Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологическая активность новых отечественных индукторов интерферона при экспериментальной гриппозной инфекции

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Биологическая активность новых отечественных индукторов интерферона при экспериментальной гриппозной инфекции"

российская академия гщщинских наук

НАУЧНО-ИССЛЕЦОВАТЕЛЬСгаЙ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ вмени Д.И.ИВАНОБСКОГО

т.—ы-:-

_ л п^г ■¡""•1 На правах рукорпсп

'( м 111 ¡«./^1

МЕЗЕНЦЕВА Маряса Владшпровка

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НОЭДХ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ 1ЗДУКТОРОВ ИНТЕРФЕРОНА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГРИППОШСЙ ИНФЕКЦИИ

03.00.06 - вирусология

Автореферат длссертапип на соискание ученой степенп кандидата биологических наук

Москва - 1293

Работа выполнена в Научно-исследовательском институту вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН а Научно-исследовательском институте эпи д©миологии и микробиологии нм.Н.Ф .Гамалеи РАМН.

Научный руководитель

Научный консультант . Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение

академик РАЕН, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук Ф.И.ЕРШШ

доктор биологических наук Э.Б.ТАЗШХОДА

д. б. н., профессор В.В.МАЛИН ОБСКАЯ д.м.н..профессор Л.А.ФАДЕЕВА

Центральный институт усовершенствования врачей МЗ Р5 (кафедра вирусологии).

Защита диссорташш состоится " " О^Сг^Ги1993 г.

в_часов на аасодаюш Специализированного Совета Д.001.20.01

при НИИ вирусоло!нп щ.Д.И.Ивановского РАШ (Москва, 123098, ул.Га-иалва,16)\

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологи) ем.Д.И.Ивановского РАШ.

Автореферат разослан " " 993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат нодишшски.с наук

АЛЛ. ЖУКОВСКИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актузлькость,проблемы, Однам из актуальных направлений в области здравоохранения является определение эффективных средств профилактики и лечений гриппа. Учитывая, что грипп приводит к снижению иммунологической резистентности организма, важны также разработки по коррекции иммунитета населения, В последние годы эти вопросы активно разрабатываются и внедряются в практику сотрудникам! отдела "Идтерфзронов" Н'И ЭиМ им.Н.5.Гамалеи (Ершов и др.,1965; Тазулахова и др. 1985; Григорян 1992).Ими доказана возможность использования интерферона и его индукторов для профилактики а лечения гриппа, а также роль различных классов индукторов в стимуляции иммунологической реакции организма .Известно, что уровень продукции ИЗН определяется различными факторами,среди которых вирус занимает одно из первых мест. Так, вирусы гриппа являются наиболее активными индуктораш ИФН в пмроком спектре клеток и тканей, а также в организме животных и человека.

В нашей стране производится и используется в клинической практике лейкоцитарный ИФН, получаемый в культурах: клеток лейкоцитоз донор. ской крови, а такйв генно-инЕекернш ШН - реафероп. Перспективы их применения для лечения гриппозной инфекции ограничиваются слогдюстьв Приготовления в достаточном количестве и высокой стоимостью препарата. Необходимо учитывать также сложности с донорской кровью. Поэтому индукция е организме собственного (эндогенного) И2Н под воздействием индукторов ИФН, безопасных для челозека и низкая стоимость препаратов делает их очень перспективными для практического применения.

Исходя из этого, вакен поиск менее токсичных и более активных индукторов, отработка оптимальных условий для изучения закономерностей образования и проявления антивирусной активности индуцированного И'ЗН в экспериментах ин витро и ин вибо. Известно, что у интактных йивот-ных, как клетки фикоирозанних тканей, так и циркулирующие клетки крови являются хорошим:! продуцентами эндогенного М5Н. Однако, не установлено точно, какие клетки (кромэ лимфоцитов) исследуемых органов являются собственно продуцента?,® Й$Н*з ответ на индукцию препаратами,относящимися к разным классам. Таюхе не ясно, яалякгся ли клетки этих органов, выделенных от заракешсых гриппом мышей, функционально активными в ответ на тот или другой индукторы ИФН. Нет сведений о том, в какой мере локально образующийся И'ЗН играет роль в патогенезе гриппозной инфекции.

Цель и задача исследования. Целью настоящей работы являлось комплексное изучение закономерностей стимуляции 1штертеронообразова-гая и развития противовирусного эффекта в культура клеток и opräliiiS^ ме экспериментальных животных под воздействием индукторов различней природы, а такие определенно рола тмунокошатонткых клеток в шт&р* фероногенезе.

Для достижения указанной цела были поставлены следующие задачи5

1. Определить способность пкмуноыятов tsinsli синтезировать Ж>Н б зависимости от типа аддуктора и способа его введения. Л также выяснить роль макрофагов в регуляции продукции К&Н.

2. Подобрать эпидемически актуалний вирус гриппа в чувствительную к этому вирусу лакаю мышей, способную о: зечать продукцией ИЪН на индукторы разных классов.

3. Изучить возможность применения отечественных индукторов И1Н, относящихся к разним классам соединений, в качество профилактических и лечебных средств при гриппозной инфекпии и разработать оптимальнее схемы 'введения кланически перспективных индукторов ИМ.

4. Показать преимущество, сочоташюго применения индукторов И1>Н

с рекомендуемым химЕотерапевтическим лромшогриппозным прзпаратсм ремантадином».

Нау-шяя нобчзня. . При выполнении настоящей работы получен ряд новых и приоритетных научных данных, имеицнх г-зкноэ теоретическое значение.

Выявлена разданная степень индукции ентерфэрокообразовзндя при действии разных тшоь отечественных.аддукторов (рдцостина, ларпфана, камедона, амяксина, МШ 35/1ОЭ, кагоцалз, саараш, гозалидона).

Впервые на модели реассортаата вируса гриппа ¿(НЗ//2) изучен широкий спектр этих индукторов в опытах ;зн внтро и части из них (ка-гонел, камедон, ларифак, МСП 35/109) в экспериментах ин виво.

Впервне в клеточных культурах изучено влияние реафэрона и индукторов Ш11 (кагоцела и даряфака) на репродукцию реассортакта вируса гриппа А, Установлено зируснойтраллзуюцеэ действие индуцированного JffiH и выявлена различная активность реаферона (от стимуляции до полного подавления) е зависимости от дозы препарата.

Впервые на ?:.оделп реассортанта вируса гриппа в опытах на белых мышах определены более оффоктиЕные способа введения индукторов КЕН, обеспечивающих большую Еыаиваемость лх от гриппозной инфекции.

Исследованы закономерности синтеза эндогенного ИЗН в крова и органах (селезенка» лимфоузлы,, костный мозг, тимус) при различных способах введения разных классов индукторов. Установлено, что наиболее активными продуцентами ЮН являются спленоггаты я лиг,Допиты периферической крови, которые отвечают синтезом ИШ при введении практически всех индукторов. В то время гак клетки лшроузлов,тимуса и костного мозга продуцируют ИМ в различной степени в зависимости от тпп;>> индуктора.

Впервые показано, что в клетках, зараженных гриппом животных титры ЖН, как правило, выше, чем у ке инфицированных мышей.

Практическая значимость работа.

Расспрен спектр отечественных шдукторсв Ш1, которое .могут быть рекомендованы для применения при гриппозной инфекции.

Для каждого типа индуктора \7Ш отработаны оптимальные условия (концентрация, сроки и способ введения), способствующие увеличению интерйеронпродуцирующей л вируснейтрзлизущой активности, как пра проведении экспериментальных исследований пн зятро в хслэточних культурах так и утл виво в организме аивотных.

Рекомендована экспоргт.'.онтальная модель (эпидемически актуальный вирус гриппа л чувствительная к нему гибридная лизпя И, обладающая еысокой степенью продукции 10Н) для проведения псследсваклй по определенна ГОН-яздуниругяцзй и вяруснейтралязущеЗ активности индукторов Ш>К я организме животных. '.

Со материалам диссертационной работы получен положительный ответ Фарикомитета 'ЧТнтзрфэроншздупирущеэ и противовирусное средство", И 4907166/14 от 04._02.SI г. Разработаны Методические рекомендации "Применение индукторов Ш>Н при гриппозной инфекции", 1391 г.

Основные положения, ?нностко на защиту.

I. Способность клеток иммунной система (лимгопиты периферической крови, селезенки, лимроузлов, тимуса я костного мозга) организма

экспериментальных животных синтезировать ШН зависит от типа индуктора и способа его введения.

2. Роль макрофагов в интерфероногенезе ограничивается способностью передавать ицформапяа о синтезе И5Н Т-лимйоцитам.

3. Реассортант .вируса гриппа (Н5//2), являясь эпидемически актуальным, обладает патогенностью для мыиэй, более высокой репродуцирующей способностью в разных клеточных линиях и КБН-индуцирующей активностью по сравнению с исходными птаьэама.

4. Линия мышей И (СВАхС57В4о) является оптимальной моделью для определения ШШ-индуцирующвй способности Еммунокомпетентных клеток при гриппозной инфекции.- . .

5. Индукторы, вызывающие синтез Ш1 в клетках именной системы нперЕнэ 3 суток послс заражения гриппом, могут быть рекомендованы для применения по лечебной схема3 препараты, индупярушэде ИШ через 3-5 суток после инфицирования - по профилактической схемэ^в более поздние срои; (7-9 суток) - не рзкомещфугся к применению.

6. Сэчетанное применение двуспирального индуктора ШН ларифана и химвоцрепарата ремантадина более эффективно при экспериментальной гриппозной инфекции.

.Апгобпгоя работу.

Результаты исследований были доложена на Международных симпозиумах по интерферону 1988 г., г.Юрмала, Латвия; 1590 г., г.Ленинград. •

Диссертация йхшробирована 8 июня 1923 г. на конференции отдела "Интерфероном" ШИЭиМ Ш.Н.Ф .Гака лез РАМН.

РубдчТОГОШ

По материалам диссортацни опубликованы 5 печатных работ.

Объем и структура лиссеотаиии '

Диссертация изложена на У ГО машинописного текста и состоит из введепия, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав собственных исследований, обсуждения результатов и выводов.Список использованной литературы включает ./32 источника, из них У? зарубежных. Работа иллюстрирована £ таблицами и рисунками.

X *

X

Автор пользуется случаем гчразать всхрзннкэ благодарность своему научному р-псоводателю члеп-коррзснондснту РАМН, академику РАЕН, профессору, л.м.н.Ф.И.Ергзсву за оказанную? псмояхь з выполнении диссер?а-пшшой работа. От Eceil дупл благодарю д.ci.п. Э.Б.Тазулахсву за ока-оатшо всесторонней помопи. Вырагап яскрегожэ благодарность геем соавторам л коллегам отдела янтерфарсноз НИИЭ&М ем .Н.Ф .Гамалея FAlffi и лаборатории онтогенеза вирусов Института вирусология им.Д.И.Ивановского РАМН.

ШШШ1 -А матон.

ллдотлце... Исследования прсводих! па мгшах-езмцге ляалз СБА массой 12-14 г.,линяя C57BL6 массой 10-12 г., гибридной линии И (СВАх C57BL 6) массой 10-12 г. к болах бсспородткс мигах массой 10-12 г. •

Клйадь Б работа использовали поршчгао клвтяп фябробластов с-м-брпонов чзловока ($34) л пояска крол;:кзз-сое.уп:-:о:п (П крэл. ), омбриогд ■ коровы (IÎSK), возорогдешгого слрйсхого хс?.'лгоп (BKK-2I), зол экой гар-тыака (линия l/éro, 4347 я QV-1), ембрязга евлш-я (СП2В), клон I-5C-4 кскъяхтявк человека, ?«:х"лс-го фибробгаедч ( L -929) ; диплоядгав клетки хоглю-мггаачной ткани змбряенэ чэло(Ы22), логкпз змбряона человека (ЛЗЧ),

Яспользопля глруся грлппа HI.-/I (птамм А/PP/8/3^ H3/V2 (ггамм А/0яли1шшгл/2/82), рсасссртакт ЕЭ4 (НЗУ2), получешшй в результате скр-эцлванлн пзр'пх двух сгаг.мзз; яярус ог'цсТллсмЕэлата мышей (ЕЛС) --агамм "Колумбия Se -Ùi - 5с вирус болпзпл Нз^глстгп ( s/Sif) -птамм "Н".

Препарата,. Человеке скг.й сэ:;смбгла«тй;:Ч гатерророн «s<-2 - реаферон. Енсоко!.'.олокуляршв"глуг/::торл L'iH: ргдэстш (до. РНК дрегавй Saccharo-nvjC.es ceretftsiae. ), ,rip::-'<" (до RîK фага ). Назксмолскулярнне синтетические угл?т:сдоро~!: (яроязвояиой акрадакона), ампкеин

, (2,7- бис 2 дргндродлорйд), МОП 35/109

(германвй.-содеряагззо ссодяиешго). Прясоднио полг'фенел:! на осяоео гос-

- G -

скполг.: кагоцел, саврлц, югадпдок. Лрародши «ктогеп - кониаивал:«! I (Кои.'.), природа-.-;» :.атогсл -OTA; а&шшлыгй :и^и:олропараа' - рошгга-

Пспольсссал/, культ уро-^'.ша, крусо.чзг^чвсгд: з i«oaopj, m-дробная ¡саракюрпстшг. кочодох кродитаьл.^; ь сооадстогЕугда: раадо&х работа.

Тагровашю К';К проъодили с по-'осьл mâkpoî.-jyoâi uo волавлэпаэ ШД '.ocv-ьлруса Г Г; {СлмрбаЧу. t Vn-ni^er ?- е/ ni , Носик U.K., Асистап и др., 1C¿2)'.

Выделению ШК г.з орг&пзв ппоьо;;:;-:! по мишду, глураоотакному H.H. Амшшой í: др. (1284).

Доо-говвая-тя-л ъалучыурх и Гас-:лсп»,«...п!ах результатов опа'-лвали по грлтер::й (Ьъь&окга. Рез.-лы..«^ е>гцт.-:лч достоверно:;! пгл Р£ 0,05.

míhbsüjíke • :» • i •

Осиовнил;; лг.оедасяти-.'л '.&Н в орг-иизмв человека и ¿лготпих явля-ъхсл клот:г, ,. (¡¡'¡.о, чго ¡^зл.гшле классы соаД1.не~

III,способа L'-йр'.-луи'са Ш-Н, отлечь •оцяхсл по аитягсшш;.г/ TLiiy, при ovc:.: SÄt ли:-лран,ьмпr¿: ¿o рйздл\;а.лея (Ipso» Ф .И.,Ноет: H.H.,Тазула::01.. :>,B.Xí?.'J:.'út. o3í«u!;y:u:i::cii ИШ играет сущост-

E^jíiy» роль i» p-.^iocdj^vjjx к частиостх rpsnnos»

но!;, прздсга^;::;:а ;.:!! иадуат.рудгуу активность iigi/j го-

рах прошрагоа г: uouv-im „■.•<.:■: iov.toi: ииуш.о.1 систсш.С зтс1;

нел1>а били шбраи: пргшкраш, odp¿.r. рааних типое íf.-H

li súiaKTKia «.и::*;? СЗ':. Так, rj;.:eLoa ai-г пиру«?, в осноиюм, <.(,-

-KU; zapvùïK r¡ nep;:Jcp:;4'jcico3 ia;ei;t¡ л силонаmvaaz ~ «par,-

¡.•уюственке - fi -1.-.-H; Mlíi 35/1 СО н-елваат синтез -SR, хо-.я e rojarax он гдцгЖруйг c-6 -LvH. Cíjdcs ¿¿-u - K>Ii г разлше пропорциях сглтезируш i'j.i'U'-; расж.ги:тх органам а ответ на шпесии, 1>йдостпк,га~ гошл, carpuiv г. гогадьчел (?аоулд::с£а Э.Б.,1£БЗ).

j _/

Рис.1 Продукции IfcH в клетках крови, костного мозга, тимуса и | о-=ле зенки под действием индуктород ин вятро.

качедон ' ларкган рвдостян амиксин М0П35/109 1сагоцзл саврац

гозалидон

г

1*■<

M-Jnxk

Клетки-продуценты выделяли из крови, костного мозга, тимуса и селезенки а индуцировали ин вптро. На рисунке I отмечены глкспшльные уровни 1®Н, которыо синтезируются в этих культурах. Как вадио, наиболее активно продуцируют ISH спленоциты в -ответ на Есе использованные препараты. В меньшей степени обладают способностью продуцировать Ш>Н лигЛопиты периферической крови. Клетки костного мозга синтезируют наибольшие уровни Й5Н в ответ на препарат, индуцирующий Х-KiH, - каме-дон (1000 Ец/мл), а тагсно з ответ на препараты, вызывающие продукцию смеси d. и уз -Ш, - ридостин, кагоцел, саврап (320 Ец/мл) и гозали-' дон (80 Ец/мл). Возможно, это является результатом того, что костный мозг состоит из В-лимйонитов и макрофагов, которыо продуцируют, главным образом, cL -1Ш1. Тямогшты, состоящие и основном лз Т-клеток,ян- . тенсивно синтезирует Ш>Н в ответ на все индукторы, кроме камедона.Проведенные ранее исследования с использованием моноклоналыщх антител показали, что эти индукторы стимулируют продукцию ISH в Т-лам-

фопитах, а камедон не способен вызывать синтез ШЯ в данных клетках.

Таким образом, продукция Mil з различных клетках иммунной системы при индукпии их ин зптро различается в ответ на индукторы, относящиеся к разным типам. Это монет быть результатом разного уровня дифференци-ровки клеток, выделенных из органов иммунной системы, а так же различным соотношением популяций клеток в исследованных органах.

Продукция шн д. пммтнокомпетентннх клетках, гаделекнчх от индущроватшх яивотннх

Стимулируя интактныэ клетка ин витро моено решить вопрос об их способности синтезировать IBH. Однако, нельзя определять тот вклад, кото-

рий осуществляет та илд иная популяция йммуноцэнтав с .организма в ответ на конкретный индуктор. -Решить этот вопрос ыокно» изучая ИШ-син-тезлрззрщую способность различных популяций клеток лимфоцитов п-ерифари-ческсйЗ крсшхц селе зенки, тл'.туса, костного мозга и макрофагов, выдаяен-ных от Ендуш1роЕанных животных.

Клетки пммуяной системы приобретают способность синтезировать более высокие уровни ШН в ответ на введение зшюяшм индукторов КШ.Мак-симальная способность разках популяций глоток продуцировать ®Н приобретается через разные промокутки времени после индукции и,в первую очередь, зависит от использованного препарата. Так, в ответ на индукторы "раннего" ИБН - ларифан, камздон и ридсстпн иммуноциты продуцируют В5Н в более раннио срсйсц. Наоборот р в ответ ж аддукторы "позднего" Ш>Н, такие как' амаксдк, клетки постепенно прдобретавт способность синтезировать И&Н.

Рода ъ регулят*^ ппоттуигип '/^Н.

Как показано .ранее, осыовеиз нродуцепгамд ИШ в организма ябля-ются лимфоциты., а К£Н - сзнгезяруэдая способность макрофагов невысока по сравнения о шса.

Иоходч из стощ можно было прадполонить, что 1Ш-продупирувшая роль макрофагов ги основная для них к помяио регуляторной, эта популяция глоток погнет коегд фунглшо лергдачи ш^орт-ядии о синтезе ШН лимфоцитам.

Для подтверждения данного Еродполоп-зния и определения роли г.шкро-фагов в продувдсд КЗН нами были использованы смешанные культуры интакт-шх лиглйоштоз селэзонки с макрофагами, выделенными из ператониального эксудата (ПО) аавоткцх через 24 часа поело индукции шлей ларафаном и кагледоном (таблица I).

Таблипа I.

Синтез йЗН смешанными культурами спленояитов и макросбагов ПЭ, стимулированных ин виво

Индуктор _Титр ь кулътута.х (Ед/мл)_

_ли?дпонита_макрофаги_микст-куль туш

Ларифан 640 40 840 Ка^едон_2560_320_- 2560

Таблица 2

Синтез ИШ смешанными культурами иитаетных спленонитов и макрофагов, выделенных^ через 4 часа после индукции животных

Культуры кл6т0к Обработка. митомяц,С Титр да в ответ та инхпгсатия (Ел/мл)

ямгчссте к' гмедон ■ ряяоеткн тюряФян

Макрофага - 30 ' 40 60 60

Макрофагя 10 Ю 10 Ю

Макрсйаги+ - 80 20 640 320

лимфоциты

Макрофаги* + 320 Ю ' 1280 320

лемвоциты

Видно, что макет-культуры сшгтезируют И5Н в тех не титрах, которые продуцируя* л?ггёош5тн, ищэлепнко от лнтактннх животных л яндупярован-нне кн Еятро. В тс^е время уровень РУ5Н, синтезированного смешанными культура?ли з 8 раз прзЕНшал тятрц 1ЙН, синтезированного одними макрофагами. Это свидетельствуем о том, что продукция ШИ в смсхашщх культурах, обработанных гадукторэмд "раннего'1 КШ, осуществляется в основном лимфоцитами.

Далее отл применяли г.отод получения "стимулирующих" клеток, который используется-в пг.с.тнолг.гля дли определения антягвн-прэзеятирутсзвЗ роля мапрофагоз. О этой ясякэ макрофагл, выделенные через 4 часа от янкунярованних зизсиясг, обрабатывал:! мятоггпцпном С л использовали их для приготовления птцсст-культур. В таблице 2 приставлена результата экспериментов, прсведзшяс а шкрофаглмз ПЭ, аыдвленваия спустя 4 часа посла ютухоса навойах ам:-.:ссг.Еом, .Егалздоноч, рвдостшом и лар^фгком. Необработанные иажроЗагд ст-абллпзаруда скнтз'з 1Ш1 з смешанных культурах с ивтакишкд ЛЕ.*.§одитакп з ответ на большинство исслвдовананх ия-дуктороз. Обращает на себя 23».анав то? бак?, что уровень синтеза И5Н в микст-культурах еышо, чем в культурах тлакрофагоз мышей, индунировал-ных яя виз о амикенном, рядостязом я ларнфаяом. Пря яндукшза камедонс.м титры И5Н в смешанных культурах остаются па уровне синтеза в контрольных макрофагах. Т.К. макрофага, обработанные мдтсмигожом С, нэ синтезирует К5Н, использование их для приготовления микст-культур позволи-

- ю -

ло установить, что при индукции ларяфаном, ридостиноми амиксином эти макрофаги способны передавать информацию о синтезе ИМ1 интактным • лимфоцитам. Об этом свидетельствуют одинаковые уровня Ш>Н в смешанных культурах лимфоцитов с макрофагами, обработанными к не обработанными митомииином С.

Макрофаги, индуцированные камедоном не передают информацию 'о синтезе Щ>Н лимфоцитам-.. Это объясняется, по-видимому, тем, что основными продуцентами Ш>Н в организме в ответ за индукцию данным препаратом являются В-лимфоциты, вспомогательную роль макрофаги выполняют дли Т-лимфопитов.

^Синтез ГФН клетками иммунной системы в ответ на разные пути введения индукторов ИИ

Известно, что при введении индукторов И5Н разными способами уровень сывороточного ГЯ'Н отличается (Тазулахова Э.Б., Амитина Н.Н.,1984), что возмогио является результатом неодинаковой продукции локального И5Н в одних и тех ае органах. Поэтому в следующей серии экспериментов препараты, относящиеся к разным классам соединений (амиксин, камедон, рпдостпн, тарифан, кагоцел, саврац, гозалвдон и МОП 35/109), беодили мышам линии СБА разными способами - перорально, Енутрибрюшинно,внутримышечно к подкожно. Кз данных, представленных на рисунке 2, видно, что камедон вызывает продукцию енсоких титров ИФН (до 5.000 Ед/мл) при всех способах введения в лимфоцитах периферической крови, селезенки и костного мозга. Аналогичные данные наблюдаются при применении природных соединений на основе гоесипола - кагоцела, саврапа и гоза-лидона, которые таете активно индуцируют Ш1 во всех популяциях меток практически при любом пути введения.

■ При использовании двуспиральных индукторов Ш>Н (ларщака и ридо-стина) сдай и те лее клетки иммунной системы по-разному реагируют на способ введения этих препаратов в организм гивотных. Поэтому стратегия нрименэнля до-индукторов должна быть различной в зависимости от пели исследования. Оптимальные пути введения ридостина, при которых наибольшее количество популяций отвечает максимальной продувной ШН, - Енутримыщечный я подкожный, а ларифан проявляет наибольшую активность при Енутрибрюшинном способе применения. Несмотр!! на то, что при

Рис.2 Продукщя ИФН иммуноксмдетентнквд клзтками милей СВА поя введении индукторов различными способами,

камедон

1

V.

I

рцдостян ларпфан МОП ЗбД09_кагоцэл саврац гоТззлвдон

Г*"!

V.

и

К

о

й

I

/

И

3

г??

Й

Ш 1 и

ь]

I

*

5'

I

'5

§

1 !

и

'!

>- з

а!

У - пзрорально [Щ- внутрпбрЕшгнно

Ц - внутримышечно

- подкояно

всех способах введения германий-содернащего препарата МСП 35/109 отмечаются приблизительно одинаковые уровни продукции Ш>Н, оптимальным путем следует считать пероралышй. При этом более высокие титры И5Н отмечаются в сплоноцигах е плетках костного мозга...

Изучение ропподупипущей и ш?-инду1гипу№вй активности вирусов гриппа А в опятах ин витро

Нами'проведено сравнительное иэучешзэ вирусов гриппа А - штамма А/Р?/8/34 (И//1), эпидемически актуального штамма.А/Филшшины/2/82 (НЗ//2) и реассортанта Е94 (НЗ//2), полученного Щапановой М.В. (1988) путем их скрзадвания. Изучение репродуцирующей активности исходных вирусов Ш.М1 и НЗ//2 и реассортанта в первичных (ФЗЗ в П крол.) и перевиваемых (МДСК, гслок колъшктивд Чанга 1-5С-4, СПЭВ, ЕНК-21, ПЭК,464?, С (/-I ц М-22) клетках позволило впявить. спектр пермиссивных культур для каздого тепа вируса, что может способствовать расширению диапазона их применения для экспериментальна:;: исследований па клеточной модели с вирусами грыша того или иного подтипа. Откачены штаммоаые различия среди вирусов гриппа А по степени репродуцирующей активности в различных клеточных линиях. Выявлено, что реасссртант В94 обладает более широким спектром чувствительных клеток и более еысокоД репродуцирующей . активность:.) в .больалшявв глзточннх лшвшх (МДСК, СПЗЗ, ВНК-21, ПЭК, 4547 и клон 1-5С-4). Изучение Ш>Н - индуцирующей способности исходных вирусов гриппа ШЛ/1 и 113//2 и рзассортаята еыяеило, что последний' вызывает активную продукцию К£Н в парзвивасглис гл-зточных линиях МДСК в Цгго .

Учитывая, что реассортант 11 94 обладает антигенными свойствами эпидемически актуального штамма А/Филидпени/2/82, а патогенность для мышей и высокую р опродуцаруюцую активность в клеточных культурах приобрел от штамма Л/Р™ 8/34, он был использован в наших дальнейших исследованиях в качестве модельного вируса гриппа-

Синтез Ш1. улмукокомцетвнтннми к детками, выделенных из разных

. лиш2__шшЖ ......

Следующим о гас см работы .был. выбор линии мышей, которяя с одной стороны была бн чувствительна к вирусу гриппа А, отобранному для рабо-•ты, а. с другой - обладала бы способностью синтезировать И5Н в ответ на

- ig -

индуктора разных классов. Для сравнения были выбрани 3 линии мкией: СБА, C57BL 6 и гибриды первого поколения кзхщу ними - П. В качестве индукторов УШ использовала срегараттх, вызывающие синтез разных антигенных типов И±>Н: лзрафап Хлцдукзюрß -¡Ш), камсдои («6-1ЭН) и Кон .-• Му-тк).

Поскольку шеи линдд СБА, обычно использующиеся для проведения .таптюлогических исследований, на чувствительны к вирусу гриппа,данная линяя не могла быть использована в нолях исследованиях. Murnt линии С57В L 6 хотя я обладала чувствительностью к вирусу гриппа, но продукция !©Н во всех ^¿муноксмлетоитннх клетках (лимфоцитах селезенки, тдму-са и лимфоузлов) былэ снижена в ответ на ларпфан л Кон А. Поэтому эта линия такяе не подходила дп до лтаеЯжЗ работы.

В клеточных культурах, выделенных о? гибридов FI, уровень синтеза И$Н достигал тех гее значений, чхо п з подобных культурах, выделенных от мышей линии СБА. Т.О., по потеряв ПШ -синтезирующую активность,гиб-' риды первого поколения унеслздорлла от денди.гквотннх C57BL 6 чувстви- • тельность к вирусу гргтпа А. Исхода из этого, данная линия (®шзй балл выбрана намя для скрининга индукторов ИЗН ни вптро при грлппозной инфекции. • , ,

Лейотлгя ппп.гртгшрэтс""'. рп вптпо

Б предыдущих исслс-довачпж: было когзззпе, что клетки тсмунной спет®« организма гивот.чих агетиго продуцируют 1Ш1. Представляло интерес изучить степень уччетпд разята-ах подухщяЯ глоток, з частности лжфо-питов периферической -роя;:, сглзгенгп я даЛсузлов, .в синтезе эндогоп-ного ISH при зкепер;: ¿-экталг-даЗ гр'шлезпе^ гпфекцли у мчсай. Выбор органов был сбуатовлсн том, что ара вирусном заболезатла именно клетки откс тмунокоупотештных органов ясшсахся кжзньп вируса'Зункппональ-ная активность данпых клз?с:: €:ггь определена по способности продуцировать ШП. Кжт-прз.-ззкетаг гс'лэетллсл ох норкалышх животных линии И v зарагошшх рассортготгс-д вируса грзпда Е24 в дозе I ¿£>50,обеспечивающей исшпчэопзз прсгтзтгия гайэлязаЕЯя. На видзленпых клетках был проЕэден ля гктро озриппг О шяухгопез КШ, относящихся к разным классам, - //ЯК', маздея, zipztem, МСП 35/10Э, ш, кагопол, саврап и гозалидоз. Контролем схуапгл тлтру ¡311, синтезированные определенными

- к - .

нммунокомпетентнымл клетками незаракеншх. мышей в ответ на соответствующий индуктор. 1

По нашим данным не все иммуноцати, выделенные от зараженных животных, способны отвечать адекватным синтезом ШН на изучаемые препараты. Так, лимфоциты лимроузлов продуцируют -йБН, как правило, ниже контрольных показателей в ответ на большинство используемых индукторов» И только соединения на основе госсипола - кагоцел, саврац и гоза-лидон индуцирует Ш1 в перше п вторые сутки посла заражения на 100120 Ед/мл выше контрольных уровней.

В лимфоцитах периферической крови .введение индукторов приводит к значительному изменению динамики продукции ИМ1 е клетках, выделенных от зараженных животных по сравнении с синтезом б интактных иммуноцитах. В качестве классического индуктора с(. -КЖ использовали ^ Но поскольку клетки были выделены от инфицированных гриппом животных,синтез ®Н в ответ на этот вирусный индуктор был в основном ниже контрольных значений, которые отмечаются в интактных кшуногштах, индуцированных М5Ж. В ответ на другой индуктор Ш-Н-камедон, лиьфопиты периферической крови продуцируют титры ИЬН выше контрольного уровня на 3-5 сурки. Из препаратов, вызывающих синтез ^ -ЮН, нами был использован £С -индуктор - ларифан, которий з той ке культуре клеток вызывает продукцию титров ШЕ гораздо шив контрольных значений. Оба индуктора ^ -ГОН (ФГА и МЯ1 35/109) индуцируют ШН превытающий показатель контроля на 4-5 сутки. Из природных соединений на основе госсипола индуцирующие смесь - и уь - И>Н, два индуктора - кагоцел и саврап, вызывают синтез №Н выше контроля, как это свойственно хсамедопу, индуцирующему с(-®Н. А один из них - гозалидон, вызывает синтез 53Н пине контрольного титра, как зто было показано для ларифа1!а, индуцирующего ^А -Ш>Н.

Как было показано ранее, продукция Й5Н в лимфоцитах периферической крова штаб,, чем в некоторых других клетках. Наибольшая продукция 1©Н отмечается в спленоцитах, т.к. клетки селезенки представляют собой .идеальную систему для иммунологических ответов, включая продукцию ИЕН, поэтому что в селезенке наиболее оптимальное соотношение клеток: 30л макрофагов (активных) и 70,? лимфопитов, из которых 6СЙ Т-ли.йоци-ты (зрелые) и 40$ В - лимфоциты. Поэтому способности спленопитов синтезировать ШН под воздействием индукторов следует уделять особое бни-

¡no.

!h\uí огмз^лл, "T"¡ ллулл:" :'rIÍ т'модси p.MT!rasöT продуглию Г.:>Н и лглллги'гях злрл'лл^?: г'пллач r::i neчх eul:j лс;:тролышх урог,-ки:*, п л u:\Vi". тт'луричзс.х". киояк, на 5 су;лл посда талп-Il'sp ¿naA^r:'.:" ¿ реьрт.тап.: íi >Лу\Т."Ч яря прямзпеяпп ЮТ/КТОрОВ

'■г; fi -ЯП •>!:)» w:: f -ПН (ПСД 35/lCO и ФГЛ). Учятчяа.*, ■л о л ci'-'íT л!;г/;ллэ болг ллстга прелата-тон (кл.":"^, лзрглзн, £ТЛ ;; ;'СЛ Ib/ïQO) в rtprr.o Ъ е„'?о:; гго::оуж:- СН:Г..С!"'3 ирод/п'.ч 'ЙН л ПЛ; дсс. яг у.!7 i-'.n?Kiv:t>vi4 rur>\--,?Ki! поом-гаст г.х только при вгде инк ::~зг:с:с гллулнел сатлл торт 2--5 ovrr;: посла заражения г^еотянх, кг.глл K3ífs3Kir.íOim*íH пг^лзес у~о nv.ocï хара:;тпр, :/mi:o рзко-

ллгдоллл "Л'кпо лргларгг:; •.•^•'"'■-зня.гь гте гллапо no прэТлл^глчческой 01гсмз.

Одгд: т,.з r.p:m;/лл.11 "r-.i оттого гесеггллл -• кагоцвл, шадуцвруот Г«?Н я с:;.: >.с;-л титрах (СО Di/

r.ï), но елнтоо ::">:• i. -лдллт в яс.ш!.:е 3 сг,тс:<, когда лщяошшй процесс гслъко и: '."îu'-ix- '¿¿«я sc тисопомзеноегь при ярпмепэ-г

ггл рллл r.H:;.,}.iCt ; ;л":л и в Jл.ллл!лх лачЬоузлэв и и:-р::ропц-

чзс::./.: Ллл .-.i еду- п-ь дл* рэкслоаязниц

нр^олjvùt щлг'л!1 :лл;:!Д' но л:--: схс-мо.

лд'лл, ллл. г • ■;.. -лл •:.. с г •л.л.лл длдуктороз 1Ш ¿!/;гл о-хояр '.¡.-i'. л-; Глдлл'л ."дллд, 'д глгоцул), ддзкваю-

4,:о .{■, j - : ::cn;.z\¡::~iZ yy'.íynotcшето.'Л--

ivxr'y.:. л;сл:.л ¡.-■ л; •• .\-.г • ллкт-^л'г'сл -'^ллшс:; о/.?-

ЛО с. Пи;.: л .

fi*v; ллл отр .ост;\";.. г .т-" " Л/'ЛЛ'С "зодг;Н.:;т на го

лг». ил: .M'V'üF.pvV л;л;; у^-.^м г • ¿coop. лл'О : i дою, глл д.л;

других ;;:гду(ггог':4 -тл сх,;;.л :..-ьзст!.,;.

1>-

зо

¿0-

/О-ьо ¿0 к; 30 гоЛ?

Рис. 3. Выгиа£ьл>сть кашей, ин^шшровашшх роассортактом вируса х'ргтиш (10¿О ,-п) прл вваденап

кагопола по лзчсбцой схс.«о '¿/н ¡заг/б* '

/£)0 /У

■ ■■"•?

I .1

1

/

!

7

4*.

/

/

/

Ж.

Как видно пз рлсуш:а 3, Х-ззультатг экм^рлманта податорздак» наша предположение о ¿¿лобном г^-ектв е^гоцогл ир:: гриппозной хлг&екапл. Лучший результат (75« защити) отмочаотся при ъвсдошч; ии-оцела перо-рально в концентрации 100 ьса'Лойз чорсз 4 ч^сз после сарс~снпя. Так не при иримонснпч данного про'Юрта по лечебной схсле (чероз 4,24,43 и 72 часа после заражения) вайлдиалас*. екн-г лщо репродукции вируса в легких на 2-4 ЭЛЛ^д (рас.4).

6

Рис. 4. Репродукция релссостанта Р94 В* + в легких мытэй при введении нагопела по лечебной схема

Обозначения:.

о—о - контроль вируса;

в—з - кагоцел - через 4 ч. после .заражения;

-л - кагоцел - через 24 ч.;

- кагоцел - через 48 ч.

6

Профилактическое использование .кагопэла, наоборот, способствовало усилению размножения вируса в легких в срэднем на 2 ¿д. ЭИД^.

Т.о. кагснед копою рекомгндовать к применению только б качестве лечебного препарата.

Внедеггао других глдук-гор&в (каме.яона, ларифана и МШ 35Д09) по профилактической и .тзчобгоЧ схемам показало, что более эффективно применять из для профилактики гриппа, т.к. при этсм наблюдался достаточно Еирагкеннцй гащитньд эффект (до 35/Î). С цельз? увеличения протектизного действия данных препаратов были поставлены эксперименты по сочетанному использованию индукторов с р-зясмендуамым при гриппе химиопрепаратом -рзмантадином.Лучшие результаты получат» при комплексном применении дс-индуктора ИШ - ларгфана с ремантадином. Ларифан (в/бр, 150 т.цсг/ к;иь) вводили мышам за 24 часа до заражения реассортантом вируса гриппа (I0Z^5q), а ремантадин ( fcr-/û$ , 50 мкг/мыпь) - ч^?ез 4,2^,48 часов и ежедневно (2 дня) после заражения (рис.5).

- 18 - .

Рис. 5. Выживаемость мышей, инфицированных рзассортактом ЕЭ4 при сс^етанном применении ларифана и ремантадина.

Обозначения: '

I. Ларифан - за 24 ч до заражения

П. Ларвфан + ремантадин - через 4 ч посла заражения

¡1!.. Ларл£ан + ремантадин - через 24 ч.

IV.ДарЕфан + ремантадин - через 48 ч.

V. Ларафен ремантадин - ежедневно У I» Ремантадин - чорез 4 ч. УЛ. Ремантадин - через 24 ч. УШ. Ремантадин - чорез 48 ч. XX. Реман.адан - ежедневно.

ж/

I

Как видно из првдставланных данных, разделъноо применение индуктора или ремантадина не вызывало достоверной сациты животных. А совместное их применение способствовало увеличению выживаемости животных до 60$ при введении ларпфана по профилактической схеме,а ремантадина - через 24 или 48 часов посла

Т.о. нами впервцо был предложен новый тест во отбору индукторов для лечения или профилактики 'гриппозной пцфэявдщ. Те аддуктора, которые способны вызывать продукция ШН ь- клэтках кммунноЛ системы в первые днч (до 3 суток) посла заражена.- жгшстннх, могут быть использованы для терапии гриппа, т,к. б а ¿-см случае синтезируемый И1Н способен защитить мышей от гриппозной инфекции. Препараты, индуцирующие Ш1 превышающий контрольный уровень в культурах, выделенных через 3-5 суток- гюслэ йараж'бшй» могут применяться только по .профилактической ехзыв; а вызывающие сййтез ЖН еще позже - на 7-9 сутки, не рекомендуются к применению» т.к. при этом ®Н не оказывает влияния на течение гриппозной инфекции.

- 19 -

1 В Н В ОДЫ

I» Вдавлено, что" клетки, выделенные из различных иглмуно компетентных органов интактных мышей синтезирует разные уровни 1Ш1. Наибольшей интерфоронпродупирущей способностью в ответ на все индукторы обладают спленопяты, наименьшей - лшфопитн периферической крови. Клетки костного мозга синтезируй'? наиболее высокие уровни ИЗН при стиг,гулянии индукторами Л. -И5Н (камедоя, ридостин). Тимопятн активно синтезируют ИФН в ответ на дс-РНК я шщухторы /'--1&Н.

2. Впервые установлено, что уровень УШ, синтезированного лкмуно-компетентными ¡слетками, ндаленш1'.'.я от индуцированных шесй, зависит от способа введения индуктора. Высокие уровни №>Н больпипство популяций иммунопитов синтезируй? при пороральном введений МШ 35/109 л вяу-трцбрюшинном - ларифана. Поэтому эти способы введения веществ являются предпочтитмькымя» Ридостин моено вводить как Енутрлыгазчно, так и йсштшо, а камедоя - весмл способами, кроме перорального.

о» Оплачено, что в ответ на соединения на основе госсглола (яаго-пел, саврэц к гозалидоц) И5Н синтезируют практически все исследованные • популяодл иммуноцлтов, Выделенных от интакткых мышей. Установлено,что соединения этого класса мозно вводить мышам практически ллбкм способом.

4. Показано, что макрофаги, обладая низкой лнтерференшщунпрующей активности, способны передавать информации о синтеза И£К Т-лимфоцитам.

5. Проведен скрининг препаратов на чувствительной к гриппу линии мышей я разработаны оптимальные схемы применения индукторов ШН ври гриппе. УстануятеНО, что камэдон, ларкфан, 1'СЯ 35/109 и ФГА индуцируют ШН Ниже контрольных значены! (уровень 1ЙН з клетках незаряженных животных в ответ на текз аддукторы). Показано, что эти индукторы способ-ш зашатать мышей от грплпозной инфекции нрп введении только по профилактической бхемо. Наиболее яктленпмл препаратом при этой схеме введе-ит являотоя индуктор ¿1 -ИЕН камедоя.

6. ВаорЕШ выявлено, что кагсцел способен индуцировать ГОН, преЕы-пзеттй контрольные значения, в йммуксиитах, »¿деленных в первые 3 дня ПОбЛв заражения животных, л мозет быть применен для терапия гриппа по лечебной схема» Установлена максимальная зашита зиготных от вируса грип-

- 2Cf -

па (75/o) при Еведений мншам кагоцела (100 мкг/мышь) пероралыю через' 4 часа поело заражений/

7. В результате исследований показана эффективность сочетанного применения дс-индуктора ларифана с ремантадином. Введение индуктора за сутки до заражения Мшей гриппом с последующим применением ремантадина через I и 2 суток после заражения способствует усилению защитного действия препаратов при гриппозной инфекции.

Описок габот, опубликованных по теме диссертации

1. Мезенцева М.В., Тазулахова Э.Б. Роль клеточных систем в синтезе интерферонов й ответ на индукцию препаратами разных классов// Тезисы на X региональный симпозиум социалистических стран по интерферону, 5-10 сент.1983 г,, г.Юрмала, М.-Р. - 1988 г.,

2. Интерфероновае реакции различных популяций ли.йонитов инбредных линий мышей с разной степенью чувствительности к вирусу западного энцефалита лошадей */Тазулахова Э„Б., НестерчуК С.Л., Мезенцева М.В., Ершов Ф.И., БаринокиЗ И*Ф,//Bttrtpöcu вирусологии, Я 1, 1989, стр.72-76.

3. Роль макрофагов S йродушии интерфероном ./Тазулахова Б. .Мезенцева М.В., Ершов ФЛ'и// Лнтйдяотикй, т<35, & "II, 1990, стр.40-43.

4. Изучеьие чувствительности ряда клеточных культур к различным типам вирусов гриппа и реассортайТам./Данлыбабва Г^.^Подчерняева Р.Я., Саятов М.Х., Мезенцева М.В.// Вопросы вирусологии, & I, 1991, стр.1013.

5. Роль иммунопитов в продукции интерйорэков./Тазулахова Э.Б., Паршина О.В., Мезенцева М.Б., Гусева Т.С»// Й1Торферои-92 (Сборник научных трудов), М.92, стр.74-79.