Биохимическая и молекулярно-генетическая характеристика болезни Гоше у российских пациентов

Букина, Татьяна Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биохимическая и молекулярно-генетическая характеристика болезни Гоше у российских пациентов
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Биохимическая и молекулярно-генетическая характеристика болезни Гоше у российских пациентов"

Российская академия медицинских наук ГУ Медико-генетический научный центр

На правах рукописи УДК 616-056.7+577.2.214.622

Букина Татьяна Михайловна

Биохимическая и молекулярно-генетическая характеристика болезни Гоше у российских пациентов

03.00.15-Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2005

Работа выполнена в ГУ Медико-генетическом научном центре РАМН

Научный руководитель - кандидат медицинских наук,

Е.Ю. Воскобоева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Д.В. Залетаев

Кандидат медицинских наук А.Н. Прытков

Ведущее учреждение - ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН

Защита состоится « ХЬ »_Л_2005г.

в часов на заседании Диссертационного совета Д.001.016.01 при ГУ МГНЦ РАМН по адресу: 115478 г. Москва, ул. Москворечье, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ МГНЦ РАМН.

Автореферат разослан « ДЗ » 1У_2005г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

Доктор биологических наук, .

Профессор ( '¿/IШШсМ? Л.Ф. Курило

Актуальность темы исследования. Гликосфинголипидозы - группа наследственных болезней обмена веществ, характеризующихся нарушением ферментативного гидролиза гликосфинголипидов (TCJI), важнейших структурных элементов клеточных мембран. Нарушение гидролиза ГСЛ сопровождается их внутрилизосомным накоплением в клетках-мишенях, что приводит к гибели этих клеток.

К гликосфинголипидозам относится и болезнь Гоше (БГ). Это аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное мутациями в структурном гене ß-D-глюкоцереброзидазы, фермента, участвующего в процессе расщепления ГСЛ и присутствующего в лизосомах всех типов тканей (Brady et al, 1965а). БГ является наиболее распространенным гликосфинголипидозом человека, однако три ее основных клинических фенотипа (I - III) распространены с различной частотой. Самым частым из них является тип I, не неврологический, (в различных популяциях от 1:40 ООО до 1:60 ООО новорожденных), типы П и III, неврологические, встречаются реже (1:100 ООО и 1:50 ООО соответственно).

Характерными особенностями БГ являются генетическая гетерогенность и клинический полиморфизм (Beutler and Grabowski, 1995), что существенно затрудняет клиническую диагностику БГ. Поэтому для верификации диагноза необходимо проведение биохимических исследований (локусная дифференциация БГ) и молекулярно-генетических исследований (аллельная дифференциация БГ)- Использование таких диагностических процедур, очевидно, позволяет решать проблемы точной постнатальпой диагностики, а в последствии и пренатальной диагностики БГ, что необходимо для профилактики БГ в семьях высокого риска. Ранняя диагностика, лечение и профилактика БГ, как и других наследственных болезней обмена веществ, имеют большое значение для практики отечественного здравоохранения.

Метод измерения активности кислой ß-D-глюкозидазы в клетках крови и фибробластах человека был разработан в 1965г (Brady et al, 1965b). Метод является простым, удобным и быстрым, а также не требует тяжелых инвазивных вмешательств. В 1994г. было обнаружено, что у больных с БГ макрофаги при накоплении негидролизованного субстрата начинают интенсивно синтезировать фермент хитотриозидазу (XT), в результате ч«о активность этого фермента возрастает более чем в сто раз (Hollak et al, 1994). Это позволяет использовать значение активности XT в качестве дополнительного маркера в диагностике БГ.

Расшифровка последовательности гена ß-D-глюкоцереброзидазы, картированного па хромосоме lq 21, позволяет проводить анализ спектра мутаций при БГ (Sorge et al, 1985). Мояекулярно-генетический анализ БГ начался в 90-х г тогда >енио®

wiii'

Ri- ОТЕКА ■ '<■<>*П*

медицинской генетике еще не проводился (Веийег « а1, 1990; 7лтгап е1 а1, 1991; 8!ЬП1е И а1, 1993).

Практическая значимость выполненной работы определяется задачами медико-генетического консультирования (МГК), т.е. точной диагностикой и дифференциацией различных по тяжести форм заболевания. Для значительного количества семей поводом для обращения в МГК является прогноз жизни ребенка. Тяжесть заболевания влияет на решение родителей о сохранении или прерывании беременности.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлись локусная дифференциация БГ и аллельная дифференциация различных клинических форм БГ. В ходе исследования решали следующие задачи:

- формирование выборки больных с болезнью Гоше;

- сравнительный анализ активности дефектного фермента (Р-О-глюкоцереброзидазы) у пациентов с различными клиническими формами БГ, носителей БГ и в контрольной группе;

- сравнительный анализ активности маркерного фермента (хитотриозидазы) у пациентов с различными клиническими формами БГ, носителей БГ и в контрольной группе;

- скрининг на частые мутации и поиск редких мутаций в гене БДГ;

- анализ гено-фенотипических корреляций на исследуемой выборке больных. Научная новизна работы.

- Разработаны подхода к анализу первичной структуры нормального и мутантных аллелей гена рЛ)-глюкозидазы, позволяющие выявить молекулярные дефекты, лежащие в основе болезни Гоше.

- Впервые был проведен анализ мутантного гена у 55 российских больных с I, II и III типами БГ. Это позволило создать базу для прямого исследования генетической гетерогенности БГ. Разработанные методы исследования позволили идентифицировать 16 мутантных аллелей. В ходе исследования обнаружены три преобладающих мутациив в 9 и 10 экзонах гена ¡3-0-глюкозидазы. Эти результаты позволяют предположить наличие специфических генотипов для российских популяций.

- Впервые определен спектр мутаций в гене р-О-глюкозидазы в выборке российских больных, и предпринята попытка выявления влияние данных мутаций на клиническое проявление БГ.

Практическая значимость работы.

- Отработанный метод биохимической диагностики, основанный на измерении активности р-О-глюкозиддаы в лейкоцитах крови, дает возможность достоверно диагностировать БГ без применения сложного и болезненного для пациента исследования пункции костного мозга.

- Дополнительное исследование активности XT в плазме дает возможность контролировать правильность постановки диагноза в случаях пшраничной активности P-D-глюкозидазы, а также процесс лечения БГ.

- Определение спектра мутаций, характерных для различных клинических форм ЬГ, создает предпосылки для проведения системного молекулярно-генетического анализа с целью дальнейшего предсказания клинического течения БГ, что является важным для отягощенных семей, а также может использоваться в практике медико-генетических консультаций.

Положения, выносимые на защиту.

1. Проанализированы значения активности p-D-глюкозидазы в выборке пациентов с различными клиническими формами БГ, носителей БГ и в контрольной группе.

2. Проанализированы значения активности хитотриозидазы в выборке пациентов с БГ клиническими формами БГ, носителей БГ и в контрольной ipymie.

3. Обнаружено 16 мутаций в гене P-D-глюкозидазы у больных с различными клиническими формами БГ, в том числе 7 новых.

4. Выявлены особенности гено-фенотипических корреляций при БГ. Публикации. По основным положениям диссертации опубликовано 16 научных работ. Апробация работы. Результаты исследования были представлены на Рабочем совещании «Лизосомные болезни, модели, терапия», Новосибирск 2000; 2 (4) съезде медицинских генетиков, Курск, 2000; 5й1 European working group on Gaucher disease (EWGGD), Прага, Чехия, 2002r; 6th European working group on Gaucher disease (EWGGD), Барселона, Испания, 2004г; 3 (5) съезд медицинских генетиков, Уфа, 2005.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, заключение, выводы, приложения, список литературы. Диссертация содержит 28 таблиц и 32 рисунка. Библиографический указатель содержит 195 источников, из них 190 зарубежных

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Материалы и методы исследований. Характеристика выборки больных. Нами было обследовано 152 больных из разных регионов страны с направляющим диагнозом БГ с манифестацией диагноза от 8 месяцев до 62 лет. Клиническое и параклиническое обследование пациентов проводилось на приеме НКО МГНЦ РАМН врачами-генетиками, а также врачами эндокринологического и гематологического отделений Республиканской детской клинической больницы (РДКБ), гематологического отделения Научного центра здоровья детей РАМН (НЦЗД РАМН), НИИ

гематологического отделения Научного центра здоровья детей РАМН (НЦЗД РАМН), НИИ детской гематологии, педиатрического отделения ДКБ № 38, Центральной клинической больницы № 2 МПС, Гематологического научного центра РАМН, Московского областного научно-исследовательского клинического института (МОНИКИ) и региональных больниц. А. Постнатальная энзимодиагносгика.

Материал для исследования. Материалом для биохимических исследований являлись лейкоциты и плазма периферической крови пациентов и здоровых доноров разного возраста. Измерение активности кислой ß-D-глюкозидазы. Активпость кислой ß-D-глтокозидазы измеряли в гомогенате лейкоцитов по стандартной методике (Beutler & Kühl, 1970). Измерение активности хитотриозидазы в плазме. Активность хитотриозидазы измеряли в плазмы пациентов, разведенной в 50 раз водой, и образцах контрольной плазмы здоровых доноров, использованной без разведения, по стандартной методике (Guo et al, 1995). Б. Пренатальная энзимодиагностика. Материал для исследования.

Материалом для исследования служил гомогенат ворсин хориона (ВХ), полученных на 9-10 неделе беременности от женщин из группы высокого риска и от жепщин контрольной группы (медицинские абортусы). Биопсию хориона получали из Московского городского центра пренатальной диагностики, родильный дом № 27 (врач Юдина Е.В.). Измерение активности кислой ß-D-глюкозидазы в ВХ.

Активность кислой ß-D-глюкозидазы измеряли так же как в гомогенате лейкоцитов, но концентрация субстрата составляла 25мМ. Молекулярно-генетические методы исследования.

Для молекулярно-генетических исследований использовали ДНК, выделенную из клеток периферической крови.

Поскольку многие мутации гена ß-D-глюкозидазы (БДГ) входят в состав нормальной последовательности псевдогена, на 97% гомологичного функциональному гену, то на первом этапе синтезировали участки ДНК, комплиментарные только функциональному гену (Stone et al, 2000). ПЦР-продукты использовали в качестве матрицы для дальнейшей работа.

Для всех образцов, используя стандартные методы ПЦР-анализа и последующего рестрихционного анализа, был проведен скрининг па частые мутации 84_85insG, IVS2+1G—>А, N370S, D409H, L444P, R463C, и g6765-6819del.

Для обнаружения редких мутаций в гене БДГ исследовали экзоны и области интрон-экзонных соединений гена с использованием метода SSCP-аяализа (Condie et al, 1993) и последующего прямымого нерадиоактивного секвенирования.

Результаты проведенных исследований и обсуждение. Характеристика выборки обследованных больных. Из 152 пациентов с направляющим диагнозом БГ биохимическими методами, включавшими измерение активности (S-глюкоцереброзидазы лейкоцитов и активности хитотриозидазы плазмы, диагноз БГ был подтвержден у 86. ДНК-анализ был проведен у 55 пациентов из 52 семей, имеющих одного или несколько больных с БГ. На основании клинической картины у 49 пациентов из 55 был определен I тип БГ (неневрологический), у 6 пациентов - II и III типы. Клинический фенотип у пациентов с I тип БГ варьировал: у 2 пациентов была выделена легкая форма тяжеста заболевания, у 47 - промежуточная. Пациентов со И и III типами БГ имели тяжелио форму течения заболевания. Для легкой формы были характерны более поздний возраст манифестации!! заболевания (на 3-5 десятилетии), умеренная спленомегалия, нормальная или близкая к норме формула крови. Для пациентов со средней тяжестью заболевания было характерно появление первых клинических признаков на 1-2 десяти лежи жизни, гепатоспленомегалня, гематологические нарушения, анемия различной степени тяжести, частые носовые кровотечения, изменения костной ткани, отставание в физическом развитии. Для тяжелой формы была характерна ранияя манифестация (на 1-2 году жизни), массивная гепатоспленомегалня часто с явлениями гиперспленизма, тяжелая анемия, тромбоцитопения, лейкопения, гипотрофия, тяжелые нарушения скелета, задержка или регрессия психомоторного развития. Постиатальная энзимодиагносгика. Активность p-D-глюкоцереброзидазы.

Активность p-D-глюкозидазы была измерена в лейкоцитах 152 пациентов с направляющи«! диагнозом БГ, гетерозигот (родителей пациентов) и контрольной группы. Только у 86 пациентов на основании сниженной активности фермента (0 - 4,2 hM/mi/ч) диагноз был подтвержден. Средние значения активности p-D-глюкозидазы рассчитанные для этих трех групп приведены в таблице 1, и они не противоречат литературным данным (Galjaard, 1980).

Таблица 1. Активность кислой P-D-глюкозидазы в лейкоцитах.

Обследованная группа Активность (М ± SD) (нМ/мг/ч) Интервал значений(нМ/мг/ч) Активность (M±SD)(HM/mr/4) (по Galjaard, 1980)

Контроль (п=219) 10,8 ±6,3 2,4-52,7 8,2 ± 3,1

Гетерозиготы (п=50) 6,8 ±2,7 2,8-12,9 -

Пациенты (п=86) 1,9 ±0,9 0-4,2 0,3-3

Оценка статистической зпачимости отличий распределения активности Р-О-глюкозидазы между группами контроля и гетерозигот, контроля и пациентов и гетерозигот и пациентов с использованием непараметрического критерия Уилкоксона для двух независимых выборок показала их достоверное отличие друг от друта (табл.2). Оценку

Таблица 2. Оценка значимости средних значений активности [З-О-глюкозидазм с использованием критерия Уилкоксона.___

Обследованная группа Контроль (Р) Гетерозиготы (Р) Пациенты (Р)

Контроль 0,000 0,000

Гетерозиготы 0,000 - 0,000

Пациенты 0,000 0,000 -

статистической значимости отличий распределения активности (З-О-глюкозидазы между исследуемыми группами проводили с использованием непараметрического критерия Уилкоксона, так как анализ распределения значений активности фермента в исследуемых группах и проверка согласия эмпирического распределения с теоретическим нормальным законом, проведенный с помощью критерия согласия Колмогорова - Смирнова для сложной гипотезы (Тюрин, Макаров, 1998), показал нормальное распределение значений активности фермента в группе гетерозигот (р=0,35) и отличное от нормального распределения в контрольной группе (р=0,01) и в группе пациентов с БГ(р=0,00). Активность хитотриозидазы (ХТ).

В качестве дополнительного маркера БГ с 1997г. в плазме всех пациентов, измеряется активность ХТ. У пациентов с БГ наблюдается возрастание активности этого фермента в 100 и более раз.

Сравнение активности ХТ в контрольной группе, группе гетерозигот и группе пациентов с БГ, приведенные в таблице 3, показывают, что у пациентов с БГ активность Таблица 3. Активность ХТ плазмы при БГ.____

Обследованная• группа Активность (\ttSD) (нМ/мл/ч) Интервал значений (нМ/мл/ч) Интервал значений (по Уи. вио с! а1,1995)

Контроль (п=760) 20,5±1,3 0,0 -200,0 5-199,4

Гетерозиготы (п=50) 23,1±5,5 0,0-94,0 -

Пациешы (п=85) 11328± 1850,5 1175-35550 5580-51800

ХТ была повышена во всех случаях, кроме одного (0,3 нМ/мл/ч). Оценка статистической значимости отличий распределения значений активности ХТ между группами контроля, гетерозигот и пациентов, проведенная с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни (табл. 4), подтвердила существование статистически значимых отличий между группами контроля и патентов с БГ и между группами гетерозигот ВГ и пациентов с БГ и отсутствие статистически значимого отличия активности ХТ между группами контроля и

Таблица 4. Результаты оценки статистической значимости различий показателей активности ХТ при БГ._____

Среднее значение активности ХТ Статистика Манна-Уитни (и) Уровень значимости (р)

Пациенты 11328,4± 1850,5 Контроль 20,5±1,3 701,5 0,00

Пациенты 11328,4±1850,5 Гетерозиготы 23,1±5,5 53,5 0,00

Контроль 20,5±1,3 Гетерозиготы 23,1±5,5 1814,2 0,35

гетерозигот. Для оценки статистической значимости отличий распределения значений активности ХТ использовали непараметрический критерий Манна-Уиган, потому, что анализ распределения значений активности ХТ, проведенный с помощью критерия Колмогорова-Смирнова для сложной гипотезы (Тюрин, Макаров, 1998), и проверка согласия эмпирического распределения с нормальным теоретическим законом, показали, что в обследованных группах распределение было отличным от нормального: пациенты (р=0,010), гетсрозиготы (р=0,001), контроль (р=0,009).

В нескольких случаях была отмечена аномально низкая активность ХТ - от 0 до 4,5 нМ/мл/ч. Такие низкие значения ХТ встретились во всех обследованных группах. В гене ХТ описана единственная мутация (дупликация 24 пн в 10 экзоне гена ХТ), наличие которой приводит к полной утрате активности ХТ (Воот Л а1, 1998). Гетерозиготное носительство этой мутации, вероятно, также изменяет значение активности фермента, поэтому было проведено молекулярио-генетическое исследование на наличие 24-нухлеотидной дупликации в 10 экзоне генаХТ.

В обследованной выборке пациентов с БГ (п=55) было выявлено 13 гетерозиготных носителей этой дупликации (23,6%), а у одного пациента она обнаружена в гомозиготном состоянии (1,8%). У 41 эта дупликация отсутствовала (74,6%). Среди 166 здоровых индивидов, чья ДНК была доступна для исследования, четверо (2,4%) оказались гомозиготными носителями 24нп дупликации, 56 (33,7%) - гетерозиготными носителями дупликации, у 106 (63,8%) дупликация 24нл в гене ХТ отсутствовала.

Оценка статистической значимости отличия распределений активности ХТ у здоровых индивидов при наличии и отсутствии24-нуклеотидной дупликации в гене ХТ, проведенная с использованием непараметрического критерия Маяна-Уитни, показала статистически значимое отличие в значениях ХТ (табл 5). Для оценки статистической значимости отличия распределений был использован непараметрическяй критерий Манна -Уитни, так как анализ распределения значений активности ХТ и проверка согласия эмпирического распределения с теоретическим нормальным законом, рассчитанная с

Таблица 5. Результаты опенки статистической значимости различий показателей активности ХТ у здоровых иидивидов.___________

Среднее значение ХТ Статистика Маяна-Уитни (Ц) Уровень значимости (Р)

При отсутствии дупликации (п=М6) При наличии дупликации (п=56)

22,4±4,3 9,1±1,9 886,5 0,00

использованием критерия Колмогорова-Смирнова для сложной гипотезы, показали отличное от нормального распределение в исследуемых группах при гетерозиготном носительстве 24-нуклеотидной дупликации (р=0,000) и в ее отсутствии (р-0,010). Гомозиготные носители дупликации не анализировались из-за малого количества данных.

Для количественной оценки отличия активностей ХТ при наличии и отсутствии 24-

нуклеотидной дупликации в гене ХТ у здоровых индивидов было рассчитано отношение

границ доверительных интервалов, которым с вероятностью 0,95 принадлежат средние

значения активпостей ХТ в рассматриваемых группах (табл. 5):

Активность ХТ при отсутствии дупликации . Активность ХТ при наличии дупликации ' ' ' ''

Таким образом, было показано, что, во-первых, 24-нуклеотидная дупликация снижает активность ХТ у гетерозиготных носителей и, во-вторых, снижает активность ХТ примерно в 2 раза.

Повторное биохимическое обследование двенадцати пациентов, отобранных для лечения, показало, что значение активности ХТ, полученное при вторичном измерении, было более высоким по сравнению с первоначально измеренным (табл. 6).

Таблица 6. Изменение активности ХТ во времени.

Пациеш Дата первою измерения Активность ХТ 1 Дата второго измерения Активность ХТ 2

1. 05. 1999 9600 03.2001 27450

2. 06.1999 7025 01.2003 10000

3. 10.1999 7950 01.2000 8850

4. 12.1999 . 4975 10.2003 12050

5. 01.2000 14250 01.2003 36800

6 06.2000 13625 01.2001 20750

7. 05.2003 10575 10.2003 13825

8. 11.2003 7550 05.2004 9350

9. 09.2000 4925 09.2003 17600

10. 11.2000 2350 11.2003 4825

П. 06.2002 15400 09.2003 25750

12. 03.2004 9825 04.2004 10100

Для определения характера изменения активности ХТ во времени был применен регрессионный анализ (рис. 1). Для этого исследования была сформирована группа из 20 человек разни о возраста, которую составили две наиболее многочисленные группы пациентов с генотипами К3708/Ь444Р и Ю708/КесКа I, так как клиническая картина у них сходна. Значения активности ХТ при наличии 24-нуклеотидной дупликации и при ее отсутствии обсчитывались отдельно. Результаты показали, что активность ХТ у пациентов с БГ с возрастом увеличивается, что можно объяснить накоплением негидролизованного субстрата (Но11аке1а1,1994).

Результаты регрессионного анализа позволили сделать сравнимыми значения активности ХТ у пациентов разного возраста с одинаковым генотипом. Для чего была введена условная величина «прирост активности ХТ», которая определялась как частное значения активности ХТ и возраста пациента (в годах) в момент биохимической диагностики. У гетерозиготных носителей 24-нуклеотидной дупликации гена ХТ значение прироста активности ХТ умножали на два (перерассчитанные значения прироста активности ХТ приводятся в скобках).

Рис. 1. Изменение активности ХТ у пациентов с генотипами N370S/L444P и N370S/Rec Neil в зависимости от возраста при наличии и отсутствии 24-нуклеотидной дупликации в i ене ХТ.

Пренатальная энзимодиагностика.

Дородовая диагностика была проведена в 4 семьях у пяти плодов. Активность р-13-глюкозидазы измеряли в ворсинах хориона на 9-10 неделе беременности. В исследованных

образцах активность фермента колебалась в пределах от 158.7 нМ/мг/ч до 202,8 нМ'чг ч. чго полностью согласовалось с контрольными результатами (норма - 107,8 - 213,9 нМ'мг/ч), поэтому плоды были диагностированы как здоровые Верификация анализов, проведенная после рождения детей, результаты дородовой диагностики подтвердила Молекулярно-генетический анализ БГ.

По данным мировой литературы молекулярно-генетический анализ гена БДГ бьп начат в 1987г. К началу данного исследования было идентифицировано более 100 м>таций За последние семь лет обнаружено еще около 50 мутантных аллелей гена БДГ, обуславливающих возникновение различных клинических форм БГ. Молекулярный анализ гена БДГ значительно затруднен из-за наличия псевдогена БДГ (пБДГ) на 97% идентичного функциональному гену, а также из-за возможности образования кроссоверных мутаций между ними.

ДНК-анализ был проведен у 55 из 86 пациентов с подтвержденным диагнозом БГ. Из исследованных 110 аллелей, идентифицировано сто мутаций (рис. 2) При обнаружении обеих мутаций у пациента, исследовалась ДНК его родителей (когда это было возможно)

Рис. 2. Распределение частот мутаций гена БДГ в выборке пациентов с БГ.

1 % ------ —-----

3 40 В--------------------

I S I | ^

^ 0 .В В В—_mm———— — — — —_ Я-

S ¿Р к/ ^ ^ ^ ^ ^ ^ > £ £ ¿f ¿>

ДНК-анализ был начат с исследования восьмого, девятого, десятого и одиннадцатого экзонов гена БДГ, так как в этом регионе располагается наибольшее количество мутаций, в том числе и частые.

На первом этапе исследования для всех пациентов с БГ был проведен скрининг на частые мутации 84 85 insG, IVS2 t 1G>A, N370S, g6765-6819del (del 55bp). D409H, L444P. R463C и Ree Nci I. В результате массового скрининга были определены восемьдесят мутантных аллелей (72,7%) Самой частой оказалась миссенс мутация N370S (50/110 аллелей БГ) (45,4%) найденная у пяти пациентов в гомозиготном состоянии и у сорока - в гетерозиготном (рис. 3).

Рис. 3. Скрининг мутации N3708. Гидролиз эндонуклеазой ХЬо1: 1 -Ч^- (Юбпн); 2 -маркер длин РиС/Мвр1 (снизу вверх: 67, 110, 111,147, 190пн); 3-14 - 1М3708/1М (106, 91пн); 15 - Ж70«/Ы370Я Г91пи>

Второй по частоте оказалась миссенс мутация 1.444Р (28/110 аллелей БГ) (25,5%), причем у четырех пациентов она была обнаружена в гомозиготном состоянии, а у двадцати - в гетерозиготном (рис. 4). Поскольку замена 1.444Р может являться частью целого ряда рекомбинантных мутаций, товсе амплификационные фрагменты 10 экзона гена БДГ. содержащие мутацию 1.444Р. анализировали методом ЭЗСР (рис. 5). Образцы с аномальной подвижностью секвенировали (рис. 6, 7). Это позволило определить, что только у шестнадцати пациентов из 24 (20/110 аллелей БГ) (18,2%) замена 1.444Р являлась 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19

—240пн —167пн

Ппн

73 пн 56пн

Рис. 4. Скриниш мутаций L444P и Н463С. Гидролиз эндонуклеазой Msp I: 3,8,11.16 — N/N (167, 73пн); 2 - 6, 9,13.15.17,19 -L444P/N (167,111, 73, 56пн); 1, 10, 18-L444P/L444P ( 111, 73. 56пн); 14 -R463C/N (240, 167, 73пн); 12 -L444P/R463C (240. 111. 73, 56пн), 7 - маркер 1 ООпн (снизу вверх 100. 200. 300. 400, 5ООпн).

самостоятельной мутацией, а у восьми пациентов (8/110 аллелей БГ)(7,3%) она явилась частью рекомбинантной мутации Rec Nci I, где кроме L444P еще присутствует две замены А456Р и V460V. Отсутствие мутаций D409H и del 55 в сочетании с L444P позволило исключить наличие других рекомбинантных мутаций. Делеция 55 нуклеотидов в девятом

1234 567 89 10

Рис. 5. Результаты SSCP-анализа 10 экзона БДГ: 1. 2.

3,9, 10 -L444P/N; 4, 7 -RccNcil/N; 5. 6, 8 -N/N.

Т1448С (Ь444Р) 01483С ГА456Р) Г.1497Г ГУ46(ЛП

| ВО 90 100 40 1 '2Я I 130

Т1448С (Ь444Р)

1 ао 90 100 110 120

СУ ОС , I Г. и - ВТСС^л СТ6 к Г С С А С С - 6 г.ТС&СТСТ 6 С Г С.-Т С' бвг

Рис. 7. Снквенс 10 экзона. Мутация Ь444Р в гетерозиготном состоянии.

экзоне гена БДГ была обнаружена > одною пациента в гетерозиготном состоянии (0.9%) как самостоятельная мутация (рис. 8). У одного пациента в гетерозиготном состоянии встретилась мутация И463С (0,9%) (рис. 4). Мутации 0409Н, 84_85 тэС и 1УЙ2+1 0>А обнаружены не были.

1 2 3 4 5 6 7

254пн

199пн

Рис. 8. Делеция 55 нуклеотидов (8%

ПААГ) (слева направо): 1 - del 55/N (254, 199пн); 3,4,5,6.7 - N/N (254пн); 2 - маркер длин ДНК Рис/ Msp 1 (снизу вверх: И 0,111, 147, 190, 242, 331,404,489, 501пн)

На втором этапе исследования для поиска редких и новых мутаций использовали метод прямого нерадиоактивного секвенирования. Отбор образцов для секвенирования проводили методом БвСР-анализа (Сопйе ег а1, 1993) (рис. 9, 10). Мутации, обнаруженные при секвенировании. подтверждали рестрикционным анализом.

В результате у трех пациентов была обнаружена мутация Ш20>У (2,7%), у четырех пациентов - АУ184Я (3.6%), у двух - С202Я (1,8%), у двух - \V381X (1,8%) и у трех - А3840 (2,7%). Мутации Я170С, ^Ч84Я+гес(ё4355-4430), Р236Т, Ь288Р, 1288р, Р319Б были встречены только однажды (по 0,9%). Семь мутаций ранее описаны не были (Р236Т, W184R+rec(g4355-4430), Ь288Р, Ь288(}, Р3198, и А3840, \V381X).

123456789 10 11

2 3 4 56 7 8 9 11 13 15

■вснш

Рис. 9. ЗвСР-анализ 6 экзона (слева направо). 1-4,7 - 9 - норма; 5 - 02021Ш; 6 ■ W184R/N; 10-R170W/N; И -\V184R +Яес(§4355-4430)/К. Названия мутаций приводятся по результатам сиквенса.

Рис. 10. SSCP-анализ 7 экзона. 1 -7.9 -16-N/N; 3,5- L288P/N; 8 - P236T/N. Названия мутаций приводятся по результатам сиквенса.

У пациентов нашей выборки обнаружилась значительная молекулярная гетерогенность (16 различных мутантных аллелей и 17 генотипов) Наиболее частыми генотипами в обследованной популяции были N370S/L444P - 10/55 (18%), N370S/Rec Nci I - 8/55 (15%);

N370S/N370S - 5/55 (9%), L444P/L444P - 4/55 (7%). Остальные 12 генотипов встретились в 1 -1 сл>чаях (рис. 11).

Рис. 11. Распределение генотипов в популяции пациентов с БГ.

12 из обнаруженных мутаций представляют собой 9 транзиций и 3 трансверсии в транслируемой области гена БДГ. ведущие к аминокислотным заменам, одна из них является нонсенс-мутацией Одна мутация представляет собой делецию протяженностью 55пар нуклеотидов в 9 экзоне гена БДГ, ведущую к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного кодона терминации в середине 9 экзона. Две мутации образованы по типу рекомбинации между геном и псевдогеном в 6 и 10 экзоне

Среди семи новых мутаций W381X приводит к образованию стоп-кодона и преждевременной терминации. следовательно, является патогенной. Замены Р236Т L288P. L288Q, P319S и A384D можно считать патогенными, поскольку у этих пациентов не было найдено других мутаций ни внутри кодирующего региона, ни внутри интрон/экзонньгх границ, ни в 5'- или З'-нетранслируемых регионах. В аллеле rec(g4355-4430) 6 экзона содержатся замены W184R, N188K, V191G, S196P, G202R и F213I, соответствующие нормальной последовательности псевдогена. Это предполагает образование данной мутации путем рекомбинации между геном и псевдогеном. Однако у больного СТ41 данный аллель находится в комплексе с N370S, и W184R. Можно предположить, что он образовался в ре)ультате кроссинговера между участками мутантного гена и псевдогена Однако в настоящее время более точное исследование провести невозможно, поскольку ДНК одного из родителей недоступна, а другой является носителем только частой мутации N170S Описания нескольких пациентов с комплексом мутаций происходящих не из псевдогена приведены в работах Eal et al, 1991; Grace et al, 1999 и Hodanova et al, 1999

46 пациентов из 55 являются генетическими компаундами по обнаруженным мутациям У 10 пациентов идентифицирован только один мутантный аллель.

Сравнение полученных данных с данными публикаций но другим популяциям позволяет выявить черты сходства и отличия (табл 7). Как и в европейских популяциях, в Российской популяции наиболее частыми являются мутации N3705, 1-444Р и гес!мс11. Таблица 7. Мутационный профиль популяций пациентов с БГ в разных популяциях (по

Coutre et al, 1997; Cormand et al, 1998).

| мутации 1 Россия (п=55) Чехия (п=29) Англия (п=46) Испания (п=35) Германия (п=21) Португалия (п=16) Япония (п=32)

j N370S 50/110j 28/58 36/92 31/70 17/42 20/32 0

! L444P 20/110 11/58 31/92 18^70 8/42 7/32 26/64

Ree Nci I 8/110 5/58 4/92 1/70 2/32

| прочие 32/110 14/58 21/92 20/70 17/42 3/32 38/64

образующими 73,8% мутантных аллелей Особенности распространения мутаций N3705, Ь444Р и гес№1 1 обуславливают сходство российской популяции с чешской и немецкой. (Найоп с» а1.1997; ТуШ-вгутапзка « а1,1996; Согтап<1 ег а1,1995).

К особенностям Российской популяции можно отнести отсутствие мутаций 84 85 ГУ82-М 0>А и 0409Н; обнаружение аллеля R120W у трех не родственных пациентов с заболеванием средней тяжести; ранее не описанного аллеля А3840. у трех не родственных пациентов с тяжелым и средней тяжести течением заболевания и аллеля W184R у пяги пациентов из четырех семей с тяжелым и средней тяжести течением заболевания, причем у одного пациента эта мутация встретилась в комплексе с N3708 и гес(§4355-4430). Исследование популяционного полиморфизма по обнаруженным мутациям.

С целью точной клинической интерпретации ранее не описанных мутаций в гене БДГ был проведен рестрикционный анализ для исключения популяционного полиморфизма по данным нуклеотидным заменам соответствующих амплификационных фрагменте здоровых индивидуумов При анализе 100 аллелей гена БДГ у 50 контрольных индивидуумов не было выявлено ни одной из мутаций, обнаруженных у пациентов в исследуемой выборке Это позволяет предположить, что найденные мутации носят повреждающий функцию фермента характер, а не являются проявлениями ДНК-полиморфизма. Гено-фенотипические корреляции.

Сопоставление результатов биохимической и молекулярно-генетической диагностики с клиническим фенотипом пациентов с БГ показало, что не существует прямой зависимости между клиническими формами тяжести течения БГ и значением остагочной активное ги ¡}-0-1люкозидазы Снижение активности кислой |}-0-глюкозидазы позволяет только подтвердить диагноз БГ, но не определить ее тип Так у пациента Л2 с легкой формой БГ I типа значение остаточной активности Р-О-глюкозидазы ниже, чем у пациентов Т5 и Т6 с тяжелой неврологической формой БГ (0,7; 2.7 и 2,2 мМ/мг/ч, соответственно) (табл. 8 - 12).

Пациент, пол,год рождения 1. Возраст манифестации 2. Активность ХТ (нМ/мл/ч) 3. Прирост акт-ти ХТ/год 4. АктивностьР-D-глюкозидазы (нМ/мг/ч) 5. Генотип (БДГ) 6. Дупликация 24пи в генеХТ 7.

1.Л1 ж, 1947 51 4250 85 2,2 N370S/ N370S N/N

2. Л2 ж, 1974 29 1275 44(88) 0,7 N370S/? N/m

При анализе взаимосвязи прироста активности ХТ (показатель, который мы ввели по результатам регрессионного анализа зависимости активности ХТ от возраста пациентов) и тяжести клинической формы прослеживается корреляция между ними. Прирост активности ХТ менее 100 нМ/мл/ч характерен для БГ тип 1 с поздней манифестацией (на 3 - 6 десятилетии) и легким течением; от 200 до5Т)00 нМ/мл/ч - для больных БГ тип I с манифестацией от 2 лет и более тяжелой формой; прирост активности ХТ свыше 1500 нМ/мл/ч - для больных БГ тип Ш и II (табл. 8-12).

Таблица 9. Активность ХТ и кислой ß-D-глюкозидазы у пациентов с БГ.

Пациент, Возраст Актив Прирост Активность ß- Генотип Дуплика-

пол,год мани- иостьХТ акт-тн D-глюкозидазы (БДГ) ция 24пи в

рожде- фестации (нМУмл/ч) ХТ/год (нМ/мг/ч) генеХТ

ния

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

3. СТ30 24 28800 1200 U9 N/N

ж, 1977

4. СТ45 4 16000 696 3,2 N/m

ж, 1980. (1392) N370S/

5. СТ44 4 35550 1975 2,8 N370S N/N

м,1985

6. СТ31 6 22400 1600 1,8 N/N

ж, 1987

Прослеживается четкая корреляция между генотипом и тяжестью течения БГ -клиническим фенотипом. Генотип N3708/143708 обнаружен только у пациентов с легкой и промежуточной формами БГ 1 типа. Большинство пациентов с легкой и промежуточной формой тяжести БГ 1 типа имеют, по крайней мере, 1 аллель представленный N3708. Тяжесть течения БГ у гетерозиготных носителей N3708 обусловлена также вторым мутаншым аллелем (табл. 8-12) У пациентов с генотипом N3708/1444? возраст манифестации варьирует от 2 до 44 лет. Клиническая картина у них сходна и характеризуется гепатоспленомегалией, анемией, панцитопенией, задержкой физического развития и патологией костной ткани различной степени (табл. 10).

Пациент, пол,год рождения 1. Возраст манифестации 2. Активность XT (нМ/мл/ч) 3. Прирост акт-ти ХТ/год 4. Активность ß-D-глюкозидазы (нМ/мг/ч) 5. Генотип (БДГ) 6. Дупликация 24пн в гене ХТ 7.

7. СТ26 м 1956 44 10650 242 2,5 N/N

8. СТ32 м. 1968 12 22150 671 U N/N

9. СТ36, ж 1970 2 18925 591 2,7 N/N

10.СТ28» 1979 7 14800 672 1,3 N/N

11. СТ4, ж 1982 21 8175 389 2,6 N370S/ L444P N/N

12. СТ35 щ 1984 8 7825 435 1,5 N/N

13.СТ10, ж,1987 7 13175 878 1,2 N/N

14. СТ38 м 1991 9 22150 671 1,2 N/N

15.СТ11, ж,1990 3 6050 756 1,5 N/N

Пациенты с генотипом N370S/Rec Nci I имели промежуточную форму БГ I типа с возрастом манифестации от 3 до 12 лет. В клинической картине кроме гепатоспленомегалки, анемиии, тромбоцитопении, задержки физического развития и различных нарушений костной ткани, характерных для всех пациентов, присоединялись также атонический дерматит, синусовая аритмия, тугоухость, остеомиелитоподобные состояния (табл. 11).

Известно также, что мутация L444P, RecNcil, W184R и G202R в гомозиготном состоянии определяют неврологическую форму БГ (Grace et al, 1997; Choy et al, 2000; Stone et al, 2000). Но у наших пациептов в сочетании с мутацией N370S они образуют генотипы, определяющие БГ I типа с промежуточной формой течения. У пациентов с генотипами N370S/del 55, N370S/L288Q, N370S/W184R, N370S/R120W, N370S/G202R, N370S/A384D, N370S/P236T, N370S/W184R+rec(g4355-4439), N370S/W381X, R120W/R170C, L288Q/P319S, L444P/R463C развилась также БГ I типа с промежуточной формой течения. Для клинической картины этих пациентов характерны гепагоспленомегалия, анемия, тромбоцитоления, связанные с этим частые носовые кровотечения и отставание в физическом развитии.

Наличие мутации L444P как самостоятельной мутации в гомозиготном состоянии обуславливает развитие тяжелой формы БГ II или Ш типа.Тяжелая неврологическая форма

Пациент, Возраст Актив- Прирост Активность ß- Генотип Дуплика-

пол, год мани- ность ХТ акт-ти D-глюкозндазы (БДГ) ция 24пн в

рожде- фестации (нМ/мл/ч) ХТ/год (нМ/мг/ч) гене ХТ

ния

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

16. СТ34, 6 9900 291 2,8 N/N

м, 1968

17. СТ23 6 5725 220 (440) 2,2 N/m

ж 1974

18. СТ43 6 15000 714 2,5 N/N

ж, 1981

19. СТ47 м,1991 12 8475 706(1412) 1,3 N370S/ N/m

20. СТ2, 5 7950 994 3,0 recNci I N/m

м, 1991 (1988)

21.СТ17, 3 4975 829 1,5 N/m

ж, 1993 (1658)

22. СТ21 3 0,3 0 3,4 M/m

м 1995

23.СТ18, 3 14250 4750 2,7 N/N

ж, 1996

представлена в нашей выборке шестью пациентами, у четырех из которых мутация L444P обнаружена в гомозиготном состоянии (табл. 12). При БГ II и III типов это наиболее часто встречающаяся мутация(Т8иД et al, 1987).

Таблица 12. Активность ХТ и кислой p-D-глюкозидазы у пациентов с БГ.

Пациент, пол,год рождения 1. Возраст манифестации 2. Активность ХТ (яМ/мл/ч) 3. Прирост акт-ти ХТ/год 4. Активность ß-D-глюкозидазы (нМ/мг/ч) 5. Генотип (БДГ) 6. Дупликация 24пн в гене ХТ 7.

53. Т6 ж, 1989 2 г. 13950 1550 2,2 L444P/ L444P N/N

50. Т1 ж 1998 7мес. 3450 1725 1,9 N/N

51.T2.M 1999 7мес. 11250 5625 (11250) 1,3 N/m

52. Т5 м, 2002 9мес. 1550 1550 2,7 N/N

54. Т4 м, 2002 5мес. 13675 13675 1,2 L444P/ A384D N/N

52 ТЗм, 2001 8мес. 15000 15000 (30000) 0 W184R7? N/m

Еще у одного пациента с тяжелой формой БГ выявлен генотип 1,444Р/Л3840. Заболевание у этого пациента проявилось в возрасте 5 месяцев отставанием в развитии, с 9 месяцев - анемия, в 10 месяцев - массивная гепатоспленомегалия, жесткое дыхание,

тахикардия (ЧСС 144/минуту), выраженная потливость, снижение турюра 1каней, резкое истончение подкожножирового слоя, в гемограмме тромбоцитодения, лейкопения. Активность ХТ у него превышала 1 ЗОООнМ/мл/ч. Основываясь на особенностях феношпа и биохимической диагностики можно говорить, что мутация A384D является тяжелой и в сочетании с L444P приводит к развитию БГII типа (табл. 12).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

БГ - наиболее распространенное среди сфинголипидозов заболевание. Оно характеризуется широким спектром клинических форм от мягких бессимптомных до тяжелых с поражением ЦНС. Определение активности ß-D-глюкозидазы в лейкоцитах позволяет точно верифицировать диагноз БГ, не прибегая к гистологическим методам исследования. Результаты исследования экспрессии ß-D-глюкозидазы показали статистически достоверное снижение активности мутантного фермента в лейкоцитах пациентов с БГ. Столь же важным для диагностики БГ являй ся исследование активности ХТ плазмы, поскольку в некоторых случаях остаточная активность ß-D-глюкозидазы настолько высока, что ее значения у пациентов перекрываются со значениями активности у гетерозигот. В этом случае уровень активности ХТ становится дополнительным маркером при верификации диагноза БГ. Ранее было показано, что активность ХТ зависит от количества накопленного субстрата, что позволяет также осуществлять контроль при лечении пациентов с БГ. Результаты проведенного исследования позволяют говорить о взаимосвязи активное га ХТ и тяжести клинического фенотипа, а также о взаимосвязи активности ХТ и генотипа.

В результате молекулярно-генетического анализа 55 пациентов было верифицировано 90% мутантных аллелей. Как в большинстве европейских популяций частыми оказались три: N370S, L444P и RecNcil, которые составили 45,6%, 20% и 7,3% от общего числа аллелей, соответственно. В числе редких и единичных мутаций были обнаружены R120W (2,7%), W184R (3,6%), G202R (1,8%), W381X (1,8%), A384D (2,7%), а мутации R170C, Р236Т, rec(g4355-4430), L288P, L288Q, P319S, R463C и <1е155были встречены только однажды (0,9%). 9% мутантных аллелей пока остались не идентифицированными. Отличительной особенностью нашей выборки явилось присутствие четырех аллелей W184R и A384D у не родственных пациентов. У пациентов нашей выборки обнаружилась значительная молекулярная гетерогенность (16 различных мутантных аллелей и 17 генотипов). Сорок шесть пациентов выборки являются генетическими компаундами, а из них сорок два пациента (76,4%) являются гетерозиготными носителями мутации N370S Наиболее частыми генотипами в обследованной популяции были N370S'L444P - 10/55 (18%), N370S/Rec Nci I -8/55 (15%); N370S/N370S - 5/55 (9%), L444P/L444P - 4'55 (7%).

Учитывая частоты встречаемости мутаций, а также наличие псевдогена, на 97% гомологичного функциональному гену, и достаточно часто возникающие рекомбинантные мутации, обусловленные кроссинговером между БДГ и пБДГ, можно предложить следующую схему проведения ДНК-анализа для пациентов с БГ:

- скрининг на частые мутации (N3708, Ъ444Р, WI84R, гесШ I, Ю20\У, А384П);

- обязательное исследование родительской ДНК в случае гомозиготного носительства мутации у пробанда;

- если родительская ДНК отсутствует, необходимо проведение дополнительного ДНК-анализа на наличие рекомбинантных мутаций, или крупных делеций гена;

Для практической диагностики основным методом верификации диагноза БГ являются биохимические методы исследования активности |№-глюкозидазы и ХТ в качестве дополнительного маркера. ДНК-диагностика необходима в случае промежуточного значения активности р-В-глтокозидазы и нулевого значения активности ХТ. ДНК-диагностика на носительство возможна только в семьях с точно установленным генотипом, либо при помощи косвенной ДНК-диагностики. Пренатальная диагностика БГ на ранних сроках беременности также возможна как методом определения активности кислой [5-0-глюкозидазы, так и с помощью ДНК-анализа.

ВЫВОДЫ

1. Подтверждена необходимость биохимической диагностики для верификации диагноза БГ вследствие существования значительного количества гено- и фенокопий БГ', т.к. диагноз был подтвержден только у 86 из 152 пациентов с направляющим диагнозом БГ.

2. Проведен сравнительный анализ значений активности кислой р-О-глюкозидазы в контрольной группе, в группах пациентов с различными формами тяжести БГ и в группе облигатных гетерозигот Получены значения контрольных величин активпости р-Ц-глюкозидазы (конгроль - 10,6±6,3 нМ/мг/ч; носители - 6,8±2,7 нМ/мг/ч; пациенты с БГ -1,94:0,9 нМ/мг/ч. Установлено статистически достоверное снижение активности Р-1)-глюкозидазы в лейкоцитах пациентов с БГ (р=0,000).

3. При сравнительном анализе значений активности ХТ в плазме установлено статистически достоверное возрастание активности фермента у пациентов с БГ (р—0,00) и отсутствие достоверного изменения активности ХТ в плазме облигатных гетерозигот по сравнению с нормой (р=0,35). Возрастание активности хитотриозидазы (11328,4±1850,5 нМ/мл/ч) является решающим фактом в пользу диагноза БГ при явлении пограничной активности р-Э-глюкозидазы между патологией и гетерозиготным носительством.

4. Выявлена корреляция между уровнем прироста активности ХТ и тяжестью течения БГ: прирост активности ХТ менее 100 нМ/мл/ч характерен для БГ тип I с поздней

манифестацией (на 3-6 десятилетии) и легким течением; от 200 до Г000 нМ/мл/ч - для больных БГ тип I с манифестацией от 2 лет и более тяжелой формой; прирост активности XT свыше 1500 нМ/мл/ч - для больных БГ тип III и II типов с тяжелой неврологической формой заболевания.

5. Впервые в России налажены методы ДНК-анализа гена БДГ. Проведен молекулярно-генетический анализ 55 пациентов. При скрининге на частые мутации было обнаружено три преобладающих аллеля в 9 и 10 экзонах гена БДГ: N370S, L444P и Ree Neil. В процессе исследования идентифицировано 16 мутаций, из которых 7 описаны впервые: Р236Т, Rec(g4355-4430), L288P, L288Q, P319S, W381X и A384D. 6 Выявлены четкие корреляции тяжести течения БГ с обнаруженными мутациями. Мутация N370S в гомозиготном состоянии обуславливает легкую или промежуточную форму БГ I типа. Клиническое проявление БГ у гетерозиготных носителей N370S обусловлено вторым мутантным аллелем. Наличие мутации L444P в гомозиготном состоянии обуславливает развитие тяжелой клинической формы БГ II или III типов, а в сочетании с мутацией A384D она определяет II тип БГ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Krasnopolskaya X.D., Mirenburg T.V., Bukina Т.М. Diagnosis and prevention of Gaucher disease in Russia. 2nd EWGGD Workshop. Abstracts, 1997, p. 29.

2. Краснопольская К.Д., Мирепбург T.B., Ахунов B.C., Покровская А.Я, Шехтер О.В., Захарова Е.Ю., Воскобоева ЕГО., Букина Т.М. Пр01рамма диагностики и профилактики наследственных болезней обмена клеточных органелл у российских больных. "Актуальные проблемы диагностики, лечения и профилактики наследственных заболеваний у детей". Тезисы докладов. 1998, стр. 33-34.

3. Журкова Н.В., Краснопольская К.Д., Кириллова Е.А., Покровская А.Я., Гаркуша В.Е., Дмитриенкова H.H., Букина Т.М., Никифорова O.K. Разработка и апробация программы селективного скрининга и методов подтверждения диагноза на наследственные болезни обмена веществ с острым течением и ранним летальным исходом. "Актуальные проблемы диагностики, лечения и профилактики наследственных заболеваний у детей". Тезисы докладов. 1998, стр. 24-25.

4. Краснопольская К Д., Букина Т.М., Ахунов B.C., Евдокименков В.Н., Захарова Е.Ю., Покровская А.Я,, Воскобоева Е.Ю., Шехтер О.В., Тишкашша C.B., Мытникова Е.А., Погорелов А.Г. Протрамма диагностики и профилактики наследственных болезней обмена клеточных органелл Всстник РАМН, 1999, №11, сгр.16-22.

5. Румянцев А.Г., Смирнова Г.В., Букина Т.М., Лунга И.Н, "Диагностика и лечение наследственных лизосомных болезней накопления у детей. Болезнь Гоше". Проблемы и перспективы" Сборник лекций по актуальным проблемам педиатрии РГМУ.2000, стр. 599-608. 6 Бейер Е.М., Букина Т.М., Цветкова И.В. "К вопросу диагностики болезни Гоше" Рабочее совещание «Лизосомные болезни, модели, терапия» сборник тезисов, стр. 9, 28-29 сентября, Новосибирск 2000г.

7. Krasnopolskaya K.D., Boukina Т.М." Diagnoses of Gaucher disease in Russia""Pa6o4ee совещание Лизосомные болезни, модели, терапия" сборник тезисов, стр. 11, 28-29 сентября, Новосибирск 2000г.

8. Букина Т.М., Краснопольская К.Д "Болезнь Гоше: фено-генотипическяе корреляции" 2 (4) съезд медицинских генетиков.Курск, 2000, сборник тезисов стр. 30.

9. Бейер Е.М., Букина Т.М.Б Цветкова И.В. «Биохимическая и генетическая диагностика болезни Гогае и фенотипическая гетерогенность заболевания» (2000) Вопр. Мед. Химии 46 (5): стр. 451 -

10. Букина Т.М. "Мутации в гене кислой P-D-глкжозндазы у российских пациентов с болезнью Гоше". Вестник РГМУ, 2002, №4 (25), стр. 39-42.

11. Mutations in the gene of the acid p-D-glucocerebrosidase in Russian patients with Gaucher's disease, (стенд The 5th Workshop of EWGGD, 1-4 May, 2002).

12. Boukina T.M. Molecular screening of Russian patients with Gaucher's disease.- Abstract, The 5th Workshop of EWGGD, 1-4 May, 2002, p. 41.

13. Voskoboeva EYu., Boukina T.M., Boukina A.M., Zakharova E.Yu., Akhunov V.S. Molecular-genetic analysis of lysosomal storage diseases in Russia. European Jornal of Human genetics 2002, p.

14. T.M. Boukina, E.Yu. Voskoboeva, AM.Boukina, V.A.Galkina, E.L. Dadali Distribution of genotypes among patients with GD. 6th European working group on Gaucher disease (EWGGD). Barcelona, Spain - October 14-16,2004. P5.

15 Букина T.M , Басистова A.A., Белогурова М.Б., Гундобина O.C. Болезнь Гоше: патогенез и клинические проявления. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2004, тЗ, №4, стр. 36-42.

16. БукинаТ.М., Воскобоева Е.Ю., Цветкова И.В., Галкина В.А., Дадали Е.Л., Козлова В.М, Руденская Г Е Биохимическая и молекулярно-генетическая диагностика болезни Гоше. 3 (5) съезд медицинских генетиков, Уфа, 2005, Мед Гепетика, № 4, стр. 162.

455.

208 Р0637.

Принято к исполнению 21/09/2005 Заказ № 1060

Исполнено 21/09/2005 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (095)975-78-56 (095) 747-64-70 www.autoreferat.nl

РНБ Русский фонд

2007-4 5591

" 'г t. 1л X г г

54 - *

2 9 НОЯ 2005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Букина, Татьяна Михайловна

Список сокращений.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Структура, функции, метаболизм гликосфинголипидов (ГСФ).

2.2. Лизосомные болезни накопления ГСФ.

2.3. Болезнь Гоше (БГ).

2.3.1. Характеристика клинических фенотипов БГ.

2.3.2. Молекулярные механизмы этиологии и патогенеза БГ.

2.3.2.1. Патологические метаболиты БГ.

2.3.2.2. Патогенные маркеры БГ.

2.3.2.3. Кислая p-D-глюкоцереброзидаза.

2.3.3. Молекулярно-генетический анализ БГ

2.3.3.1. Характеристика гена p-D-глюкоцереброзидазы.

2.3.3.2. Анализ мутаций в гене p-D-глюкоцереброзидазы.

2.3.3.3. Гено-фенотипические корреляции при БГ.

2.4. Методические подходы к диагностике БГ

2.4.1. Клинико-биохимическая диагностика БГ.

2.4.2. Молекулярно-генетическая диагностика БГ.

2.5. Лечение БГ

2.5.1. Ферментзаместительная терапия.

2.5.2. Субстратподавляющая терапия.

2.5.3. Генотерапия.

2.5.4. Другие методы лечения.

2.6. Профилактика БГ.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.2.1. Характеристика выборки обследованных больных.

3.2.2. Пре- и постнатальная энзимодиагностика

3.2.2.1. Активность p-D-глюкозидазы.

3.2.2.2. Активность хитотриозидазы.

3.2.3. Пренатальная энзимодиагостика.

3.2.4. Молекулярно-генетический анализ БГ.

3.2.5. Исследование популяционного полиморфизма по обнаруженным мутациям.

3.2.6. Гено-фенотипические корреляции.

3.3. ОБСУЖДЕНИЕ

3.3.1. Биохимическая диагностика.

3.3.2. Молекулярно-генетическая диагностика.

3.3.3. Гено-фенотипические корреляции.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биохимическая и молекулярно-генетическая характеристика болезни Гоше у российских пациентов"

Гликосфинголипидозы - группа наследственных болезней обмена веществ, характеризующихся нарушением ферментативного внутрилизосомного расщепления гликосфинголипидов (ГСП), важнейших структурных элементов клеточных мембран. Нарушение процесса расщепления ГСЛ сопровождается их внутрилизосомным накоплением в клетках-мишенях, что приводит к гибели этих клеток.

К гликосфинголипидозам относится и болезнь Гоше (БГ). Это аутосомно-рецессивное наследственное заболевание, обусловленное мутациями в структурном гене P-D-глюкоцереброзидазы, фермента, участвующего в процессе расщепления ГСЛ и присутствующего в лизосомах всех типов тканей (Brady et al, 1965а). БГ является наиболее распространенным гликосфинголипидозом человека, однако три ее основных клинических фенотипа (I - III) распространены с различной частотой. Самым частым из них является тип I, не неврологический, (в различных популяциях от 1:40 ООО до 1:60 ООО новорожденных), типы II и III, неврологические, встречаются реже (1:100 ООО и 1:50 000 соответственно).

Характерными особенностями БГ являются клиническая гетерогенность и полиморфизм (Beutler and Grabowski, 1995), что существенно затрудняет диагностику БГ. Поэтому на клиническом уровне заболевание может быть только заподозрено, а для точной диагностики необходимо проведение биохимических исследований (локусная дифференциация БГ) и молекулярно-генетических исследований (аллельная дифференциация БГ). Использование таких диагностических процедур, очевидно, позволяет решать проблемы точной постнатальной диагностики, что необходимо для профилактики БГ в семьях высокого риска.

В исследовании, диагностике и разработке методов лечения БГ I типа последовательно реализовались все методические подходы, используемые для других наследственных болезней обмена веществ (ИБО), что делает это заболевание своеобразной моделью в современной медицинской генетике. Методические подходы включают анализ патологических метаболитов, дефектного фермента, мутантного гена, разработку методов терапии (ферментзаместительной (ФЗТ), субстратподавляющей (СПТ) и генотерапии).

Метод измерения активности кислой p-D-глюкозидазы в клетках крови и фибробластах человека был разработан в 1965r (Brady et al, 1965b). Метод является простым, удобным и быстрым, а также не требует тяжелых инвазивных вмешательств. Кроме того, в 1994г. было обнаружено, что у больных с БГ макрофаги при накоплении негидролизованного субстрата начинают интенсивно синтезировать фермент хитотриозидазу (XT), в результате чего активность этого фермента возрастает более чем в сто раз (Hollak et al, 1994). Это позволяет использовать значение активности XT в качестве дополнительного маркера в диагностике БГ.

Расшифровка последовательности гена p-D-глюкоцереброзидазы, картированного на хромосоме lq 21, позволяет проводить анализ спектра мутаций при БГ (Sorge et al, 1985). По данным мировой литературы молекулярно-генетический анализ БГ начался в 90-х годах, тогда как в отечественной медицинской генетике еще не проводился (Beutler et al, 1990; Zimran et al, 1991; Sibille et al, 1993).

Настоящая работа важна как с научной, так и с практической точки зрения. Ее научная значимость определяется вкладом в исследование полиморфизма генома человека. Особенности формирования геномной структуры популяции обуславливают целесообразность изучения геномного полиморфизма, сопровождающегося как патологическим, так и нейтральным действием во всех популяциях, без чего представления о генофонде человека не могут быть полными.

Практическая значимость определяется задачами медико-генетического консультирования (МГК), т.е. точной диагностикой и дифференциацией различных по тяжести форм заболевания. Для значительного количества семей поводом для обращения в МГК является прогноз жизни ребенка. Тяжесть заболевания влияет на решение родителей о сохранении или прерывании беременности.

Все, выше изложенное, определяет актуальность выполненной работы. Цель и задачи исследования.

Целью данной работы являлись локусная и аллельная дифференциация различных клинических форм БГ. В ходе исследования решались следующие задачи: формирование выборки больных с болезнью Гоше;

- сравнительный анализ активности дефектного фермента (P-D-глюкоцереброзидазы) у пациентов с различными клиническими формами БГ, носителей БГ и в контрольной группе;

- скрининг на частые мутации и поиск редких мутаций в гене БДГ;

- анализ гено-фенотипических корреляций на исследуемой выборке больных.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Учитывая фенотипическое сходство БГ с другими заболеваниями (например, БГ тип I с болезнью Ниманна-Пика тип В или остеомиелитом, БГ тип II с Gml-ганглиозидозм), при клиническом обследовании БГ можно только заподозрить. В практике отечественной медицины до сих пор главным методом постановки диагноза БГ является исследование цитологических препаратов костного мозга. Процедура забора клеток костного мозга является болезненной для пациента, а результат цитологического исследования не всегда может быть однозначным. Отработанный метод биохимической диагностики, основанный на измерении активности P-D-глюкозидазы в лейкоцитах крови, дает возможность достоверно диагностировать БГ без применения сложного и болезненного для пациента исследования пункции костного мозга. А дополнительное исследование активности XT в плазме дает возможность контролировать не только правильность постановки диагноза в случаях пограничной активности p-D-глюкозидазы, но и процесс лечения БГ. Результаты, полученные при обследовании пациентов в нашей лаборатории, подтверждают значимость биохимических методов исследования в диагностике БГ. Так из 152 человек с направляющим диагнозом БГ, диагноз БГ был подтвержден только у 86 человек.

Разработанные подходы к анализу первичной структуры нормального и мутантных аллелей гена P-D-глюкозидазы позволяют выявить молекулярные дефекты, лежащие в основе болезни Гоше. Впервые был проведен анализ мутантного гена у 55 российских больных с I, II и III типами БГ. Это позволило создать базу для прямого исследования генетической гетерогенности БГ. Впервые определен спектр мутаций в гене P-D-глюкозидазы в выборке российских больных и предпринята попытка выявить влияние данных мутаций на клиническое проявление БГ. Разработанные методы исследования позволили идентифицировать 16 мутантных аллелей. В ходе исследования обнаружены три преобладающих мутациив 9 и 10 экзонах гена P-D-глюкозидазы. Эти результаты позволяют предположить наличие специфических генотипов для российских популяций.

Положения, выносимые на защиту.

2. Проанализированы значения активности хитотриозидазы в выборке пациентов с БГ клиническими формами БГ, носителей БГ и в контрольной группе.

4. Выявлены особенности гено-фенотипических корреляций при БГ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Букина, Татьяна Михайловна

выводы

1. Подтверждена необходимость биохимической диагностики для верификации диагноза БГ вследствие существования значительного количества гено- и фенокопий БГ, т.к. диагноз был подтвержден только у 86 из 152 пациентов с направляющим диагнозом БГ.

2. Проведен сравнительный анализ значений активности кислой P-D-глюкозидазы в контрольной группе, в группах пациентов с различными формами тяжести БГ и в группе облигатных гетерозигот. Получены значения контрольных величин активности P-D-глюкозидазы (контроль - 10,6±6,3 нМ/мг/ч; носители - 6,8±2,7 нМ/мг/ч; пациенты с БГ - 1,9±0,9 нМ/мг/ч. Установлено статистически достоверное снижение активности p-D-глюкозидазы в лейкоцитах пациентов с БГ (р=0,000).

3. При сравнительном анализе значений активности XT в плазме установлено статистически достоверное возрастание активности фермента у пациентов с БГ (р=0,00) и отсутствие достоверного изменения активности XT в плазме облигатных гетерозигот по сравнению с нормой (р=0,35). Возрастание активности хитотриозидазы (11328,4±1850,5 нМ/мл/ч) является решающим фактом в пользу диагноза БГ при явлении пограничной активности p-D-глюкозидазы между патологией и гетерозитотным носительством.

4. Выявлена корреляция между уровнем прироста активности XT и тяжестью течения БГ: прирост активности XT менее 100 нМ/мл/ч/год характерен для БГ тип I с поздней манифестацией (на 3-6 десятилетии) и легким течением; от 200 до 1000 нМ/мл/ч/год - для больных БГ тип I с манифестацией от 2 лет и более тяжелой формой; прирост активности XT свыше 1500 нМ/мл/ч/год - для больных БГ тип III и II типов с тяжелой неврологической формой заболевания.

6. Выявлены четкие корреляции тяжести течения БГ с обнаруженными мутациями. Мутация N370S в гомозиготном состоянии обуславливает легкую или промежуточную форму БГ I типа. Клиническое проявление БГ у гетерозиготных носителей N370S обусловлено вторым мутантным аллелем. Наличие мутации L444P в гомозиготном состоянии обуславливает развитие тяжелой клинической формы БГ II или III типов, а в сочетании с мутацией A384D она определяет II тип БГ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

БГ - наиболее распространенное среди сфинголипидозов заболевание. Оно характеризуется широким спектром клинических форм от мягких бессимптомных до тяжелых с поражением ЦНС. Определение активности p-D-глюкозидазы в лейкоцитах позволяет точно верифицировать диагноз БГ, не прибегая к гистологическим методам исследования. Результаты исследования экспрессии P-D-глюкозидазы показали статистически достоверное снижение активности мутантного фермента в лейкоцитах пациентов с БГ. Столь же важным для диагностики БГ является исследование активности XT плазмы, поскольку в некоторых случаях остаточная активность p-D-глюкозидазы настолько высока, что ее значения у пациентов перекрываются со значениями активности у гетерозигот. В этом случае уровень активности XT становится дополнительным маркером при верификации диагноза БГ. Ранее было показано, что активность XT зависит от количества накопленного субстрата, что позволяет также осуществлять контроль при лечении пациентов с БГ. Результаты проведенного исследования позволяют говорить о взаимосвязи активности XT и тяжести клинического фенотипа, а также о взаимосвязи активности XT и генотипа.

В результате молекулярно-генетического анализа 55 пациентов было верифицировано 90% мутантных аллелей. Как в большинстве европейских популяций частыми оказались три: N370S, L444P и RecNcil, которые составили 45,6%, 20% и 7,3% от общего числа аллелей, соответственно. В числе редких и единичных мутаций были обнаружены R120W (2,7%), W184R (3,6%), G202R (1,8%), W381X (1,8%), A384D (2,7%), а мутации R170C, Р236Т, rec(g4355-4430), L288P, L288Q, P319S, R463C и с!е155были встречены только однажды (0,9%). 9% мутантных аллелей пока остались не идентифицированными. Отличительной особенностью нашей выборки явилось присутствие четырех аллелей W184R и A384D у не родственных пациентов. У пациентов нашей выборки обнаружилась значительная молекулярная гетерогенность (16 различных мутантных аллелей и 17 генотипов). Сорок шесть пациентов выборки являются генетическими компаундами, а из них сорок два пациента (76,4%) являются гетерозиготными носителями мутации N370S. Наиболее частыми генотипами в обследованной популяции были N370S/L444P - 10/55 (18%), N370S/Rec Nci I - 8/55 (15%); N370S/N370S - 5/55 (9%), L444P/L444P - 4/55 (7%).

Учитывая частоты встречаемости мутаций, а также наличие псевдогена, на 97% гомологичного функциональному гену, и достаточно часто возникающие

87 рекомбинантные мутации, обусловленные кроссинговером между БДГ и пБДГ, можно предложить следующую схему проведения ДНК-анализа для пациентов с БГ:

- скрининг на частые мутации (N370S, L444P, W184R, recNci I, R120W, A384D);

- обязательное исследование родительской ДНК в случае гомозиготного носительства мутации у пробанда;

Для практической диагностики основным методом верификации диагноза БГ являются биохимические методы исследования активности P-D-глюкозидазы и XT в качестве дополнительного маркера. ДНК-диагностика необходима в случае промежуточного значения активности P-D-глюкозидазы и нулевого значения активности XT. ДНК-диагностика на носительство возможна только в семьях с точно установленным генотипом, либо при помощи косвенной ДНК-диагностики. Пренатальная диагностика БГ на ранних сроках беременности также возможна как методом определения активности кислой P-D-глюкозидазы, так и с помощью ДНК-анализа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Букина, Татьяна Михайловна, Москва

1. Ленинджер А. Основы биохимии: В 3-х т. М, Мир, 1985.

2. Тюрин Ю.Н., Макаров А.А. Статистический анализ данных на компьютере. М., ИНФА-Мб 528с., 1998.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное «<лонирование. М., Мир, 1984 г, 479с.

4. Пейджен К. Генетическая регуляция лизосомных ферментов. В кн.: Лизосомы и лизосомные болезни накопления. М., «Медицина», стр. 17-32, 1984.

5. Abrahamov A, Elstein D, Gross-Tsur V et al. (1995) Gaucher's disease variant characterised by progressive calcification of heart valves and unique genotype. Lancet 346:1000-1003.

6. Aerts JMFG, Donker-Koopman WE, Brul S et al (1990) Comparative study on glucocerebrosidase in spleen from patients with Gaucher1 disease. Biochem J 269: 93-100.

7. Aerts JM, Hollak C, Boot R, Groener A (2003) Biochemistry of glycosphyngolipid storage disordes: implications for therapeutic interventioa Philos Trans R Soc bond В 358: 905-914.

8. Aghion E (1934) La maladie de Gaucher dans l'enfance. In These, Faculte de Medecine, Paris, France.

9. Achord D, Brot F, Gonzalez-Noriega A, Sly W, Stahl P (1977) Human beta-glucuronidase. II. Fate of infused human placental beta-glucuronidase in the rat. Pediatr. Res. 11:816.

10. Ashkenazi A,Zaizov R, Matoth Y (1986) Effect of splenectomy on destructive bone chenges in children with chronic (typel) Gaucher disease. Eur J Pediatr 145:138.

11. Austin J (1959) Metachromatic sulfatides in cerebral white matter and kidney. Proc Soc Exp Biol Med 100: 361-364.

12. Austin J, Suzuki K, Arnstrong D, Brady R et al (1970) Studies in globoid (Krabbe) leukodystrophy (GLD). V. Controlled enzymic studies in ten human cases. Arch Neurol 23: 502-509.

13. Balazs E.A. (1987) Chemistry and molecular biology of the intercellulur matrix. Academic press New-York. 1: 111.

14. Balicki D & Beutler E (1995) Gaucher disease. Medicine 74: 305-323.

15. Baltimore D (1981) Gene conversion: Some implications for immunoglobulin genes. Cell 24: 592.

16. Barneveld RA, Keijzer W, Tegelaers FPW et al (1983) Assigment of the gene coding for human P-glucocerebrosidase to the region q21-q31 of chromosome 1 using monoclonal antibodies. Hum Gen 64: 227-231.

17. Barranger JA & Ginns EI (1989) Gaucher disease. In Scriver CR, Sly WS & Valle D (eds) The Metabolic Basis of Inherited Disease, pp 1677-1698. New York: Mc Graw Hill.

18. Barton NW, Brady RO, Dambrosia JM, Di Bisceglie AM, Doppelt SH, Hill SC et al. (1991) Replacement therapy for inherited enzyme deficiency Macrophage-targeted glucocerebrosidase for Gaucher's disease. N Engl J Med 324: 1464-1468.

19. Bassan R, Montanelli A & Barbui T (1985) Interaction between a serum factor and T lymphocytes in Gaucher disease. Am J Hematol 18: 381-384.

20. Belchetz PE, Crawley JCW, Braidman IP, GregoriadisG (1977) Treatment of Gaucher's disease liposome-entrapped glucocerebroside:beta-glucosidase. Lancet 2: 116.

21. Berent SL & Radin NS (1981) Mechanism of activation of glucocerebrosidase by co-P-glucosidase (glucosidase activator protein). Biochim Biophys Acta 664: 572582.

22. Berg-Fussman A, Grace ME, Ioammon Y and Grabowski GA (1993) Human acid P-glucosidase: N-glycosylation site occupancy and the effect of glycosylation on enzymatic activity. J Biol Chem 268:14861-14866.

23. Berrebi A, Malnick SDH, Vorst EJ & Stein D (1992) High incidence of factor XI deficiency in Gaucher's disease. Am J Haematol 40: 153-161.

24. Beutler E (1991) Gaucher disease N Engl J Med 325: 1354.

25. Beutler E (1992) Gaucher disease: New molecular approaches to diagnosis and treatmen. Science 256: 794.

26. Beutler E (1993) Gaucher disease as a paradigm of current issues regarding single gene mutations of humans. Proc Nat Acad Sci USA 90: 5384-5390.

27. Beutler E & Gelbart T (1993) Gaucher disease mutations in non-Jewish patients. Brit J Haem 85: 401 405.

28. Beutler E & Gelbart T (1996) Glucocerebrosidase (Gaucher disease). Hum Mut 8: 207-213.

29. Beutler E, Gelbart T, Kuhl W, Sorge J, West С (1991) Identification of the second common Jewish Gaucher disease mutation makes possible population based screening for the heterozygote state. Proc Natl Acad Sci USA 88:10544.

30. Beutler E, Gelbart T, Kuhl W, Zimran A, West С (1992) Mutations in Jewish patients with Gaucher disease. Blood 79:1662.

31. Beutler E, Gelbart T, West С (1990) The facil detection of the NT 1226 mutation of glucocerebrosidase by "mismatched" PCR. Clin Chin Acta 194:161.

32. Beutler E & Grabowski GA (1995) Gaucher disease. In Scriver CR, Beudet A, SlythfVS, Valle D (eds) Molecular and Metabolic Bases of Inherited Disease, 7 edn, pp. 2641-2692. New York: McGrow-Hill.

33. Beutler E, Kay A, Saven A, Garver P, Thurston D, Dawson A, Rosenbloom В (1991) Enzyme replacement therapy for Gaucher disease. Blood 78:1183-1185.

34. Beutler E & Kuhl W (1970) The diagnosis of the adult type of Gaucher's disease and its carrier state by demonstration of deficiency of beta-glucosidase activity in peripheral blood leukocytes. J Labor Clin Med 76: 747 755.

35. Beutler E, Kuhl W, Matsumoto F et al (1976) Acid hydrolases in leucocytes and platelets in normal subjects and in patients with Gaucher's disease. J Exp Med 143: 975-980.

36. Beutler E & Saven A (1990) Misuse of marrow examination in diagnosis of Gaucher disease. Blood 76: 646-648.

37. Beutler E, Sorge JA, Zimran A, West C, Kuhl W, Westwood B, Gelbart T(1988) The molecular biology of Gaucher disease. In Salvayre R, Douste-Blagy L.Gatt S (eds): Lipid Storege Disorders. Biological and Medical Aspects. New York, Plenum, p 19.

38. Beutler E. (2000) Commentary: Dosage-Response in the Treatment of Gaucher Disease by Enzyme Replacement Therapy. Blood Cells, Mol., and Diseases 26: 303306.

39. Billet HH, Rizvi S & Sawitsky A (1996) Coagulation abnormalities in patients with Gaucher's disease: effect of therapy. Am J Haematol 51: 234-236.

40. Boot RG, Renkema GH, Strijland A et al (1995) Cloning cDNA encoding chitotriosidase, a human chitinase produced by macrophages. J Biolog Chem 270: 26252-26256.

41. Boot RG, Renkema GH, Verhoek M et al (1998) The human chitotriosidase gene. J Biolog Chem 273: 25680-25685.

42. Bornstein P, McKinney CE, LaMarca ME et al (1995) Metaxin, a gene contiguous to both thrombospondin 3 and glucocerebrosidase, is required for embrionic development in the mouse: Implications for Gaucher disease. Proc Natl Acad Sci USA 92: 4547-4549.

43. Bradford MN (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem, 72: 248-254.

44. Brady RO, Gal AE, Bradley RM et al (1967) Enzymatic defect in Fabry's disease. Ceramidetrihexosidase deficiency. N Engl J Med 276:1163.

45. Brady RO, Kanfer J, Mock MB, Fredrickson DS (1966) The metabolism of sphingomyelin. II. Evidence of an enzymatic deficiency in Niemann-Pick disease. Proc Natl Acad Sci USA 55: 366-371.

46. Brady RO, Kanfer J & Shapiro D (1965a) Metabolism of glucocerebrosides .II. Evidence of an enzymatic deficiency in Gaucher's disease. Bioch. Bioph. Res. Com. 18: 221-225.

47. Brady RO, Kanfer J & Shapiro D (1965b) The metabolism of glucocerebrosides. I. Purification and properties of a glucocerebroside-cleaving enzyme from spleen tissue. J Biol Chem 240: 39-42.

48. Brady RO, Pentchev PG, Gal AE, Hibbert SR, Dekaban AS (1974) Replacment therapy for inherited enzyme deficiency. Use of purified glucocerebrosidase in Gaucher's disease. N Engl О Med 291: 989/

49. Brady RO (1966) Sphingolipidoses. New Engl J Med 275: 312-318.

50. O'Brien JS (1969) Generalized gangliosidosis. JPediatr 75: 167.

51. Brill NE (1901) Primary splenomegaly with a report of three cases occurring in one family. Am J Med Sci 121: 377-392.

52. Brill NE (1904) A case of "splenomegalie primitif': with involvement of the haemopoetic organs. Proceedings of the New York Pathological Society 4: 143-149.

53. McCabe ERB, Fine В A, Globus MS et al (1996) Gaucher disease Current issues in diagnosis and treatment. JAmer Med Assoc 275: 548-553.

54. Choy FY, Wong K, Vallance HD, Balduin V (2000) Novel point mutation (W184R) in neonatal type 2 Gaucher disease. Pediatr Dev Pathol 3:180-183.

55. Choudary PV, Barranger JA, Tsuji S, Mayor J, LaMarca ME, Cepko CL et al (1986a) Retrovirus-mediated transfer of the human glucocerebrosidase gene to Gaucher fibroblasts. Mol. Biol. Med. 3: 293-295.

56. Choudary PV, Horowitz M, Barranger JA, Ginns EI (1986b) Gene transfer and expression of active human glucocerebrosidase i n mammalian cell cultures. DNA 5: 78-81.

57. Choy FY, Wong K, Vallance HD, Balduin V (2000) Novel point mutation (W184R) in neonatal type 2 Gaucher disease. Pediatr Dev Pathol 3:180-183.

58. Collier WA (1895) A case of enlarged spleen in a child aged six. Transaction of the Pathological Society of London 46:148-150.

59. Condie A, Borresen A-L,Eeles R et al (1993) Point-mutation detection: Comparison of SSCP, CDGE and HOT. Hum Mut 2: 58-66.

60. Conradi NG, Saurander P, Nilsson O, Svennerholm L, Erikson A (1984) Neuropatology of the Norrbottnian type of Gaucher disease: Morphological and biochemical studies. Acta Neuropathol (Berl) 65: 99.

61. Conzelmann E, Sandhoff К (1978) Deficiency of a factor necessary for stimulation of hexosaminidase A catalyzed degradation of ganglioside Gm2 and glycolipid Ga2. Proc Natl Acad Sci USA 75: 3979.

62. Conzelmann E and Sandhoff К (1991) Biochemical basis of lateonset neurolipidoses. Dev Neurosci 13:197-204.

63. Cormand B, Montfort M, Chabas A, Vilageliu L, Grinberg D (1997) Genetic fine localization of the p-glucocerebrosidase (GBA) and prosaposin (PSAP) genes: implications for Gaucher disease. Hum Genet, 100: 75-79.

64. Cormand B, Grinbeg D, Gort L, Chabus A et al (1998) Molecular analysis and clinical findings in the Spanish Gaucher disease population: putative haplotype of the N370S ancestral chromosome. Hum Mut, 11 (4): 295-305.

65. Countre P, Demina A, Beutler T, Beck M? Petrides PE (1997) Molecular analysis of Gaucher disease: distribution of eight mutations and the compleate gene deletion in 27 patiants from Germany. Hum Genet, 99 (6): 816-821/

66. CoxT, Lachmann R, Hollak C, Aerts J, van Weely S et al (2000) Novel oral treatment of Gaucher's disease with N-Butyldeoxynojirimycin (OGT 918) to decrease substrate biosynthesis. Lancet 355:1481-1485.

67. Cullis P.R., Hope M.J., Tilcock C.P.S. (1986). Lipid polymorphism and the Roles of Lipids in Membranes. Chem. Phys. Lipids, 40, 127 144. •

68. Curatolo W., Neuringer L.J., (1986). The Effects of Cerebrosides of Model Membrane Shape. J. Biol. Chem., 261:17177-17182.

69. Curatolo W.(1987). Glycolipid Function. Biochim. Biophys. Acta, 906: 137-160.

70. Dahl N, Lagerstrom M, Erikson A, Pettersson U (1990) Gaucher disease type III (Norrborttnian type) is caused by a single mutation in exon 10 of the glucocerebrosidase gene. Am J Hum Genet 47:275.

71. Dawson G & Oh JY (1977) Blood glucosylceramide levels in Gaucher's disease and its distribution amongst lipoprotein fractions. Clin Chim Acta 75: 149-153.

72. De Duve, Pressman ВС, Gianotto R, Wattiaux R, Appelmans F (1955) Tissue fractionation studies, intracellular distribution patterns of enzymes in rat liver tissue. Biochem. J. 60: 604.

73. Demina A, Boas E and Beutler E (1998) Structure and linkage relationships of the region containing the human L-type pyruvate kinase (PKLR) and glucocerebrosidase (GBA) genes. Hematopathol Mol Hematol 11: 63-71.

74. Van Echten G and Sandhofif К (1993) Ganglioside metabolism. Enzymology, topology and regulation. J Biol Chem 268: 5341-5344.

75. Eto Y, Kawame H, Hasegawa Y et al (1993) Molecular characteristics in Japanese patients with lipidosis: novel mutations in metachromatic leucodystrophy and Gaucher disease. Mol Cel Bioch 119: 179-184.

76. Farber S, Cohen J, Usmann LL (1957) Lipogranulomatosis. A new lipoglicoprotein storage disease. J Mt Sinai Hosp 24: 816-822.

77. Fink JK, Correll PH, Perry LK, Brady RO, Karlsson S (1990) Correlation of glucocerebrosidase deficiency after retroviral-mediated gene transfer into hematopoietic progenitor cells from patiets with Gaucher disease. Proc Natl Acad Sci USA 87: 234.

78. Fleshner PR, Aufses AH Jr, Grabowski GA, Elias R (1991) 27-year experience with splenectomy for Gaucher's disease. Am J Surg 161: 69.

79. French JH, Brotz M & Poser CM (1969) Lipid composition of the brain in infantile Gaucher's disease. Neurology 96: 81-86.

80. Furst W., Sandhoff K. (1992) Activator proteins and topology of lysosomal sphyngolipid catabolism. Biochim. Biophys. Acta, 1226:1.

81. Galjaard H Genetic metabolic diseases. Early diagnosis and prenatal diagnosis. Elsevier/North-IIolland biomedical press. Amsterdam-New York-Oxford, 1980, 870pp.

82. Gaucher PCE (1882) De l'epithelioma primitif de la rate,hypertrophic idiopathique de la rate sans leucemie Thesis. Paris.

83. Gery I, Zigler JSJ, Brady RO &Barranger J A (1981) Selective effects of glucocerebroside (Gaucher's storage material) on macrophage cultures. J Clin Invest 68:1182-1189.

84. Gilbert HS & Weinreb N (1976) Increased circulating levels of transcobalamin ii in Gaucher's disease. N Engl J Med 295:1096-1101.

85. Ginns EI, Choudary PV, Tsuji S et al (1984) Isolation of cDNA clones for human p-glucocerebrosidase using the Xgtl 1 expression sistem. Biochem Biophys Res Com 123: 574-580.

86. Ginsberg II, Grabowski GA, Gibson JC et al (1984) Reduced plasma concentrations of total, low density and high density lipoprotein cholesterol in patients with Gaucher type 1 disease. Clin Gen 26:109-116.

87. Glenn D, Gelbart T & Beutler E (1994) Tight linkage of pyruvate kinase (PKLR) and glucocerebrosidase (GBA) genes. Hum Gen 93: 635-638.

88. Goldblatt J, Sacks S, Dall D, Beigton P (1988) Total hip arthroplasty in Gaucher's disease. Long-term prognosis. Clin Orthop 228: 94-98.

89. Grabowski GA, Pastores G, Brady RO, Barton NW (1993) Safety and efficacy of macrophage targeted recombinant glucocerebrosidase therapy. Pediatr. Res. 33: 139A.

90. Grabowski GA, Ponce E, Leonova T & Qi X (1997) Clinical and basic studies of enzyme and gene therapy in Gaucher disease type 1. Jap J Incher Metab Dis 13: 283-292.

91. Grabowski G.A. (2004) Gaucher disease: lesions from a decade of terapy. J. Pediatr. 144:15-19.

92. Grace ME, Desnick RJ, Pastores GM (1997) Identification and expression of acid beta-glucosidase mutations causing severe type 1 and neurologic type 2 Gaucher disease in non-Jewish patients. О Clin Invest 99: 2530-2537.

93. Grace ME, Grabowski GA (1990) Human acid beta-glucosidase: Glycosylation is required for catalytic activity. Biochem Biophys Res Commun 168: 771.

94. Graves PN, Grabowski GA, Ludman MD, Palese P, Smith EI: Human acid beta-glucosidase (1986) Nothern blot and SI nuclease analysis of the mRNA from cells and normal and Gaucher disease fibroblasts. Am J Hum Genet 39: 763.

95. Graves PN, Grabowski GA, Eisner R et al (1988) Gaucher disease type 1: cloning and characterization of a cDNA ancoding acid p-glucosidase from an Ashkenazi Jewish patient. DNA and Cell Biology 7: 521-528.

96. Guo Y, He W, Boer AM, Wevers RA, de Bruun AM, Groener JEM, Hollak СЕМ, Aerts JMFG, Galjaard H, van Diggelen OP. (1995) Elevated plasma chitotriosidase activity in various lysosomal storage disorders. J Inher Me tab Dis 18: 717-722.

97. Hakomori S. (1981) Лшш. Rev. Biochem. 50: 733 764.

98. Hannun YA, R.M.Bell (1989). Science 243 500 507.

99. He G-S, Grabowski GA (1992) Gaucher disease: A G+1—>A+1 IVS2 splice donor site mutation causing exon 2 skipping in the acid P-glucosidase mRNA. Am J Hum Genet 51: 810.

100. Hillborg PO (1959) Morbus Gaucher: Norrbortten. Nor disk Medicin 61: 303-306.

101. Hers H.G. (1965) Inborn lisosomal diseases. Gastroenterology 48: 625-652.

102. Ho MW, O'Brien JS, Radin NS & Ericson JS (1973) Glucocerebrosidase: reconstitution of activity from macromolecular components. Biochem J 131: 173176.

103. Hollak СЕМ, Levi M, Berends F et al (1997a) Coagulation abnormalities in type I Gaucher disease are due to low grade activation and can be partly restored by enzyme supplementation therapy. Brit JHaemotol 96: 470-476.

104. Hollak СЕМ, Evers L, Aets JMFG & van Oers MHJ (1997b) Elevated level of M-CSF, sCD14 and IL8 in type 1 Gaucher disease. Blood Cells, Molecules and Diseases 23:201-212.

105. Hollak СЕМ, van Weely S, van Oers MHJ& AertsLMFG (1994) Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher desease. J Clin Invest 93, 1288-1292.

106. Holleran WM, Ginns EI, Menon GK, Grundmann JU, Fartasch M, McKinney CE, Elias PM & Sidransky E (1994) J Clin Invest 93, 1756-1764.

107. I Iorowitz M, Tzuri G, Eyal N, Berebi A et al (1993) Prevalence of nine mutations among Jewish and non-Jewish Gaucher disease patients. Am О Hum Genet 53 (4): 921-930.

108. Hong CM, Ohashi T, Yu XJ, Weiler S, Barranger JA (1990) Sequence of two alleles responsible for Gaucher disease. DNA Cell Biol 9:233.

109. Horowitz M, Wilder S, Horowitz Z, Reiner O, Gelbart T, Beutler E (1989) The human glucocerebrosidase gene and pseudogene: Structure and evolution. Genomics 4: 87.

110. Horowitz M, Zimran A (1994) Mutations causing Gaucher disease. Hum Mut 3: 111.

111. Iyer SS, Berent SL & Radin NS (1983) The cohydrolases in human spleen that stimulate glucosil ceramide P-glucosidase. Biochem Biophys Acta 748: 1-7.

112. Jeyakumar M, Norflus F, Tifft CJ et al (2001). Enchanced survival in Sandhoff disease mice receving a combination of substrate deprivation therapy therapy and bone marrow transplantation. Blood; 97: 327-329.

113. Jacson LG, Barr MA, Wapner RA, Grebner EE, Davis GO (1986) Chorion villus sampling (CVS): an assessmrnt of safety and accuracy in a consecutive series of nearly 2000 patients. Am О Hum Genet; 39: 256-261.

114. Jatzkewitz H, Stinshof К (1973) An activator of cerebroside sulphatase in human normal liver and in cases of congenital metachromatic leukodystrophy/ FEBS lett 32: 129.

115. Kennaway NG & WoolfLI (1968) Splenic lipids in Gaucher's disease. J Lip Res 9: 755-765.

116. Kolodny EN, Firon N, Eyal N, Horowitz M (1990) Mutation analysis of an Ashkenazi Jewish family with Gaucher disease in three successive generations. Am J Med Genet 36: 467.

117. De Kruiff B. (1987) Polymorphic Regulation of Membrane Lipid Composition. Nature, 329, 587-588.

118. Mc Kusik VA, Neufeld EF, Kelly ТЕ (1995) Gaucher desease. In: The metabolic bases of inherited diseases. N-Ye.a., McGrow Hill Book Сотр., pp. 2641 2670.

119. Latham T, Grabowski GA, Theophilus BDM, Smith FI (1990) Complex alleles of the acid P-glucosidase gene in Gaucher disease. Am J Hum Genet 47: 79.

120. Le NA, Gibson JC, Rubinstein A et al (1988) Abnormalities in lipoprotein metabolism in Gaucher type 1 disease. Metabolism 37: 240-245.

121. Leiberman J & Beutler E (1976) Elevation of serum angiontensin-converting anzyme in Gaucher's disease. N Engl J Med 294:1442-1444.

122. Leinekugel P, Michel S, Conzelmann E and Sandhoff К (1992) Quantitative correlation between the residual activity of p-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Hum Genet 88: 513-523.

123. Li S-C, Li Y-T (1976) An activator stimulating the enzymic hydrolysis of sphingoglycolipids. J Biol Chem 251:1159.

124. Lindblom B, Holmlund G (1988) Rapid DNA purification for restriction fragment length polymorphism analysis. Gen Anal Tech 5: 97 -101.

125. Long GL, Winfield S, Adolph KW et al (1996) Structure and organization of the human metaxin gene (MTX) and the pseudogene. Genomics 33: 177-182.

126. Lowden JA, O'Brein JS (1979) Sialidosis: A review of human neuraminidase deficiency. Am О Hum enet 31:1.

127. Mehl E, Jatzkewitz H (1965) Evidence for the genetic block in metachromatic leukodistrophy (ML). Biochem Biophys Res Commun 19: 407.

128. Michelakakis H, Spanou C, Kondyli A et al (1996) Plasma tumor necrosis factor (TNF-a) levels in Gaucher's disease. Biochem Biophys Acta 1317: 219-222.

129. Mistry PK (1995) Genotype/phenotype correlations in Gaucher's disease. Lancet 346: 982.

130. Neufeld EF (1991) Lysosomal storage diseases. Annu Rev Biochem 60: 257-280.

131. O'Neill RR, Tokoro T, Kozak CA & Brady RO (1989) Comparison of thechromosomal localization of murine and human glucocerebrosidase genes and of the deluced amino acid sequences. Proc Nat Ac Scienes USA 86: 5049 5053.

132. Nilsson О & Svennerholm L (1982a) Accumulation of glucosylsphingosine (psychosine) in cerebellum in infantile and juvenile Gaucher disease. J Neurochem 39: 709-718.

133. Nilsson О & Svennerholm L (1982b) Characterization and quantitative determination of gangliosides and neutral glycosphingolipids in human liver. J Lip Res 23: 327-334.

134. Van Oers MHJ, van Zaanen HC & Lokhorst HM (1993) Interleukin-6, a new target for therapy in multiple myeloma? An Hematol 66: 219-223.

135. MO.Orita M, Iwahana H, Kanazawa H et al (1989) Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as singl-strand conformation polymorphisms. Proc Natl Acad Sci USA 86: 2766-2770.

136. Paigen К (1979) Acid hydrolases as models of genetic control. A. Rev. Genet 13: 417-466.

137. Pentchev PG, Brady RO, Gal AE & Hibbert SR (1975) Isolation and characterization of glucocerebrosidase from human placental tissue. J Mol. Med. 1: 73-78.

138. Piatt FM, Butters TD (1998) New therapeutic prospects for the glycosphingolipid lysosomal storage diseases. Biochem Pharmacol 56: 421-430.

139. Platt FM, Neises GR, Reinkensmeier G e al (1997) Prevention of lysosomal storage in Tay-Schs mice treated with N-butyldeoxynojirimycin. Science 276: 428-431.

140. Platt FM, Jeyakumar M, Andersson U et al (2003). Substrate reduction therapy in mouse models of the glycosphingolipidoses. Philos Trans R Soc Lond В 358:947954.

141. Ponce E, Moskovitz J, Grabowski G (1997) Enzyme therapy in Gaucher disease type I: Effect of neutralizing antibodies to acid p-glucosidase. Blood 90: 43-48.

142. Preziosi P, Prual A, Galan P, Daouda H et al (1997) Effect of iron supplementation on the iron status of pregnant women: Consequeces for newborns. Am J Clin Nutr 66:1178-1184.

143. Qi X, Qin W, Sun Y, Kondoh К & Grabowski GA (1996) Functional organization of saposin C: difinition of the neurotrophic and acid p-glucosidase activation regions. J Biol Chem 271: 6974-6880.

144. Raghavan SS, Topol J & Kolodny EH (1980) Leucocyte beta-glucosidase in homozygotes and heterozygores for Gaucher disease. Am J Hum Gen 32: 158-173.

145. Reiner O, Horowitz M (1988) Differential expression of the human glucocerebrosidase-coding gene. Gene 73:469.

146. Reiner O, Wigderson M & Horowitz M (1988a) Structural analysis of the human glucocerebrosidase gene. DNA 7:107.

147. Reiner O, Wilder S, Givol D, Horowitz M (1987) Efficient in vitro and in vivo expression of human glucocerebrosidase cDNA. DNA 6:101.

148. Renkema GH, Boot RG, Strijland A et al (1997) Synthesis, sorting and processing into distinct isoforms of human macrophage chitotriosidase. Europ J Biochem 244: 279-285.

149. Ringden O, GrothCG, Erikson A et al (1995) Ten years experience of bone marrow transplantation for Gaucher disease. Transplantation 59: 864-870.

150. Rose JS, Grabowski GA, Barnett SH, Desnick RJ (1982) Accelerated skeletal deterioration after splenectomy in Gaucher type 1 disease. Am J Roentgenol 139:1202.

151. Sandhoff K., van Echten G., Schroder M., Schnabel D., Suzuki K. (1992) Metabolism of glycolipids: The role of glycolipidbinding proteins in the function and pathobiochemistry of lysosomes. Biochem. Soc. Trans 20: 695.

152. Sandhoff К and van Echten G (1993) Ganglioside metabolism Topology and regulation. Adv Lipid Res 26: 119-142.

153. Sandhoff К and Kolter T (1996) Topology of glycosphingolipid degradation. Trends Cell Biol 6:98-103.

154. Schiffmann R, Brady RO (2002). New prospects for the treatment of lysosomal storage diseases. Drugs; 62(5): 733-742.

155. Schindelmeiser J, Radzum HJ & Munstermann D et al (1991) Tartrate resistant purple acid phosphatase in Gaucher cells of the spleen. Immuno- and cytochemical analysis. Pathology, Research and Practice 187: 209-213.

156. Schneider EL, Ellis WG, Brady RO, Mc Culloch JR, Epstein CJ (1972) Infantile (type II) Gaucher's disease: In utero diagnosis and fetal pathology. J Pediatr 81: 1134-1137.

157. Sibille A, Eng CM, Kim S-J, Pastores G, Grabowski GA (1993) Phenotype/genotype correlations in Gaucher disease typel: Clinical and therapeutic implications. Am J Hum Genet 52: 1094.

158. Silverstein E & Friedland J (1977) Elevated serum and spleen angiotensin converting enzyme and serum lysozyme in Gaucher's disease. Clin Chim Acta 74: 21-25.

159. Sidransky E, Lau EK, Winfield S et al (1997) Identification two novel polymorphisms in the glucocerebrosidase gene region. Am J Hum Gen

160. Sidransky E, Tsuji S, Martin BM, Stublefield B, Ginns EI (1992) DNA mutation analysis of Gaucher patients. Am J Med Genet 42: 331.

161. Sorge J, Eest C, Westwood В et al (1985) Molecular cloning and nucleotide sequence of human glucocerebrosidase cDNA. Proc Nat Acad Sci USA 82: 72897293.

162. Sorge J, Gross E, West C, Beutler E (1990) High level transcription of the glucocerebrosidase pseudogene in normal subjects and patients with Gaucher disease. J Clin Invest 86:1137-1142.

163. Sorge J, Kuhl W, West C, Beutler E (1987) Complete correcetion of the enzymatic defect of type 1 Gaucher disease fibroblasts by retroviral- mediated gene transfer. Proc Natl Acad Sci USA 84: 906.

164. Sorge JA, West C, Kuhl W, Treger L, Beutler E (1987) The human glucocerebrosidase gene has two functional ATG initiator codons. Am J Hum Genet 41:1016.

165. Sorge J, West C, Westwood B, Beutlerr E (1985) Molecular cloning and nucleotide sequence of the human glucocerebrosidase gene. Proc Natl Acad Sci USA 82: 7289.

166. Srivastava S, Beutler E (1973) Hexosaminidase A and hexosaminidase B: Studies in Tay-Sachs disease and Sandhoff disease. Nature 24: 463.

167. Stone DL, Tayebi N, Orvisky E, Stubblefield B, Madike V, Sidransky E (2000) Glucocerebrosidase gene mutations in patients with type 2 Gaucher disease. Hum Mut 15:181 188.

168. Suzuki К (1982) Glucosylceramide and related compounds in normal tissues and in Gaucher disease. In DesnicK RJ, Gatt S & Grabowski GA (eds) Gaucher Disease: a Century of Delineation and Research, pp. 219-230. New York: Alan R Liss.

169. Suzuki K, Suzuki Y (1970) Globoid cell lcucodystrophy (Krabbe's disease): Deficiency of galactocerebroside P-galactosidase. Proc Natl ACAD Sci USA 66: 302-308.

170. Sweeley CC, Klionsky В (1963) Fabry's disease: Classification as a sphingolipidosis and partial characterization of a novel glicolipid. J Biol Chem 238: 3148.

171. Symington F.W., Murray W.A., Bearman S.I., Hakomori S. (1987). Intracellular Localization of Lactosilceramide, the Major Human Neutrophil Glycosphyngolipid. J. Biol. Chem., 262, 11356-11363.

172. Takasaki A, Murray GJ, Furbish FS et al, (1981) Structure of the N-asparagine-linked oligosaccharide units of human placental P-glucocerebrosidase. J Biol Chem 259:10112-10117.

173. Theophilus BD, Latham T, Grabowski GA, Smith FI (1989) Gaucher disease: Molecular heterogeneity and phenotype-genotype correlations. Am J Hum Genet 45: 212.

174. Tsuji S, Choudary PV, Martin BM, Winfield S, Barranger JA, Ginns EI (1986) Nucleotide sequence of cDNA containing the complete coding sequence for human lysosomal glucocerebrosidase. J Biol Chem 261: 50.

175. Tsuji S, Choudary PV, Martin BM et al (1987). A mutation in the human glucocerebrosidase gene in neuronopathic Gaucher's disease. N Engl J Med 316: 570-574.

176. Tsuji S, Martin BM, Barranger JA et al (1988) Genetic heterogeneity in type 1 Gaucher disease: Multiple genotypes in Ashkenazic individuals. Proc Natl Acad Sci USA 85: 2349-2353.

177. Turner BM & Hischhorn К (1978) Properties of beta-glucosidase in cultured fibroblasts from controls and patients with Gaucher disease. Am J Hum Gen 30: 346358.

178. Vistry PK, Smith SJ, АН M, Hatton CSR, Mclntyre N, Cox TM (1992) Genetic diagnosis of Gaucher disease. Lancet 339: 889.

179. Walley AJ, Barth ML, Ellis I et al (1993) Gaucher's disease in the United Kingdom: screening non-Jewish patients for the two common mutations. J Med Gen 30: 280283.

180. Weiler S, Kishimoto Y, O'Brien JS et al (1995) Identification of the binding and activating sites of the sphingolipid activator protein, saposin C, with glucocerebrosidase. Prot Sci 4: 756-764.

181. H.Wiegandt, In: H.Wiegandt (Ed.), Glycolipids, Elsevier, New York, 1985, pp. 199259.

182. Winfield SL, Tayebi N, Martin BM et al (1997) Identification of three additional genes contiguous to the glucocerebrosidase locus on chromosome lq21: Implications for Gaucher disease. Genome Res 7: 1020-1023.

183. Zimran A, Gelbart T, Westwood B, Grabowski GA, Beutler E (1991) High frequency of the 1226 mutation for type 1 Gaucher disease among the Ashkenazi Jewish population. Am J Hum Genet 49: 855.

184. Zimran A, Horowitz M (1994) Rec TL: A complex allel of the glucocerebrosidase gene associated with a mild clinical course of Gaucher disease. Am J Med Genet 50: 74.

185. Zimran A, Kay A, Gelbart T et al (1992) Clinical, laboratory radiologic and genetic features of 53 patients. Medicine 71: 337-353.

186. Zimran A, Sorge J, Gross E, Kubitz M, West C, Beutler E (1989) Prediction of severity of Gaucher's disease by identification of mutations at DNA level. Lancet 2: 349.

187. Zimran A, Sorge J, Gross E, Kubitz M, West C, Beutler E (1990) A glucocerebrosidase fusion gene in Gaucher disease. Implications for the molecular anatomy, pathogenesis and diagnosis of this disorder. J Clin Invest 85: 219.

Информация о работе

Букина, Татьяна Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.15

Диссертация

Биохимическая и молекулярно-генетическая характеристика болезни Гоше у российских пациентов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы