Биохимические механизмы неспецифической защиты клетки от окислительного стресса

Чистяков, Владимир Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биохимические механизмы неспецифической защиты клетки от окислительного стресса
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические механизмы неспецифической защиты клетки от окислительного стресса"

На правах рукописи

ЧИСТЯКОВ ВЛАДИМИР АНАТОЛЬЕВИЧ ./у^с.^^/*

БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ НЕСИЕЦИФИЧЕСКОИ ЗАЩИТЫ КЛЕТКИ ОТ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА

03.01.04- биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

4854617

2 А 013 2311

Ростов-на-Дону 2011

4854617

Работа выполнена в НИИ биологии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южный федеральный университет»

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Внуков Валерий Валентинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Арутюнян Александр Вартанович

доктор биологических наук Федорова Татьяна Николаевна

доктор биологических наук, Заслуженный деятель науки РФ, профессор Коснцын Николай Степанович

Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН (ИЭФБ РАН)

Защита состоится «3» марта 2011 г. в « /Л часов на заседании диссертационного совета Д212.208.07 в ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» (г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки 194/1, актовый зал)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» по адресу: г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148

Автореферат разослан «¿¿7» Ьс^^рЛ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Асланян Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Окислительный стресс лежит в основе действия самых разных экстремальных и патогенных факторов (Lee et al., 1983; Toyokuni, 1999; Fridovich, 2000; Wells et al., 2005; Sedelnikova et al., 2010). В их число входят гипоксия/ишемия, воспалительные и аутоиммунные процессы, токсическое действие многих ксенобиотиков, в частности, тяжелых металлов, диоксинов (Koizumi, 2000) и микотоксинов (Atroshi et al., 2002), гипербарическая оксигенация (ГБО). Существуют серьезные доказательства того, что накопление модифицированных активными формами кислорода (АФК) биомолекул является причиной развития тяжелых, а порой и необратимых нарушений процессов и структур, поддерживающих гомеостаз организма. Прооксиданты вызывают самый широкий спектр негативных эффектов - от острой токсичности до гибели клеток как по пути апоптоза, так и некроза, индукции летальных мутаций и гормональных нарушений. Процессы свободнорадикального окисления являются одной из движущих сил развития старения, а, следовательно, лежат в основе большинства возрастных патологий (Harman, 1956; Скулачев 1999, 2005, 2007, 2009).

К началу 80-х годов прошлого века в результате серии исследований, выполненных Д. Джилбертом, Р. Гершман, И. Фридовичем, Н.М. Эммануэлем и др. были в основном сформированы современные представления о системе механизмов, основной, специфической функцией которых является защита клетки от окислительного стресса за счет инактивации АФК.

В то же время, многие экспериментальные факты, в частности наличие высокой антиоксидантной активности катаболитов нуклеиновых кислот и белков, способность митохондрий снижать внутриклеточное парциальное давление кислорода и т.д., указывают на то, что помимо специфических существуют эффективные механизмы защиты от окислительного стресса, основанные на использовании веществ и процессов, которые в норме выполняют другие функции, связанные с синтезом и распадом биомолекул, выработкой энергии и др. Эти механизмы можно назвать «неспецифическими механизмами защиты клетки от окислительного стресса».

Их изучение поможет глубже понять принципы взаимодействия живых систем с агрессивной для них кислородной средой. Неспецифические защитные механизмы - более древние и примитивные, формировались на ранних этапах развития аэробной жизни. Поэтому их исследование дает возможность лучше представить этапы развития современных метаболических путей и клеточных структур. Так, выдвинутая В.П. Скулачевым в 1994 году гипотеза о существовании дополнительной функции митохонрий, связанной с защитой от кислорода, по-прежнему остается единственной рациональной основой объяснения постепенности их симбиогенного происхождения.

Примитивность, а, следовательно, простота неспецифических защитных механизмов определяет значимость их исследования для поиска новых путей повышения адаптационных возможностей организма при помощи антиоксидантов, поскольку чем проще система, тем больше вероятность ее эффективной работы в новых условиях.

Таким образом, актуальность разработки концепции неспецифических механизмов защиты клетки от окислительного стресса определяется, с одной стороны, важностью данной проблематики, а с другой - недостаточно системным характером представлений, существующих на сегодняшний день в данной области биохимии.

Цель и задачи работы. Целью настоящего исследования было установление механизмов неспецифической защиты от индукторов окислительного стресса и разработка на их основе путей коррекции патобиохимических последствий взаимодействия активных форм кислорода с биомолекулами.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие

задачи:

1. Исследовать способность ионов марганца защищать ДНК от АФК in vitro и in vivo.

2. Исследовать антиоксидантную активность аллантоина и мочевой кислоты, в том числе способность этих веществ защищать генетический аппарат клетки от АФК.

3. Исследовать супероксидустраняющую активность представителей основных групп аминокислот, входящих в состав белков.

4. Исследовать устойчивость ковалентно замкнутой кольцевой ДНК, линейной ДНК, а также РНК к деструктивному действию АФК.

5. Изучить роль дыхательной системы дрожжей-сахаромицетов в защите от токсического действия кислорода под давлением.

6. Сравнить антиоксидантную активность пула низкомолекулярных соединений из тканей видов рыб, отличающихся по «эволюционному возрасту».

7. Исследовать способность катионного производного пластохинона - 10-(б'-пластохинонил) децилтрифенил фосфония (SkQl) снижать уровень повреждения ДНК активными формами кислорода.

Первые пять экспериментальных задач посвящены изучению неспецифических механизмов защиты от окислительного стресса, действующих на базовых уровнях организации живых систем: уровне неорганических соединений, уровне низкомолекулярных органических соединений, уровне биополимеров (нуклеиновых кислот), субклеточном уровне.

Две последние задачи имеют прикладной характер. Полученные ранее результаты позволили сформулировать предположение о том, что «процветающие реликтовые формы», в частности, виды семейства

Acipenseridae, могут отличаться гипертрофированным развитием систем неспецифической защиты от окислительного стресса, а, следовательно, служить источником высокоэффективных смесей антиоксидантов. Проверка этого предположения стала одной из задач работы.

Развитие современной биохимии позволяет перейти к использованию сложных антиоксидантных конструкций, способных адресно накапливаться в митохондриях, где генерируется большая часть клеточных АФК.

Под руководством В.П. Скулачева был создан и исследован ряд липофильных катионов, в которых пластохинон объединен с трифенилфосфонием. Использование растительного метаболита пластохинона в антиоксидантных конструкциях, предназначенных для животных, можно рассматривать как эксплуатацию его неспецифической антиоксидантной активности.

Задачей завершающего этапа работы было исследование способности SkQl модифицировать процессы повреждения ДНК, опосредованные действием активных форм кислорода in vivo.

Научная новизна. В результате проведенных исследований были впервые получены новые данные, имеющие существенное значение для понимания роли ряда неспецифических механизмов защиты клетки от окислительного стресса:

- обнаружена способность марганца защищать ДНК от продуктов реакции Фентона;

- подтверждена и количественно оценена способность аллантоина защищать ДНК клетки от повреждения АФК in vitro-,

- обнаружена высокая антиоксидантная активность лизина, превышающая таковую для серусодержащих аминокислот;

- показано существование различных механизмов разрушения кольцевых и линейных ДНК в условиях генерации АФК;

- выявлена способность ГБО вызывать SOS-индукцию у Е. coli, а также способность аскорбиновой кислоты усиливать токсичность ряда тяжелых металлов;

описан феномен гиперчувствительности дыхательных мутантов диплоидных штаммов дрожжей Saccharomyses cerevisiae к ГБО;

- проведен сравнительный анализ способности этанольных экстрактов тканей различных видов рыб защищать ДНК от повреждения АФК in vivo, выявлена более высокая протекторная активность экстрактов тканей осетровых рыб по сравнению с костистыми рыбами;

- исследована способность митохондриально направленного производного пластохинона SkQl снижать фоновый уровень повреждения ДНК активными формами кислорода in vivo.

Теоретическая и практическая значимость работы. На основании полученных результатов была сформулирована и обоснована концепция, учитывающая важную роль неспецифических механизмов защиты от

деструктивного действия активных форм кислорода, таких как: синтез метаболитов с высокой антиоксидантной активностью; формирование молекул ДНК с защищенной от АФК пространственной структурой; активизация дыхания в обеспечении существования клеток в кислородной среде.

Разработанные при выполнении работы методы определения активности супероксиддисмутазы и генотоксичности химических соединений применяются в настоящее время для скрининга биологической активности природных и синтетических соединений, мониторинга качества водной среды Азово-Черноморского бассейна.

Результаты по стабильности ДНК в кислородной среде были применены для разработки методов сохранения ДНК-содержащих образцов в Национальной коллекции генетических материалов при ВНИРО, которые используются в качестве эталонов при ДНК-идентификации происхождения экспортных партий черной икры.

Результаты доклинических испытаний препарата БкСП использованы «НИИ Митоинженерии МГУ» при разработке ветеринарного препарата «Визомитин» и препарата для лечения заболеваний глаз, который в настоящее время проходит клинические испытания.

Материалы работы используются при чтении лекций на кафедрах биохимии и генетики Южного федерального университета в спецкурсах: «Основы патобиохимии», «Свободные радикалы в биологических системах», «Основы мембранологии», «Современные проблемы генетики», «Нехромосомная наследственность», «Мутагены окружающей среды»

Проведенные исследования послужили основой четырех изобретений, на которые получены авторские свидетельства.

Положения, выносимые на защиту:

1. Способность ионов марганца защищать ДНК от АФК, генерируемых в реакции Фентона, лежит в основе неспецифического антиоксидантного механизма, реализуемого на уровне неорганических соединений.

2. Низкомолекулярные органические азотсодержащие соединения -метаболит мочевой кислоты аллантоин и аминокислоты - аланин, валин, изолейцин, метионин, цистеин, лизин, гистидин, треонин, аспарагин и глутаминовая кислота обладают антиоксидантной активностью.

3. Замыкание ДНК в кольцо может быть эффективным механизмом защиты ДНК от АФК, не связанным с их перехватом, который реализуется на уровне макромолекул.

4. Снижение парциального давления кислорода за счет работы дыхательной системы дрожжей лежит в основе защиты этих микроорганизмов от гипербарической оксигенации. Данный механизм реализуется на уровне органелл.

5. Высокая антиоксидантная активность экстрактов тканей осетровых рыб по сравнению с костистыми рыбами является примером высокого

уровня неспецифических механизмов защиты от АФК, характерного для процветающих реликтовых форм.

6. Препарат SkQl (Ю-(б'-пластохинонил) децилтрифенил фосфоний), способен эффективно понижать уровень повреждения ДНК активными формами кислорода. Использование компонента цепи переноса электронов в хлоропластах - пластохинона - в антиоксидантных конструкциях, предназначенных для митохондрий животных, можно рассматривать как эксплуатацию его неспецифической антиоксидантной активности.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были доложены и обсуждены на следующих конференциях: 2-й съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000); Всероссийская научная конференция «Проблемы и перспективы развития аквакультуры в России» (Краснодар, 2001); Всероссийская научно-практическая конференция «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов-на-Дону, 2007); Конференция «Биоресурсы, биотехнологии, экологически безопасное развитие регионов Юга России» (Сочи, 2007); «Russian-European Workshop on DNA Repair and Epigenetic Regulation of Genome Stability» (St.Petersburg, Russia 2008); Международный Междисциплинарный Симпозиум «От экспериментальной медицины к превентивной и интегративной медицине» (Судак, 2008); Международная конференция «Биоэнергетика в прошлом, настоящем и будущем: путь к "Homo sapiens liberatus"» (Москва, 2010), VI Съезд Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 33 работы (6,7 пл., личный вклад 41,2%), в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК РФ - 19 статей, получены 3 патента и 1 авторское свидетельство.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 282 страницах и состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований с обсуждением их результатов в каждой главе, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 19 рисунками. Список литературы включает 74 источника отечественных и 373 иностранных авторов.

Финансовая поддержка. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и образования РФ (грант «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 гг.)» № 2.1.1/5628) и ООО «НИИ митоинженерии МГУ» (проект «Практическое использование ионов Скулачева»)

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Объектом исследования в опытах по влиянию солей марганца на разрушение ДНК in vitro служили молекулы длиной 414 п.н., полученные в результате рутинной процедуры ПЦР-амплификации образцов ДНК Acipenser gueldenstaedti. ДНК обрабатывали перекисью водорода в присутствии солей железа, марганца и урата. Нативность ДНК определяли при помощи ПЦР.

Для оценки протекторной активности марганца in vivo была исследована способность этого вещества супрессировать генотоксичность перекиси водорода в SOS-lux тесте, основанном на использовании штамма Е. coli PT-l(C600(pPLSl)), несущего плазмиду, содержащую lux-оперон Photobacterium leognathi под контролем сильного SOS-промотора, представляющего часть cda гена плазмиды ColD (Ptitsyn et al., 1997). Повреждение ДНК тестерного штамма ведет к индукции свечения. Для коррекции артефактов, связанных с подавлением активности люциферазы, использовали дополнительный штамм РТ-5 (С600(рВА5)), генотип которого аналогичен SOS-lux штамму, но lux-оперон находится под контролем конститутивного промотора, обеспечивающего постоянный уровень экспрессии люциферазы (Сазыкина и др., 2000; 2002). Дополнительный штамм позволяет оценивать, как изменяется активность люциферазы за счет механизмов, не связанных с индукцией фермента, что делает возможным расчет соответствующего коэффициента коррекции.

Величина, характеризующая генотоксичность, — фактор индукции Г, показывает, во сколько раз увеличилась интенсивность свечения тестерного штамма после инкубации с мутагеном с поправкой на подавление свечения.

Для оценки антиоксидантной активности аллантоина и урата был использован интегральный показатель - способность этого вещества подавлять вызванную перекисью водорода SOS-индукцию у Е. coli.

Показатель антиоксидантной/антимутагенной активности (А) рассчитывали как процент уменьшения генотоксической активности перекиси водорода в присутствии изучаемой пробы.

В качестве характеристики взаимодействия изученных соединений с Ог~ использовали супероксидустраняющую активность (СУА), определяемую по разработанной нами методике (Чистяков и др., 1992). Данные по СУА аминокислот представляли в виде единиц активности супероксиддисмутазы, рассчитанных согласно Фридовичу (1973).

Удельную супероксидустраняющую активность рассчитывали по формуле:

Суд? СУ А/С,

где Суд - удельная супероксидустраняющая активность;

С - концентрация аминокислот в мМ.

Для экспериментального исследования роли топологической организации нуклеиновых кислот при защите от повреждающих агентов использовали систему генерации АФК, позволяющую определить степень разрушения линейных и кольцевых суперспиральных молекул ДНК и суммарной РНК.

В качестве источника линейной хромосомной ДНК и суммарной РНК использовали штамм E.coli АВ 1157. ДНК и РНК выделяли с использованием фенольной депротеинизации, затем разделяли хроматографией на сефарозе 4В («Pharmacia», Швеция). Ковалентно замкнутую кольцевую ДНК выделяли из штамма НВ-101 — носителя плазмиды pBR-322 по методу Кизера (1984).

Для получения гидроксильных радикалов в систему генерации супероксидного аниона, образующегося при аутоокислении гидроксиламина в нитрит, вводили ионы Си2+. В качестве перехватчика гидроксильных радикалов использовали раствор маннита. Деградацию нуклеиновых кислот in vitro учитывали, измеряя флуоресценцию комплексов нуклеиновых кислот с бромидом этидия.

Для определения способности активных форм кислорода вызывать однонитевые разрывы в ковалентно замкнутых кольцевых ДНК использовали их свойство быстрой ренатурации после щелочной денатурации, применяемое во многих методах выделения ковалентно замкнутых кольцевых ДНК (Кантор, Шиммел, 1984). Определение сводилось к измерению флуоресценции комплекса ДНК-бромид этидия после инкубации при рН=12,3 и последующей нейтрализации до рН = 8,0.

Степень деградации нуклеиновых кислот рассчитывали по формуле: kx{F0-Ff))

D =

1----/>

х100%

где:

F0 - флуоресценция опытной пробы нуклеиновой кислоты; Fk - флуоресценция контрольной пробы нуклеиновой кислоты; Ff - флуоресценция 0,5 мкг/мл бромистого этидия в соответствующем буфере.

С целью учета поглощения сульфата меди в области 500-700 нм при измерении флуоресценции для каждого буфера в модельных опытах определяли коэффициент гашения флуоресценции ионами меди (к):

FEt - флуоресценция раствора бромистого этидия без CuS04;

FcU2+ - флуоресценция раствора бромистого этидия в присутствии

определенной концентрации CuS04.

Для определения токсичности металлов в присутствии аскорбата использовали стандартный протокол биолюминесцентного теста на токсичность (Суслов, Данилов, 1996) с использованием рекомбинантного штамма E.coli В 5356. Результаты всех экспериментов с биосенсорами

рассчитывали по данным минимум трех измерений. Эксперименты проводили в трех независимых повторностях.

В экспериментах по выживаемости дрожжей после гипербарической оксигенации (ГБО) обрабатывали чашки Петри с полной средой, засеянные исследуемыми культурами. В биохимических экспериментах суспензии дрожжей в полной среде обрабатывали ГБО в пенициллиновых флаконах. Немедленно после обработки клетки отмывали от среды 0,1 M Na фосфатным буфером с pH 7,4.

Во всех биохимических экспериментах дрожжи гомогенизировали по модифицированному методу (Bhaduri, Demchick, 1983). Содержание продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), определяли по методу Ushiyama, Mishara (1978). Определение белка проводили по методу Лоури (Кочетов, 1981). Каталазную активность определяли по методу Баха и Зубковой (Березов, 1976). Определение суммарной пероксидазной активности проводили по методу Ornstein в модификации Лукаша (1995). Определение СОД активности проводили по разработанному нами методу (Чистяков и др., 1991). Биохимические параметры дрожжей рассчитывали по данным 6-7 повторностей.

Материалом для исследования антимутагенной/антиоксидантой активности тканей рыб служили образцы гонад, печени и мышц 12 особей русского осетра Acipenser gueldenstaedti, хряща хорды трех особей севрюги Acipenser stellatus, гонад и печени 35 особей пиленгаса Mugil soiuy, 15 особей чехони Pelecus cultratus, и 5 особей тарани Rutilus rutilus heckeli. Рыбы были выловлены в 1999-2001 гг. в Азовском море. Органы для исследования замораживали до -20° С и доставляли в лабораторию, где измельчали и экстрагировали пятью объемами 96 % этанола. Принцип оценки антимутагенного потенциала, как и в случае аллантоина, был основан на определении способности вещества или экстракта гидробионта подавлять SOS-индукцию, вызванную перекисью водорода у Е. coli.

В экспериментах с ионами Скулачева самцам крыс Wistar (аутбредный сток), в возрасте 45 дней в течение 14 дней вводили SkQl по 25 и 250 нмоль/кг в день. Часть крыс после окончания введения препарата подвергли обработке ГБО в режиме 0,5 МПа в течение 60 минут.

Частоту аберраций хромосом определяли в роговице глаза при помощи анафазного теста (Дарлингтон, Ла Кур, 1980). Учитывали хромосомные фрагменты, хроматидные фрагменты, хромосомные и хроматидные мосты. Митотический индекс рассчитывали как процентное отношение числа делящихся клеток к общему числу проанализированных клеток (не менее 3000 для одного глаза). Всего для цитогенетических исследований было сформировано 6 групп по 10 животных.

Для биохимических экспериментов использовали животных с характеристиками, аналогичными вышеописанным, SkQl вводили по вышеприведенной схеме. Исследование внеклеточного 8-ОН-2-деоксигуанозина (8-OHdG) проводили в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы - DNA Damage

ELISA Kit, (Biohem Acquires Assay Designs (США)), на автоматическом анализаторе Alisei (Италия). Число животных в контроле - 18, в опытных группах по 9.

Статистическую обработку проводили по стандартным биометрическим формулам. Для оценки статистической значимости различий использовали t-критерий Стьюдента и непараметрический критерий Уилкоксона (Манна-Уитни) (Лакин, 1990; Владимирский, 1983).

Результаты и нх обсуждение

Уровень неорганических соединений: оценка протекторных свойств марганца

Способность некоторых двухвалентных катионов усиливать деструктивное действие АФК — общеизвестный факт. Менее известно то, что еще в 1982 году Арчибальдом и Фридовичем были опубликованы данные о супероксидустраняющей активности ионов марганца (Archibald, Fridovich, 1982). В экспериментах in vitro было обнаружено, что двухвалентный марганец, взаимодействуя с супероксид-анионом и двумя протонами, окисляется до трехвалентного состояния с образованием перекиси водорода (Archibald, Fridovich, 1982). Позже были найдены косвенные доказательства эффективной работы данного цикла у некоторых микроорганизмов. По мнению Дэйли и соавторов (Daly et al., 2007), именно высокое содержание марганца обеспечивает резистентность бактерии Deinococcus radiodurans к дозам радиации, измеряемым десятками кГр. Согласно предположению Дэйли, участие марганца в защите D. radiodurans от радиации указывает как на первичность супероксид-аниона, а не гидроксильного радикала, так и на первичность повреждения белков, а не нуклеиновых кислот, в развитии радиационного повреждения микроорганизмов. Эта гипотеза выглядит несколько избыточной. Логичнее предположить, что ионы марганца способны обеспечивать защиту ДНК, которая, по классическим представлениям, является главной клеточной мишенью для ионизирующих излучений от гидроксильного радикала. Проверка этого предположения была задачей экспериментов, описанных в данной главе.

Результаты эксперимента представлены на рис. 1а. Как видно на рисунке, исследованные концентрации перекиси водорода и железа по отдельности не вызывают повреждения ДНК в использованной нами системе (дорожки 2, 3). Объединение двух компонентов реактива Фентона делает амплификацию исследованных ДНК невозможной (дорожка 4). Введение в реакционную смесь ионов марганца в концентрации, в 10 раз превышающей концентрацию железа, полностью восстанавливает способность ДНК к амплификации (дорожка 5). Введение эквимолярной и дециэквимолярной концентраций ведет к частичному восстановлению нативности (дорожки 6, 7). На рис. 16 представлены результаты исследования в данной экспериментальной системе одного из наиболее эффективных органических протекторов ДНК - мочевой кислоты. В частности, урат применяется для

защиты ДНК при помощи одного из наиболее распространенных средств для ее длительного хранения — РТА карт (Вищоупе, 1998). Однако, как видно на рисунке, использование урата в концентрации, близкой к насыщенной (1 мМ), не позволяет достичь характерного для марганца протекторного эффекта. ПЦР проходит неспецифично с образованием размытой высокомолекулярной фракции.

Перекись водорода — необходимый компонент процессов, открытых Фентоном и детально изученных Габером и Вейссом. Побочным продуктом фентоновских процессов является гидроксильный радикал, способный эффективно разрушать ДНК (Водолажский и др., 1987).

12345678 Ка

I мм* от т «ям ■ * ■ ШИШ' 1 2345 6 78 К-

яйи «м» «г.« тт шт

Рис. 1. Электрофореграммы продуктов амплификации нативной и обработанной АФК ДНК

а) 1; 8 - нативная ДНК; 2 — Ре804 0,8125 мМ; 3 — Н202 1,25 %; 4 — РеБ04.0,8125 мМ и Н202 1,25 %; 5 — Ре804. 0,8125 мМ, Н202,1,25 % и МпБ04 8,125 мМ; 6 — Ре504. 0,8125 мМ , Н202 1,25 % и Мп8046,8125 мМ; 7 1 — РеБ04 0,8125 мМ, Н202 1,25 % и МпБ04 0,08125 мМ; К— негативный контроль.

б) Обозначения дорожек 1 - 6 и 8 аналогичны рис. а, 7 — Ре304,0,8125 мМ и Н202 1,25 % и 1 мМ урата.

Данные об участии ионов марганца в фентоновских процессах достаточно противоречивы. С одной стороны, их комплексы с органическими молекулами катализируют разложение перекиси водорода, что должно, также как и перехват супероксид-аниона, тормозить развитие

реакций генерации АФК (Вег1еп е1 а1., 1990). Но, с другой стороны, процесс разложения перекиси в присутствии марганца также может идти по свободно-радикальному механизму. В работе Мепёег-АЬагег и др. (2001) отмечено 72 % снижение уровня генерации гидроксильного радикала и 17 % снижение количества перекиси водорода, образующихся при автоокислении 6-гидроксидофамина.

Наши эксперименты показали, что в условиях, близких к физиологическим, марганец катализирует реакции, ведущие к уменьшению свободно-радикального разрушения ДНК.

Эффективность действия марганца как антиоксиданта/антимутагена может быть проиллюстрирована тем, что Мп304 в концентрациях 10 и 100 мМ подавляет генотоксичность перекиси водорода в концентрации 10"' М на 75,7 % и 87,2 %, соответственно. Концентрация Мп304 1 мМ не дает протекторного эффекта (рис. 2).

Таким образом, способность ионов марганца защищать ДНК от разрушения в фентоновских процессах проявляется и в форме подавления генотоксичности перекиси водорода. По-видимому, накопление марганца бактериями позволяет им не только имитировать супероксиддисмутазную активность, но и формировать целый комплекс защитных механизмов, которые обеспечивают как удаление супероксид-аниона, так и защиту ДНК от агрессивных продуктов фентоновских процессов, в первую очередь, от гидроксильного радикала.

О 1 10 100

Концентрация сульфата марганца мМ

Рис. 2. Индукция SOS-ответа Е. coli перекисью водорода в концентрации

10 5 М в присутствии сульфата марганца

ДНК-протекторные свойства солей марганца были использованы нами для создания методики консервации образцов ДНК внутри пластиковых пленок (Чистяков и др., 2007; 2009). Эта методика позволяет при помощи стандартного офисного ламинатора формировать компактные пакеты

архивных образцов ДНК, защищенных, в отличие от ИТА-карт, от избытка влажности, потравы насекомыми и т.д.

Уровень низкомолекулярных органических соединений: участие

азотсодержащих низкомолекулярных соединений в защите от окислительного стресса

Исследования последних десятилетий выявили целый ряд веществ, специфической функцией которых является защита клетки от АФК. Менее изучены антиоксидантные свойства веществ, основная функция которых, по существующим представлениям, не связана с защитой от кислорода. Весьма интересны в этом плане азотсодержащие соединения, наиболее изученным представителем которых является мочевая кислота.

Непосредственным катаболитом урата у большинства позвоночных, за исключением приматов, является аллантоин, и, таким образом, вопрос об антиоксидантной способности аллантоина представляет несомненный интерес. Квантово-химические расчеты, проведенные Корниенко с соавт. (2002), позволили предположить у некоторых аминокислот способность реагировать с супероксид-анионом.

Таким образом, задачей данного раздела работы было исследование антиоксидантной активности аллантоина, урата и аминокислот.

Аллантоин. урат. Как видно из результатов, представленных в табл. 1, аллантоин и аскорбат проявляют способность супрессировать вызванную перекисью водорода БОБ-индукцию. При этом максимальная активность аллантоина регистрируется для концентрации 10~4 М, а аскорбата - 10"2 М. Кроме того, антимутагенная активность аллантоина сохраняется и для малых концентраций - Ю"10 и 10"9 М, в которых аскорбат начинает усиливать 80Б-индукцию, вызванную перекисью.

Данное явление связано, по-видимому, со взаимодействием аскорбата, перекиси и железа, присутствующих в питательной среде для бактерий. Рассматривая результаты эксперимента в целом, отметим, что оба исследованные соединения обладают способностью подавлять генотоксическое действие перекиси водорода.

Подавление аллантоином как мутагенеза, так и 508-ответа, развивающегося под действием перекиси водорода, указывает на способность этого вещества непосредственно защищать ДНК от деструктивного действия гидроксильного радикала, что характерно и для мочевой кислоты. При этом максимальный антимутагенный эффект проявляется при введении аллантоина за 1,5 часа до обработки.

Отсутствие достоверного защитного эффекта при одновременном введении перекиси и аллантоина, по-видимому, объясняется разными скоростями проникновения этих веществ в клетку.

Таблица 1

Индукция SOS-ответа Е. coli перекисью водорода (10"4 М) в присутствии аллантоина, аскорбата и урата

Концентрация M Алланотоин Аскорбат Урат

А, % Фактор индукции de) А, % Фактор индукции de) А, % Фактор индукции de)

0 0 141 ± 12 0 158±13 0 100±1

ю-10 75* 37 ±2 -140 221±19 18* 82±5

кг9 15* 37 ±2 -226 356±23 23* 77±1

10"8 15* 37±3 40* 95±8 62* 38±3

10"' 86* 22±2 54* 73±5 65* 35±4

10"6 82* 24±1 50* 79+5 40* 60±5

ю-3 86* 22±2 65,5* 55±4 49* 52±12

ю-4 93* 9+1 49* 80±6 66* 34±10

ю-3 64* 51+5 73* 43+2 68* 32±7

ю-2 75* 35±4 95,5* 7+0,3 Концентрации выше насыщенной при 30°С

ю-1 64* 50+4 - 0,5**

* - статистически значимый протекторный эффект, 1-критерий, р<0,05

** - сильное подавление свечения

Квантово-химические расчеты, проведенные И.В. Корниенко, также подтверждают эффективность аллантоина в качестве антиоксиданта в реакциях его радикальной атаки активными формами кислорода (Гуськов и др. 2002). Сопоставление антимутагенной активности аскорбиновой кислоты и аллантоина показывает, что последний является более эффективным протектором ДНК клетки от АФК.

Сопоставление полученных данных с наблюдениями за содержанием этого вещества в плаценте здоровых и страдающих патологиями женщин позволило высказать обоснованное предположение о том, что определенный уровень аллантоина «обеспечивает жизнеспособность развивающегося эмбриона млекопитающих» (Гуськов и др., 2004). Тем не менее, при интерпретации данных по антиоксидантной активности аллантоина у человека необходимо учитывать то, что мочевая кислота также обладает определенной антиоксидантной активностью. Более того, урат является основным катаболитом азотсодержащих соединений у высших приматов и предшественником аллантоина у животных, выделяющих азот в виде более простых соединений. Способность этого вещества защищать клеточные структуры от АФК продемонстрирована в целом ряде исследований, наиболее тщательное из которых проведено Б. Эймсом с соавторами (Ames et al., 1981). Известно также, что объединение в геноме дрозофилы дефектов по содержанию урата и супероксидцисмутазе приводит к развитию летального эффекта у имаго (Hilliker et al., 1992). Способность урата защищать

нуклеиновые кислоты применяется на практике. Это вещество входит в состав пропитки наиболее популярного «инструмента» консервации ДНК -РТА-карт.

Наши эксперименты показали (табл. 1), что урат, также как и аллантоин, проявляет антимутагенную активность практически во всех вариантах опыта. Максимальная активность регистрируется для концентрации 10"3 М. Максимальное значение этого показателя (А) для аллантоина регистрируется в концентрации 10"4 М. В отличие от урата, его активность сохраняется и при малых концентрациях - 10"9-Ю"|0М.

Таблица 2

Супероксидустраняющая активность урата и аллантоина.

Концентрация, М Урат Аллантоин

Ю"10 0,060±0,019 0,058±0,004

10"9 0,084±0,012 0,069±0,004

10"8 0,224±0,016* 0,089±0,002

ю-' 0,309±0,013* 0,129±0,012

10"6 0,339±0,013* 0,181±0,011

Ю-5 0,401±0,010* 0,171±0,003

ю-4 0,029±0,007 0,137±0,018*

* - Отличия между эффектами одинаковых концентраций исследованных веществ статистически значимы ([-критерий р<0,05)

Максимальное значение антимутагенной активности аллантоина превышает аналогичный показатель для урата в 1,37 раза.

Как аллантоин, так и урат, обладают супероксидустраняющей активностью. Для аллантоина увеличение концентрации не приводит к достоверному росту СУА, тогда как для урата обнаружена явная зависимость эффекта от дозы. Максимум супероксидустраняющей активности урат проявляет в концентрации 10"5 М, что соответствует физиологической концентрации в спинномозговой жидкости.

Таким образом, урат способен более эффективно, чем аллантоин, «перехватывать» супероксид-анион, проявляя в то же время меньшую способность инактивировать свободнорадикальные продукты реакций Фентона и Габера-Вейсса, ответственных за ДНК-повреждающую активность перекиси водорода. Мочевая кислота, как показано выше, является эффективным перехватчиком гидроксильных и супероксид-радикалов. С повышением концентрации урата вследствие Uox — мутаций (Oda et al., 2002; Wu et al., 1992) связывают увеличение продолжительности жизни и снижение уровня возрастных раковых заболеваний у человека (Ames et al., 1981). С другой стороны, в результате атаки мочевой кислоты свободными радикалами образуется аллантоин, обладающий свойствами антиоксиданта, антимутагена и витамина (Гуськов и др., 2002; 2004). Таким образом,

неферментативная генерация аллантоина у видов, потерявших уриказную активность, может отражать развитие адаптационной составляющей окислительного стресса.

В пользу этого предположения говорят данные по антиоксидантной активности смеси, характерной для спинномозговой жидкости человека концентрации урата и в десять раз меньшей концентрации аллантоина — 10"5 и 10"6 М, соответственно (Атопш е! а1., 2009). Антимутагенная активность такой смеси (несмотря на то, что содержание аллантоина в ней около 10 %) на 33 % выше, чем чистой мочевой кислоты. Подобный эффект синергизма при совместном действии антиоксидантов в физиологических концентрациях согласуется с представлениями о том, что биоантиоксиданты наиболее эффективны в составе природных смесей. В то же время, значение СУА смеси достоверно не отличается от такового для урата - 0,386±0,014.

Полученные нами данные позволяют высказать предположение о том, что аллантоин может служить в основном для защиты генетического аппарата клетки от АФК, а главной протекторной функцией урата является защита мембран от супероксид-аниона.

Аминокислоты. Как показали теоретические исследования Корниенко и соавт. (2002), аминокислоты могут быть эффективными перехватчиками супероксид-аниона. Исследование взаимодействия аминокислот с 02~ позволит глубже понять механизм развития окислительно-восстановительного дисбаланса в организме при ряде патологий и действии экстремальных факторов среды.

По максимальной СУА, обнаруженной в исследованном диапазоне концентраций, изученные аминокислоты можно разделить на две группы. Максимальной СУА удалось достичь для лизина - 2,89 ед., глутаминовой кислоты - 2,23 ед., цистеина - 1,91 ед. Промежуточное положение занимает гистидин - 1,22 ед. Минимальную СУА проявили треонин, аспарагин, метионин и алифатические аминокислоты (0,81—1,04 ед.). Анализ дозовых зависимостей СУА/концентрация показал, что удельная СУА аминокислот существенно зависит от концентрации.

Данные по удельной СУА представлены на рис. 3. Для большинства изученных аминокислот (гистидин, изолейцин, аланин, треонин, валин, аспарагин) достоверных различий в Суд не обнаружено, поэтому они представлены на рис. 3 одной кривой. Большую СУА проявляют глутаминовая кислота и цистеин. Для всех вышеназванных аминокислот увеличение концентрации приводит к экспоненциальному понижению СУА с выходом на плато. Аномальная и-образная зависимость отмечена для лизина. Такой вид кривых, по нашему мнению, можно объяснить тем, что при концентрациях выше 9 мМ идет образование комплексов, СУА которых ниже, чем у свободных аминокислот, возможно, за счет координационных взаимодействий между кислотными и аминогруппами.

По достижении концентраций, приводящих к образованию таких комплексов, СУА аминокислот будет в большей степени зависеть от свойств их радикалов. Такое предположение позволяет логически увязать аномально

высокую СУА лизина с наличием дополнительной аминогруппы. Данные по СУА лизина явились несколько неожиданными, так как в литературе эта аминокислота не рассматривается в качестве потенциального антиоксиданта, в то время как его максимальная СУА в нашей системе почти в 2,5 раза выше, чем у метионина, который является признанным природным антиоксидантом.

Концентрация, мМ. Глутаминовая кислота Лизин -Л- Цистеин — Гистидин

Рис. 3. Зависимость удельной супероксидустраняющей активности аминокислот от их концентрации

Сделанные нами выводы были подтверждены проведенными Корниенко (2004) квантовохимическими ab initio расчетами в базисе UHF/6-31G молекулярных комплексов, Ог'- с протонированным по свободной аминогруппе лизином. В качестве причины высокой супероксидустраняющей активности лизина может быть названо образование устойчивого межмолекулярного комплекса, сопровождающееся переносом протона с аминокислоты на анион-радикал кислорода. Именно такой механизм процесса позволяет уменьшить энергию, необходимую для восстановления Ог" до Н2О2.

В заключение отметим, что аллантоин и природные аминокислоты не токсичны, не разрушаются в пищеварительном тракте, хорошо растворимы в воде и могут быть введены в организм в значительных количествах, что облегчает их использование для фармакологической коррекции кислородзависимых патологических состояний.

Определенное прикладное значение может иметь обнаруженная нами (Сазыкина и др., 2009) способность аллантоина снижать генотоксичность такого распространного индуктора АФК, как ультрафиолет длиной волны 300-400 нм, характерный для солнечного света у земной поверхности.

Современные представления о вкладе различных повреждений ДНК в генотоксичность данного типа излучения достаточно противоречивы. С одной стороны, есть данные о его способности генерировать пиримидиновые димеры. С другой стороны, эта активность зависит от антиоксидантного статуса клетки (подавляется альфа-токоферолом). Кроме того, достаточно хорошо показана способность УФ длиной волны 300-400 нм увеличивать внутриклеточное содержание супероксид-аниона. Обнаруженный нами эффект 55% снижения уровня SOS-индукции после облучения Е. coli в присутствии аллантоина может служить дополнительным аргументом в пользу прооксидантного механизма. В любом случае, полученные данные позволяют поставить вопрос об испытании солнцезащитных свойств аллантоина на более близких к человеку моделях.

Уровень биополимеров (нуклеиновых кислот): различия в чувствительности РНК, линейной и кольцевой ДНК к индукторам окислительного стресса, замыкание в кольцо как защитный механизм

Сравнение условий, в которых обнаруживаются линейные и ковалентно замкнутые кольцевые ДНК, позволяет сделать предположение о том, что в основе их различной распространенности лежит различная устойчивость к повреждающим агентам, в том числе к активным формам кислорода.

Ковалентно замкнутые кольцевые ДНК преимущественно обнаруживаются в компартментах, содержащих клеточные системы переноса электронов, способные интенсивно генерировать АФК. Линейная ДНК обнаруживается только в структурах, изолированных мембранами от каких-либо источников АФК и других повреждающих агентов.

Эксперименты показали, что 20-60-минутная экспозиция при давлении 0,7 МПа чистого кислорода не вызывает достоверной деградации ни одной из исследованных форм нуклеиновых кислот. Деструктивного действия супероксид-аниона на препараты нуклеиновых кислот обнаружить в пределах использованной экспериментальной схемы также не удалось.

Данные по деградации хромосомной ДНК и суммарной РНК в условиях аутоокисления солянокислого гидроксиламина в присутствии ионов меди в бикарбонатном и глициновом буферах представлены на рис. 4.

Из приведенных данных следует, что в условиях генерации АФК с увеличением концентрации СиБС^ до 14 мМ в обеих буферных системах происходит практически линейное увеличение деградации как хромосомной ДНК, так и суммарной РНК.

Деградация РНК, в среднем, идет эффективнее по сравнению с линейной хромосомной ДНК (на 20 % в глициновой и на 40 % в бикарбонатной буферной системе). Для бикарбонатной системы генерации активных форм кислорода характерен больший деструктивный эффект.

На рис. 5 приведены данные по деградации ковалентно замкнутой кольцевой ДНК плазмиды рВЯ322 в различных условиях. На рисунке видно, что при концентрациях меди 5-10 мМ, вызывающих -50 % разрушение линейной ДНК (рис. 4), деградация ковалентно замкнутой ДНК отсутствует.

При рассмотрении зависимостей степени деградации нуклеиновой кислоты от концентрации ионов меди, обращает на себя внимание факт увеличения флуоресценции исследуемых образцов ковалентно замкнутых кольцевых молекул ДНК, что проявляется в появлении отрицательных значений Б.

По-видимому, этот эффект может объясняться появлением однонитевых разрывов в ковалентно замкнутых кольцевых молекулах ДНК после стадии щелочного расплетания, что ведет к устранению топологических ограничений при взаимодействии интеркалирующего лиганда (бромистого этидия) с молекулами ДНК. Такие разрывы возникают при ренатурации ковалентно замкнутой ДНК после инкубации при щелочных рН и последующей нейтрализации (Иезег, 1984).

Интересным представляется феномен индукции разрывов ковалентно замкнутой кольцевой ДНК ионами меди в отсутствие супероксидного аниона. Складывается впечатление, что в различных буферных системах ионы меди вызывают однонитевые разрывы на разных этапах экспериментальной процедуры. Разрывы, индуцируемые медью в бикарбонатном буфере, происходят до стадии денатурации/ренатурации и успевают привести к расплетанию ковалентно замкнутой кольцевой ДНК, в отличие от однонитевых разрывов, происходящих в глициновой системе (рис. 5) после стадии щелочного расплетания, в результате чего флуоресценция проб увеличивается вследствие снятия топологических ограничений взаимодействия бромистого этидия с ДНК.

Концентрация (ГиБО,), мМ

Рис. 4. Степень деградации (О) линейной хромосомной ДНК и суммарной РНК в условиях генерации активных форм кислорода в зависимости от концентрации Си504: 1 - РНК в бикарбонатном буфере; 2 - ДНК в бикарбонатном буфере; 3 - РНК в глициновом буфере; 4 - ДНК в глициновом буфере

Рис. 5. Степень деградации (D) ковалентно замкнутой кольцевой ДНК плазмиды pBR322 в условиях генерации активных форм кислорода в зависимости от концентрации Q1SO4 и после обработки CuS04 без гидроксиламина; 1 - C11SO4 с гидроксиламином в бикарбонатном буфере; 2 -то же в глициновом буфере; 3 - C11SO4 без гидроксиламина в бикарбонатном буфере; 4 - то же в глициновом буфере.

Рассматривая результаты экспериментов в целом, необходимо, прежде всего, отметить, что наши данные согласуются с распространенной в настоящее время точкой зрения, согласно которой наибольший вклад в биологическое повреждение вносят гидроксильные радикалы (Rozenberg-Arska et all., 1985; Marnett, 2000; Fridovich, 2000 и др.), так как деструктивный эффект использованной системы генерации супероксидного аниона по отношению к нуклеиновым кислотам проявляется только при введении в

реакционную смесь ионов Си2+. Выраженное защитное действие маннита, обнаруженное в экспериментах с ковалентно замкнутой кольцевой ДНК, также прямо указывает на участие гидроксильных радикалов в возникновении обнаруженных нами однонитевых разрывов. Для линейных форм нуклеиновых кислот значительного защитного эффекта маннита от активных форм кислорода, генерируемых в нашей системе, не обнаружено, что указывает на различие механизмов разрушения кольцевых и линейных форм нуклеиновых кислот.

В рамках наших экспериментальных условий с большей эффективностью протекают процессы разрушения линейных молекул нуклеиновых кислот, по сравнению с ковалентно замкнутыми кольцевыми. Для объяснения подобных эффектов мы хотим предложить следующий механизм: замыкание ДНК в кольцо делает менее доступными для повреждающих воздействий высокореактивные 3' и 5' - концы нуклеиновых кислот. Разрушение линейных молекул нуклеиновых кислот АФК, возможно, идет по принципу "концевой атаки" - неферментативного аналога экзонуклеазной активности, а кольцевых молекул - по принципу разрывного действия - неферментативного аналога эндонуклеазной или никазной активности. При концевой атаке идет связывание ионов, в данном случае Си2+, с 3'- или 5'-концами нуклеиновых кислот с последующим их разрушением гидроксильными радикалами.

Защитный эффект маннита, обнаруженный только для ковалентно замкнутой кольцевой ДНК (рис. 6), можно объяснить образованием высокореактивного комплекса меди с концевыми участками линейной ДНК. По-видимому, различия в устойчивости кольцевых и линейных нуклеиновых кислот объясняются разной эффективностью реакций "концевой атаки" и "разрывного действия".

В то же время необходимо отметить, что замкнутость - не единственное отличие плазмидной ДНК от хромосомной. Можно предположить, например, влияние степени суперспиральности, химических модификаций нуклеотидов и их последовательности на устойчивость нуклеиновых кислот к активным формам кислорода. Однако результаты подробного исследования разрушения плазмидной ДНК АФК, генерируемыми с участием меди, показали, что скорость разрушения плазмид практически не зависит ни от последовательности нуклеотидов, ни даже от присутствия вставок Z-ДНК и крестообразных структур (Reed, Douglas, 1991).

Большая устойчивость ковалентно замкнутых кольцевых ДНК к действию активных форм кислорода позволяет, естественно, с некоторой долей приближения, объяснить ряд важнейших биологических феноменов, а, именно, ответить на вопрос: почему ДНК в одних случаях имеет линейную, а в других - кольцевую конфигурацию? Известно, что кольцевые формы ДНК присутствуют либо у прокариот, где клеточная ДНК соседствует с системами переноса электронов, способными генерировать активные формы кислорода

(Freeman-Bruce , 1984), либо в митохондриях и хлоропластах эукариот, где существуют аналогичные условия.

Концентрация маннита, мМ

-»-РНК -«-Хромосомная ДНК -а-рВЯ-322

Рис. 6. Зависимость степени деградации (0%) препаратов нуклеиновых кислот в условиях генерации АФК от концентрации маннита.

С различиями в устойчивости к активным формам кислорода связаны, возможно, и различия в эффективности трансформации бактерий линейной и ковалентно замкнутой кольцевой плазмидной ДНК, а также необходимость замыкания фаговых ДНК в кольцо при проникновении в клетку. Известно также, что, хотя нуклеиновые кислоты появились в процессе эволюции еще на восстановительных стадиях биопоэза, при облучении ультрафиолетовым светом даже в этих условиях могут возникать активные формы кислорода (РезЬкш, 5ЫуасЬо\'а, 1986). Присутствие в первичном бульоне значительного количества ионов металлов переменной валентности должно было локализовать мощные центры источников свободных радикалов и перекисей, эффективно разрушающих линейные формы нуклеиновых кислот. В подобной ситуации наиболее эффективной, если не единственной формой "самозащиты", могло быть образование и селективный отбор кольцевых форм ДНК. Этот способ защиты от активных форм кислорода, возникший до появления кислорода в атмосфере, мог оказаться впоследствии эффективным способом защиты нуклеиновых кислот от окислительного стресса. Наши эксперименты проведены на относительно короткой (4362 п.н.) плазмидной

ДНК, однако известны факты, указывающие на повышенную устойчивость к действию АФК и митохондриальной ДНК, являющейся, в отличие от плазмид, необходимым элементом генетического аппарата эукариотической клетки.

Большая устойчивость кольцевых ДНК к деструктивному действию активных форм кислорода позволяет объяснить широко известный феномен лучшей сохранности митохондриальной ДНК в архивных препаратах, археологических и палеонтологических образцах (Макаров и др. 2001), поскольку АФК - это один из основных деструктивных факторов, действующих на ДНК при ее хранении (Sambrook et al., 1989; Черенкова и др., 2002). Полученные результаты были использованы нами в работе по оптимизации методов сбора и консервации ДНК-содержащих образцов для «Национальной генетической коллекции ДНК-содержащих образцов осетровых рыб», созданной на базе Всероссийского научно-исследовательского института рыбного хозяйства и океанографии, в которых был выявлен оптимальный набор тканей и методов консервации вышеназванных образцов (Войнова и др., 2000; Корниенко и др., 2002; Черенкова и др., 2002).

Клеточный уровень: чувствительность микроорганизмов к индукторам окислительного стресса, участие дыхательной системы дрожжей-сахаромицетов в защите от токсического действия кислорода

Способность АФК атаковать нуклеиновые кислоты лежит в основе токсического действия, а также генетических эффектов, вызываемых индукторами окислительного стресса. Развивающиеся при этом процессы значительно сложнее, чем взаимодействия АФК/ДНК in vitro. Благодаря длительности сосуществования живых систем и кислорода, взаимодействие АФК со структурами клетки опосредовано промежуточными этапами, связанными с защитными системами, внутриклеточными барьерами и т. д.

Результаты многочисленных исследований показали, что штаммы аэробных микроорганизмов, не подвергавшиеся специальной селекции, проявляют значительную, по сравнению с высокоорганизованными эукариотами, устойчивость к токсическому действию кислорода.

В то же время, комбинация аскорбата и металлов оказывает значительное токсическое действие на микроорганизмы даже в условиях нормобарии. Как показано в наших работах (Чистяков и др., 2002; Чистяков, 2003), эффект усиления характерен для мембранотропного действия системы металлы/аскорбат, регистрируемому по подавлению биолюминесценции светящихся бактерий (Bulich, 1979; Чистяков и др., 2002).

Добавление аскорбиновой кислоты в нетоксичной концентрации 20 мг/л усиливает токсичность ионов марганца, железа и меди, но не цинка, для которого при концентрации 0,1 мг/л отмечен достоверный протекторный эффект. Наибольший эффект усиления обнаружен для меди. Концентрация 0,05 мг/л, которая в 20 раз меньше минимальной действующей концентрации для ионов меди без аскорбата, в его присутствии дает почти 100%-ное

подавление свечения культуры бактерий. Мощные синергические эффекты такого рода были зарегистрированы для марганца и двухвалентного железа. Для трехвалентного железа синергический эффект обнаружен только для концентрации 1 мг/л. Различия в способности аскорбата потенцировать мембрано- и ДНК-тропные эффекты металлов, очевидно, объясняются различной доступностью для них соответствующих мишеней. Таким образом, ограничение генетического аппарата клетки гидрофобной мембраной также можно рассматривать как один из первых, пассивных механизмов защиты от АФК.

Низкая чувствительность микроорганизмов к токсическому и ДНК-тропному действию кислорода под давлением, в отличие от других индукторов окислительного стресса, позволяет поставить вопрос о поиске кислород-протекторных механизмов, не связанных непосредственно с перехватом АФК. Согласно предположению Скулачева (1994), таким механизмом может быть индукция дыхания, в результате которой падает внутриклеточное напряжение кислорода. Однако дыхательная система, безусловно, способная «сжигать» кислород, одновременно способна и генерировать АФК. Для изучения этих взаимосопряженных процессов нами была исследована биохимия чувствительных к кислороду мутантов дрожжей-сахаромицетов, имеющих одну из самых эффективных дыхательных систем.

В наших публикациях 1985-1996 гг. был описан феномен чувствительности к гипербарической оксигенации дыхательных мутантов, полученных на основе гаплоидного штамма Saccharomyces cerevisiae (Guskov, Chistyakov, 1985; Чистяков, 1986; Чистяков, Водолажский, 1996). В то же время известно, что существующие в природе и используемые в промышленности штаммы дрожжей диплоидны. Диплоидные формы более устойчивы к действию многих экстремальных факторов среды, повреждающих ДНК, за счет значительно меньшей вероятности проявления рецессивных летальных мутаций (Захаров и др., 1980). В данном разделе приведены результаты биохимических исследований серии дыхательных мутантов, полученных на основе диплоидного штамма.

Материалом для выделения дыхательных мутантов служил штамм Saccharomyces cerevisiae Д-248 из Петергофской генетической коллекции, использованный нами ранее для исследования токсичности и генотоксичности ГБО для микроорганизмов (Гуськов и др., 1987). Этот штамм был выбран как несущий мутацию ade2-278, придающую колониям красную окраску, что облегчает выделение дыхательных мутантов.

Для получения дыхательных мутантов была использована методика, основанная на обработке дрожжей бромидом этидия. По данным авторов методики (Meyer, Whittaker, 1977), выделенные при помощи бромида этидия дыхательные мутанты дрожжей полностью теряют митохондриальную ДНК, т.е. являются rho°.

Исследование чувствительности к ГБО 25 диплоидных дыхательных мутантов, независимо выделенных под действием бромида этидия, показало,

что, в отличие от исходного штамма, все они полностью гибнут после 22-часовой обработки кислородом при давлении 0,7 МПа.

Шесть независимо выделенных дыхательных мутантов были использованы для исследования их биохимических характеристик в связи с чувствительностью к ГБО.

Как видно на рис. 7, гЬо~ мутанты, полученные на основе диплоидного штамма дрожжей, отличаются чувствительностью к кислороду под давлением. Трехчасовая обработка дыхательных мутантов ГБО приводит к статистически значимому падению выживаемости. Выживаемость штамма Д-248 при этих условиях - 100%. Десятичасовая обработка ГБО приводит к полной гибели гЬо-, выживаемость исходного штамма - 60%.

140 - -

120 .......................

100 --<■

С «О -------

о Е ь га а

16° .......

л ш

АО 4----------

20 О

0123456789 10 11 12 Время ГБО во здействия, ч

Рис. 7. Выживаемость исследованных штаммов дрожжей сегехч.ч/ас после воздействия ГБО при давлении 0,7 МПа

Двухчасовая экспозиция при давлении 0,7 МПа была выбрана нами для биохимических исследований как подпороговая по выживаемости для всех штаммов.

Существование различий по выживаемости после ГБО для г!ю~ и дикого штамма и отсутствие таких различий между дыхательными мутантами хорошо согласуется с данными по содержанию в них ТБК-положительных продуктов (рис. 8). Этот параметр широко используется в качестве показателя уровня окислительного стресса. Содержание ТБК-положительных продуктов у исследованных мутантов в норме не превышает его содержания у дикого штамма — 0,450+0,017 усл. ед./мг белка. Средняя

» (Д-248)

-с1 р2

--с1рб

--с1р7

- . -с)р8

— с!р10 •• с)р11

величина содержания ТБК-положительных продуктов у дыхательных мутантов составляет 0,235+0,026 усл. ед./мг белка.

После ГБО в исследованной нами дозе уровень ТБК-положительных продуктов статистически значимо возрастал для всех дыхательных мутантов, но не для исходного штамма. Увеличение этого показателя варьирует от 88 % у штамма с!р7 до 15 % у штамма ёр11.

Средний рост уровня ТБК-положительных продуктов у дыхательных мутантов составляет 37+11 %. Судя по этому показателю, перекисное окисление липидов стимулируется при ГБО у всех исследованных дыхательных мутантов, но остается на уровне контроля у дикого штамма. Данный факт указывает на большую доступность мембран дыхательных мутантов для деструктивного действия кислорода, либо на большую интенсивность продукции АФК.

0,5 ------—.......-

р-Ьо+ с1р2 с)р6 с!р7 с(р8 фЮ с)р11

Штамм

Рис. 8. Содержание ТБК-положительных продуктов у гЬо+ и г1ю~ штаммов cerevisiae в норме (темные прямоугольники) и после ГБО (светлые прямоугольники)

Повышенный, по сравнению с г1ю~ , уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) у дикого штамма связан, очевидно, с анаэробным характером метаболизма у гЬо- и свидетельствует о том, что при нормоксии образование значительной части продуктов ПОЛ связано с функционированием дыхательной системы.

Способность дыхательной системы дрожжей быть эффективным генератором АФК подтверждена данными работы (Guidot et al., 1993), где показано, что дыхательные мутанты дрожжей (rho°), в отличие от rho+, способны расти после полной потери медноцинковой супероксиддисмутазы.

Предположение об участии соединений, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в летальном действии ГБО на дрожжевую клетку, нашими данными не подтверждается, так как, несмотря на рост после ГБО, уровень этого показателя у штаммов гЬо^ниже, чем у rho+.

Важнейшим показателем, отражающим работу кислород-протекторных систем клетки, является активность ферментов, способных перехватывать активные формы кислорода: супероксиддисмутазы, каталазы, пероксидазы (рис. 9, 10, 11).

Определение активности СОД у диплоидных штаммов показало, что этот показатель существенно (в 2—4 раз) меньше у дикого штамма, чем у rho~ (рис. 9). Максимальная суммарная супероксиддисмутазная активность в норме отмечена для штамма dpi 1 (85,4+3 ед/мг белка).

100

rho+ dp2 dp6 dp7 dp8 dplO dpll

Штамм

Рис. 9. Супероксиддисмутазная активность гЬо+ и гЬо~ штаммов в норме (темные прямоугольники) и после ГБО (светлые прямоугольники).

Минимальная супероксиддисмутазная активность при нормоксии у дикого штамма — 25,7+2,2 ед/мг белка. После воздействия ГБО в дозе 20,7 МПа, супероксиддисмутазная активность дикого штамма индуцируется и достигает 43,4+1,3 ед/мг белка (увеличение в 1,7 раза). У дыхательных

мутантов активность этого фермента падает в среднем на 27 %. Максимальное падение активности СОД характерно для штамма dpi 1 и составляет 39%.

Повышенное содержание СОД у rho~ объясняется, по-видимому, тем, что супероксиддисмутаза берет на себя функции каких-то других, нефункционирующих компонентов системы защиты от кислорода, причем активность СОД у rho~ максимальна, и не может больше индуцироваться при увеличении содержания супероксид-аниона под действием ГБО.

При исследовании гаплоидных штаммов наблюдалась аналогичная картина, за исключением того, что различия между диким типом и rho- были значительно больше, максимальное превышение было семикратным; более выраженными были и различия между штаммами, дефицитными по дыханию.

Примечательно, что максимальное превышение супероксид-дисмутазной активности у rho", по сравнению с диким штаммом (в 4 раза у диплоидных штаммов и в 7 раз у гаплоидных (Чистяков, Водолажский, 1996), близко к данным по увеличению содержания СОД при росте дрожжей-сахаромицетов в атмосфере чистого кислорода (в 6,5 раза) (Gregory et al., 1974). Эти данные подтверждают наше предположение о максимальном синтезе СОД у rho- при нормоксии. Уменьшение активности супероксиддисмутазы является следствием инактивации этого фермента перекисью водорода (Фридович, 1979; Гоготов, 1981; Imlay, 2008) и, возможно, подавлением синтеза белка rho- под действием ГБО (Brown et al., 1979).

Очевидно, что различия по активности данного фермента не могут лежать в основе различий по выживаемости, что, однако, ни в коей мере не противоречит представлениям о супероксиддисмутазе, как одном из основных элементов системы защиты от кислорода.

По суммарной каталазной активности между исходным диплоидным штаммом и rho' нет таких очевидных различий, как для супероксиддисмутазы (рис. 10). Максимальная каталазная активность отмечена для штаммов dp6 и dp7. Удельная каталазная активность штамма дикого типа и мутантов dp8 dplO составляет 240-260 ед/мг белка. Штаммы dp2 и dpi 1 в норме имеют минимальную активность каталазы 207+12 и 220+8 ед/мг белка, соответственно. У штаммов dp7, dp8 и dp 11 после обработки ГБО активность каталазы статистически значимо не изменяется, в то время как у штамма дикого типа она уменьшается на 17 %, у штаммов dp2, dp6, dplO на 16 %, 32 % и 15 %, соответственно. В среднем снижение уровня активности каталазы для дыхательных мутантов составляет 10,5+5,2%. Индукции каталазы ни в одном случае не обнаружено.

Падение каталазной активности после ГБО, очевидно, объясняется способностью супероксид-аниона инактивировать этот фермент (Shimizu et al, 1984; Fridovich, 1999). Для гаплоидных штаммов нами ранее была получена качественно сходная картина. Для гаплоидных rho" были характерны больший размах вариаций между штаммами и более выраженное

подавление активности каталазы после ГБО.

Различия между исследованными нами диплоидными штаммами по суммарной пероксидазной активности сходны с таковыми для каталазы (рис. 10,11).

350

г1ю<- с1р2 йрб ар7 аре йрю йри Штамм

Рис. 10. Каталазная активность гЬо+ и гЬо штаммов в норме (темные прямоугольники) и после ГБО (светлые прямоугольники).

гЬо+- с!р2 ир& с|р7 с!р8 брЮ с]р11

Штамм

Рис. 11. Суммарная пероксидазная активность гЬо+ и г!ю штаммов в норме (темные прямоугольники) и после ГБО (светлые прямоугольники).

Между этими показателями для различных штаммов существует тесная корреляция (г=0,95). При нормоксии максимальная пероксидазная активность, характерная для штаммов с!р6 и с1р7 — 36,0±1,1 и 32+0,9 ед/мг белка, соответственно. У остальных штаммов этот показатель в пределах 23—15 ед/мг белка. После воздействия ГБО в дозе 0,7 МПа 2 часа наблюдалось статистически значимое снижение удельной пероксидазной активности характерное для всех штаммов, кроме дикого штамма и ёр11. В среднем для дыхательных мутантов величина этого показателя снижается на 19±4%.

Отсутствие индукции каталазы и пероксидазы ГБО, а также то, что их активность у некоторых дыхательных мутантов, чувствительных к ГБО, выше или равна таковой для дикого штамма, указывает на то, что различия по активности этих ферментов, так же как и СОД, не играют существенной роли в развитии ГБО-чувствительности г1ю- штаммов.

Обсуждая полученные результаты, необходимо отметить, что наиболее вероятное объяснение обнаруженных фактов может быть дано в рамках гипотезы Скулачева (1994) о том, что основой кислородпротекторного действия дыхательной системы является понижение внутриклеточного р02 за счет связывания растворенного внутри клетки кислорода. В работе (Скулачев, 1996) приведен ряд примеров существования такого механизма у некоторых микроорганизмов, в частности, у некоторых азотфиксирующих бактерий. Логично предположить, что такая "побочная" функция дыхания (Скулачев 1994), не требующая никаких дополнительных механизмов, может эффективно осуществляться и у дрожжей, имеющих одну из самых мощных дыхательных систем среди эукариот (Берри, 1985).

Однако дыхательная система является одновременно и главным внутриклеточным генератором АФК. Соотношение защитного эффекта дыхания и деструктивного действия АФК для каждой экспериментальной модели индивидуально. Этим можно объяснить обнаруженную Озавой и сотрудниками низкую чувствительность к 95% кислороду линий фибробластов, не имеющих митохондрий (р~), по сравнению с дикими (р+) (Скулачев, 1996). После трех дней инкубации в условиях гипероксии большинство р+ клеток погибло, в то время как выживаемость р" была около 80 %. Очевидно, в данном случае причиной гибели клеток была генерация АФК дыхательной цепью митохондрий, о чем свидетельствует накопление делеций в митохондриальной ДНК выживших р+ клеток.

Можно предположить, что «древнейшая», «первичная в эволюционном плане» (Скулачев, 1994) функция дыхания мобилизуется клеткой в наиболее экстремальных состояниях, в частности, при действии высоких давлений чистого кислорода. В пользу этого предположения говорят представленные данные, свидетельствующие о том, что наличие или отсутствие митохондрий у различных штаммов дрожжей является фактором, предопределяющим различия в выживаемости клеток после действия токсических режимов ГБО (2 ч, 0,7 МПа). Различия по таким показателям, как уровень ПОЛ, активность

СОД, каталазы и пероксидазы, сами по себе, без анализа состояния митохондриальной системы, не в состоянии играть существенную прогностическую роль, хотя и необходимы для объяснения некоторых механизмов реализации защиты клеток от АФК.

Данный вывод применим не только к гаплоидным, но и к диплоидным штаммам дрожжей. Причем если первые существуют, в основном, как исследовательский инструмент, то вторые составляют основу природного разнообразия дрожжей, а также широко эксплуатируются человеком в биотехнологических процессах.

Ткани реликтовых видов как источник высокоэффективных смесей

антиоксидантов

Практическим следствием успехов в исследовании механизмов генерации АФК и защиты от них стали многочисленные попытки использования антиоксидантов для повышения адаптационных возможностей человека и животных, профилактики и лечения заболеваний. Высокая сложность естественных антиоксидантных механизмов, их системный характер, определяет тот факт, что одним из основных путей получения препаратов, способных корректировать неблагоприятные проявления свободнорадикальных реакций in vivo, является использование сложных смесей антиоксидантов, различные компоненты которых должны активировать разные защитные механизмы.

Усложнение воздействия позволит гармонизировать взаимодействие с клеточной антиоксидантной системой. Здесь можно надеяться на положительное следствие высокой сложности системы защиты от кислорода

Наряду с конструированием таких смесей из отдельных веществ, рациональные принципы которого в настоящее время не сформулированы, можно воспользоваться природными смесями - экстрактами из растений, животных и микроорганизмов. Причем, чем сильнее выражен в системе антиоксидантной защиты неспецифический компонент, тем больше вероятность сохранения ее активности при экстракции.

Увеличение специфичности, в том числе числа ферментов, участвующих в осуществлении биохимических функций - одна из основных закономерностей в эволюции живых организмов, поэтому высокую активность антиоксидантной защиты следует ожидать у древних, реликтовых форм.

Общеизвестно, что продолжительность существования различных таксонов значительно отличается (Гуськов, 1999, Жданов, 2000). Примером «эволюционного долгожительства» могут быть осетровые, которых в наши дни зачастую называют «живыми ископаемыми» (Макаров, Житенева, 2000).

Логично предположить, что представители долгоживущих видов обладают рядом древних адаптационных механизмов, позволяющих сохранить генофонд вида. Один из них может быть основан на защите ДНК от гидроксильного радикала при помощи низкомолекулярных антимутагенов.

На рис. 12 представлены данные по антиоксидантному действию экстрактов исследованных тканей. Ткани самцов и самок осетра по исследованному показателю достоверно не отличались, поэтому мы сочли возможным объединить их в одну выборку. Для чехони и пиленгаса половых различий по исследованному признаку также не отмечено. Все исследованные особи тарани были самками.

Как видно на рис. 12, антиоксидантная активность экстрактов исследованных тканей костистых рыб существенно ниже, чем у осетровых. Результаты, полученные для печени и гонад осетра, в 1,9 и 2,0 раза, соответственно, превышали таковую для чехони. Для тарани превышение составило 3,4 и 6,3 раза, для печени пиленгаса - 1,6 раза.

120

100

Рис. 12. Антиоксидантная активность экстрактов тканей рыб; 1 - русский осетр, печень, 2 - русский осетр, гонады, 3 - русский осетр, мышцы, 4 -севрюга, хрящ, 5 - пиленгас, печень, 6 - чехонь, печень, 7 - чехонь, гонады, 8 - тарань, печень, 9 - тарань, гонады.

Согласно данным литературы (Зиновьев и др., 1998; Когшепко й а!., 1999; Дудкин, 2000; 2001; 2002), ни по уровню активности ферментов антиоксидантной защиты, ни по содержанию токоферола и других низкомолекулярных антиоксидантов осетровые не отличаются принципиально от костистых рыб Азовского моря.

Можно предположить, что наблюдаемые различия по способности исследованных экстрактов защищать ДНК от перекиси водорода связаны именно с развитием неспецифических защитных механизмов.

Для большинства антиоксидантов характерны колоколообразные зависимости доза-эффект, существует максимально эффективная концентрация, уменьшение или увеличение которой одинаково приводит к ослаблению эффекта. Как показали наши исследования (Чистяков и др., 2001), эта закономерность сохраняется и для антимутагенной активности антиоксидантов. Поэтому максимальная величина эффекта может служить показателем «силы» антимутагенного действия антиоксиданта. Ранее было показано, что этот показатель для экстрактов тканей русского осетра превышает максимальные эффекты, полученные для токоферола и других антиоксидантов (Чистяков и др., 2001), что является доказательством существования у осетровых весьма эффективной системы антиоксидантов, способных защищать генетический аппарат.

Идентификация веществ, ответственных за антимутагенный потенциал тканей осетровых рыб, - это отдельная, весьма актуальная задача. Клеточная система защиты от ДНК-тропных воздействий включает ряд как ферментативных, так и неферментативных механизмов. Низкомолекулярные антиоксиданты - это лишь часть этой системы (Ames, 1989). Однако мы полагаем, что развитие этой части отражает эволюцию целого и, следовательно, позволяет получить представление о работе важнейшей части генетического аппарата гидробионтов в натурных условиях.

Молоки осетровых рыб используются в настоящее время в качестве сырья для производства препарата «Деринат». Наши данные позволяют надеяться, что и другие их органы могут быть использованы для получения биологически активных препаратов, а осетровые рыбы будут служить не только пищевым объектом, но и дополнительным источником веществ, защищающих генетический аппарат человека от деструктивных воздействий экзо- и эндогенных факторов, а также объектами, позволяющими изучать принципы «природного дизайна» эффективных антиоксидантных смесей.

Адресованное в митохондрии производное пластохинона как протектор от повреждения ДНК активными формами кислорода

Согласно современным представлениям, основным источником внутриклеточных АФК являются митохондрии. Адресная доставка в митохондрии антиоксидантов теоретически должна дать возможность, по образному выражению Скулачева, «очистить грязное место клетки», не увеличивая концентрацию антиоксидантов в других компартментах, где такое увеличение может быть бессмысленным или вредным. При этом содержание действующего вещества в пересчете на всю массу клетки будет ничтожно малым, что позволит избежать запуска природных механизмов, компенсирующих изменение антиоксидантного статуса клетки в сторону увеличения.

Под руководством академика Скулачева в 70-е годы XX века были разработаны теоретические основы конструирования липофильных органических катионов, способных накапливаться в митохондриях. По предложению Грина, такие молекулы были названы «Ионами Скулачева».

Попытки использования конструкций на основе трифенилфосфония, «нагруженных» альфа-токоферолом и убихиноном (mitoQ), оказались в целом неудачными из-за низкой терапевтической широты этих соединений. При этом наихудшие результаты были получены для производного токоферола - вещества, специфической функцией которого является защита мембран от свободно-радикального повреждения. Лучшие результаты на клеточных моделях были получены для производного убихинона, антиоксидантная функция которого является дополнительной по отношению к основной - участию в цепи переноса электронов. Однако исследования in vivo не выявили серьезных протекторных свойств mitoQ.

В 2003-2005 гг. был синтезирован ряд ионов Скулачева, «нагруженных» пластохиноном - метаболитом хлоропластов, обладающим высокими антиоксидантными свойствами и способностью к восстановлению при взаимодействии с дыхательной цепью митохондрий. Эти вещества показали целый ряд адаптогенных эффектов in vivo - от замедления старения до ускорения восстановления сердца, почек и мозга после ишемии-реперфузии. Применительно к теме работы отметим, что ряд веществ (токоферол, убихинон, пластохинон) можно охарактеризовать возрастанием неспецифичности в плане защиты митохондрий от АФК. Таким образом, использование растительного метаболита пластохинона в антиоксидантных конструкциях, предназначенных для животных, можно рассматривать как эксплуатацию его неспецифической антиоксидантной активности.

Задачей наших исследований было изучение способности наиболее активного из данной группы соединений - Ю-(б'-пластохинонил) децилтрифенил фосфония (препарата SkQl), модифицировать процессы спонтанного и индуцированного мутагенеза с последующим исследованием механизмов выявленных феноменов биохимическими методами.

В качестве мутагена - индуктора окислительного стресса был использован кислород под давлением.

Результаты экспериментов (рис. 13) показали, что двухнедельное введение крысам самцам Wistar препарата SkQl в дозах 25 и 250 нМ/кг статистически значимо снижает уровень аберраций хромосом в эпителиоцитах роговицы глаза более чем в три раза - с 0,37 % до 0,13 % и 0,14 %, соответственно. Большинство перестроек хромосом (60 %) представляют собой хроматидные фрагменты. В целом, 88 % от всех хромосомных аберраций связаны с фрагментацией ДНК.

После действия использованного режима ГБО - 0,5 МПа 60 мин, в эпителиоцитах роговицы животных регистрировался повышенный уровень аберраций хромосом, который более чем в 2 раза превышал контрольное значение. При этом наблюдалось увеличение как числа хроматидных фрагментов, так и хроматидных мостов. Статистически значимого

подавления индуцированного ГБО мутагенеза при введении малой дозы БкСМ (25 нмоль/кг в день), не обнаружено. Более высокая доза 5к<21 (250 нмоль/кг в день) снижала частоту аберраций хромосом, индуцированную окислительным стрессом, до уровня контроля.

1.4

день день вдень нмоль/нги

день

Рис. 13, Влияние БкСН на фоновую частоту аберраций хромосом и кластогенный эффект гипребарической оксигенации в эпителиоцитах роговицы глаз крыс.

Пролиферативная активность эпителия роговицы, определяемая по митотическому индексу, в контроле составила 1,6+0,2 %. Обработка ГБО не вызвала статистически значимых изменений пролиферативной активности, митотический индекс составил 1,8+0,1 %. В варианте с введением 25 нмоль/кг в день 8к()1 митотический индекс также не отличался от контроля (1,5+0,12 %).

При введении большей дозы зарегистрировано достоверное (1:-критерий, р<0,05) повышение митотического индекса до 2,7 % (в 1,68 раза). Обработка ГБО на фоне меньшей дозы ЭкО! не вызвала статистически значимых изменений этого показателя.

После обработки ГБО у животных, получавших большую дозу БкСН, регистрировали статистически значимое уменьшение пула митотических клеток до уровня 1,2+0,1 %, составляющего 75 % от интактного контроля. По современным представлениям, такие отклонения находятся в пределах физиологической нормы.

Результаты определения 8-ОН-2-дезоксигуанозина в сыворотке крови исследованных животных (рис. 14) показали, что содержание этого вещества в контроле составило 32,12+1,55 нг/мл. Введение животным 8кС>1 в дозе 25 нмоль/кг снизило его до 25,90+2,26 нг/мл. Введение большей дозы - до 25,76+1,50 нг/мл.

20 15 10

5 0

Контроль

5кСЦ 25 нмоль/кг в день

БкСЦ 250 нмоль/кг в день

Рис. 14. Содержание 8-ОН-2-дезоксигуанозина (8-ОНсЮ) в сыворотке крови животных после введения ЭкСН. Различия между контрольной и опытными группами статистически значимы (^-критерий, ¿><0,0.5).

К настоящему времени накоплен ряд фактов, свидетельствующих о связи мутагенеза и старения. Во-первых, генетические аномалии накапливаются с возрастом. Во-вторых, прогероидный эффект наблюдается практически для всех воздействий, нарушающих работу генетического аппарата, а его выраженность связана со степенью повреждения. В-третьих, прогероидный эффект имеют мутации, связанные с дефектами репарации ДНК. Описание действия любого потенциального геропротектора без учета его влияния на процессы мутагенеза отличалось бы существенной неполнотой. Старение многоклеточных организмов сопровождается, а, возможно, и обеспечивается прогрессирующим уменьшением числа клеток.

Поэтому при изучении влияния препарата БкСН на спонтанный мутагенез, руководствуясь формальной логикой, мы обратили внимание на наиболее разрушительные для клетки генетические аномалии - аберрации хромосом, выявляемые в анафазном тесте.

Обе исследованные дозы 8к(21 вызывают снижение спонтанного уровня таких событий. Этот феномен может быть вызван разными факторами. Образование хромосомных аберраций - процесс, который осуществляется десятками ферментов с использованием энергии АТФ. Поэтому, в принципе, снижение их частоты может быть проявлением угнетения метаболизма. Считать вклад такого механизма в развитие наблюдаемого феномена незначительным позволяют данные по пролиферации. Ни одна из доз, подавляющих спонтанный мутагенез, не снижает митотического индекса, т.е. не угнетает деления клеток.

«Позитивные» факторы, способные вызвать подавление спонтанного мутагенеза, можно разделить на две группы. Первая группа связана с изменением настройки репарационных механизмов. Превращение повреждения ДНК в морфологически различимую хромосомную аномалию

опосредовано активностью механизмов склонной к ошибкам репарации. Поэтому снижение частоты аберраций может быть связано с активацией безошибочной репарации. Вторая группа факторов связана со снижением уровня первичных повреждений ДНК. Способность продуктов одноэлектронного восстановления кислорода и перекисного окисления липидов индуцировать повреждения, ведущие к формированию хромосомных аберраций, достаточно точно установлена (Машей, 2000). Эти вещества постоянно генерируются митохондриями. Логично предположить, что исследованный препарат, подавляя фоновую генерацию митохондриальных АФК (Скулачев, 2009), снижает и содержание эндогенных соединений, повреждающих ДНК.

Обе исследованные дозы препарата вызывают статистически значимое снижение содержания 8-ОН-2-дезоксигуанозина в сыворотке (рис. 14). Отметим, что репарация окислительных повреждений ДНК связана с вырезанием 8-ОНсЮ. Поэтому, если бы Бкр 1 работал как активатор репарации, мы получили бы эффект, обратный наблюдаемому.

Таким образом, можно предположить, что главным механизмом супрессии 5к<31 фонового уровня образования хромосомных аберраций является снижение количества генотоксичных продуктов взаимодействия активных форм кислорода с биомолекулами.

Эксперименты по модификации БкСН индуцированного мутагенеза были проведены с целью поиска адаптогенных свойств этого препарата, не связанных непосредственно с геропротекторной активностью.

Гипербарическая оксигенация достаточно широко применяется в клинике. Все большее количество здоровых людей подвергается действию давления кислорода при глубоководных погружениях. При этом парциальное давление кислорода приближается к уровню терапевтических режимов ГБО. Мутагенный эффект такого воздействия описан в ряде работ (Гуськов, Шкурат, 1986; в из ко V е1 а1., 1990). Как показали результаты наших исследований, ионы Скулачева с антиоксидантной нагрузкой могут быть использованы для защиты от кислородного мутагенеза.

Заключение

Таким образом, рассматривая аэробный метаболизм в целом, необходимо учитывать, что помимо основных функций, клеточные процессы и структуры несут определенную «антиоксидантную нагрузку». При этом эффективность неспецифических защитных механизмов достаточно велика.

Наши исследования показали наличие высокой антиоксидантной активности солей марганца, таких распространенных метаболитов, как аллантоин и аминокислоты; а также существование как минимум двух высокоэффективных неспецифических механизмов защиты от окислительного стресса. Замыкание ДНК в кольцо защищает молекулы от разрушения гидроксильным радикалом. Удаление избыточного кислорода

дыхательной системой митохондрий дрожжевых клеток защищает их от токсического действия кислорода под давлением.

Именно совокупность специфических и неспецифических антиоксидантов создает антиоксидантный потенциал организма, величина которого имеет важнейшее адаптивное значение. Результаты исследования неспецифических кислород-протекторных механизмов могут быть успешно внедрены в самых различных областях практической деятельности - от разработки эффективных систем мониторинга качества среды до создания высокоэффективных лекарственных препаратов и пищевых добавок.

ВЫВОДЫ

1. Ионы марганца защищают ДНК от активных форм кислорода, генерируемых при разложении перекиси водорода in vivo и in vitro.

2. Аллантоин способен эффективно подавлять индукцию мутаций и SOS-ответа у E.coli, вызванную перекисью водорода.

3. Аминокислоты обладают супероксидустраняющей активностью. Максимальную активность проявляет лизин.

4. Кислород под давлением и генерация супероксид-аниона за счет аутоокисления гидроксиламина в щелочной среде не способны разрушать первичную структуру нуклеиновых кислот. Генерация супероксид-аниона в присутствии ионов меди вызывает разрушение структуры молекул нуклеиновых кислот. ДНК-тропный эффект возрастает в ряду: РНК, линейная ДНК, кольцевая ковалентно замкнутая ДНК.

5. Маннит защищает ковалентно замкнутую кольцевую, но не линейную ДНК, от разрушения при генерации супероксид-аниона в присутствии ионов меди.

6. Дыхательные мутанты дрожжей чувствительны к дозам ГБО, подпороговым для дикого штамма.

7. Различную чувствительность rho~ и rho+ штаммов невозможно объяснить различиями по активности супероксидцисмутазы, каталазы и пероксидазы - основных перехватчиков активных форм кислорода.

8. Экстракты тканей рыб подавляют вызванную перекисью водорода SOS-индукцию у E.coli. Препараты из осетровых рыб обладают большей активностью по сравнению с препаратами из костистых рыб.

9. Адресованное в митохондрии производное пластохинона - 10-(6'-пластохинонил) децилтрифенил фосфоний (SkQl) в дозах 25 и 250 нмоль/кг защищает ДНК крыс от повреждения активными формами кислорода in vivo.

10. Помимо основных функций, некоторые клеточные процессы и молекулярные структуры образуют систему неспецифических механизмов защиты от кислорода, сформировавшихся на ранних этапах развития аэробной жизни. В связи с чем их исследование дает

возможность лучше представить этапы эволюции современных метаболических путей и клеточных структур.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Чистяков В.А. Деградация нуклеиновых кислот в условиях генерации супероксид-аниона в присутствии ионов меди / Водолажский Д.И., Чистяков В.А., Гуськов Е.П., Шерстнев К.Б. // Молекулярная биология. 1987. Т. 21, №6. С. 1664-1670 (0,33 п.л., личн. вк. 25%).

2. Чистяков В.А. Участие дыхательной системы дрожжей-сахаромицетов в защите от токсического действия кислорода / Чистяков В.А., Водолажский Д.И. // Биохимия. 1996. Т. 61, №9. С.1610 - 1614 (0,21 пл., личн. вк. 50%).

3. Чистяков В.А. Усиление токсического действия металлов аскорбиновой кислотой / Чистяков В.А., Водолажский Д.И.. Тимошкина H.H., Войнова

H.В. // Экология. 2002. Т.ЗЗ, №4. С. 331-333. (0,13 пл., личн. вк. 25%)

4. Чистяков В.А. Аллантоин как тушитель свободных радикалов / Гуськов Е.П., Клецкий М.Е., Корниенко И.В., Олехнович Л.П., Чистяков В.А., Шкурат Т.П., Прокофьев В.Н., Жданов Ю.А. // ДАН, серия Биохимия, Биофизика. 2002. Т.383, № 2. С.105-107 (0,13 пл., личн. вк. 12,5%).

5. Чистяков В.А. Интенсивность свободнорадикальных процессов в гомогенатах метаболически-активных тканей русского осетра Acipenser gueldenstaedtii (Acipenseridae) как показатель пригодности тканей для генетического коллекционирования / Черенкова И.Ф., Чистяков В.А.. Тимошкина H.H., Соколова И.В. // Вопросы ихтиологии. 2003. Т. 43, №

I. С. 142-144 (0,13 пл., личн. вк. 25 %).

6. Чистяков В.А. Окислительный стресс - как один из основных механизмов токсического действия тяжелых металлов / Чистяков В.А. // Известия вузов. Естественные науки. Северо-Кавказский регион. Приложение 2003. №7. С. 65-69 (0,21 пл., личн. вк. 100 %).

7. Чистяков В.А. Биохимические механизмы кислородного мутагенеза у микроорганизмов / Чистяков В.А. // Известия вузов. Северо-Кавказский регион. Приложение. 2003.- №11. С. 57-63. (0,21 пл., личн. вк. 100%)

8. Чистяков В.А. Хрящевая ткань как источник биологически активных веществ / Чистяков В.А. // Вопросы рыболовства. 2004. Т. 17, №1. С. 174-178 (0,21 пл., личн. вк. 100 %).

9. Чистяков В.А. Аллантоин как витамин / Гуськов Е.П., Прокофьев В.Н., Клецкий М.Е., Корниенко И.В., Гапуренко О. А., Олехнович Л.П., Чистяков В.А., Шестопалов A.B., Сазыкина М.А., Маркеев A.B., Шкурат Т.П., Малхосян С.Р., Жданов Ю.А. // ДАН, серия Биохимия, Биофизика. 2004. Т.398, № 6. С.823-827 (0,21 пл., личн. вк. 8 %).

10. Чистяков В.А. Супероксидустраняющая активность некоторых аминокислот в водных растворах / Чистяков В.А., Корниенко И.В.,

Клецкий М.Е., Корниенко И.Е., Лисицын A.C. Новиков В.В. // Биофизика. 2005. Т. 50, №4 С. 601-605 (0,21 пл., личн. вк. 17%).

11. Чистяков В.А. Неспецифические механизмы защиты от деструктивного действия активных форм кислорода / Чистяков В.А. // Успехи современной биологии. 2008. ВЫП. 128, № 3, С. 301-308 (0,33 пл., личн. вк. 100 %).

12. Чистяков В.А. Роль аллантоина в процессах репродукции /ШкуратТ.П., Ломтева С.В., Александрова A.A., Азарин К.В., Чистяков В.А. // Валеология. 2008. № 4. С. 32-37 (0,25 пл., личн. вк. 20 %).

13. Чистяков В.А. Антиоксидантный потенциал некоторых природных азотсодержащих соединений / Чистяков В.А., Азарин К.В., Усатов A.B. // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2008. №5. С. 75-77 (0,125 пл., личн. вк. 33%).

14. Чистяков В.А. Неферментативные механизмы контроля уровня активных форм кислорода / Азарин К.В., Чистяков В.А., Усатов A.B. // Валеология. 2008. №3, С. 68-74 (0,29 пл., личн. вк. 33%).

15. Чистяков В.А. Супероксидустраняющая активность природных азотсодержащих соединений / Азарин К.В., Чистяков В.А., Усатов A.B. // Валеология. 2008. №2, С. 38-43. (0,25 пл., личн. вк. 33%).

16. Чистяков В.А. Аллантоин и урат как супрессоры генотоксического эффекта ультрафиолетового излучения длиной волны 300 - 400 нм / Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Коленко М.А., Азарин К.В. // Экологическая генетика. 2009. Т. 7, № 2. С. 44-46 (0,125 пл., личн. вк. 20%).

17. Чистяков В.А. Реликтовые формы как источник эффективных смесей антиоксидантов / Чистяков В.А., Сазыкина М.А. // Валеология. 2009. №2, С. 59-63 (0,21 пл., личн. вк. 50 %).

18. Чистяков В.А. Возрастная потеря клеточности: исследование in silico / Чистяков В.А., Денисенко Ю.В. // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). 2009. Т. 53, №3. С.. 105-110 (0,25 пл., личн. вк. 50 %).

19. Чистяков В.А. Антимутагенная активность производного пластохинона, адресованного в митохондрии / Чистяков В.А., Сазыкина М.А., Александрова A.A., Беличенко Н.И., Машкина Е.В., Гутникова Л.В., ЗолотухинП.В., ШкуратТ.П. //Биохимия. 2010. Т. 75, № 3, С. 331-336 (0,25 пл., личн. вк. 14%).

Авторские свидетельства и патенты

20. Чистяков В.А. Способ определения супероксидустраняющей активности / Чистяков В.А., Голубев Г.А., Лисицин A.C. // Авторское свидетельство №1793375. Зарегистрировано 8.10.1992 (личн. вк. 33%).

21. Чистяков В.А. Способ определения генотоксичности химических веществ / Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Войнова Н.В. // Патент РФ № 2179581. 2001 (личн. вк. 33%).

22. Чистяков В.А. Способ хранения ДНК / Чистяков В.А., Мирзоян A.B., Тимошкина H.H., Рынза Е.Т., Азарин К.В. // Патент на изобретение № RU 2352636 С1. 2007 (личн. вк. 20%).

23. Чистяков В.А. Способ иммобилизации образцов ДНК / Чистяков В.А., Мирзоян A.B., Тимошкина H.H., Рынза Е.Т., Мухоньков М.М., Барминцев В.А. // Патент на изобретение RU 2346984 С2. 2008 (личн. вк. 25%).

Список работ, опубликованных по теме диссертации: Монографии н глава в коллективной монографии.

24. Чистяков В.А. Новые технологии в рыбохозяйственных исследованиях / Войнова Н.В., Чистяков В.А., Корниенко И. В., Барминцев В.А. // Ростов-на-Дону: Эверест. 2001. 112 с. (4,7 п.л., лич. вк. 25,8 %).

25. Чистяков В.А. Генотоксичность и антимутагенная активность в тканях осетровых рыб Азовского моря / Чистяков В.А., Дудкин С.И., Сазыкина М.А., Тимошкина H.H. // Среда, биота и моделирование экологических процессов в Азовском море / под ред. Матишова Г.Г. Аппатиты: изд-во Кольского научного центра РАН. 2001. С. 218-226 (0,33 п.л. лич. вк. 25,8%).

26. Чистяков В.А. Биохимические механизмы неспецифической защиты клетки от окислительного стресса / Чистяков В.А., Сазыкина М.А. // Ростов-на-Дону: Издательство ЮФУ. 2009. 158 с. (6,6 п.л. личн. вк. 51%).

Статьи и тезисы

27. Чистяков В.А. Коррекция артефактов SOS-lux теста, связанных с подавлением активности люциферазы / Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Птицын Л.Р. // Тез. докл. 2-ого съезда Вавилонского общества генетиков н селекционеров. Т. 2 С-Пб.: Изд-во НИИ химии СПбГУ. 2000. С. 170-171 (0,08 п.л., личн. вк. 33%).

28. Чистяков В.А. Осетровые рыбы как потенциальный источник биологически активных веществ / Чистяков В.А., Сазыкина М.А., Гартунг В.В., Дудкин С.И. // Тезисы докл. науч.-практ. конф. «Проблемы и перспективы развития аквакультуры в России». Краснодар: «Здравствуйте». 2001. С. 304-305 (0,08 п.л., личн. вк. 33%).

29. Чистяков В.А. Проблемы методологии мониторинга токсичности природных сред: необходимость синтеза. Биоресурсы, биотехнологии, экологически безопасное развитие регионов Юга России / Воинова Н.В., Чистяков В.А., Федоренко Г.М., Сазыкина М.А. // Материалы

Международной конференции, 3-5 октября 2007. Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет». 2007. С. 16 - 20 (0,21 п.л., личн. вк. 25%).

30. Chistyakov V.A. Manganese ions enhance resistance of DNA to reactive oxygen species / Chistyakov V.A., Rynza E.T., Sazykina M.A., Mirzoyan A.V. // «Russian-European Workshop on DNA Repair and Epigenetic Regulation of Genome Stability. June 24-26, 2008. St. Petersburg, Russia»: изд-во «Арта», 2008. P.59 (0,04 п.л., личн. вк. 25%).

31. Чистяков В.А. Антиоксиданты - супрессоры генотоксичности ультрафиолетовой компоненты солнечного света / Чистяков В.А., Сазыкина М.А., Коленко М.А., Червяков Г.Г., Усатов А.В. // Тез. докл. Международного Междисциплинарного Симпозиума. Судак - Крым, Украина, 19-30 сентября 2008 г. «От экспериментальной медицины к превентивной и интегративной медицине» / Под ред. Тимофеева И.В., Перминовой Н.Г. 2008 г. С. 134 (0,04 п.л., личн. вк. 20%).

32. Чистяков В.А. Митохондриально-направленные антиоксиданты (производные «ионов Скулачева») подавляют мутагенез и увеличивают уровень эстрадиола / Чистяков В.А. // Тез. докл. Международной конференции «Биоэнергетика в прошлом, настоящем и будущем: путь к "Homo sapiens liberatus"» 22-24 февраля 2010. Москва. С. 27. (0,04 п.л., личн. вк. 100%).

33. Чистяков В.А. Генопротекторный эффект аллантоина и урата при действии свободных радикалов / Азарин К.В., Чистяков В.А., Усатов А.В. // Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010. Москва. С. 3-4 (0,04 п.л., личн. вк. 33%).

Перечень использованных сокращений

АФК - активные формы кислорода

ГБО - гипербарическая оксигенация

СОД — супероксиддисмутаза

СУА - супероксидустраняющая активность

ТБК - тиобарбгауровая кислота

ПОЛ - перекисное окисление липидов

8к(}1- Ю-(б'-пластохинонил) децилтрифенил фосфоний

Подписано в печать 14.12.2010 г. Формат 60x84 'Аб. Усл. печ. л. 2,56. Уч. -изд. л. 3,24. Тираж 100 экз. Заказ № 1450. Типография Южного федерального университета 344090, г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки, 200/1, тел (863) 247-80-51.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Чистяков, Владимир Анатольевич

ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Обзор литературы 1 з

1.1. Токсичность кислорода

1.2. Свойства активных форм кислорода

1.2.1. Супероксидный анион - радикал

1.2.2. Перекись водорода

1.2.3. Гидроксильный радикал

1.2.4. Синглетный кислород

1.2.5. Роль железа и железосодержащих комплексов в генерации

1.2.6 Перекисное окисление липидов

1.2.7 Повреждение белков активными формами кислорода

1.2.8 Повреждение ДНК активными формами кислорода

1.3. Механизмы защиты от токсического действия кислорода

1.3.1. Супероксиддисмутаза

1.3.2. Ферменты - перехватчики перекиси водорода

1.3.3. Исследование механизмов действия АФК на объектах с модифицированной системой ферментативной защиты

1.3.4. Регуляция свободнорадикальных окислительных процессов низкомолекулярными антиоксидантами

1.3.4.1. Глутатион

1.3.4.2. Токоферол (витамин Е)

1.3.4.3. Аскорбиновая кислота (витамин С)

1.3.4.4. Азотсодержащие метаболиты

1.3.5. Взаимодействие ферментативных и неферментативных защитных механизмов

1.3.6. Защита железо-серных белков

1.3.7. Репарация белков

1.3.8. Репарация ДНК

1.3.9. Контроль уровня неинкорпорированного железа

1.3.10. Регулонная организация управления механизмами антиокси- 72 дантной защиты у микроорганизмов

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. Уровень неорганических соединений: Оценка протекторных свойств марганца

2.1. Материалы и методы

2.2. Результаты и их обсуждение

ГЛАВА 3. Уровень низкомолекулярных органических соединений: участие азотсодержащих низкомолекулярных соединений в защите от окислительного стресса

3.1. Материалы и методы

3.2. Результаты

3.2.1. Аллантоин, урат

3.2.2. Аминокислоты

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биохимические механизмы неспецифической защиты клетки от окислительного стресса"

Их изучение поможет глубже понять принципы взаимодействия живых систем с агрессивной для них кислородной средой. Неспецифические защитные механизмы — более древние и примитивные, формировались на ранних этапах развития аэробной жизни. Поэтому их исследование дает возможность лучше представить этапы развития современных метаболических путей и клеточных структур. Так, выдвинутая В.П. Скулачевым в 1994 гипотеза о существовании дополнительной функции митохонрий, связанной с защитой от кислорода, по-прежнему остается единственной рациональной основой объяснения постепенности их симбиогенного происхождения.

Примитивность, а, следовательно, простота неспецифических защитных механизмов определяет значимость их исследования для поиска новых путей повышения адаптационных возможностей организма при помощи ан-тиоксидантов, поскольку чем проще система, тем больше вероятность ее эффективной работы в новых условиях.

Цель работы: Целью настоящего исследования было установление механизмов неспецифической защиты от индукторов окислительного стресса и разработка на их основе путей коррекции патобиохимических последствий взаимодействия активных форм кислорода с биомолекулами.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Исследовать способность ионов марганца защищать ДНК от АФК in vitro и in vivo.

2. Исследовать антиоксидантную активность аллантоина и мочевой кислоты, в том числе споосбность этих веществ защищать генетический аппарат клетки от АФК.

4. Исследовать устойчивость коваггентно замкнутой кольцевой ДНК, линейной ДНК, а также РНК к деструктивному действию АФК.

7. Исследовать способность катионного производного пластохинона - 10-(б'-пластохинонил) децилтрифенил фосфония (SkQl), снижать уровень повреждения ДНК активными формами кислорода.

Две последние задачи имеют прикладной характер. Полученные результаты позволили сделать предположение о том, что «процветающие реликтовые формы», в частности, виды семейства Acipenseridae могут отличаться гипертрофированным развитием систем неспецифической защиты от окислительного стресса, а, следовательно, служить источником высокоэффективных смесей антиоксидантов. Проверка этого предположения стала одной из задач работы.

Под руководством академика В.П. Скулачева был создан и исследован ряд липофильных катионов, в которых пластохинон объединен с трифенил-фосфонием. Использование растительного метаболита пластохинона в антиоксидантных конструкциях, предназначенных для животных, можно рассматривать как эксплуатацию его неспецифической антиоксидантной активности. Задачей завершающего этапа работы было исследование способности SkQl модифицировать процессы повреждения ДНК, опосредованные действием активных форм кислорода in vivo. Научная новизна.

В результате проведенных исследований получены новые данные, имеющие существенное значение для понимания роли ряда неспецифических механизмов защиты клетки от окислительного стресса:

- обнаружена способность марганца защищать ДНК от продуктов реакции Фентона;

- подтверждена и количественно оценена способность аллантоина защищать ДЕК клетки от повреждения АФК in vitro;

- показано существование различных механизмов разрушения кольцевых и линейных ДНК в условиях генерации АФК;

- впервые описан феномен гиперчувствительности дыхательных мутантов диплоиного штамма дрожжей Saccharomyses cerevisiae к ГБО;

- впервые проведен сравнительный анализ способности этанольных экстрактов тканей различных видов рыб защищать ДНК от повреждения АФК in vivo, выявлена высокая протекторная активность экстрактов тканей осетровых рыб по сравнению с костистыми рыбами;

- впервые исследована способность митохондриально направленного поиз-водного пластохинона SkQl снижать фоновый уровень повреждения ДНК активными формами кислорода ш vivo.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Теоретическая значимость работы состоит в обосновании концепции, учитывающей важную роль неспецифических механизмов защиты от деструктивного действия активных форм кислорода, таких как синтез метаболитов с высокой антиоксидантной активностью, формирование молекул ДНК с защищенной от АФК пространственной структурой, активизация дыхания, в обеспечении существования клеток в кислородной среде.

Разработанные при подготовке работы методы определения активности супероксиддисмутазы и генотоксичности химических соединений применяются для скрининга биологической активности природных и синтетических соединений, мониторинга качества водной среды Азово-Черноморского бассейна.

Результаты по стабильности ДНК в кислородной среде использованы для разработки методов сохранения ДНК-содержагцих образцов в Национальной коллекции генетических материалов при ВНИРО. Образцы используются в качестве эталонов при ДНК-идентификации происхождения экспортных партий черной икры.

Результаты доклинических испытаний препарата SkQl использованы «НИИ Митоинженерии МГУ» при разработке ветеринарного препарата «Визоомитин» и препарата для лечения заболеваний глаз, который в настоящее время проходит клинические испытания.

Материалы работы используются в лекциях на кафедрах биохимии и генетики Южного федерального университета в спецкурсах: «Основы пато-биохимии», «Свободные радикалы в биологических системах», «Основы мембранологии», «Современные проблемы генетики», «Нехромосомная наследственность», «Мутагены окружающей среды».

Проведенные исследования послужили основой четырех изобретений, на которые получены авторские свидетельства: Положения, выносимые на защиту:

1. Способность ионов марганца защищать ДНК от АФК, генерируемых в реакции Фентона, лежит в основе неспецифического антиоксидантно-го механизма, реализуемого на уровне неорганических соединений

2. Низкомолекулярные органические азотсодержащие соединения - метаболит мочевой кислоты аллантоин и аминокислоты - аланин, валин, изолейцин, метионин, цистеин, лизин, гистидин, треонин, аспарагин и глутаминовая кислота - обладают антиоксидантной активностью.

3. Замыкание ДНК в кольцо может быть эффективным механизмом защиты ДНК от АФК, не связанным с Pix перехватом, который реализуется на уровне макромолекул.

5. Высокая антиоксидантная активность экстрактов тканей осетровых рыб, по сравнению с костистыми рыбами, является примером высокого уровня неспецифических механизмов защиты от АФК, характерного для процветающих реликтовых форм.

Апробация работы:

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях: 2-й съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000). Всероссийская научная конференция «Проблемы и перспективы развития аквакультуры в России» (Краснодар, 2001); Всероссийская научно-практическая конференция «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов-на-Дону, 2007) «Russian-European Workshop on DNA Repair and Epigenetic Regulation of Genome Stability» (St.Petersburg, Russia2008); Международный Междисциплинарный Симпозиум, Судак - Крым, Украина, 19-30 сентября 2008 г. «От экспериментальной медицины к превентивной и интегративной медицине» (Судак, 2008); III Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009) Международная конференция «Биоэнергетика в прошлом, настоящем и будущем: путь к "Homo sapiens liberatus"» (Москва, 2010).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Чистяков, Владимир Анатольевич

выводы

2. Аллантоин способен эффективно подавлять индукцию мутаций и SOS-ответа у E.coli, вызванную перекисью водорода.

3. Представители основных групп аминокислот, изученные в данной работе, обладают супероксидустраняющей активностью. Максимальную активность проявляет лизин.

4. Кислород под давлением и генерация супероксид-аниона за счет ауто-окисления гидроксиламина в щелочной среде не способны разрушать первичную структуру нуклеиновых кислот. Генерация супероксид-аниона в присутствии ионов меди вызывает разрушение структуры молекул нуклеиновых кислот. ДНК-тропный эффект возрастает в ряду: РЕК, линейная ДНК, кольцевая, ковалентно-замкнутая ДНК.

6. Дыхательные мутанты дрожжей чувствительны к дозам ГБО, подпорого-вым для дикого штамма.

7. Различную чувствительность rho" и rho+ штаммов невозможно объяснить различиями по активности супероксиддисмутазы, каталазы и пероксида-зы - основных перехватчиков активных форм кислорода.

Ю.Помимо основных функций, некоторые клеточные процессы и молекулярные структуры образуют систему неспецифических механизмов защиты от кислорода, сформировавшихся на ранних этапах развития аэробной жизни. В связи с чем их исследование дает возможность лучше представить этапы эволюции современных метаболических путей и клеточных структур.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Фундаментальные исследования эффектов повышенного парциального давления кислорода и механизмов защиты от его токсического действия, начавшиеся с 60-х годов в рамках частных разделов физиологии и биохимии, фактически позволили создать новую биологическую методологию, основанную на необходимости учитывать взаимодействие биосистем с кислородом и его активными формами при построении непротиворечивых схем самых различных биологических механизмов.

Ее формирование оказало и продолжает оказывать значительное влияние на развитие как теоретических, так и прикладных дисциплин биологического и медицинского направления. Для того чтобы убедиться в этом, достаточно вспомнить, как усилилась за последние несколько десятков лет «свободнорадикальная составляющая» представлений о механизмах развития патологических процессов различного генеза, действия экстремальных факторов среды, мутагенеза, канцерогенеза, воспалительных процессов, старения, и т.д.

Фундаментальным достижением, обусловленным такой методологией, стало, в частности, открытие системы защиты от кислорода, основанной на работе ряда специфических ферментативных и неферментативных механизмов. Согласно современным представлениям (81ирр1ш1щ е! а1., 2003), «первой линией защиты живых форм от кислорода» являются ферменты, непосредственно дезактивирующие АФК (суперсоксиддисмутаза и каталаза), а также обеспечивающие восстановление высокоэффективных низкомолекулярных антиоксидантов, в основном глутатиона (глутатион-редуктаза). Вторая линия защиты - это низкомолекулярные антиоксиданты (токоферол, аскорбат, ка-ротиноиды и т.д.). Эти механизмы весьма эффективны, на что недвусмысленно указывает, например, обнаруженная еще в 70-е годы неспособность к существованию в кислородной среде мутантов по супероксиддисмутазе (Im-lay, 2002).

Очевидно, что защита от такого «вездесущего» агента как кислород, должна иметь сложную системную структуру, а соответствующие свойства и активности должны быть «встроены» в самые различные механизмы жизнедеятельности. В противном случае придется допустить, что появление системы защиты от кислорода предшествовало появлению аэробной жизни, что представляет собой очевидный логический тупик.

Многие экспериментальные факты указывают, что развитие жизни в кислородной среде определило существование целого ряда неспецифических механизмов, в которых для защиты от окислительного стресса «используются» вещества и процессы имеющие и ряд других функций. Причем эффективность таких неспецифических механизмов иногда может быть достаточно высокой.

Помимо логических аргументов, к настоящему времени накоплено, в том числе и в результате наших исследований, значительное число подтверждающих этот тезис результатов.

Первым шагом построения любой теории является систематизация фактов (Линней, 1989). Исследованные в данной работе механизмы неспецифической защиты от кислорода относятся к различным уровням организации клетки, что положено в основы их систематизации.

Наиболее простые вещества которыми способны манипулировать живые системы - неорганические ионы. Способность некоторых двухвалентных катионов усиливать деструктивное действие АФК - общеизвестный факт. Менее известно то, что в 1982 году Арчибальдом и Фридовичем была опубликованы данные о супероксидустраняющей активности ионов марганца (Archibald, Fridovich, 1982). Двухвалентный марганец, взаимодействуя с супероксид анионом и двумя протонами, окисляется до трехвалентного состояния с образованием перекиси водорода. Последняя реагирует с Mn(III) с образованием Mn(II), кислорода и двух протонов. Таким образом, ионы марганца способны в достаточно широком диапазоне рН формировать цикл «дезактивации» супероксид аниона. Позже были найдены косвенные доказательства эффективной работы данного процесса in vivo (Daly et al., 2007). Было обнаружено также, что антиоксидантная активность марганца значительно увеличивается при образовании комплексов с лактатом и сукцинатом. Последнее указывает на важность роли низкомолекулярных органических соединений в системе защиты от деструктивного действия АФК

Наши исследования показали, что антиоксидантная роль ионов марганца не ограничивается супероксид устраняющей. Добавление сульфата марганца защищает ДНК от разрушения продуктами реакций Фентона и Га-бера-Вейсса. Способность ионов марганца защищать ДНК от разрушения в подобных процессах, проявляется и in vivo, в форме подавления генотоксич-ности перекиси водорода. По-видимому, накопление марганца бактериями позволяет им не только имитировать супероксиддисмутазную активность, но и формировать целый комплекс защитных механизмов, которые обеспечивают как удаление супероксид-аниона, так и защиту ДНК от агрессивных продуктов фентоновских процессов, - в первую очередь, от гидроксильного радикала.

Уровень низкомолекулярных соединений исследован в плане поиска антиоксидантов наиболее подробно. А.И. Лукашом (1993) была разработана концепция протекторного катаболизма, которая дала толчок к изучению ан-тиоксидантных свойств метаболитов нуклеиновых кислот. Одной из характерных черт любого стресса, в том числе и окислительного, является активация процессов катаболизма. Многие метаболиты, в частности продукт распада пуринов - мочевая кислота, обладают антиоксидантными свойствами.

Поэтому активизация катаболизма имеет адаптивный характер, проявляющийся в защите клеточной структур от повреждения АФК.

Исследования последних десятилетий выявили антиоксидантные свойства у целого ряда веществ, основные (или считаемые таковыми) функции которых, по существующим представлениям, не связаны с защитой от активных форм кислорода. Колоссальная сложность живых систем и неполнота наших знаний, конечно, не позволяют однозначно выделить главные и второстепенные функции клеточных систем и метаболитов. Но для удобства изложения мы предлагаем в дальнейшем главную функцию метаболита определять по наиболее разрушительным для системы последствиям его дефицита.

В качестве примера можно привести аскорбат. Для существования большинства клеток необходимы как антиоксидантная (например, опосредованное ферментами восстановление токоферола, поддерживащее стабильность мембран), так и прооксидантная (синтез предшественников коллагена, траспорт железа) активность этого вещества (Levenson, Schultz, 1979; Traber, 2007). Гибель людей от цинги происходит из-за массовых кровоизлияний, вызванных ослаблением стенок сосудов. Последнее является следствием дефицита оксипролина (мономера коллагена). То есть, по важности, для выживания анти- и прооксидантная активности аскорбата как минимум равнозначны. Преобладание одной из активностей определяется участием сотен макромолекул и метаболитов, образующих «биохимический контекст». Самая известная иллюстрация одного из наиболее грубых механизмов такой модуляции - взаимное усиление токсичности аскорбата и металлов переменной валентности (Чистяков и др., 2002). Анти- и прооксидантное действие одного и того же вещества может быть востребовано в разных клеточных компартментах, что, безусловно, ограничивает эффективность применения «неизбирательных» антиоксидантов для коррекции кислородзависимых патологий.

Весьма интересны в качестве потенциальных протекторов от АФК азотсодержащие соединения, в частности, мочевая кислота и ее катаболит -аллантоин. Урат, в качестве АФК протектора, входит в состав пропитки одного из наиболее популярных средств для хранения образцов крови для анализа ДНК - карт FTA (Burgoyne, 1998). Антиоксидантные свойства аллан-тоина были исследованы нами в цикле работ, проведенных под руководством Ю.А. Жданова и Е.П. Гуськова (Гуськов и др.,2002; Гуськов и др., 2004). Была обнаружена способность этого вещества подавлять перекисное окисление липидов in vitro, мутагенез и SOS-индукцию, вызываемые перекисью водорода у Е. coli. Сопоставление антимутагенной активности аскорбиновой кислоты и аллантоина показало, что последний является более эффективным протектором клеточной ДНК от действия АФК. Квантово-химические расчеты, проведенные И.В. Корниенко, также подтверждают эффективность аллантоина в качестве антиоксиданта в реакциях его радикальной атаки активными формами кислорода (Гуськов и др.,2002; Гуськов и др., 2004).

Обладает способностью инактивировать АФК и такая распространенная группа метаболитов, как аминокислоты. Антиоксидантные свойства се-русодержащих аминокислот хорошо известны. Нами было установлено, что супероксидустраняющая активность свойственна в той или иной мере большинству аминокислот, входящих в состав белков (Чистяков и др., 2005), причем аномально высокая активность характерна для лизина. Супероксиду-страняюшей активностью обладают также полиамины, несущие, подобно лизину, две аминогруппы. Причем интересно, что при усилении окислительного стресса проявляется способность этих соединений активировать SoxR peiynoH, управляющий системой «специфических» антиоксидантов у Е. coli.

Ткаченко, Федотова, 2007). Это еще один пример сложности системы защиты от кислорода, проявляющейся даже при действии одного соединения.

Высокой антиоксидантной активностью обладают многие гидрофобные метаболиты, причем не только носители тиоловых групп, а, например, каротиноиды - предшественники ретинола и ретиноевой кислоты (Voss, Siems, 2006). Главная функция этих соединений - осуществление фоторецепции и межклеточных взаимодействий. Антиоксидантная активность ко-энзима Q - существенного компонента электронтранспортной цепи митохондрий, широко известна (Skulachev, 2005).

Недавно обнаружены антиоксидантные свойства гормона эпифиза -мелатонина. Это соединение в несколько раз активнее тролокса - водорастворимого аналога «признанного» антиоксиданта токоферола в качестве антидота против токсинов синезеленых водорослей, действующих как генераторы АФК (Эль-Яссаби, Халил, 2006).

Таким образом, помимо защитного потенциала специализированных антиоксидантов (см. обзор литературы), живые системы могут использовать для защиты от АФК самые разные метаболиты, в частности, аминокислоты, метаболиты пуринов и т. д. В этом плане полученные нами результаты хорошо согласуются с концепцией протекторного катаболизма, позволившей предсказать антиоксидантные свойства аллантоина. Проявлением системной адаптированности живых форм к кислороду является то, что большинство молекул, вовлеченных в метаболизм, в той или иной степени обладают анти-оксидантным действием. Таким образом, антиоксидантная активность характерна для широкого спектра клеточных метаболитов, в том числе и входящих в состав биополимеров. Однако уровень низкомолекулярных органических соединений - это только фундамент системы неспецифической защиты клетки от кислорода.

Низкомолекулярные органические соединения это тот субстрат из которого и в эволюционном и в биохимическом плане формируются биополимеры. Многие особенности биополимеров отражают необходимость противостоять от разрушающему действию АФК Общеизвестно, что генетический аппарат - одна из наиболее уязвимых мишеней самых разных деструктивных факторов, в том числе и индукторов окислительного стресса. Это связано с реализацией так называемого «принципа усилителя» (Тимофеев-Ресовский, Ромпе, 1996). Есть серьезные основания полагать, что широкое распространение в природе кольцевых ДНК связано именно с большей устойчивостью последних к свободнорадикальным атакам.

Для экспериментального исследования роли топологической организации нуклеиновых кислот при защите от АФК нами была исследована стабильность линейных и кольцевых молекул ДНК и суммарной РНК в условиях генерации супероксид аниона и гидроксильного радикала.

Статистически достоверные эффекты деструкции нуклеиновых кислот были зарегистрированы только в условиях генерации гидроксильного радикала. При этом наиболее устойчивой оказалась кольцевая ковалентно замкнутая (кзк) ДНК. Более того, только для кзк ДНК, в отличие от линейной, проявлялся защитный эффект маннита.

По-видимому, замыкание ДНК в кольцо делает менее доступными для повреждающих воздействий высокореактивные 3' и 5' - концы нуклеиновых кислот. Разрушение линейных молекул нуклеиновых кислот АФК, очевидно, идет по принципу "концевой атаки" - неферментативного аналога экзонук-леазной активности, а кольцевых молекул по принципу разрывного действия - неферментативного аналога экзонуклеазной или никазной активности. Различия в устойчивости кольцевых и линейных нуклеиновых кислот объясняются разной эффективностью реакций "концевой атаки" и "разрывного действия". Данные о большей устойчивости кольцевых ДНК к действию АФК по сравнению с линейными были подтверждены с использованием других методических подходов (Reed, Douglas, 1991).

В настоящее время получен ряд доказательств того, что различные субструктуры нуклеиновых кислот, существующие в пределах одной молекулы, также могут отличаться по устойчивости к АФК. Наиболее яркий пример такого рода связан с теломерами. Концевые последовательности хромосом образуют особые структуры (Bolzan, Bianchi, 2006), которые отличаются повышенной, по сравнению с общей геномной ДНК, чувствительностью к индукции гидроксильными радикалами одно- и двунитевых разрывов (Passos, Von Zglinncki, 2006). Структура теломерных капов отнюдь не статична и может изменяться при взаимодействии с короткими НК. Вопрос о возможном участии веществ, модифицирующих конформацию нуклеиновых кислот, в защите от АФК, в настоящее время не изучен, однако существование такого механизма теоретически возможно. Само существование некоди-рующих теломерных повторов может быть способом защиты ДНК от концевой атаки АФК. Протекторный эффект может быть связан с упаковкой ДНК в нуклеосомы, ограничивающей контакт молекулы с водным окружением. Разрушение первичной структуры РНК в обеих использованных нами буферных системах идет на 10-20 % эффективнее, чем линейной ДНК, в зависимости от концентрации меди. Такие различия могут лежать в основе разных функций РНК и ДНК - более устойчивая ДНК является долговременным носителем информации, а РНК - оперативным.

Существует целый ряд данных, свидетельствующих, что механизмы, не связанные непосредственно с перехватом АФК, работают и на более высоких уровнях клеточной организации. Низкая чувствительность, микроорганизмов к токсическому и генотоксическому действию кислорода под давлением, в отличие от других индукторов окислительного стресса (например, перекиси водорода), продемонстрированная с использованием самых разных методов (Гуськов и др., 1987), позволила поставить вопрос о существовании системных кислород-протекторных механизмов. Предположения о том, что дыхательная система способна защищать клетку от окислительног стресса, «сжигая» излишки кислорода, высказывались еще в 60 - 70 годы прошлого века. Однако эти предположения касались частных, хотя и важных вопросов. Drozd и Postgate (1970), например, считали, что таким образом создаются условия для работы в аэробных условиях s чувствительной к кислороду нитрогеназы азотфиксирующих бактерий.

Гипотеза о всеобщем характере феномена способности дыхательной системы защищать клетку от токсического действия кислорода впервые была высказана В.П. Скулачевым (1994). Такую активность, не связанную непосредственно с перехватом кислород содержащих свободных радикалов, можно назвать кислород-протекторной. Дыхательная система, безусловно, способная связывать кислород, одновременно способна и генерировать АФК. Для изучения этих взаимосопряженных процессов нами была исследованы биохимические параметры дыхательных мутантов дрожжей-сахаромицетов - микроорганизмов, имеющих одну из самых эффективных дыхательных систем.

Было показано, что все выделенные нами 25 petite (неспособных к дыханию) - мутантов гибли при 22 часовой обработке 0,7 МПа чистого кислорода. Выживаемость исходного диплоидного штамма Д-248 при такой обработке была около 50%. Шесть независимо выделенных дыхательных мутантов были использованы для исследования их биохимических характеристик. Определяли каталазную, пероксидазную и супероксиддисмутазную (СОД) активность, а также содержание ТБК-положительных продуктов. Данные по последнему показателю хорошо коррелировали с данными по выживаемости. Сублетальные дозы ГБО вызывали индукцию ТБК+ продуктов у дыхательных мутантов, но не у дикого штамма. Анализ результатов энзимологических экспериментов показал, что различия по исследованным активностям не связаны статистически с выживаемостью. Таким образом, гипотеза о непосредственном участии дыхательной системы дрожжей в защите от кислорода, как основе чувствительности дыхательных мутантов к ГБО, остается единственным корректным объяснением этого феномена. Логично предположить, что такая "побочная" функция дыхания (Скулачев, 1994), не требующая никаких дополнительных механизмов, может эффективно осуществляться не только у дрожжей.

Как упоминалось выше, дыхательная система является одновременно и главным внутриклеточным генератором АФК. Соотношение защитного эффекта дыхания и деструктивного действия АФК для каждой экспериментальной модели индивидуально. Этим можно объяснить обнаруженную Оза-вой и сотрудниками () низкую чувствительность к 95 % кислороду линий фибробластов, не имеющих митохондрий (р") по сравнению с дикими (р+) (Скулачев, 1995). После трех дней инкубации в данных условиях большинство р+ клеток погибло, в то время как выживаемость р" была около 80 %. Очевидно, в данном случае причиной гибели клеток была генерация АФК дыхательной цепью митохондрий, о чем свидетельствует накопление деле-ций в митохондриальной ДНК выживших р+ клеток.

Системный характер взаимодействия клетки с кислородом следует учитывать при обсуждении еще одного условия, необходимого для осуществления протекторного эффекта дыхания. Очевидно, что защита, основанная на снижении внутриклеточного напряжения кислорода, возможна только при ограничении скорости диффузии кислорода через клеточную мембрану, поскольку в противном случае этот механизм будет напоминать черпание воды решетом. До недавнего времени предположение о существовании механизма, регулирующего транспорт кислорода в клетку, воспринималось как безосновательное, поскольку считалось, что, благодаря высокой растворимости кислорода в липидах, клеточные мембраны не представляют собой препятствия для диффузии этого газа. При этом, однако, не учитывали того, что скорость диффузии газа в жидкости связана обратной зависимостью с вязкостью жидкой фазы. Результаты прямых измерений, проведенных Ивановым и соавт. (2004), показали, что диффузия кислорода через липидные бислои идет достаточно медленно. Авторы работы предположили, что эффективное снабжение клеточных митохондрий кислородом не может осуществляться без участия специальных структур («кислородных пор»), облегчающих этот процесс. Не прибегая к малообоснованным спекуляциям, заметим, что участие во взаимодействии клетки с кислородом этих структур, какую бы биохимическую основу они ни имели и как бы ни регулировались, делает процесс защиты от кислорода еще более сложным и еще более расширяет перечень потенциальных регуляторов этого процесса.

В работе (Meyer et al., 2006) описан еще один биохимический механизм, теоретически позволяющий регулировать соотношение кислород-протекторной и супероксид-генерирующей активностей митохондрий. Как известно, интенсивность генерации АФК зависит от величины митохондри-ального мембранного потенциала. По мнению авторов работы (Meyer et al., 2006), в условиях гипергликемии, когда цикл трикарбоновых кислот работает с максимальной интенсивностью, возникает угроза дефицита АДФ, который приводит к росту трансмембранного потенциала. При этом энергия, не израсходованная на синтез АТФ, идет на генерацию супероксид-аниона. Но в клетках некоторых органов, в частности, мозга, есть фермент креатинкина-за, способный переносить фосфат с АТФ на креатин и обратно. Тем самым запасается энергия макроэргических связей и высвобождаются новые молекулы АДФ для активизации процесса связывания энергии трансмембранного потенциала. Теоретические рассуждения авторов в некоторой степени спекулятивны, но, тем не менее, ими показана способность креатина снижать интенсивность генерации перекиси водорода митохондриями. Таким образом, различия по содержанию креатина теоретически могут создавать фон, обеспечивающий при избытке этого вещества преобладание кислород-протекторной (причем здесь необходимо говорить именно о кислород-протекторной, а не об антиоксидантной активности, поскольку последняя для креатина не выявлена), а при его недостатке - супероксидгенерирующей активности дыхательной системы.

В данном случае, не обладающий способностью перехватывать АФК креатин влияет на антиоксидантный статус клетки благодаря тому, что последняя реагирует на присутствие кислорода как многоуровневая, саморегулирующаяся система.

Таким образом, в настоящее время существуют серьезные основания полагать, что протекторным потенциалом обладают не только антиоксидан-ты (перечень которых значительно шире, чем предполагали в конце XX века), но и значительное число веществ, индуцирующих образование устойчивых к АФК конформаций макромолекул и активацию механизмов субклеточного уровня защиты.

Практическим следствием успехов в исследовании механизмов генерации АФК и защиты от них стали многочисленные попытки использования антиоксидантов для повышения адаптационных возможностей человека и животных, профилактики и лечения заболеваний (Меныцикова и др, 2006). Первые положительные результаты применения антиоксидантов следует рассматривать как важные «вехи», указывающие направление будущих исследований, результатом которых (позволим себе высказать такую надежду) станет появление эффективных средств коррекции многих кислородзависи-мых патологических состояний, включая старение.

Представления, учитывающие важность неспецифических механизмов защиты от кислорода и его активных форм позволяют наметить ряд таких направлений.

Высокая сложность естественных антиоксидантных механизмов, их системный, многоуровневый характер, определяет то, что одним из основных путей получения препаратов, способных корректировать неблагоприятные проявления свободнорадикальных реакций in vivo, является использование сложных смесей антиоксидантов, различные компоненты которых должны активировать разные защитные механизмы.

Наряду с конструированием таких смесей из отдельных веществ, рациональные принципы которого в настоящее время не сформулированы, можно воспользоваться природными смесями — экстрактами из растений, животных и микроорганизмов. Препараты природного происхождения имеют перед продуктами химического синтеза целый ряд преимуществ, определяемых тем, что безвредность веществ, участвующих в метаболизме, уже апробирована в ходе миллионов лет эволюции. Последнее, конечно, не относится к веществам, «целенаправленно» генерируемым живыми системами, для борьбы друг с другом. Очевидно, что чем сильнее выражен в системе ан-тиоксидантной защиты неспецифический компонент, тем больше вероятность сохранения ее активности при экстракции. Увеличение специфичности, в том числе числа ферментов, участвующих в осуществлении биохимических функций - одна из основных закономерностей в эволюции живых организмов, поэтому высокую активность антиоксидантной защиты следует ожидать у древних, реликтовых форм.

Многие «живые ископаемые» существуют отнюдь не в реликтовых биотопах - они способны занимать обширные ареалы и отличаются от своих эволюционно «молодых» родственников высокой жизнестойкостью. Достаточно вспомнить один из самых примитивных среди позвоночных класс

Chondrichthyes, представители которого (акулы и скаты) населяют все океаны от полярных широт до экватора. Не менее широко распространены сформировавшиеся еще в Девоне и давшие максимум формообразования в Пермском периоде хрящевые ганоиды. К ним относятся осетровые рыбы, процветание которых было прервано исключительно «хозяйственной» деятельностью человека. Одна из самых жизнестойких и плодовитых из костистых рыб - Carassius auratus gibelio, является одной из самых примитивных. Во всяком случае, караси существовали уже более 50 млн. лет назад (Ohno et al., 1969).

Материалом для наших исследований служили образцы гонад, печени и мышц русского осетра {Acipenser gueldenstaedtï), хряща хорды севрюги {Acipenser stellatus), гонад и печени чехони {Pelecus cultratus) и тарани {Rutis lus rutilus heckelî). Способность экстрактов исследованных тканей костистых рыб снижать генотоксичность перекиси водорода была существенно ниже, чем у осетровых. Результаты, полученные для печени и гонад осетра, в 1,9 и 2,0 раза, соответственно, превышали таковую для аналогичных тканей чехони. Для тарани превышение составило 3,4 и 6,3 раза.

Оценить эффективность антимутагенов, содержащихся в органах и тканях осетровых рыб, можно путем сравнения полученных эффектов с антимутагенными эффектами ряда синтетических и природных антиоксидан-тов. Для большинства антиоксидантов характерны колоколообразные зависимости доза-эффект. Т.е. существует максимально эффективная концентрация, уменьшение или увеличение которой одинаково приводит к ослаблению эффекта. Как показали наши исследования (Чистяков и др., 2001), эта закономерность сохраняется и для антимутагенной активности антиоксидантов. Поэтому максимальная величина эффекта может служить показателем «силы» антимутагенного действия антиоксиданта. Согласно полученным данным, этот показатель для экстрактов тканей русского осетра (печень, 95 % ингибирования эффекта перекиси) превышает максимальные эффекты, полученные для токоферола (53 % ингибирования эффекта перекиси).

Большинство исследований механизмов антиоксидантной защиты ограничивается узким кругом лабораторных объектов, поэтому данные по реликтовым видам достаточно разрознены. Наиболее известный пример из этой области - акулий хрящ. В 1983 г. в «Science» была опубликована статья Lee и Langer (1983), в которой описывались свойства акульего хряща, который, в отличие от хряща позвоночных, содержит вещества, подавляющие ан-гиогенез. Наличие таких веществ, по мнению авторов, объясняло высокую устойчивости акул к канцерогенезу. Через несколько лет появился коммерческий препарат - порошок высушенного акульего хряща, который сразу начали широко рекламировать как пищевую добавку. В последующие годы был проведен ряд исследований по исследованию биологической активности препарата и выделению антиангиогенного фактора. Результаты исследований оказались противоречивыми. Если антиангиогенная активность препарата проявляется как для мышей, так и для людей, то серьезной антиканцерогенной активности не обнаружено (Gonzalez et al., 2001). По-видимому, антиангиогенная активность - не главная причина устойчивости акул к онкозаболеваниям. Окислительное повреждение ДНК лежит в основе самых разнообразных клеточных патологических процессов - от канцерогенеза до старения. Поэтому закономерным было появление в девяностых годах работ Felzenszwalb и соавторов (Gomes et al., 1996; Felzenszwalb et al., 1998), которые обнаружили присутствие в водных экстрактах свежего акульего хряща высокую активность веществ, способных защищать ДНК от свободно-радикального повреждения.

Таким образом, экспериментальные данные подтверждают, что экстракты тканей многоклеточных животных способны проявлять кислород-протекторную активность в бактериальных моделях. Это свидетельствует об универсальности кислородиротекторного пула. Фактически экстракты, проявляющие способность усиливать эффективность защиты от АФК, представляют собой сложные антиоксидантные смеси. Как показывают наши данные, по крайней мере, для рыб, древность происхождения соответствует большей антиоксидантной активности.

Другой пример совершенствования «антиоксидантной» методологии на основе концепции неспецифических защитных механизмов связан с использованием сложных антиоксидантных конструкций, способных адресно накапливаться в митохондриях, где генерируется большая часть клеточных АФК. Такие молекулы дают возможность, по образному выражению В.П. Скулачева, «очистить грязное место клетки», не увеличивая концентрацию антиоксидантов в других компартментах, где увеличение может быть бессмысленным или вредным. При этом содержание действующего вещества в пересчете на всю массу клетки будет ничтожно малым, что позволит избежать запуска природных механизмов, компенсирующих изменение антиок-сидантного статуса клетки в сторону увеличения.

Под руководством В.П. Скулачева в 70-е годы XX века были разработаны теоретические основы конструирования липофильных органических катионов, способных адресно накапливаться в митохондриях. По предложению Д. Грина (1974), такие молекулы были названы «Ионами Скулачева» (Антоненко и др., 2008).

Попытки использования конструкций на основе трифенилфосфония, «нагруженных» альфа-токоферолом и убихиноном (ткоС)), оказались в целом неудачными из-за низкой терапевтической широты этих соединений. При этом наихудшие результаты были получены для производного токоферола - вещества, специфической функцией которого является защита мембран от свободно-радикального повреждения. Лучшие результаты на клеточных моделях были получены для производного убихинона, антиоксидантная функция которого является дополнительной по отношению к основной - участию в цепи транспорта электронов. Однако исследования in vivo не выявили серьезных протекторных свойств mitoQ (Скулачев, 2007).

В 2003-2005 гг. был синтезирован ряд ионов Скулачева, «нагруженных» пластохиноном - метаболитом хлоропластов, обладающим высокими антиоксидантными свойствами и способностью к восстановлению при взаимодействии с дыхательной цепью митохондрий. Эти вещества показали целый ряд адаптогенных эффектов in vivo от замедления старения до ускорения восстановления сердца, почки и мозга после ишемии - реперфузии (Ан-тоненко и др., Бакеева и др., 2008; Агапова и др., 2008; Нероев и др.,2008; Анисимов и др. 2008; Скулачев, 2009). Применительно к теме работы отметим, что ряд веществ: токоферол, убихинон, пластохинон можно охарактеризовать возрастанием неспецифичности в плане защиты митохондрий от АФК. Таким образом, использование растительного метаболита пластохино-на, главной функцией которого является перенос электронов от фотосистемы I к фотосистеме II, в антиоксидантных конструкциях, предназначенных для защиты от АФК биомолекул клеток животных, можно рассматривать как эксплуатацию его неспецифической антиоксидантной активности.

Эксперименты, проведенные в рамках данной работы показали, что ежедневное в течение двух недель введение крысам-самцам Wistar этого соединения в дозах 25 и 250 нмоль/кг в день значительно, примерно в три раза снижает спонтанный уровень аберраций хромосом в анафазах роговицы. Эти изменения сопровождаются статистически значимым уменьшением уровня 8-гидрокси-2'-деоксигуанозина в сыворотке крови. Таким образом, биохимической основой наблюдаемого антикластогенного эффекта является снижение уровня повреждения ДНК эндогенными активными формами кислорода. Большая доза SkQl снижает уровень аберраций хромосом и после действия кислорода под давлением 0,5 МПа в течение 60 мин до уровня контроля. Данные литературы по антимутагенным эффектам столь низких концентраций других антиоксидантов отсутствуют.

Подводя общие итоги проведенных исследований можно отметить, что рассматривая аэробный метаболизм в целом, необходимо учитывать, что помимо основных функций, некоторые метаболические процессы несут определенную «антиоксидантную нагрузку». Наши эксперименты показали наличие высокой антиоксидантной активности у таких распространенных метаболитов, как аллантоин и аминокислоты, а также существование как минимум двух высокоэффективных неспецифических механизмов защиты от окислительного стресса, не связанных с перехватом АФК. Замыкание ДНК в кольцо защищает молекулы от разрушения гидроксильным радикалом. Удаление избыточного кислорода дыхательной системой митохондрий дрожжевых клеток защищает их от токсического действия кислорода под давлением.

При этом эффективность неспецифических защитных механизмов достаточно велика. Именно совокупность специфических и неспецифических антиоксидантов создает антиоксидантный потенциал организма, величина которого имеет важнейшее адаптивное значение.

Неспецифические механизмы защиты клеточных структур от окислительного стресса, возникшие на самых ранних этапах эволюции, отличаются простотой и универсальностью, что делает перспективным их практическое использование. Замыкание молекул ДНК в кольцо защищает их от разрушения свободными радикалами независимо от нуклеотидной последовательности. Это позволяет использовать кольцевые ДНК-метки для более надежной маркировки продукции, которая является одним из наиболее перспективных путей борьбы с фальсификацией товаров (см. например http://www.biowell.com.tw/). Большая устойчивость кольцевых молекул определяет необходимость использования митохондриальной ДНК для идентификации видового и популяциоиного происхождения биологической продукции, несмотря на меньшую информативность нуклеотидных последовательностей мтДНК по сравнению с ядерной. Особенно это важно при идентификации продукции, прошедшей термическую и химическую обработку: икры, копченостей, кожаных изделий, и т.д. Повышенная, по сравнению с ДНК, чувствительность РНК к активным формам кислорода позволяет поставить вопрос о применении такого широко апробированного метода терапии, как гипербароксигенация для лечения заболеваний, вызываемых РНК-содержащими вирусами. Как известно, многие из этих заболеваний, в частности атипичная пневмония, плохо поддаются лечению медикаментозными средствами. Широкое распространение дыхательной недостаточности среди опухолевых клеток, может быть использовано для разработки новых подходов к лечению онкозаболеваний, основанных на применении прооксидантов. Дыхательные мутанты дрожжей сахаромицетов могут быть удобной моделью для таких исследований. Обнаружение высокой антиоксидантной активности нормальных клеточных метаболитов, в частности аллантоина и лизина, открывает широкие возможности их использования в качестве основы лекарственных препаратов и биологически активных добавок. Эти вещества, именно в силу своей вовлеченности в нормальный метаболизм, не токсичны и могут быть введены в организм в больших количествах. В качестве источника природных биологически активных веществ в последнее время все шире используются эволюционно древние, часто реликтовые виды. Можно предположить, что высокий адаптогенный потенциал изготовленных из них препаратов, определяется, в том числе и большим развитием у этих форм неспецифических защитных механизмов, основанных на действии низкомолекулярных антиоксидантов. Как показали наши исследования, перспективным в этом плане может быть использование хряща осетровых рыб, обычно не употребляемого в пищу.

Первые результаты испытаний ионов Скулачева с антиоксидантной нагрузкой подтвердили высокую эффективность использования компонентов неспецифической антиоксидантной защиты для конструирования принципиально новых средств коррекции патобиохимических состояний, антиок-сидантов, действующих в концентрациях, измеряемых десятками наномолей.

Таким образом, развитие концепции неспецифических механизмов защиты от деструктивного действия кислорода и его активных форм, помимо теоретического значения, способно дать практический выход в целом ряде биологических и медицинских направлений.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Чистяков, Владимир Анатольевич, Ростов-на-Дону

1. Андроникошвили Э.Л. и др. О тканевой специфичности связывания микроэлементов с ДНК: Тез. докл. АН СССР. — 1976. — Т. 227. —№ 5. —С. 1244—1247.

2. Березов Т.Т., Буробина С.С., Волкова Л.В., Евграфов В.Г., По-знанская A.A., Яровая Г.А. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. — М.: Медицина, 1976. — 294 с.

3. Берри Д. Биология дрожжей. — М.: Мир, 1985. — 95 с.

4. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного слоя биологических мембран// Биофизика -1987. Т.32. - Вып. 5. - С. 830-844.

5. Владимиров Ю.В., Арчаков A.A. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. — М.: Наука, 1972. — 218 с.

6. Владимирский Б.М. Математические методы в биологии. — Ростов н/Д: Изд-во Рост, ун-та, 1983. — 304 с.

7. Гоготов H.H. Функции и свойства супероксиддисмутаз микроорганизмов // Успехи микробиологии. 1981. — №. 16. — С. 35—50.

8. Гуськов Е.П., Клецкий М.Е., Корниенко И.В., Олехнович Л.П., Чистяков В.А., Шкурат Т.П., Прокофьев В.Н., Жданов Ю.А. Аллантоин как тушитель свободных радикалов // ДАН, серия Биохимия, Биофизика. 2002. — Т. 383. —№2. —С. 105—107.

9. Гуськов Е.П., Павлов Ю.И., Тер-Аванесян М.Д., Чистяков В.А. Влияние гипербарической оксигенации на выживаемость, мутагенез и рекомбиногенез одноклеточных организмов // Цитология и Генетика. Киев, 1987 — Т. 21. — № 1. —С. 10—16.

10. Гуськов Е.П., Шкурат Т.П., Милютина Н.П., Прокофьев В.Н., Покудина И.О., Машкина Е.В., Тимофеева И.В. Влияние аллантоина на активность ферментов, регулирующих ROS-зависимый статус организма // ДАН. 2001. —Т. 379. —№3. —С. 398—401.

11. Дудкин С.И. Экологическая физиология и биохимия азово-черноморских гидробионов и проблемы рыбного хозяйства Краснодарского края // Сб. тр. КГУ «Экологические проблемы Краснодарского края». — 2001. -№12.-С. 189-194.

12. Дудкин С.И., Колесникова Л.В., Цема Н.И., Цыбульская М.А. Токсикологический и биохимический мониторинг популяций рыб Азовского моря // Тез. Докл. Всеросс. Конф. «Современные проблемы водной токсикологии». Борок, 2002. — С.81-87.

13. Ефуни С.Н., Каплан Е.Я., Лукаш А.И. и др. Особенности хеми-люминесценции системы, содержащей Н202 в присутствии соединений железа // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 1984. - №7. -С. 42-43.

14. Захаров И.А. Мутационный процесс у грибов. — Л.: Наука,1980. —287 с.

15. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. — Л.: Наука, 1984. — 144 с.

16. Иванов И.И. Гуськова P.A. Локтюшкин A.B., Федоров Г.Е. Мембрана эритроцита: барьер или ворота для кислорода? Докл. МОИП. 2005. — Т. 36. —С. 53—55.

17. Каган В.Е., Орлов О.Н., Прилипко Л.Л. Проблема анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов // ВИНИТИ. Биофизика. 1986. Т. 18. С. 5-133.

18. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. — М: Мир, 1984. —Т. 2.-96—97 с.

19. Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе // Успехи современной биологии. 1993. — Т. 113 — № 4. — С. 456—470.

20. Комар В.Е., Хансон К.П. Информационные макромолекулы при лучевом поражении клеток. М.: Атомиздат, 1980. - С. 176.

21. Корниенко И.В., Клецкий М.Е., Корниенко И.Е., Внуков И.И., Водолажский Д.И. Механизм ферментативной дисмутации супероксиданион радикала // Биофизика. 2002. — Т. 47. — № 4. — С. 607—610.

22. Корниенко И.В., Клецкий М.Е., Олехнович Л.П., Внуков В.В., Корниенко И.Е., Вейко В.П., Синичкин A.A. Механизм антиоксидантного действия полипептидов: экспериментальное и теоретическое изучение // Биотехнология. 2001. — № 2. — С. 83—88.

23. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. — М: Высшая школа, 1980. — 286 с.

24. Кричевская A.A. Аминокислоты, их производные и регуляция метаболизма. — Ростов н/Д: Изд-во Рост, ун-та, 1983. — 124 с.

25. Кричевская A.A., Лукаш А.И., Антипина Т.В. Механизм ингиби-рования мочевиной перекисного окисления липидов // Известия Северокавказского научного центра высшей школы. Серия естественные науки. 1977.1. —С. 108—109.

26. Лакин Г.Ф. Биометрия. — М.: Высшая школа, 1980. — 293 с.

27. Линней К. Философия ботаники (изд. подгот. И. Е. Амлинский).1. М.: Наука, 1989. — 456 с.

28. Меныцикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиок-сиданты. М.: Фирма «Слово», 2006. 556 с.

29. Минкин В.И., Симкин Б.Я., Миняев P.M. Квантовая химия органических соединений. Механизмы реакций. — М.: Химия, 1986. — 172 с.

30. Птицын JT.A. Биолюминесцентный анализ SOS—ответа клеток Е. coli/1 Генетика. 1996. — Т. 32. — № 3. — С. 354—355.

31. Пшеничнов P.A., Колотов В.М., Никитина Н.М. и др. Мониторинг общей токсичности природных вод и оценка их очистки методом микробиолюминесценции // Экология. 1999. —№ 3. — С. 228—230.

32. Рябченко Н. И. Радиация и ДНК. М.: Атомиздат, 1979 - С. 86.

33. Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Войнова Н.В. Способ определения генотоксичности химических веществ. Патент РФ № 2179581. 2002.

34. Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Коленко М.А., Азарин К.В. Аллантоин и урат как супрессоры генотоксического эффекта ультрафиолетового излучения длиной волны 300 — 400 нм // Экологическая генетика. 2009. — Т. 7, № 2. — С. 44^6.

35. Самойленко И., Васильев Е., Павлова И., Туманян М. Механизмы бактерицидного действия перекиси водорода // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1983. № 12. - С. 30-33.

36. Скулачев В.П. Как отменить программу старения? // Российский химический журнал. 2009. — Т. 53. — № 3. — С. 125— 140.

37. Скулачев В.П. Нефосфорилирующее дыхание как механизм, предотвращающий образование активных форм кислорода // Молекулярная биология. 1995 — Т. 29. — № 6. — С. 1199—1209.

38. Скулачев В.П. Попытка биохимиков атаковать проблему старения: «Мегапроект» по проникающим ионам. Первые итоги и перспективы // Биохимия. 2007. — Т. 72. — № 12. — С. 1572—1586.

39. Скулачев В.П. Снижение внутриклеточной концентрации 02 как особая функция дыхательных систем клетки // Биохимия. 1994. — Т. 59. —12. —С. 1910—1912.

40. Скулачев В.П. Старение как атавистическая программа, которую можно попытаться отменить. // Вестник РАН. 2005. — Т. 75. — № 9. — С. 831—843.

41. Скурлатов Ю.И., Дука Г.Г., Мизити А. Введение в экологическую химию. М.: Высшая школа, 1994. 400 с.

42. Сорокин В.А., Гладченко Г.О., Валеев В.А. Исследование связывания ионов трехвалентного железа с ДНК // Молекулярная биология. 1983. — Т. 14. — № 4. — С. 868—877.

43. Суслов А.Н., Данилов B.C. Определение токсичности воды и водных экстрактов из объектов окружающей среды по интенсивности биолюминесценции бактерий. Методические рекомендации. М., 1996. 11 с.

44. Тимофеев-Ресовский Н., Савич А., Шаляпов М. Ведение в молекулярную радиобиологию (физико-химические основы). М.: Медицина, 1980. - 320 с.

45. Тимофеев-Ресовский Н.В., Ромпе P.P. О статистичности и принципе усилителя в биологии // Тимофеев-Ресовский Н.В. Избранные труды. Генетика. Эволюция. Биосфера. — М. 1996. — С. 154—172.

46. Франклин Т., Сноу Д. Биохимия антимикробного действия. — М.: Мир, 1984. —240 с.

47. Фридович И. Радикалы кислорода, пероксид водорода и токсичность кислорода. / В кн.: Свободные радикалы в биологии. — М.: Мир, 1979.— С. 190—226.

48. Чайковский Ю.В. Наука о развитии жизни. Опыт теории Эволюции. — М.: Т-во научных изданий КМК, 2003. — 542 с.

49. Чистяков В.А., Водолажский Д.И. Участие дыхательной системы дрожжей-сахаромицетов в защите от токсического действия кислорода // Биохимия. 1996. —Т. 61. —№9. —С. 1606—1612.

50. Чистяков В.А. Характеристика системы защиты от гипербарической оксигенации дрожжей Saccharomyces cerevisiae : автореф. дисс. + канд.биол. наук. Ростов-на-Дону., 1986. 24 с.

51. Чистяков В.А. Хрящевая ткань как источник биологически активных веществ // Вопросы рыболовства. 2004. — Т. 17. — № 1 — С. 174— 178.

52. Чистяков В.А., Водолажский Д.И., Тимошкина H.H., Войнова Н.В. Усиление токсического действия металлов аскорбиновой кислотой // Экология. 2002. — № 4. — С. 331—333.

53. Чистяков В.А., Голубев Г.А., Лисицин A.C. Способ определения супероксидустраняющей активности. Авторское свидетельство № 1793375. 1992.

54. Чистяков В.А., Гуськов Е.П. Усиление рекомбиногенного действия ГБО аскорбатом // Известия СКНД ВШ. Естественные науки. 1985. — № 4. —С. 92—93.

55. Чистяков В.А., Корниенко И.В., Клецкий М.Е., Корниенко И.Е., Лисицын A.C. Новиков В.В. Супероксидустраняющая активность некоторых аминокислот в водных растворах // Биофизика. 2005. — Т. 50. — № 4. — С.601—605.

56. Чистяков В.А., Мирзоян А.В., Тимошкина Н.Н., Рынза Е.Т., Азарин К.В. Способ хранения ДНК. Патент РФ № 2352636. 2009.

57. Чистяков В.А., Сазыкина М.А., Коленко М.А., Червяков Г.Г., Усатов А.В. Метиленовый синий как супрессор генотоксического действия ультрафиолетового излучения длиной волны 300—400 нм // Генетика. 2009. — Т. 45. — № 3 — С. 304—307.

58. Чистяков В .А., Тимошкина Н.Н., Рынза Е.Т., Мухоньков М.М., Мирзоян А.В., Барминцев В.А. Способ иммобилизации образцов ДНК. Патент РФ № 2346984. 2009.

59. Эрнестова JI.C. Экологические модификации и критерии экологического нормирования. JL: Гидрометеоиздат, 1991. 328 с.

60. Acworth I.N., Bailey В. The Handbook of Oxidative Metabolism. — Chelmsford (USA): ESA Inc., 1996. — 40 p.

61. Aleman V., Handler P. Dihydroorotate dehydrohenase. 1.General properties // The Journal of Biol. Chem. 1967. - Vol. 242. - № 5. - P. 4087-4096.

62. Alen C., Sonenshein A.L. Bacillus subtilis aconitase is an RNA— binding protein //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1999. — V. 96. — № 18. — P. 10412—17.

63. Al-Jassabi S., Khalil A.M. Microcystin-induced 8- hydroxy deoxygu-anosine in DNA and its reduction by melatonin, vitamin C, and vitamin E in mice // Biochemistry (Mosc). — 2006. — Vol. 71. — № 10. — P. 1115—1119.

64. Altuvia S., Almiron M., Huisman G., Kolter R., Storz G. The dps promoter is activated by OxyR during growth and by IHF and sigma S in stationary phase // Mol. Microbiol. —1994. — V. 13. — № 2. — P. 265—272.

65. Ames B.N. Cathcart R., Schwiers E., Hochstein P. Uric acid provides an antioxidant defense in humans against oxidant and radical-caused aging and cancer: A hypothesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1981.— V. 78. — № 1. —1. P. 6858—6862.

66. Ames B.N. Endogenous DNA damage as related to cancer and aging //Mutat.Res. — 1989. —Vol.214. — № 1. —P. 41—46.

67. Amorini A.M., Petzold A., Tavazzi B., Eikelenboom J., Keir G., Belli

68. A., Giovannoni G., Di Pietro V., Polman C., D'Urso S., Vagnozzi R., Uitdehaag

69. B., Lazzarino G. Increase of uric acid and purine compounds in biological fluids of multiple sclerosis patients // Clin Biochem. 2009. - V.;42. - №10-11. - P. 1001-1006

70. Archibald F., Fridovich I. The scavenging of superoxide radical by manganous complexes: in vitro // Arch, of Biochem. and Bioph. — 1982. — Vol. 214. —№2.—P. 452—463.

71. Asad S.F., Singh S., Ahmad A., Hadi S.M. Bilirubin/biliverdin— Cu(II) induced DNA breakage; reaction mechanism and biological significance // Toxicol. Lett. —2002. —Vol. 131. —№3. —P. 181—189.

72. Aslund F., Zheng M., Beckwith J., Storz G. Regulation of the OxyR transcription factor by hydrogen peroxide and the cellular thiol—disulfide status // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1999. — № 96. — P. 6161—6165.

73. Atroshi F., Rizzo A., Westermarck T., Ali-Vehmas T. Antioxidant nutrients and mycotoxins // Toxicology. — 2002. — Vol. 15. — № 180 (2). —1. P. 151—167.

74. Balin A., Goodman D., Rasmussen H., Cristofallov V. Oxygen-sensitive stades of cell cicle of human diploid fibroblasts // Trends Journal of Cell. Biol. — 1978. — Vol. 78. — № 5. — P. 390—400.

75. Balla J., Vercellotti G.M., Nath K., Yachie A., Nagy E., Eaton J.W., Balla G. Haem, haem oxygenase and ferritin in vascular endothelial cell injury// Nephrol Dial Transplant. 2003. - V.18. - Suppl 5. - P. v8-vl2.

76. Banerjee R.K. Membrane peroxidases // Molecular and Cellular Biochemistry. 1988. - Vol. 83. - № 2. - P. 105-128.

77. Ban-as F, Loiseau L, Py B. How Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae build Fe/S proteins. // Adv. Microb. Physiol. — 2005. — V. 50. — P. 41—101.

78. Bash A., Lawrence M. molecular requirement for the mutagenicity of malonaldehyde and related acroleins // Cancer Research. 1984. - Vol. 44. - № 7. - P. 2848-2854.

79. Battistony A., Foliarelly S., Gabianelly R., Capo C., Rotilio G. The Cu, Zn superoxide dismutase from Escherichia coli retains monomeric structure at high protein concentration// Biochem J. 1994. - Vol. 320. - № 5. - P. 713-716.

80. Benenson Y. Biocomputers: from test tubes to live cells // Mol. Bio-syst. — 2009. — Vol. 5. — № 7. — P. 675—685.

81. Benenson Y., Adar R., Paz-Elizur T., Livneh Z., Shapiro E. DNA molecule provides a computing machine with both data and fuel // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.— 2003. — Vol. 100. — № 5. — P. 2191—2196.

82. Benov L. How superoxide radical damages the cell // Protoplasma. -2001.- Vol.217.-№ 1-3.-P. 33-36.

83. Benov L., Fridovich I. Escherichia coli expresses a copper- and zinc-containing superoxide dismutase // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269.- № 11. - P. 25310-25314.

84. Benov L., Fridovich I. Why superoxide imposes an aromatic amino acid auxotrophy on Escherichia coli. The transketolase connection // J. Biol. Chem. —1999. — № 274. —P. 4202—4206.

85. Berdanier C.D., Everts H.B. Mitochondrial DNA in aging and degenerative disease. // Mutat. Res. — 2001. — Vol. 475. — № 1—2.— P. 169—183.

86. Beyer W.F. Jr., Fridovich I. Effect of hydrogen peroxide on the iron-containing superoxide dismutase of Escherichia coli // Biochemistry. — 1987. — V. 26. —№5. —P. 1251—57.

87. Bhadury S., Demchik P. simple and rapid method for disruption of Bacteria for protein studies // Appl. and Environ. Microbiology. — 1983. — Vol. 46. — № 4. — P. 941—942.

88. Bielski B.H.J., Richter H.W. A study of the superoxide radical chemistry by stopped—flow radiolysis and radiation induced oxygen consumption.// J. Am. Chem. Soc. —1977. —V 99. —N 9. — P. 3019-3023.

89. Blokhina O., Fagerstedt K.V. Reactive oxygen species and nitric oxide in plant mitochondria: origin and redundant regulatory systems // Physiol. Plant. -2010. Vol. 138. №4. - P.447-462.

90. Bolzan A.D., Bianchi M.S. Telomeres, interstitial telomeric repeat sequences, and chromosomal aberrations // Mutat Res. — 2006. — Vol.612. —№3. —P. 189—214.

91. Boveris A., Oshino N., Chance B. The cellular production on hydrogen peroxide // Biochemical Journal. 1972. - Vol. 128. - № 3. - P. 617-629.

92. Breimer L.H., Lindahl T. DNA glycosylase activities for thymine residues damaged by ring saturation, fragmentation, or ring contraction are functions of endonuclease III in Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1984. - Vol. 259. - № 6. - P. 5543-5548.

93. Brigelius-flohe B., Tpaber M. G. Vitamin E: function and metabolism //The FASEB journal.- 1999.-Vol. 13.-№7.-P. 1145-1155.

94. Brown G., Tomson J., Block N. Effects of hyperbaric oxygen upon S.aureus, S.aeruginosa and S.albicans. Aviation, Space and Environmental Medicine // 1979. — Vol. 50. — № 7. — P. 717—720.

95. Brown O.R. Mechanisms of hyperbaric-oxygen inhibition of growth and net biosynthesis of RNA, DNA, protein and lipids in Escherichia coli// Microbios 1990.-V.64.-№260-261.-P. 135-151.

96. Brown O.R., Seither R.L. Oxygen and redox-active drugs: shared toxicity sites // Fundam Appl Toxicol. 1983. - Vol. 3. - № 4. - P. 209-214.

97. Bruynicks H., Mason N., Morse S. Are physiological oxygen concentration mutagenic? // Nature. — 1978. — Vol. 274. — № 7111. — P. 606—607.

98. Bsat N., Chen L., Helmann J.D. Mutation of the Bacillus subtilis alkyl hydroperoxide reductase (ahpCF) operon reveals compensatory interactions among hydrogen peroxide stress genes // J. Bacteriol. — 1996. — № 178. — P. 6579—6586.

99. Buettner G.R. Activation of oxygen by metal complexes and its relevance to autooxidative processes in living systems // Biochemistry and Bioener-getics. — 1987. — Vol. 8. — № 1—3. — P. 29—36.

100. Bulich A.A. Use of Luminescent Bacteria for Determining Toxicity in Aquatic Environments // Aquatic Toxicology. ASTM 667, Markings L.L. and

101. Kimerle R.A. Eds., American Society for Testing and Materials. — 1979. — P. 98—106.

102. Burgoyne L. A. Solid medium and method for DNA storage U.S. Pat. № 5807527. 1998.

103. Burk R., Nishikimi N., Lowrence R., Chance B. Peroxide removal by selenium dependent and selenium independent glutation-peroxidases in hemoglo-binfree perfused rat liver // Jounal of Biol.Chem. 1978. - Vol. 253. - № 1. - P. 43-49.

104. Buzard G.S., Kasprzak K.S. Possible roles of nitric oxide and redox cell signaling in metal—induced toxicity and carcinogenesis: a review // J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. — 2000. — Vol. 19. — № 3. — P. 179— 199.

105. Cabiscol E., Tamarit J., Ros J. Oxidative stress in bacteria and protein damage by reactive oxygen species // Int. Microbiol. 2000. - V.3. - №1. - P.3-8.

106. Candeias L.P., Steenken S. Electron transfer in di(deoxy)nucleoside phosphates in aqueous solution: rapid migration of oxidative damage (via adenine) to guanine // J. Am. Chem. Soc., 1993. — V.l 15. — № 6.— P. 2437-2440

107. Carlioz A., Touati D. Isolation of superoxide dismutase mutants in Escherichia coli: is superoxide dismutase necessary for aerobic life? // EMBO. J. —1986. —№ 5. — P. 623—360.

108. Carlson J., Carpenter V. The rec AA Gene product is more important than catalase and superoxide-dismutase in protecting E.coli against hydrogen peroxide toxicity // Jounal of Bacteriology. 1980. - Vol. 139. - № 4. - P. 567-575.

109. Carlsson L., Jonsson J., Edlund T., Marklund S. Mice lacking extracellular superoxide dismutase are more sensitive to hyperoxia. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995. - Vol. 92. - № 14. - P. 6264-6268.

110. Carmel-Harel O., Storz G. Roles of the glutathione— and thioredoxin—dependentreduction systems in the Escherichia coli and saccharomyces cerevisiae responses to oxidative stress // Annu. Rev. Microbiol. — 2000. — V. 54—P. 439—61.

111. Cartron M. L., Maddocks S., Gillingham P., Simon J. C. Feo A. -Transport of ferrous iron into bacteria // BioMetals 2006. - V. 19. - №1. - P. 43157

112. Catalâ A. Lipid peroxidation of membrane phospholipids generates hydroxy-alkenals and oxidized phospholipids active in physiological and/or pathological conditions. Chem Phys Lipids.-2009.-V. 157. №1.-P. 1-11.

113. Chakravarti B., Chakravarti D.N. Oxidative Modification of Proteins: Age-Related Changes // Gerontology. — 2006. — Vol. 53. — № 3. — P. 128— 139.

114. Chan E., Weiss B. Endonuclease IV of Escherichia coli is induced by paraquat //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1987. — V. 84. — № 10. — P. 3189— 3193.

115. Chance B. The spectra of the enzyme-substrate complexes of catalase and peroxidase // Arch. Biochem. Biophys. 1952. - Vol. 41. - № 12. - P. 404415.

116. Chang E.C., Kosman D.J. Intracellular Mn (II)—associated superoxide scavenging activity protects Cu,Zn superoxide dismutase—deficient Saccharomyces cerevisiae against dioxygen stress // J. Biol. Chem. —1989. —№ 264. —P. 12172—12178.

117. Chang J.C., Taylor P.B., Leach F.R. Use of the microtox assay system for environmental samples. // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1981. V. 26.N.2. P.150-156.

118. Chaudhary A.K., Nokubo M., Reddy G.R., Yeola S.N., Morrow J.D., Blair I. A., Marnett L.J. Detection of endogenous malonaldehide-deoxyguanosine adducts in human liver // Sciense. 1994. - Vol. 265 (5178). - № 9. - P. 1580 -1582.

119. Cherrington C.A., Hinton M., Chopra I. Effect of short-chain organic acids on macromolecular synthesis in Escherichia coli // J. Appl. Bacteriol. -1990. Vol. 68. - №1.- P.69-74.

120. Chistyakov V., Alexandrov I. Sectoral and salt-pepper eye mosaicism induced by potential and obvious mutagen/carcinogens in white mutants of D.melanogaster // Drosophila Information Service. — 1983. — Vol. 59. — P. 27—28>.

121. Choi H., Kim S., Mukhopadhyay P., Cho S., Woo J., Storz G., Ryu S. Structural basis of the redox switch in the OxyR transcription factor // Cell. — 2001. —№ 105. —P. 103—113.

122. Christman M.F., Morgan R.W., Jacobson F.S., Ames B.N. Positive control of a regulon for defenses against oxidative stress and some heat—shock proteins in Salmonella typhimurium // Cell. —1985. — № 41. —P. 753—672.

123. Claiborn A., Malinovski D., Fridovich I. Purification and characterization of hydroperoxidase II of Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1979. - Vol. 254.- №22.-P. 11664-11668.

124. Claiborne A., Fridovich I. Purification of the o-dianisidine peroxidase from Escherichia coli B. Physicochemical characterization and analysis of its dualcatalatic and peroxidase activities // J. Biol. Chem. 1979. - Vol. 254. - № 10. - P. 4245-4252.

125. Cola D.Di., Sacchetta P., Battista P. Proteolysis in human erythrocytes is triggered only by selected oxidative stressing agents // The Italian Journal of Biochemistry. — 1988. — Vol. 37. — № 3. — P. 129—138.

126. Cunningham R.P., Saporito S.M., Spitzer S.G., Weiss B. Endonuclease IV (nfo) mutant of Escherichia coli // J. Bacteriol. — 1986. — V. 168. —№3. —P. 1120—27.

127. Czapski G., Goldstein S. Role of metal complexes in the formation— detoxication action of active oxygen species // J. Electroanal. Chem. section: Bio-electrochemistry and Bioenergetics. — 1987. — Vol. 232. — № 18. — P. 21—28. '

128. D'Angio C.T., Finkelstein J.N. Oxygen regulation of gene expression: a study in opposites // Mol. Genet. Metab. — 2000. — Vol. 9—10. — № 71 (1—2). — P. 371—380.

129. Davies M.J. The oxidative environment and protein damage I I Biochim. Biophys. Acta. — 2005. —V. 1703. — P. 93-109.'

130. Dean R.T., Fu S., Stocker R., Davies M.J. Biochemistry and pathology of radical—mediated protein oxidation // Biochem. J. — 1997. — V. 324.— Pt 1. —P. 1—18.

131. Decuyper-Debergh D., Piette J., Jassogne-Lion M., De Vorst V. Singlet oxygen mutagenicity induced in the lac operon // Archive int. physiol. et bio-chem. 1986. - Vol. 94. - № 5. - P. 535-538.

132. Del Rio L.A., Corpas F.J., Sandalio L.M., Palma J.M., Gomez M., Barroso J.B. Reactive oxygen species, antioxidant systems and nitric oxide in peroxisomes. J. Exp. Bot. - 2002. - Vol. 5. - № 53 (372). - P. 1255-1272.

133. Demple B., DeMott M.S. Dynamics and diversions in base excision DNA repair of oxidized abasic lesions II Oncogene. — 2002. — V. 21. — № 58.1. P. 8926—34.

134. Demple B., Halbrook J., Linn S. Escherichia coli xth mutants are hypersensitive to hydrogen peroxide // J. Bacteriol. — 1983. — V. 153. — № 2.1. P. 1079—82.

135. Denu J.M., Tanner K.G. Specific and reversible inactivation of protein tyrosine phosphatases by hydrogen peroxide: evidence for a sulfenic acid intermediate and implications for redox regulation // Biochemistry. — 1998. — V. 37. — № 16. — P. 5633—42.

136. DeSecco J.M., Lavin S.M., Hsia S.M., Mavis R.D. Assessment of the carcinogenicity associated with oral exposures to hydrogen peroxide // Food and chemical toxicology. 2000. - Vol. 38. - № 11. - P. 1021- 1041.

137. Dietrich L.E., Price—Whelan A., Petersen A., Whiteley M., Newman D.K. The phenazine pyocyanin is a terminal signalling factor in the quorum sensing network of Pseudomonas aeruginosa // Mol. Microbiol. —2006. —№ 61. —P. 1308—1321.

138. Dingman D., Stanly P. Comparison of two strains of Bacillus larvaewith different catalase activity // Appl. Environ. Microbiol. — 1984. — Vol. 47. — № 6. — P. 1228—1237.

139. Diquiseppi J., Fridovich L. Oxygen toxycity in Streptococcus sanguis // Journal of Biol.Chem. 1982. - Vol. 257. - № 8. - P. 4046-4051.

140. Djaman O, Outten FW, Imlay JA. Repair of oxidized iron—sulfur clusters inEscherichia coli // J. Biol. Chem. — 2004. — V. 279. — № 43. — P. 44590—99.

141. Dosanjh M.K., Roy R., Mitra S. and Singer B.l. N6-Ethenoadenine is preferred over (3-methyladenine as substrate by a cloned human N-methylpurine-DNA glycosylase (3-methyladenine-DNA glycosylase) // Biochemistry. 1994. -Vol. 33. - № 7. - P. 1624-1628.

142. Drozd J., Postgate J. Effects of Oxygene on acetylene reduction, cytochrome content and respiratory activity of Azotobacter chroococcum // Joum. of Gen. Microbiol. — 1970. — Vol. 63. —№ 1. — P. 63—72.

143. Dukan S, Nystrom T. Oxidative stress defense and deterioration of growth-arrested Escherichia coli Cells //. J. Biol. Chem.- 1999/ V.274. - №: 37. -P. 26027-26032

144. Efrat M., Ezma Y. Catalase-negative mutantsof E.coli // Current Microbiology. 1984. - Vol. II. - № 11. - P. 13-18.

145. Ephrussi B., Hottinger H. Cytoplasmic constituents of heredity on an unstable state in yeast // Cold Spring Harbor Symp. Quant. BioL. — 1951. —№ 16. —P. 75—85.

146. Erecinska M., Oshinov N., Loh P. In vitro stadies on yeast cytochrome C peroxidase and its possible function in the electron transfer and energycoupling reactions. Biochem.Biophys. Acta. - 1973. - Vol. 291. - № 1. - P. 1-11.

147. Evans H.M., Bishop K.S. On the existence of a hitherto unrecognized dietary factor essential for reproduction// Science. 1922. - Vol. 56. - P. 650-651.

148. Ezraty В., Aussel L., Barras F. Methionine sulfoxide reductases in prokaryotes // Biochim. Biophys. Acta. — 2005. — V. 1703. — № 2. — P. 221— 29.

149. Farinati F., Cardin R., Degan P., Rugge M., Mario F.D., Bonvicini P., Naccarato R. Oxidative DNA damage accumulation in gastric carcinogenesis// Gut. 1998. - Vol.42. - № 3. - P. 351-356.

150. Farr S.B., D'Ari R., Touati D. Oxygen dependent mutagenesis in Escherichia coli lacking superoxide dismutase // Proc. Natl. Acad. Sci. — 1986. — Vol. 83. — № 11. — P. 8268—8272.

151. Feig D.I., Sowers L.C. and Loeb L.A. Reverse chemical mutagenesis: identification of the mutagenic lesions resulting from reactive oxygen species-mediated damage to DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - № 14.-P. 6609-6613.

152. Felzenszwalb, Pelielo de Mattos J.C., Bernardo-Filho M., Caldeira-de-Araujo A. Shark cartilage-containing preparation: protection against reactive oxygen species. // Food Chem. Toxicol. — 1998. — Vol. 36. — № 12. — P. 1079—1084.

153. Fink S.P., Reddy G.R., and Marnett L.J. Mutagenicity in Escherichia coli of the major DNA adduct derived from the endogenous mutagen, malondial-dehyde // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94. - № 16. - P. 86528657.

154. Flint D.H., Allen R.M. Ironminus signSulfur Proteins with Nonredox Functions //Chem. Rev. — 1996. — V. 96. — № 7. — P. 2315—2334.

155. Flint D.H., Tuminello J.F., Emptage M.H. The inactivation of Fe—S cluster containing hydro—lyases by superoxide // J. Biol. Chem. — 1993. —№ 268. —P.22369—22376.

156. Floyd R.A. Serendipitous findings while researching oxygen free radicals. Free Radic Biol Med. 2009. - V.46. - №8. - P.1004-1013

157. Flury H., Mahler H., Feidman F. A novel respiratore deficient mutant of Saccharomyces cerevisiae // Journal of Biol.Chem. — 1974. — Vol. 249. — № 7. — P. 6130—6137.

158. Forman H., Fisher A. Antioxidant Defenses. In: Oxygen and living process, interdisciplinary approach. - Ed. by Gilbert. - New York, Academic Press, 1981.-P. 235-250.

159. Forman H., Fridovich I. Superoxide dismutase: a comparison of rate constants // Archives of Biochem. and Biophys. 1973. - № I. - P. 396-400.

160. Forman H.J., Torres M. Redox signaling in macrophages // Mol. Aspects Med. 2001.-Vol. 8-10.-№22 (4-5).-P. 189-216.

161. Fowler R.G., Schaaper R.M. The role of the mutT gene of Escherichia coli in maintaining replication fidelity // FEMS Microbiol. Rev. — 1997. —V.21.—№ 1. —P. 43—54.

162. Frei B, England L, Ames BN. Ascorbate is an outstanding antioxidant in human blood plasma. Proc Natl Acad Sci U S A 1989. - V. 86. - P. 6377 -6381

163. Fridovich I. Fundamental aspects of reactive oxygen species, or what's the matter with oxygen? 11 Arm. N. Y. Acad. Sci. — 1999. — Vol. 893. — P. 13—18.

164. Fridovich I. Oxygen toxisity: a radical explanation // The Journal of Experimental Biology. — 1998. — Vol. 201. — № 6. — P. 1203—1209.

165. Fridovich I. Quantitative aspects of the production of superoxide anion radical by milk xantine oxidase // Journ. of Biol. Chem. 1970. - Vol. 245. -№ 16. - P.4053-4057.

166. Fridovich I. Superoxide dismutase. — In: Molecular mechanisms of oxygen activation / Ed. by Hayashi O. // New York: Academic Press., 1974. — P. 453—477.

167. Fridovich I. The biology of oxygen radicals // Science. 1978 - Vol. 201.- №4359.-P. 875-879.

168. Gardner PR, Fridovich I. Inactivation—reactivation of aconitase in Escherichiacoli. A sensitive measure of superoxide radical // J. Biol. Chem. — 1992. —V. 267.—№ 13. —P. 8757—63.

169. George S.E., Allison J.C., Brooks L.R. et al. Modulation of 2,6-dinitrotoluene genotoxicity by alachlor treatment of Fischer 344 rats /Environ, and Mol. Mutagenes. 1998. V. 31. № 3. P. 274-281.

170. Giel J.L., Rodionov D., Liu M., Blattner F.R., Kiley P.J. IscR— dependent gene expression links iron—sulphur cluster assembly to the control of 02—regulated genes in Escherichia coli // Mol. Microbiol. — 2006. — V. 60. — №4. —P. 1058—75.

171. Gilbert D. Oxygen: An overall biological view. — In: Oxygen and living process, interdisciplinary approach / Ed.by Gilbert D. // New York: Academic Press, 1981. — P. 23—44.

172. Gingold E., Saunders G., Lukins H. Biogenesis of mitochondria. X Reassortment of the cytoplasmic genetic determinants for respiratory competenceand erythromycin resistance in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. — 1969. — № 4. —P. 735—744.

173. Gomes A.A., Asad L.M., Felzenszwalb I., Leitao A.C., Silva A.B., Guillobel H.C., Asad N.R. Does UVB radiation induce SoxS gene expression in Escherichia coli cells? // Radiat Environ Biophys. — 2004. — Vol. 43. — № 3. — P. 219—222.

174. Gomes E.M., Souto P.R., Felzenszwalb I. Shark-cartilage containing preparation protects cells against hydrogen peroxide induced damage and mutagenesis // Mutat. Res. — 1996. — Vol. 367. — № 4. — P. 204—208.

175. Gonzalez R.P., Leyva A., Morales M.O. Shark cartilage as source of antiangiogenic compounds: from basic to clinicalresearch // Biol. Pharm. Bull. — 2001. —Vol.24.—№ 10.— P. 1097—1101.

176. Gort A.S., Imlay J.A. Balance between endogenous superoxide stress and antioxidant defenses // J. Bacteriol. —1998. —№ 180. — P. 1402—1410.

177. Gossin S., Fridovich I. The purification and properties of superoxide dismutase from Saccharomyces cerevisiae // Biochem. and Biophys. Acta. 1972.

178. Vol. 289. № 2. - P. 276-283.

179. Gralnick J., Downs D. Protection from superoxide damage associated with anincreased level of the YggX protein in Salmonella enterica. // Proc. Natl. Acad. Sci.USA. —2001.—V. 98. —№ 14.—P. 8030—35.

180. Grant C.M., Quinn K.A., Dawes I.W. Differential protein S— thiolation of glyceraldehyde—3—phosphate dehydrogenase isoenzymes influences sensitivity to oxidative stress // Mol. Cell. Biol. — 1999. — V. 19. — №4. —P. 2650—6.

181. Grant R.A., Filman D.J., Finkel S.E., Kolter R., Hogle J.M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA // Nat. Struct. Biol. —1998. —V. 5. — № 4. —P. 294—303.

182. Green, D. The electromechanochemical model for energy coupling in mitochondria // Biochim. Biophys. Acta 1974.- V. 346.-№l. - p. 27-78.

183. Greenberg J.T., Monach P., Chou J.H., Josephy P.D., Demple B. Positive control of a global antioxidant defense regulon activated by superoxide— generating agents in Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. —1990. —№ 87.—P. 6181—6185.

184. Gregory E. M., Dapper C.H. Isolation of an iron-containing superoxide dismutase from Bacteroides fragilisireconstitution as a manganese-containing enzyme // Arch. Biochem. Biophys. 1983. - Vol. 220. - P. 293-300.

185. Gregory E., Fridovich I. Induction of superoxide dismutase by molecular oxygen // Journal of Bacteriology. 1973. - Vol. 114. - № 2. - P. 543-548.

186. Gregory E., Fridovich I. Oxygen metabolism in Lactobacillus planta-rum // Journal of Bacteriology. — 1974. — Vol. 117. — № 1. — P. 166— 169.

187. Gregory E., Gossin S., Fridovich I. Superoxide dismutase and oxygen toxicity in a eukaryote // Journal of Bacteriology. — 1974. — Vol. 117. — № 2.1. P. 456—463.

188. Griffiths S.W., Cooney C.L. Relationship between protein structure and methionine oxidation in recombinant human alpha 1—antitrypsin // Biochemistry. — 2002. — V. 41. — № 20. — P. 6245—52.

189. Grimaud R, Ezraty B, Mitchell JK, Lafitte D, Briand C, et al. Repair of oxidized proteins. Identification of a new methionine sulfoxide Reductase // J. Biol. Chem.- 2001. -V. 276. № 52. - P.48915^18920

190. Guidot D.M., McCord J.M., Wright R.M., Repine J.E. Absence of electron transport (Rho 0 state) restores growth of a manganese-superoxide dismu-tase-deficient Saccharomyces cerevisiae in hyperoxia // J. Biol. Chem. — 1993.

191. Vol. 268. — № 2. — P. 26699—26703.

192. Guidot D.M., Repine J.E., Kitlowski A.D., Flores S.C., Nelson S.K.,

193. Wright R.M., McCord J.M. Mitochondrial respiration scavenges extramitochon-drial superoxide anion via a nonenzymatic mechanism // J. Clin. Invest. — 1995. — Vol. 96. — № 2. — P. 1131—1136.

194. Guskov E., Chistyakov V. Petite mutants of Saccaromyces cerevisiae sensitive to increased oxygen pressure // X-lnternational Specialised Congress on genetic and molecular biology of Saccharomyces Cerevisiae. Sofia. Bulgaria, 1985. —P. 111.

195. Hall B. Yeast thermotholerance does not requre protein synthesis // Journal of Bacteriology. — 1983. — Vol. 156. — № 3. — P. 1363—1365.

196. Halliwell B. Oxidation of formate by peroxisomes and mitochondria from spinach // Biochemical Journal. 1974. - № 1. - P. 77-85.

197. Halliwell B. The biological effects of the superoxide radical and its products // Bull. Europ. Physiopath. Resp. 1981. - Vol. 17. - № 1. - P. 2128.

198. Halliwell B., Gutteridge J.M.C., Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease // Biochem J. 1984. - Vol. 219. - № 1. - P. 1-14.

199. Hamilton G., Libbi D. The valence of copper and the role of superoxide in the D-Galactose-oxidase catalysed reaction // Biochem. and Biophys. Research Communication. 1973. - Vol. 55. - № 2. - P. 333-340.

200. Harley J.B., Flaks J.G., Goldfme H., Bayer M.E., Rasmussen H. Hyperbaric oxygen toxisity and ribosome destruction in Escherichia coli K 12 // Canad. J.Microbiol. —1981.—Vol. 27.— № 1. — P. 44—51.

201. Harrison D., Griendling K.K., Landmesser U., Hornig B., Drexler H. Role of oxidative stress in atherosclerosis // Am. J. Cardiol. 2003. - Vol. 91. - № 3.-P.7-11.

202. Hartman P., Eisenstark A. Killing of Escherichia coli K-12 by near-ultraviolet radiation in the presence of hydrogen peroxide: role of doble strand DNA Breaks in absence of recombinational repair // Mut. Research. — 1980. — Vol. 72. —№ 1. — P. 31—42.

203. Hassan H.M., Fridovich I. Regulation of the' synthesis of superoxide dismutase in Escherichia coli. Induction by methyl viologen // J. Biol. Chem. — 1977. —№ 252. —P. 7667—7672.

204. Hassan M., Fridovich I. Enzymatic defense against the toxicity of oxygen and streptonigrin in Escherichia coli // Journal of Bacteriology. 1977. -Vol. 129. - № 3. - P. 1574-1583.

205. Hassan M., Fridovich I. Enzymatic defense against the toxicity of oxygen and streptonigrin in Escherichia coli // Journal of Bacteriology. 1977. -Vol. 129.-№3.-P. 1574-1583.

206. Hayes J.D., McLellan L.I. Glutathione and glutathione-dependent enzymes represent a co-ordinately regulated defence against oxidative stress // Free Radic Res. 1999. - V.31. - №4. - P. 273-300.

207. Hearse D Ji, Manning A.S., Downey J.M., Yellon D.M. Xanthine oxidase: a critical mediator of myocardial injury during ishemia and reperfusion? // Acta Physiologica Scandinavica. 1986. - Suppl. 548. - P. 65-78.

208. Heinz G. H., Hoffman DJ. Methylmercury chloride and selenome-thionone enteractions jn health and reproduction- in mallards/ZEnviroti. Toxicol. andlChem. 1998. V.17. № 2. P: 139-145.

209. Hilliker A.J., Duyf B., Evans D., Phillips J. Urate-null rosy mutants of Drosophila. melanogaster are hypersensitive to oxygen stress // Proc. Natl. Acad: Sci. USA. 1992. - Vol. 89. - № 5. - P. 4343-4347.

210. Hofmann B., Hecht H.-J., Flohe L. Peroxiredoxins // Biol Chem. — 2002. — V. 383. — № 3—4. — P. 347—64.

211. Hogg M., Wallace S.S., Doublie S. Bumps in the road: how replicative DNA polymerases see DNA damage // Curr. Opin. Struct. Biol. — 2005.—V. 15. —№ 1. — P. 86—93.

212. Hondorp E.R., Matthews R.G. Oxidative stress inactivates cobalamin—independent methionine synthase (MetE) in Escherichia coli // PLoS. Biol. —2004. —V. 2. —P. 1738-53.

213. Horsburgh M.J., Clements M.O., Crossley H., Ingham E., Foster S J.

214. Jacob R.A., Burri B.J. Oxidative damage and defense // Am J Clin Nutr. 1996. - V.63. - №6. - P.985S-990S.

215. Jakob U., Muse W., Eser M., Bardwell J.C. Chaperone activity with a redox switch // Cell. — 1999. — V. 96. — № 3. — P. 341—52.

216. Jang S., Imlay J.A. Micromolar intracellular hydrogen peroxide disrupts metabolism by damaging iron—sulfur enzymes // J. Biol. Chem. —2007. —№ 282. —P. 929—937.

217. Jenney F.E. Jr, Verhagen M.F., Cui X., Adams M.W. Anaerobic microbes: oxygen detoxification without superoxide dismutase.// Science. —1999. — V.286. — N. 5438. — P.306—309.

218. Johnson K.A., Fink S.P. and Mamett L.J. Repair of propanodeoxy-guanosine by nucleotide excision repair in vivo and in vitro // J. Biol. Chem. -1997. Vol. 272. - № 17. - P. 11434-11438.

219. Jordan P.A., Tang Y., Bradbury A.J., Thomson A.J., Guest J.R. Biochemical andspectroscopic characterization of Escherichia coli aconitases (AcnA and AcnB) //Biochem. J. — 1999. — V. 344. — Pt.3. — P. 739—46.

220. Justino M.C., Almeida C.C., Teixeira M., Saraiva L.M. Escherichia coli di—iron YtfE protein is necessary for the repair of stress—damaged iron— sulfur clusters // J. Biol. Chem. — 2007. — V. 282. — № 14. — P. 10352—59.

221. Kang J.G., Paget M.S., Seok Y.J., Hahn M.Y., Bae J.B., Hahn J.S., Kleanthous C., Buttner M.J., Roe J.H. RsrA, an anti—sigma factor regulated by redox change // EMBO J. —1999. — V. 18. — № 15. — P. 4292—8.

222. Katcher H.L. and Wallace S.S., Characterization of the Escherichia coli X-ray endonuclease, endonuclease III I I Biochemistry. — 1983 . Vol. 22. - № 17. - P. 4071-4081.

223. Kehrer J., Haschek H., Witnhi H. The influence of hyperoxia on the toxicity of paraquat and diquat // Drugchem. Toxical. 1979. - Vol. 2. - № 4. - P. 337-408.

224. Kellog E., Fridovich 1. Superoxide, hydrogen peroxide and singlet oxygen in lipid peroxidation by xanthine oxidase system // Journal of Biol. Chem. 1975. - Vol. 250. - № 8. - P. 8812-8834.

225. Keyer K., Imlay J.A. Superoxide accelerates DNA damage by elevating free—iron levels // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. —1996. — № 93. —P. 13635—13640.

226. Kieser T. Factors affecting the isolation of CCC DNA from Strepto-myces lividans and Escherichia coli // Plasmid. — 1984. — Vol. 12. — № 1. — P. 19—36.

227. Kim S.O., Merchant K., Nudelman R., Beyer W.F. Jr., Keng T., DeAngelo J., Hausladen A., Stamler J.S. OxyR: a molecular code for redox— related signaling // Cell. —2002. — № 109. — P. 383—396.

228. Kirkman H.N., Galiano S., Gaetani G.F. The function of catalase-bound NADPH // J. Biol Chem. 1987. - Vol. 262. - № 2.- P. 660-666.

229. Kleinofs A., Smith J. Effect of Excision repair on azide—induced mutagenesis // Mutation Research. — 1976. — Vol. 41. — № 4. — P. 233—240.

230. Kobayashi K., Tagawa S. Activation of SoxR—dependent transcription in Pseudomonas aeruginosa // J. Biochem. —2004. —№ 136. — P. 607—615.

231. Kono Y. Generation of superoxide radical during autooxidation of hydroxylamine and assay for superoxide dismutase // Archives of Biochemistry and Biophysics. — 1978. —№ 1. — P. 189—195.

232. Kono Y., Fridovich I. Isolation and characterization of the pseudoca-talase of Lactobacillus plantarum // J. biol. Chem. 1983. - Vol. 258. - № 10. - P. 6015-6019.

233. Koo M.S., Lee J.H., Rah S.Y., Yeo W.S., Lee J.W., Lee K.L., Koh Y.S., Kang S.O., Roe J.H. A reducing system of the superoxide sensor SoxR in Escherichia coli IIEMBO. J. —2003. —№ 22. — P. 2614—2622.

234. Koppenol W.H. The Haber-Weiss cycle 70 years later // Redox Rep. - 2001.-Vol. 6.-№ 4.-P. 229-234.

235. Koppenol W.H., Moreno J.J., Pryor W.A., Ischiropoulos H., and Beckman. J.S. Peroxynitrite: a cloaked oxidant from superoxide and nitric oxide // Chem. Res. Toxicol. 1992. - Vol. 5. - № 6. - P. 834-842.

236. Kornienko G.G., Lozhichevskaya T.V., Dudkin S.I. Monitoring of reproductive potential of Azov Sea sturgeons under present conditions of habitat // J. Appl. Ichtyol. 1999. - V. 14. - №4-5. - P. 290-291

237. Korshunov S., Imlay J.A. Detection and quantification of superoxide formed within the periplasm of Escherichia coli // J. Bacteriol. —2006. —№ 188. —P. 6326—6334.

238. Kuo C.F., Mashino T., Fridovich I. Alpha, beta—

239. Dihydroxyisovalerate dehydratase. A superoxide—sensitive enzyme // J. Biol. Chem. —1987. — № 262. — P. 4724—4727.

240. Le Moan N., Clement G., Le Maout S., Tacnet F., Toledano M.B. The Saccharomyces cerevisiae proteome of oxidized protein thiols: contrastedfunctions for the thioredoxin and glutathione pathways // J. Biol. Chem.2006. — V. 281. —№ 15. —P. 10420—30.

241. Lee D., Bochner B., Ames B. AppppA heat-shock stress and the cell oxidation // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. — 1983. — № 24. — P. 7496—7500.

242. Lee J.W., Helmann J.D. The PerR transcription factor senses H202 by metal-catalysed histidine oxidation /¡Nature 2006. - V.440. - № 7082. - P.363-367

243. Lee L.R. Shark cartilage contains inhibitors of tumor angiogenesis // Science. — 1983. — V.221. №.4616. — P. 1185—1187

244. Leichert L.I., Jakob U. Protein thiol modifications visualized in vivo //PLoS. Biol. —2004. —V. 2. — № 11. —P. 1723-37.

245. Levenson G.E., Schiltz J.R. The role of ascorbic acid on the structural integrity of developing tooth germs // J. Biol. Buccale. — 1979. — Vol. 7. —№2. —P. 137—148.

246. Levi S., Arosio P. Mitochondrial ferritin// Int J'Biochem Cell Biol. — 2004.-V.36. -№10.-P. 1887-1889.

247. Levin D.E., Hollstein M., Christman M.F., Schwiers E.A., Ames B.N. A new Salmonella tester strain (TA102) with A X T base pairs at the site of mutation detects oxidative mutagens // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. —1982. —№ 79.—P. 7445—7449.

248. Li K., Hein S., Zou W., Klug G. The glutathione—glutaredoxin system in Rhodobacter capsulatus: part of a complex regulatory network controlling defense against oxidative stress // J. Bacteriol. — 2004. — V. 186. — №20.— P. 6800—8.

249. Li W.G., Li Q.H., Tan Z. Detection of telomere damage as a result of strand breaks in telomeric and subtelomeric DNA. // Electrophoresis. — 2005. — Vol. 26. — № 3. — P. 533—536.

250. Ligeza A., Tikhonov A.N., Hyde J.S., Subczynski W.K. Oxygen permeability of thylalcoid membranes: electron paramagnetic resonance spin labeling study // Biochim. Biophys. Acta. —1998. — № 1365. —P. 453-^163.

251. Liochev S.I, Fridovich I. The Haber-Weiss cycle 70 years later: an alternative view // Redox Rep. - 2002. - Vol. 7. - № 1. - P. 55-57.

252. Liochev S.I., Benov L., Touati D., Fridovich I. Induction of the soxRS regulon of Escherichia coli by superoxide // J. Biol. Chem. —1999. —№ 274.—P. 9479—9481.

253. Liochev S.I., Fridovich I. Effects of overproduction of superoxide dismutases in Escherichia coli on inhibition of growth and on induction of glucose—6—phosphate dehydrogenase by paraquat // Arch. Biochem. Biophys. —1992. —№294. —P. 138—143.

254. Liu J., Head E., Gharib A.M., Yuan W., Ingersoll R.T., Hagen T.M.,

255. Liu J., Yeo H.C., Doniger S.J., Ames B.N. Assay of aldehydes from lipid peroxidation: gas chromatography-mass spectrometry compared to thiobarbi-turic acid//Anal Biochem. 1997 Vol. 245. N.2. P.161-166.

256. Llaurado J.G. The saga of BHT and BHA in life extension myths // J. Am. Coll. Nutr. — 1985. — Vol. 4. — № 4. — P. 481—484.

257. Lombard M., Fontecave M., Touati D., Niviere V. Reaction of the desulfoferrodoxin from Desulfoarculus baarsii with superoxide anion. Evidence for a superoxide reductase activity // J. Biol. Chem. —2000. — № 275. P. 115— 121.

258. Long J., Gao F., Tong L., Cotman C.W., Ames B.N., Liu J. Mitochondrial decay in the brains of old rats: ameliorating effect of alpha-lipoic acid and acetyl-L-carnitine // Neurochem. Res. — 2009. — Vol. 34. — № 4. — P. 755—63.

259. Ma Q. Transcriptional responses to oxidative stress: pathological and toxicological Implications // Pharmacol. Ther. 2010. - Vol.125. - №3. - P.376-393.

260. Malich G., Markovic B., Winder C. Human cell line toxicity of binary and ternary chemical mixtures in comparison to individual toxic effects of their components /Arch. Environ. Contam. and Toxicol. 1998. V.35. № 3. P. 370

261. Malins D.C. and Haimanot R. Major alterations in the nucleotide structure of DNA in cancer of the female breast // Cancer Res. 1991. - Vol. 51. -№ 19. - P. 5430-5432.

262. Mao H., Schnetz-Boutaud N.C., Weisenseel J.R, Marnett L.J. and Stone M.P. Duplex DNA catalyzes the chemical rearrangement of a malondialde-hyde deoxyguanosine adduct // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - № 7.-P. 6615-6620.

263. Marnett L.J. Oxyradicals and DNA damage // Carcinogenesis. — 2000. — Vol. 21. —№ 3. — P. 361—370.

264. Marotta R., Colin Y., Goursot R., Bernardi G. A region of extreme instability in the mitochondrial genome of yeast // EMBO J. — 1982. — Vol. 1. — №5. —P. 529—534.

265. Martinez A., Kolter R. Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA—binding protein Dps // J. Bacteriol. — 1997. — V. 179. — № 16.—P. 5188—94.

266. McBride T.J., Preston B.D., Loeb L.A., Mutagenic spectrum resulting from DNA damage by oxygen radicals // Biochemistry. 1991. - Vol. 30. - № 1.-P. 207-213.

267. McLachlan J.A., Arnold S.F., Kotz D.M. et al. Potency of combined estrogenic pesticides //Science. 1997. V.275. № 5298. P. 405-406.

268. Melov S. Therapeutics against mitochondrial oxidative stress in animal models of aging // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 2002. — Vol. 959. — P. 330— 340.

269. Melov S., Ravenscroft J., Malik S. et al. Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics // Science. — 2000. — Vol. 289. — № 5484. —P. 1567—1569.

270. Messner K.R., Imlay J. A. The identification of primary sites of superoxide and hydrogen peroxide formation in the aerobic respiratory chain and sulfite reductase complex of Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. -№15. - P. 10119-10128.

271. Meyer J. Z., Whittaker P.A. Respiratory Repression and the Stability of the Mitochondrial Genome// Molec. gen. Genet. 1977. - V. 151. N.3. 333342.

272. Michaels M.L., Cruz C., Grollman A.P., Miller J.H. Evidence that MutY and MutM combine to prevent mutations by an oxidatively damaged form of guanine in DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1992. —V. 89. — № 15. — P. 7022—25.

273. Miertus S., Scrocco E., Tomasi J. Electrostatic interaction of a solute with a continuum. A direct utilization of ab initio molecular potentials for the prevision of solvent effects // Chemical Physics. — 1981. — Vol. 55. — № 1. — P.l 17—129.

274. Miura T., Muraoka S., Ogiso T. Inhibitory effect of urate on oxidative damage induced by adriamycin-Fe3+ in the presence of H202 // Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. — 1993. — Vol. 79. — № 1. — P. 75—85.

275. Moody C., Hassan H. Mutagenicity of oxygen free radicals // Proc. • Nat. Acad. Sci. U.S.A. — 1982. — Vol. 79 — № 9. — P. 2855—2859.

276. Morimyo M. Anaerobic incubation enhances the colony formation of a polA recB strain of Escherichia coli K—12 // J Bacteriol. — 1982. — V. 152. — № 1. —P. 208—14.

277. Moriya M. Single-stranded shuttle phagemid for mutagenesis studies in mammalian cells: 8-oxoguanine in DNA induces targeted G-C—>T-A transversions in simian kidney cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1993. - Vol. 90. -№ 3. - P. 1122-1126.

278. Mouret S., Baudouin C., Charveron M., Favier A., Cadet J., Douki T.

279. Cyclobutane pyrimidine dimers are predominant DNA lesions in whole human skin exposed to UVA radiation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2006. — Vol. 103. — № 37. — P. 13765—13770.

280. Nachin L., Loiseau L., Expert D., Barras F. SufC: an unorthodox cytoplasmic ABC/ATPase required for Fe—S. biogenesis under oxidative stress // EMBO J. — 2003. — V. 22. — № 3. — P. 427—37.

281. Nahum A., Horvath C. Evaluation of octanol—water partition coefficients by using high—pressure liquid chromatography // J. Chromatogr. — 1980. — Vol. 192. —№. 2, —P. 315—322.

282. Nakamura J., Purvis E.R., Swenberg J.A. Micromolar concentrations of hydrogen peroxide induce oxidative DNA lesions more efficiently than milli-molar concentrations in mammalian cells // Nucleic Acids Research. — 2003. — Vol. 31. —№6. —P. 1790—1795.

283. Neilands J.B. Siderophores // Arch Biochem Biophys. —1993. — V. 302. —№ 1,—P. 1—3.

284. Nishikimi M. Oxidation of ascorbic acid with superoxide ion generated by the xanthine-oxidase system.-Biochem.Biophys // Research Communication. 1975. - Vol. 63. - № 3 . - P. 463-468.

285. Nishikimi M., Machlin L. Oxidation of a-tocopherol model compound by superoxide anion // Arch. Biochem. Biophys. 1975. - Vol. 170. - № 2.- P. 684-690.

286. Nohl H. The biochemical mechanism of the formation of reactive oxygen species in heart mitochondria// J. Mol. Cell. Cardiol. 1981. - Vol. 13. -№ 1 - P. 66-68.

287. Ohno S., Muramoto J., Stenius C., Christian L., Kittrell W.A., Atkin N.B. Microchromosomes in holocephalian, chondrostean and holostean fishes // Chromosoma. — 1969. — Vol. 26. — № 1. P. 35—40.

288. Outten F.W., Djaman O., Storz G. A suf operon requirement for Fe— S cluster assembly during iron starvation in Escherichia coli // Mol. Microbiol. —2004. —V. 52. —№3. —P. 861—72.

289. Outten C.E., Falk R. L. and Culotta V. C. Cellular factors required for protection from hyperoxia toxicity in Saccharomyces cerevisiae/ZBiochem. J. —2005. V. 388. - № 1. -P. 93-101.

290. Pan J.S., Hong M.Z.; Ren J.L. Reactive oxygen species: a double-edged sword in oncogenesis // World J. Gastroenterol. 2009. - Vol.15. - №14. -P. 1702-1707.

291. Pandya G.A. and Moriya M. 1, N6"ethenodeoxyadenosine, a DNA adduct highly mutagenic in mammalian cells // Biochemistry. 1996. - Vol. 35. -№35.-P. 11487-11492.

292. Park S., You X., Imlay J.A. Substantial DNA damage from submicromolar intracellular hydrogen peroxide detected in Hpx— mutants of Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. —2005. —№ 102. —P. 9317— 9322.

293. Park W., Pena—Llopis S., Lee Y., Demple B. Regulation of superoxide stress in Pseudomonas putida KT2440 is different from the SoxR paradigm in Escherichia coli // Biochem. Biophys. Res. Commun. —2006. —№ 341.—P. 51—56.

294. Parsonage D., Youngblood D.S., Sarma G.N., Wood Z.A., Karplus

295. P.A., Poole L.B. Analysis of the link between enzymatic activity and oligomeric state in AhpC, a bacterial peroxiredoxin // Biochemistry. — 2005. — № 44. — P. 10583—10592.

296. Passos J.F., Von Zglincki T. Oxygen free radicals in cell senescence: Are they signal transducers? // Free Radical Research. — 2006. — Vol. 40. — № 12. —P. 1277—1283.

297. Pedersen T., Aust S. The role of superoxide, hydrogen peroxide, singlet oxygen in lipid peroxidation promoted by xanthine-oxidase // Biochem. and Biophys. Research. Communication. 1973. - Vol. 52. - № 10. - P. 1071.

298. Peng T.I., Jou M.J. Oxidative stress caused by mitochondrial calcium overload // Ann N Y Acad Sci. 2010. - Vol.120. - №1. - P. 183-188.

299. Perner A., Andresen L., Pedersen G., Rask-Madsen J. Superoxide production and expression of NAD(P)H oxidases by transformed and primary human colonic epithelial cells // Gut. 2003. - Vol. 2. - № 52(2). - P. 231-236.

300. Phillips D.H., Castegnaro M. and Bartsch H. Post-labelling Methods or the Detection of DNA Damage. Lyon: IARC Scientific Publications, 1993. -P. 64-92

301. Pomposiello P.J., Koutsolioutsou A., Carrasco D., Demple B. SoxRS—regulatedexpression and genetic analysis of the yggX gene of Escherichia coli // J. Bacteriol. — 2003. — V. 185. — № 22. — P. 6624—32.

302. Poole L.B. Bacterial defenses against oxidants: mechanistic features of cysteine—based peroxidases and their flavoprotein reductases // Arch. Biochem. Biophys. — 2005. — № 433. —P. 240—254.

303. Porter W., Lavasseur L., Leffers J.L., Henick A.S. UV Spectrophotometry of autooxidized lipid monolayers while on silicagel // Lipids. 1971. -Vol. 6. - № 1. - P. 16-21.

304. Poyton R.O., Ball K.A., Castello P.R. Mitochondrial generation of free radicals and hypoxic signaling // Trends. Endocrinol. Metab. 2009. -Vol.20.-№7.-P.332-340.

305. Purmal A.A., Lampman G.W., Bond J.P, Hatahet Z. and Wallace S.S. Enzymatic processing of uracil glycol, a major oxidative product of DNA cytosine //J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. - № 11. - P. 10026-10035.

306. Radi R. Peroxynitrite reactions and diffusion in biology // Chem. Res. Toxicol. 1998. - Vol. 11. - № 7. - P. 720-721.

307. Reed C.J., Douglas K.T. Chemical cleavage of plasmid DNA by glutathione in the presence of Cu(II) ions.The Cu(II)-thiol system for DNA strand scission //Biochem J. 1991.- V.275. - Pt 3.-P.601-608.

308. Reveillaud I., Phillips J., Duyf B., Hilliker A., Kongpachith A., Fleming J.E. Phenotypic rescue by a bovine transgene in a Cu/Zn superoxide dismu-tase-null mutant of Drosophila melanogaster// Mol. Cell. Biol. 1994 V. 14. N.2. P.1302-1307.

309. Richter H., Loewen P. Induction of catalase in E.coli by ascorbic acid involves hydrogen peroxide // Biochemical and Biophysical Research Communication. — 1981.—Vol. 100. —№3. —P. 1039—1048.

310. Ritz D., Beckwith J. Roles of thiol—redox pathways in bacteria // Annu. Rev. Microbiol. — 2001. — V. 55— P. 21—48.

311. Rocha E.R., Smith CJ. Transcriptional regulation of the Bacteroides fragilis ferritin gene (ftnA) by redox stress //Microbiology. — 2004. — V. 150.—1. Pt 7. —P. 2125—34.

312. Rodriguez H., Holmquist G.P., D'Agostino R.Jr., Keller J., Akman S.A. Metal ion-dependent hydrogen peroxide-induced DNA damage is more sequence specific than metal specific // Cancer Res. — 1997. — Vol. 1 (15). — № 57(12). — P. 2394—2403.

313. Rush J.D., Koppenol W.H. Reactions of Fe(II)—ATP and Fe(II)— citrate complexes with t—butyl hydroperoxide and cumyl hydroperoxide.// FEBS Lett. —1990. — V.275. — N.l—2. —P.114—116.

314. Sakai A., Nakanishi M., Yoshiyama K., Maki H. Impact of reactive oxygen species on spontaneous mutagenesis in Escherichia coli // Genes. Cells. — 2006, —V. 11. —№7.—P. 767—78.

315. Sakano K., Oikawa S., Hasegawa K., Kawanishi S. Hydroxyurea induces site-specific DNA damage via formation hydrogen peroxide and nitric oxide // Japan J. Cancer Res. — 2001. — Vol. 92. — № 11. — P. 1166—1174.

316. Salacinski H.J., O'Brien P. 12 evidence that the reactions of nickel in the presence of vitamin C do notproduce toxic oxygen intermediates such as hy-droxyl but ascorbate and carbonradicals // Arch. Toxicol. — 2000. — Vol. 74. — № 1. —P. 5—12.

317. Sambrook J., Fritsch E. and Maniatis T., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (second ed.). — Cold Spring Harbor: CSHL Press, 1989. — 1659 p.

318. Saparbaev M., Kleibl K., and Laval J. Escherichia coli, Saccharo-myces cerevisiae, rat and human 3-methyladenine DNA glycosylases repair 1, N6-ethenoadenine when present in DNA // Nucleic Acids Res. 1995. - Vol. 23. - № 18. - P. 3750-3755.

319. Sato M., Kondoh M. Recent studies on metallothionein: protection against toxicity of heavy metals and oxygen free radicals // Tohoku J. Exp. Med.2002. —Vol. 196. —№ 1.—P. 9—22.

320. Saunders B., Holmes A., Stark B. Peroxidase. Buffer-worth, London, 1964.-218 p.

321. Schloss J.V. Oxygen toxicity from plants to people // Planta. 2002.1. V.216. №1. — P.38-43.

322. Seaver L.C., Imlay J.A. Are respiratory enzymes the primary sources of intracellular hydrogen peroxide? // J. Biol. Chem. —2004. —№ 279. —P. 48742—48750.

323. Seaver L.C., Imlay J.A. Hydrogen peroxide fluxes and compartmentalization inside growing Escherichia coli // J. Bacteriol. — 2001. — №183.—P. 7182—7189.

324. Sedelnikova O.A., Redon C.E., Dickey J.S., Nakamura A.J., Georgakilas A.G., Bonner W.M. Role of oxidatively induced DNA lesions in human pathogenesis //Mutat. Res. 2010. - Vol. 704. - №1-3. - P.152-159.

325. Sen C.K., Khanna S., Gordillo G., Bagchi D., Bagchi M., Roy S. Oxygen, oxidants, and antioxidants in wound healing: an emerging paradigm // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2002. - Vol. 5. - № 957. p. 239-249.

326. Senft A.P., Dalton T.P., Nebert D.W., Genter M.B., Hutchinson R.J., Shertzer H.G. Dioxin increases reactive oxygen production in mouse liver mitochondria // Toxicol Appl Pharmacol. — 2002. — Vol. 178. — № 1. — P. 15—21.

327. Shackelford R.E., Kaufmann W.K., Paules R.S. Oxidative stress and cell cycle checkpoint function // Free Radic. Biol. Med. — 2000. — Vol. 29. — №9. —P. 1387—1404.

328. Shibutani S., Takeshita M. and Grollman.A.P. Insertion of specific bases during DNA synthesis past the oxidation-damaged base 8-oxodG // Nature. -1991. Vol. 349. - № 6308. - P. 431-434.

329. Shimizu N., Kobayashi F., Hayashi K. Reaction of superoxide radical with catalase, mechanism of the inhibition of catalase by superoxide radicals // The Journ. Of Biol. Chem. — 1984. — Vol. 259. — № 7. — P. 4414—4418.

330. Shinar E., Navok T., Sheviour J. The analogous mechanism of enzymatic inactivation induced by superoxide and ascorbate in the presence of copper // The Journ. of Biol. Chem. 1983. - № 24. - P. 1477-1478.

331. Singh H., Ewing D. Methylene blue sensitized photoinactivation of E.coli ribosomes effection RNA and protein components // Photochem.and Photobiol. 1978. - Vol. 28. - № 4-5. - P. 539-545.

332. Singh H., Vada A. Singlet oxygen-major reactive species in furocu-marin photosensitized inactivation of E.coli ribosomes // Photochem. and Photo-biol. 1978. - Vol. 28. - № 4-5.- P. 547-552.

333. Singh K., Singh A., Singh D.K. Synergism of MGK-264 and pipe-ronyl butoxide on the toxicity of plant derive molluscicides//Chemosphere. 1998. V. 36, № 15.-P. 3055-3060.

334. Singh M., Nam D.T., Arseneault M., Ramassamy C. Role of Byproducts of Lipid Oxidation in Alzheimer's Disease Brain: A Focus on Acrolein // J Alzheimers Dis.- 2010. V. 15. Epub ahead of print.

335. Sivakumar V., Thanislass J., Niranjali S., Devaraj H. Lipid peroxidation as a possible secondary mechanism of sterigmatocystin toxicity // Hum. Exp. Toxicol. 2001. - Vol. 8. - № 20 (8). - P. 398-403.

336. Skulachev V.P. How to Clean the Dirtiest Place in the Cell: Cationic Antioxidants as Intramitochondrial ROS Scavengers // IUBMB Life. — 2005. — Vol. 57. — № 4—5. — P. 305—310.

337. Skulachev V.P. Role of uncoupled and non—coupled oxidations in maintenance of safely low levels of oxygen and its one—electron reductants // Q. Rev. Biophys. — 1996. — Vol. 29. — № 2. — P. 169—202

338. Slonimski P., Tzagoloff A. Localization in yeast mitichondrial DNA of mutation expressed in a deficiency of cytochrome oxidase and/or coenzyme QHA —cytochrome c—reductase // European Joum. of Biochem. — 1976. — Vol.61. —№ 1. —P. 27—41.

339. Slupphaug G., Kavli B., Krokan H.E. The interacting pathways for prevention and repair of oxidative DNA damage // Mutat. Res. — 2003. — Vol. 29. —№3. —P. 231—251.

340. Song Y., Kang J., Wang Z., Lu X., Gao J., Wang L. Study on the interactions between CuL(2) and Morin with DNA // J. Inorg. Biochem. — 2002. —

341. Vol. 91. — № 3. — P. 470—474.

342. Soonsanga S., Fuangthong M., Helmann J.D. Mutational analysis of active site residues essential for sensing of organic hydroperoxides by Bacillus subtilis OhrR // J. Bacteriol. — 2007. — V. 189. — № 19. — P. 7069—76.

343. Spinks D, Shanks EJ, Cleghorn LA, McElroy S, Jones D, James D, Fairlamb AH, Frearson JA, Wyatt PG, Gilbert IH. Investigation of trypanothione reductase as a drug target in Trypanosoma brucei // ChemMedChem. 2009. -V.4. - №12. P. 2060-2069.

344. Stanier R., Dondoroff M., Adelberg E. General Micribiology / Ed. by Mac Milan. London, 1971.-267 p.

345. Starkov A.A. Protein-mediated energy-dissipating pathways in mitochondria. // Chem. Biol. Interact. — 2006. — Vol. 163. — № 1—2. — P. 133— 144.

346. Steinbrenner H., Sies H. Protection against reactive oxygen species by selenoproteins. Biochim Biophys Acta. 2009. - V.1790. - №11. - P.1478-1485.

347. Suslova T.B., Cheremisina Z.P., Korkina L.G. Free radical generation during interaction of chrysotile asbestos with natural compounds // Environ. Res.- 1994. Vol.8. - № 66 (2). - P. 222-234.

348. Tang Y., Guest J.R. Direct evidence for mRNA binding and post— transcriptionalregulation by Escherichia coli aconitases // Microbiology. — 1999.

349. V. 145.—Pt. 11, —P. 3069—79.

350. Tao K., Fujita N., Ishihama A. Involvement of the RNA polymerasealpha subunit C—terminal region in co—operative interaction and transcriptional activation with OxyR protein // Mol. Microbiol. —1993. —№ 7. — P.859—864.

351. Tchou J., Kasai H., Shibutani S., Chung M.H., Laval J., Grollman

352. A.P., Nishimura S. 8—oxoguanine (8—hydroxyguanine) DNA glycosylase and itssubstrate specificity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1991. — V. 88. — № 11. — P. 4690—94.

353. Thacker T., Parker W. The indication of mutation in yeast by hydrogen peroxide // Mutation Research. — 1976. — Vol. 38. — № 1. — P. 43—52.

354. Theil E. C. Ferritin: At the Crossroads of Iron and Oxygen Metabolism // The Journal of Nutrition 2003.- V. 133.- №5. - P.1549S-1553S.

355. Toyokuni S. Reactive oxygen species-induced molecular damage and its application in pathology // Pathol. Int. — 1999. — Vol. 2. — № 49 (2). — P. 91—102.

356. Traber M.G. Heart disease and single-vitamin supplementation // Am. J. Clin. Nutr. — 2007. — Vol. 85. — № 1. p. 293—299.

357. Trachtenberg B.H., Hare J.M. Biomarkers of oxidative stress in heart failure// Heart Fail Clin. 2009. - V.5 - №4. - P.561-577.

358. Triantaphylides C., Havaux M. Singlet oxygen in plants: production, detoxification and signaling // Trends Plant Sci. 2009. - V.14. - №4. - P.219

359. Tsaneva I.R., Weiss B. soxR, a locus governing a superoxide response regulon in Escherichia coli K—12 // J. Bacteriol. —1990. —№ 172. —P. 4197—4205.

360. Ursini F., Maiorino M., Gregolin C. The selenoenzyme phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase // Biochim Biophys Acta. 1985. - Vol. 839.-№ l.-P. 62-70.

361. Ushiyama M., Mihara M., The simple method for malonaldehide determination // Anal. Biochem. — 1978. —- Vol. 86. — № 2. — P. 271—278.

362. Vaidyanathan V.G., Nair B.U. Oxidative cleavage of DNA by triden-tate copper (II) complex // J. Inorg. Biochem. — 2003. — Vol. 93. — № 1. — P. 271—276.

363. Valdivia E., Martinez J., Ortega J., Montoya E. Control of catalase and peroxidase biosynthesis by carbon source and oxygen in the yeast Saccharo-myces cerevisiae // Can. J. of Microb. — 1983. — Vol. 29. — № 9. — P. 1200— 1204.

364. Varghese S., Tang Y., Imlay J.A. Contrasting sensitivities of Escherichia coli aconitases A and B to oxidation and iron depletion // J. Bacteriol. — 2003. —V. 185. —№ 1. —P. 221—230.

365. Varghese S., Wu A., Park S., Imlay K.R., Imlay J.A. Submicromolar hydrogen peroxide disrupts the ability of Fur protein to control free—iron levels in Escherichia coli // Mol. Microbiol. — 2007. — V. 64. — № 3. — P. 822—830.

366. Visick J., Clarke S. RpoS- and OxyR-independent induction of HP-1 catalase at stationary phase in Escherichia coli and identification of lpos mutations in common laboratory strains // J. Bacteriol. 1997. - Vol. 179. - № 13. - P. 41584163.

367. Voitkun V. and Zhitkovich A. Analysis of DNA-protein -crosslinking activity of malondialdehyde in vitro // Mutat. Res. 1999. - Vol. 424. - № 2. - P.97.106.

368. Voss P., Siems W. Clinical oxidation parameters of aging // Free Radic.Res. —2006. —Vol. 40. —№ 12.—P. 1339—1349.

369. Vaca C.E., Fang J.L., Mutanen M. and Valsta,L. P-Post-labeling determination of DNA adducts of malonaldehyde in humans: Total white blood cells and breast tissue // Carcinogenesis. 1995. - Vol. 16. - № 8. - P. 1847-1851.

370. Wainwright M., Phoenix D.A., Gaskell M., Marshall B. Photobacte-ricidal activity of methylene blue derivatives against vancomycin-resistant Entero-coccus spp // J. Antimicrob. Chemother. — 1999. — Vol. 44. — № 6. — P. 823— 825.

371. Walling C. Fenton's reagent revisited. //Acc. Chem. Res . — 1975. — V. 8,—N.I. —P.125-131.

372. Wang D., Kreutzer D.A. and Essigmann J.M. Mutagenicity and repair of oxidative DNA damage: insights from studies using defined lesions // Mutat. Res. Fundam. Mol. Mech. Mutagen. 1998. - Vol. 400. - № 1. - P. 99-115.

373. Wang M., Dhingra K., Hittleman W.N., Liehr J.G., de Andrade M. and Li.D. Lipid peroxidation-induced putative malondialdehyde-DNA adducts in human breast tissues // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1996. - Vol. 5. - № 9.-P. 705-710.

374. Ward J.F. DNA damage produced by ionizing radiation in mammalian cells: identities, mechanisms of formation and reparability // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1988. - Vol. 35. - № 1. - P. 95-125.

375. Ward J.F., Limoli C.L., Calabro-Jones P. and Evans J.W. Radiation versus chemical damage to DNA. In: Cerutti P.A., Nnygaard O.F. and Simic M.G. (eds.). / Anticarcinogenesis and Radiation Protection. - Plenum, New York, 1987.-P. 321.

376. Waters R., Moustacchi E. Excision of pyrimidine dimers from the nuclear DNA of a haploid respiration-deficient (rho") strain of Saccharomyces cerevisiae // Photochem.and Photobiol. — 1975. — Vol. 21. — № 3. — P. 441— 444.

377. Wefers H. Singlet oxygen in biological systems // Electroanal. Chem. Section: Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 1987. -Vol. 232. - № 18. - P. 91-104.

378. Weiss S. Oxygen, ischemia and inflammation // Acta Physiologica Scandinavica. — 1986. — Vol. 126. — Suppl. 548. — P. 9—37.

379. Wetterhahn K.E., Hamilton J.W., Aiyar J., Borges K.M., Floyd R. Mechanism of chromium(VI) carcinogenesis. Reactive intermediates and effect on gene expression // Biol. Trace Elem. Res. 1989. - V.21. - P.405-411.

380. Wiesner R.J., Zsurka G., Kunz W.S. Mitochondrial DNA damage and the aging process: facts and imaginations // Free Radic Res. — 2006. — Vol. 40. — № 12. —P. 1284—1294.

381. Wilkie D. The yeast mitochondrial system: a test for antimitichondri-al drugs and mutagens. Top. Enzyme and Ferment // Biotechn.-Chichester: New York, 1982. — P. 132—150.

382. Winterbourn C.C., Metodiewa D. Reactivity of biologically important thiol compounds with superoxide and hydrogen peroxide // Free. Radic. Biol. Med. — 1999. —V. 27. — № 3—4. — P. 322—328.

383. Yamashita N., Murata M., Inoue S., Burkitt M.J., Milne L., Kawani-shi S. Alpha-tocopherol induces oxidative damage to DNA in the presence of cop-per(II) ions // Chem. Res. Toxicol. — 1998. — Vol. 11. — № 8. — P. 855—862.

384. Yeo W.S., Lee J.H., Lee K.C., Roe J.H. IscR acts as an activator inresponse to oxidative stress for the suf operon encoding Fe—S assembly proteins // Mol. Microbiol. — 2006. — V. 61. — № 1. — P. 206—18.

385. Zheng M., Aslund F., Storz G. Activation of the OxyR transcription factor by reversible disulfide bond formation // Science. —1998. — № 279. —P. 1718—1721.

386. Zheng M., Doan B., Schneider T.D., Storz G. OxyR and SoxRS regulation of fur // J. Bacteriol. —1999. — V. 181. — № 15. — P. 4639—4643.

387. Zheng M., Wang X., Templeton L.J., Smulski D.R., LaRossa R.A., Storz G. DNA microarray—mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide // J. Bacteriol. —2001. — № 183. — P. 4562—4570.

388. Zweier J.L., Duke S.S., Kuppusamy P. et. al. Electron paramagnetic resonance evidence that cellular oxygen toxicity is caused by the generation of superoxide and hydroxyl free radicals // FEBS Letters. 1989. - Vol. 252. - № 1-2. -P. 12-16.

Информация о работе

Чистяков, Владимир Анатольевич
доктора биологических наук
Ростов-на-Дону, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Биохимические механизмы неспецифической защиты клетки от окислительного стресса - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Биохимические механизмы неспецифической защиты клетки от окислительного стресса ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические механизмы неспецифической защиты клетки от окислительного стресса"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Чистяков, Владимир Анатольевич

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биохимические механизмы неспецифической защиты клетки от окислительного стресса"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Чистяков, Владимир Анатольевич

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Чистяков, Владимир Анатольевич, Ростов-на-Дону

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биохимические механизмы неспецифической защиты клетки от окислительного стресса
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия