Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологическая характеристика условно-патогенных энтеробактерий, выделенных в промышленных животноводческих комплексах

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологическая характеристика условно-патогенных энтеробактерий, выделенных в промышленных животноводческих комплексах"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФВДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ

РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ

п г Ь о.Д

. На правах рукописи

Фи" УДК 576.851.48/49:636/639

ЧЕРНЕВШЯ Ольга Михайловна

ШОЛСПШЕСШ ХАРАКТЕРИСТИКА УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ЭНГЕРОБАКГЕРИЙ, ВЫДОЕННЫХ в штшшш ЖИВОТНОВОДЧЕСКИХ КОМПЛЕКСАХ.

03. 00. 07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соисаание ученой степени кандадата биологических наук

Москва - 1995 г.

Работа выполнена в Нижегородском ноучио-исс тодоштолс-скогл институте эпидемиологии п микробиологии Государственного комитета сшшторно-эвддедшшгогнческого надзора Российской £сдс'>шы

Научный руководитель -доктор ыодицпнскнх наук Е. !Л. ЛАВРОЕСКЛЧ

Официальные оппслс:)':": доктор иодацаиоких иоук,профессор <* '?ЛТГЛЯ

кандидат биологических паук, доцент Л. Е. СЛРУХЛШВЛ.

Ведущая организация -Российская медицинская академия посядшшомпого образования.

Залшта состоится " /5" и ,А/й{>Та. 1935 г. в" /¿" "час, на заседании диссертационного совета К 050,22.16 п Российском университете другйы народов по адресу : Ц7190 г.Москва, улица Мцклухо-Макдая, дом 8.

С диссертацией майю ознакомиться в к-- учпоЯ библиотеке Российского университета дружбы народен ко адресу : г.Москва, улица Миклухо-Маклая, дом 6.

Автореферат разослан "_"_1095 г.

Учоный секретарь диссертационного совота, кандидат биологических наук доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

В условиях неблагополучной экологической ситуации, отмечаемой в последние десятилетня, в составе микробиоценозов как человека, так и сельскохозяйственных животных и птиц, происходят аналогичные нарушения, выражающиеся в уменьшении содержания облигатных представителей и увеличении удельного веса условно-патогенных микроорганизмов. При снижении естественной резистентности макроорганизма этот процесс представляет потенциальную опасность развития инфекционных заболеваний (смолянская А.З., 1988; Петровская В.Г., 1990; Гиза-тулина С.С., Биргер М.О., Никовская М.И. с соавт.,1991,1992; Воронин Е.С., Шишков В.П., Ставцева Л. Я. с соавт.,1991; Ули-скоИ.Н., Батуро А.П., Ромаленко Э.Е., 1993; Levy S.B. ,1986; OJeniji A.A., 1989; Mikelsaar M., Siigur U., Tarai A. et al., 1991 И др.).

Возможность наличия факторов, агрессивности у условно-патогенных энтеробактерий и их этиологическая роль в возникновении острых кишечных заболеваний (ОКЗ) у людей показана многочисленными исследованиями. Вместе с тем, в животноводстве, где большой экономический ущерб обусловлен падежом молодняка от желудочно-кишечных заболеваний, при изучении кишечных инфекций бактериальной природы до последнего времени основное внимание уделялось патогенным эшерихиям и сальмонеллам. Сообщения об этиологической роли условно-патогенных энтеробактерий в развитии диареи телят и выявлении у них факторов патогенности немногочисленны (Каврук Л.С., Бритова С.В.,1987; Корж Б.ф., Злонкевич Я.Д.,1988; Воронин Е.С.,Дев-ришов Д.Ф., Ставцева Л.Я. с соавт., 1990; Сисягин П.Н., Ред-жепова Г.Р., Ким P.E. с соавт.,1991; Ставцева Л.Я., Девришов Д. А.. 1993).

Актуальность изучения свойств условно-патогенных энтеробактерий, выделенных при ОКЗ сельскохозяйственных животных, связана и с широким распространением антибиотикорезистентных штаммов в животноводческих хозяйствах. Лекарственная устой-

э

чивость энтеробактерий часто обусловлена наличием плазмид множественной антибиотикорезистеНтности, способных к внутри/! межродовой передаче, на которых могут находиться и детерминанты патогенности (Пехов А.П.,1986; Петровская В.Г., Бонда-ренко В.М., 1990,1994; Baca В.Е., Martinez L.Y., Arenas H.M.P. et al.,1990; Pal R., Ghose A.C.,1990; Zgur-Bertok L., Grabnar M.,1991 и др.).

Данные о распространении лекарственноустойчивых культур среди различных условно-патогенных энтеробактерий (кроме зшерихий), выделенных при диарее у телят, единичны (Bpycnn-t гина Н.Ф., Быкова С.А..Эалесских Н.В.,1988; Бруснигина Н.Ф., Поздышева Л.А.,1991; Воронин Е.С..Шишков В.П., Ставцева Л.Я. с соавт.,1991; Turtura G.С.,Massa S..Qhazvinizadeh H.,1990), а работы по изучению их генетических особенностей практически отсутствуют.

Недостаточная эффективность и вредное экологическое воздействие интенсивного применения антибактериальных средств в ветеринарии в условиях широкой циркуляции потенциально-патогенных микроорганизмов делает настоятельно необходимым применение в лечебных и профилактических целях экологически чистых биопрепаратов направленного действия - препаратов нормофлоры и специфических бактериофагов, а также усовершенствование и разработку вакцин с расширенной валентностью и обогащенных патогенетически значимыми компонентами микробных клеток (Блохина И.Н., ВоронинЕ.С., Лавровская В.М., 1988; Петров Р.В., Шишков В.П., Воронин Е.С. с соавт.,1990; Грязнева Т.Н., Ставцева Л.Я.,1991; Соболева С.В.,1991; Исме-туллова Ф.М., Воронин Е.С.,1993; Dougan G.,1989; Jenny В.F., Yandijk Y.J., Collins J.A.,1991 и др.).

Все вышеизложенное определяет целесообразность изучения биологических свойств условно-патогеиных энтеробактерий, ь том числе выделенных от молодняка крупного рогатого скота, для их характеристики как потенциальных-возбудителей ОКЗ, исследования факторов, способствующих селекции штаммов в условиях экологического неблагополучия,, а также совершенствования лечебно-профилактических мероприятий.

Работа выполнена в соответствии с планом научных иссле-

к

дований Нижегородского НИИЭМ в рамках фрагмента 04 Б договора N 3-152-20 "Лактопрепараты для лечения и профилактики ОКИ и дисбактериозов", номер госрегистрации 01.89.004 23 94.

Цель и задачи исследования.

Целью работы явилась коынлегазная характеристика биологических свойств условно-патогенных знтеробактерий, циркулирующих в животноводческих хозяйствах, для обоснования возможностей совершенствования системы профилактики острих кишечных заболеваний телят.

В соответствии с целью били поставлены следующие задачи:

1. Изучить патогенетически значимые факторы знтеробактерий как потенциальных возбудителей острых кишечных заболеваний - адгезивные свойства, энтеротоксигенность и гемолитическую активность.

2. Исследовать факторы, способствующие распространению штадаов потенциально-патогенных знтеробактерий - уровни и спектры лекарственной устойчивости и наличие конъюгатишшх плазмид антибиотикорезистентности.

3.' Определить чувствительность знтеробактерий к биологическим препаратам, которые могут служить эффективным и экологически чистим дополнением химиотерапии - донорспецифичес-шш бактериофагам и коммерческому лактобактерииу.

4. Разработать способ подбора вакцинных штаммов знтеробактерий с целью повышения эффективности и расширения механизмов действия специфических иммунных препаратов.

Научная новизна исследования.

Впервые использован комплекс методов исследования биохимических, генетических и патогенная свойств знтеробактерий, циркулирующих в конкретных животноводческих хозяйствах, позволивший установить потенциальную возможность участия условно-патогенных бактерий в развитии заболеваний.

Определены особенности плазмидного профиля различных представителей условно-патогенных знтеробактерий, свидетельствующие о распространенности в промышленных животноводческих комплексах штаммов, обладающих конъюгативными плазмидами

антибиотикорезистентности.

Установлена высокая чувствительность всех изученных штаммов к антагонистическому действию коммерческого лакто-бактерина и недостаточная эффективность специфических бактериофагов в отношении большинства культур, что свидетельствует о необходимости дальнейшего совершенствования препаратов.

Впервые разработан способ подбора вакцинных штаммов эн-теробактерий (патент N1785531 от 01.09.92г.), использованный при конструировании ассоциированной инактивированной вакцины.

Практическая ценность работы.

Выявлена устойчивость подавляющего большинства изученных штаммов энтеробактерий к наиболее часто применяемым лекарственным средствам и целесообразность более широкого использования экологически безвредных биопрепаратов.

Показана целесообразность применения для идентификации аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов по, морфологическим и биохимическим признакам вновь разработанного в Нижегородском НИИ эпидемиологии и микробиологии набора N 6 систем индикаторных бумажных (СИВ).

Вакцинные штаммы энтеробактерий, отобранные по предложенному нами комплексу характеристик, депонированы в государственной коллекции микроорганизмов ГИСК им.Л.А.Тарасевича (справка о депонировании N 01-26/33 от 24.11.89г.).

Способ отбора штаммов защищен патентом N 1785531 от 01.09.92г.

Штаммы включены в инструкцию по изготовлении и контролю вакцины бактериальной ассоциированной претив острых кишечных заболеваний телят и переданы для освоения производства на Краснодарскую биофабрику, а такде используются в Ростовской НИИ микробиологии и паразитологии при производстве препарата лактоглобулинов знтерального применения.

Результаты работы используются в научных исследованиях и учебном процессе на кафедре молодняка сельскохозяйственных животных МВД им.К.И.Скрябина и кафедре микробиологии и эпизоотологии Нижегородской Государственной Сельскохозяйственной Академии.

На защиту выносится следующее положение:

Комплексное изучение биологических свойств условно-патогенных энтеробактерий, выделенных в промышленных животноводческих комплексах, позволило предложить меры усовершенствования профилактюш острых кишечных заболеваний молодняка крупного рогатого скота.

Апробация диссертации.

Основные положения работы доложены на Всесоюзной конференции "Наука и производство в решении комплексной проблемы "Антибиотики"" (Москва,1989г.), конференции молодых ученых Горьковского медицинского института "Актуальные вопросы медицины" (Горький, 1990г.), заседании Совета биологического факультета Нижегородского госуниверситета (1989,1991гг.), на заседании Ученого совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии (1992,1994гг.).

По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов и приложения. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 9 рисунков. Список литературы включает 369 источников, в том числе 125 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Бактериальные штаммы, бактериофаги, плазмиды.

Объектом исследования явились 130 штаммов условно-патогенных энтеробактерий, выделенных в животноводческих хозяйствах Нижегородской и Тульской областей от телят с диареей (60 культур), фекалий клинически здоровых телят (45 культур) и из смывов с объектов внешней среды (25 культур). Из фекалий больных телят условно-патогенные энтеробактерий выделялись в этиологически значимых количествах - от 10 микр.кл./г

- б -

и выше, аот здоровых - не более 103 микр.кл./г фекалий и лишь после подращивания на среде обогащения.

Изученные культуры относились к различным родам семейства Enterobacteriaceae: Klebsiella, Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Morganella, Providencia, Hafnia и Serratia. Учитывая особое значение клебсиелл и протеев в этиологии ОКЗ и значительный удельный вес этих микроорганизмов в изученной коллекции, в дальнейшем при обсуждении результатов штаммы были условно подразделены на три группы: клебсиелл (36 культур), протеев (51 культура) и группу, объединяющую других представителей сем.Enterobacteriaceae (43 культуры).

В работе были использованы штамм-реципиент E.coli К12 С600 5К rifr и ультрафиолетовый мутант Staphylococcus aureus 209 Р в качестве тест-объекта.

Для определения молекулярной массы ДНК плазмид использовали плаамиды pBR 322, RSF 1010, RPt , R 222, R 40A.

Изучение фагочувствительности проводили с серийными,, препаратами коли-протейного и клебсиеллёзного бактериофагов Нижегородского государственного предприятия по производству бактерийных препаратов и клебсиеллезного бактериофага НПО "Иммунопрепарат" (г.Уфа).

Среды. Штаммы выращивали на мясо-пептонном бульоне и агаре, ауксотрофность и прототрофность культур изучали на глюкозоминералыюй среде М-9 (Миллер Дж., 1976), чувствительность к антагонистическому действию лактобактерина - на среде МРС-Б.

Видовую принадлежность антеробактерий устанавливали с помощью классических дифференциально-диагностических гадких сред и набора СИБ N 6. .

Определение типов адгезинов проводили в реакции Д-манно-зорезистентной гемагглютинации в соответствии с классификацией J.P.Duguid (1980). Использовали сверле и формалииизиро-ванные эритроциты пяти видов: человека, быка, барана, цыпленка и морской свинки,а также танизированные эритроциты человека, быка и барана. Маннозочувствительные гемагглютинины

<

(ГЛ I) - выявляли по ' агглютинации эритроцитов, подавляемой Д-манноаой.Гемагглютинины'типа Р (протеусподобные или ГА II) вызывали агглютинацию эритроцитов цыпленка независимо от присутствия Д-маннозы. Наличие гемагглютининов типа К (клеб-сиеллоподобные или ГА III) определяли по маннозорезистентной гемагглютинации только танизированных эритроцитов крупного рогатого скота, человека и барана.

Знтеротоксигенность выявляли в дегидрогеназном тесте на модели У'^-мутанта S.aureus 209 Р (Пастернак H.A., Андрусенко И.Т., Ведьмина Е.А. с соавт., 1985). Поиск генетических детерминант энтеротоксигенностц методом ДНК-ДНК гибридизации in situ проводили совместно с сотрудниками лаборатории генетики микроорганизмов Нижегородского НИИЭМ. В ¡сачестве зонда был использован Pst-I фрагмент рекомбинатной плазмиды рИЗОВ в штамме E.coli HB 101, полученном из НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи.

Гемолитическую активность изучали традиционным методом (Лабинская A.C.,1984) и частично.модифицированным нами методом с применением среды М-9 с 3% отмытых эритроцитов человека или кролика и 0,002% L-цистеина (в соответствии с рекомендацией С.И.Похил и Л.А.Кособуцкого, 1991г.).

Определение уровней лекарственной устойчивости к девяти антибактериальным препаратам (ампициллину, канамицину, стрептомицину, хлорамфениколу, рифампицину, гентамицину, на-лидиксовой кислоте и сульфаниламидам) проводили методом реплик на твердой, питательной среде (МПА), содержащей серии двукратных разведений препаратов.

Наличие в штаммах плазмидной ДНК регистрировали по методу Экхардта (1978г.).

Конъюгативный перенос плазмид резистентности в полиаук-сотрофный штамм E.coli К 12 С 600 5К гifrосуществляли в жидкой и твердой питательных средах по методам Макino S. et al. (1981) и Миллера Дж.(1976).

) .

Чувствительность к фагам изучали по методу Лппельмана (Лабинская A.C.,1984).

Определение чувствительности к антагонистическому действию лактобактерина проводили методом отсроченного антагонизма, предусмотренным ФС 42-252 ВС-89.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Как показал анализ данных литературы, одной из причин недостаточности сведений о роли условно-патогенных энтеробактерий в развитии ОКЗ являются сложности методических подходов для проведения широких исследований.

В связи с этим, выбор методов для биологической характеристики штаммов условно-патогенных энтеробактерий основывался на следующих соображениях.

Во-первых, был использован комплекс методов для получения по возможности более полной характеристики патогенетически значимых факторов. Особое внимание было обращено на подбор, апробацию и модификацию методов, характеризующих потенциально агрессивные свойства энтеробактерий. Из большого перечня описанных методических приемов нами были отобраны информативные, но достаточно простые в исполнении способы, которые могут быть рекомендованы для применения в практических бактериологических лабораториях, а именно: выявление адгезивной активности в реакции Д-манноаорезисгентной гемагг-лютинации, энтеротбксигенности по подавленно дегидрогеназной активности ультрафиолетового мутанта золотистого стафилоко-ка, а также гемолитической активности по предложенному нами варианту метода, способствующему максимальному выявлению комплекса гемолизинов.

Для более углубленной характеристики изученных штаммов у небольшой группы культур был проведен поиск генетических детерминант энтеротоксигенности методом ДНК-ДНК гибридизации.

Кроме того, были изучены биологические свойства, косвенно влияющие на потенциальную.патогенность бактерий - уровни

»

и спектры лекарственной устойчивости, способствующей распространению резистентных штаммов энтеробактерий в условиях широкого применения антибактериальных препаратов, и наличие койъюгативных плаэмид антибиотикоустойчивости, в состав которых могут входить и детерминанты патогенности.

Во-вторых, нас интересовали те свойства условно-патогенных энтеробактерий, на изучении которых могло бы базироваться совершенствование способов профилактики заболеваний и оздоровления молодняка. Для этого была определена чувствительность к биологическим препаратам, широко использующимся в медицинской практике - специфическим бактериофагам и лакто-бактерину.

Результаты проведенных исследований показали, что значительная часть штаммов условно-патогенных энтеробактерий, выделенных в условиях промышленного животноводческого комплекса, независимо от видовой принадлежности и источника выделения, характеризовалась наличием потенциально агрессивных свойств.

Так, способность к Д-манноаорезистентной гемагглютинации выявлена у 36,2 ±4,2%, знтеротоксигенность - у-29.,7 ± 6,1%, а гемолитическая активность - у 52,3 + 4,4% всех изученных культур.

Установлено, что среди энтеробактерий различной родовой принадлежности наиболее высокой адгезивной .истинностью характеризовались клебсиеллы - 69,4 ± 7,7% штаммов. Значительно реже наличие маннозорезистентных гемагглюгининов выявлено у протеев - 15,7 ± 5,3%, среди других представителей сем.'Еп-1егоЬас1ег1зсеае адгезивными свойствами обладали 3?,б ± 7,1% Iсультур. Частота обнаружения маннозорезистентных гемагглюти-ников у изолятов от здоровых и от больных телят совпадала (40,0 + 7,3 и 40,0 ± 6,3%), но была выше, чем у культур, выделенных из внешней среды (20,0 ± 8,0%).

Проведенные исследования показали отсутствие существенных различий в частоте выявления энгеротоксигенных штаммов среди изолятов от здоровых и больных телят (26,6 ± 6,6% и 21,6 ± 5,3%; р>0,05) и высокую частоту обнаружения знтеро-токсигенных свойств у культур из внешней среды (40,0 ±

9,8%). Аналогичные данные получены рядом авторов при изучении энтеротоксигенности эшерихий, циркулирующих во внешней' среде (Касьяненко A.M., Григорьева Л.В., Ерусалимская Е.Ф., 1986; Григорьева Л.В., Малахова Л.А., Глушкевич Т.Г., 1991; Sato М.I.Z., Sanchez P.S., Martins М.Т. et al., 1990; Ewald P.W., 1991 и др.).

Выявлено, что среди культур условно-патогенных энтеро-бактерий различных родов наиболее часто энтеротоксигенностыо обладали клебсиеллы (52,8 ± 8,3% культур). "

Примененный нами на ограниченной группе культур метод молекулярного зондирования показал .перспективность этого приема для объективного выявления токе-гена.

Результаты определения гемолитической активности свидетельствовали о значительном распространений среди изученных условно-патогенных знтеробактерий штаммов с гемолитическими свойствами. В целом гемолитическая способность была выявлена у 52,3 ± 4,4% изученных штаммов, в том числе у 54,9 ± 7,ОХ протеев, 52,8 ± 8,3% клебсиелл и 48,8 ± 7,6% других знтеробактерий.

Сравнительный анализ частоты обнаружения гемолитических культур, выделенных из различных источников, показал, что изоляты от больных телят характеризовались гемолитической активностью несколько чаще (63,3 ± 6,2%) по сравнению со штаммами, выделенными от здоровых животных (42,2 ± 7,4%) ' и из внешней среды (44,0 ± 9,9%). Однако следует отметить, что удельный вес гемолитических штаммов среди культур, изолированных от здоровых телят и из окружающей среды довольно велик, что свидетельствует об их циркуляции в условиях промышленных животноводческих хозяйств.

Полученные результаты в сочетании с данными литературы подтверждают настоятельную необходимость дальнейшего совершенствования методов определения гемолитической активности условно-патогенных знтеробактерий в целях как наиболее полной характеристики самих бактерий, так и роли гемолитических штаммов в развитии ОКЗ. То обстоятельство, что частота обнаружения штаммов с потенциально агрессивными признаками среди условно-патогенных знтеробактерий, выделенных из разных ис-

• «

точников, отличается'незначительно, является подтверждением неудовлетворительного санитарно-гигиенического состояния помещений для животных. Это способствует распространению штаммов знтеробактерий, в том числе и с вирулентными свойствами, и повышает вероятность развития ОКЗ у новорожденных телят.

При определении лекарственной устойчивости условно-патогенных знтеробактерий установлено, что все штаммы обладали устойчивостью к действию одного или нескольких антибактериальных агентов, причем подавляющее большинство культур (96,2 ± 1,7%) были полирезистентны.

Наибольшей активностью в отношении изученных штаммов характеризовались препараты, редко применяемые в животноводческих -хозяйствах - нзлидиксовая кислота (14,6 ± 3,1%) и гентамицин (31,5 ± 4,1% устойчивых культур). Частота резистентности к лекарственным препаратам, наиболее интенсивно используемым в хозяйствах, была высокой и составила для сульфаниламидов 99,2 ± 0,8%, хлорамфеникола (левомицгаина) -75,4 ± 3,8%, ампициллина - 69,2 ± 4,0%, тетрациклина - 61,5 ±4,3% устойчивых штаммов. \ ;

Установлено большое разнообразие спектров антибибтикоус-тойчивости изученной коллекции культур - выявлено 53 варианта, .27 из которых не повторялись.

Среди знтеробактерий разных родов более высокой частотой резистентности к действию большинства антибиотиков характеризовались протеи и клебсиеллы. При изучении устойчивости к отдельным антибактериальным препаратам культур, выделенных из разных источников, существенных отличий не установлено. Однако следует отметить, что штаммы от больных животных обладали более выраженной множественной резистентностью. Так, среди изолятов от телят с диареей преобладали культуры с одновременной устойчивостью к 6 - 9 препаратам (60,0 ± 6,3%), а среди штаммов от здоровых телят и из окру-, жавдей среды - к 3 - 5 препаратам (64,4 ± 7,7% и 68,0 ± 9,3% устойчивых культур соответственно).

Анализ плазмидного профиля изученных бактерий выявил значительную частоту распространения плазмидосодержащих штаммов, У 56,9 ± 4,3% культур обнаружены одна или несколько

плазмид различного молекулярного веса, в том числе у 35,4 + 5,5% штаммов - плазмиды весом от 60 до 100 ВД, характерным для большинства плазмид вирулентности энтеробактерий. Наибольшая частота выявления плазмвд отмечена у изолятов из внешней среды - 64,0 ± 9,5% (по сравнению с 50,0 ± 6,5% культур, выделенных от больных, и 33,3 ± 7,0% - от здоровых телят), что соответствует данным литературы о роли окружающей среды как резервуара плазмидосодержащих штаммов (Отель-цер В.,1988; Мойсеенко H.H. ,1994; Linton А.Н.,1988 и др.).

Из 34 штаммов, использованных в качестве доноров детерминант резистентности, у 15 культур различной видовой принадлежности показана трансферабельность устойчивости к антибактериальным препаратам, в том числе к наиболее широко применяемым в животноводстве ампициллину", тетрациклину, хлорам-фениколу и сульфаниламидам.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено распространение в промышленных животноводческих хозяйствах штаммов условно-патогенных энтеробактерий, характеризующихся потенциальной агрессивностью и множественной антибиотикорезистентностыо, что придает особое значение использованию физиологичных и безвредных биопрепаратов для лечения и профилактики острых кишечных заболеваний.

Нами показано, что лактобациллы обладали сильным антагонистическим воздействием в отношении всех изученных штаммов условно-патогенных энтеробактерий, что подтверждает целесообразность и необходимость расширенного применения коммерческого препарата лактобактерина в животноводстве. В то же время, производственные препараты специфических бактериофагов (коли-протейный и клебсиеллеэный Нижегородского предприятия по производству бактерийных препаратов и клебсиеллёэный - НПО "Иммунопрепарат" г. Уфа) были недостаточно эффективны. В целом, фагочувствительность выявлена у 72,2 ± 7,5% клебси-елл и 37,3 ± 6,8% протеев, причем в большинстве случаев в невысоких титрах - до 10~*.

Характеристика изученных культур по предложенному нами комплексу показателей, включающему потенциально патогенные свойства, позволила установить значительную частоту расп-

• •

ространения штаммов о'наличием двух и более определяемых признаков - 60,8 ± 4,ЗХ.

Показано, что среди культур различной родовой принадлежности сочетанием двух и более свойств чаще обладали клебси-еллы (66,7 ± 7,6%), а среди изолятов из разных источников -штаммы, выделенные из фекалий больных телят (58,3 + б,4%). Частота обнаружения сочетанностн адгезивных и энтеротокси-генных свойств была более высотой у клебсиелл - как в целом, среди всех изученных ыТацмов (38,9 ± 8,1%), Tait и среди 1сультур, выделенных из фекалий телят с диарреей (41,Z ± 11,9%).

Анализ полученных данных по определению адгезивной, эн-теротоксигешюй и гемолитичесюти астивности, а тагане антиби-отикорезистентности исследуемых icy ль тур в сочетании с данными о тяжести заболевания, при котором они были изолированы, и с учетом большой значимости в этиологии диарей клебсиелл и протеев дал возможность выделить два штамма условно-патогенных энтеробактерий (Klebsiella pneumoniae и Proteus mirabilis) для создания ассоциированной бактериальной вакцины.

Одновременно нами (совместно с В.М.Лавровской, Н.Ф.Брус-нигнной, Н.В.Залесских и Л.А.Поздышевой) были проведаны комплексные исследования коллекции штаммов энтеробактерий (440 культур) музея Нижегородского НИИЗМ, выделенных от людей и животных. Полученные результаты выявили идентичность основных свойств энтеробактерий, выделенных от людей и животных, что свидетельствовало об общности источников заболеваний и целесообразности использования компл ксной характеристики энтеробактерий, включая вирулентные свойства, при подборе вакцинных штаммов.

Предложенный нами способ подбора вакцинных штаммов позволил сконструировать инактивированную ассоциированную вакцину с механизмом действия, расширенным за счет наличия антигенов, индуцирующих комплекс антител. Вакцина предназначена для иммунизации животных с целью профилактики ОКЗ, получения гипериммунных специфических сывороток и препаратов лактоглобулинов.

выводы..

1. Предложен информативный комплекс современных методов для характеристики энтеробактерий, включая потенциально патогенные свойства: определение адгезивной активности в реакции Д-маннозорезистентной гемагглютинацин с набором эритроцитов, энтеротоксигенности in vitro по выявлению токс-гопа ДНК-ДНК гибридизацией in situ и по подавлению дегидрогепаз-ной активности ультрафиолетового мутанта золотистого стафилококка, гемолитической активности и плазмидного профиля.

2. Установлена потенциальная агрессивность большинства (60,8 ± 4,3%) штаммов условно-патогенных энтеробактерий, циркулирующих в конкретных животноводческих хозяйствах, на основании их характеристики по предложенному комплексу методов.

3. Выявлено, что наиболее часто адгезивными и энтероток-сигенными свойствами обладали штаммы клебсиелл (69,4 ± 7,7 Z и 52,8 ± 8,3% соответственно).

4. Показана множественная лекарственная устойчивость подавляющего большинства (95,2 ± 1,7%) изученных штаммов энтеробактерий.

5. Определена распространенность плазмидосодермащих штаммов и показана трансферабельность резистентности условно-ла-тогенных энтеробактерий различной видовой принадлежности к антибактериальным препаратам, наиболее широко используемым в животноводстве.

6. Разработан способ подбора вакцинных штаммов энтеробактерий антропозоонозной природы, позволяющий расширить механизм защитного действия специфических иммунных препаратов за счет их обогащения патогенетически значимыми компонентами микробных клеток.

7. Рекомендовано, наряду с улучшением саннтарно-гигиени-ческих условий содержания животных и обоснованной антибиоти-котерапией, расширенное применение биопрепаратов для лечения и профилактики острых кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных.

»

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Черневская О.М., Бруснигина Н.Ф. Лекарственная резистентность условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от молодняка крупного рогатого скота//Наука и производство в решении комплексной проблемы "Антибиотики": Тез. докл. Всес. конф.-М.,1989,- С.140.

2. Черневская О.М., Бруснигина Н.Ф. Лекарственная устойчивость условно-патогенных энтеробактерий, выделенных из раздичннх источииков//Антибиоти!си и химиотерапия,- М. ,1991.т.- С.7-9.

3.' Черневская О.М., Залесских Н.В., Лавровская В.М. Изучение гемолитической активности условно-патогенных энтеробактерий при подборе вакцинных штаммов//Биотехнология и генетика.- Н.Новгород, - 1991.- С.23-25.

4. Лавровская В.М., Бруснигина Н.Ф., Залесских Н.В., Черневская О.М., Поздышева Л.А. Применение патогенетически значимых характеристик энтеробактерий при конструировании иммунных препаратов//В сб."Акт.вопр.мед.биотехнол.": Матер.науч. конф.,поев.85-летию Томского НИИ вакцин и сывороток.Томск, 1991.- Ч.1.- С. 134-135.

5. Блохина И.Н., Лавровская В.М., Бруснигина Н.Ф., Черневская О.М. Факторы патогенносги энтеробактерий антропоЗоо-нозной природы и их роль в биотехнологии иммунобиологических препаратов // Акт.пробл.инфекционной патологии. Ч.З. Иммунология и биотехнология.Мат.юбилейной научно-практ.конф.,поев. 70-летию Ин-та им.Пастера (Санкт-Петербург, 25-27 мая 1993г.).- Санкт-Петербург, 1993. - С 53.

6.Информационное письмо о бактериологической диагностике острых кишечных и гнойно-воспалительных заболеваний с приме- . нением систем индикаторных бумажных (СИВ)/Сост. :В. М.Лавровская , JI. Л. Поздышева, О ,М Лерневская, Н.В. Носкова. -Н. Новгород, 1994... т 14 с. -

» *

O.M.Chernevskaya.

BIOLOGICAL CHARACTERIZATION OF OPPORTUNISTIC ENTEROBACTERIA ISOLATED IN INDUSTRIAL STOCK-BREEDINQ FARMS.

Biological properties of 130 strains of opportunistic en-terobacteria isolated from clinically healthy and d.iarrhoeic neonatal calves and from farm environmental objects were investigated.

Adhesive, haemolytic and enterotoxigenic activity, antimicrobial drug resistance and presense of conjugative plas-mids were tested. Sensitivity to specific bacteriophages and lactobacterin were also determined.

The results indicate that multiresistant strains of opportunistic enterobacteria with potential pathogenicity factors are widespread in a farm environment. Of the total isolates investigated 96,2 ± 1,7% were polyresistant and 60,8 + 4,3% possessed at least two of the potential pathogenetic characteristics studied. All of the strains were sensitive to antagonistic effect of lactobacilli.

Two strains (Klebsiella pneumoniae and Proteus mirabilis) for .multicomponent vaccine design were selected.

Extended employment of biopreparations for treatment and preventing acute enteric infections of farm animals was recommended.

О.М.Черневская.

БКОЛОГИ^СКЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ЭН Т ЕГО! >Д!iТЕRill, ВВДЕЛОПШ В ПРОМШШШЫХ ЗШОТНОВОДЧЕСКИХ КОМПЛЕКСАХ.

Робела исгзяпзкз томплекспочу изучению биологических 120 уотоР!Ю-п?\гогеницх энтеробактерий, шдо-

г. nix;-.....iw"-/. гаготчоЕ'ОДчесгсж !сс::зйстиач от телят с

;\нг.рес;*1, вли>вп'чя«г рдсрсрых т?ллт и из сгружающей среди.

ЗГсслгдсе21Л.1 адггегшпач, n-молитичоская и энтеротоксиген-:iöi ¿ktiibhoctj- штаммов, их чувствительность к антибактериальным и биопрепаратам, а также наличие конъюгативных плаз-мид а*. :лбиотпксрезистентнссти.

Показано, что, независимо от источника выделения, значительная часть культур характеризовалась множественной резистентностью (96,2 ± 1,7%) и наличием двух и более потенциально агрессивных свойств (60,8 ± 4,3%). Среди штаммов различной родовой принадлежности наиболее часто потенциально патогенными признаками обладали клебсиеллы. Все культуры были чувствительны к антагонистическому действию коммерческого препарата лактобактерина.

На основании полученных данных по предложенному комплексу характеристик отобраны два штамма условно-патогенных энтеробактерий для создания ассоциированной бактериальной вакцины против острых кишечных заболеваний сельскохозяйственных :гл!Еотных. Рекомендовано расширенное применение экологически' чистых биопрепаратов для лечения и профилактики диарей молодняка крупного рогатого скота.

30 »01.95г.. Объем 1я„ л»_Ддр. IQQ

Im. Fym, Орджоникидзе, 3

3atrt 58