Биофизические основы создания новых ферментных препаратов пролонгированного действия

Зелепуга, Елена Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биофизические основы создания новых ферментных препаратов пролонгированного действия
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Биофизические основы создания новых ферментных препаратов пролонгированного действия"

На правах рукописи

ЗЕЛЕПУГА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

БИОФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СОЗДАНИЯ НОВЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ

03 00 02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Санкт-Петербург - 2007

003071215

Работа выполнена в лаборатории химии пептидов Тихоокеанского института биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской Академии наук

Научный руководитель

Доктор химических наук, Козловская Эмма Павловна

Официальные оппоненты

доктор физико-математических наук, ст н с Тимковский Андрей Леонидович

кандидат химических наук, доцент Глазова Наталья Владимировна

Ведущая организация Институт высокомолекулярных соединений РАН

диссертационного совета Д 212 229 25 при ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный политехнический университет по адресу: 194021 Санкт-Петербург, ул Хлопина, д 5, факультет медицинской физики и биоинженерии

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный политехнический университет»

Автореферат разослан « 10 » <?*,£<£- 2007г

Защита состоится 22 мая

2007 г в 10 часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат физико-математических наук, доцент ¿^С^г-у Власова О Л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Разработка новых лекарственных препаратов сопряжена с решением огромного числа трудных задач как теоретического, так и практического плана Современные подходы к разработке новых лекарственных средств основаны на понимании молекулярных механизмов, как нормального развития живого организма, так и возникающих в нем патологических процессов Поэтому в создании новых или модификации известных лекарственных средств все большую роль начинают играть подходы, основанные на молекулярной биофизике Особое место среди лекарственных средств занимают ферменты -белковые макромолекулы с разнообразными структурой и функциями, чья роль в фундаментальных процессах биологии делает их не только превосходными мишенями для лекарств, но и перспективными лекарственными препаратами В частности, рибонуклеазы (РНКазы) являются высокоактивными противовирусными средствами

Обладая высокой терапевтической активностью, нативные ферменты имеют и ряд существенных недостатков, среди которых быстрое разрушение их в организме, нежелательные побочные эффекты вследствие возможных иммунных реакций организма на чужеродный белок, а для микробных ферментов - еще и токсичность Изменение физико-химических свойств и биологической активности белков путем посттрансляционной модификации является широко распространенной стратегией регуляции метаболических процессов в живой клетке Особенно перспективными являются межмолекулярные комплексы (конъюгаты) активного фермента с инертным стабилизирующим носителем Разработанные ранее системы гетероолигопротеинов на основе олигомеров гемоглобина и донорского сывороточного альбумина (САЧ) и химически фиксированных на них молекул фермента позволяют стабилизировать и пролонгировать действие фермента (Горячева JIК и др, 1989) Однако такие гетероолигопротеины характеризуются высокой молекулярной массой и низким содержанием биологически активного вещества (не более 7%) и не могут быть эффективно использованы в качестве лекарственных препаратов В связи с этим весьма актуальной является задача разработки на основе молекулярно-биофизического подхода рациональных путей модификации ферментных препаратов, а также создания и отбора наиболее эффективных и безопасных носителей

Данная работа посвящена разработке биофизической стратегии и получению на ее основе водорастворимых конъюгатов безлигандного сывороточного альбумина человека (БЛСАЧ) с панкреатической РНКазой и РНКазой из Bacillus intermedius 7Р с высоким содержанием (до 30-40%) и высокой биологической активностью действующего фермента

Цель и задачи исследования Цель работы создание биофизической стратегии по созданию перспективных лекарственных препаратов пролонгированного действия на основе веществ белкового происхождения, обладающих новыми фармакологическими свойствами, с использованием методов молекулярной биофизики и современных компьютерных технологий

Для достижения указанной цели в работе ставились следующие задачи

1 Подобрать оптимальный носитель для модификации физиологически активных веществ, обладающий биосовместимостью, минимальной иммуногенностью, аллергенностью и позволяющий получать высокоактивные лекарственные препараты

2 Модифицировать САЧ, используемый в качестве носителя ферментов, с целью увеличения его способности к связыванию с полилептидными препаратами, изучить способы освобождения САЧ от связанных с ним лигандов и разработать методику получения безлигандного САЧ (БЛСАЧ)

3 Изучить физико-химические свойства (БЛСАЧ) исследовать динамику поведения БЛСАЧ в растворе и его гидрофобность, влияние денатурирующих условий (значений рН среды и концентрации мочевины) на структуру белка

4 Разработать методику получения конъюгатов ферментов (РНКаз) с БЛСАЧ исследовать влияние условий и времени комплексообразования БЛСАЧ с ферментами, а также соотношения компонентов в реакционной смеси на степень связывания панкреатической РНКазы и биназы Разработать метод выделения каталитически активных конъюгатов

5 Провести теоретическое исследование молекулярных механизмов изменения биологических свойств ферментов в конъюгате с БЛСАЧ

6. Изучить противовирусную активность полученных конъюгатов и динамику проявления ферментативной активности в кровотоке животных после введения конъюгатов различной молекулярной массы Положения, выносимые на защиту

1 Связывающая способность белка-носителя (САЧ) может быть существенно повышена путем его освобождения от связанных с ним балластных лигандов

2 Предложенный в работе метод такого освобождения с использованием сильного анионита АВ-17-8 обеспечивает эффективную очистку коммерческого САЧ от связанных с ним лигандов как физиологического, так и экзогенного происхождения и позволяет получить безлигандный САЧ (БЛСАЧ)

3 Применение БЛСАЧ в качестве носителя биологически активного белкового компонента и использование предложенного в работе метода проведения соконденсации существенно увеличивает содержание активного компонента в составе конъюгатов и значительно улучшает терапевтическое действие и фармакологические свойства модифицированных ферментов

4 Построенные компьютерные молекулярные модели открывают новые возможности в прогнозировании оптимизации биологических свойств модифицированных ферментов Методы компьютерного анализа и выявляемые с его помощью закономерности взаимодействия БЛСАЧ с активным компонентом могут использоваться для разработки способов направленного создания широкого набора лекарственных препаратов

Научная новизна и практическая значимость. Впервые разработана стратегия создания перспективных лекарственных препаратов пролонгированного действия, основанная на фундаментальных закономерностях взаимодействия лекарственных препаратов с транспортным белком плазмы крови человека (САЧ) Применение этой

стратегии позволит целенаправленно конструировать лекарственные препараты с новыми полезными фармакологическими свойствами Впервые предложен и экспериментально апробирован оптимальный метод получения конъюгатов САЧ с ферментными препаратами, обеспечивающий высокое содержание и высокую активность фермента Разработанный метод позволяет использовать вместо донорского гомологичный САЧ из плазмы крови пациента Впервые построена компьютерная молекулярная модель комплекса панкреатической РНКазы с сывороточным альбумином, содержащего более одной молекулы фермента

Апробация работы. Основные результаты настоящей работы были представлены на Международной, Всесоюзных и Всероссийских конференциях "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование" (Рига, 1989), "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, 1990), 9-й Конференции межвузовского проекта "Ферменты микроорганизмов" (Казань, 1991), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004) и Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» (Владивосток, 2004), 30th FEBS Congress - 9th IUBMB Conference (Budapest, Hungary, 2005)

Публикации. По материалам работы опубликовано 6 статей и 7 тезисов докладов Благодарности. Автор выражает глубокую признательность дтн, профессору В М Коликову за неоценимый вклад в формирование научного мировоззрения, благодарит д м н М JI Медведева (Военно-медицинская академия им С М Кирова) за сотрудничество в проведении биологического тестирования полученных ферментных препаратов, д б н Т М Третьяк (Институт белка, г Пущино-на-Оке) за проведение совместного исследования распределения полученного ферментного препарата по органам экспериментальных животных, Г Н Лихацкой за помощь в построении гипотетических структур поликомплексов БЛСАЧ и ферментов с помощью программы GRAMM (лаборатория биоиспытаний Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН)

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 162 машинописных страницах, содержит 34 рисунка и 18 таблиц, в том числе 5 табл в Приложении Она включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и обсуждение, заключение и выводы Библиографический раздел включает 430 наименований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель и задачи работы, показано ее научно-практическое значение

Первая глава - обзор литературы, в котором рассмотрены основные способы модификации белков, в том числе ферментов, приводящие к улучшению фармакологических свойств последних Описаны функции, свойства и структура САЧ, а также локализация и закономерности организации центров связывания данного белка с различными лигандами

Во второй главе описаны объекты и методы исследования, использованные в работе

В третьей главе изложены метод и результаты получения и исследования физико-химических свойств альбумина, очищенного от связанных с ним лигандов (БЛСАЧ) Изложены результаты исследования процесса комплексообразования БЛСАЧ с РНКазами и последующей поликонденсации полученных комплексов с помощью глутарового альдегида Приведены данные о ферментативной активности, кажущейся молекулярной массе и биологических свойствах полученных конъюгатов Во второй части главы проблема стабилизации биологической активности лекарственных веществ белкового происхождения (на примере РНКазы А) рассматривается с общих позиций физической и структурной химии проводится теоретический анализ связи структуры комплексов обезжиренного альбумина с ферментом и биологической активностью последнего На основании знаний трехмерной структуры биологических макромолекул, а также механизмов белок-белковых взаимодействий, конкретные научные задачи решались с использованием имеющегося в наличии пакета специализированного программного обеспечения, включая докинг лигандов, конформационный анализ, минимизацию энергии, молекулярную динамику и некоторые ресурсы глобальной сети Интернет

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение и исследование физико-химических свойств безлигандного сывороточного

альбумина человека

В борьбе с вирусными возбудителями заболеваний человека и животных, наряду с вакцинацией и противовирусной химиотерапией, имеющими определенные ограничения в применении, весьма полезным является применение нуклеаз - ферментов, деполимеризующих генетический материал вируса Однако введенные чужеродные ферменты быстро утрачивают активность вследствие разрушения протеазами или блокирования ингибиторами В связи с этим очевидна необходимость защиты и пролонгации функционирования в организме введенного фермента Такой эффект может быть достигнут путем иммобилизации ферментов на синтетических или природных полимерных носителях При этом носитель не должен вызывать накопления препарата в отдельных органах и трудностей с его выведением из организма Поэтому в качестве носителей удобнее всего использовать гомологичные сывороточные альбумины (САЧ) с их ярко выраженной транспортной функцией и умеренной иммуногенностью Ранее проводилась иммобилизация панкреатической РНКазы на олигомерах САЧ или гемоглобина с использованием глутарового альдегида (ГА) (Горячева Л К и др, 1989, в дальнейшем метод I) Метод I позволил получить конъюгаты, содержащие в среднем 0,3 моля фермента на 1 моль САЧ, и полностью сохранить активность фермента в процессе соконденсации Тем не менее, низкое содержание фермента в полученных конъюгатах не дает возможности использовать данный подход для получения высокоактивных лекарственных средств

Благодаря транспортной функции, САЧ обладает множеством центров связывания различной специфичности и способностью адаптироваться к лигандам различной химической природы Рядом авторов выдвигалось предположение, что физико-хилшческие характеристики и связывающая способность САЧ в значительной мере определяются

степенью его «загруженности» различными лигандами, которая в свою очередь зависит от метода получения белкового препарата В целях увеличения доли иммобилизованного фермента нами предложено использовать в качестве носителя безлигандный сывороточный альбумин человека (БЛСАЧ), то есть освободить САЧ от связанных с ним лигандов и тем самым увеличить его потенциал для взаимодействия с заданным биологически активным компонентом Обычно применявшаяся процедура обезжиривания САЧ состоит в доведении значения рН раствора альбумина до 3,0 и адсорбции на древесном угле (Scheider W et al, 1970), поверхности резины или гидрокси(алкокси)пропилдекстрана (Kragh-Hansen U, 1993) Сообщалось о снижении при этом содержания жирных кислот до 0,22 и 0,06 М/М, соответственно

Предложенный нами метод очистки САЧ предполагает выдерживание САЧ в кислом растворе в присутствии сильного анионита АВ-17-8 В области значений рН 3,5-2,5 макромолекула САЧ претерпевает конформационную перестройку, в результате которой молекула белка разворачивается и легко освобождается от связанных лигандов при диссоциации Используемый адсорбент имеет гидрофобную полистирольную матрицу и связывает лиганды, высвободившиеся в процессе разворачивания макромолекулы альбумина Методом поляризованной люминесценции нами проведено сравнение эффективности связывания сывороточным альбумином молекул панкреатической РНКазы с включенной 9-антрилметилуретановой группировкой в качестве люминесцентной метки (РНКаза-JIM) при разных способах освобождения его от лигандов (рис 1) Очевидно, что способ снятия лигандов существенно влияет на способность альбумина связывать РНКазу

■ САЧ

О обработай активированным углем

Д 5 ч при рН 3,0

о обработан

анионном АВ-17-8

Б 10 15 Альбумин/РНКаза, (М/М) в растворе

Рис 1 Зависимость доли связанных САЧ молекул панкреатической РНКазы-ЛМ от мольного соотношения САЧ/РНКаза в растворе (при различных режимах обработки САЧ)

Рис 2 Потенциометрическое титрование САЧ (1) и БЛСАЧ сразу (2) и через 2 часа после растворения (3) Концентрация №ОН 0,137 М Концентрация САЧ 2,85 мг/мл

Изменение концентрации взаимодействующих компонентов при сохранении их мольного соотношения не привело к изменениям доли связанных молекул РНКазы (С?с,я,) Обнаружено, что различие значений <3СВЯ, дгм системы РНКаза-САЧ зависит прежде всего от числа участков связывания РНКазы в макромолекулах альбумина разных образцов Наибольшей связывающей способностью обладает образец БЛСАЧ, полученный с помощью анионита АВ-17-8 Проведена экстракция связанных с САЧ и БЛСАЧ лигандов Методом тонкослойной хроматографии на закрепленном слое силикагеля показано, что липиды и фосфолипиды практически отсутствуют в образцах БЛСАЧ, тогда как в образцах САЧ их содержание составляет соответственно 80% и 15% от общего количества экстрагированных лигандов Мольное содержание свободных жирных кислот, среди которых преобладали линолевая, олеиновая, стеариновая и пальмитиновая, менялось от 2,2 моль на 1 моль САЧ до 0,03 моль на 1 моль БЛСАЧ

С помощью потенциометрического титрования обнаружено существенное различие кривых титрования БЛСАЧ (рис 2, кривая 2) и САЧ (рис 2, кривая 1) Кроме того, отмечено изменение количества титруемых групп БЛСАЧ во времени Если в области нейтральных и щелочных значений рН среды (рН 6,0-10,0) в исходном САЧ титровалось 46 групп, то в БЛСАЧ непосредственно после растворения титровалось 78 групп, а через 2 ч - 56 групп (рис 2) Титрование в кислой области значений рН показало эквивалентное уменьшение во времени количества титруемых карбоксильных групп По-видимому, в растворе происходит образование солевых мостиков между кислотными и основными группами БЛСАЧ после освобождения САЧ от лигандов

Исследование влияния денатурирующих агентов, таких как кислота и мочевина, на структуру макромолекул САЧ и БЛСАЧ, проведенное методом спектроскопии кругового дихроизма (КД), обнаружило, что при освобождении САЧ от лигандов пространственная организация молекулы белка претерпевает незначительные изменения на уровне третичной

Концентрация мочевины, М

Рис 3 Изменение молекулярной эллиптичности при X 263 нм растворов САЧ и БЛСАЧ в интервале значений рН 5,0-2,0 (а) и растворах мочевины в 0,05М Иа-фосфатном буферном растворе, рН 7,4 (б) Концентрация альбумина 0,5 мг/мл

структуры Это выражается в повышении величины молекулярной эллиптичности при длине волны 263 нм ([0]2бз) (рис 3) Эти результаты позднее были подтверждены 8 8гщю и А ВЬаМасЬагуа методом рентгеновской кристаллографии (Б^ю 8 , 1999, ВЬайасЬагуа А, 2000), которые предположили незначительные изменения конформации, касающиеся в основном положения субдомена III

При уменьшении значений рН среды наблюдался конформационный переход макромолекулы БЛСАЧ в интервале 4,0-3,5 (рис 3,а), в то время как для исходного САЧ в тех же условиях имело место более плавное изменение конформации Конформационные изменения при увеличении концентрации мочевины (рис 3,6) также носили более кооперативный характер в случае БЛСАЧ Такие различия вполне объяснимы, поскольку в процессе освобождения САЧ от лигандов снимаются и гидрофобные «скрепки» в виде жирных кислот, скрепляющих три домена макромолекулы САЧ, что делает молекулу альбумина более гибкой и подвижной Вероятно, это позволяет макромолекуле легче адаптироваться к структуре нового лиганда и, следовательно, улучшает связывание с последним Следует отметить, что для обеих форм белка денатурация под действием, как ионогенных, так и неионогенных агентов является обратимым процессом, вплоть до значения рН 2,6 и концентрации денатуранта 8 М

Гидрофобность БЛСАЧ оценивали методом поляризованной люминесценции (ПЛ) с помощью гидрофобного люминесцентного индикатора акридинового оранжевого (АО) и сопоставляли с гидрофобностью исходного САЧ На рис 4 представлена зависимость доли связанного АО ((2СВяэ ) от его концентрации для САЧ и БЛСАЧ Очевидно, что доля связанного с БЛСАЧ акридинового оранжевого, а следовательно, и гидрофобность БЛСАЧ меньше, чем у исходного белка, и не изменяется при хранении в течение года Падение 0СВЯ1 с увеличением концентрации АО обусловлено, вероятно, уменьшением числа вакантных мест связывания по мере их занятости индикатором Построение графика Скэтчарда дало возможность оценить константы связывания и число мест связывания АО Для САЧ константа связывания КСач ао = (0,9 ± 0,03) 105 Моль"1 и число мест связывания Исач = (1 ± 0,05) 10"5 моль/л, а для БЛСАЧ соответствующие значения Кблсачао = (1 ± 0,03) 105 Моль'1 и ^блсач = (0,6 ± 0,05) -105 моль/л Как видно, константы связывания гидрофобного АО отличаются незначительно, однако число мест связывания гидрофобного АО в молекуле САЧ

Ос ваз

сАО Ю6, (моль/л)

Рис 4 Зависимость доли связанного альбумином АО от его концентрации для исходного САЧ, БЛСАЧ и БЛСАЧ через год хранения Концентрация альбумина = 1 мг/мл

после снятия лигандов несколько уменьшается

Поскольку методом потенциометрического титрования показано существенное увеличение количества титруемых групп макромолекулы альбумина в результате снятия лигандов и, в то же время, методом поляризованной люминесценции установлено, что число мест связывания с гидрофобным лигандом несколько снижается, то можно сделать вывод о том, что увеличение эффективности связывания РНКазы безлигандным САЧ обуславливается в основном электростатическими взаимодействиями

Получение конъюгатов ферментов с БЛСАЧ

Для того, чтобы наиболее полно использовать возможности мест связывания САЧ, освобожденных от лигандов, в качестве первой стадии модификации фермента проведено образование комплекса БЛСАЧ с РНКазой Влияние таких факторов, как порядок добавления компонентов и продолжительность процесса на способность САЧ и БЛСАЧ образовывать полимерные комплексы (ПК) с ферментами рассмотрено на примере взаимодействия с бактериальной РНКазой Экспериментальные данные свидетельствуют, что активность комплексов, образованных со свежерастворенным БЛСАЧ, не превышает 4060% Взаимодействие фермента с немодифицированным САЧ, а также с БЛСАЧ через 2 ч после его растворения не приводило к уменьшению активности фермента При этом на количество включенного в комплекс альбумина влияет последовательность смешивания компонентов Поскольку комплексообразование проводилось в мягких условиях (0,05 М Иа-фосфатный буферный раствор, рН 7,4) разумно предположить, что в результате взаимодействия с БЛСАЧ активный центр фермента экранируется В случае образования ПК БЛСАЧ с панкреатической РНКазой падения активности не наблюдалось Следует отметить, что увеличение ионной силы раствора вызывало разрушение комплекса, что также указывает на ведущую роль электростатических взаимодействий в их образовании Комплекс БЛСАЧ-РНКазав. показал незначительную пролонгацию действия активного фермента в сыворотке крови при внутривенном введении кролику по сравнению со свободным ферментом В целях увеличения стабильности препарата использовали «сшивку» полученного комплекса с помощью бифункционального реагента (ГА) (метод II) Продукты реакции соконденсации разделяли методом гельпроникающей хроматографии на колонке с Ультрогелем АСА-44

(рис 5)

1 0,8 о °0,7 : '

0,6

0,5

0,4 /

0,3 1

0,2 1

0,1 I] 1

V а

0 50

-Конъюгат БЛСАЧ-РНКаза

- РНКаза панкреатическая

100 обьем, мл

Рис 5 Разделение продуктов соконденсации БЛСАЧ-РНКаза

панкреатическая (1), САЧ (2) и панкреатической РНКазы (3) методом гельпроникающей хроматографии на колонке с Ультрогелем АСА-44 (1,6х 50 см), уравновешенной 0,05М Иа-фосфатного буферного раствора, рН 7,4 Элюцию проводили рабочим буферным раствором, скорость элюции 12 мл/ч На колонку нанесено 13 мг белка

1,5

2 ,0

1 ^

< О

г 0,5

2,5

Е у

о с ш

1,5

!С X О-

0,5

рН7,4

рН6,0

0 1 2 3 4 5 6

РНКаэа (М) / САЧ (М) в реакции

♦ методиса! САЧ Пметодика II, САЧ Д методика! БЛСАЧ X методика II БЛСАЧ

Рис 6 Активность конъюгатов панкреатической РНКазы, полученных двумя методами (I и И)

0 4 8

РНКаза, (М) / БЛСАЧ, (М) в реакции

Рис 7 Содержание бактериальной РНКазы в конъюгате в зависимости от соотношения компонентов в реакционной смеси

Для сравнения конъюгаты были получены двумя методами (I и II) с использованием в качестве носителя БЛСАЧ и исходного САЧ (рис 6) Показано, что наибольшей активностью обладали конъюгаты, полученные с БЛСАЧ по методу II Активность же конъюгатов, полученных по методу I как с САЧ, так и с БЛСАЧ, а также по методу И с САЧ, практически совпадала и была значительно ниже Очевидно, что для получения максимального связывания фермента носителем необходимо использовать только БЛСАЧ и проводить процесс по предложенной схеме Условия соконденсации БЛСАЧ и обеих РНКаз оптимизированы по таким параметрам, как соотношение компонентов, концентрация ГА (табл 1) и рН раствора (рис 7) Как следует из экспериментальных данных, в 0,05 М Ыа-фосфатном буферном растворе, рН 7,4, при концентрации БЛСАЧ 2%, мольном соотношении РНКаза БЛСАЧ = 5 и соотношении ГА белок = 3 с одним молем БЛСАЧ связывается по меньшей мере до 2 молей биназы Указанные условия соблюдали при проведении поликон-

денсации РНКаз и альбумина

Предложенный метод экспериментально апробирован на примере иммобилизации протеаз, которые, как известно, также обладают противовоспалительным и противоотечным действиями

Таблица 1 Влияние соотношения ГА белок на связывание биназы в конъюгате

Мольное соотношение ГА/белок в реакционной смеси (моль/моль) Суммарная активность {%) Количество биназы в конъюгате на 1 моль БЛСАЧ (моль)

0,5 68 0,1

1,5 100 0,38

3,5 94 1,8

6,0 95 1,17

Таблица 2 Характеристика конъюгатов САЧ и БЛСАЧ с химотрипсином

Форма САЧ Метод получения конъюгата Количество связанного химотрипсина, МОЛЬ хтр/моль САЧ Сохранение ферментативной активности при соконденсации, (%)

САЧ исх метод I 0,02 30

САЧ исх метод II 0,75 95

БЛСАЧ метод II 2,24 100

В таблице 2 приведены характеристики конъюгатов САЧ-химотрипсин и БЛСАЧ-химотрипсин, полученных методами I и II Применение предложенного нами способа получения конъюгатов позволяет полностью сохранить активность фермента в процессе иммобилизации и получить препараты с высоким содержанием активного компонента -более двух молей химотрипсина на 1 моль БЛСАЧ

Таким образом, для получения конъюгатов с высоким содержанием ферментного компонента в качестве носителя можно рекомендовать безлигандный САЧ, а сам процесс следует осуществлять в две стадии на первой стадии получать ПК БЛСАЧ с ферментом, а далее проводить соконденсацию продуктов комплексообразования белков с помощью ГА

Исследование физико-химических свойств синтезированных продуктов

Задача сохранения активности иммобилизованных ферментов является одной из центральных в биоконъюгации Панкреатическая РНКаза и химотрипсин полностью сохраняли свою специфическую активность в составе полимерных комплексов и конъюгатов, полученных на основе БЛСАЧ по разработанному нами методу Однако комплексы, образованные РНКазой Bacillus mtermedius 7Р и свежерастворенным БЛСАЧ, сохраняли только 40-60% активности Активность Связано ли уменьшение активности в данном поликомплексе с инактивацией фермента или оно вызвано недоступностью его активного центра9 В последнем случае латентная

ферментативная активность будет проявляться, например, при

протеолитическом расщеплении олиго-альбумина Для выяснения причин частичной утраты ферментативной активности РНКазыв, в составе комплекса с БЛСАЧ проведен модельный эксперимент Полимерный комплекс был "зафиксирован" с помощью ГА и были получены конъюгаты РНКазавгБЛСАЧ, а также олигоальбумин аналогичной

условн ед 400

— Конъюгат БЛСАЧ-биназа +трипсин ^ Конъюгат БЛСАЧ-биназа

РНКаза

бактериальная РНКаза

бактериальная + трипсин

Время, ч

Рис 8 Динамика проявления ферментативной активности бактериальной РНКазы и конъюгата БЛСАЧ-биназа в присутствии трипсина и без него Концентрация трипсина 0,03 мг/мл в 0,05 М Ка-фосфатном буферном растворе, рН 6,5, концентрация белка 4,3 мг/мл

молекулярной массы. Ферментативная активность ПК при пол и конденсации сохранялась полностью. В условиях, когда трипсин гидролизовал олигоальбумин, ¡¡о не РНКазуц, наблюдали за изменением активности РНКазыв! и ее конъюгата с БЛСАЧ а течение ШО ч при комнатной температуре (рис. 8). На фоне небольшого падения активности свободного фермента, независимо от присутствия трипсина, конъюгат БЛСАЧ-РНКазак сохранял активность в распюрс п течение всего времени эксперимента, что свидетельствует о стабилизации фермента в составе конъюгата. При добавлении трипсина к* раствору конъюгата БЛСАЧ-РНКазал наблюдался рост трансфертной активности, приводившей к практически полному восстановлению утраченной активности фермента. Вес вышесказанное позволяет сделать вывод, что получение конъюгатов ферментов с БЛСАЧ по предложенному нами методу позволяет создать макромолекулярные «микрореакторы», способные под действием эндогенных протеиназ постепенно высвобождать действующий биологически активный компонент во время пребывания в организме.

В результате разделения высокомолекулярных продуктов реакции со конденсации методом ЗОв-электрофореза в 7,0 % 11ААГ показано, что фракции I (см. рис. 5) представляет собой смесь макромолекул с К ММ 210-350 кДа для обоих ферментов, что соответствует конъюгатам следующего состава: 2 моля САЧ и 6 молей РНКазы, а также 3 моля САЧ и ! моль РНКазы. Фракция И (рис. 5) включает в себя компоненты с КММ 68, 82 и 95 кДа для панкреатической РНКазы и 68, 80, и 92 кДа для бактериального фермента. Это указывает на содержание во фракции как свободного САЧ, так и конъюгатов, состоящих из 1 мо;1я САЧ и 1-2 молей РНКазы. Следует отметить, что статистически вероятным является также и присутствие олигомеров альбумина.

Известно, что димеры РНКазы обладают повышенной противовирусной и противоопухолевой активностью, что зачастую связывают со способностью данной молекулярной формы РНКаз разрушать двунитевую РНК, содержание которой в опухолевых клетках повышено по сравнению с нормаль-

ными клетками. В связи с вышесказанным представляло интерес исследование способности конъюгатов, например, панкреатической РНКазы с БЛСАЧ, деградировать двунитевую РНК, Экспериментально показано, что специфическая активность в отношении данного субстрата во фракции II (ем. рис. 5) почти в 20 раз превышает активность свободного фермента (рис. 9). Активность более высокомолекулярной фракции 1, содержащей конъюгаты с КММ 220 кДа и выше, превышает активность в отношении двунитевой РНК в 170 раз но

□ РНКаза исходная

■ Конъюгат БЛСАЧ-РНКаза Фракция I

□ Конъюгат БЛСАЧ-РНКаза Фракция II

Активность а □ Фракция III

условных оптических единицах

Рис. 9: Ферментативная активность конъюгатов панкреатической РНКазы с БЛСАЧ в отношении двунитевой РНК. Фракции I, 11 и 111 получены в результате гел ьхром ато гр афи и на колонке с Ультрогелем АСА-44 (1,6*50 см) (рис. 5.)

сравнению с нативной РНКАзой.

Характер распределения активности в отношении двуиитевой РНК во фракциях также является косвенным доказательством преимущественно внутримолекулярного связывания, а именно «скрепления» ПК БЛСАЧ-фермент в выбранных условиях проведения реакции пояикондвйсиции с помощью Г А, так как к противном случае наблюдалось бы интенсивное образование искусственных днмеров РНКазы, для которых характерна на два порядка более высокая активность в отношении двуиитевой РНК по сравнению с наблюдаемой экспериментально.

Вышеописанные результаты позволяют сделать вывод, что взаимодействие панкреатической РНКазы с БСАЧ приводит к образованию сложных м акр о м о лекул я р н ы х комплексов, включающих в свой состав более одной молекулы фермента. Важно, что освобождение молекулы САЧ от связанных с ней лигандов способствует образованию комплексов, в которых активные центры взаимодействующих с носителем молекул фермента сближены в пространстве настолько, что препарат получает новое свойство - способность к деградации двунитевого высокомолекулярного субстрата.

Способ выделения конъюшов альбумина и рдбонуклеаз

Одним из ключевых и часто трудных вопросов в области инженерной эизимологии является необходимость характеризовать продукты, полученные биоконъюгацией. В результате реакции со конденсации нуклеаз с БЛСАЧ, наряду с образованием активных конъюгатов, статистически

вероятным является синтез олигомеров альбумина и РНКаз. Гельпроникающая хроматография (ГПХ) продуктов реакции соконденсации позволяет отделить высокомолекулярные компоненты, включая коньюга™, сп свободного фермента. Следующий этап данного исследования - определение содержания олигоальбуминов в полученном препарате и разработка метода выделения активных конъюгатов. Сложность данной задачи заключается в необходимости разделения веществ близкой молекулярной массы и химической природы. Для её решения был предложен простой и оригинальный способ, учитывающий высокое сродство РНКазы к кремнеземам, -

0.7М NaCI

1 4 7 10 13 16 19

Na фракции

Рис. 10. Профили элюции кокьюгата РНКаз с БЛСАЧ па колонке с макропористым стеклом МПС-100 (объем фракции 3 мл.): а - конъюгат Бнназа-БЛСАЧ (КММ 210 и более кДа). На колонку нанесено )5 мг препарата, обладающего активностью 4400 Ед., б - конъюгат РНКаза„шкр-БЛСАЧ КММ 82 - 95 кДа, на колонку нанесено 15 мг препарата, обладающего активностью 570 Ед.; «А» - фракция, содержащая олигомер альбумина; нВ» - фракция, содержащая конъюгат, включающий в свой состав фермент. Цветом отмечена величина ферментативной активности фракций «А» и «В».

хроматография на макропористом стекле МПС-200 Адсорбент проявляет свойства слабого катионита, размеры пор достаточно велики и их внутренняя поверхность доступна для сорбционного взаимодействия с макромолекулами даже очень большой молекулярной массы (до 1000 кДа) Максимум сорбции белков (сывороточного альбумина, РНКазы и химотрипсиногена) из водных растворов на макропористом стекле наблюдается вблизи значения изоэлектрической точки (ИЭТ)

Поэтому, опираясь на адсорбционные свойства макропористых кремнеземов, были подобраны условия сорбции и десорбции РНКаз на макропористом стекле МПС-200 в зависимости от значений рН (6,0-9,0) и ионной силы раствора (0,05-1 М ИаС1), так как именно в этом диапазоне значений рН наблюдается падение сорбции альбумина в динамическом режиме со 100% до 0% Согласно экспериментальным данным, оптимальные условия, при которых РНКазы и, следовательно, содержащие их конъюгаты сорбируются на МПС-200, а альбумин и его олигомеры с адсорбентом не взаимодействуют, таковы 0,05 М трис-НС1 буферный раствор, рН 8,5 Практически полной десорбции нуклеаз удавалось достичь при использовании растворов высокой ионной силы - 0,7 М №С1 (рис 10, табл 3) В результате проведенных исследований показано, что в комплексообразование с ферментами вступает, по крайней мере, 76% макромолекул БЛСАЧ и количество макромолекул, не содержащих фермент в препаратах I и II, полученных после разделения продуктов реакции соконденсации с помощью ГПХ на Ультрогеле АСА 44, не превышает 24%, что удовлетворяет требованиям фармакопеи России

Из данных о содержании белка и ферментативной активности во фракции «В» после разделения на колонке с МПС-200 (рис 10, табл 3), а также данных электрофореза следует, что препараты конъюгата с КММ 80-95 кДа состоят из 1 моля БЛСАЧ и 1 моля РНКазы и (или) 1 моля БЛСАЧ и 2 молей РНКазы, а препараты конъюгата с КММ 210-350 кДа - из 3 молей БЛСАЧ и 1 моля РНКазы и (или) 2 молей БЛСАЧ + 6 молей РНКазы Для панкреатической РНКазы компоненты смеси, по-видимому, представлены в примерно

Таблица 3 Характеристика конъюгатов БЛСАЧ с панкреатической и бактериальной РНКазами, полученных хроматографией на МПС-200

Объект Молекулярная масса кДа Активность Отн ед Фракции на МПС-200 Предполагаемый состав конъюгата

Белок, мг Активность, отн ед Мольное соотношение РНКаза/САЧ

А В А В А В

Конъюгат БЛСАЧ-РНКазафр I Панкреатическая Бактериальная >220 >210 776 4400 3,25 11,85 3,3 11,7 18 784 280 5325 0,05 1,9 0,13 3,3 2 М САЧ +6 М РНКазы, ЗМ САЧ + 1М РНКазы

Конъюгат БЛСАЧ-РНКаза фракция II Панкреатическая Бактериальная 67 -95 67-92 570 3750 3,5 11,5 2,9 12,1 12 597 193 4200 0,05 1,7 0,10 2,3 1 М САЧ +1 М РНКазы 1 М САЧ +2 М РНКазы

равных количествах, в то время как в случае конъюгатов бактериальной РНКазы из Bacillus intermedius 7Р можно предположить преобладание более высокоактивных конъюгатов Среднее соотношение компонентов в таком конъюгате составляет 2,3 моля РНКазы на 1 моль БЛСАЧ для низкомолекулярного продукта (препарат II) и 3,3 моль РНКазы на 1 моль белка-носителя для более высокомолекулярных конъюгатов Использование макропористых кремнеземов позволило охарактеризовать конъюгаты РНКаз различного происхождения с БЛСАЧ, а также дало метод получения конъюгатов без примеси олигомеров альбумина

Таким образом, предложен эффективный метод получения модифицированных конъюгацией с БЛСАЧ форм ферментов Он позволяет не только полностью сохранить каталитическую активность последних, но и в отличие от предложенных ранее, обеспечивает участие по меньшей мере, 75% макромолекул БЛСАЧ во взаимодействии с РНКазами, а также высокое содержание активного компонента в полученном препарате

Изучение биологических свойств конъюгатов РНКаз с БЛСАЧ

Была оценена фармакологическая эффективность конъюгатов БЛСАЧ с панкреатической и бактериальной РНКазами Определение времени циркуляции конъюгатов в кровеносной системе кроликов после их однократного внутривенного введения выявило существенное пролонгирование действия ферментов ш vivo Так, трансферазная активность в плазме крови после введения конъюгатов БЛСАЧ-РНКазая, (80-92 кДа) сохранялась на уровне более 50% в течение 2-х суток, а при введении конъюгатов с КММ 220-350 кДа - и по истечение 3-х суток, тогда как время полувыведения свободного фермента составляло 2 часа Возрастание трансферазной активности в плазме крови через 3 часа после введения конъюгата может быть связано с высвобождением фермента из "депо" при гидролизе альбуминовой составляющей конъюгата

При внутривенном введении кроликам конъюгата панкреатической РНКазы с БЛСАЧ в аналогичных экспериментах также наблюдалась пролонгация трансферазной активности в плазме крови (рис 11) Активность свободной РНКазы обнаруживается только в течение первых 20-30 мин после инъекции (кривая 3), в то время как при введении конъюгатов

Рис И Динамика трансферазной активности в плазме крови кроликов после однократного внутривенного введения конъюгатов БЛСАЧ-РНКаза панкреатическая в дозе, соответствующей 0,5 мг фермента на 1 кг веса животного

1 - конъюгат ММ 68-95 кДа,

2 - конъюгат с ММ 220-350 кДа,

3 - панкреатическая РНКаза,

4 - конъюгат с ММ 68-95 кДа в дозе, соответствующей по активности 5 мг фермента на 1 кг веса животного, после внутримышечного введения

Активность, %

активность сохраняется на уровне 30-40% от исходной в течение 4 суток Хотя при введении более высокомолекулярного конъюгата (кривая 2) уровень трансферазной активности несколько ниже, чем для низкомолекулярного, он остается достаточно высоким для терапевтического действия фермента Преимуществом использования препаратов небольшой кажущейся молекулярной массы (68-95 кДа) является возможность вводить их не внутривенно, а внутримышечно, сохраняя при этом ферментативную активность в кровеносной системе в течение более двух суток на уровне 25% от введенной Это существенно упрощает процедуру их применения

Полученные конъюгаты РНКаз проявили высокую антивирусную активность в экспериментах на белых мышах, зараженных вирусом гриппа B/Lee/40, A/Lee/40 и A/PR/8/34 (Hon 1) При введении мышам конъюгата РНКаз в дозе 4-23 мкг фермента на мышь показатель Alg LDso (Alg LDso - изменение логарифма 50%-тй летальной дозы вируса в опыте с препаратом РНКазы по сравнению с контрольным опытом без препарата) увеличивается на 1,8 lg (табл 4) и, что особенно актуально, препарат проявляет активность не только против вирусов гриппа типа А, но и типа В, от которого не защищает ремантадин Аналогичный эффект установлен и в опытах на куриных эмбрионах (табл 4) (Alg ЭИД50 -изменение логарифма 50%-ной эмбриональной инфицирующей дозы вируса в опыте с

Таблица 4 Защитное действие панкреатической и бактериальной РНКаз, модифицированных двумя методами, при экспериментальной гриппозной инфекции

Препарат Куриные эмбрионы Мыши

Дозы препарата (в мкг по содержанию РНКазы) Alg ЭИД50 Дозы препарата (в мкг по содержанию РНказы) Alg ¿£>50

РНКаза

панкреатическая Нативная 1000 0,63 500 1,00

Модифицированная Метод I (Горячева Л, 1989) 700 500 1,30 1,04 500 400 1,50 1,54

Метод II Конъюгат БЛСАЧ- 118 1,04 4,2 1,55

РНКаза 220 -350 кДа

Конъюгат БЛСАЧ- 75,5 1,00 4,8 1,60

РНКаза 67 -95 кДа 4 а 1,00

РНКаза

бактериальная Нативная 1,0 Токсичен _

Модифицированная Метод I (Горячева, 1989) 1,0 5,0 0,80 1,04 100,0 1,60

Метод II Конъюгат БЛСАЧ- 1,1 из 23,0 1,75

РНКазав, 220 -350 2,4 2,04

кДа Конъюгат БЛСАЧ- 0,83 0,98 17,5 1,82

РНКазав, 67 -92 кДа 1,75 1,75

препаратом по сравнению с контрольным экспериментом) Показано более выраженное защитное действие конъюгатов бактериального фермента

РНКазы уже используются в экспериментальной терапии опухолей и заболеваний вирусной этиологии Нами была поставлена задача выяснения возможности прохождения конъюгатов панкреатической РНКазы с БЛСАЧ через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) в связи с возможностью применения пролонгированных форм РНКаз для лечения ряда вирусных нейроинфекций В опытах использовали крыс линии Вистар массой 180-200 г В хвостовую вену однократно вводили 3Н-меченый исследуемый препарат в количестве 3,5 мг Через определенные промежутки времени измеряли радиоактивность и определяли ферментативную активность в гомогенате мозга, очищенного от оболочек и сосудов (рис 13) Результаты экспериментов свидетельствуют, что экзогенная панкреатическая РНКаза как в нативной, так и конъюгированной форме проникает из сыворотки крови в головной мозг крыс, без потери ферментативной активности Нативная форма РНКАзыпан]ф проявила наибольшую активность через 15-30 мин после введения, но через 1,5 ч ее активность снижалась до контрольного уровня значений в контрольном опыте, как в сыворотке крови, так и в ткани мозга Изучение динамики распределения конъюгатов БЛСАЧ-РНКазапанхр выявило, что применение конъюгата с КММ 68-95 кДа позволяет получить стабильно высокий уровень активности в тканях мозга, по крайней мере в течение первых 24 ч, в то время как конъюгат с КММ 220-350 кДа имел несколько отличающуюся динамику проявления активности в тканях мозга (рис 12) Максимальная его активность наблюдается лишь через 3,5-5 ч после ведения и сохраняется на достаточно высоком уровне в течение 24 ч, как в крови, так и в ткани мозга Этот результат согласуется с полученными ранее данными о прохождении нативной панкреатической РНКазы через ГЭБ и проявлении ею антивирусного

действия против нейровирусных инфекций Механизм

проникновения РНКазы в паренхиму мозга остается пока невыясненным Изучение влияния 3,4-дигидрокси-Ь-фенилаланина (Ь-ДОФА) на интенсивность поступления конъюгата БЛСАЧ-РНКазапшЖр в мозг достоверных различий между контрольными и подопытными животными не обнаружило

Таким образом, связывание с БЛСАЧ не препятствует проявлению ферментом антивирусной активности и способст-

время ч

Рис 12 Динамика изменения трансферазной активности в гомогенате клеток мозга (1 г) при однократном введении конъюгата РНКаза-БЛСАЧ 1 - КММ - 68-95 кДа, 2 - КММ - 220-350 кДа, 3 -РНКАзапа„кр, и в плазме крови (1 мл) 5 - КММ - 6895 кДа, 4 - КММ - 220-350 кДа

вует пролонгированию его действия в ткани мозга, что, в свою очередь, должно повышать его эффективность Это наблюдение позволяет сделать вывод о перспективности препаратов такого рода для практической медицины

Компьютерное моделирование межмолекулярных комплексов САЧ и ферментов

Для установления молекулярных механизмов изменения биологических свойств ферментов в составе конъюгата с БЛСАЧ, полученного по предложенному методу, проведено компьютерное моделирование межмолекулярных комплексов обезжиренного альбумина (PDB код 1А06) и РНКазы A (PDB код lfs3) В силу отсутствия информации о структуре комплекса и локализации сайта связывания данных молекул с помощью оригинальной программы GRAMM (http //vakser bioinformatics ku edu) проведен так называемый несвязанный докинг Подбор параметров геометрического докинга, таких как величина шага решетки и величина отталкивающего потенциала силового поля проведен путем реконструкции модели комплекса для близких по строению (размерам) белковых макромолекул, кристаллическая структура комплекса которых установлена экспериментально, например, РНКаза А-ингибитор РНКазы (RI) (PDB код ldfg, В Kobe, J Deisenho, 1996) Использованы следующие параметры размер ячейки трехмерной решетки (грид) 1-5 Â, отталкивающая часть потенциала 10 и интервал вращения 20° Поскольку стерическая комплементарность не всегда является ведущим фактором молекулярного узнавания, докинг и оптимизация энергии для данной системы проведены с помощью программы ZDOC (http //zlab bu edu/zlab/index shtml) и ресурсов сервера «ClusPro» (http //тс bu edu/cluster) Это позволило дополнительно провести оптимизацию с учетом межмолекулярных электростатических взаимодействий и энергии десольватации на основании потенциала межатомных контактов (Zhang et al, 1997) При построении предполагаемой структуры комплекса САЧ-РНКазапанкр получено достаточно хорошее согласие между результатами независимых расчетов

Структурный анализ гипотетических комплексов выявил наличие до пяти возможных участков связывания РНКазы А на поверхности САЧ (с учетом хорошей геометрической комплементарности и энергии связывания АЕ < -250 уел ккал/моль) Эти участки локализованы преимущественно вдоль впадины в пространственной структуре молекулы САЧ, где расположены основные сайты связывания САЧ с различными лигандами Поскольку экспериментально получены макромолекулярные комплексы БЛСАЧ и РНКаз, содержащие более одной молекулы фермента, для определения мест локализации следующих сайтов связывания проведен последовательный докинг и построена модель структуры комплекса, включающего САЧ и 3 макромолекулы РНКазы А (рис 13) Смещение положения глобальных минимумов оценочной функции при построении модели комплекса обезжиренного САЧ и трех молекул РНКазы А в направлении сайта связывания #2, по-видимому, отражает известное свойство РНКаз образовывать в растворах олигомерные формы, что часто связывают с механизмом их катализа

Анализ динамики предполагаемых структур комплексов САЧ-ЗР1 1Ка1ы А, проведенный на сервере elNemo (Sulire R.. 2004), указывает на доступность активных центров для взаимодействия с субстратом и отсутствие стерическнх ограничений ДЛЯ Подвижности аминокислотных остатков (АКО), формирующих активный центр ферментов, что соответствует полученным нами экспериментальным результатам. Близкое расположение активных центров ферментов, связанных а центрах U2 и #3 приводит к увеличению плотности положительного заряда в области снизывания субстрата и дает теоретическое обоснование проявления полученными конъюгатами активности в отношении двунитевой РНК. Не столь значительный рост активности в отношении двунитевого субстрзта во фракции 11 (ем, рис. 10). которая содержит конъюгагы, включающие 2 моля РНК азы, может являться свидетельством того, что наиболее приоритетные цещры связывания РНКазы на молекуле альбумина достаточно удалены друг от друга. А существенное повышение активности по отношению к данному субстрату конъюгатов, в состав которых входит более двух молей РНКазы (во фракции I), подтверждает локализацию третичного центра связывании фермента в непосредственной близости от молекулы фермента уже вошедшей в состав комплекса с бел ко м-носителем.

Анализ, аминокислотного состава поверхностей контактов молекулы САЧ в комплексе с молекулами фермента (РНКазы А), выявил локализацию в области поверхностей бедок-белковых контактов АКО, вводящих в состав разданных дигаид-связывающих центров молекулы САЧ. Так сайт связывания РНКазы А #1 затрагивает Су$34, отвечающий за связывание сульфгидрильных соединений и Argl 17, формирующий наиболее высокоаффинный сайт связывания одного из важнейших лигандов альбумина - дпииио-непочечнак жирных кислот. Центр связывания #2 затрагивает спирали hl, h3, h4 субдомена IIA, которые образуют центр не специфического связывания лекарственных препаратов "Sudlow Г* молекулы САЧ. Характерной особенностью центра связывания #3 является локализация на поверхности контактов АКО спиралей hlO субдомена 1В, hl субдомена IIA, М и Ь6 субдомена 1НА, которые входят в состав сайтов "Sudlow I" и "Sutllow II", а также Arg222, участвующего во взаимодействии с билирубином, и Lys351. играющего главную роль в высокоаффинном центре связывания жирных кислот макромолекулами альбумина. Это позволяет предположить, что освобождение САЧ от связанных с ним лигандов должно

Рис. 13. Ленточная диаграмма предполагаемой структуры комплекса САЧ-ЗРНКазы А." Отмечены предпочтительные сайта связывания, Выделены аминокислотные остатки активного центра РНКазы А

существенно повлиять на образование комплекса с ферментом, в особенности, в центрах связывания #2 и #3. Вероятно, это и позволяет объяснить увеличение активности экспериментально полученных комплексов (и в последствии конъюгатов) БЛСАЧ и РНКаз после снятия лигандов с макромолекулы донорского САЧ почти на порядок

Сложной задачей в теоретических исследованиях белок-белковых взаимодействий явтяется возможность идентифицировать комплексы, существующие ш vivo, которые должны быть достаточно прочными для образования при биологических концентрациях мономеров Для валидации предполагаемых структур комплексов с использованием ресурсов сервера «Protein-protein interactions» (Jones S , 1996) проведен анализ поверхности контактов, учитывающий такие характеристики взаимодействий, как количество, тип и положение взаимодействующих аминокислотных остатков, площадь поверхности контактов После минимизации энергии комплексов в вакууме с помощью программ SPDBV и МОЕ был проведен анализ вероятных межмолекулярных контактов в комплексе обезжиренного САЧ и трех макромолекул РНКазы, а также дана оценка значений энергии образования комплексов (табл 5)

Согласно полученным результатам, в образовании высокоактивного макромолеку-лярного комплекса принимают участие различные виды взаимодействий Площадь поверхности макромолекулярных контактов, недоступная растворителю - AASA, составляет в среднем 1326,58 ± 24,7 А2, что составляет порядка 20% всей поверхности лиганда и соответствует значению данной величины для достаточно устойчивых комплексов (Jones, Thornton, 1996) Поверхности контактирующих белков в области сайта #1 имеют высокую комплементарность, что характерно для постоянных комплексов Комплементарность молекул альбумина и РНКазы А в сайтах #2 и #3 ниже, однако для этих поверхностей отмечено наличие нескольких полостей, и в их образовании задействованы участки большого количества элементов вторичной структуры Число водородных связей на 100 А2 поверхности контактов и большое количество контактирующих аминокислотных остатков говорят в пользу образования достаточно прочных комплексов обезжиренного САЧ и нескольких макромолекул РНКазы A (Gong, Yoon, 2005, Winter, Henschel, 2006) Таким образом, анализ характеристик поверхностей контактов рассчитанных комплексов указывает на то, что предполагаемые структуры соответствуют современным представлениям о белок-белковых взаимодействиях и, по-видимому, являются достаточно прочными

Таблица 5 Возможные межмолекулярные взаимодействия в комплексах обезжиренного САЧ и трех молекул РНКазы А

Участок Водородные связи Ионные связи Гидрофобные взаимодействия Энергия образования комплекса ДЕ (условные ккал/моль)

#1 8 3 2 -2 341

#2 5 1 1 -311,5

#3 9* 1 - -227,7

* в том числе 4 связи между молекулами РНКазы А, связанными в сайтах #2 и #3

Использование ресурсов серверов «Hydrophobic clusters detector» (http //monkey belozersky msu su/) и «ClusPro» позволило провести анализ межмолекулярных гидрофобных взаимодействий и энергетического вклада аминокислотных остатков белков в свободную энергию связывания Эти результаты, с одной стороны, красноречиво указывают на то, что АКО, расположенные в сайтах связывания традиционных физиологических лигандов САЧ, не только локализованы на поверхности контакта компонентов комплекса, но и принимают активное участие во взаимодействии с ферментом С другой стороны, они дают возможность предположить, что движущими силами образования данных белок-белковых комплексов выступают преимущественно электростатические и гидрофобные взаимодействия При этом их вклад варьирует в разных сайтах связывания Форма электростатического потенциала свободных макромолекул и их комплексов, а также данные об электростатической компоненте свободной энергии связывания, составляющей около половины расчетной величины энергии связывания, показывают, что дальнодействующие электростатические взаимодействия являются инициирующими при образовании комплекса А затем более тонкая архитектура комплекса «подстраивается» и стабилизируется гидрофобными взаимодействиями и водородными связями

Полученные результаты позволяют предположить теоретическую возможность получения устойчивых мультимолекулярных комплексов, включающих БЛСАЧ и до трех (по крайней мере) молекул РНКазы А Причем это не отражается на подвижности АКО, составляющих активный центр фермента Кроме того, для всех ферментов, входящих в состав комплекса, не обнаружено стерических ограничений доступности активных центров для взаимодействия с субстратом

Взаимодействие БЛСАЧ-модифицированных ферментов с ингибитором РНКаз

Известно, что для борьбы с проникшим чужеродным белком (и ферментом в частности) в организм использует первую очередь механизмы иммунной защиты, ингибирования его каталитической активности и протеолитическую деградацию В связи с этим представляется чрезвычайно важным рассмотреть вопрос о взаимодействии БЛСАЧ-модифицированного фермента с ингибитором его активности Анализ структуры полученных нами комплексов САЧ и панкреатической РНКазы показал^ что лабильный в отношении протеолиза и иммунореактивный фрагмент РНКазы А (аминокислотные остатки 32-43) расположен на поверхности белок-белковых контактов и находится в экранированном состоянии, что препятствует взаимодействию протеиназ с модифицированными ферментами Поэтому разумно будет предположить, что конъюгирование панкреатической РНКазы с БЛСАЧ, проведенное по предложенному методу, понижает риск протеолитической деградации модифицированного фермента в кровотоке и тканевых жидкостях (при введении в кровоток) и, следовательно, способствует пролонгированию его действия, что и наблюдали в экспериментах in vivo

В данной работе построена модель возможного взаимодействия цитоплазматического ингибитора рибонуклеаз (RI) с ПК, образованным молекулой обезжиренного САЧ и двумя молекулами РНКазы А Аналогично была предсказана возможная структура комплексов

обезжиренного альбумина и бактериального фермента. Анализ полученных нами данных ,vvt гипотез комплексов а системах САЧ/2Р1 ИСаза А/цитогшазм атичесв}® ингибитор РНК аз и САЧ/31 Бимазы/ийтопяазматическяй ингибитор РНКаз, показал, что доя данных систем характерно наличие двух центров связывании R1. При этом ни один из них не затрагивает активных центров, входящих в состав комплекса ферментов как в случае панкреатической РНКазы, так и для бактериального фермента (рис 15, А и Б, соответственно) и, следовательно, не препятствует реализации ферментативной активности, необходимой для биологического действия препарата.

РНКаза А #1

Рис. 15. Схемы предполагаемого взаимодействия комплексов САЧ с ферментами: А) ленточная диаграмма структуры комплекса САЧ/2-Р11Казы АЛИ; Ь) проволочное представление модели взаимодействия К1 и комплекса САЧ/3 РНКачыц,.

Следует отметить, что моделирование всегда гипотетично и, следовательно, подтвердить локализацию центров связывания можно только после проведения дополнительных исследований - например, рентгеноетру ктурным анализом. Однако, в совокупности с данными о физико-химических свойствах полученных нами конъюгатов, которые достаточно хорошо Согласуются с результатами проведенного теоретического исследования, мы можем высказать предположение о том, что представленный модели позволяют углубить понимание молекулярных механизмов изменения биологических свойств данных ферментов в составе конъюгатов, а также с достаточной долей вероятности предсказать характер поведения модифицированных ферментов.

На основании проведенных теоретических и экспериментальных исследований с использованием методов структурной биохимии и компьютерного молекулярного докинга белков, минимизации энергии и анализа структуры комплексов предложен подход к разработке белковых лекарственных средств пролонгированного действия. Данный подход может быть использован для конструирования широкого набора лекарственных препаратов с заданными свойствами.

Результаты и выводы

1 Предложен и экспериментально обоснован оптимальный метод получения САЧ, очищенного от балластных лигандов - безлигандного сывороточного альбумина человека (БЛСАЧ)

2 Экспериментально разработан новый метод получения конъюгатов БЛСАЧ с терапевтическими ферментами, состоящий в комплексообразовании БЛСАЧ с соответствующим ферментом (в частности, нуклеазой или протеазой) и последующей соконденсации компонентов комплекса с помощью глутарового альдегида Полученные этим методом конъюгаты обладают существенно повышенным отношением фермент/альбумин и придают ферментным компонентам ряд новых полезных терапевтических свойств

3 В ходе биоиспытаний показано, что конъюгаты нуклеаз обладают высоким антивирусным пролонгированным действием и сниженной по сравнению со свободным ферментом токсичностью Показано, что конъюгаты нуклеаз обладают активностью в отношении двунитевой РНК, что повышает возможности их терапевтической эффективности Показано также, что полученные по предложенному методу конъюгаты РНКазы А, обладают способностью проходить через гематоэнцефалический барьер, и могут быть эффективны также при внутримышечном введении

4 Примененные методы компьютерного моделирования позволяют провести анализ структур конъюгатов, изучить механизмы образования комплексов и прогнозировать свойства конъюгатов иного молекулярного состава

5 На основании проведенных теоретических и экспериментальных исследований с использованием методов структурной биофизики и современных компьютерных технологий предложена новая стратегия создания белковых лекарственных препаратов пролонгированного действия Она включает использование безлигандного сывороточного альбумина человека (БЛСАЧ) в качестве носителя ферментов, теоретическое предсказание физико-химических и биологических свойств комплексов белка и фермента, получение и выделение фермент-альбуминовых конъюгатов

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Пономарева Р Б , Зелепуга Е А , Ануфриева Е В , Паутов В Д, Шевелева Т В Взаимодействие рибонуклеазы с нативным и модифицированным сывороточным альбумином //Всесоюзная конференция "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование" Тезисы докл Рига, 1989, С 6

2 Пономарева Р Б , Зелепуга Е А Самсонов Г В Конъюгаты нуклеаз с белками сыворотки крови, обладающие пролонгированным действием в организме //Всесоюзная конференция "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование" Тезисы докл Рига, 1989, с 65

3 Пономарева Р Б , Зелепуга Е А , Медведев М Л, Самсонов Г В Модификация нуклеаз сывороточным альбумином //Всесоюзная конференция "Методы получения, анализа и применения ферментов" Тезисы докл Юрмала, 1990, с 126

4 Терпеловская О Н , Зелепуга Е А , Пономарева Р Б , Третьяк Т М О проникновении РНКазы в ткань головного мозга //Девятая конференция межвузовского проекта "Ферменты микроорганизмов" Тезисы докл Казань 1991, с 39-42

5 Пономарева Р Б, Зелепуга Е А Комплексообразование нуклеаз сывороточным альбумином //Девятая конференция межвузовского проекта "Ферменты микроорганизмов" Тезисы докл Казань 1991, с 22-23

6 Пономарева Р Б, Зелепуга Е А, Медведев М Л Конъюгаты нуклеаз с безлигандным сывороточным альбумином //Биологические науки, 1992, №2, с 86-89

7 Терпеловская О Н, Зелепуга Е А , Пономарева Р Б , Третьяк Т М Проникновение панкреатической РНКазы через гематоэнцефалический барьер в паренхиму головного мозга Вопросы медицинской химии , 1993, т 39, № 5, с 41-43

8 Пономарева Р Б , Зелепуга Е А , Илларионова Н Г , Медведев М Л Взаимодействие рибонуклеазы Bacillus mtermedius 7Р с безлигандным сывороточным альбумином //Прикладная биохимия и микробиология, 1994, т 30, вып 1,с 88-93

9 Зелепуга Е А, Пономарева Р Б , Третьяк Т М , Коликов В М , Терпеловская О Н , Медведев М Л Конъюгаты панкреатической рибонуклеазы с безлигандным сывороточным альбумином человека //Биомедицинская химия, 2003, т 49, №6, стр 588597

10 Зелепуга ЕА, Коликов ВМ, Катушкина HB Выделение конъюгатов альбумина и рибонуклеаз //Прикладная биохимия и микробиология, 2004,т 40, №1, стр 28-31

11 Зелепуга ЕА, Лихацкая Г Н Высокоактивные комплексы панкреатической рибонуклеазы и модифицированного альбумина //III Съезд биофизиков России 24-29 июня 2004 г Воронеж Тезисы докладов том 1, с 41-42

12 Зелепуга Е А, Лихацкая Г Н, Нурминский Е А , Трифонов Е В Использование методов структурной биохимии и компьютерного моделирования для дизайна ферментных препаратов пролонгированного действия //Материалы региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» Владивосток, 2004, С 60-61

13 ZelepugaE А, Likhatskaya G N,TrifonovE V,NurmmskyE A New approach for creation of drugs endowed with prolonged action on the basis of human serum transport protein l/FEBS Journal 2005 V 272 (si), M2-022P

ЗЕЛЕПУГА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

БИОФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СОЗДАНИЯ НОВЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Зак №83 Формат 60x84 '/,6 Уел п л 1,0 Тираж 100 экз Подписано в печать 18 04 2007 г Печать офсетная с оригинала заказчика

Отпечатано в типографии ОАО «Дальприбор» 690105, г Владивосток, ул Бородинская, 46/50, тел 32-70-49

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Зелепуга, Елена Александровна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Применение ферментов в медицине.

1.2. Модификация ферментов.

1.2.1. Функциональные группы белков.

1.2.2. Модификация белков природными и модифицированными природными полимерами.

1.2.3. Модификация синтетическими полимерами.

1.2.3.1. Системы депонирования белковых лекарств в организме.

1.2.3.2. Модификация белков монофункциональными полимерами.

1.2.3.3. Синтетические полифункциональные полимеры.

1.2.4. Фермент-белковые конъюгаты.

1.2.5. Проблемы биоконъюгации.

1.3. Механизмы биологического действия РНКаз.

1.4. Факторы, необходимые для проявления РНКазами биологического действия.

1.5. Сывороточный альбумин человека (САЧ).

1.5.1. Метаболизм и распределение альбумина.

1.5.2.1. Аминокислотная последовательность альбумина.

1.5.2.2. Вторичная структура и доменная организация.

1.5.2.3. Пространственная структура молекулы альбумина в растворе.

1.5.2.4. Распределение аминокислотных остатков и зарядов.

1.5.3. Физико-химические свойства молекулы САЧ.

1.5.4. Влияние физико-химических факторов на структуру и свойства альбумина.

1.5.4.1. Влияние значения рН среды.

1.5.4.2. Денатурация макромолекулы САЧ.

1.5.4.2.1. Температурная денатурация.

1.5.4.2.2. Влияние мочевины на структуру САЧ.

1.5.5. Функции альбумина в организме.

1.5.5.1. Связывающие центры альбумина.

1.5.5.1.1. Главные центры неспецифического связывания («лекарственные»).

1.5.5.1.2. Центр связывания двухвалентных катионов.

1.5.5.1.3. Тиоловая группа остатка Cys34.

1.5.5.1.4. Центры связывания неэтерифицированных жирных кислот.

1.5.5.1.5. «Минорные» центры.

1.5.5.1.6. Билирубин связывающие центры.

1.5.6. Группы молекулы САЧ, доступные для химической модификации.

1.6. Получение конъюгатов ферментов с белками при помощи глутарового альдегида.

1.6.1. Химическое поведение глутарового альдегида в растворе.

1.6.2. Взаимодействие ГА с белками.

1.6.3. Факторы, определяющие успешную иммобилизацию ферментов.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы н методы.

2.2. Характеристика химических реактивов.

2.3. Характеристика используемых белков.

2.3.1. Рибонуклеаза из Bacillus Intermedins 7р.

2.3.2. Бычья панкреатическая рнбопуклеаза.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Конъюгаты ферментов с сывороточным альбумином человека, их получение и характеристики

3.1.1. Получение и исследование физико-химических свойств безлигандного сывороточного альбумина человека.

3.1.2.Способ получения конъюгатов ферментов с БЛСАЧ.

3.1.3. Исследование физико-химических характеристик конъюгатов и их биологической активности in vitro

3.1.3.1. Ферментативная активность конъюгатов.

3.1.3.2. Определение «молекулярной массы» конъюгатов.

3.1.3.3. Активность конъюгатов БЛСАЧ и панкреатической РНКазы в отношении двунитевой РНК.

3.1.4. Способ очистки конъюгатов от примесных агрегатов САЧ.

3.1.5. Изучение биологической активности конъюгатов in vivo.

3.1.5.1. Пролонгация действия модифицированного фермента в организме.

3.1.5.2. Исследование проникновения панкреатической рибонуклеазы через гематоэнцефалический барьер

3.2. Компьютерное моделирование межмолекулярных комплексов БЛСАЧ и РНКазы А.

3.2.1. Молекулярный докинг обезжиренного альбумина и РНКазы А.

3.2.2. Анализ поверхности контактов предполагаемых комплексов.

3.2.3. Анализ влияния взаимодействия РНКазы А и обезжиренного САЧ на активность фермента.

3.2.4. Анализ структуры центров связывания РНКазы А макромолекулы албьумина.

3.2.5. Анализ возможных взаимодействий макромолекул в составе полимерного комплекса.

3.2.6. Гидрофобные взаимодействия.

3.2.7. Конформационный анализ.

3.2.8. Предсказание биологической активности БЛСАЧ-модифицированных ферментов (РНКаз).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биофизические основы создания новых ферментных препаратов пролонгированного действия"

Разработка новых лекарств представляет собой длинный и трудный процесс, который включает в себя несколько стадий: идентификацию и валидацию цели, скрининг или дизайн лидирующего соединения, его оптимизацию, выделение или синтез и клинические испытания [1]. При этом она сопряжена с огромным числом непредвиденных сложных задач как научных, так и медицинских [2]. Современные подходы к разработке новых лекарственных средств основаны на понимании молекулярных механизмов как нормального развития живого организма, так и возникающих в нем патологических процессов. Поэтому в создании новых или модификации известных лекарственных средств все большую роль начинают играть подходы, основанные на молекулярной биофизике.

Особое место среди лекарственных средств занимают ферменты - макромолекулы белковой природы, имеющие разнообразную структуру и функцию, роль которых в фундаментальных биологических процессах делает их как превосходными мишенями для лекарств при многих заболеваниях, так и непосредственно действующими веществами при лечении многих патологий. В частности, рибонуклеазы (РНКазы) являются высокоактивными противовирусными средствами. Существенным недостатком нативных ферментов при внутривенном введении является короткое время удерживания их в кровеносной системе, а для ферментов из микробиальных источников еще и их токсичность.

Изменение физико-химических свойств и биологической активности белков путем посттрансляционной модификации является широко распространенной стратегией регуляции метаболических процессов в живой клетке. Особенно перспективными являются межмолекулярные комплексы (конъюгаты) активного фермента с инертным стабилизирующим носителем. При этом носитель не должен вызывать накопления препарата в отдельных органах и трудностей с его выведением из организма. Поэтому в качестве носителей удобнее всего использовать гомологичные транспортные белки плазмы крови, и в частности сывороточный альбумин человека (САЧ). Его физиологическая роль и уникальная способность связывать и переносить огромный спектр лигандов различной природы наряду с умеренной иммуногенностыо позволяют предполагать перспективность использования гомологичных альбуминов в качестве носителей лекарственных средств. Разработанные ранее системы гетероолигопротеинов на основе олигомеров гемоглобина и донорского сывороточного альбумина (САЧ) и химически фиксированных на них молекул фермента позволяют стабилизировать и пролонгировать действие фермента. Однако такие гетероолигопротеины характеризуются высокой молекулярной массой и низким содержанием биологически активного вещества (не более 7%) и не могут быть эффективно использованы в качестве лекарственных препаратов. В связи с этим весьма актуальной является задача разработки на основе молекулярно-биофизического подхода рациональных путей модификации ферментных препаратов, а также создания и отбора наиболее эффективных и безопасных носителей.

Данная работа посвящена разработке биофизической стратегии конструирования высокоактивных ферментных препаратов пролонгированного действия, используя принципы и подходы, открытые природой и отобранные ею в результате эволюции. Стратегия основана на выявлении фундаментальных закономерностей взаимодействия лекарственных препаратов с транспортным белком плазмы крови человека (САЧ) и получению на их основе водорастворимых конъюгатов безлигандного сывороточного альбумина человека (БЛСАЧ) с панкреатической РНКазой и РНКазой из Bacillus intermedius 7Р с высоким содержанием и высокой биологической активностью действующего фермента. Применение этой стратегии позволит целенаправленно конструировать лекарственные препараты с новыми полезными фармакологическими свойствами.

Исследование особенностей взаимодействия САЧ с различными лигандами и лекарственными препаратами, в частности, со временем приобретает все большее фундаментальное и прикладное значение. Вследствие этого особую актуальность приобретает разработка новых способов очистки коммерческого альбумина от его лигандной нагрузки. Решение данной задачи позволит не только увеличить способность САЧ к связыванию с полипептидными препаратами и синтезировать высокоактивные лекарственные препараты, но и получить очищенный альбумин для исследования механизмов и движущих сил взаимодействия транспортного белка с обширным спектром соединений различной природы.

Рассмотрение проблемы «сохранения» биологической активности лекарственных веществ белковой природы с общих позиций физической и структурной химии: проведение теоретического анализа связи структуры комплексов транспортного белка с ферментом и биологической активностью последнего с использованием пакета специализированного программного обеспечения позволяет конструировать лекарственные препараты с заданными свойствами.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Зелепуга, Елена Александровна

выводы

1. На основании проведенных теоретических и экспериментальных исследований с использованием методов структурной биофизики и современных компьютерных технологий предложена новая стратегия создания белковых лекарственных препаратов пролонгированного действия. Она включает использование безлигандного сывороточного альбумина человека (БЛСАЧ) в качестве носителя ферментов, теоретическое предсказание физико-химических и биологических свойств комплексов белка и фермента, получение и выделение фермент-альбуминовых конъюгатов.

2. Предложен и экспериментально обоснован оптимальный метод получения САЧ, очищенного от балластных лигандов - безлигандного сывороточного альбумина человека (БЛСАЧ).

3. Экспериментально разработан новый метод получения конъюгатов БЛСАЧ с терапевтическими ферментами, состоящий в комплексообразовании БЛСАЧ с соответствующим ферментом (в частности, нуклеазой или протеазой) и последующей соконденсации компонентов комплекса с помощью глутарового альдегида. Полученные этим методом конъюгаты обладают существенно повышенным отношением фермент/альбумин и придают ферментным компонентам ряд новых полезных терапевтических свойств.

4. В экспериментах, проведенных совместно с медиками и биохимиками, показано, что конъюгаты нуклеаз обладают высоким антивирусным пролонгированным действием и сниженной по сравнению со свободным ферментом токсичностью. Показано, что конъюгаты нуклеаз обладают активностью в отношении двунитевой РНК, что повышает возможности их терапевтической эффективности. Показано также, что полученные по предложенному методу конъюгаты РНКазы А, обладают способностью проходить через гематоэнцефалический барьер, и могут быть эффективны также при внутримышечном введении.

5. Примененные методы компьютерного моделирования позволяют провести анализ структур конъюгатов, изучить механизмы образования комплексов и прогнозировать свойства конъюгатов иного молекулярного состава.

СПИСОК РАБОТ, В КОТОРЫХ ОПУБЛИКОВАНО ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Пономарева Р.Б., Зелепуга Е.А. Ануфриева Е.В., Паутов В.Д., Шевелева Т.В. Взаимодействие рибонуклеазы с нативным и модифицированным сывороточным альбумином. //Всесоюзная конференция "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование" Тезисы докл. Рига, 1989, С. 6.

2. Пономарева Р.Б., Зелепуга Е.А. Самсонов Г.В. Конъюгаты нуклеаз с белками сыворотки крови, обладающие пролонгированным действием в организме. //Всесоюзная конференция "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование" Тезисы докл. Рига, 1989, с. 65.

3. Пономарева Р.Б., Зелепуга Е.А. Медведев М.Л. Самсонов Г.В. Модификация нуклеаз сывороточным альбумином. //Всесоюзная конференция "Методы получения, анализа и применения ферментов". Тезисы докл. Юрмала, 1990, с. 126.

4. Терпеловская О.Н., Зелепуга Е.А. Пономарева Р.Б., Третьяк Т.М О проникновении РНКазы в ткань головного мозга. //Девятая конференция межвузовского проекта "Ферменты микроорганизмов". Тезисы докл. Казань 1991, с 39-42.

5. Пономарева Р.Б., Зелепуга Е.А. Комплексообразование нуклеаз сывороточным альбумином. Девятая конференция межвузовского проекта "Ферменты микроорганизмов." Тезисы докл. Казань 1991, с. 22-23.

6. Пономарева Р.Б. Зелепуга Е.А., Медведев М.Л. Конъюгаты нуклеаз с безлигандным сывороточным альбумином. // Биологические науки, 1992, №2, с. 8689.

7. Терпеловская О.Н., Зелепуга Е.А., Пономарева Р.Б., Третьяк Т.М. Проникновение панкреатической РНКазы через гематоэнцефалический барьер в паренхиму головного мозга. //Вопросы медицинской химии., 1993, т.39, № 5, с. 41-43.

8. Пономарева Р.Б., Зелепуга Е.А., Илларионова Н.Г., Медведев М.Л. Взаимодействие рибонуклеазы Bacillus intermedius 7Р с безлигандным сывороточным альбумином. //Прикладная биохимия и микробиология, 1994, т. 30, вып. 1, с. 88-93.

9. Зелепуга Е.А., Пономарева Р.Б., Третьяк Т.М. Коликов В.М., Терпеловская О.Н., Медведев М.Л Конъюгаты панкреатической рибонуклеазы с безлигандным сывороточным альбумином человека. //Биомедицинская химия, 2003, т.49, №6, стр. 588-597.

10. Зелепуга Е.А., Коликов В.М. Катушкина Н.В. Выделение конъюгатов альбумина и рибонуклеаз. //Прикладная биохимия и микробиология, 2004,т.40, №1, стр. 28-31. (Applied Biochemistry and Microbiology, Vol. 40, No. 1, 2004, pp. 22-24).

11. Зелепуга EA., Лихацкая Г.Н. Высокоактивные комплексы панкреатической рибонуклеазы и модифицированного альбумина. //III Съезд биофизиков России. Тезисы докл. Воронеж, 2004. Т. 1, С. 41-42.

12. Зелепуга Е.А., Лихацкая Г.Н., Нурмипский Е.А., Трифонов Е.В. Использование методов структурной биохимии и компьютерного моделирования для дизайна ферментных препаратов пролонгированного действия. //Региональная научная конференция «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» Тезисы докл. Владивосток, 2004, С. 60-61

13. ZelepugaE. A., Likhatskaya G. N., Trifonov Е. V., Nurminsky Е. A. New approach for creation of drugs endowed with prolonged action on the basis of human serum transport protein FEBS Journal. 2005. V. 272 (si), M2-022P

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Значимость белков со структурными, сигнальными или ферментативными функциями признавалась всегда, однако важность посттрансляционной модификации белков и ее роли в физиологических процессах продемонстрирована только недавно. Соответствующие эксперименты, которые стали возможны лишь в последнее время благодаря высокочувствительным аналитическим методам, показали, как много белков находится в организме в конъюгированном состоянии и насколько различны химические реакции, изменяющие первичную последовательность белка. Эти модификации могут затрагивать различные сайты белков, и они используются природой для получения различных функций in vivo, где даже незначительная модификация создает новую сущность, которая узнается и может выполнять иные функции по сравнению с нативным белком. Незначительное изменение структуры белка может выступать в качестве триггера функций, таких как передача сигнала, катализ, катаболизм, изменение времени циркулирования в организме, иммуногенности.

Принципы и подходы, открытые живой природой и отобранные ею в результате эволюции, были использованы нами в лабораторных условиях, с помощью химических инструментов для связывания природных биологически активных соединений белковой природы. На примере РНКаз различного происхождения и протеиназы с транспортным белком плазмы крови были получены конъюгаты с улучшенными фармакологическими свойствами. Среди преимуществ, которые может получить фермент при такой модификации, - снижение иммуногенности и антигенности, а также увеличение времени пребывания в организме и стабильности.

Теоретическое исследование белок-белковых взаимодействий в системах САЧ/РНКаза и САЧ/РНКаза А/ингибитор РНКаз методами компьютерного молекулярного моделирования показало возможность образования стабильного комплекса САЧ и нескольких молекул РНКаз, что хорошо согласуется с полученными экспериментальными данными. Результаты экспериментов in silico, обеспечивают более глубокое понимание структурных особенностей белок-белковых взаимодействий и возможных механизмов изменения биологических свойств конъюгированных форм ферментов.

В рамках настоящей работы мы не рассматривали ассоциацию с другими основными белками крови, такими, как у-глобулин и фибриноген, поскольку сывороточный альбумин является основным транспортным белком, и большинство лекарственных препаратов при попадании в кровь взаимодействует, главным образом, с этим белком. Анализ взаимодействия с другими упомянутыми транспортными белками крови является, непсомненно, предметом отдельного исследования, но предлагаемая нами стратегия создания лекарственных препаратов не исключает возможности в специальных случаях (например, специфической доставки лекарственных препаратов) использовать их в качестве носителей лекарственных веществ.

130

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Зелепуга, Елена Александровна, Санкт-Петербург

1. Ofran Y, Punta М, Schneider R, Rost В. Beyond annotation transfer by homology: novel protein-function prediction methods to assist drug discovery// Drug Discov Today. 2005. v.10, №21 P. 1475-1482.

2. Swinney D.C. Biochemical mechanisms of drug action: what does it take for success? // Nature Reviews Drug Discovery 2004, V.3, №.9. P.801 -808.

3. Walsh G. Pharmaceutical biotechnology products approved within the European Union // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2003. V.55, P. 3-10.

4. Holmer A.F. 324 biotechnology medicines in testing promise to bolster the arsenal against disease (2004). http://www.phnna.org/newmedicines/biotech/

5. Walsh G: Biopharmaceuticals: recent approvals and likely directions.// Trends Biotedind. 2005. V.23,№ 11. P. 553-558

6. Leipner J, Sailer R. Systemic enzyme therapy in oncology: effect and mode of action.// Drugs. 2000. V.59, №4. P. 769-780.

7. Kasseroller R., Wenning H.G. Efficacy and tolerability of proteolytic enzymes as an antiinflammatory agent in lymphoedema after axillary dissection due to mammary cancer // The European Journal of Lymphology (2002-2003): X(37-38), P. 18 26.

8. Guseinov N.I. Wobenzym in therapy of rheumatoid arthritis // International Journal on Immunorehabilitation, 2001. Vol. 3, N 2. P. 73-74.

9. Кванчахадзе Р.Г.Применение вобэнзима в комплексной терапии аутоиммунного тиреоидита // International Journal on Immunorehabilitation, 2002. v. 4, №1, p. 114.

10. Лещинская И.Б.-Современная промышленная микробиология // Соросовский образовательный журнал. 2000. Т.6, № 4.

11. Crommeltn DJ, Storm G, Verrijkr, De Leede L, Jiskoot W, Hennink W.E: Shifting paradigms: biopharmaceuticals versus low molecular weight drugs. // Int. J. Pharm., 2003. V. 266, P. 3-16.

12. Cleland JL, Daughertya, MRSNYR: Emerging protein delivery methods // Curr. Opin. Biotedind. 2001. Vol. 12, P. 212-219.

13. Van de Weert M., Jorgensen L., Horn Moeller E., Frokjaer S. Factors of importance for a successful delivery system for proteins. // Expert Opin. DrugDeliv. 2005. V. 2, № 6, P. 10291037.

14. Tangl, Perskyam, Hochhausg, Meibohm B: Pharmacokinetic aspects of biotechnology products // J. Pharm. Sd. 2004. V. 93, P. 2184-2204.

15. Reger MA, Watson GS, Freywh 2nd et al.: Effects of intranasal insulin on cognition ir memory-impaired older adults: modulation by APOE genotype // Neurobiol. Aging. 2006 Vol. 27, №3, P. 451-8.

16. Mandal Т.К. Inhaled insulin for diabetes mellitus // Am. J. Health Syst. Pharm. 2005. Vol. 62, P. 1359-1364.

17. Cefalu W.T. Evolving strategies for insulin delivery and therapy // Drugs. 2004. V. 64, P. 1149-1161.

18. Dreborg S., Akerblom E.B. Immunotherapy with mono-methoxypoly(ethylene glycol) modified allergens // Crit. Rev. Ther. Drug Carr. Syst. 1990. V. 6, P. 315-365.

19. Okamoto C.T. Endocytosis and transcytosis // Adv. Drug Deliv. Rev. 1998. Vol. 29, P. 215-228.

20. Tanksale A., Chandra P. M., Mala Rao Deshpande V. Immobilization of alkaline protease from Conidiobolus macrosporus for reuse and improved thermal stability // Biotechnology Letters. 2001. Vol. 23, P. 51-54.

21. Sehon A.H., Suppression of antibody responses by conjugates of antigens and mono-methoxypoly(ethylene glycol) // Adv. Drug Deliv. Rev. 1991. Vol. 6, P. 203-217.

22. Monfardini C., Veronese F.M. Stabilization of substances incirculation // Bioconjug. Chem. 1998. Vol. 9, P. 418-450.

23. Walsh G: Therapeutic insulins and their large-scale manufacture // Appl Microbid. Biatedmd. 2005. V. 67, P. 151-159.

24. Havelund S, Plum A, Ribel U, Jonassen I, Volund A, Markussen J, Kurtzhals P. The mechanism of protraction of insulin detemir, a long-acting, acylated analog of human insulin//Pharm. Res. 2004. V. 21, №. 8. P. 1498-1504.

25. Ringsdorf H., Structure and properties of pharmacologicallyactive polymers // J. Polym. Sci., Polym. Symp. 1975. V. 51, P. 135-153.

26. Cryan S-A: Carrier-based strategies for targeting protein and peptide drugs to the lungs // AAPS J. 2005. V. 7, P. E20-E41.

27. Bolivar JM, Wilson L, Ferrarotti SA, Guisan JM, Fernandez-Lafiiente R, Mateo C. Improvement of the stability of alcohol dehydrogenase by covalent immobilization on glyoxyl-agarose // J, Biotechnol. 2006. V. 125, № 1. P. 85-94.

28. Li J., Crasto C.F., Weinberg J.S., Amiji M., Shenoy D., Sridhar S., Bubley G.J., Jones G.B. An approach to heterobifunctional poly(ethyleneglycol) bioconjugates // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005. Vol. 15, № 24, P. 5558-61.

29. Vasir JK, Labhasetwar V.Targeted drug delivery in cancer therapy // Technol Cancer Res. Treat. 2005. Vol. 4, P. 363-374.

30. Cao L. Immobilised enzymes: science or art? // Curr Opin Chem Biol. 2005. Vol. 2, P. 217-26.

31. Veronese F.M., Pasut G. PEGylation, successful approach to drug delivery.// Drug Discov. Today. 2005. V. 10, № 21, P. 1451-8.

32. Hudecz F. Synthesis of peptide bioconjugates / Methods Mol Biol. 2005. № 298. P. 20923.

33. Veronese F.M., Visco C., Massarotto S., Benassi C.A., Ferruti P., New acrylic polymers for surface modification of enzymes of therapeutic interest and for enzyme immobilization // Ann. NY Acad. Sci. 1987. № 501, P. 444-448.

34. Heredia KL, Bontempo D, Ly T, Byers JT, Halstenberg S, Maynard HD.In situ preparation of protein-"smart" polymer conjugates with retention of bioactivity // J Am Chem Soc. 2005. V. 127, № 48, P. 16955-60.

35. Ali S. A., Joao H. C., Hammerschmid F., Eder J., Steinkasserer A. Transferrin Trojan Horses as a Rational Approach for the Biological Delivery of Therapeutic Peptide Domains // J Biol Chem. 1999. Vol. 274, Issue 34. P. 24066-24073.

36. Chang Alex H, Matthias T Stephan, Michel Sadelain Stem cell-derived erythroid cells mediate long-term systemic protein delivery // Nature Biotechnology. 2006. Vol. 24, P. 1017-1021.

37. Kilinc A, Teke M, Onal S, Telefoncu A. Immobilization of pancreatic lipase on chitin and chitosan // Prep Biochem Biotechnol. 2006. Vol. 36, № 2. P. 153-63.

38. Goodson R.J., Katre N. Site-directed pegylation of recombi-nant interleukin-2 at its glycosilation site // Biotechnology. 1990. Vol. 8, P. 343-346.

39. Torchilin V.P., Voronkov J.I., Mazoev A.V. The use of immobilized streptokinase (Streptodekaza) for the therapy of thromboses II Ter. Ark. (Ther. Arch. Russ.) 1982. V. 54, P. 21-25.

40. Chazov E.I., Smirnov V.N., Torchilin I.M., Moskivichev V.P., Grimberg G.M., Skuja A.Z., Kleiner G.I. Dextran derivatives of fibrinolysin. // US Patent No. 4446316

41. Tarn S.C., J. Wong T.F., Modification of hemoglobin upon covalent coupling to dextran: enhanced stability against acid denaturation and reduced affinity for haptoglobin // Can. J. Biochem. 1980. V. 58, P. 732-736.

42. Abuchowsky A., Me Coy J.R., Palczuck N.C., Van Es Т., Davis F.F. Alteration of rmmulogical properties of bovine serum albumin by covalent attachment of poly(ethylene glycol) // J. Biol. Chem. 1997. V. 252, P. 3578-3581.

43. Snider J., Neville C., Yuan L.C., Bullock J. Characterization of the heterogeneity of poly(ethylene glycol)-modified superoxide dismutase by chromatographic and electrophoretic techniques//!. Chromatagr. 1992. Vol. 599, P. 141-155.

44. Satchi-Fainaro R, Puder M, Davies JW, Tran HT, Sampson DA, Greene AK, Corfas G, Folkman J. Targeting angiogenesis with a conjugate of HPMA copolymer and TNP-470 // Nat Med. 2004. V. 10, № 3. P. 255-61. Epub 2004 Feb 22.

45. Veroneze F.M., Morporgo M. Bioconjugation in pharmaceutical chemistry // II Farmaco. 1999. V. 54, №8. P. 497-516.

46. Takakura Y., Mahoto R.I., Hashida M. Extravasation of macromolecules // Adv. Drug Deliv. Rev. 1998. V. 34, P. 93-108.

47. O'Hare K., Duncan R., Strohlam J., Ulbrich K., Kopeckova P. Polymeric drug carriers containing doxorubicin and melanocyte-stimulating hormone: in vitro and in vivo evaluation against murine melanoma// J. Drug Target. 1993. V.l, № 3. P. 217-229.

48. Seymour L.W., Flanagan P.A., Al-Shamkhani A., V. Subr, K. Ulbrich, J. Cassidy, R. Duncan Synthetic polymers conjugated to monoclonal antibodies: vehicles for tumor-targeted drug delivery // Sel. Cancer Ther. 1991. V. 7, P. 59-73.

49. Torchilin VP, Lukyanov AN, Gao Z, Papahadjopoulos-Sternberg B.Immunomicelles: Targeted pharmaceutical carriers for poorly soluble drugs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100, № 10. P. 6039-6044.

50. Rabinow B.E.Nanosuspensions in drug delivery // Nat Rev Drug Discov. 2004. Vol. 3, № 9. P. 785-96.

51. Kavimandan N.J., Losi E., Peppas N.A. Novel delivery system based on complexation hydrogels as delivery vehicles for insulin-transferrin conjugates // Biomaterials. 2006. V. 27, № 20. P. 3846-54.

52. Валуев JI. И., Валуева Т. А., Валуев И. Л., Платэ Н. А. Полимерные системы для контролируемого выделения биологически активных соединений // Успехи биологической химии. 2003. Т. 43, С. 307-328.

53. Shuai X., Merdan Th., Schaper А. К., Xi Fu, Kisse Th. Core-Cross-Linked Polymeric Micelles as Paclitaxel Carriers // Bioconjugate Chem. 2004. V. 15, P. 441-448.

54. Drive G., Gascon A.R., Hernandez R.M., Dominguez-Gil A., Pedraz J.L. Techniques: new approaches to the delivery of biopharmaceuticals. // Trends Pharmacol. Sd. 2004. V. 25, P. 382-387.

55. Riess J.G. Oxygen carriers ("blood substitutes") // Raison d'Etre, chemistry, and some physiology Chemical Reviews. 2001. V. 101, Iss. 9. P. 2797-2919.

56. Torchilin V.P. Structure and design of polymeric surfactant-based drug delivery systems. J Control Release. 2001. V. 73, № 2-3. P. 137-72.

57. Балабушевич Н.Г., Зимина Е.П., Ларионова Н.И. Включение каталазы в полиэлектролитные микросферы из меламинформальдегида, декстрансульфата и протамина // Биохимия. 2004. Т. 69, № 7. С. 937-944.

58. Van de Weert М, Hennink WE, Jisko Ot W. Protein instability in poly(lactic-co-glycolic acid) microparticles // Pharm. Res. 2000. V. 17, P. 1159-1167.

59. Bilati U., Alleman E., D О Elker E: Strategic approaches for overcoming peptide and protein instability within biodegradable nano- and microparticles // Eur. J. Pharm. Biapharm. 2005. V. 59, P. 375-388.

60. Tracy M.A: Development and scale-up of a microsphere protein delivery system II Biatechnol. Prog. 1998. V. 14, P. 108-115.

61. Woodle M.C., Engbers C.M., Zaiipsky S. New amphipatic polymer-lipid conjugates forming long-circulating reticuloen-dothelial system-evading liposomes // Bioconjug. Chem. 1994. № 5. P. 493-496.

62. Morpurgo M., Veronese F.M. Conjugates of peptides and proteins to polyethylene glycols // Methods Mol Biol. 2004. V. 283, P. 45-70.

63. Pang S.N. J., Final report on the safety of polyethylene glycols) (PEGs) 6, 8,32, 75,150, 14M//J. Am. Coil. Toxicol. 1993. V. 12, P. 429-456.

64. Graham LM. PEGASPARAGINASE: a review of clinical studies // Adv. Drug Deliv. Rev. 2003. V. 55, P. 1093-1102

65. Wang YS., Youngster S., Grace M., Bausch J., Bordens R., Wyss D.F. Structural and biological characterisation of pegylatcd recombinant interteron u-2b and its therapeutic implications //Adv. Drug. Deliv. Rev. 2002. V. 54, P. 547-570.

66. Pasut G, Guiotto A, Veronese E.M. Protein, peptide and non-peptide drug PEGylation for therapeutic application // Expert Opin. Ther. Patents. 2004. V. 14, P. 859-894.

67. Somack R., Saifer M.G.P., Williams L.D. Preparation of long-acting superoxide dismutase using high molecular weight poly(ethylene glycol) (41 000-72000 Da) // Free Rad. Res. Commun. 1991.12-13, Pt 2. P. 553-562.

68. Veronese FM, Harris JM. Introduction and overview of peptide and protein pegylation. // Adv Drug Deliv Rev. 2002. V. 54, № 4. P. 453-6.

69. Aucetip C. Pharmacokinetics of pegylated interferons: what is misleading? // Dig. Liver Dis. 2004. Vol. 36, Suppl. 3. P. S334-S339.

70. Friman S, Egestad B, Sjovall J, Svanvik J. Hepatic excretion and metabolism of polyethylene glycols and mannitol in the cat // J Hepatol. 1993. Jan;17. № 1. P. 48-55.

71. Kawai F. Microbial degradation of polyethers // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 58, P. 30-38.

72. Breslow D.S. Biologically active synthetic polymers // Pure Appl. Chem. 1976. V. 46, P. 103-113.

73. Maeda H. Pharmacological uniqueness and clinical effects, in: H. Maeda, K. Edo, N. Ishida (Eds.), Neocarzinostation: The Past, Present and Future of Anticancer Drugs, Springer, Tokyo, 1997

74. Коршак В.В., Штильбан М.И. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. Москва, «Наука», 1984.264.

75. Zhang Y.Q., Zhou W.L., Shen W.D. Synthesis, characterization and immunogenicity of silk fibroin-L-asparaginase bioconjugates. // J. Biotechnol. 2005. V. 120, №3. P. 315-26.

76. Vieth W.R., Venkatasubramanian K. Collagen-immobilized enzyme systems // Methods Enzymol. 1976. V. 44, P. 243-63.

77. Maksimenko A.V., Torchilin V.P. Water-soluble urokinase derivatives with increased affinity to the fibrin clot // Thromb Res. 1985. V. 38, № 3. P. 289-95.

78. Kohda J., Kawanishi H., Suehara K., Nakano Y., Yano T. Stabilization of free and immobilized enzymes using hyperthermophilic chaperonin // J. Biosci. Bioeng. 2006. V. 101, №2. P. 131-6.

79. Rybak S.M., Saxena S.K., Ackerman E.J., Youle R.J. Cytotoxic potential of ribonuclease and ribonuclease hybrid proteins // J. Biol. Chem. 1991. V. 266, № 31. P. 21202-21207.

80. Bartholeyns J., Baudhuin P. Inhibition of Tumor Cell Proliferation by Dimerized Ribonuclease // PNAS. 1976. V. 73, P. 573-576.

81. Poznansky M.J. Targeting enzyme albumin conjugates. Examining the magic bullet // Ann NYAcadSci. 1987. V. 507, P. 211-219.

82. Allen T.M., Murray L., Bhardwaj D., Poznansky M.J. Alpha-Glucosidase-albumin conjugates: effect of chronic administration in mice // J. Pharmacol. Exp. Ther.1985. V. 234, P. 250-254.

83. Mao G.D., Poznansky M.J. Superoxide dismutase: improving its pharmacological properties by conjugation with human serum albumin // Biomater. Artif .Cells Artif Organs. 1989. V. 17, № 3. P. 229-244.

84. Remy M.H., Poznansky M.J. Immunogenicity and antigenicity of soluble cross-linked enzyme/albu-min polymers: Advantages for enzyme therapy // Lancet. 1978. V. 2, № 8080. P. 68-70.

85. Wong K, Cleland LG, Poznansky M.J. Enhanced anti-inflammatory effect and reduced immunoge-nicity of bovine liver superoxide dismutase by conjugation with homologous albumin // Agents Actions. 1980. Vol. 10, № 3, P.231-239.

86. Poznansky M.J., Shandling M., Salkie M.A., Elliott J.F., Lau E. Advantages in the use of L-aspara-ginase-albumin polymer as an antitumor agent // Cancer Res. 1982. V. 42, № 3. P. 1020-1025.

87. Горячева Л.К., Пономарева Р.Б., Кузнецова Н.П., Самсонов Г.В. Статистические и регулярные гетероолигопротеины на основе сыворотосного альбумина человека и панкреатисческой РНКазы // Высокомолекулярные соединения. 1989. Т.31, С.17-21.

88. Горячева Л.К., Медведев М.Л., Самсонов, Г.В., Пономарева Р.Б. Гетероолтгопротеины, содержащие панкреатическую рибонуклеазу ферментныеконъюгаты пролонгированного действия // Вопросы Мед. Химии. 1990. т 36, №5. С. 4-6.

89. Горячева JI.K., Самсонов, Г.В., Пономарева Р.Б., The effect of chemical modification of ribonuclease A by serum albumin on its catalytic properties // Prikl. Biokhim. Mikrobiol. 1989. V. 25, №5. P. 599-603.

90. Martin MT, Plou FJ, Alcade M, Ballesteros A: Immobilisation on Eupergit С of cyclodextrin glucosyltransferase (CGTase) and properties of the immobilised biocatalyst // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. 2003. V. 21, P. 299-308.

91. Salmaso S., Semenzato A., Bersania S., Chinol M., Paganelli G., Caliceti P. Preparation and characterization of active site protected poly(ethylene glycol)-avidin bioconjugates // Biochim. Biophys. Acta. 2005. V. 1726, № 1. P. 57-66.

92. Caliceti, P. SchiavonO., Sartore L., Monfardini C., Veronese F.M. Active site protection of proteohtic enzymes by polyethylene glycol) surface modification // J. Bioact. Biocomp. Polyrn. 1993. №8. P. 41-50.

93. Hoa L.F., Lia S.Y., Lin S.C., Hsu W.H. Integrated enzyme purification and immobilisation processes with immobilised metal affinity adsorbents // Process Biochem. 2004. V. 39, P. 1573-1581.

94. Nouaimi M., Moschel K., Bisswanger H. Immobilization of trypsin on polyester fleece via different spacers // Enzym. Microb. Technol. 2001. V. 29, P. 567-574.

95. Yodoya S, Takagi T, Kurotani M, Hayashi T, Furuta M, Oka M, Hayashi T: Immobilization of bromelain onto porous copoly(g-methyl-L-glutamate/L-leucine) beads. // Europ. Polym. J. 2002. V. 39, P. 173-180.

96. Huang Y., Komatsu Т., Wang R.M., Nakagawa A., Tsuchida E. Poly(ethylene glycol)-conjugated human serum albumin including iron porphyrins: surface modification improves the 02-transporting ability// Bioconjug. Chem. 2006. V. 17, № 2. P. 393-8.

97. Configliacchi E., Razzano G., Rizzo V., Vigevani A. HPLC methods for the determination of bound and free doxorubicin, and of bound and free galactosamine, in methacrylamide polymer-drug conjugates//!. Pharm. Biomed. Anal. 1996. V. 15, № 1. P. 123-129.

98. Veronese F.M., Sacca В., Schiavon 0., Caliceti P., Orsatti L., Orsolini P. PEG-peptide and protein delivery: a procedure to identify the PEGylation site // 26th Proc. Int. Symp. Controlled Release Bioact. Mater., Boston, MA, 1999.

99. Vasandani V.M., Wu Y.N., Mikulski S.M., Youle R.J., Sung C. Molecular determinants in the plasma clearance and tissue distribution of ribonucleases of the ribonuclease A superfamily // Cancer Res. 1996. V. 56, № 18. P. 4180-4186.

100. Harder J., Schroder JM. RNase 7, a Novel Innate Immune Defense Antimicrobial Protein of Healthy Human Skin // The Journal Of Biological Chemistiy. 2002. V. 277, №. 48. P. 46779-46784

101. Domachowske J.B., Dyer K.D., Bonville C.A., Rosenberg H.F. Recombinant human eosinophil-derived neurotoxin/ RNAse 2 functions as an effective antiviral agent against respiratory syncytial virus//J. Infect. Dis. 1998. V. 177, P. 1458-1464.

102. Грибенча С. В., Поцелуева JI. А., Баринский И. Ф., Деев С. М., Баландин Т. Г., Лещинская И. Б. Защитная активность РНКазы Bacillus intermedius у морских свинок и кроликов, зараженных уличным вирусом бешенства // Вопросы вирусологии. 2006. №5. С. 41.

103. Ilinskaya O.N., Dreyer F., Vock E. Microbial ribonucleases as anti-proliferative agents // 6th Int.Meet. on Ribonucleases, Bath, UK, 2002, P.106-107.

104. Аликин Ю.С.,Клименко В.П.,Сенженко Л.П. Использование препаратов на основе эндонуклеазы Serracia marcescehs против респираторных болезней телят // Актуал. вопр. ветеринарии. Новосибирск, 1997.-С.13-14.

105. D'Alessio G., Riordan J.F. Ribonucleases: Structures and Functions. New York: Academic Press, 1997. 670 p.

106. Raines R. T. Ribonuclease A //Chem. Rev. 1998. V. 98, P. 1045 -1065.

107. Makarov A. A., Ilinskaya O.N. Cytotoxic ribonucleases: molecular weapons and their targets // FEBS Lett. 2003. V. 540, № 1-3. P. 15-20.

108. Matousek J. Ribonucleases and their antitumor activity // Сотр. Biochem. Physiol. С Toxicol. Pharmacol. 2001. V. 129, P. 175-191.

109. Deutscher M.P., Li Z. Exoribonucleases and their multiple roles in RNA metabolism // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2001. V. 66, P. 67-105.

110. Лобзина Ю.В., Козлов C.C. Клещевой энцефалит // Медицинская газета электронная версия Медицинская газета > № 34 —14 мая 2003 г. >

111. Хомов В.В. Новосибирск: новая технология получения рибонуклеазы. гсс.ги./новости 10/12/2001 http://rcc.ru/Rus/?ID=10019

112. Newton D.L., Rybak S.M. Unique recombinant human ribonuclease and inhibition of Kaposi's sarcoma cell growth // J. Natl. Cancer Inst. 1998. V. 90, P. 1787-1791.

113. Maeda Т., Mahara K., Kitazoe M., Futami J., Takidani A,, Kosaka M., Tada H., Seno M., Yamada H. RNase 3 (ECP) is an extraordinarily stable protein among human pancreatic-type RNases. // J. Biochem. (Tokyo) 2002. V. 132, P. 737-742.

114. Leland P.A., Raines R.T. Cancer chemotherapy ribonucleases to the rescue // Chem. Biol. 2001. V. 8, P. 405-413.

115. Saxena S. K., Shogen K., Ardelt W. Onconase and its therapeutic potential // Lab. Med. 2003. V. 34, P. 380-387.

116. Schein С.Н. From housekeeper to microsurgeon: the diagnostic and therapeutic potential ofribonucleases//Nat Biotechnol. 1997. V. 15, P. 6. P. 529-36.

117. Han J.Q.; Barton D.J. Activation and evasion of the antiviral 2'-5' oligoadenylate synthetase/ribonuclease L pathway by hepatitis С virus mRNA // RNA. 2002. V. 8, №4. P. 512-25.

118. Буеверов A.O. Современная терапия хронических гепатитов // Русский Медицинский Журнал. 1997. Т. 5, № 22

119. Cole J.L., Carroll S.S., Kuo L.C. Stoichiometry of 2',5'-oligoadenylate-induced dimerization of ribonuclease L. A sedimentation equilibrium study // J. Biol. Chem. 1996. V. 271, P. 8. P. 3979-81.

120. Коваленко ГА., Долгих MC., Лапик А.С. Влияние нуклеаз на клетки и организм животных: клеточные механизмы их противовирусного действия. // Материалы всесоюзной конференции «Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование». Рига 1985, с. 19-23.

121. Салганик Р.И. Ферменты побеждают вирусы // Наука в СССР. 1985. № 4, С. 98-103.

122. Коваленко Г.А. Влияние панкреатических нуклеаз на синтез тирозинамино-трансферазы, индуцированный гидрокартизоном в печени крыс // Изв. СО АН СССР. 1984. №6, серия биол. наук. Вып. 1.

123. Smith А. Е., Helenius Ari How Viruses Enter Animal Cells // Science 2004. V. 304, P. 237-242.

124. Быковский А.Ф., Ершов ФИ Карамышева В.Я. Атлас вирусней цитопатологии. // М. Медицина 1975.

125. Коваленко Г.А МайстренкоАГ, Христомова Н.Б. Салганик Р.И. Электронно-микроскопическое изучение механизма специфичности противовирусного действия панкреатической дезоксирибонуклеазы // Известия СО АН СССР 1985. вып 1, с. 117121.

126. Куриненко Б.М., Нехорошкова З.М., Булгакова. P.M. Стимуляция рибонуклеазами неспецифических факторов защиты в организме экспериментальных животных // Антибиотики и химиотерапия. 1995. Т. 40, №7. С. 30-34.

127. Youle R J, Wu Y.N., Mikulski S.M., Shogen K., Hamilton R.S., Newton D., D'Alessio G., Gravell M. RNase inhibition of human immunodeficiency virus infection of H9 cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91, № 13. P. 6012-6016.

128. Saxena S.K., Sirdeshmukh R., Ardelt W., Mikulski S.M., Shogen K., Youle R.J. Entry into Cells and Selective Degradation of tRNAs by a Cytotoxic Member of the RNase A Family // The Journal of Biological Chemistry. 2002. V. 277, № 17, P. 15142-15146.

129. Hansen R, Oren M. p53; from inductive signal to cellular effect.// Curr. Opin. Genet. Dev. 1997. V. 7, № 1. p. 46-51.

130. Earnshaw W.C., Martins L.M., Kanfmann S.H. Mammalian caspases; structure, activation, substrates and functions during apoptosis // Annu. Rev. Biochem. 1999. V. 68, P. 383-424

131. Куриненко Б.М. Давыдов Р.Э., Булгакова Р.Ш., Калачева Н.В. Зависимость биологической активности бактериальной РНКазы от некоторых энзиматических свойств// «Методы получения, анализа и применения ферментов.» Рига 1990, С. 115.

132. Futami J., Seno М., Ueda М., Tada Н., Yamada Н. Inhibition of cell growth by a fused protein of human ribonuclease 1 and human basic fibroblast growth factor // Protein Eng. 1999. V. 12, № 11. P. 1013-1019.

133. Suwa Т., Ueda M., Jinno H., Ozawa S., Kitagawa Y., Ando N., Kitajima M. Epidermal growth factor receptor-dependent cytotoxic effect of anti-EGFR antibody-ribonuclease conjugate on human cancer cells //Anticancer Res. 1999. V. 19, P. 4161-4165

134. Gaur D., Swaminathan S., Batra J. K. Interaction of human pancreatic ribonuclease with human ribonuclease inhibitor. Generation of inhibitor-resistant cytotoxic variants // J. Biol. Chem. 2001. V. 276, P. 24978-24984.

135. Leland P.A., Schultz L.W., Kim B.-M., Raines R.T. Ribonuclease A variants with potent cytotoxic activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95, P. 10407-10412.

136. Kobe В., Deisenhofer J. A structural basis of the interactions between leucine-rich repeats and protein ligands // Nature. 1995. V. 374, P. 183-186.

137. Nitta K., Takayanagi G., Kawauchi H., Hakomori S. Isolation and characterization of Rana catesbeiana lectin and demonstration of the lectin-binding glycoprotein of rodent and human tumor cell membranes // Cancer Res. 1987. V. 47, P. 4877-4883.

138. Ilinskaya O., Decker K., Koschinski A., Dreyer F., Repp H. Bacillus intermedius ribonuclease as inhibitor of cell proliferation and membrane current // Toxicology, 2001. V. 156, P. 101-107.

139. Collier R. J. Understanding the mode of action of diphtheria toxin: a perspective on progress during the 20th century// Toxicon. 2001. V. 39, P. 1793 -1803.

140. Olsnes S., Kozlov J. V. Ricin // Toxicon. 2001. V. 39, P. 1723 -1728.

141. Lord J. M., Roberts L. M. Toxin entry: retrograde transport through the secretory pathway III Cell Biol. 1998. V. 140, P. 733 -736.

142. Haigis M.C., Raines, R.T. Secretory ribonucleases are internalized by a dynamin-independent endocytic pathway // J Cell Sci. 2003. V. 116, Pt. 2. P. 313-324.

143. Lee J.E., Raines R.T. Cytotoxicity of Bovine Seminal Ribonuclease: Monomer versus Dimer. // Biochemistry. 2005, V. 44, P. 15760-15767.

144. Moroianu J., Riordan J. F. Nuclear translocation of angiogenin in proliferating endothelial cells is essential to its angiogenic activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91, № 5. P. 1677-81.

145. Kim J.-S., Soucek J., Matousek J., Raines R. T. Catalytic activity of bovine seminal ribonuclease is essential for its immunosuppressive and other biological activities // Biochem. J. 1995. V. 308, P. 547-550.

146. Leland P. A., Staniszewski К. E., Kim B-M., Raines R. T. Endowing Human Pancreatic Ribonuclease with Toxicity for Cancer Cells // J. Biol. Chem. 2001. V. 276, Is 46. P. 43095-43102.

147. Rutkoski T.J., Kurtenl E. L., Mitchelll J. C., Raines R. T. Disruption of Shape-Complementarity Markers to Create Cytotoxic Variants of Ribonuclease A // J. Mol. Biol. 2005. V. 354, P. 41-54.

148. Куриненко Б.М. Депонировано ВИНИТИ, 1979, №4422-79

149. Skvor J„ Lipovova P„ Pouckova P„ Soucek J„ Slavik T„ Matousek J. Effect of wheat leaf ribonuclease on tumor cells and tissues // Anticancer Drugs. 2006 V.17, № 7. P. 815-823.

150. Benito A., Ribo M., Vilanova M. On the track of antitumour ribonucleases // Mol. BioSyst. 2005.№ \f p. 294 302

151. Sica F., Di Fiore A., Merlino A., Mazzarella L. Structure and Stability of the Non-covalent Swapped Dimer of Bovine Seminal Ribonuclease: an Enzyme Tailored to Evade Ribonuclease Protein Inhibitor // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 36753 36760.

152. Antignani A, Naddeo M, Cubellis MV, Russo A, D'Alessio G. Antitumor action of seminal ribonuclease, its dimeric structure, and its resistance to the cytosolic ribonuclease inhibitor // Biochemistry. 2001. V. 40, P 3492-3496.

153. Sevcik J., Urbanikova L., Leland P.A., Raines R.T. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277, P. 47325-47330.

154. Алексеева И.И., Куриненко Б. M. Клейнер Г.И. Сравнительное изучение противовирусной активности панкреатической и микробной рибонуклеаз // Антибиотики. 1981. № 7. С. 527-532.

155. Newton D.L., Hansen H.J., Mikulski S.M., Goldenberg D.M., Rybak S.M. Potent and specific antitumor effects of an anti-CD22-targeted cytotoxic ribonuclease: potential for the treatment of non-Hodgkin lymphoma // Blood. 2001. V. 97, P. 528-535.

156. Klink T. A., Raines R. T. Conformational Stability Is a Determinant of Ribonuclease A Cytotoxicity. //J. Biol. Chem. 2000.V. 275, Is. 23. P. 17463-17467.

157. Arnold U., Ulbrich-Hofmann R. Kinetic and thermodynamic thermal stabilities of ribonuclease A and ribonuclease В // Biochemistry 1997. V. 36, P. 2166-2172.

158. Pouckova P., Skvor J., Gotte G., Vottariello F., Slavik J.T., Matousek J., Laurents D.V., Libonati M., Soucek J. Some biological actions of PEG-conjugated RNase A oligomers // Neoplasma. 2006. V. 53, №1. P. 79-85.

159. Peters T. All About Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical Applications. Academic Press, San Diego, CA, 1996.

160. Curry S. Plasma albumin as a fatty acid carrier // Advances in Molecular and Cell Biology, 2004, V. 33, P. 29-46.

161. Horsey P.J. The Cochrane 1998 Albumin Review not all it was cracked up to be // European Journal of Anesthesiology 2002. V. 19, P. 701-704.

162. Шалаева Т.И., Добрецов Г.Е., Родман В.Г. Перераспределение альбумина между кровью и перитонеальном экссудате при заболеваниях органов брюшной полости //Медицинская биохимия. 2005. Т. 51, вып. 2. С. 206-211.

163. Simionescu М., Gafencu A., Antohe F. Transcytosis of plasma macromolecules in endothelial cells: a cell biological survey // Microsc. Res. Tech. 2002 V. 57, № 5. P. 269288.

164. Ghinea N., Eskenasy M., Simionescu M., Simionescu N. Endothelial albumin binding proteins are membrane-associated components exposed on the cell surface // J. Biol. Chem. 1989. V. 264, P. 4755-4758.

165. Tiruppathi C., Finnegan A., Malik A.B. Isolation and characterization of a cell surface albumin-binding protein from vascular endothelial cells // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1996. V. 93, P. 250-254.

166. Schnitzer J.E., Oh P. Albondin-mediated capillary permeabilityto albumin. Differential role of receptors in endothelial transcytosis and endocytosis of native and modified albumins // J. Biol. Chem. 1994. V. 269, P. 6072-6082.

167. Schnitzer J.E. gp60 is an albumin-binding glycoprotein expressed by continuous endothelium involved in albumin transcytosis // Am. J. Physiol. 1992. V. 262, P. H246-H254.

168. John T.A., Vogel S.M., Tiruppathi C., Malik A.B., Minshall R.D. Quantitative analysis of albumin uptake and transport in the rat microvessel endothelial monolayer // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2003. V. 284, P. L187-L196.

169. Predescu D., Predescu S., Malik A.B. Transport of nitrated albumin across continuous vascular endothelium // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 13932-13937.

170. Van der Vusse G.J., van Bilsen M., Glatz J.F., Hasselbaink D.M., Luiken J.J. Critical steps in cellular fatty acid uptake and utilization // Mol. Cell. Biochem. 2002. V. 239, P. 9-15.

171. Behrens P.Q., Spiekerman, A.M., Brown, J.R. //Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 1975. V. 34, P. 591.

172. Meloun В., Moravek L., Kostka V. Complete amino acid sequence of human serum albumin//FEBS Lett. 1975. V. 58, № 1. P. 134-137.

173. He X.M., Carter D.C. Atomic structure and chemistry of human serum albumin. // Nature. 1992. V. 358, P. 209-215.

174. Walji F., Rosen A., Hider R.C. The existence of conformally labile (preformed) Drug Binding Sites in Human Serum Albumin as Evedenced by optical Rotation Mesurements // J. Pharm. Pharmacol. 1993. V. 45, P. 551-558.

175. Грызунов 10.А., Деев А.И., Курышева Н.И., Комарова M.H. Флюоресцентный метод исследования свойств альбумина водянистой влаги // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1999. Т. 127, № 11. Р. 597-600.

176. Carter D.C., Но J.X. Structure of serum albumin // Adv. Protein Chem. 1994. V. 45, P. 153-196.

177. Shrake A., Finlayson J.S., Ross P.D. Thermal stability of human albumin measured by differential scanning calorimetry // Vox Sang. 1984. V. 47, P. 7-18.

178. Tanford C., Buzzel J. G. The viscosity of aqueous solutions of bovine serum albumin betweenpH 4.3 and 10.5 //J. Phys. Chem. 1956. V. 60, P. 225-231.

179. Loeb G. I., Scheraga H. A. Hydrodynamic and thermodynamic properties of bovine serum albumin at lowpH // J. Phys. Chem. 1956. V. 60, P. 1633-1644.

180. Squire P. G., Moser P., O'Konski С. Т. The hydrodynamic properties of bovine serum albumin monomer and dimer // Biochemistry. 1968. V. 7. P. 4261-4271.

181. Feng L., Andrade J. D., Ни C. Z. Scanning tunneling microscopy of proteins on graphite surfaces // Scan. Microsc. 1989. V. 3, № 2. P. 399-410.

182. Carter D.C., He X.M., Munson S.H., Twigg P.D., Gernet K.M., Broom M.B., Miller T.Y. Three-dimensional structure of human serum albumin // Science. 1989. V. 244, P. 11951198.

183. Hagag N., Birnbaum E.R., Darnall D.W: Resonance energy transfer between cysteine-34, tryptophan-214, and tyrosine-411 of human serum albumin // Biochemistry. 1983. V. 22, № 10. P. 2420-2427.

184. Ferrer M.L., Duchowicz R., Carrasco В., Garcia de la Torre G., Acuna U. The Conformation of serum albumin in solution: a combined phosphorescence depolarization-hydrodynamic modeling study// Biophys. J. 2001. V. 80, P. 2422-2430.

185. Киселев M.A., Грызунов Ю.А., Добрецов Г.Е., Комарова M.H. Размер молекулы сывороточного альбумина человека в растворе // Биофизика. 2001. Т. 46, В. 3, Р. 423.

186. Sjoberg В., Mortensen К. The Gibbs-Duhem equation for a mixture of two components at constant V containing N ellipsoids of revolution with semi-axes a, b (= c) // Biophys. Chem. 1994. V. 52, P. 131-138.

187. Oliveri J.R., Craievich A. F. The subdomain structure of human serum albumin in solution under different pH conditions studied by small angle X-ray scattering // Eur. Biophys. J. 1995. V. 24, №2. P. 77-84.

188. Sugio S., Kashima A., Mochizuki S., Noda M., Kobayashi K., Crystal structure of human serum albumin at 2.5 A resolution // Protein Eng. 1999. V. 12, P. 439-446.

189. Bhattacharya A.A., Curry S., Franks N.P. Binding of the general anesthetics propofol and halothane to human serum albumin. High resolution crystal structures // J. Biol. Chem. 2000. V. 275, P. 38731-38738.

190. Svergun D.I., Petoukhov M.V., Koch M.H. Determination of domain structure of proteins from x-ray solution scattering// Biophys. J. 2001. V. 80, P. 2946-2953.

191. Tanford C. "Cohn and Edsall physical chemistry conclusively supports a protein model" // Biophys.Chem. 2003. V. 100, № 1-3. P. 81-90.

192. Oncley J. L. Dielectric behavior and atomic structure of serum albumin // Biophys.Chem. 2003. V. 100, № i3. p. 151-158.

193. Сорокина Д.А. Гетерогенность сывороточного альбумина // Вопросы медицинской химии. 1991. №2. С. 14-17.

194. Gallier J., Rivet P., de Certaines J. 1H- and 2H-NMR study of bovine serum albumin solutions // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Protein Structure and Molecular Enzymology 1987. V. 915, Is. 1. P. 1-18

195. Luzzati V., Witz J. and Nicolaieff A. La structure de la serum albumine de boeu fen solution к pH 5,3 et 3,6: Etude par diffusion centrale absolue des rayons X // J. Mol. Biol. 1961. V.3, P. 379-392.

196. Figge J., Rossing Т.Н., Fencl V. The role of serum proteins in acid-base equilibria // J Lab Clin Med. 1991. V. 117, № 6. P. 453-467.

197. Weber G. Energetics of ligand binding to proteins // Adv. Protein Chem. 1975. V. 29, P. 183.

198. Choi P.K., Bae J.R., Takagi K. Ultrasonic spectroscopy in bovine serum albumin solutions // J. Acoust. Soc. Am. 1990. V. 87, P. 874-881.

199. Gurd F.R.N., Rothgeb T.M. Motions in proteins // Adv. Protein Chemistry. 1979. V. 33, P. 74-165.

200. Peters T. Serum albumin // Adv. Protein Chem. 1985. V. 37, P. 161-1-254.

201. Ивкова М.И., Веденкина H.C., Бурштейн Э.А. Флуоресценция остатков триптофана в сывороточном альбумине // Молек. Биол. 1971. № 5. С. 214-224.

202. Dzhafarov E.S. pH-Dependent conformational transitions of human serum albumin -investigation by tritium labeling // Mol. Bsol.-Engl. Tr. 1991. V. 25, P. 1109-1133.

203. Era S., Ashida H., Nagaoka S., Inouye H., Sogami M. CD-resolved secondary structure of bovine plasma albumin in acid-induced isomerization // Int. J. Pept. Protein Res. 1983 . V. 22, № 3. P. 333-340.

204. Миллер И.Ю., Добрецов Г. Е.,Колчин Ю.А. Анион-связывающие центры сывороточного альбумина человека во время N-F конформационного перехода // Биофизика. 1991. Т. 36, С. 505-508.

205. Koren R., Nissani Е., Perlmutter-Hayman В. The kinetics of the reaction between bovine serum albumin and bilirubin. A second look // Biochim Biophys Acta. 1982. V. 703, № 1. P. 42-48.

206. Dirr HW. Effects of hydrogen ion and fatty acid concentrations on the binding of aflatoxin B1 to human albumin // Biochem. Int. 1987. V. 14, № 4. P. 727-733.

207. Bos O.J., Remijn J.P., Fischer M.J., Wilting J., Janssen L.H. Location and characterization of the warfarin binding site of human serum albumin. A comparative study of two large fragments // Biochem. Pharmacol. 1988. V. 37, № 20. P. 3905-3909.

208. Bos O.J., Remijn J.P., Fischer M.J., Wilting J., Janssen L.H. Mechanism by which warfarin binds to human serum albumin. Stopped-flow kinetic experiments with two large fragments of albumin // Biochem. Pharmacol. 1988. V. 38, № 12. P. 1979-84.

209. Dzhafarov ES: Analysis of the structure of fatty acid-free human serum albumin by tritium labeling // MoL Biol.- Engl. Tr. 1992. V. 26, P. 135-138.

210. Era S., Itoh K.B., Sogami M., Kuwata K., Iwama Т., Yamada H., Watari H. Structural transition of bovine plasma albumin in the alkaline region the N-B transition // Int J Pept Protein Res. 1990. V. 35, № 1. P. 1-11.

211. Suzukida. Resonance energy transfer between cysteine-34 and tiypcophan '214 in human serum albumin. Distance measurements as a function of pH // Biochemistry 1983.

212. Honore B, Pedersen AO. Conformational changes in human scrum albumin studied by fluorescence and absorption spectroscopy. Distance measurements as a funclion of pH and fatty acids // Biochem J. 1989. V. 258, P. 199-201.

213. Wanwimolruk S., Birkett D.J. The effecis of N-B trauaition of human serum albumin on Ihe spicific drug-binding sites //Biochim. Biopliys. Acta. 1982. V. 709, P. 279-284.

214. Niamaa D., Bat-Erdene O., Burshtein E.A. The effect of medium on functional and structural properties of serum albumins. II, The effect of temperature on the N-form of human serum albumin // Mol. Biol. 1984. V. 18, P. 972-978.

215. Loun В, Hage DS: Chiral separation mechanisms in protein-based HPLC columns. 1. Thermodynamicstudies of (R)- and (S)-warfarin binding to immobilized human serum albumin// Anal Chem. 1994. V. 66, № 21. P. 3814-22.

216. Rose H., Conventz M., Fischer Y., Jungling E., Hennecke Т., Kammermeier H, Long-cliain fatty acid-binding to albumin: Re-evaluation with directly measured concentrations // BBA-Lipid. Lipid.Metab. 1994. V. 1215, №3. P. 321-326.

217. Dowiko J.P., Nompleggi D.J. The role of albumin in human physiology and patophysiology? Part III. Albumin and diease states // J. of Parenteral Nutrition. 1991. V. 15, P.476-483.

218. SakataN., Moh A., Takebayashi S. Contribution of superoxide to reduced antioxidant activity of glycoxidative serum albumin // Heart Vessels. 2002. V. 17, № 1. P. 22-29.

219. Liu L., Murray D.K., Dameron C.T., Parker C.J., Rodgers G.M. Biochemical characterization of procoagulant albumin // Thromb Res. 1997. V. 85, № 5. P. 399-411.

220. Zoellner H., Hofler M., Beckmann R., Hufnagl P., Vanyek E., Bielek E., Wojta J., Fabry A., Lockie S., Binder B.R. Serum albumin is a specific inhibitor of apoptosis in human endothelial cells // J Cell Sci. 1996. V. 109, Pt 10. P. 2571-2580.

221. Arid M., Chana R., Lewington A., Brown J., Brunskill N.J. Stimulation of proximal tubular cell apoptosis by albumin-bound fatty acids mediated by peroxisome proliferator activated receptor-gamma // J. Am. Soc. Nephrol. 2003. V. 14, № 1. P. 17-27.

222. Иванов А.И., Сарнацкая B.B., Короленко E.A. Модификация лигандной нагрузки и структуры сывороточного альбумина человека при различных методах выделения // Биохимия. 1996. Т. 61, № 5. С. 903-912

223. Миллер Ю.И., Добрецов Г.Е. Молекулярные основы флуоресцентного метода определения связывающей емкости альбумина сыворотки крови // Биохимия. 1994. № 5. С. 20-28.

224. Bult J.M. РРТА Response to albumin article // BMJ. 2000. V. 320, P. 533.

225. Tsuchida E., Komatsu Т., Matsukawa Y., Hamamatsu K., Wu J. Human serum albumin incorporating Tetrakis(o-pivalamido) phenylporphinatoiron(II) derivative as a totally synthetic 02-carrying hemoprotein // Bioconjug. Chem. 1999. V. 10, P. 797-802.

226. Loun В., Hage D.S. Chiral separation mechanisms in protein-based HPLC columns. 2. Kinetic studies of (R)- and (S)-warfarin binding to immobilized human serum albumin // Anal. Chem. 1996. V. 68, P. 1218-1225.

227. Добрецов ГЕ: Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов, Москва, Наука, 1989.

228. Yamasaki К., Mamyama Т., Kragh-Hansen U., Otagiri М. Characlcrizalion of sile I on human serum albumin: concept about the structure of a drug binding site // Biochim Biophys Acla. 1996. V. 1295. P. 147-157.

229. Yamasaki K, Mamyama T, Yoshimoto K. elal. Interactive binding to the two principal ligand binding sites of human serum albumin: effect of the neuitral-to-base transition // Biochem. Biophys. Acta. 1999. V. 1432, P. 313-323.

230. Jakoby M.G., Covey D.F., Cistola D.P: Localization of tolbutamide binding sites on human serum albumin using titration calorimetry and heteronuclear 2-D NMR // Biochemistry 1995. V. 3, № 1. P. 8780-8787.

231. Bal W., Christodoulou J., Sadler P. J., Tucker A. Multi-metal binding site of serum albumin //Jnorg. Biochem. 1998. V. 70. P. 33-39.

232. Stamler JS, Jaraki 0, Osborne J, Simon DI, Keaney J, Vita J, Singel D, Valeri CR, Loscalzo J. Nitric oxide circulations in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA .1992. V. 89, P. 7674-7677.

233. Spector A. A: Fatty acid binding to plasma albumin // Journal of Lipid Research, 1975. V. 16, P. 165-179.

234. Pedersen A.O., Mensberg K.L., Kragh-Hansen U. Effects ionic strength and pH on the binding of medium-chain fatty acids to human serum albumin // Eur. J. Biochem. 1995. V. 223, P. 395-405.

235. Bhattacharya A.A., Griine Т., Curry S. Crystallographic analysis reveals common modes of binding of medium and long-chain fatty acids to human serum albumin // J. Mol. Biol. 2000. V. 303, P. 721-732.

236. Petitpas I., Grune Т., Bhattacharya A. A., Curry S. Crystal Structures of Human Serum Albumin Complexed with Monounsaturated and Polyunsaturated Fatty Acids // J. Mol. Biol. 2001. V. 314. P. 955-960.

237. Curry S. Beyond expansion: structural studies on the transport roles of human serum albumin // Vox Sang. 2002. V. 83, Suppl 1. P. 315-319.

238. Hamilton J.A., Era S., Bhamidipati S.P., Reed R.G. Locations of the three primary binding sites for long-chain fatty acids on bovine serum albumin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88, P. 2051-2054.

239. Krishnakumar S.S., Panda D. Spatial relationship between the; prodan site, Trp-214, and Cys-34 residues in human serum albumin and loss of stricture through incremental unfolding // Biochemistry 2002. V. 41, P. 7443-7452.

240. Simard J.R., Zunszain P. A., Hamilton J. A., Curry S. Location of high and low affinity atty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis // J. Mol. Biol. 2006. V. 361, № 2. P. 336-351.

241. Hage D.S., Sengupla A. Characterization of the binding of digiloxin and aceiyldigiloxin to human serum albumin by high-performance affinity chromatcigraphy// J Chromatogr. Biomed. Sci. Appt. 1999. V. 72, № 1. P. 91-100.

242. Sengupta A., Hage D.S. Characterization of minor site probes for human serum albumin by high- performance affinity chromatography // Anal. Chem. 1999. V. 71, № 17. P. 38213827.

243. Blauer G, Lavie E, Silfen J. Relative affinities of bilirubin for serum albumins from different species// Biochim. Biophys. Acta. 1977. V. 492. № l.P. 64-69.

244. Sri Ranjini A., Das P.K., Balaram P. Binding constant measurement by hyper-Rayleigh scattering: bilirubin-human serum albumin binding as a case study // J. Phys. Chem. В Condens Matter Mater Surf Interfaces Biophys. 2005. V. 109, № 12. P. 5950-5953.

245. Honore B, Pedersen AO. Conformational changes in human scrum albumin studied by fluorescence and absorption spectroscopy. Distance measurements as a funclion of pH and fatty acids // Blochem. J. 1989. V. 258, P. 199-201.

246. Wennberg R.P., Ahlfors C.E. A different view on bilirubin binding // Pediatrics. 2006. V. 118, №2. P. 846-847.

247. Jacobsen C., Jacobsen J. Dansylation of human serum albumin in the study of the primary binding sites of bilirubin and L-tryptophan // Biochem J. 1979. V. 181, № 1. P. 251-253.

248. Kiernan J. A. Formaldehyde, formalin, paraformaldehyde and glutaraldehyde: what they are and what they do // Microsc. Today. 2000. № 1. P. 8-12.

249. Nimni M.E., D. Cheung, B. Strates, M. Kodama, and K. Sheikh. Chemically modified collagen: a natural biomaterial for tissue replacement // J. Biomed. Mater. Res. 1987. V. 27, P. 741-771.

250. Okuda K., Urabe I., Yamada Y., Okada H. Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds//J. Ferment. Bioeng. 1991. V. 71, P. 100-105.

251. Walt D.R., Agayn V. The chemistry of enzyme and protein immobilization with glutaraldehyde // Trends Anal. Chem. 1994. V. 13, P. 425-430.

252. Rembaum A., Margel S., Levy J. Polyglutaraldehyde: a new reagent for coupling proteins to microspheres and for labeling cell-surface receptors // J. Immunol. Methods. 1978. V. 24, P. 239-250.

253. Tashima Т., Kawakami U., Harada M., Sakata Т., Satoh N., Nakagawa Т., Tanaka H. Isolation and identification of new oligomers in aqueous solution of glutar-aldehyde // Chem. Pharm. Bull. 1987. V. 35, P. 4169-4180.

254. Hardy P.M., Nicholls A.C., Rydon H.N. The nature of glutaraldehyde in aqueous solution //J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1969. V. 10, P. 565-566.

255. Richards F.M., J.R. Knowles. Glutaraldehyde as a protein cross-linkage re-agent // J. Mol. Biol. 1968. V. 37, P. 231-233.

256. Monsan P., Puzo G., Mazarguil H. №ude du mficanisme d'fitablissement des liaisons glutaraldehyde protfiines // Biochimie 1975. V.57, P. 1281-1292.

257. Korn A.H., Feairheller S.H., Filachione E.M. Glutaraldehyde: nature of the reagent // J. Mol. Biol. 1972. V. 65, P. 525-529.

258. Whipple E.B., Ruta M. Structure of aqueous glutaraldehyde // J. Org. Chem. 1974. V. 39, P. 1666-1668.

259. Margel S., Rembaum A. Synthesis and characterization of poly(glutaraldehyde). A potential reagent for protein immobilization and cell separation // Macromolecules. 1980. V. 13, №1. p. 19-24.

260. Tashima Т., Masahiro I., Kuroda Т., Yagi S., Terumichi N. Structure of a new oligomer of glutaraldehyde produced by aldol condensation reaction // J. Org. Chem. 1991. V. 56, P. 694-697.

261. Migneault I., Dartiguenave C., Bertrand M.J., Waldron K.C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking // Biotechniques. 2004. V. 37, № 5. P. 790-796,798-802.

262. Guisan J.M. Aldehyde-agarose gels as activated supports for immobilization stabilization of enzymes//Enzyme Microb. Technol. 1988. V. 10, P. 375-382.

263. Paule J. Polymerization of proteins with glutaraldehide. Soluble molecular-weight markers. // Biochem J. 1973. V. 135, № 4. P. 867-873.

264. Hopwood D., Callen C.R., McCabe M. The reactions between glutaraldehyde and various proteins. An investigation of their kinetics // Histochem. J. 1970. № 2. P. 137-150.

265. Poznansky M. Y. Enzyme-albumin polymers. New approaches to the use of enzymes in medicine. // Appl Biochem Biotechnol. 1984. V. 10, P. 41-56.

266. Avrameas S. Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. Use of the conjugates for the detection of antigens and antibodies // Immunochemistry 1969. № 6. P. 43-52.

267. Peters К., Richards F.M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure // Annu. Rev. Biochem. 1977. V. 46, P. 523-551.

268. Acharya A.S., Sussman L.G., Manning J.M. Schiff base adducts of glutaraldehyde with hemoglobin. Differences in Amadory rearrangement at the a-aminogroups // J. Biol. Chem., 1983, V. 258, № 4.2296-2302.

269. Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques. Academic Press, San Diego, CA. 1996.

270. Lubig R., Kusch P., Roper K., Zahn H. Zum reaktionsmechanismus von glutaraldehyd mit proteinen // Monatsh. Chem. 1981. V. 112, P. 1313-1323.

271. Кузнецова Н.П., Самсонов Г.В .Кинетические исследования поликонденсации биополимеров // ВМС А 1986/ Т. 28, № 3. С. 643-648.

272. Jansen E.F., Tomimatsu Y., Olson А.С. Cross-linking of a-chymotrypsin and other proteins by reaction with glutaraldehyde // Arch. Biochem. Biophys. 1971. V. 144, P. 394400.

273. Кузнецова Н.П., Самсонов Г.В. Исследование поликонденсации молекул биополимеров // ВМС А 1985. т. 27, С. 2611-2614.

274. Chui W.K., Wan L.S. Prolonged retention of cross-linked trypsin in calcium alginate microspheres // J. Microencapsulation 1997. V. 14, P. 51-61.

275. Broun, G.B. Chemically aggregated H20 D20 // Enzymes, p. 263-280. In K. Mosbach (Ed.), Methods in Enzymology, Academic Press, New York. 1976.

276. Bullock, G.R. The current status of fixation for electron microscopy: a review// J. Microsc. 1984. V. 133, P. 1-15.

277. Krogh T.N., Berg Т., Hojrup P. Protein analysis using enzymes immobilized to paramagnetic beads // Anal. Biochem. 1999. V. 274, P. 153-162.

278. Tomer S., Dorsey J.G., Berthod A. Nonionic micellar liquid chromatography coupled to immobilized enzyme reactors // J. Chromatogr. 2001. A V. 923, P. 7-16.

279. Tomimatsu Y., Jansen E.F., Gaffield W., Olson A.C. Physical chemical observations on the б-chymotrypsin glutaraldehyde system during formation of an insoluble derivative // J. Colloid Interface Sci. 1971. V. 36, P. 51-64.

280. Ottesen M., Svensson В. Modification of papain by treatment with glutaraldehyde under reducing and nonreducing conditions // С .R. Trav. Lab. Carlsberg. 1971. V. 35, P. 171185.

281. Jansen E.F., Olson A.C. Properties and enzymatic activities of papain insolubilized with glutaraldehyde//Arch. Biochem. Biophys. 1969. V. 129, P. 221-227.

282. Пономарева Р.Б., Зелепуга E.A., Илларионова Н.Г. Медведев M.JI. Взаимодействие рибонуклеазы Bacillus intermedius 7Р с безлигандным сывороточным альбумином // Прикл. биохим. и микробиол. 1994. Т. 30, С. 88-93.

283. Chen R F. Removal of fatty acids from serum albumin by charcoal treatment // J. Biol. Chem. 1967. V.242, P. 173-181.

284. Ануфриева E.B., Демьяненко Т.Ф., Красилъников B.H., и др. (1980) Тезисы докл. Всес. конф. "Химия пищевых веществ. Свойства и использование биополимеров в пищевых продуктах.", Москва, с.21.

285. Краковяк М.Г., Сычева Е.А., Шевелева Т.В., и др. // Высокомолек. соед. 1989. А31, №1. С. 117-122.

286. Ануфриева Е.В., Краковяк М.Г., Громова Р.А., и др. // ДАН СССР. 1991. № 319. с. 895-898.

287. Peters Т.Н., Reed R.G. Jr. // Proc. FEBS Meeting. Colloq. 1978. B9. V. 50, P. 11-20

288. Anfinsen C.B., Redfield R.R., Choate W.L., Page J., Carroll W.R. Studies on the gross structure, cross-linkages, and terminal sequences in ribonuclease // J Biol Chem. 1954 V. 207, №1. P. 201-210.

289. Голубенко И.Б., Балабан Н.П., Лещинская И.Б. и др. Рибонуклеаза Bacillus intermedius. Очистка на фосфоцелюлозе и некоторые характеристики гомогенного препарата // Биохимия. 1979. Т 44, № 4. 640-647.

290. D'Alessio G., Zofra S., Libonatti M. Action of dimeric ribonucleases on double-stranded RNA // FEBS Lett. 1972. V.24, P. 355-358.

291. Vera J.C. Measurement of microgram quantities of protein by a generally applicable turbidimetric procedure //Anal. Biochem. 1988. V. 1741, P. 87-196.

292. Reibarkh M. Y. a., Nolde D. E., Vasilieva L. I., Bocharov E. V., Shulga A. A., Kirpichnikov M. P., Arseniev A. S. Three-dimensional structure of binase in solution // FEBS Lett 1998. V. 431, P. 250-254.326. http://www.rcsb.org/pdb

293. Vakser I. A., Matar O.G., Lam C.F. A systematic study of low-resolution recognition in protein-protein complexes (Large scale low-resolution docking) // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999. V. 96, P. 8477-8482.

294. Camacho C.J., Gatchell D.W. Successful discrimination of protein interactions // Proteins. 2003. V. 52, P. 92-97.

295. Kobe В., Deisenhofer J. Crystal structure of porcine ribonuclease inhibitor, a protein with leucine-rich repeats //Nature. 1993. V. 366, P. 751-756

296. Иванов A.C. Основы вычислительной химии для медико-биологов // Биомедицинская химия. 2005. Т. 51, №2.152-169.

297. Vakser I.A., Jiang S. Strategies for modeling the interactions of transmembrane helices of G protein-coupled receptors by geometric complementarity using the GRAMM computer algorithm // Methods in enzymology. 2002. V. 343, P. 313-328.

298. Guex N., Diemand A., Peitsch MC. Protein modelling for all // TiBS. 1999. V. 24, P. 364367.

299. Koradi R., Billeter M., Wu'thrich K. MOLMOL. A program for display and analysis of macromolecular structures // J. Mol. Graph. 1996. V. 14, P. 51-55.

300. Lesk A. M., Protein Architecture: A Practical Approach. IRL Press Publishers, 1991.

301. Chen R., Li L., Weng Z. ZDOCK: an initial-stage protein docking algorithm // Proteins. 2003. V. 52, P. 82-87.

302. Zhang C, Vasmatzis G, Cornette JL, DeLisi, C. Determination of atomic desolvation energies from the structures of crystallized proteins // J. Mol. Biol. 1997. V. 267, P. 707726.

303. Camacho C.J., Gatchell D.W., Kimura S.R., Vajda S. Scoring docked conformations generated by rigid-body protein-protein docking // Proteins. 2000. V. 40, P. 525 537.

304. Camacho C.J., Weng Z.P., Vajda S., DeLisi C. Free Energy Landscapes of Encounter Complexes in Protein-Protein Association // Biophys J. 1999, Vol. 76, №. 3. P. 1166-1178.

305. Comeau S.R., Vajdal S., Camacho C.J. Performance of the First Protein Docking Server ClusPro in CAPRI Rounds 3-5 // Proteins. 2005. V. 60, №. 2. P. 239-244.

306. Brooks B.R., Bruccoleri R.E., Olafson B.D., States D.J., Swaminathan S., Karplus M. CHARMM: A program for macromolecular energy minimization, and dynamics calculation //J. Сотр. Chem., 1983. V. 4, P. 187-217.

307. Schaumann Т., Braun W., Wuthrich K. The program FANTOM for energy refinement of polipeptides and proteins using a newton-raphson minimizer in torsion angle space // Biopolymers. 1990. V.29, P. 679-694.

308. К. Suhre & Y.H. Sanejouand, On the potential of normal mode analysis for solving difficult molecular replacement problems. I I Acta Cryst. D 2004. V. 60, ?.196-199.

309. Jones S, Murakami Y. Patch prediction of protein interaction sites: validation of a scoring function for an online server// Lecture Notes in Bioinformatics LNBI. 2007. V.4414 P. 303-113.

310. Pang Y., Buck M., Zuiderweg E.R.P. Backbone Dynamics of the Ribonuclease Binase Active Site Area Using Multinuclear (15N and 13 CO) NMR Relaxation and Computational Molecular Dynamics // Biochemistry 2002. V. 41, P. 2655-2666.

311. Лещинская И.Б., Клейнер Г.И., Волкова Т.И. Метод выдаления и очистки щелочной рибонуклеазы Bacillus intermediu //Прикладная биохимия и микробиология. 1981, Т. 17, №2,241-246.

312. Ягодина Л.О., Шленкин В.И., Альтшулер А.Е. Особенности рн-зависимой температурной денатурации спин-меченной бактериальной рибонуклеазы из Bacillus intermedius // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. 1999. № 2

313. Libonatti М., Gotte G. Oligomerization of bovine pancreatic ribonuclease A: structural and functional features of its multimers // Biochem. J. 2004. V. 380, P. 311-327.

314. Gotte G., Vottariello F., Libonati M. Thermal Aggregation of Ribonuclease A. A contribution to the understanding of the role of 3D domain swapping in protein aggregation // J. Biol. Chem. 2003. V. 278, P. 10763-10769.

315. Eckert DM, Kim PS. Mechanisms of viral membrane fusion and its inhibition.// Annual Review of Biochemistry. 2001. V. 70. P. 777-810.

316. Лабзин В. С., Сичко Ж.В. Лечение вирусных нейроинфекций нуклеазами. Ленинград 1976;

317. Сичко Ж.В. Нервные формы эпидемического паротита. Автореф. дисс. на соискание уч. Ст. доктора мед. наук Л-1985.

318. Самсонов Г.Б., Кузнецова Н.П., Пономарева Р.Б., Гудкин Л.Р., Мишаева Р.Н. Иммобилизованная панкреатическая РНКаза, обладающая пролонгированной ферментативной активностью и способ ее получения. Авт. Свид. № 1253073,1986.

319. Spector A., Fletcher J.E. Albumin. Structure, biosynthesis, function // FEBS Federation of Turopean Bioch. Sos. 1978. Vol. 50, colloq. В 9, P. 51-60.

320. Kragh-Hansen U. A micromethod for delipidation of aqueous proteins // Anal. Biochem. 1993. V. 210, P. 318-327.

321. Айсанов 3.P., Кокосов A.H., Овчаренко С.И., Хмелькова Н.Г., Цой А.Н., Чучалин А.Г., Шмелев Е.И. Хронические обструктивные болезни легких. Федеральная программа // Consilium medicum. 2000. Т. 2, № 1.

322. Зеленихин П.В., Колпаков А.И., Черепнев Г.В., Ильинская О.Н. Индукция апоптоза опухолевых клеток биназой // Молек. биология. 2005. Т.39, №3. С.457-463.

323. Винна И.А., Карсакевич А .С.// Тез. докл. Всес. итог. конф. "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование", 1989. Рига, С.45-48.

324. Пономарева Р.Б., Зелепуга Е.А., Медведев М.Л. Конъюгаты нуклеаз с безлигандным сывороточным альбумином // Биологические науки. 1992. №2. С. 86-89.

325. Sulkowski E. The saga of IMAC and MIT//Bioassays. 1989.V 10, № 5. P. 170-175.

326. Shier W. Th. Albumin microspheres Lectins as Carriers: preparation and purification of a Concanavalin A Trypsin conjugates // In Methods in Enzymology. 1985. V. 112, P.248-258.

327. Бреслер C.E., Коликов B.M., Катушкина H.B., Пономарева Р.Б., Жданов С.П., Коромальди Е.В. // Коллоидный журнал. 1974. Т. 37, № 4. С. 748-751.

328. Катушкина Н.В., Белаш О.Л. // Коллоидный журнал 1990. Т. 52, № 5. С. 978-982.

329. Hack СЕ, Paardekooper J, Van Milligen F. Demonstration in human plasma of a form of C3 that has the conformation of "C3b-like C3" // J Immunol. 1990. V. 144, № 11. P. 42494255.

330. Bartholeyns J., Baudhuin P. Effect of dimerized ribonuclease A on the intracellular localization of exogenous proteins taken up from the culture medium by hepatoma cells proceedings. //Arch. Int. Physiol. Biochim. 1978. V. 86, № 4. P. 844-5.

331. Friden P.M., Walus L.R., Watson P., Doctrow S.R., Kozarich J.W., Backman C., Bergman H., Hoffer В., Bloom F., Granholm A.C. Blood-brain barrier penetration and in vivo activity of an NGF conjugate // Science. 1993. Vol. 259, №. 5093, pp. 373 377.

332. Kobe В., Deisenho J. Mechanism of ribonuclease inhibition by ribonuclease inhibitor protein based on the crystal structure of its complex with ribonuclease A // J.Mol.Biol. 1996. V. 264, P. 1028-1043.

333. Зелепуга E.A., Пономарева Р.Б., Третьяк Т.М. Коликов В.М., Терпеловская О.Н., Медведев М.Л. Конъюгаты панкреатической рибонуклеазы с безлиганднымсывороточным альбумином человека // Биомедицинская химия. 2003. Т.49, №6. С. 588-597

334. Зелепуга Е.А., Коликов В.М., Катушкина Н.В. Выделение конъюгатов альбумина и рибонуклеаз // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т.40, №1. С. 28-31.

335. Jones S., Thornton J.M. Prediction of protein-protein interaction sites using patch analysis //J. Mol. Biol. 1997. V. 272,P. 133-143.

336. Hubbard S.J., Argos P. Cavities and packing at protein interfaces //Protein Sci. 1994. V. 3, P. 2194-2206.

337. Janin J., Rodier F. Protein-protein interaction at crystal contacts // Proteins. 1995. V. 23, P. 580-587.

338. Vajda S., Sippl M., Novotny J. Empirical potentials and functions for protein folding and binding // Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. № 7, P. 222 228.

339. Larsen T.A., Olson A.J., Goodsell D.S. Morphology of protein-protein interfaces // Structure. 1998. № 6. P. 421^27.

340. Carugo O., Argos P. Protein-protein crystal-packing contacts// Protein Sci. 1997, № 6, P. 2261-2263.

341. Janin J. Specific versus non-specific contacts in protein crystals //Nature Struct. Biol. 1997. № 4. P. 973-974.380. http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/PP/server/index.html

342. Jones S., Thornton J.M. Principles of protein-protein interactions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996. Vol. 93, P. 13-20

343. Veselovsky A.V., Ivanov Yu. D., Ivanov A.S., Archakov A.I., Lewi P.P. Protein-protein interactions: mechanisms and modification by drugs // Janssen Journal of molecular recognition (J. Mol. Recognit.). 2002. V. 15, P. 405-422.

344. Winter C., Henschel A., Kim Wan K., Schroeder M. SCOPPI: a structural classification of protein-protein interfaces. //Nucleic Acids Research 2006, V. 34(Database Issue):D310-D314

345. Raines R.T. Active Site of Ribonuclease A // Nucleic Acids and Molecular Biology. 2004. Vol. 13, P. 19-32.

346. Власов A.B. Рибонуклеазы человека // Биохимия 1998. T 65, №12. С. 1587-1599.387. delCardayre S.B., Raines R.T. A residue to residue hydrogen bond mediates the nucleotide specificity of ribonuclease A // J. Mol. Biol. 1995. V. 252, № 3. P. 328-36.

347. Panov K.I., Kolbanovskaya E.Y., Okorokov A.L., Panova T.B., Terwisscha van Scheltinga A.C., Karpeisky M.Y., Beintema J.J. Ribonuclease A mutant Hisl 19Asn: The role of histidine in catalysis // FEBS Lett. 1996. V. 398, P. 57-60.

348. Thompson J.E., Raines R.T. Value of general acid-base catalysis to ribonuclease A // J.Am. Chem. Soc. 1994. V. 116, P. 5467-5468.

349. Park C, Schultz LW, Raines RT. Contribution of the active site histidine residues of ribonuclease A to nucleic acid binding // Biochemistry. 2001. V. 40, P. 4949-4956

350. Messmore J.M., Raines R.T. Decavanadate inhibits catalysis by ribonuclease A. // Bioconjug. Chem. 2000. V. 11, P. 25-30.

351. Messmore J.M., Raines R.T. Pentavalent organo-vanadates as transition state analogues for phosphoryl transfer reactions // J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122, P. 9911-9916.

352. Trautwein K., Holliger P., Stackhouse J., Benner S.A. Site-directed mutagenesis of bovine pancreatic ribonuclease: Lysine-41 and aspartate-121 // FEBS Lett. 1991. V. 281, P. 275277.

353. Berisio R., Sica F., Lamzin V.S., Wilson K.S., Zagari A., Mazzarella L. Atomic resolution structures of ribonuclease A at six pH values // Acta Crystallogr D Biol. Crystallogr. 2002. V. 58, (Pt 3). P. 441-450.

354. Messmore JM. PhD Thesis, University of Wisconsin, Madison. 1999

355. Haigis M.C.; Kurten E.L.; Abel R.L.; Raines R.T. KFERQ sequence in ribonuclease A-mediated cytotoxicity // J. Biol. Chem. 2002. V. 277, № 13. P. 11576-81

356. Pares X., Nogues M.V., de Llorens R., Cuchillo C.M. Structure and function of ribonuclease A binding subsites // Essays Biochem. 1991. V. 26, P. 89-103. Erratum in: Essays Biochem 1992;27:177.

357. Moussaoui M., Guasch A., Boix E., Cuchillo C., Nogues M. The role of non-catalytic binding subsites in the endonuclease activity of bovine pancreatic ribonuclease A // J. Biol. Chem. 1996. V. 271, № 9. p. 4687-4692.

358. Tanimizu N., Ueno H., Hayashi R. Role of Phel20 in the activity and structure of bovine pancreatic ribonuclease A // J. Biochem. 1998. V. 124, P. 410-416.

359. Chatani E., Tanimizu N., Ueno H., Hayashi R. Structural and functional changes in bovine pancreatic ribonuclease A by the replacement of Phel20 with other hydrophobic residues //J. Biochem. (Tokyo) 2001. V. 129, P. 917-922.

360. Evans T.C. Jr., Benner J., Xu M.-Q. Semisynthesis of cytotoxic proteins using a modified protein splicing element // Protein Sci. 1998. V. 7, P. 2256-2264.

361. Muir T.W., Sondhi D., Cole P.A. () Expressed protein ligation: a general method for protein engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998.V. 95. P. 6705-6710.

362. Quirk D.J., Park C., Thompson J.E., Raines R.T. His—Asp catalytic dyad of ribonuclease A: Conformational stability of the wild-type, D121 N, D121 A, and HI 19A enzymes // Biochemistry. 1998. V. 37, P. 17985-17964.

363. Libonati M., Sorrentino S. Degradation of double-stranded RNA by mammalian pancreatic-type ribonucleases // Methods Enzymol. 2001. V. 341, P. 234-248.

364. Zhang J., Zhang Y.-P., Rosenberg H.F. Adaptive evolution of a duplicated pancreatic gene in a leaf-eating monkey//Nat. Genet. 2002. V. 30, P. 411-415.

365. Xu D., Tsai C.-J., Nissinov R. Hydrogen bonds and salt bridges across protein-protein interfaces // Protein Eng. 1997. V. 10, P. 999-1012.

366. Lo Conte L., Chothia C., Janin J. The atomic structure of protein-protein recognition sites //J. Mol. Biol. 1999. V. 285, P. 2177-2198.

367. Tsai C.-J., Lin S.L., Wolfson H.J., Nissinov R. Studies of protein-protein interfaces: a statistical analysis of hydrophobic effect // Protein Sci. 1997. V. 6, P. 53-64.

368. Tsai C.-J., Nissinov R. Hydrophobic folding units at protein-protein interfaces: Implications to protein folding and to protein-protein association // Protein Sci. 1997.V. 6., P. 1426-1437.

369. Braden B.C., Poljak R.J. Structure and energetics of anti-lysozyme antibodies. In Protein-protein recognition, Oxford University Press: USA; 2000. P. 126-161.

370. Lijnzaad P, Argos P. Hidrophobic patches on protein subunit interfaces: Characteristics and prediction//Proteins. 1997. V. 28, P. 333-343.417. http://monkey.belozersky.msu.su/~mlt/help.html

371. Fabian Glaser, David M. Steinberg, Ilya A. Vakser, and Nir Ben-Tal Residue Frequencies and Pairing Preferences at Protein-Protein Interfaces. // Proteins: Structure, Function, and Genetics 2001. V. 43, P. 89-102.

372. Schellekens H. Immunogenicity of therapeutic proteins: clinical implications and future prospects I I Clin. Ther. 2002. V. 24, P. 1720-1740.

373. Chamberlain P., Mire-Sluis A.R. An overview of scientific and regulatory issues for the immunogenicity of biological products // Dev. Bid. Basel. 2003. V. 112, P. 3-11.

374. Hermeltng S., Crommeltn D.J., Schellekens H, Jisko Ot.W: Structure-immunogenicity relationships of therapeutic proteins // Pharm. Res. 2004. Vol. 21, P. 897-903.

375. Frost H. Antibody-mediated side-effects of recombinant proteins // Tadcol. 2005. V. 209, P. 155-160.

376. Schellekens H. Bioequivalence and the immunogenicity of biopharmaceuticals // Nat. Rev. 2002. V 1, P. 457-462.

377. Casadevall N., Rossert J. Importance of biologic follow-ons: experience with EPO // Best Pract. Res. Clin. Haematol. 2005. V. 18, P. 381-387.

378. Evens A.M., Bennett C.L., Luminari S: Epoetin-indcued pure red-cell aplasia (PRCA): preliminary results from the research on adverse drug events and reports (RADAR) group //Best Pract. Res. Clin. Haematol. 2005. V. 18, P. 481-489.

379. Schellekens H. Immunological mechanismsof EPO -associated pure red cell aplasia // Best Pract. Res Clin. Haematol. 2005. V. 18, P. 473-480.

380. Boven K., Stryker S., Knight J. et al. The increased incidence of pure red cell aplasia with an Eprex formulation in uncoated rubber stopper syringes // Kidney Int. 2005. V. 67, P.2346-2353.

381. Hermeling S., Jiskoot W., Crommelin D., Bornes C., Schellekens H. Development of a transgenic mouse model immune tolerant for human interferon beta // Pharm. Res. 2005. V. 22, №6. P. 847-851.

382. Beintema J.J., Schuller C., Irie M., Carsana A. Molecular evolution of the ribonuclease superfamily //Prog. Biophys. Mol. Biol. 1988. V. 51, № 3. P. 165-92.

Информация о работе

Зелепуга, Елена Александровна
кандидата физико-математических наук
Санкт-Петербург, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Биофизические основы создания новых ферментных препаратов пролонгированного действия - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы