Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические измения гиалинового хряща в преднатальном онтогенезе человека в норме и при некоторых формах остеохондродислпазии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические измения гиалинового хряща в преднатальном онтогенезе человека в норме и при некоторых формах остеохондродислпазии"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

МИНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

СОКОЛЬНИК ВАЛЕНТИНА ПЕТРОВНА

БИОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ГИАЛИНОВОГО ХРЯПА В ПРЕНЙТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ ЧЕЛОВЕКА В НОРКЕ И ПРИ НЕКОТОРЫХ ФОРМАХ ОСТЕОХОНДРОДИСПЛАЗИИ

03.00,04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание уч8ной степени кандидата биологических наук

МИНСК-19Э2

Работа выполнена в лаборатории патогенеза и морфологии врожденны* пороков развития НИИ наследственных и врожденных заболеваний Республики Беларусь

Научные руководители

доктор медицинских наук, . член-корреспондент РАМН, профессор Г.И.Лазвк

кандидат медицинских наук С.П.Фещенко

Официальные оппоненты - доктор биологических наук Н.А.Юсипова

доктор медицинских наук профессор Й.П. Амвросьев

Ведущее учреждение - Белорусский государственный университет

Запита состоится декабря 1992 года в час,

на заседании Специализированного совета К 007.01.02. по присуждению ученой степени кандидата медицинских наук в Минско> медицинском институте (220116, г.Минск, проспект Дзгржинского, НЗ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Минского медицинск( го института.

/С-

Автореферат разослан "за," декабря 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Л.А.Келентович '

Актуальность проблемы.

В медицинской генетике проблема наследственных заболеваний скелета остается одной из наиболее сложных. Генетическая гетерогенность скелетных дисплазий (известно более 100 нозологических форм) и несовериенство их клинико-рентгенологических классификаций требуют выявления дополнительных морфологических и биохимических маркеров отдельных заболеваний. Хотя методические подходы к реиению этой задачи существуют.успехи в их реализации ограничены лишь единичными находками (С.П. Фещенко, 1986; Horton et al, 1Э8Э).

Молекулярные механизмы, обеспечивающие определенный характер формообразования скелета в норме, такие не изучены. Известно только несколько генных продуктов (так называемых регуляторных компонентов), которые возможно задействованы в контроле морфогенеза.Среди них компоненты внеклеточного матрикса: коллагеновне белки, протеог-ликаны. некоторые гликопротеинн.

Логично предположить, что мутации генов, обеспечивалщих синтез данных веществ, могут принципиально изменять пространственный паттерн индивидуального развития через влияние на формообразовательные процессы . Тем не менее, онтогенетические особенности экспрессии отдельных компонентов матрикса в норме изучены недостаточно, тем более не изучены их спектр и структура при остеохондродисплази-ях. Имевшиеся данные зачастуа весьма противоречивы, что затрудняет понимание нолекулярннх механизмов патогенеза скелетных дисплазий.

Принципиально вазной проблемой, изучение которой необходимо для понимания патогенеза остеохондродисплазий, является обнаружение причинно-следственной связи меяду молекулярно-генетическими, биохимическими и морфологическими событиями,выяснение каким образом из определенной молекулярной ситуации однозначно вытекает именно такой^ не иной характер морфологического процесса.Анализ биохимической экспрессии и распределения компонентов внеклеточного ватрикса.в сочетании с изучением ультраструктурной гетерогенности популяции хондроцитов отчасти иозет способствовать разрейекив данной проблемы. Кроме того подобные исследования способствует обнарузенив коле-кулярных маркеров клеточных типов хондроцитов в норме 'и яолййтся актуальными в плане поиска ааркеров отдельных нозологических фора скелетных дисплазий.

Таким образом, изучение характера биохимической экспрессии компонентов внеклеточного матрикса и их распределения в хряяе, в сочетании с ультраструктурнами исследованиям перспективна в плане изу-. чения механизмов патогенеза и способствует углублении навих знаний

относительно механизмов хондрогенеза в норме. Данные подобных исследований имеют определенное значение для усовершенствования методов дифференциальной диагностики скелетных дисрлазий и медико-генетического консультирования, так как способствуют выявлению маркеров отдельных нозологических форм заболеваний.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования являлось изучение биохимических и морфофункциональных особенностей гиалинового хряща в онтогенезе человека в норме и при наследственных скелетных дисплазиях. В соответствии с этим задачи работы заключались в следующем:

1. Изучить особенности экспрессии коллагеновых белков в гиалиновом хряще в пренатальном онтогенезе человека в норме и при наследственных формах системных скелетных дисплазий.

2. Изучить распределение отдельных компонентов матрикса гиалинового хряща в норне и при наследственных Формах остеохондродиспла-зий.

3. Изучить клеточный состав и ультраструктурные особенности внеклеточного матрикса гиалинового хряща в пренатальном онтогенезе человека в норме и при некоторых формах скелетных дисплазий.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Работа является одной из первых, касающихся комплексного изучения биохимических особенностей экспрессии, распределения отдельных компонентов внеклеточного матрикса и ультраструктуры клеточных эле-нентов хряща при редко встречающихся скелетных дисплазиях. Изучен спектр коллагеновых белков, синтезируемых в закладках конечностей человека на 16-22 стадиях развития ( по системе Карнеги), выдвинуто предположение о взаимонезависимой регуляции синтеза коллагена типа II и IX. Впервые изучено распределение коллагена типа I в хряще закладок бедренной кости на ранних стадиях онтогенеза человека.

Проведенное исследование позволило получить убедительное подт-веркдение гипотезы о биохимической гетерогенности одной из летальных форм остеохондродисплазий - ахондрогенеза.

В настоящей работе проведен углубленный анализ ультраструктурной гетерогенности хондроцитов и описано строение околоклеточного пространства всех идентифицированных типов клеток. Показано, что клеточный состав хряща при скелетных дисплазиях менее гетерогенен,

чем в норме. Выявлено также изменение зональных характеристик внек-' .неточного катрикса при гипохондрогенезе, диастрофической дисплазии и синдроме "короткие ребра-полидактилия".

Впервые проведено иммуногистохиаическое изучение распределения тенасцина и протеогегарансульфата в хряще плодов с гнпохондрогене-эом и диастрофической дисплазией. Выявлена экспрессия тенасцина в хряще плода с гипохонярогенезом и аномальное распределение протео-гепарансульфата при диастрофической диспяаэии.

Результата работы имеют определенное значение для более детального понимания процессов интеграции биохимических и иорфологических механизмов патогенеза при ряде скелетных дисплазий и иогут быть использованы для уточнения классификации остеохондродисплазий и их дифференциальной диагностики.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В пренатальнон онтогенезе человека существуют временные различия в количественных и качественных параметрах зкспрессии колла-геновых белков гиалинового хряща.

2. йхондрогенез является биохимически гетерогенной остеохондро-дисплазией.

3. Комплексное морфобиохимическое исследование гиалинового хряца при скелетных дисплазиях позволяет установить корреляцию невду отдельными звеньями их патогенеза.

4. Ультраструктурные исследования клеточной гетерогенности гиалинового хря*а и его внеклеточного матрикса позволяпт оценить диагностическую и патогенетическув значиаость отдельных морфологических маркеров скелетных дисплазий.

Объбм и структура работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, излоле-ния методов и результатов экспериментов, обсуядения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, содеркащего 112 ссылок. Работа изловена на 157 страницах машинописного текста, иллвстрирова-на 61 рисунком и 4 таблицами.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доло!ены на XIV Европейской симпозиуме остеоартрологов ( Сочи, 1987), на Всесовэном симпозидив "Проблемы изучения наследственности человека на уровне белковой

продукции генной экспрессии" ( Иосква, 1989), на II Европейском съезде по дисиорфологии С Франция, Ле-Бишенберг, 1991), на Международной конференции по клинико-рентгенологической диагностике скелетных дисплазий ( Польиа, Люблин, 1991), на Всемирном конгрессе по пренатальной и перинатальной психологии и медицине ( Польва, Краков, 1992).

Публикации.

По теые диссертации опубликовано 9'научных работ.

Материалы и методы.

1. Биохимические исследования коллагеновых белков.

Образцы хряща коленного сустава, ребра и позвоночника плодов с хондродисплазиями получали при аутопсии не позднее 24 часов.пасле смерти. Все образцу хранили до момента экстракции коллагеновых белков при t -24сС. Характеристика материала, используемого в работе, приведена в таблице 1. В качестве контроля использовали хрящ плодов, погибших от асфиксии, родовой травмы, или абортированных по социальным показаниям. Изучение особенностей экспрессии коллагеновых белков в эмбриогенезе человека проведено на почках конечности эмбрионов 16-19 ст. развития (по системе Карнеги) и дистальных фрагментах закладок бедренной кости на 20-23 ст.Эмбрионы были получены при искусственном прерывании беременности и хранились в питательной среде Игла не более 2-4 часов до исследования.

выделение и очистку коллагеновых белков проводили по методу Бургесона и Холистера.( Burgeson and Holllster, 1979), модифицированному Лайбигер с соавт.( 1986). Бромциановые пептиды получали по методу Сага и Борнитейна ( Sage and Bornstein, 1982).Для анализа бромциановых пептидов отдельных цепей коллагена использовали метод Соколова с соавт.С Sokolov et al; 19В9).Коллагеновые белки разделяли в 7Х-Н0Ы полиакриламидном геле,либо в градиентном полиакриламид-ном геле (7Х-15/0 по методу Лэммли ( Laemll,- 1970).Для разделения бромциановых пептидов использовали 12,5/С-ный полиакриламидный гель. Гели окрапивали Кумасси R-250 по методу Фэрбенкса и др.( Fairbenks et al; 1971) и при необходимости окрапивали дополнительно азотнокислым серебром по методу Рей с соавтД Hray et al; 1981). Сканировали электрофореграмыы на денситометрической приставке спектрофотометра "LKB" с компьютерной обработкой денситограмм.

Количественное определение коллагенов проводили как описано

Таблица 1. Характеристика материала, использованного в рзбс-е.

ВОЗРАСТ ТИП НА- КЛИНИЧЕСКАЯ

диагноз СВ неае- СЛЕДОВА- ФОРМА

аях з НИЯ

1. Ахондрогенеэ 24 АР Стальная

тип 18 (Франкаро)

2. Ахондрогенеэ 32 АР - " - .

тип II СЛаягера-Салдино)

3. — " — 38 АР - " -

4. Гипохондрогенез 28 АР/АД - " -

5. Синдром "короткие ребра - 39 АР

полидактилия"

тип I (Салдино-Нунан)

6.. 24 АР - '" -

7. Диастрофическая 28 АР

дисплазия

8. — •• — 27 АР - " -

9. Танатофорная 32 ?

дисплазия

10. — " — 24 - " - - " -

11. — " — 34 - " -

12. -— " — 30 - " - - " -

13. Кампомелический 26 АР Имеются ле-

синдром тальные

форыы

.14. Метатропическая 32 АР/АД - " -

дисплазия • •

15. Псевдоахондроплазия 25 АД - " -

Сокращения: АД - аутосоиио-лоиинатиий АР - аутосоино-рецессивный

? - тип наследования не установлен

- 6 -

Лайбигер с соавторами ( 1986).

2. Иммуногистохимическое исследование распределения компонентов внеклеточного матрикса.

Криостатные срезы толщиной 6-8 микрон фиксировали в течение 10 минут забуференным 47.-ньш формальдегидом, Последующую обработку срезов проводили по методу Виламитьяна с соавтЛUilaeitjana et al; 1389). Инкубации с первыми антителами проводили в течение 1-18 часов. В работе использовали моноспецифические поликлональные антитела против коллагена типа 1 и IU ( НПКО ДИНГО, Москва), моноклональ-ные антитела к стержневому ■ белку большого гепарансульфат протеогликана Склон СПИ, крыса) и клеточному домену тенасцина. Антитела любезно предоставлены сотрудниками ВОНЦ РАМН A.B. Любимовым и Г.А. Банниковым. В качестве вторых антител использовали козьи антитела к иммуноглобулинам кролика меченные ФИТЦ ( НПКО ДИНГО), кроличьи антитела к иммуноглобулинам мыии, меченные ФИТЦ С НПКО ДИНГО), коныогированные с ФИТЦ антитела морской свинки против иммуноглобулинов крысы ( НИИ ЭМ им. Гамалеи, Москва), мышиные антитела к иммуноглобулинам кролика, мечешше пероксидазой (НИИ ЗМ им. Гамалеи), При использовании антител, меченных пероксидазой, срезы предварительно обрабатывали по Хортону с соавт. (Horton et al., 1983). Инкубация со вторыми антителами длилась 1-2 часа. Срезы доокрашива-ли гематоксилин-эозином по стандартной методике, для выявления сульфатированных гликозаминогликанов применяли метод окрашивания альциановым синим при pH 1.0 (Луппа, 1980).

Распределение компонентов внеклеточного матрикса устанавливали такве с помощью иммуногистохимического метода окраски полутонких срезов с использованием антител, перечисленных выше, и комплекса ПАП (ГНИИЗМ), по Хортону (Horton et al., 1983).

3.Электронная микроскопия гиалинового хряща.

Образцы хряща толщиной 1-1,5 мм, полученные не позднее 2 часов после смерти, фиксировали и обрабатывали как описано Годфрей с соавторами (Godfrey et al., 1988). Материал заключали в Эпон-812 по общепринятой методике.

С целью выявления в тканях веществ полисахаридной природы использовали метод электронной цитохимии, предложенный Лафтом ( Га-йер, 1974). Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим по мето-

- 7 -

ду Трумпа с соавт. ( Гайер, 1974).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ 0БС91ДЕНИЕ.

1. Биохимические исследования экспрессии коллагеновых белков в раннем онтогенезе хряца и при наследственных остеохондродисплазиях.

Коллаген - семейство генетически гетерогенных белков. Клетки хрява синтезируют не менее 10 типов коллагена. Предполагается, что некоторые из них причинно вовлечены в регуляция хондрогенеза в процессе эмбрионального развития (Kosher and Solursh, 1989).

Изучение спектра коллагеновых белков, синтезируемых почкой конечности человека на стадии 16-19 и дистальным фрагментом закладки бедренной кости на 20-23 стадиях эмбрионального развития , позволило выявить следующее. Во всех исследованных образцах синтезируется коллагены типа 1 и II, а так«е белки, соответствующие по злектрофо-ретической подвияности цепям коллагена типа XI. Коллаген, пепсиновые Фрагменты которого соответствуют коллагену типа IX, обнаруаен на электрофореграммах начиная с 20 стадии эмбриогенеза, что соответствует началу костеобразования. Полученные результаты свидетель-ствувт о взаимокезависимои синтезе коллагенов типа II и IX. Предпо-ломение о существовании независимого механизма регуляции синтеза данных белков было подтверадена нами при исследовании характера экспрессии коллагенов в гиалиновом хряще при ахондрогенезе типа II (Лангера-Салдино), где в отсутствие коллагена типа II выявлен коллаген типа IX. Это предполоаение таМе согласуется с результатами инмунофлуоресцентного исследования распределения коллагена типа II и IX у эмбрионов цыпленка. Получениями Ковер и Солурв ( Kosher and Solursh, 1989), из которых следует, что локализация данных белков в тканях часто не совпадает.

Относительное содераание различных типов коллагена в пепсиновом экстракте почяя конечности и хрящевых закладках бедреной кости представлены в таблице 2. Как видно из этой таблицы.содерйание коллагена типа I в хрявевах закладках на ранних стадиях эмбрионального развития в сравнении с плодный периодов относительно высокое (по данным С.П.Феяенко ( 1905) содеряанив коллагена типа I в хрячв 40-недельных плодов составляет 6.3Z). Относительное содервание минорного коллагена типа И и коллагена типа II, как следует из соотношения цепей этих белков, такав имеет возрастнуя зависимость, а именно уменьааегся по мере созревания хряаа ( относительное содер-

Таблица 2. Относительное содержание различных типов коллагена в пепсиновом экстракте почки конечности и хряшевых закладках бедренной кости эмбрионов человека.

ИССЛЕДОВАННЫЙ ПЛТЕРЩА СОДЕРЖАНИЕ КОЛЛАГЕНА ТИПА I, в я* СОДЕРЖАНИЕ МИНОРНЫХ КОЛЛЛГЕНОВЫХ БЕЛКОВ в а1С1}+а\С11 В У. а2 С ¡3 в я

1а 2а За

1. ГЬчка конеч-

ности

16 стадия 96.0 12.3 4:0 3.2 54.6 25.7

17 стадия 22.2 12.9 2.6 8.3 70.0 5.6

18 стадия 38.0 14.0 2.2 8.0 66.2 9.7

19 стадия 36.1 14.5 5.9 7.9 62.9 8.6

2. Дистапьный

фрагмент за-

чатка бед-

ренной кости

21 стадия 33.3 17.5 11.0 63.6 7.9

22 стадия 41.3 16.0 11.9 62.2 9.9

23 стадия 50.3 13.4 9.7 63.9 12.9

9 недель 46.3 8.2 8.4 70.3 13.1

* £ о.1 (I) +а2( I) 11) =100Х

** £ 1а+2а+3а+а1( П)+а2( I)+о.1( I) =100*

Относительное содержание коллагена типа I рассчитывали по формуле

2а2СI)* 3

- • 100%

а1( I) +с*1( II)] +5а2( I)

где з - площадь соответствующего пика на денситограмме.

«ание i<*. 2-х, и f«l< П +л!(П)1 составляет в хряце 40- недельного плода I А'/.. 3,87. и 91,1 У. соответственно (Лайбигер и соавт., 1986 )). Кроме того,определенное нами соотношение цепей 1л и 2<х ыовет свидетельствовать о том, что на ранних стадиях эмбрионального раэзития коллаген типа XI имеет не гетеротримернуш структуру молекулы. Аналогичные данные в доступной литературе найдена не были.

Результаты исследований экспрессии коллагеновых белков при скелетных дисплазиях представлены в таблице 3. Наиболее выразенные изменения выявлены в хряще плодов с ахондрогенезом. Различные типы данной патологии отличались по характеру экспрессии основных коллагенов хряща: при ахондрогенезе типа IB наряду с коллагеном типа ГГ синтезируется коллаген типа I; при ахондрогенезе типа II отмечено полное отсутствие коллагена типа И; при гипохондрогенезе выявлен коллаген типа 11 с измененной подвиеностьи цепей, что возможно связано со сверхмодификацией данного белка. Наличие сверхнодифициро-ванного коллагена типа II в хряще при гипохондрогенезе показано ГодФрей и Холистерок (Godfrey and Hollster, 1988),что по мнению авторов связано с мутацией в гене C0L2fll, Однако вряд ли на основании полученного результата правомерно делать однозначный вывод о наличии молекулярного дефекта коллагена типа II. приводящего к сверхао-дификации последнего. Это сомнение обусловлено тем, что Злцепь минорного коллагена типа XI имеет сходную карту брокциановых пептидов п. как предполагаит некоторые авторы (cej. Eyre and Ки, 1387),является продуктом альтернативно сплайсированной нРНК«1(Н) цепи. Кроке того имеются данные, свидетельствупяне, о гетерогенности популяции культивируемых хондроцитов по экспрессии цепей коллагена типа KI (Swoboda et а 1 ., 1989). Следовательно, при патологии преобладание в хряще определенного клеточного типа монет привести к изиенениа соотношения отдельных цепей коллагена.

Кроме того нами выявлены топографические особенности зкспрессии сверхнодифицированного коллагена типа II, наиболызее количество которого обнаружено в хряще коленного сустага и позвоночника, наименьшее - в хряще ребра. В хряще ребра и позвоночника наряду со сверхмодифицированным коллагенои типа II выявлен коллаген типа I, Вознояно. что данные различия в зкспрессии связаны с различием в происхоядении и особенностями дифференцировки хондроцитов из разных участков скелета: в хрящевой ткани, подверяёиноЯ зидохоядра-льной оссификации синтезируется больве сверхводифицированного кол-

Таблица 3. Результаты биохимических исследований экспрессии коллагеновых белков в гиалиновом хряда плодов со скелетными дисплазиями.

АНАЛИТИЧЕСКИЙ ПЕТО А

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В

ЗАБОЛЕВАНИЕ SDS- ПАЛГ СУННАРНО- ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

ГО ПЕПСИНОВОГО СЫВг—ПЕПТИДОВ*

ЭКСТРАКТА

Ахондрогенез типа IB Смесь коллагенов Смесь пептидов кол-

(фраккаро) I и II типов лагена типа I и И

Ахондрогенез типа II Коллаген типа I Смесь пептидов кол-

С Лангера-Салдино) лагена типа I и III

Гипохондрогенез Сверхмодифицирован- Сверхмодифицирован-

ный коллаген ные пептиды коллаге-

типа 11 на типа И

Диаст рсфическая Смесь коллагена Смесь пептидов кол-

диасплазия типа I и 11 лагена типа I и II

Кашоыелический Норма Нэрма

синдром

Синдром "короткие Норма Норма

■ребра - полидаки-

лия"

Танатофорная Норма Норма

дисплазия

Метатропическая Норма Норма

дисплазия

Псвв доах ондроплазия Норма Нзрма

* Пэптиды получали из цепи, соответствуюпей по подвижности «КII) во всех случаях, за исключением ахондрогенеза типа II, где использовали коллагены суммарного пепсинового экстракта.

лагена.

Исследование гиалинового хряща при ахондрогенезе типа II С Лан-гера-Салдино) показало, что основным синтезируемым коллагеном является коллаген типа I. Содержание последнего составило около 1002 в хряще бедренной кости и позвоночника и около 647. в хряще ребра. Полное отсутствие коллагена типа II при данной патологии показано ранее ( Eyre et al., 1986; Murray et al., 198?). Такие изменения не выявлены при других формах остеохондродисплазий и являются, следовательно, специфичными для зтой патологии. Из литературы известно, что коллаген типа I синтезируется недифференцированными лрехондро-генными клетками ( von der Hark, 1980). Позтому приведенные выше данные позволяет предположить, что патогенез заболевания возможно связан с нарушением дифференцировки хондроцитов.

При биохимическом анализе гиалинового хряща плодов с диастрофи-ческой дисплазией обнаружено увеличенное содервание коллагена типа I. Однако это изменение, по-видимомд, не связано с нарушением синтеза коллэгеновых белков хондроцитами и является следствием фиброза хряща, поскольку известно, что коллаген типа I синтезируется фибробластами (Horton et al., 1989).

При кампомелическом синдроме, синдроме "короткие ребра- полидактилия", танатофорной дисплазии, метатропической дисплазии и псевдоахондроплазии существенных изменений в характере экспрессии и структуре основных коллагенов хряща с помощью использованных методов не найдено. Следует отметить, что метод картирования бромциано-вых пептидов позволяет выявить изменения, обусловленные делециями, вставками, либо мутациями, замещающими остатки метионина ( места • расщепления бромцианом), а также мутациями, нарушающими сплайсинг, биосинтетический процессинг, либо экспрессию коллагена (Horton et al., 1989). Полученный нами результат не исключает наличие других мутаций,не затрагивающих данные параметры, например точкозых мутаций, на которые приходится большинство дефектов генон коллагена при несовершенном остеогенезе.

2 . Электронномикроскопические исследования.

С цельв идентификации различных типов хондроцитов в норме и последупщего сравнительного анализа соответствующих клеток, выявленных в хряще при остеохондродисплазиях , проведено электронномик-роскопическое исследование гиалинового хряща на ранних стадиях

хондрогенеза (19-я и 23-я стадии ) и на 27-й неделе пренатального развития. Электронномикроскопическое исследование хрящевых закладок бедренной кости на стадии 19 позволило выявить неоднородность клеточной популяции по ультраструктурным характеристикам. Обнаруке-но два типа клеток: клетки округлой формы, гетерогенные по электронной плотности цитоплазмы, и клетки вытянутой формы. Йналогичные данные получены С.Л. Кабак ( 1930 ). Внеклеточный иатрикс на этой стадии представлен дискретными гранулами и незначительным количеством тонких филаментов без периодичности.

Сходные клеточные типы имелись в хрящевых закладках и на стадии 23. Однако в матриксе хряща эмбрионов этого возраста выявлены существенные иэненения - появились коллагеновые фибриллы,что возможно связано с экспрессией на этой стадии коллагена типа IX. Предполагается, что данный белок определяет трехыернуа иакромолекулярнуа организации хрящевой ткани (Olsen. 1989).

В хряще дкстаглбного отдела бедренной кости 27-недельных плодов нами описано 8 Клеточных типов, отличавшихся ультраструктурныии особенностями й строением околоклеточного матрикса.

Проведено такае изучение клеточного состава и ультраструктуры хондроцитов хряща дистального отдела бедра при синдроме "короткие ребра-полидактилия" типа I, диастрофической дисплазии и гипохондро-генезе. Показано, что при всех исследованных дисплазиях клеточный состав хряца менее гетерогенен, чем в норме. Кроме того выявлено расширение шероховатого эидоплазматического ретикулуна хондроцитов При' синдроме "короткие ребра-полидактилия" типа 1 и гипохондрогене-зе. Но «ненип Янга с соавторами ( Yang et al.,1980) этот признак мовет быть использован как диагностический для синдрома " короткие ребра-полидактилия" типа Ш. Однако полученные нами данные свидетельствует, что расвирение эидоплазматического ретикулука вероятнее всего ыовет указывать на общность отдельных патогенетических звеньев при различиях нозологических Формах заболеваний. Кроме того, исследование дльтраструктуры гиалинового хряца в норме показало, что расширенный эндоплаэмаТический ретикулум - морфологический признак определенных клетсчных типов хондроцитов.

Исследование гиалинового хряща при гипохондрогенеэе выявило таксе преобладание в нем клеток округлой формы, которые по своим уль-траструкт&рнмм особенностям близки к гипертрофированным хондроци-таи. Обсувдение обнарувенных изменений при данной патологии

приведено ниве.

Для оценки особенностей внеклеточного матрикса в норме и при ос-теохондродиспдазиях нами проведено злектронногистохимическае исследование внеклеточного матрикса с использованием метода Лафта( Luft, 1971). Описано строение околоклеточного пространства всех идентифицированных клеточных типов и внеклеточного матрикса различных зон хряща дистального отдела бедра плодов человека в норие и при наследственных остеохондродисплазиях.

При всех исследованных дисплазиях показано изменение зональных характеристик внеклеточного матрикга хряща эпифиза. При диастрофи-ческой дисплазии выявлены коллагеновые структуры, образованные спаренными короткими поперечноисчерченными фибриллами во всех зонах эпифиза. При гипохондрогенезе в дистальном отделе бедра коллагеновые Фибриллы отсутствовали , а в реберном хряще выявлено только небольшое количество тонких фибрилл. Отсутствие коллагена типа II в матриксе -хряща при гипохондрогенезе мояет быть объяснено его внцт-рикпеточной аккумуляцией в результате неполного либо наруиенного процессирования (Horton et al., 1989 ). Моино такие предполо»ить, что для данного белка характерно несколько конформационных изменений, одно из которых приводит к его внутриклеточному накоплении. Полученный нами результат несколько отличается от данных Годфрея и Хол-листера (Godfrey,Hollister,1988), которым не удалось выявить существенных изменений в матриксе хряща на злектронномикроскопическом уровне при гипохондрогенезе. По мнению авторов это объясняется тем, что, наряду со сверхмодифицированным коллагеном типа И, в хряще синтезируется коллаген типа II с неизменённой структурой. Этот результат нами не подтверждён. Наличие небольшого количества тонких фибрилл в рёберном хряще по-видимому связано с присутствием там коллагена типа I .

Необычную структуру коллагеновых фибрилл при диастрофичёской дисплазии моино объяснить изменениями в характере распределения протеогликанов. Известно, что эти вещества оказывают существенное влияние на морфологию коллагеновых фибрилл (Kuijer et al., 1985; Uogel. Trotter,1987).

3.Иммуногистохимические исследования.

С помощью иммуногистохиыических исследований нами изучено распределение тенасцина и лротеогепарансульфата в хряще дистального от-

- И -

дела бедренной кости плодов человека в норме и при наследственных остеохондродисплазиях.а такие распределение коллагена типа I в дис-тальном отделе закладок бедренной кости эмбрионов человека на стадиях 19 и 23 .

Тенасцин - общее название гликопротеинов внеклеточного матрикса, выделенных из различных источников - эмбриональных предмественников мывцы и мозга цыпленка, глиомы и фибросаркомн человека. Распределение данного гликопротеина в хряще развивающейся конечности свидетельствует о том, что тенасцин является бластемоспецифическим маркером.

Протеогепарансульфат - компонент базальных мембран. Это позволяет рассматривать его как вещество, опосредующее взаимодействие хряща с эндотелием. Кроме того цепи гепарансульфата являются составной частью недавно открытого семейства интегрированных в мембрану клеток протеогликанов - синдекана, а поскольку синдекан появляется только там, где имеют место тканевые взаимодействия, и способен взаимодействовать с двумя классами зффекторных молекул - коллагено-выми белками и факторами роста (Bernfteld and Sanderson, 1990),есть веские основания считать его потенциальным медиатором морфогенеза.

С помощью иммунофлуоресцентного метода нами исследовано распределение тенасцина и протеогепарансульфата в хряще дистального отдела бедра плодов человека в норме и плодов с гипохондрогенезом и диастрофической дисплазией. Обнарумено, что в норме данный гликоп-ротеин локализуется вокруг клеток хрящевых каналов и по-видимому является биохимическим маркёром этих клеток. Вместе с тем, следует отметить, что в настоящее время не существует единого мнения относительно принадлешности клеток хрящевых каналов к определенной клеточной линии. Некоторые авторы рассматривают их как гипертрофированные хондроциты (Cole and Cole, 1989

Установленный нами факт синтеза тенасцина клетками хряща дистального отдела бедра при гипохондрогенезе, позволяет предполомить, что этот гликэпротеин имеет определенное отношение к клеточному составу хряща при данной патологии.Косвенно об этом свидетельствуют данные литературы - тенасцин обнарушен в конденсирующейся мезенхиме перед дифференцировкой хондроцитов и рассматривается некоторыми авторами как бластемоспецифический маркер. Более того, отмечено, что в процессе энхондральной оссификации тенасцин появляется вокруг мигрирующих в хрящ остеогенных клеток (Hackle et а!..

198?). Обнарувенный нами синтез данного гликопротеина клетками хряща моает быть причиной выявленных с помощью электронноыикроскопи-ческих и биохимических исследований изменений - округления клеток и сверхмодификации коллагена.Это предполоаение согласуется со следуп-щики фактами. Известно, что добавление тенасцина в культуральную среду ингибирует прикрепление клеток к фибронектиновому субстрату и модулируе" взаимодействие клетка-фибронектин, тем самым способствуя округлению клеток 1Маск1е е1 а1.,1987 ).Следовательно, выявленное нами с помощью морфологических исследований преобладание в хряще клеток округлой формы при гипохондрогенезе моает являться результатом нарушений взаимодействий клетка-субстрат. В какой-то мере ответ на вопрос, каким образом эти данные согласуются с наличием сверхмо-дифицированного коллагена типа П. выявленного нами при биохимических исследованиях, дает работа Йдамса с соавторами (1Штз е1 а1., 1991) о характере экспрессии проколлагенов при переводе культивируемых хондроцитов в суспензии. В названных условиях эти исследователи отметили снижение синтеза проколлагена типа II и увеличение экспрессии коллагена типа X. Однако на электрофореграиме можно видеть таме дополнительнув цепь выае пролКП), которая может представлять собой проЗэ,- либо сверхаодифицированнув про.х1(11)- цепь.

Исследование методом имыунофлворесценции закономерностей распределения тенасцина в хряще плода с диастрофической дисплазией показало его преимущественную локализации в области кистообразных структур, что можно объяснить скоплением вокруг кист фибробластов, синтезирующих данный гликопротеин.

Изучение распределения протеогепарансуяьфата в дистальном отделе бедренной кости плодов человека выявило данное вещество в мембранах хондроцитов неорганизованного хряща, межлакунарноы пространстве зоны первичного костеобразования и вокруг зндотелиальных клеток сосудов. Обнару>енне протеогепарансульата в мембранах хондроцитов позволяет предполо«ить, что он.выполняет в хряще функции рецепторных молекул, которые, как считают некоторые авторы (5о1игэЬ.198Э), опосредуют эффект внеклеточного матрикса и ростовых факторов на хондрогенез.

Б хряще дистального отдела бедренной кости плода с гипохондро-генезом протеогепарансульфат локализован преимущественно в ме«ла-кунарных пространствах и сосудистой стенке. Меалакунарное распределение этого вещества, как было отмечено ранее, характерно для

- 16 -

гипертрофированного хряща в норме.

При исследовании распределения протеогепарансульфата в хряще плодов с диастрофической дисплазией обнарувены полости неясной природы, которые в отличие от сосудов не окраиивались антителами к данному веществу. Кроме того выявлены мелкие светящиеся структуры, напоминающие формирующиеся капилляры.Мелкие светящиеся структуры найдены такве при окраске хряща антителами к коллагену типа 1U.

Последующая окраска срезов альциановым синим позволила выявить участки лизиса хряща различных размеров.Более мелкие были окаймлены альциан-полояительным материалом,что свидетельствует о высоком со-дервании сульфатированных гликозаминогликанов. Альциан-полоЕитель-ный материал имелся такяе внутри этих структур. Крупные кистообраз-ные образования не окраиивались альциановым синим. в отдельных случаях внутрь подобных структур врастали сосуды, эндотелий которых интенсивно прокраиен на протеогепарансульфат.

Выявленные изменения в распределении названных компонентов мат-рикса при диастрофической дисплазии,сочетающиеся с интенсивной капиллярной инвазией, могут свидетельствовать.о нарушении взаимодействий ме»ду хондроцитами и зндотелиальными клетками. Аналогичные кистеобразные стриктуры описании ранее Хортоном с соавторам^Horton et al., 1979). Наличие участков лизиса хряща возможно связано с интенсивной капилляризацией последнего, поскольку известно, что процесс сосудистой инвазии сопровощдается деструкцией матрикса и, в частности,коллагена (Montesano,1986). Выяснение механизмов подобных изменений представляет интерес для будущих исследований.

. Иииуногистохимический анализ распределения коллагена типа I в хрящевых закладках бедренной кости человека на стадии 19 и 23 показал, что-данный белок локализован в надхрящнице и поверхностной зоне хряща. -Это соответствует данным, полученным ранее на животных <Scheven .et.al.. 19В8).

Выводы.

г1.\»В.,крящевых закладках бедренных костей человека на ранних стадиях развития, наряду с коллагеном типа II, синтезируется коллаген типа

1. который локализован преимущественно в поверхностной зоне хряща.

2,' Коллаген типа IX выявляется в хрящевых закладках бедра человека

на 20-ой стадии эмбрионального развития, в то время как коллаген типа И обнаруяен в закладках конечностей начиная с 17-й стадии. Это позволяет предположить существование взаиыонезависимой регуляции синтеза коллагенов типа II и IX.

3. Отсутствие в гиалиновом хряще коллагена типа II при ахондрогене-зе Лангера-Салдино, наличие сверхыодифицированнного коллагена типа II при гипохондрогенезе и синтез коллагенов типа I и II в случае ахондрогенеза Фраккаро свидетельствуют о биохимической гетерогенности данной остеохондродисплазии.

4. Тенасцин в хряще плодов человека преимущественно локализован вокруг клеток хрящевых каналов, а протеогепарансульфат - в мембранах хондроцитов и интерлакунарных пространствах зоны первичного ко-теобразования.

5. Аномальное распределение протеогепарансульфата и коллагена типа IU при диастрафической дисплазии свидетельствуют о нарушении механизмов ангногенеза при данной остеохондродисплазии.

6. Расширенный шероховатый зндоплазматический ретикулум следует рассматривать как неспецифический маркер синдрома "короткие реб-ра-полидактилия" типа III, так как такое нарушение выявляется не только при различных типах данного синдрома, но и при некоторых других формах летальных остеохондродисплазий.

7. Толстые короткие спаренные коллагеновые фибриллы, выявленные во внеклеточном матриксе гиалинового хряща при диастрофическай дисплазии. могут быть использованы в качестве её специфического морфологического маркера ,

Список работ.опубликованных по теме диссертации.

1. Фешенко С.П.. Ребрин И.А.. Лайбигер И.Б.. Сокольник В.П.. Чантурия A.B. Биохимические маркеры различных типов корфофункциональных изменений гиалинового хряща при наследственных остеохондродисплазиях. Тез. докл. XIV симп. Европ. общ. остеоарггр., Сочи, 1987, с. 5/42.

2. Feshchenko S.P., Bylinsky N.N., Sokolnik V.P., Kravzova G.I., Kabak S.L., Jaro3hevich E.Yu. Changes of structure and spectrum of hyaline cartilage extracellular matrix components in inherited forms of osteochondrodysplasias. Math. 17th Symp. Soc. Osteoarth., Debrecen, 1988, p. 40.

3. Фешенко С.П., Сокольник В.П.. Ребрин И.А., Шер Б.М. Отсутствие коллагена типа II и изменение структуры протеогликанов в гиалиновом хряив при ахондрогенеэе типа Лангера-Салдино. Тез. докл. I съезда мед. ген. Укр. ССР. Львов. 1388. с.99.

4. Feshchenko S.P. , Bebrin I.A., Sokolnik V.P., Sher В.M., Sokolov В.P., Kalinin V.N., Lazjuk G.I. The absence of type II collagen and changes in proteoglycan structure of hyaline cartilage in a case of Langer-Saldino achondrogenesis. Hum. Genet. -1989, p.49-54.

5. Фешенко С.П., Оонольник В.П.. Былинский H.H.. Ярошевич Е.Ю., Арыдов H.H.. Кабак C.I. вменение структуры и спектра компонентов внеклеточного матрикса при врожденных пороках развития. Мат 1-й конф. НИИ мед. ген., Томск. 1989. с. 121-122.

6. Сокольник S.U.. Фешенко С.П.. Шер Б.М., Соколов Б.П. Изучение спектра коллагеновых белков на ранних стадиях хондрогенеза человека и при нарушениях дифференцировки хондршитов. Тез. докл. Всесоюзн. симп. "Проблемы изучения наследственности человека на уровне белковых продуктов генной экспрессии. '. Москва. 1989. с. 58.

7. Feshchenko S.P., Sokolnlk V.P., Arydov N.N., Yaroshevich E.Yu. Disturbed structure of extracellular matrix in a case of Langer-Saldino achondrogenesis. Math. 18th Synp. Europ. Soc. Osteoarth., Dubrovnlk, 1990, p. 50.

8. Feshchenko S.P., Krapiva G.A., Kovalev S.I., Kirillova I.A., Novikova I.V., Sokolnlk V.P. Prenatal diagnosis of skeletal dysplasias. 2nd Europ. Meet. Dysmorph., Le Bischenberg, 1991, Genetic Counselling, 1991, v. 2, N 3, p. 170.

9. Feshchenko S.P., Krapiva G.A., Kovalev S.I., Kirillova I.A. Novikova I.V., Sokolnik V.P., Lurie I.W., Sheleg S.B., Borovko S.R. Prenatal and postnatal diagnosis of inherited connective tissue diseases. Math. World Congr. Pren. Perinat. Psychol. Med., Int. J. Prenatal. Perinatal. Stud., 1992, v.4, p.56.

Подписано к печати^-. АТ формат 60x84 1 Ав.

Обтем 1.0 усл. печ. л. Тираж 100 экз. Заказ. ГЬЗ Бесплатно.

Отпечатано на ротапринте ЭКОО-Принтинг ЛТД. г.Минск, ул.Мельникайте, 2.