнообразие. Интродукция растений: Матер. IV междунар. науч. конф. - СПб., 2007. - С. 93-95.

10. Бешлей И.В. Биологически активные вещества некоторых видов рода Allium (Alliaceae) / Т.И. Ширшова, И.В. Бешлей, Г.А. Волкова // Эколого-популяционный анализ полезных растений: интродукция, воспроизводство, использование: Матер, докл. X междунар. симпоз. - Сыктывкар, 2008. - С. 240-241.

11. Бешлей И.В. Жирнокислотный состав нейтральных липидов лука Allium schoenoprasum L. (Alliaceae) / И.В. Бешлей, II.В. Матисгов, Т.И. Ширшова, И.В. Груздев //Липиды н оксилипшш растений: Тез. докл. междунар. симпоз. - Казань, 2008. - С. 50.

12. Бешлей И.В. Компонентный состав стериновой фракции нейтральных липидов лука Allium schoenoprasum L. (Alliaceae) / И.В. Бешлей, Н.В. Матистов, Т.И. Ширшова // Липиды и оксилипшш растений: Тез. докл. междунар. симпоз. -Казань, 2008. - С. 3G.

13. Бешлей И.В. Липиды и высшие жирные кислоты в природных и культурных растениях рода Allium L. из флоры Республики Коми / 1I.B. Матистов, И.В. Бешлей, Т.И. Ширшова // Новые достижения химии и химической технологии растительного сырья: Матер. IV всерос. конф. В 2-х книгах. - Барнаул, 2009. - Кп. 2. - С. 184-185.

14. Beshley I.V. Steroid Glycosides in Some Allium L. Species of Alliaceous Family (Alliaceae J. Agardh)/N.V. Matistov, T.I. Shirshova, I.V. Beshley// Current issues of natural products chemistry and biotechnology: Book of abstracts of 2nd Annual Russian-Korean Conference. - Novosibirsk, 2010. - P. 97.

15. Beshley I.V. Sterols as a Part of Neutral Lipids in Some Allium L. (Alliaceae) Species / N.V. Matistov, T.I. Shirshova, I.V. Beshley // Current issues of natural products chemistry and biotechnology: Book of abstracts of 2nd Annual Russian-Korean Conference. -Novosibirsk, 2010. - P. 97.

16. Бешлей И.В. Химический состав лука A. schoenoprasum L. и влияние па него различных факторов/ И.В. Бешлей, Н.В. Матистов, Т.И. Ширшова//' Экология арктических и приарктических территорий: Матер, докл. междунар. симпоз. - Архангельск, 2010.-С. 153-155.

17. Бешлей И.В. Оценка селенового статуса некоторых видов рода Allium L. из флоры Республики Коми/ И.В. Бешлей, П.В. Матистов, Т.И. Ширшова // Экология арктических и приарктических территорий: Матер, докл. междунар. симпоз. - Архангельск, 2010. - С. 155-156.

18. Бешлей И.В. Биологически активные вещества лука Allium schoenoprasum L./ И.В. Бешлей, А.Л. Швецова //' Актуальные проблемы биологии и экологии: Матер, докл. XIII молодеж. науч. конф. - Сыктывкар, 2007. - С. 31-34.

19. Бешлей И.В. Химический состав лука A. schoenoprasum L. в природных популяциях и культуре /И.В. Бешлей // Актуальные проблемы биологин и экологии: Матер, докл. I (XIV) всерос. молодеж. науч. конф. - Сыктывкар, 2007. - С. 25-28.

20. Бешлей И.В. Стероидные гликозиды в луке Allium schoenoprasum L. / Бешлей И.В. // Молодежь и наука на Севере: Матер, докл. 1 всерос. молодеж. науч. конф. в 3-х томах. - Сыктывкар, 2008. - Т. 3. - С. 19-20.

21. Бешлей И.В. Содержание азота и протеиногенных аминокислот в луке A. schoenoprasum L. и влияние на них различных факторов / Бешлей И.В. // Актуальные проблемы биологии и экологии: Матер. XVI всерос. молодеж. науч. конф. - Сыктывкар, 2009.-С. 31-33.

Бешлей Игорь Васильевич

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДИКОРАСТУЩИХ И ИНТРОДУЦИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ Allium schoenoprasum L. НА ЕВРОПЕЙСКОМ СЕВЕРО-ВОСТОКЕ РОССИИ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Компьютерная верстка Е.С. Данилова

Подписано и печать 14 февраля 2013 года. Формат 60x84 '/ю- Объем 1,5 уч.-изд. л., 1 усл. исч. л. Бумага офсетная. Гарнитура «Petersburg». Заказ № 346. Тираж 100 экз.

Отпечатано п ООО «Печатное издательство Агро-Сибирь» Новосибирск, ул. Никитина, 155, тел.: (383) 267-19-90,264-00-72 e-mail: agroprint@mail.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бешлей, Игорь Васильевич, Сыктывкар

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ КОМИ НАУЧНОГО ЦЕНТРА УрО РАН

УДК 581.192:635.265 На правах рукописи

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДИКОРАСТУЩИХ И ИНТРОДУЦИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ А Шит БсИоепоргаэит Ь. НА ЕВРОПЕЙСКОМ СЕВЕРО-ВОСТОКЕ РОССИИ

БЕШЛЕЙ ИГОРЬ ВАСИЛЬЕВИЧ

Специальность: 03.02.14 - Биологические ресурсы

СО

со 00

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

см тг

о?

ГЧ ^ Научный руководитель

™ ™ ЛI

ведущий научный сотрудник,

кандидат химических наук, доцент Т.И. Ширшова

Сыктывкар 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................6

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.....................................................................13

1.1. Род Allium: классификация, распространение

и видовое разнообразие.....................................................................................13

1.2. Метаболиты растений рода Allium и их значение для человека............21

1.2.1. Углеводы................................................................................................24

1.2.2. Азот, азотистые вещества, аминокислоты.........................................25

1.2.3. Липиды...................................................................................................28

1.2.4. Эфирные масла......................................................................................31

1.2.5. Фенольные вещества............................................................................34

1.2.6. Витамины...............................................................................................36

1.2.7. Стероидные гликозиды........................................................................38

1.2.8. Алкалоиды.............................................................................................44

1.3. Макро- и микроэлементы в составе растений Allium.............................46

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ....................................58

2.1. Объект исследования..................................................................................58

2.2. Методы исследования.................................................................................62

2.2.1. Экстракция растительного сырья........................................................62

2.2.2. Получение метиловых эфиров жирных кислот.................................63

2.2.3. Хроматография.....................................................................................64

2.2.4. Гидролиз суммы стероидных гликозидов..........................................67

2.2.4. Определение жирнокислотного состава нейтральных липидов......68

2.2.5. Определение общего азота и протеиногенных аминокислот..........68

2.2.6. Определение содержания макро- и микроэлементов.......................69

2.2.7. Определение противоопухолевой активности экстрактов

из листьев растения A. schoenoprasum..........................................................70

2.2.8. Статистическая обработка результатов..............................................71

А

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.................................................72

3.1. Характеристика образцов лука А. яскоепоргахит флоры РК.................72

3.2. Липиды, их компонентный и жирнокислотный состав..........................73

3.2.1. Нейтральные липиды...........................................................................73

3.2.2. Высшие жирные кислоты в составе нейтральных липидов............78

3.2.3. Стерины в составе нейтральных липидов.........................................80

3.2.4. Фосфолипиды.......................................................................................82

3.3. Содержание стероидных гликозидов.......................................................82

3.4. Азотистые вещества в составе А. зскоепоргаБит....................................89

3.5. Содержание макро- и микроэлементов в А. БсНоепоргазит...................97

3.6. Исследование противоопухолевой активности.....................................113

ВЫВОДЫ.............................................................................................................116

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................118

ПРИЛОЖЕНИЕ...................................................................................................134

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АК - аминокислоты

БАВ - биологически активные вещества

БС - Ботанический сад Института биологии Коми НЦ УрО РАН

ВЖК - высшие жирные кислоты

ВСЭЛ - водно-спиртовый экстракт из лука

ВФК - ванилин-фосфорная кислота

ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭЛ - водный экстракт из лука КХ - колоночная хроматография КЭ - карцинома Эрлиха

ЛББ - лаборатория биохимии и биотехнологии

м.т.ж. - масса тела животного

НЛ - нейтральные липиды

НФ - нормально-фазовая ВЭЖХ

ОА - общий азот

ОЛ - общие липиды

ОФ - обращено-фазовая ВЭЖХ

ПАК - протеиногенные аминокислоты

ПНЖК - полиненасыщенные высшие жирные кислоты

РК - Республика Коми

Р.К. - сортовой образец А. Бскоепоргаяит су. Ргагэка Кга^уа

С 16:0 - пальмитиновая кислота

С 18:0 - стеариновая кислота

С 18:1 - олеиновая кислота

С 18:2 - линолевая кислота

С 18:3 - линоленовая кислота

С20:0 - арахиновая кислота

СГ - стероидные гликозиды

СпГ - спиростаноловые гликозиды

ССГ - сумма стероидных гликозидов

СФ - стериновая фракция HJI

СЭВ - сумма экстрактивных веществ

ТРО - торможение роста опухоли

ТСХ - тонкослойная хроматография

ФГ - фуростаноловые гликозиды

ФЛ - фосфолипиды

ХМС - хромато-масс-спектрометрия

FR - форма A. schoenoprasum f. Roseum

MeSeCys - селенометил селеноцистеин

Rf- коэффициент подвижности

SeMet - селенометионин

SeCys - селеноцистеин

tR - время удерживания

VM - разновидность A. schoenoprasum var. major y-Glu-MeSeCys - гамма-глутамил селенометил селеноцистеин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Растения рода Allium - лук, с каждым годом привлекают все большее внимание исследователей, так как обладают присущей высшим растениям уникальной особенностью синтезировать огромное количество разнообразных вторичных метаболитов, обладающих, как правило, биологической активностью. Как было доказано, вещества, входящие в состав лука, ингибируют рост опухолей и микробных клеток, снижают риск заболевания раком, улавливают свободные радикалы и защищают человека от сердечно-сосудистых заболеваний, что связывают с наличием серосодержащих соединений и флавоноидов (Ly et al., 2005). В литературе неоднократно отмечались высокие антиоксидантные свойства многолетних луков, обусловленные как наличием специфических химических форм селена, так и высокими концентрациями витаминов Е, С и флавоноидов (Clark et al., 1996). Давно известны антицинготные свойства представителей этого рода. В официальной медицине существует набор препаратов, созданных на основе экстрактов из лука репчатого Allium сера L. и чеснока A sativum L., влияющих на моторику желудочно-кишечного тракта и сердечно-сосудистую систему (Червяков и др., 1977; Лютомски, 1980; Машковский, 1984). Из чеснока A. sativum был получен препарат сативин, обладающий терапевтическим эффектом при лечении желудочно кишечных инфекций, гнойных конъюнктивитов пневмококкового происхождения, и аллицин - природный антибиотик широкого спектра действия. Препарат аллилчеп, представляющий собой спиртовую вытяжку из лука репчатого, применяется при атонии кишечника, колитах, атеросклерозе, усиливает двигательную и секреторную деятельность желудочно-кишечного тракта, расширяет сосуды и улучшает деятельность сердца. Препарат обладает фитонцидными свойствами. Многие лекарственные свойства луков

связывают с присутствием в них стероидных гликозидов (Nuutila et al., 2003; Kawashima et al., 1993).

Согласно современным данным на территории России и сопредельных государств произрастает 332 вида лука (Черепанов, 1995). В Республике Коми встречаются лишь три вида, среди которых самый широкий ареал распространения имеет A. schoenoprasum L. (лук скорода, резанец, шнитт), произрастающий практически на всей территории республики. Однако, несмотря на широкое распространение и многовековое использование шнитт-лука в пищу человеком, его химический состав недостаточно хорошо изучен, а сведений о содержании в нем таких важных классов биологически активных веществ (БАВ), как липиды, высшие жирные кислоты (ВЖК), недавно обнаруженные в некоторых представителях этого рода стероидные гликозиды, в научной литературе нет. Недостаточно исследовано и содержание макро- и микроэлементов в этом виде лука.

Исследование практически ценных природных соединений в растениях является одной из ключевых задач ботанического ресурсоведения. Под биологическими ресурсами понимают все живые компоненты биосферы, образующие окружающую природную среду. Согласно современной трактовке перед направлением «биологические ресурсы» стоят задачи расширения биоресурсной базы и развития биотехнологий, оптимизирующих управление ресурсами природных и искусственно созданных биосистем. В соответствии с новой концепцией управления биологическими ресурсами, отвечающей актуальным проблемам сохранения биологического разнообразия и природного баланса в современных условиях развития страны, разработанной Отделением общей биологии РАН, представители рода Allium можно отнести к одной из трех категорий биологических ресурсов, представляющих важную часть сырьевого потенциала страны, которые могут быть вовлечены в хозяйственную деятельность в качестве

продуктов питания и лекарственных препаратов и служить сырьем для промышленности.

Известно, что уровень и характер накопления БАВ в растениях зависит от многих факторов - климатических условий региона выращивания, географического положения, экологических условий произрастания и культивирования, состава и свойств почвы, агротехнических приемов и др. (Казакова, 1978; Черемушкина, 1992; Тухватуллина, 2010). Учитывая обширность территории республики и широкое разнообразие ее физико-географических условий, можно ожидать большой изменчивости как в компонентном составе БАВ, так и в их содержании. Первостепенное значение при этом имеет изучение динамики накопления БАВ и микронутриентов и определение фенофазы, отвечающей за их максимальное накопление. Поэтому всестороннее и детальное изучение химического состава лука А. schoenoprasum, высокая антиоксидантная активность которого была обнаружена рядом авторов (Steiner et al., 2004; 2011), имеет важное теоретическое и практическое значение.

Цель работы: Целью настоящей работы является комплексное исследование содержания важнейших групп БАВ и микронутриентов (нейтральных и фосфолипидов, стеринов, высших жирных кислот, протеиногенных аминокислот, стероидных гликозидов, микро- и макроэлементов) в дикорастущих и культивируемых образцах лука А. schoenoprasum, мониторинг их накопления в растении, а также изучение некоторых аспектов физиологической активности.

Задачи исследования:

1. Эколого-ценотическая характеристика местообитаний

А. schoenoprasum на территории Республики Коми.

2. Определение содержания и компонентного состава важнейших групп БАВ и микронутриентов в дикорастущих и культивируемых растениях A. schoenoprasum L. и мониторинг их накопления.

3. Выявление зависимости содержания и компонентного состава БАВ от происхождения, фазы развития и эколого-географических условий произрастания.

4. Изучение физиологических свойств субстанций из лука A. schoenoprasum с целью создания фармакологических композиций антиоксидантной и противоопухолевой направленности.

Работа выполнена в лаборатории биохимии и биотехнологии растений. Института биологии Коми НЦ УрО РАН в соответствии с планом научно-исследовательских работ по теме НИР «Технологии «живых систем» в целях сохранения биоразнообразия, комплексного использования и воспроизводства биологических ресурсов Севера» (№ Гр 0120.0 853979) при частичной финансовой поддержке проекта «Состояние ресурсов полезных растений европейского Северо-Востока России, мониторинг и разработка биотехнологических подходов по рациональному использованию и воспроизводству» (Per. № 09-Т-4-1002) программы Отделения биологических наук РАН «Биологические ресурсы России: оценка состояния и фундаментальные основы мониторинга».

Научная новизна.

Впервые из лука A. schoenoprasum выделены важнейшие группы БАВ и микронутриентов - нейтральные липиды (HJ1) и фосфолипиды (ФЛ), стерины, ВЖК, стероидные гликозиды спиростанолового и фуростанолового ряда, протеиногенные аминокислоты, проведен мониторинг их накопления в растении, выявлена зависимость содержания и компонентного состава БАВ от происхождения, фазы развития, эдафических и эколого-географических

условий произрастания. Проведен сравнительный анализ содержания и компонентного состава макро- и микроэлементов в культурных и природных образцах A. schoenoprasum из географически удаленных районов Республики Коми.

Предварительные экспериментальные исследования

противоопухолевого потенциала показали, что водный и водно-спиртовый экстракт листьев лука проявляют тенденцию к ингибированию роста подкожно перевиваемой карциномы Эрлиха у мышей-самцов BDF на стадии ее интенсивного развития.

Положения, выносимые на защиту:

1. Впервые из растения A. schoenoprasum выделены HJ1, основными компонентами которых являются стерины и их эфиры, ВЖК и их эфиры, моно- ди- и триацилглицерины. Эссенциальные ВЖК, входящие в состав НЛ, имеют строго специфическое распределение по частям растения. Доминирующей в семенах, соцветиях, а также в луковицах и корнях является линолевая кислота. Для листьев характерно высокое содержание линоленовой и линоленовой кислот. Олеиновая кислота накапливается в соцветиях, семенах и покровных чешуях.

2. С помощью методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и хромато-масс-спектрометрии показано, что основным компонентом стериновой фракции является ситостерин, в минорных количествах содержатся холестерин, кампестерин и стигмастерин.

3. Впервые из шнитт-лука выделены стероидные гликозиды спиростанолового и фуростанолового ряда. Методами хроматографии (тонкослойной хроматографии, ВЭЖХ) и хромато-масс-спектрометрии идентифицированы два фуростаноловых гликозида - дельтозид и протодиосцин, спиростаноловый гликозид дельтонин и генин большинства стероидных гликозидов диосгенин.

4. Установлено, что лук А. эскоепоргаБит является аккумулятором целого ряда важных для человека макро- и микроэлементов с определенными закономерностями распределения их по частям растения. Влияние комплекса эколого-географических условий произрастания и почвенно-климатических факторов экотопов проявляется в большой вариабельности концентрации элементов. Высокое содержание Сг и 8е, антиоксидантным и антиканцерогенным свойствам которого в последнее время уделяется большое внимание, позволяет отнести этот вид лука к перспективным объектам фармаконутриентологии.

5. Водный и водно-спиртовый экстракт листьев лука проявляют тенденцию к ингибированию роста подкожно перевиваемой карциномы Эрлиха у мышей-самцов ВБР на стадии ее интенсивного развития.

Практическая значимость: Результаты, полученные в работе, вносят вклад в изучение биохимического состава ресурсного вида А. хскоепоргазит и подтверждают его изменчивость от различных биотических и абиотических факторов произрастания. Месторасположения дикорастущих популяций шнитт-лука, определенные в ходе полевых исследований, могут быть использованы при составлении карт ареала данного вида. Выявленная биологическая активность экстрактов лука А. яскоепоргшит позволяет рекомендовать дальнейшие исследования этого растения на онкопротекторное и ранозаживляющее действие с целью создания фармакологических композиций противоопухолевой направленности.

Апробация работы: Материалы диссертации были представлены на Х1Н-ХУ1 Всероссийских молодежных научных конференциях «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2005-2009); Четвертой Международной научной конференции «Биологическое разнообразие. Интродукция растений» (Санкт-Петербург, 2007); X Международном симпозиуме «Эколого-популяционный анализ полезных растений:

интродукция, воспроизводство, использование» (Сыктывкар, 2008); Международном симпозиуме «Липиды и оксилипины растений» (Казань, 2008); Всероссийской конференции «Новые достижения химии и химической технологии растительного сырья», (Барнаул, 2009); Международном симпозиуме «Экология арктических и приарктических территорий» (Архангельск, 2010) и 2-й ежегодной Русско-Корейской конференции "Current issues of natural products chemistry and biotechnology" (Новосибирск, 2010).

Публикации: По материалам работы было опубликовано 21 печатная работа, из них 7 статей в реферируемых журналах из перечня ВАК.

Благодарности:

Автор выражает особую благодарность своему научному руководителю, ведущему научному сотруднику лаборатории биохимии и биотехнологии, к.х.н. Ширшовой Т.И. за неоценимую помощь и поддержку на всех этапах выполнения работы, заведующему лабораторией, д.б.н. В.В. Володину за постоянную поддержку при выполнении работы, старшему научному сотруднику НИИ питания РАМН (Москва), д.б.н. Голубкиной Н.А. за выполнение анализа почвенных и растительных образцов на содержание селена, сотрудникам лаборатории «Экоаналит» Зубковой Л.Р., Естафьевой А.Г., Бадулиной Н.В., Адамовой Л.И. за выполнение анализов на содержание протеиногенных аминокислот, макро- и микроэлементов, старшему научному сотруднику этой же лаборатории, к.х.н. Груздеву И.В. за проведение газо-жидкостной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии, старшему научному сотруднику Отдела флоры и растительности Севера, к.б.н. Тетерюк