Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биоинформационное обоснование оценки отдаленных последствий γ-облучения лимфоидного компонента слизистой оболочки тощей кишки

ВАК РФ 03.01.09, Математическая биология, биоинформатика

Автореферат диссертации по теме "Биоинформационное обоснование оценки отдаленных последствий γ-облучения лимфоидного компонента слизистой оболочки тощей кишки"

На правах рукописи

Шишкина Виктория Викторовна

БИОИНФОРМАЦИОННОЕ ОБОСНОВАНИЕ ОЦЕНКИ ОТДАЛЕННЫХ ПОСЛЕДСТВИЙ у-ОБЛУЧЕНИЯ ЛИМФОИДНОГО КОМПОНЕНТА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ТОЩЕЙ КИШКИ

03.01.09 — математическая биология, биоинформатика (биологические и медицинские науки)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

5 ДЕК 2013

Сургут -2013

005542595

005542595

Работа выполнена на кафедре гистологии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия им.Н.Н. Бурденко» Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор ВОРОНЦОВА ЗОЯ АФАНАСЬЕВНА ГБОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия им.Н.Н. Бурденко», заведующая кафедрой гистологии, г. Воронеж

доктор медицинских наук, профессор, СУББОТИНА ТАТЬЯНА ИГОРЕВНА МИ ГБОУ ВПО «Тульский государственный университет», заведующая кафедрой медико-биологических дисциплин,г. Тула

кандидат медицинских наук, НИКИТИНА ЮЛИЯ ВИКТОРОВНА МБУЗ «Клиническая городская больница №1», заведующая клинико-диагностической лабораторией, врач клинической лабораторной диагностики, г. Сургут

Ведущая организация: государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет им.Н.Н. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «28 » декабря 2013г. вЛ^Часов на заседании диссертационного совета Д. 800.005.05 в ГБОУ ВПО «Сургутский государственный университет Ханты-Мансийского автономного округа - Югры» по адресу: 628400, г. Сургут, пр. Ленина, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Сургутский государственный университет Ханты-Мансийского автономного округа-Югры» по адресу: 628400, г. Сургут, пр. Ленина, д. 1.

ЯО/'З*.

Автореферат разослан^//» / . ^

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент Л

С.Н. Русак

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Проблема изучения воздействия факторов радиационной природы на организм остается актуальной до настоящего времени, несмотря на многолетние исследования. Специфическая профессиональная деятельность с применением радиоактивных материалов и обусловленная экстремальными радиационными ситуациями требует эффективного экспериментального подхода с этиогенным анализом связи выявленных нарушений. В отношении патологического действия факторов ионизирующей радиации на биологические объекты в диапазоне малых доз нет единства взглядов, поэтому возникает необходимость использования интегративного подхода в исследованиях (A.B. Аклеев, 2010; Ю.А. Эйдельман, 2010, Е.Б. Бурлакова, 2010; А.И. Га-зиев, 2010; JI.A. Ильин, 2010; O.A. Тихонова, 2010). Эффект лучевого воздействия на организм зависит от поглощенной дозы, ее фракционирования во времени, от пространственного распространения энергии. При этом происходит повреждение или разрушение клеточных, тканевых структур на организменном уровне. Однако, эти закономерности не всегда аргументированы, что усложняет интерпретацию радиобиологических эффектов в сравнительном аспекте, при этом, с достоверностью доказано, что структурные и ультраструктурные особенности изменений соответствуют характеру и степени определенных функциональных и биохимических процессов. В облученном организме выявляется комплекс динамически изменяющихся во времени показателей в зависимости от мощности дозы и пострадиационного периода наблюдения (Л.В.Жорина, Г.Н. Змиевской, 2006; З.А. Воронцова, 2009; Ю.Б. Черкасова, 2009; С.Н. Золотарева, 2009; К.Я. Буланова, 2010; Ю.Б. Кудряшов, 2010, O.A. Слюсарева, 2011).

Весьма актуальным в настоящее время представляется направление по изучению компонентов иммунной системы, участвующих на всех этапах развития организма до старости в защитных реакциях на воздействие факторов различной природы, в том числе радиационной, обеспечивающих структурную и функциональную целостность организма. Одним из крупных периферических отделов иммунной системы является кишечно-ассоциированная лимфоидная ткань (А.Ю. Юлдашев, 2008, Т.С. Гусейнов, С.Т. Гусейнова, 2012, A.M. Зем-сков, 2013). Иммунные структуры, ассоциированные со слизистой оболочкой, иммунологически активная ткань тонкой кишки, расценивается как барьерная, способная оказать иммунную защиту в случае антигенного воздействия. Иммунные реакции могут индуцировать процессы восстановления, защиты и радиорезистентности. Именно лимфоциты получили статус главных клеток, обеспечивающих иммунный процесс и специфичность иммунных реакций (А.Г. Бабаева, 2009 (а,б); Г. Бурместер, 2009; И.В. Меньшиков, JI.B. Бедулева, 2010; Ю.А. Эйдельман, 2010; Al-Jundi J.,2009; Groschwitz K.R. et al, 2009). Есть наглядные доказательства состоятельности в запуске пролиферации, сопровождающей любые морфогенетические процессы и определяющие характер диф-ференцировки клеток. Однако, после открытия морфогенетической функции

лимфоцитов прошло уже 50 лет, но она еще не получила достаточной известности и заслуживает интереса (А.Г. Бабаева, 2009 (а, б)). Лимфоидные клетки являются оперативной подсистемой, обеспечивающей возможности изменчивости ткани и адаптации к условиям окружающей среды (В.А. Гедокян, 19/4, A.l. Бабаева 2009, А.М. Земсков, 2013). Неспецифические закономерности реакции иммунного аппарата при длительных пострадиационных нарушениях вместе с математической обработкой позволят выявить дефекты, которые могут быть условной основой для клинической интерпретации иммунопатогенеза, установления диагноза и прогноза. Динамичность модифицирующих эффектов отдаленных последствий воздействия ионизирующей радиации диапазона малых доз Y-облучения не представлена в современной литературе на уровне иммунного статуса тощей кишки. В связи с этим позиция совершенствования и фундаментальности исследований в этой области, имеет наибольший потенциал с точки зрения формирования неспецифической резистентности, снижения неопределенностей оценок риска, является научно обоснованной в условиях отдаленных последствий у-облучения малыми дозами для выявления защитных механизмов барьерными образованиями слизистой оболочки тощей кишки как наиболее функционального отдела тонкой. А процессы восстановления и закономерности их проявления являются исключительно важными на уровне иммунных реакций и будут способствовать развитию новых подходов в клеточной терапии (В.И. Сергиенко, 2006; А. Ю. Цыбулевский, 2007; А.Г. Бабаева, 2009; О А Слюсарева, 2011). Адекватный дизайн исследования и статистическии анализ является'предметом высокой важности и научности для надежности и адекватности выводов (А.Н. Герасимов, 2007; C.B. Криштопенко, 2008; A.A. Халафян, 2008; Т.А. Ланг, М. Сесик, 2011).

Цель исследования. Оценить иммунный статус слизистой оболочки тощей кишки в хронодинамике отдаленных последствий у-облучения в широком диапазоне параметров малых доз с использованием иммуногистохимических, мор-фоэнзиматических критериев на основе компьютерной гистофотометрии и анализа с применением статистических методов и математической интерпретации биосостояний.

Задачи исследования.

1 Получить информацию на основе компьютерной гистофотометрии морфологических критериев, определяющих динамику их изменений в условиях эксперимента и провести статистический анализ для подготовки данных к этапу интерпретации о состоянии компонентов, определяющих иммунный статус

слизистой оболочки тощей кишки.

2 Определить скоррелированность морфоэнзиматических эквивалентов функции структурных образований слизистой оболочки тощей кишки с адап-тометрическим анализом для выявления возможной гомеостатическои ситуации в хронодинамике отдаленных сроков после однократного и фракционированного у-облучения с широким диапазоном параметров.

3. Определить атрибутивный риск по миграционной активности лимфоцитов в эпителий слизистой оболочки тощей кишки в хронодинамике отдаленных последствий однократного и фракционированного у-облучения с широким диапазоном параметров, информирующих о неблагополучии гомеостаза.

4. Выявить кинетику проявлений функциональной активности лимфоцитов на основе их взаимозависимости с эпителиоцитами крипт в синтетическом периоде и митотическими эпителиоцитами, отражающими возможности регуляции процессов восстановления в хронодинамике отдаленных последствий у-облучения с широким диапазоном параметров.

5. Получить информацию по доверительным интервалам для оценки статистической значимости различий и зависимости величины «доза-эффект» с про-бит-анализом после однократного и фракционированного у-облучения в хронодинамике эксперимента.

Связь с основными планами научных исследований.

Работа выполнена в рамках федеральной программы «Изучение влияния малых радиационных воздействий на системы организма» (Гос. per. №01201178056), согласно плану научных исследований по тематике кафедры гистологии и договору с ГНИИИ Военной медицины МО РФ.

Научная новизна работы.

1. Впервые на основе гистофотометрии по светооптической плотности распределения иммуногистохимических и морфоэнзиматических маркеров барьерных образований слизистой оболочки тощей кишки выявлена степень риска поражения его структур в условиях отдаленных последствий у-облучения в малых дозах с широким диапазоном параметров.

2. Впервые в условиях отдаленных последствий у-облучения с широким диапазоном параметров малых доз и мощностей представлена морфогенетиче-ская активность лимфоцитов на основе их корреляционных взаимосвязей с недифференцированными эпителиоцитами камбиальной зоны.

3. Впервые определена эффективная доза по индексу миграции лимфоцитов для однократной экспозиции у-облучения и фракционированной в диапазоне параметров доз и мощностей, определяющая радиочувствительность - «доза-эффект».

4. Обнаружен эффект плазмоцитарной инфильтрации и появление М-клеток в эпителии участков слизистой оболочки, где были сформированы лимфоидные узелки с избирательностью от дозы и кратности ее применения, определяющих характер иммунных реакций.

Научно-практическая значимость.

1. Результаты данного исследования расширили представление о нарушении структурного гомеостаза по состоянию барьерных образований слизистой оболочки тощей кишки при воздействии малых доз в отдаленные периоды после у-облучения, определяющих иммунный статус.

2. Изучение морфогенетической активности лимфоцитов позволит определить поиск эффективных средств и подходов на обеспечение иммунного ответа

без химических препаратов и регулировать процессы аварийного варианта гистогенеза поврежденного органа, изменяя модус пролиферации.

Внедрение результатов исследования.

Результаты диссертационной работы были реализованы в «Методических рекомендациях по оценке экологической обстановки при эксплуатации источников ионизирующего излучения в авиации Минобороны России». Разработанный метод анализа морфологических исследований слизистой оболочки тощей кишки внедрен в практику гистологического исследования морфологическими кафедрами ГБОУ ВПО «ВГМА им. H.H. Бурденко» Минздрава РФ. Полученные в исследовании данные о влиянии однократного и фракционированного у-облучения внедрены и используются в курсе лекций студентам лечебного, педиатрического, стоматологического и медико-профилактического факультетов ГБОУ ВПО «ВГМА им. H.H. Бурденко» Минздрава РФ как опасный фактор, проявляющийся в отдаленные пострадиационные сроки.

Апробация результатов исследования.

Материалы диссертации доложены на IV World asthma&COPD forum, (Pans, 2011); Всероссийской конференции молодых ученых «Комплексный подход к диагностике, лечению и профилактике в медицине» (Воронеж, 2011); XX Юбилейной международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, 2012); Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Морфология человека в норме и при патологии» (Уфа, 2012); I Международной конференции «Морфоклинические аспекты безопасности жизнедеятельности» (Воронеж 2012); Юбилейной международной научно-практической конференции «Белые ночи - 2013» (Санкт-Петербург, 2013); Межкафедральной научной конференции ГБОУ ВПО «ВГМА им. H.H. Бурденко» Минздрава России (Воронеж, 2013г); VI Всероссийской конференции молодых ученых «Комплексный подход к диагностике, лечению и профилактике в медицине» (Воронеж, 2013).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для соискания ученой степени кандидата медицинских наук.

Объем и структура диссертационной работы.

Диссертация изложена на 181 странице машинописного текста. Она выполнена в традиционном стиле и состоит из введения, главы по анализу современного состояния проблемы, главы описания объектов и методов исследования, главы, содержащей результаты собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 250 источников, в том числе 212 отечественных и 38 зарубежных. Работа содержит 70 таблиц, 20 фотографий, 65 рисунков. Все материалы, представленные в диссертации, обработаны и проанализированы лично автором.

Личное участие автора заключается в подготовке аутопсийного гистологического материала для исследования в алгоритме эксперимента: проводка, изготовление блоков, изготовление парафиновых срезов, окраска, компьютерная гистофотометрия исследуемых критериев, статистическая обработка.

Автором самостоятельно осуществлена статистическая обработка материалов, их интерпретация и анализ данных. Весь первичный материал для диссертационного исследования собран непосредственно автором. В диссертационной работе использованы результаты исследований, выполненных и опубликованных научных работ в соавторстве. Доля личного участия автора 85%.

Положения, выносимые на защиту.

1. Биоинформационный подход на основе компьютерной гистофотометрии иммуногистохимического анализа по ядерному антигену позволяет определить изменение динамики S-периода клеточного цикла и митотического индекса камбиальных эпителиоцитов крипт в хронодинамике отдаленных последствий у-облучения в малых дозах с широким диапазоном параметров как обоснование, подтверждающее проявление лимфоцитами функциональной активности.

2. Адаптометрический анализ по скоррелированности исследуемых критериев позволяет выявить возможное адаптивное состояние для сравнительной характеристики биоэффектов у-облучения в зависимости от кратности используемых доз.

3. Коэффициент поражаемости в условиях отдаленных последствий у-облучения в малых дозах с широким диапазоном параметров определяет риск возникновения неблагоприятной ситуации в зависимости от кратности поглощенной дозы.

4. Множественные сравнения по доверительным интервалам позволяют выявить информацию о статистической значимости исследуемых иммуногисто-химических и морфоэнзиматических критериев.

5. Использование пробит-анализа по диагностической значимости признака позволяет определить функциональную зависимость «доза-эффект», модифицированный в хронодинамике отдаленных последствий у-облучения в широком диапазоне параметров.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная модель представлена белыми половозрелыми беспородными крысами-самцами с начальным возрастом 4 месяца в количестве 477. Экспериментальные крысы испытывали общее равномерное однократное и фракционированное (пятикратное) у-облучение со спектром 1,2 МЭв на установке «Хизотрон» (60Со). При фракционированном облучении суммарная доза была распределена в течение пяти суток. Мощности доз у-облучения составили 50; 100; 250 и ббОсГр/ч. Экспозиционные дозы у-облучения составили 10; 20; 50 и ЮОсГр с пострадиационным периодом наблюдения 180; 365; 545 и 730 суток. В соответствии с планом эксперимента было сформировано 48 групп, в том числе возрастной контроль (рис 1).

Контроль

Возраст крыс (мес)

[ 4 ! 10 i 1« ! И 23 |

1-i Г I 1

Количество крыс в группа;-: ,------—¡--г-1

Г 9 : 9 i 9 | 9 9

Е-,т.,

■/-облучение

Фракционированное

х

ш

Мощность дозы 50 сГр/ч

i

Дозы (сГр)

I ю ! 20 | 50 | 100 |

1 Пострадиационный период (сут)

| 130 365 545 | 730

г" Возраст крыс (мес)

i I то I 16 ! =2 i . I 1

г" _1-- Количество крыс в группа:: --^-1- -1

1 36, ¡ 36 | 36 » 1

1 1 в«то :ss J1

[ '-облучение -—-т--■

Однократное

До-за 50 сГр

Мощность дозы (сГр/ч)

ш

Групп 4S

В<етокры< 4"

50 100 250 1 660

Пострадиационный период (сут) 1 1—,-1 -1-Г-^

■ 180 365 545 730 -1--

Еоэрасткрыс (ыес) 1—i-—1-■-г-i

I 16 22 23

-1- 1 1 1

| Количество крыс в группа» -,-1- -г-1

I * ! 36 1 1

Рис. 1. Алгоритм модели эксперимента.

При оценке радиационного эффекта отдаленных последствий была рассчитана поглощенная доза, эквивалентная экспозиционной, измеряемая в зивертах (Зв), при низких дозах облучения в отдаленные сроки. С 1 января 2000 г. введены в действие нормы радиационной безопасности НРБ-99 (Л.В.Жорина, Г.Н. Змиевской, 2006).

Эвтаназию животных осуществляли декапитацией в одно и то же время суток, натощак. Протокол эксперимента в разделах выбора, содержания животных и выведения из опыта был составлен в соответствии с принципами биоэтики и правилами лабораторной практики, которые представлены в «Руководстве по содержанию и использованию лабораторных животных» (1996) и приказе МЗ РФ № 266 от 19.06.2003г «Правила клинической практики в Российской Федерации», а также с соблюдением правил гуманного обращения с животными (Report of the AVMA Panel on Euthanasia JAVMA, 2001).

Объект для исследования представлен проксимальным отделом тощей кишки, размерами 1,3-1,5 см для проведения иммуногистохимических, общегистологических и специальных методов выявления структур. Фрагменты тощей кишки фиксировали в растворе Беккера и 10% нейтральном формалине. После соответствующей проводки заливали в парафин. Для аргументирования результатов и правомерности выводов использовали взаимодополняющие методы с применением специальных окрасок, иммуногистохимических и гистохимических реакций в сочетании с морфометрией. Было проведено исследование иммунного компонента слизистой оболочки на молекулярном, клеточном и органном уровне по состоянию эпителиального пласта и соединительно-тканной стромы субэпителиального слоя. Проникшие в эпителиальный пласт лимфоциты способны вступать в контакт с эпителиоцитами, опосредованно поддерживая функциональность пласта и регуляцию процессов обновления (Бабаева А.Г., 2009). На основе иммуногистохимического метода были выявлены клетки при подготовке к делению в S-периоде по ядерному антигену пролиферирую-щих клеток (PSNA, clone PC 10), которые выполнялись на парафиновых срезах толщиной 4 мкм с использованием иммуноэнзимного полимерного метода детекции Histofine® Simple Stain МАХ PO (MULTI) (NICHIREI BIOSCIENCES INC., Япония). После детекции иммунных комплексов срезы окрашивали гематоксилином. Индекс пролиферативной активности проводили с использованием системы анализа изображений Q550W (Германия) и программы «ImageJ». Полученные данные обрабатывали статистически с использованием программы Statistica 8.0. Данные представлены в виде среднего значения (М) и стандартной ошибки средней (ш). Значимость различий оценивали по критерию Стьюдента, считая статистически достоверным значение р<0,05.

При окраске гематоксилином подсчитывали по митотическим фазам клетки камбиальной зоны в расчете на ворсинку. Определенную роль в пенетрации лимфоцитов представляет состояние барьерных структур слизистой, индуци-

рующих ответную, защитную реакцию иммунного звена и перестройки адаптивного и компенсаторно-приспособительного аппарата как эпителия, так и собственного слоя на субклеточном, клеточном, а также, тканевом уровне. Функциональные расстройства тощей кишки проявляются снижением активности ферментов и особый интерес представляет трансмембранный определяемый фермент щелочная фосфатаза, кишка наиболее богата этим ферментом. Динамика его активности тесно связана со скоростью миграции, дегенерации и деструкции кишечного эпителия. (Л.М. Яковлева, 2012). Сиаломуцины - морфологический субстрат секрета бокаловидных клеток, покрывающий слизистую оболочку, реализующий защиту, анализировали по показателям светооптиче-ской плотности их распределения на апикальной поверхности пласта с использованием программы «Image J». Учитывали соотношение дегранулированных и вакуолизированных тучных клеток, определяющих процессы местного гомео-стаза. При визуальной оценке рассматривали лимфоцитарно-плазмоцитарныи инфильтрат эпителия и субэпителиального слоя при окраске толуидиновым синим и по Романовскому-Гимза.

Для информационной интерпретации полученных результатов морфомет-рии проведен морфолого-статистический анализ на ПЭВМ Pentium IV, с помощью пакетов программ: Statistica 8.0, SSPS 13, StatGraphics Centurion с использованием параметрических и непараметрических критериев. Для выявления целостности ответа, исследуемых морфологических критериев, определяющих иммунный статус тощей кишки в условиях эксперимента использован корреляционный анализ. Метод корреляционной адаптометрии послужил показателем для выявления благоприятного исхода приближением значений к норме в динамике пролонгированности сроков наблюдения после у-облучения, определяя состояние гомеостаза как реабилитационный эффект. С использованием регрессионного и дисперсионного анализа выявлена вариабельность реагирования исследуемых критериев в условиях эксперимента и степень их чувствительности. Для определения величины статистически значимого эффекта у-облучения в диапазоне правдоподобных значений и информационной интерпретации проведен сравнительный анализ показателей между группами по доверительным интервалам с проведением соответствующих границ. Эффективная доза у-облучения выявлена с использованием метода математической статистики «пробит-анализ».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

В результате проведенных исследований иммуногистохимических и морфо-энзиматических критериев тощей кишки крыс контрольных групп соответственно хронодинамике отдаленных сроков наблюдения были обнаружены различия, которые представлены в табл. 1.

Таблица 1

Количественные морфометрические показатели исследуемых критериев контрольных крыс (М±ш).

Время, Критерии 180 365 545 730

ИЛ 2675±1,1 2721±1,1* 2332±0,57* 3336±1,1*

вв 840,16±22,31 962,3±31,6* 784,3±15,89* 1117±21,7*

св 1042,5±20,34 117б,5±29,4* 1030,6± 37,3* 1394±23,45*

HB 540,6±12,14 582,5±27,6* 517,3± 15,8* 825,8±12,9*

СПС 316±0,02 316±0,1 312±0,01 310±0,03*

ЩФ 670,4± 1,3* 669,3±3,2 665,1±1,1 660,2±1,1*

дтк 0,5±0,001 0,4±0,03 0,3±0,001 0,2±0,01*

ВТК 1,2±0,05 1,1 ±0,02* 1,0±0,03* 0,9±0,02*

ми 26±0,1 25±0,1 24±0,01* 20±0,01*

им 24,2±1,7 27,2±0,7* 23,3±0,4* 33,4±0,86*

пм 2,05±0,46 2,4±0,5* 3±0,6* 1,45±0,37*

мм 0,95±0,22 1,05±0,23* 1,35±0,25* 1,5±0,32*

AM 0,25±0,09 0,6±0,15* 0,6±0,45* 0,7±0,19*

TM 1 ±0,217 2,15±0,41* 2,6±0,45* 3,7±0,69*

PCNA 16±0,72 16,1±0,2 15,5±0,05* 14,2±0,26*

Примечание: * - р<0,05 по отношению к контролю

Возрастные изменения контрольных показателей констатировали зависимость от возраста с достоверными значениями по всем критериям к последующему сроку. Причем, исследуемые критерии разнонаправлено испытывали влияние временного параметра.

Мигрировавшие в эпителиальный пласт лимфоциты были обнаружены на всем его протяжении от донных отделов крипт до верхушки ворсинок, однако на верхушке их численность превышала содержание мигрантов в криптах, где они были единичны и изменения с возрастом не имели прямой зависимости (табл.1).

Интраэпителиальные лимфоциты мигрировавшие в эпителиальный пласт по топографическим признакам распределялись неоднородно и в средней трети ворсин их значения были выше (табл.1). ИЛ занимали преимущественно ба-зальное положение.

Экспериментальные условия в хронодинамике отдаленных наблюдений после однократного у-облучения в широком диапазоне параметров малых доз модифицировали динамику изменений миграционной активности лимфоцитов.

Для визуализации результатов исследований были построены диаграммы, иллюстрировавшие базовые показатели описательной статистики, демонстрирующие медиану, верхний и нижний квартили и размах показателей.

1000 950 900 S 850 1 800 750 700 650

D Среднее □ Среднее±Ош.ср. I Среднее^ 1,96*0ш.ср.

Рис.2. Диаграмма динамики изменений интраэпителиальных лимфоцитов на верхушке ворсин после однократного и фракционированного у-облучения спустя 180 суток в диапазоне возрастающих доз.

Диаграмма демонстрирует модифицирующий эффект у-облучения в диапазоне возрастающих доз спустя 180 суток в сравнительном аспекте после однократного и фракционированного ее применения. Рисунок демонстрирует возрастание числа интраэпителиальных лимфоцитов при дозе 0,1 Зв и достоверным относительно контроля. С возрастанием дозы инфильтрация интраэпите-лиальными лимфоцитами снижается в обратной зависимости после однократного у-облучения. При фракционировании дозы инфильтрация достоверно возрастает относительно контроля, также при дозе 0,2 Зв, остальные дозы снижали эффект. Диаграмма демонстрирует, что межквартильный размах и амплитуда у показателей ассиметричны, что свидетельствует об отличии этих выборок от нормальных и о том, что для их сравнения использованы непараметрические критерии независимо от кратности применения.

Сравнительный анализ показал, что независимо от кратности применения дозы 0,2 Зв лимфоциты достоверно повышали миграционную активность. Модифицирующий эффект остальных доз констатировал снижение миграционной активности лимфоцитов, а при фракции - с достоверной динамикой.

□ .2 Зв 180 суток однократно

0,2 Зв 180 суток фракция

ЕБ> 1150 Ш< 1150 ■И "»О ¡050 □ <1000 О <050 □ <800 □ <850

Рис. 3. Количественная характеристика динамики изменений интраэпителиальных лимфоцитов ворсин по топографии при дозе 0,2 Зв спустя 180 сут А - после однократного; Б - после фракционированного у-облучения.

Из трехмерной диаграммы видно, что миграционная активность лимфоцитов была максимальной на верхушке ворсин и в ее нижней трети максимальной после однократного у-облучения. После фракционированного у-облучения максимальные показатели были в нижней трети и верхушке ворсин.

Для оценки возникновения неблагоприятных последствий поражения в ответ на действие излучения был рассчитан коэффициент атрибутивного риска, который предполагает развитие поражения исследуемого органа (В.В. Двойрин, 1975, Юи Цао, 2006, В.К. Иванов, 2006). Если АР больше 60% наблюдается максимальная степень развития риска. При АР, от 30 до 60% — средняя степень, АР меньше 30% - минимальный риск.

Анализ коэффициента атрибутивного риска по показателям интраэпителиальных лимфоцитов показал, что наиболее существенное его повышение наблюдалось после однократного у-облучения спустя 180 суток при дозах 0,2 и 1 Зв в области нижней и средней трети ворсинок.

1 if / / J ■ х I f i * | {fl 1"

0.1 Чв 0.2 1 iB 0.5 1 ,в 1 1 * з 0.1 Зв 0.2 1 'iD 0.5 1 '}B | 1 Чв | O.l Чв 0.2 1 iB 0.5 1 iB в | 1 Чв

с^Конт^оль czr30ra.tr -•—■АР® о

Рис. 4. Атрибутивный риск спустя 180 суток после однократного у- облучения

При фракционированном применении доз спустя 180 суток коэффициент поражения с максимальными показателями отмечался также при дозах 0,2 и 1 Зв в нижней трети и верхушке ворсин. В строме ворсин наблюдался лимфоци-тарно-плазмоцитарный и плотно упакованный инфильтрат, обеспечивающий усиление антителогенеза.

■ь

0.1 Чв|о.2 'iujo.f Чо| l'in \ | |o.l'icjo.2 Мв|о.5Чв| I':

/

Ж

1 Чв|о.2 Чв|о.6 Чв| l'-.

I-ИчОНТрО.ТЬ I-М.'ПЫТ ЛГ- О

Рис.5. Атрибутивный риск спустя 180 суток после фракционированного у- облучения

Учитывая ключевую роль лимфоцитов в реализации иммунной рефляции структурной и функциональной целостности организма была исследована их роль в восстановительных процессах, обеспечивающих не только качественный, но и численный характер по сравнительной количественной оценке мито-тической активности, и также камбиальных клеток в синтетическом периоде.

« нч

i Л*

lS0 3«5:545,-30

:JLS0;365,545~30 0.1 Чв

ISO 565 545-30 0.2 Чв

lS0 3<S5545-30 ХЧв

Рис. 6. Хронодинамика индекса миграции лимфоцитов, митотического индекса и клеток в синтетическом периоде в диапазоне экспериментальных доз после однократного у-облучения.

Хронодинамика пострадиационного периода модифицировала дозовый диапазон воздействия снижением МИ при дозе 0,1 Зв во все временные параметры (р<0,05); возрастание доз определяло гетерогенность изменений: снижением при 0,2 Зв спустя 180 и 730 и повышением спустя 365 и 545 сут (р<0,05), при дозе 0,5 Зв - снижением через 180 и 545 сут и повышением спустя 365 и 730 сут (р<0,05); при дозе 1 Зв - снижением спустя 180, 365 и 545 (р<0,05) и повышением через 730 сут (р<0,05).

ИМ возрастал при дозе 0,1 Зв через 365 и 545 сут, а спустя 730 сут снижался (р<0,05). При дозе 0,2 Зв ИМ достоверно снижался спустя 730 сут; доза 0,5 Зв снижала ИМ спустя 730 и повышала в остальные сроки; при дозе 1 Зв ИМ повышался спустя 545 сут и снижался спустя 730 сут (р<0,05). Миграционная активность лимфоцитов крипт испытывала динамику митотической активности, но количественные показатели достоверно изменялись при дозе 0,1 и 0,2 Зв спустя 365 сут и при дозах 0,5 и 1 Зв спустя 545 и 730 сут.

Динамика эпителиоцитов крипт в состоянии предшествующему митотиче-скому циклу, в 8-периоде проявлялась гетерогенностью в дозовом и временном диапазоне эксперимента с эквивалентной направленностью относительно индекса миграции лимфоцитов.

Данные корреляционного анализа исследуемых критериев показали, что по сравнению с контролем отмечалось усиление существующих связей и формирование новых, подтверждающих и констатирующих взаимозависимость критериев на новом уровне.

Спустя 180 сут независимо от кратности доз у-облучения преобладали средние обратные связи. Кратность применения дозы отличалась повышением числа сильных прямых связей по сравнению с однократным. Остальные связи от-

ИЛ - интраэпителиальные лимфоциты ИМ - индекс миграции ВВ - верхняя треть ворсинки СВ - средняя треть ворсинки НВ - нижняя треть ворсинки ЩФ - щелочная фосфатаза ТКВ - тучные клетки вакуолизированные ТКД - тучные клетки дегранулированные ПМ - профаза митоза ММ - метафаза митоза АМ - анафаза митоза ТМ - телофаза митоза МИ - митотический индекс СПС - светооптическая плотность сиаломуци-нов

личались вариабельностью.

Б В

Рис. 7. Скоррелированность морфоэнзиматических критериев слизистой оболочки тощей кишки спустя 180 суток А - контроль; Б -однократное у- облучение в дозе 0,2 Зв; В - фракционированное у- облучение в дозе 0,2 Зв.

Полученные результаты по корреляционному адаптометрическому анализу показали, что адаптивное состояние возникало между индексом миграции и митотическим индексом спустя 180 и 365 сут при дозе 0,2 Зв и приближалось к показателям контроля спустя 730 сут в дозе 0,5 Зв после однократного у-облучения.

Адаптивное состояние после фракционированного у-облучения возникало между индексом миграции и митотическим индексом спустя 365 сут при дозе 0,1 Зв.

— контроль--0,13b 0,2iu 0,53в -13в ......король--0.13b 0.2iB O.S'ie -liB

А индекс миграции - митотический индекс Б индекс миграции — митотический индекс

Рис.8. Корреляционная адаптометрическая модель по ИМ - МИ показателям после А - однократного; Б - фракционированного у-облучения

Резюмируя полученные данные в хронодинамике эксперимента после однократного у-облучения можно отметить, что адаптивные состояния возникали между ИМ — МИ при дозе 0,2 Зв спустя 180 сут и 365 сут. Между ИЛ - СПС спустя 180 сут, между ИЛ - ЩФ при дозе ОД Зв и 0,5 Зв, спустя 180 и 730 сут, между ТКВ — ИЛ при дозе 0,1 Зв спустя 545 сут.

Анализ полученных данных после фракционированного у-облучения показал, что адаптивное состояние возникало между ТКВ - ИЛ, ИМ - МИ при дозах 1 и ОД Зв соответственно, спустя 365 сут. Между ИЛ - СПС, ИЛ - ЩФ при дозах 0,5; 1 и ОД Зв соответственно, спустя 545 сут. Спустя 730 сут адаптивный эффект возникал между ИЛ - ЩФ при дозе 0,2 Зв.

Таким образом, возникшее состояние гомеостаза между представленными критериями не приводило к благоприятному исходу в динамике отдаленности сроков наблюдения, на фоне десинхронизации исследуемых критериев.

Установленные в эксперименте множественные нелинейные связи позволили провести сравнительный анализ зависимости выявленных изменений от со-четанного воздействия факторов с целью выявления приоритета каждого из них между параметрами у-облучения (доза, мощность), продолжительностью пострадиационного периода и динамикой изменения изучаемых показателей на основе дисперсионного анализа, определяющих иммунный статус тощей кишки. Прежде всего была составлена полная матрица всех данных, включая показатели каждого критерия при изменении в условиях эксперимента. Затем строились таблицы с расчетом соответствующих коэффициентов для каждого показателя.

□Доза □ Мощность □ Время

Рис. 9. Диаграмма степени участия параметров однократного у-облучения.

Условные обозначения-.*-р<0,01,**-р<0,05 - коэффициент достоверности.

Величина коэффициента Дарбина-Уотсона (<3) показала, что в исследовании было использовано достаточное количество параметров. Из диаграммы (рис 6) видно, что практически все морфоэнзиматические критерии слизистой оболочки тощей кишки проявили зависимость от параметров эксперимента, исключение составили дегранулированные тучные клетки, эпителиоциты крипт в профазе и метафазе митотического цикла, лимфоциты нижней трети ворсин. Остальные параметры проявили наиболее выраженную зависимость от дозы облучения, которая носила прямой характер для вакуолизированных тучных клеток, шелочной фосфатазы и эпителиоцитов крипт в телофазе митоза. Оставшиеся показатели проявили обратный характер зависимости. Зависимость от мощности носила менее выраженный характер и была достоверной только для интраэпителиальных лимфоцитов, индекса миграции лимфоцитов и интраэпи-телиальных лимфоцитов верхней трети ворсин, а также для эпителиоцитов крипт в телофазе митоза. Зависимость от временного параметра была обратной, за исключением эпителиоцитов крипт в анафазе и телофазе митоза, и практически по всем показателям носила достоверный характер (рис. 6).

Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что низкие значения критериев свидетельствуют о большем участии не учтенных факторов, которые возникали в процессе эксперимента (А.Г. Карташов, Л.А. Иванова, 1988) или, что более вероятно, изменение параметров является неспецифической формой реагирования слизистой оболочки тощей кишки в условиях эксперимента.

30 31

Рис.10. Диаграмма радиочувствительности по коэффициенту детерминации исследуемых критериев после однократного у-облучения.

Несмотря на низкие значения коэффициентов детерминации, которые отражают степень участия факторов в изменении исследуемых критериев, большинство коэффициентов являлись статистически достоверными (р<0,05). Была выявлена гиперчувствительность лимфоцитов, мигрирующих в эпителиальный пласт. С учетом максимального показателя коэффициента детерминации ИМ определяли его диагностическую значимость по доверительным интервалам в эффектах у-облучения.

-26-24-22-20-18-16-14-12-10 -Я -6 -4 -2 0 2 4 6 8 111 12 14 16 18 20 -20-18-16-14-12-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20°

А Б

Рис. 11. Диагностическая значимость интраэпителиальных лимфоцитов по доверительным интервалам после однократного (А) и фракционированного (Б) у-облучения в диапазоне параметров малых доз.

Результаты исследования показали, что при всех дозах однократного у-облучения, независимо от сроков пострадиационного периода доверительные интервалы располагались левее левой границы интервала контрольных крыс и не содержали ноль, поэтому любая его доза вызывала диагностически значимые эффекты. Исключение составила доза 0,5 Зв спустя 180 суток после у-облучения, доверительный интервал которой проходил через ноль и располагался левее и правее доверительного интервала контроля; при мощности 660 сГр/ч правее левой границы интервала контроля спустя 180 суток; при дозе 0,2 Зв и мощности 660 сГр/ч спустя 545 суток; такой же эффект наблюдался при дозах 0,1 и 0,2 Зв спустя 730 суток после воздействия.

Для фракционированного излучения нулевая гипотеза была отвергнута для дозы 13в спустя 180 суток; 0,1 Зв и 1 Зв спустя 365 суток; 0,5 и 1 Зв спустя 730 суток после облучения. Доверительные интервалы проходили через ноль и располагались правее границы контроля.

Таким образом, можно отметить, что нулевая гипотеза была отвергнута, констатируя положительные или нейтральные эффекты изменением числа ин-траэпителиальных лимфоцитов, определяющих защитные процессы и регуля-торное участие, направленное на структурно-функциональное поддержание го-меостаза.

Проведенный пробит-анализ зависимости признака «доза-эффект» по диагностической значимости заключался в определении диапазона доз, в которых прослеживается максимальный эффект.

Пробит-анализ показал, что при однократном у-облучении он зависел от дозы 0,17 Зв и эта доза колеблется от 0,14 Зв до 0,21 Зв, с 95% вероятностью. При фракционированном облучении - 0,58 Зв и колеблется доза от 0,53 до 0,61 Зв. При этой дозе эффект будет наблюдаться у 50% крыс.

А Б

Рис.12. Зависимость «доза-эффект» после А - однократного у-облучении и Б-фракционированного у-облучения.

Таким образом, эффективная доза однократного облучения в 3-4 раза ниже дозы фракционированного и характеризуется повышением индекса миграции лимфоцитов.

Выводы

1. Реакция кишечио-ассоциированной лимфоидной ткани проявлялась образованием лимфоцитарного инфильтрата в эпителии и лимфоцитарно-плазмоцитарного - в субэпителиальном слое с образованием лимфоидных узелков и М-клеток спустя 180 и 365 суток при дозе 0,1 Зв, информируя о неблагополучии гомеостаза на фоне дезинтеграции барьерных образований, изменением динамики светооптической плотности распределения сиаломуцинов и щелочной фосфатазы энтероцитов на фоне дисгармонии перераспределением тучных клеток в хронодинамике эксперимента, определяющих местный гомео-стаз.

2. Выявлена некоторая закономерность динамики клеток в S-периоде, митозе и интраэпителиальных лимфоцитов, констатирующая повышение активности клеток S-периода на фоне повышения индекса миграции (р<0,05) при дозе 0,1 Зв спустя 365 и 545 суток; 0,2 Зв спустя 180 суток; 0,5 Зв спустя 180, 365 и 545 суток; 1 Зв спустя 545 суток (р<0,05). После фракционированного у-облучения при дозе 0,1 Зв спустя 365, 545 и 730 суток; 0,2 Зв спустя 545 и 730 суток; 0,5 Зв — 545 и 730 суток; 1 Зв спустя 545 суток. При этом, независимо от кратности доз митотический индекс снижался, проявляя на определенных этапах хроно-динамики эксперимента признаки морфогенетической активности лимфоцитов в восстановительных процессах.

3. Корреляционный адаптометрический анализ выявил адаптивный эффект после однократного у-облучения спустя 180 и 365 суток при дозе 0,2 Зв между ИМ и МИ; между ИЛ и СПС - 180 суток; между ТКВ и ИЛ, ИЛ и ЩФ при дозе 0,1 Зв спустя 180 и 545 суток и при дозе 0,5 Зв — 730 суток между СПС и ЩФ. После фракционированного у-облучения спустя 365 суток между ТКВ и ИЛ, ИМ и МИ при дозе 1 и 0,1 Зв соответственно; спустя 545 суток между ИЛ и СПС, ИЛ и ЩФ, СПС и ЩФ при дозах 0,5; 1 и 0,1 Зв соответственно; спустя 730 суток при дозе 0,2 Зв между ИЛ и ЩФ. Представленный эффект не решал судьбу гомеостаза.

4. Атрибутивный риск определил степень возможного поражающего эффекта и зависел от топографии распределения интраэпителиальных лимфоцитов в хронодинамике отдаленных последствий у-облучения в эксперименте с максимальной выраженностью на верхушке и основании ворсин избирательно от дозы.

5.Зависимость «доза-эффект», выявленная на основе диагностической значимости индекса миграции лимфоцитов слизистой оболочки тощей кишки и определяется эффективной дозой в пределах от 0,14 до 0,21 Зв при однократном у-облучении и в пределах от 0,53 до 0,61 Зв при фракционированном.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные данные могут быть рекомендованы для разработки системы мероприятий по обеспечению безопасности личного состава войск при ликвидации аварии на радиационно-опасных объектах и при профессиональном контакте с источниками ионизирующей радиации на объектах ядерной энергетики.

2. Результаты научно-исследовательской работы могут использоваться при разработке санитарно-эпидемиологических правил и нормативов по защите населения, проживающего вблизи объектов ядерной энергетики, от радиационного поражения.

3. Выявленные эффекты у-облучения и представленные подходы их изучения с целью выявления эффективной дозы могут быть рекомендованы при проведении морфологических, цитологических, гистохимических, радиобиологических исследований с точки зрения диагностической значимости.

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАННЫ СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТЫ:

С 21 октября 2011 г. Зюзина В.В. считается Шишкиной В.В. на основании записи о браке в отделе ЗАГС Центрального района г. Воронежа.

Публикация в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Зюзина В.В. Эффективность малых доз у-облучения в морфологостати-стическом алгоритме экспериментальных исследований/Слюсарева O.A., Воронцова З.А., Зюзина В.В., Афанасьев Р.В.// Вестник новых медицинских технологий. Том XVIII, №2, - Тула; ТулГу. - 2011. с. 166-169

2. Зюзина В.В. Оценка иммунного статуса слизистой оболочки тощей кишки в модельном алгоритме эффектов у- облучения/Воронцова З.А., Зюзина В.В.// Аллергология и иммунология. Том 12. - №1, М., 2011. - с. 59

3.Шишкина В.В. Динамика клеточных популяций слизистой оболочки тощей кишки при воздействии малых доз у-облучения в эксперименте /Воронцова З.А., Шишкина В.В.// Морфология, Том 141. - выпуск 3. - СПб. -2012.-с. 63

4. Шишкина В.В. Частный случай проявления морфогенетической активности лимфоцитов в эксперименте/ Воронцова З.А., Шишкина В.В.//Вестник новых медицинских технологий. Том XX, № 2, - Тула; ТулГу. - 2013. с.317-320

5. Шишкина В.В .Модифицирующие эффекты отдаленных последствий гамма-облучения в диапазоне малых доз/ Шишкина В.В., Воронцова З.А.// Вестник новых медицинских технологий. Том XXII, №2, - Тула; ТулГу. - 2012. с. 308-309.

Публикации в прочих журналах и научных сборниках:

6. Зюзина В.В. Иммунные эффекты на воздействие малых доз у-облучения в эксперименте / З.А. Воронцова, Шишкина В.В. // "Международный журнал

прикладных и фундаментальных исследований", Москва - «Академия Естествознания».-№11. - 2011,- с. 80-81

7. Зюзина В.В. Количественная оценка зависимости «доза-эффект» обновляющейся клеточной популяции после радиационного воздействия /Слюсарева O.A.,Горожанин A.B., Зюзина В.В.// Труды XIX международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Приложение к журналу «Открытое образование»— Украина, 2011. — с.207-209

8. Зюзина В.В. Интегративные связи в реакциях клеток слизистой оболочки тощей кишки после у-облучения в малых дозах/Воронцова З.А., Зюзина В.В.// Труды XIX международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Приложение к журналу «Открытое образование»— Украина, 2011. — с.204-205.

9. Шишкина В.В. Биоэффекты отдаленных последствий Y-облучения на лимфоидный аппарат/ Воронцова З.А., Шишкина В.В.// Труды XX Юбилейной международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Приложение к журналу «Открытое образование»— Украина, 2012. — с.260 - 261

10. Шишкина В.В. Морфоэнзиматические особенности состояния тощей кишки в условиях отдаленных пострадиационных последствий у-облучения малых доз/ Вестник молодых ученых Республики Башкортостан. № 4 - с. 105-109. Уфа, АИНСИ,-2012.

11. Шишкина В.В. Алгоритм оценки лабильной ткани после радиационного воздействия/ Слюсарева O.A., Воронцова З.А., Шишкина В.В.// Материалы Юбилейной международной научно-практической конференции «Белые ночи 2013», посвященные 20-летию основания МАНЭБ. В 2-х частях, часть I, стр.286-288, Санкт-Петербург.-2013 г.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИЛ- интраэпителиальные лимфоциты

им индекс миграции лимфоцитов

СПС- светооптическая плотность сиаломуцинов

ЩФ- щелочная фосфатаза

ми- митотический индекс

пм- профаза митоза

мм- метафаза митоза

АМ- анафаза митоза

ТМ- телофаза митоза

ВВ - верхняя часть ворсинки

СВ - средняя часть ворсинки

HB - нижняя часть ворсинки

ТКВ - вакуолизированные тучные клетки

ткд- дегранулированные тучные клетки

Шишкина Виктория Викторовна

БИОИНФОРМАЦИОННОЕ ОБОСНОВАНИЕ ОЦЕНКИ ОТДАЛЕННЫХ ПОСЛЕДСТВИЙ -/-ОБЛУЧЕНИЯ ЛИМФОИДНОГО КОМПОНЕНТА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ТОЩЕЙ КИШКИ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 22.11.2013. Формат 60х84*16. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №467. «Издательство ВГМА им.Н.Н. Бурденко» 394036, Воронеж, ул. Студенческая, 10