Биофизические аспекты физиологического действия экзогенного О2 на животных

Гольдштейн, Наум Исаакович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биофизические аспекты физиологического действия экзогенного О2 на животных
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Биофизические аспекты физиологического действия экзогенного О2 на животных"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ _им. М. В. ЛОМОНОСОВА___

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 612.015+577

РГБ ОД

ГОЛЬДШТЕЙН НАУМ ИСААКОВИЧ у ' '

БИОФИЗИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЭКЗОГЕННОГО 02"~ НА ЖИВОТНЫХ

03.00.02 -биофизика 03.00.13 - физиология

Автореферат диссертации па соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2000

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова и в отделе медико-биологических исследований фирмы G & L technology GmbH (Германия).

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор А. Я. Потапенко доктор биологических наук, профессор Ю. В. Архипенко доктор биологических наук, профессор С. А. Титов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Институт медико-биологических проблем Министерства здравоохранения РФ

JfiSO

Защита состоится 26 октября 2000 года в час на заседании расширенного Диссертационного Совета Д 053.05.53 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова. Адрес: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория НоВаЯ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. Автореферат разослан «2.4.» сентября 2000 г.

Ученый секретарь Специализированного диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Т. Е. Кренделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Представления о повреждающих эффектах свободнорадикальных или радикалообразующих продуктов одноэлектронного восстановления кислорода в биологических системах являются доминирующими в течение последних трех десятилетий. Основное внимание привлекают такие формы активированного кислорода, как супероксидный радикал Ог", пероксид водорода Н2О2, синглетный кислород 'Ог, гидроксильный радикал "ОН, а также липидные радикалы, образующиеся, в частности, в жидкой фазе при распаде гидроперекисей липидов ROOH (Владимиров и др., 1975; Halliwell, 1995; Скулачев, 1996; Скулачев, 1999). В многочисленных исследованиях было убедительно показано, что окислительные деструктивные процессы, вызываемые повышенными уровнями активированных форм кислорода в конденсированной водной фазе, а также липидными радикалами и гидроперекисями, могут лежать в основе клеточной патологии и сопряженных с нею заболеваний. В целом, результаты этих исследований можно рассматривать как развитие проблемы свободнорадикальной патологии и перекисного окисления в биологических структурах (Тарусов, 1964; Эмануэль, 1964). С этих позиций в настоящее время интерпретируются механизмы сердечно-сосудистой патологии и артериосклероза (Halliwell, Gutteridge, 1988), дегенеративных заболеваний нервной системы (Delanty, Dichter, 1998), аутоиммунных и хронических воспалительных заболеваний (McCord, 1985), старения (Harman, 1968), злокачественного роста (Oberley, Oberley, 1993) и др.

Не менее важными, однако значительно менее изученными, являются представления о биологической роли кислородных радикалов и процессов перекисного окисления в условиях физиологической нормы. Между тем, накапливается все больше фактов, указывающих на важную роль этих активных продуктов и процессов в нормальной жизнедеятельности. Так, отметим представления о важной роли процессов перекисного окисления липидов в функционировании митохондрий в норме (Владимиров и др., 1975). Известно также, что обусловленная генетической неполноценностью нейтрофилов недостаточная продукция супероксида при хроническом грануломатозе влечет за собой нарушение противовоспалительных механизмов и повышенный риск гибели организма от инфекции (Hohn, Lehrer, 1975). Этот пример отражает одну из наиболее полно изученных полезных биологических функций супероксида, продуцируемого активированными фагоцитами и связанную с бактерицидным действием этого радикала (Babior et al., 1973). В последнее время возрос поток новых данных о роли кислородных интермедиатов в защитной функции клеток белой крови (Furukava et al., 1992; Kimura et al., 1993). Регуляторное участие

активированных форм кислорода в жизнедеятельности клетки в норме установлено в процессах клеточного деления (Steinbeck et al., 1994; Moulton et al., 1998), экспрессии генов (Dalton, 1999) и апоптоза (Burdon et al., 1996; Del Bello et al., 1999), а также в реакциях неферментативной регуляции окислительного стресса (Halliwell, Gutteridge, 1989). В связи с проблемой роли кислородных радикалов в норме обращает на себя внимание ряд не получивших до сих пор объяснения фактов, в первую очередь таких как i) относительно высокая доля кислорода, превращаемого в клетке в активированные формы, достигающая в ряде случаев в покое 10-15% (Oshino et al., 1975; Shoaf et al., 1991), ii) многообразие внутриклеточных процессов одноэлектронного восстановления кислорода, приводящих к образованию Oz" (McCord, 1995) и iii) относительное постоянство его внутриклеточной концентрации (Elstner, 1990). Следует согласиться с мнением McCord (1995) о том, что наше понимание биологической - в широком смысле - роли супероксида в нормальном метаболизме клетки остается неполным.

Другой важный аспект этой проблемы в целом, в рамках которого и выполнена настоящее исследование, заключается в том, что существующие в настоящее время представления о роли радикалов О2" основаны исключительно на исследованиях, проведенных в конденсированных средах - водных растворах, суспензиях клеток и субклеточных частиц, а также в тканях. Между тем, для большинства наземных многоклеточных организмов нормальной средой обитания является газовая фаза - атмосфера. В атмосферном воздухе постоянно присутствуют электрически заряженные частицы, представленные ионизированными молекулами составляющих воздух газов и свободными электронами, образующие пул т.н. „аэроионов". К относительно стабильным компонентам аэроионного пула относятся, в частности, кислородные ионы СЬ". Образование этих ионов, представляющих в современной трактовке анион-радикал О2*", постулировалось различными авторами (Чижевский, I960; Loeb, 1967; Krueger, Smith, 1968). В газовой фазе устойчивость СЬ*~ как иона в значительной мере обусловлена формированием кластеров типа Ог*".(Н20)п (Krueger, Sigel, 1981). Физические процессы ионизации кислорода и других атмосферных газов изложены в обзорах и монографиях (Loeb, 1967; Pethig, 1984; Dolezalek, 1985).

Описанные в научной литературе биологические эффекты отрицательных аэроионов обусловлены у высших животных преимущественно воздействием на ЦНС, включая подкорковые структуры и кору головного мозга (Овчарова, 1966; Скоробогатова, 1991). Рефлекторное действие атмосферных газовых ионов может быть реализовано в форме физиологических ответов на изменения поверхностного электрического заряда, проницаемости и ферментативной активности клеток в области носоглотки (Финогенов, 1960

и 1962; Скоробогагова, 1964). Биологические механизмы усиления реакций целостного организма на атмосферные ионы включают вовлечение на подкорковом уровне гипоталамуса (Olivereau, 1970) и гипофиза (Olivereau, Bousquet, 1974), а также функционально связанной с ними коры надпочечников (Wasilewski et al., 1955). Описаны также реакции со стороны других контролируемых аденогипофизом желез внутренней секреции - щитовидной (Gualtierotti, 1968) и гонад (Bocconi, 1970). В то же время, существующие представления и факты о биологическом действии аэроионов, в том числе (^'"-содержащих отрицательных аэроионов, крайне противоречивы. Это обстоятельство послужило основанием для формирования у некоторых авторов скептического отношения к отрицательным аэроионам как биологически активному фактору воздушной среды (Ritter, 1985). Высказываются также сомнения относительно описанных в ряде работ физиологических и терапевтических эффектов искусственно генерируемых отрицательных кислородных ионов (Kröling, 1985; Charry, 1987).

Проведенный нами анализ работ, опубликованных в этой области в период с 1930 по 1990 гг., показал, что основной причиной противоречивости экспериментальных исследований биологической роли и лечебного действия аэроионов является отсутствие надежных методов селективной генерации биологически активных компонентов пула отрицательных кислородных ионов. Между тем, именно эти компоненты и, главным образом, супероксид, нам представляются наиболее важными и интересными.

Биологическая активность атмосферных ионов у млекопитающих реализуется, преимущественно, в результате ингаляции в процессе дыхания. Специфика ингаляционного способа воздействия анион-радикала супероксида газовой фазы на организм обусловлена следующим. Физико-химические характеристики радикала (высокая реакционная способность и короткое время жизни в протон-содержащей водной среде слизистых оболочек носовой полости и носоглотки), особенности строения и физиологии полости носа (вихревой характер движения воздушных потоков и 100%-ное насыщение вдыхаемого воздуха парами воды) позволили заключить, что реализация химической активности ингалируемого радикала Ог" возможна, преимущественно, на уровне слизистой оболочки носовой полости. В этом случае можно ожидать появления физиологических эффектов, обусловленных активацией нервных центров и структур, анатомически и функционально связанных с хеморецепторами полости носа. Существование такого предположенного нами физиологического механизма согласуется с известными данным о функциональной активации гипоталамуса аэроионами (Olivereau, 1970). Кроме того, следовые количества пероксида водорода, относительно стабильного продукта дисмутации супероксида, могут проникать в дистальные отделы дыхательного тракта, вызывая как местные реакции, так и

рефлекторные ответы со стороны бронхов и легких. Это объясняет известные из литературы физиологические реакции глубоких отделов дыхательной системы (Булатов, 1962; Скоробогатова, 1966), недоступных для проникновения собственно заряженных кислородных ионов.

Таким образом, учитывая, что кислородный радикал О2" как составная часть отрицательных аэроионов является постоянным высокоактивным компонентом естественной воздушной среды, понимание механизмов взаимодействия супероксида газовой фазы с биологическими объектами представляет несомненный интерес. Развитие этого научного направления, несомненно, должно способствовать формированию новых представлений о биологической роли кислородных радикалов и процессов перекисного окисления при патологических процессах и в условиях физиологической нормы.

В связи с вышеизложенным, основной целью настоящей работы явилось выяснение биологической роли атмосферного супероксида и механизмов его действия на живые системы, а также изучение процессов адаптации организма к активированным формам кислорода атмосферного воздуха в норме и в условиях экспериментальной и клинической патологии.

Основные задачи работы включали:

1. создание способа селективного генерирования супероксида О/" в газовой фазе и исследование физико-химических, биофизических и биохимических свойств этого радикала;

2. разработку генератора - источника супероксида газовой фазы для экспериментальных биофизических и физиологических исследований и клинического применения;

3. комплексное исследование биологической активности искусственно продуцируемого супероксида и продуктов его превращений при прямом действии в различных моделях на клетках и тканях, а также на целостном организме животных при ингаляционном пути поступления в организм;

4. определение параметров общей токсичности и местного раздражающего действия супероксида газовой фазы и низких концентраций пероксида водорода при ингаляционном пути поступления в организм животных;

5. изучение биологической роли атмосферного супероксида в условиях его элиминации из вдыхаемого воздуха (депривации);

6. исследование эффективности лечебного действия низких концентраций и/или доз активированного кислорода (супероксид, пероксид водорода) при заболеваниях и

состояниях, связанных с усилением эндогенного окислительного стресса, сопровождающихся нарушением метаболических, регуляторных и иммунных механизмов (болезнь Паркинсона, болевой синдром, бронхиальная астма).

Научное значение и новизна работы определяются тем, что:

- доказана идентичность общебиологических и физиологических эффектов Ог" воздушной среды и отрицательных аэроионов;

- установлена биологическая активность супероксида газовой фазы: 1) при прямом воздействии на биологические объекты на клеточном и тканевом уровнях (микроорганизмы, лейкоциты, ткани in vivo и in situ, а также 2) при воздействии на целостный организм млекопитающих (лабораторные животные, человек) при ингаляционном способе поступления в организм;

- показано, что физиологическое действие экзогенного супероксида на целостный организм обусловлено физико-химическими свойствами, характерными для активированных форм кислорода (супероксид, пероксид водорода), и опосредовано преимущественно стимуляцией рецепторов слизистой оболочки носовой полости, связанных с подкорковыми структурами головного мозга;

- установлено, что механизмы биологического действия супероксида газовой фазы на организм млекопитающих, опосредованные рецепторами слизистой оболочки носа, включают уменьшение эндогенного окислительного стресса, активацию гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы, ингибирование активности моноаминоксидаз тканей мозга, и что' эти эффекты вовлечены в комплекс физиологических реакций , вызванных изменениями естественных уровней атмосферного супероксида;

- показана эффективность лечебного применения ингаляций низких концентраций супероксида и низких доз пероксида водорода в экспериментальных моделях на животных, а также в модели боли у человека и у больных (болезнь Паркинсона и бронхиальная астма) и установлено, что механизмы лечебного действия изученных кислородных интермедиатов включают активацию допаминэргической и серотонинэргической нейромедиаторных систем мозга, что сопровождается уменьшением уровня эндогенного окислительного стресса;

обоснованы и развиты представления о роли супероксидного радикала Ог" как жизненно необходимого физико-химического фактора воздушной среды и показано, что в условиях депривации атмосферного супероксида развиваются патологические изменения, ведущие к ускоренной гибели животных, тогда как введение в воздушную среду супероксида в

газовой фазе способствует восстановлению нарушенных функций и предотвращает гибель депривированных животных;

- выдвинута гипотеза о связи между эволюционным формированием основных клеточных функций и присутствием в „бескислородных" условиях на ранних этапах эволюции клетки абиогенных активированных форм кислорода, и с этих позиций приведены аргументы в пользу существования эволюционно детерминированной потребности в супероксиде для реализации жизненных функций современных организмов.

Практическое значение диссертационной работы заключается в том, что

- исследованы условия и разработан способ генерации супероксида в газовой фазе, на основе которого созданы защищенные патентами устройства для генерации супероксида, применимые в условиях биофизического и физиологического эксперимента, а также первые ингаляторы супероксида БАШНОК и рго-1пЬа1®, предназначенные для лечебных целей, и освоено промышленное производство последнего;

- разработаны и прошли клиническую апробацию способы клинического применения ингалятора супероксида рго-1пЬа1® для лечения больных бронхиальной астмой;

- разработаны способы повышения антиноцицептивного действия анальгетиков, основанные на эндоназальном применении активированных форм кислорода и применимые для лечения больных с болевым синдромом;

- разработана, прошла доклинические исследования и находится на клинических испытаниях лекарственная форма на основе пероксида водорода, предназначенная для лечения больных с симптомокоплексом паркинсонизма;

- теоретически и экспериментально обосновано применение ингаляций супероксида как адаптогена для предотвращения и/или уменьшения повреждающего действия физических и химических факторов;

- полученные результаты могут найти применение также для дальнейшей разработки методов профилактики заболеваний, связанных с дефицитом супероксида в воздушной среде замкнутых помещений („чистые помещения", постнатальная медицина и др.).

Способ генерации и ингалятор супероксида, а также способы лечебного применения активированных форм кислорода в лечении больных с симптомокомплексом паркинсонизма и болевым синдромом обладают мировой новизной и защищены патентами в большинстве развитых стран, в том числе в России. На основе сформулированных в работе представлений и принципов возможна разработка способов лечения ряда других заболеваний и создание новых лекарственных форм.

Полученные в работе результаты и сформулированные представления открывают новое направление в исследовании биологической роли и механизмов действия экзогенных форм активированного кислорода в условиях физиологической нормы, их взаимодействия с рецепторными структурами, а также биологических процессов и реакций, развивающихся в ответ на воздействие этих продуктов. Дальнейшее изучение механизмов ответных реакций организма на различных уровнях (нейрогуморальная регуляция, иммунная система, органы дыхания) при воздействии экзогенных активированных форм кислорода может способствовать формированию новых взглядов на этиологию, патогенез и лечение возрастных заболеваний центральной нервной системы и способствовать разработке новых методов их лечения.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены на следующих конференциях, съездах, симпозиумах и совещаниях:

"Сверхслабые свечения в биологии" (Москва, 1969; Москва, 1972); 2-й Всесоюзный биохимический съезд (Ташкент, 1969); 4-й Международный конгресс по радиобиологии (Evion, 1970); "Сверхслабые свечения в медицине и сельском хозяйстве" (Москва, 1971); IV Международный биофизический конгресс (Москва, 1972); Всесоюзное совещание "Защита от вредного воздействия статического электричества в народном хозяйстве" (Северодонецк, 1973); Всесоюзное совещание "Физико-химические основы действия физических факторов на живой организм" (Москва, 1974); Всесоюзная конференция "Физико-математические и биологические проблемы действия электромагнитных полей и ионизации воздуха" (Ялта, 1975); Всесоюзный симпозиум "Свободнорадикальное окисление липидов в норме и патологии" (Москва, 1976); Всесоюзная конференция "Современные проблемы анестезиологии, реаниматологии и интенсивной терапии (Алма-Ата, 1984); Всесоюзная конференция "Применение гипербарического кислорода в медицине" (Москва, 1985); Всесоюзная конференция "Проблемы оценки функциональных возможностей человека и прогнозирование здоровья" (Москва, 1985); Всесоюзные семинары "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине" (Минск, 1985; Рига, 1986, 1987, 1988, 1989); Всесоюзное совещание "Транспорт кислорода и антиоксидантные системы" (Гродно, 1989); 4-й Всесоюзный симпозиум "Гипербарическая оксигенация" (Москва, 1989); Ежегодный симпозиум австрийского общества по изучению легочных заболеваний и туберкулеза (Gmunden, 1995); Ежегодный симпозиум немецкого общества по изучению легочных заболеваний (Bochum, 1996); Конгресс "Tumorschmerz" (Der 2. Kongreß der Deutschen Interdisziplinären Vereinigung für Schmerztherapie, Nürnberg, 1997); Ежегодный конгресс European Respiratory Society (Berlin, 1997); Ежегодный симпозиум немецкого общества по изучению легочных заболеваний (Hamm, 1997); Юбилейная конференция, посвященная 1007

летию дня рождения A.JI. Чижевского (Калуга, 1997); Международный аэрозольный симпозиум "IAS-4" (Санкт-Петербург, 1998); 2-й Российский биофизический съезд (Москва, 1S99); а также обсуждались на научных семинарах и лекциях в университетах, медицинских центрах и высших учебных заведениях городов Берлин (Charité), Берлин (FU), Гамбург, Геттинген, Мюнхен, Нюрнберг, Оснабрюк, Потсдам, Саарбрюкен, Франкфурт-на-Майне, Эрфурт (Германия), Вена (Австрия), Минск (Беларусь), Рим (Италия), Рига (Латвия).

Публикации: Основные результаты представленной к защите работы отражены в 55 научных статьях, включая один обзор автора. Кроме того, по результатам исследований были получены 4 патента Германии, действующие в более, чем 20 странах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, методической части, результатов и обсуждения из оЗ глав, заключения, выводов, приложения, списка публикаций по теме диссертации и списка цитированной литературы. Диссертация содержит^?.} страниц текста, нг таблиц и з.б рисунков и схем; список цитированной литературы насчитывает^^ названий (из них fSí на русском языке и2?.7на иностранных языках). Во "Введении" описано состояние вопроса и приведены научные предпосылки, предшествовавшие началу работы над изложенной в диссертации проблемой. Раздел "Методические аспекты работы" содержит подробное описание специально разработанных для целей биофизических и физиологических исследований методов, а также ссылки на известные методы или описание модификаций последних. В каждом разделе "Результатов и обсуждения" рассмотрено состояние вопроса по соответствующей тематике. В связи с таким построением диссертации, каждый раздел содержит также обсуждение результатов экспериментальных исследований. В главах "Заключение" ку "Выводы" обобщены основные итоги исследований. В "Приложении" приведены заключения по результатам рутинных токсикологических исследований, подтверждающие безвредность экзогенного супероксида и пероксида водорода при описанном в диссертационной работе эндоназальном способе воздействия на организм.

На защиту выносятся следующие основные положения и результаты:

1. Выдвинутые и экспериментально обоснованные представления о том, что в состав естественной воздушной среды входит супероксидный анион-радикал кислорода, физико-химические характеристики и свойства которого идентичны с хорошо изученным in vivo и in vitro супероксидным радикалом Ог'~.

2. Экспериментальные доказательства биологической активности супероксида газовой фазы, реализуемой а) при прямом взаимодействии с биологическими объектами на клеточном (микроорганизмы, лейкоциты) и тканевом (рецепторы полости носа, вкусовые

рецепторы, кожные раны) уровнях, и б) при воздействии на целостный организм млекопитающих (лабораторные животные, человек) при ингаляционном способе поступления в организм.

3. Экспериментальное обоснование выдвинутых представлений о механизмах физиологического действия экзогенного супероксида на организм млекопитающих, включая активацию подкорковых центров нейрогуморальной регуляции (гипоталамус, гипофиз) и нейромедиаторных систем мозга (допаминэргическая, серотонинэргическая) и связанный с последними уровень эндогенного окислительного стресса в отделах мозга (гипоталамус, базальные ганглии).

4. Экспериментальные свидетельства взаимодействия ингалируемого супероксида с рецепторными структурами слизистой оболочки носовой полости, реализуемого посредством неспецифических физико-химических и биохимических механизмов и реакций, характерных для анион-радикала Ог" и пероксида водорода.

5. Экспериментальные доказательства идентичности биологических эффектов О2" и отрицательных аэроионов у животных, в том числе адаптогенное действие, регуляция эндогенного окислительного стресса и активности нейротрансмиттерных систем мозга, активация центров нейрогуморальной регуляции, влияние на ВНД.

6. Клинические доказательства лечебного действия ингалируемого О2" и/или пероксида водорода при лечении больных с симптомокомплексом паркинсонизма и бронхиальной астмой.

7. Доказательства жизненной потребности наземных млекопитающих в экзогенном атмосферном супероксиде и гипотеза о роли абиогенного супероксида в эволюции клетки.

МЕТОДИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАБОТЫ

Решение поставленных задач потребовало привлечения широкого набора современных экспериментальных методов' биофизики и биохимии, модернизации и существенного дополнения ряда из них, а также разработки принципиально новых методов исследования. Для исследования физико-химических свойств и биологической активности экзогенного супероксида возникла необходимость в разработке специальных методов, позволяющих достаточно избирательно и стабильно генерировать радикал Ог" в газовой фазе. В диссертационной работе приведено описание устройства и параметры разработанной и изготовленной нами инжекционной ячейки для генерирования и исследования химической

активности Ог*~ газовой фазы, а также описание и принцип работы ингалятора - генератора супероксида для медико-биологических исследований.

Для исследования биологической роли и жизненной потребности в естественных уровнях атмосферного супероксида были разработаны и изготовлены специальная депривационная камера для животных с электростатическим улавливанием и нейтрализацией электрически заряженных частиц из вдыхаемого воздуха и однотипная по конструкции камера для контрольных животных, обеспечивающая сохранение нормальных уровней атмосферных газовых ионов. Мониторинг аэроионов осуществляли с помощью анализатора аэроионов САИ-ТГУ-ббм; для определения содержания аммиака и СОг внутри камер применяли соответствующие газоаналитические трубки и прибор „Pump-Automat accuro 2000" фирмы Dräger (Германия).

Были существенно усовершенствованы методы оценки биофизических и физиологических показателей экспериментальных животных. В частности, были разработаны и изготовлены высокочувствительный хемилюминометр, электронные приборы и устройства для определения суммационно-порогового показателя и автоматической регистрации поведенческих реакций, барокамера для экспозиции мелких лабораторных животных при избыточном давлении (до 4 ати) кислорода, электростатически нейтральные "домики" для проведения индивидуальных ингаляций супероксида у крыс и выносные электроды - источники супероксида для воздействия на животных в группе. Специальные устройства были изготовлены также для проведения исследований на микроорганизмах.

Из серийных приборов и устройств в работе использовали спектрофотометры Hitachi 150-20, Shimadzu UV-2101 PC, Beckman-35, фотоэлектроколориметр Model 257 (Ciba-Corning), ЭПР спектрометр РЭ 1307, Randall-Selitto анальгезиметр (Ugo Basile), аппарат ламинарного потока воздуха Нега Safe (Heraeus instruments), аппарат для мониторинга атмосферного воздуха DCH 24Т (Air Flow, Germany), электронный микроскоп JEM lOOK, гелий-неоновый лазер с полосой испускания 632,8 нм. В клинических исследованиях для исследования параметров дыхательной функции у человека использовали аппараты Pneumoscreen (Erich Jaeger) и Spiro 501 (Bosch).

Объектами исследований служили лабораторные крысы (беспородные и линии Вистар), мыши (беспородные, С57ыаск и СЗН), морские свинки, а также штаммы микроорганизмов Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, E. coli, Bacillus subtilis, Bacillus mesenthericus, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoneae, Pseudomona aeruginosa, Salmonella typhimurium, Candida albicans. В медико-биологических исследованиях принимали участие

практически здоровые добровольцы обоего пола, а также больные с симптомокомплексом паркинсонизма и бронхиальной астмой.

В биохимических и физиологических исследованиях использовали широкий набор реактивов и методов для генерации и ингибиторного анализа супероксида и синглетного кислорода (СОД, каталаза, тетранитрометан, цитохром с, ксантиноксидаза, ксантин, нитросиний тетразолиевый, хлорофиллы, каротиноиды, эозин, азид натрия, 1,4-диазобицикло{2,2,2}октан) и исследования перекисного окисления липидов (определение ТБК-активных продуктов, диеновых конъюгатов), а также лекарственные и биологически активные вещества (фенобарбитал, закись азота, элеутерококк, наркотические и ненаркотические анальгетики, ниаламид, налоксон, резерпин, нейротоксин 1 -метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин и др.).

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с применением программ SPSS (версия б. 1 для Microsoft Windows) и STATISTIKA.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. СУПЕРОКСИД КАК БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ КОМПОНЕНТ ПУЛА ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ АЭРОИОНОВ

1.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ОТРИЦАТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫХ ПРОДУКТОВ ИОНИЗАЦИИ

КИСЛОРОДА В "ТИХОМ" КОРОННОМ РАЗРЯДЕ

Основной задачей исследований на этом этапе была идентификация биологически активных компонентов пула искусственных отрицательных аэроионоа. Для ее решения были предприняты 1) теоретический анализ вероятности образования видов кислородных ионов в электрическом разряде, 2) разработка методов генерации и анализа отрицательно заряженных продуктов ионизации газов в «тихом» коронном разряде и 3) изучение физико-химических свойств газового иона - основного продукта ионизации чистых газов и смесей (N2, О2, N2/O2, воздух) и вероятного претендента на роль биологически активного начала отрицательных аэроионов.

Известно, что в процессах естественной ионизации атмосферных газов основными источниками энергии являются космические лучи, радиоактивные элементы литосферы и атмосферы, ультрафиолетовое излучение и электрические разряды. Энергия этих источников достаточна для ионизации молекул основных атмосферных газов - азота (14,5 эВ) и кислорода (13,5 эВ). В естественных условиях средняя скорость ионизации газов воздуха составляет около 10 пар ионов см'3 с"1 (Pethig, 1984). При искусственной генерации газовых ионов качественный состав и количественное соотношение образующихся биологически

активных продуктов определяются способом и условиями ионизации, газовым составом и влажностью среды, скоростью движения газа, расстоянием объекта исследования от источника ионов и рядом других параметров. Для получения газовых ионов в лабораторных и клинических целях в разное время было описано применение ионизаторов, основанных на термоионной эмиссии, действии а- и р-частиц или у-излучения, и коронного разряда. В настоящее время предпочтение отдается коронным ионизаторам, значительно более эффективным по сравнению с термоионными и имеющим ряд преимуществ перед опасными в применении и относительно громоздкими изотопными. В основе использования коронного разряда для генерации аэроионов лежит возбуждение и ионизация нейтральных молекул газов в сильном электрическом поле, в котором перепад потенциала на расстоянии порядка размера электронной оболочки молекулы ионизируемого газа достигает или превышает потенциал ионизации. Эти условия обычно возникают на концах очень острых электродов, находящихся под высоким напряжением. Величина электрического поля на кончике единичного игольчатого электрода может быть упрощенно выражена уравнением: Е = 2 U/a loge (4x/à), где U - напряжение на электроде, а - радиус изгиба кончика электрода, х -величина промежутка между ионизирующим электродом и электродом заземления. При достаточно малых размерах острия возможно возникновение полей, превышающих 108 в-м"', что значительно превышает напряжение пробоя воздуха. Поле на кончике электрода быстро рассеивается, в связи с чем ионизируются только молекулы, расположенные вблизи электрода. Таким путем удается достичь скорости генерирования более 10" пар ионов в секунду (Pettig, 1984). Интенсивность ионизации (I) и концентрация ионов связаны соотношением: I = а-n2;, где щ - концентрация (+) и (-) ионов в 1 см3, и а - коэффициент рекомбинации. Для чистого воздуха а = 2-10"6 см"3с"'; максимальные значения стационарной концентрации газовых ионов в коронном разряде могут при этом достигать 2,2-108 пар ионов см"3.

Анализ протекающих в коронном разряде процессов представляет значительные сложности, поскольку образующиеся электроны и ионы не являются моноэнергетическими. Предполагается, что из большого числа формирующихся в области коронного разряда на отрицательно заряженном острие продуктов, претендентами на роль биологически активного и/или лечебного фактора пула отрицательных аэроионов могут быть электрически заряженные и возбужденные кислородные частицы - атомарный и молекулярные кислородные ионы О", (V и Оз~ (Dolezalek, 1985), а также синглетный кислород '02 (Hagstrum, 1951; Бучельникова, 1958). Учитывая современные представления о биологической активности супероксидного радикала Ог*", идентификация этого продукта в пуле отрицательных аэроионов, а также обнаружение взаимосвязи между биологическими

эффектами отрицательных аэроионов и Ог*" могли, на наш взгляд, способствовать более глубокому пониманию природы биологической роли свободных радикалов в норме и патологии.

Нами бьши подробно рассмотрены молекулярные и атомные процессы, способные играть основную роль в продукции анион-радикала О2'' газовой фазы в естественных условиях и в коронном разряде при давлении 760 мм.рт.ст., отсутствии паров воды и посторонних газов, Т°=288°К и низкой степени ионизации, что позволило пренебречь процессами столкновения между ионизированными и возбужденными частицами (Голышггейн, 1988). В основу проведенного нами анализа были положены данные из оригинальных работ (Loeb, 1967; Sekiya, Miyoshi, 1984; Pethig, 1984; Сальм, Лутс, 1986) и обзоров (Бучельникова, 1958; Lecuiller et al., 1972; Moruzzi, Lucas, 1974; Goldman, Goldman, 1978). Анализ показал, что наиболее вероятным первичным продуктом, который может возникать в результате столкновений свободных электронов с энергией порядка 360 кДж моль"' с молекулами кислорода, является ион-радикал О". Известно, однако, что из свободнорадикальных форм кислорода ион О" наиболее реакционноспособен, вступая в реакции уже при температуре жидкого азота (Разумовский, 1979). Эволюция иона О" в воздухе может привести к образованию широкого спектра частиц, включая ион Ог", а также молекулярных продуктов О3, N0, N02, СО2 и др. (Лившиц и др., 1984). Освобожденные в первичном акте ионизации менее активные электроны с энергией < 42 кДж моль"1 могут быть захвачены нейтральными молекулами при столкновениях. Таким путем возможно образование иона Ог"

е" + 02 -> 02"

с последующим образованием других заряженных продуктов, таких как ОГ, 0з~, NO2", NO3", СОГ и "ОН. Как известно, это послужило основанием для предположений о связи биологической активности отрицательных аэроионов с некоторыми из них, в частности с ионами СОГ (Rosenthal, Ben-Hur, 1980) и ОГ (Pethig, 1984). Следует, однако, отметить, что для образования последних предполагается протекание процессов с участием трех частиц, например:

02~ + С02 + 02 -> С04" + О2 02" + 20г or + 02,

причем вероятность реализации этих реакций очень низка. Так, в частности, константы скорости последних двух реакций при комнатной температуре составляют, соответственно, 2-Ю'29 см6 с"1 (Смирнов, 1978) и 3• 10"31 см6 с"1 (Разумовский, 1979). В работе Сальма и Лутса (1986) на основе математического анализа реакций между газовыми частицами,

возникающими в коронном разряде в воздухе, было показано, что при решении системы реакций образования частиц до возраста 1 с основными отрицательными ионами в атмосфере могут быть кластеры типа Ог'ЧНгО^ и С>2~ (H20)j. В прямых масс-спектрометрических исследованиях было показано, что среди продуктов ионизации обнаруживаются преимущественно кластеры вида Ог'ЧНгО),,, где n = 1 - 5, если в качестве ионизатора используется a-источник (Huertas, Fontan, 1983). Важно подчеркнуть, что в этой работе при ионизации в коронном разряде на металлическом острие ион СЬ~ обнаружен не был. В то же время проведенный нами подробный анализ физической модели коронного генератора газовых ионов с учетом, в частности, влияния плотности зарядов на острие, плотности заряда свободных электронов, плотности заряда положительных и отрицательных ионов и плотности зарядоз, индуцированных в диэлектрике, а также анализ вероятностей протекания описанных выше реакций показал, что наиболее вероятным из относительно стабильных и биологически активных продуктов, образующихся на отрицательном острие в „тихом" коронном разряде в кислороде, может быть отрицательный молекулярный ион кислорода -супероксидный анион-радикал Ог*" (Гольдпггейн, 1988). Работ, посвященных биохимической идентификации этого продукта в пуле ионизированных и возбужденных частиц в коронном разряде в кислороде, к моменту начала наших исследований нам не было известно.

Основная задача экспериментальных исследований на этом этапе заключалась в разработке эффективного источника отрицательных кислородных ионов и сопоставление физико-химических и биохимических свойств основного образующегося продукта с известными характеристиками супероксидного радикала Ог*". В качестве генератора был выбран коронный ионизатор в виде радиально-симметричного коаксиального реактора с полубесконечным отрезком проволоки (Bregnsbo et al., 1974). Комплекс требований, которые были нами определены при разработке генератора и условий ионизации газов, включал получение ионов в замкнутом объеме при нормальном атмосферном давлении и комнатной температуре, возможность использования различных газовых сред и их быстрой замены, контроль и регулировку высокого напряжения и ионного тока, минимизацию паразитных токов и поляризации материалов, возможность исследования продуктов ионизации в конденсированных средах (водные растворы, апротонные растворители), а также обеспечение осушения и дополнительной очистки исследуемых газов и возможности регулировки объемной скорости их потока, термостатирования и перемешивания жидкостей и предотвращения их интенсивного испарения под действием электронного ветра, предотвращения образования и/или возможности удаления побочных нейтральных газообразных продуктов (озон, окислы азота). Особое внимание было уделено разработке конструкции электродов. Испытания показали, что по ряду параметров (отсутствие

побочных продуктов, стабильность работы и др.) оптимальным материалом для изготовления катода являются некоторые виды электропроводного угольного волокна, имеющие ряд преимуществ перед традиционными материалами (платина, золото, медь, сталь). Помимо ионизации молекул газов, конструкция катода обеспечивала нейтрализацию противоионов, устранение объемного заряда и элиминацию нейтральных побочных продуктов. Анод во избежание поляризации, а также для предотвращения прямого окисления продуктов химических реакций, был изготовлен, в разных модификациях, из платины или КС1-агар-агара. Схематическое изображение установки и электрохимической ячейки для генерирования газовых ионов приведены на рис.1.

Цикл работ по физико-химической и биохимической идентификации кислородных ионов, генерируемых в газовой фазе при прямой ионизации кислорода, газовой смеси азот/кислород или воздуха, а также при ионизации кислорода продуктами ионизации азота, возникающими на отрицательном острие в „тихом" коронном разряде, включал прямые спектрофотометрические исследования в газовой фазе и в апротонных растворителях, изучение взаимодействия продуктов ионизации с известными акцепторами супероксидного аниона (цитохром с, нитросиний тетразолий, адреналин), с хлорофиллом и каротиноидами в диметилсульфоксиде (ДМСО), цитотоксическое действие продуктов ионизации на микроорганизмы, включая образование малонового диальдегида (МДА) и диеновых конъюгатов (ДК) в клетках, а также влияние на эти процессы ингибиторов супероксид-зависимых реакций (СОД, каталаза, тетранитрометан) и тушителей синглетного кислорода (азид натрия, гистидин, 1,4-диазо-бицикло{2,2,2}октан - ДАБЦО).

а) Эксперименты по обнаружению Ог" в газовой фазе. Многие из форм активированного кислорода обладают специфическим поглощением в ЦУ-области (Разумовский, 1979), в связи с чем нами была предпринята попытка непосредственного обнаружения возникающих в коронном разряде в токе кислорода продуктов по их поглощению в диапазоне 190-300 нм. Ионизированный кислород продували либо через кювету из кварцевого стекла с длиной оптического пути 120 мм, либо через интегрирующую сферу с покрытием из ВаБО^ В этих экспериментах поглощающие в 1/У-области продукты обнаружены не были. С учетом чувствительности спектрофотометра (не менее 0,01 ед. опт. плотности) и молярного коэффициента поглощения для О2* (103 М-1 см" ) было сделано заключение, что стационарная концентрация этого продукта в газовой фазе не превышает 10"7 М. Эта оценка справедлива в случае, если возникающие продукты обладают большим временем жизни в газовой фазе и не гибнут с большой скоростью на внутренних поверхностях кюветы.

Рис. 1. Устройство электрохимической ячейки и установки для генерирования газовых ионов (схема).

1 - угольноволоконный полый катод; 2 - высоковольтный источник; 3 - газовый ввод; 4 - верхняя часть корпуса реактора; 5 - отверстие для выхода избытка газа; 6 - объем для протекания реакций в газовой фазе; 7 - ввод для нейтральных газов (Ог, N2, Аг); 8 - мембрана; 9 - нижняя часть корпуса реактора; 10 - объем для растворов (НОТ, буфер и др.); 11 - игла для забора жидких проб; 12 -магнитная мешалка; 13 - анод; 14 - термостатирующий кожух; 15 - микроамперметр; 16 - газовые баллоны; 17 - редукторы; 18 - устройства для осушения и доочистки газов; 19 - ротаметры; 20 -смеситель; 21 - вентиль.

б) Эксперименты по обнаружению 0{~ в апротонных растворителях. Один из возможных подходов для обнаружения Ог~ заключается в использовании апротонных растворителей, в которых эти радикалы могут обладать значительным временем жизни, достигающим нескольких часов (Ну1апс1, АисЫг, 1981). Действительно, при обдувании чистого ацетонитрила потоком ионизированного кислорода, в растворителе были обнаружены продукты, поглощающие в коротком ультрафиолете. В аналогичных условиях было зарегистрировано появление продукта(ов) с широкой полосой в области 270 - 280 нм также в ДМСО. Однако, хотя эти спектры соответствовали тому, что наблюдается при генерации Ог~ в щелочном ДМСО, они не обладали достаточной характерностью. Дополнительные указания на возникновение в коронном разряде были получены с применением насыщенного раствора акцептора ¿.¡-адреналина в ДМСО, который под действием радикала Ог~ окисляется до адренохрома (М18га, 1987, Мерзляк, 1989). Было обнаружено, что в этих условиях возникает характерная для адренохрома интенсивная полоса поглощения с максимумом около 480 нм, что может указывать на присутствие в газовой фазе супероксидного анион-радикала (рис. 2).

400

500

600

700

Рис. 2. Влияние продуктов ионизации кислорода на окисление адреналина в ДМСО.

Продолжительность воздействия: 0-0 мин; 1 - 1 мин; 3-10 мин; 4-30 мин. Напряжение на катоде (-)3,0 ± 0,1 кв; ионный ток 7 мкА. А - оптическая плотность.

Длина волны, нм

Были предприняты также попытки прямой идентификации супероксида путем регистрации спектра ЭПР в ДМСО, как это было описано при генерации значительных количеств этого радикала в щелочном ДМСО (Ну1апё, АисЫг, 1981; Мегг1уак е1 а1., 1991). В условиях генерации супероксида, идентичных использованным в оптических исследованиях, сигнал в ДМСО зарегистрировать не удалось. Мы не смогли также обнаружить появление семихинонов тайрона при добавлении этой спиновой ловушки кислородных радикалов к ацетонитрилу или ДМСО спустя 20-30 минут после обработки потоком отрицательных ионов кислорода. Следует также добавить, что в контрольных опытах ДМСО, подвергавшийся аналогичному действию ионов кислорода, не вызывал окисления адреналина в адренохром при его добавлении к свежему раствору этого акцептора в этом же растворителе. В связи с этими данными можно думать, что возникающие при ионизации

кислорода и обладающие свойствами супероксида короткоживущие активные частицы исчезают в реакциях с остаточными количествами воды или примесей, содержащихся в коммерческих растворителях даже высокой степени очистки.

в) Эксперименты по обнаружению Ог~ в водной среде с применением акцепторов. Было показано, что продукт(ы) ионизации кислорода дозо-зависимым образом окисляют адреналин и восстанавливают цитохром с и нитросиний тетразолиевый в растворе и/или на мембране, разделяющей газовую и водную фазы, а также что эти процессы эффективно ингибируются СОД (рис. 3). При потенциале на катоде -3 кВ и величине тока 7,0 мкА скорость генерации супероксида составляла 20% от установленной в общепринятых условиях определения активности СОД в системе ксантияоксидаза-ксантин (Fridovich, 1972). Введение формиата натрия (1 мМ) не увеличивало выход продукта. Обращает на себя внимание также факт, что ингибирование восстановления цитохрома с супероксиддисмутазой было неполным и при концентрации фермента 3 ед. мл'1 не превышало 64%, что может служить указанием на присутствие в пуле заряженных частиц также других восстанавливающих агентов. Такой активностью, в частности, могут обладать гидратированные электроны (eaq~~), формирующиеся в растворе из пула свободных электронов газовой фазы. Это согласуется с полученными нами данными о скорости восстановления цитохрома с в насыщенном азотом растворе при продувании продуктами ионизации азота, а .также отсутствием выраженного ингибирования этих реакций супероксиддисмутазой. В то же время, поскольку химические реакции продукта ионизации кислорода или кислород-содержащих смесей во всех случаях ингибировались СОД, был сделан вывод об идентичности этого продукта с супероксидным анион-радикалом кислорода. Были установлены оптимальные условия генерации этого продукта.

Было также обнаружено, что прямая ионизация кислорода может быть заменена ионизацией азота с последующим выдуванием образующихся электронов в кислород. Кроме того, электроны, двигаясь в электрическом поле и достигая область мембраны, могут взаимодействовать с растворенным кислородом. Протекающие в этих условиях процессы могут быть описаны реакциями:

а) N2 2N+ + 2е~

б) е- + 02 -> 02*~

в) е- + Н20 е~ач

г) е—aq + 02 02*~

^ в газовой фазе и

} в водной фазе и на мембране

30 1

г 60

30 =

а о -i

О 5 10 15 20 25

Длительность воздействия, мин

Рис. 3. Восстановление отрицательными ионами кислорода нитросинего тетразолия (НСТ) и цитохрома с. Зависимость от длительности воздействия и добавления СОД.

I - НСТ; 2 - НСТ + инактивированная СОД; 3 - НСТ + СОД (0,1 мкМ); 4 - цитохром с; S - цитохром с + СОД (0,1 мкМ). Напряжение на катоде (-)3,0 ± 0,1кв; ионный ток 7 мкА.

При этом в НСТ-содержащей среде на мембране легко можно обнаружить появление интенсивной полосы поглощения с максимумом в области 540 - 560 нм при регистрации диффузного отражения целой окрашенной мембраны и при 515 нм после растворения мембраны в пиридине, что в обоих случаях соответствует поглощению диформазана. Образование е~щ в результате ионизации азота было доказано введением в среду закиси азота N20, что предотвращало образование супероксида путем элиминации eaq— :

N20 + eaq- N2 + ~OH + "ОН

Было также показано, что прямое восстановление НСТ гидратированными электронами в бескислородной среде не ингибируется СОД.

г) Взагшодействие продуктов ионизации кислорода с хлорофиллом и каротиноидами в ДМСО. Фотосинтетические пигменты хлорофиллы и каротиноиды обладают высокой чувствительностью в реакциях с формами активированного кислорода. В ряде случаев в результате этих реакций возникают специфические продукты, позволяющие охарактеризовать природу окисляющего агента (Мерзляк, 1989; Merzlyak et al., 1991). В этой связи были изучены спектры поглощения пигментных экстрактов листьев гороха, в спектры поглощения которых основной вклад вносят хлорофилл a (максимумы при 450 нм и 666 нм) и хлорофилл Ь, проявляющийся в виде плеча при 650 нм и вместе с каротиноидами

обусловливающий полосы поглощения между 460 и 510 нм. Исследование показало зависимое от длительности экспозиции продуктами ионизации кислорода прогрессивное снижение оптической плотности хлорофиллов и каротиноидов во всем видимом диапазоне оптического спектра, свидетельствующее о деградации пигментов. Была предпринята также попытка охарактеризовать продукты взаимодействия хлорофиллов с отрицательными кислородными ионами. Известно, что супероксидный анион, генерируемый электрохимическим восстановлением в ацетонитриле, вызывает селективный отрыв протона от углерода С-10 циклопентанонового кольца V хлорофиллов а и Ь с образованием соответствующих енолят-ионов (т.н. интермедиатов Молиша). В результате окисления этих продуктов молекулярным кислородом происходит образование продуктов с хлориновым или родиновым типами спектров поглощения, т.н. алломеризация хлорофилла (Мегг1уак ег а1., 1985). Можно было предположить протекание этого процесса также при действии на пигмент продуктами ионизации кислорода. Опыты были проведены с растворенным в ДМСО неалломеризованным хлорофиллом а. Как и в опытах с общим экстрактом, действие ионов кислорода приводило к выцветанию основных полос поглощения пигмента и появлению отчетливых изобестичесхих точек. Такой характер спектральных изменений характерен для необратимой деградации хлорофилла, например при его фотоокислении (Мерзляк, 1984). Это явление не наблюдалось при воздействии на хлорофилл а нейтральным кислородом. Одновременно было обнаружено, что в результате ионизации кислорода возникает также продукт с выраженными окислительными свойствами, идентифицированный позднее как пероксид водорода. Было показано, что образование пероксида водорода ингибируется каталазой и тетранитрометаном, тогда как добавление каталитических количеств СОД резко ускоряло процесс (рис. 4).

В дальнейшем нами были разработаны способы получения идентичного супероксиду продукта также в условиях прямой ионизации воздуха. Уменьшение образования и выхода в зону реакции побочных продуктов было достигнуто путем изменения конструкции катода, что позволило уменьшить величину напряжения, а также осуществить активное выведение из зоны возбуждения следовых количеств побочных нейтральных продуктов (Оз при генерации в кислороде, Оз и N2О в воздухе). На способ генерирования супероксида в изученных газовых смесях, генератор супероксида и созданный на его основе медицинский ингалятор нами были получены два патента (БЕ 41 12 459 и БЕ 195 12 228).

ы £

ce" Ч О D, О

ч о п

5 о Ьй

о о.

Длительность воздействия, мин

Рис. 4. Влияние восстановленных продуктов ионизации кислорода на образование пероксида водорода в щелочной среде.

1 - без добавок; 2 - в присутствии каталазы (1 мкМ); 3 - в присутствии тетранитрометана (1 мкМ); 4 - в присутствии СОД (30 нМ). Напряжение на катоде: (-) 3,0 ± 0,1кв; ионный ток: 0,3 мкА; буферный раствор: гликоколь-NaOH, рН 10,1.

Известно, что в силу ряда физических и технических ограничений прямая идентификация

кислородных супероксид-радикалов часто оказывается затруднительной. Аналогично

большинству исследований супероксид-иона Ог"- in vivo, основанных почти полностью на

косвенных свидетельствах (FIohé, 1988), представленные в этом разделе данные позволили

нам сделать вывод о том, что при ионизации кислорода в "тихом" коронном разряде

возникают частицы, тождественные по всем исследованным свойствам супероксидному

радикалу Ог*-. Это заключение было сделано по результатам исследований восстановления

нитросинего тетразолиевого и цитохрома с, окисления адреналина до адренохрома,

изменения спектров поглощения апротонных растворителей, взаимодействия с

фотосинтетическими пигментами, образования пероксида водорода, зависимости этих

процессов от присутствия СОД, тетранитрометана и каталазы, а также цитотоксического

действие в высоких дозах на микроорганизмы (см. ниже).

В дальнейшем нами были проведены комплексные исследования биологической активности, лечебных эффектов и токсикологических характеристик этих частиц, обозначенных в последующем изложении терминами „экзогенный" или „газообразный" супероксид. Было показано также, что основными факторами, влияющими на состав продуктов и скорость генерации газообразного супероксида в коронном разряде, являются

материал и геометрия источника ионов, величина потенциала возбуждающего электрода, состав газовой среды, скорость пропускания газа через зону электрического возбуждения и величина ионного тока в промежутке „острие-Земля". Были определены диапазоны каждого из факторов, в пределах которых достигалась оптимальная скорость генерирования супероксида, находившаяся в пределах 0,1 - 0,5 мкМ мин'1 и было показано, что в выбранных условиях образование побочных продуктов (озон, окислы азота) пренебрежимо мало. Большинство дальнейших исследований проводили в условиях, практически исключающих образование этих продуктов и при скорости генерации супероксида, измеренной но восстановлению цитохрома с на расстоянии 10 мм от катода, равной 0,25 ± 0,06 мкМ мин"1.

2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ЭКЗОГЕННОГО 02—

2.1. ЦИТОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ВЫСОКИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ПРОДУКТОВ ИОНИЗАЦИИ КИСЛОРОДА

Хорошо известно, что такие продукты превращений радикала Oj~~ как пероксид водорода, гидроксильный радикал и синглетный кислород ('Ог) обладают цитотоксическими свойствами (Elstner, 1990). Известно также, что 'Ог может быть отнесен к числу первичных продуктов, образующихся в газовой фазе при прямой ионизации кислород-содержащих смесей и кислорода (Hagstrum, 1951; Бучельникова, 1958). Время жизни синглетного кислорода в газовой фазе может достигать 2,7 с (Kasha, Khan, 1970). Этот продукт отличается высокой реакционной способностью (Фут, 1979; Сапежинский, 1988; Красновский, 1988), в силу чего способен вызывать необратимые деструктивные эффекты в мембранных структурах клеток.

С учетом этих данных, мы исследовали влияние высоких концентраций продуктов ионизации кислорода на рост и процессы перекисного окисления липидов в культурах микроорганизмов Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, E. coli, Bacillus subtilis, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoneae, Pseudomona aeruginosa, Salmonella typhimurium, Candida albicans. Культуры были посеяны на средах на поверхности агара или в агаровом слое (посевные дозы 102 и 103 микробных тел на чашку Петри). Длительность экспозиции составляла 15 и 60 минут, скорость генерации супероксида 1,1 ± 0,3 мкМ мин"1. Во всех случаях было отмечено зависящее от интенсивности и длительности воздействия угнетение роста микроорганизмов, более выраженное в культуре на поверхности агара. Введение в среду каталитических количеств СОД достоверно усиливало, тогда как введение каталазы почти полностью снимало цитотоксический эффект. Тушители синглетного кислорода азид натрия (15 мМ) и ДАБЦО (50 мМ) не влияли на скорость роста микроорганизмов и

накопление продуктов пероксидации липидов. Эти данные были расценены как свидетельство отсутствия в газовой среде биологически значимых количеств 'Ог и возможной связи цитотоксических эффектов ионизированного газа с образованием продукта спонтанной и СОД-зависимой дисмутации супероксида - пероксида водорода и, возможно, гидроксильного радикала.

Дополнительные указания на отсутствие взаимосвязи между цитотоксическими эффектами продуктов ионизации кислорода в коронном разряде и 'Ог были получены в другой постановке экспериментов. Исследовали влияние ионизированного кислорода на рост и накопление МДА и ДК в культурах Е. coli (штамм 206) и Bacillus mesenthericus, различающихся по содержанию полиненасыщенных жирных кислот. С целью предотвращения действия Ог"- и пероксида водорода в инкубационную среду добавляли каталитические количества СОД и каталазы. В этих условиях цитотоксическое действие продуктов ионизации кислорода, а также образование продуктов перекисного окисления липидов при экспозиции 60 и 120 мин выявлено не было, что было расценено как свидетельство отсутствия в пуле активированных и ионизированных частиц биологически детектируемых количеств синглетного кислорода. В части опытов (контроль) эти же штаммы бактерий подвергались действию 'Ог, генерируемого в кислороде при облучении светом гелий-неонового лазера с полосой испускания 632,8 нм, которая почти точно соответствует переходу (%"")г -> ('Agh (634 нм) (Разумовский, 1979). Для этих целей были изготовлены специальные трубки из стекла с боковым газовым вводом и плоским запаянным торцом, располагавшимся на одной оси с выходом лазера. Для избежания эффектов прямого облучения объекта светом лазера, выходной патрубок был отогнут под углом 90°. В этих условиях при экспозициях от 1 до 15 мин были зарегистрированы дозо-зависимые эффекты цитотоксического действия синглетного кислорода и накопление МДА. а также защитное действие азида натрия и ДАБЦО.

Таким образом, в этих экспериментах было продемонстрировано отсутствие детектируемых физико-химическими и биологическими методами количеств ' Ог в пуле частиц, образующихся в «тихом» коронном разряде в кислороде.

2.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ НИЗКИХ ДОЗ ЭКЗОГЕННОГО 02*~ НА КЛЕТОЧНОМ И ТКАНЕВОМ УРОВНЯХ

Вплоть до настоящего времени исследования биологических эффектов отрицательных аэроионов на тканевом и клеточном уровнях носили преимущественно описательный характер, а полученные результаты не нашли объяснения в рамках единой гипотезы действия аэроионов (Krueger, Sigel, 1981; Kroeling, 1985). Так, не имеют, на наш взгляд,

удовлетворительного объяснения факты усиления отрицательными аэроионами двигательной активности мерцательного эпителия клеток дыхательного тракта (Krueger, Smith, 1959), стимулирующего действия этих частиц на процессы заживления ран (Портнов, Пуце, 1976) и известное из санитарно-гигиенических работ уменьшение титра микроорганизмов в искусственно ионизированном воздухе (Минх, 1974). В свете развиваемых нами представлений, большинство из известных результатов этих и аналогичных исследований могут найти объяснение свободнорадикальной природой супероксида как основного биологически активного фактора отрицательных аэроионов. Этот вопрос, однако, не нашел в научной литературе достаточного отражения. Единственная известная нам работа в этой области вышла из лаборатории Krueger (Kellogg, 1979). Ниже приведены основные результаты проведенных нами исследований биологической активности экзогенного супероксида на клеточном и тканевом уровнях.

а) Влияние на окислительный метаболизм дрожжей. Хорошо известно, что повышение содержания кислорода в среде инкубации в условиях регидратации нарушает окислительный метаболизм дрожжевых клеток (Lee, Hassan, 1987). Было исследовано влияние газообразного Ог~ (0,30 ± 0,07 мкМ мин"1) и кислорода на скорость потребления кислорода клетками Saccaromyces cerevisiae в условиях регидратационного стресса в среде 0,1 М фосфатного буфера (pH 7,4) при 22°С при окислении эндогенных субстратов. Спектрофотометрическое определение изменений поглощения цитохрома с после однократной продувки выявило защитное по сравнению с неионизированным кислородом действие супероксида на дрожжевые клетки (I/Esso-Kmhh), соответственно, 4,8 ± 0,3 и 3,9 ± 0,3; р < 0,05), что отражает уменьшение окислительной нагрузки на клетки. Известно также, что увеличение потребления кислорода клетками дрожжей вызывает увеличение скорости синтеза цитохрома а. Трехкратное продувание суспензии дрожжей в описанных условиях вызывало увеличение отношения цитохрома а к цитохрому с (E603/E550), менее выраженное при обработке супероксидом по сравнению с неионизированным кислородом (соответственно, 0,255 ± 0,01 и 0,279 ± 0,012; 0,01 < р < 0,05, тенденция). В серии других опытов (Скардс, Гольдштейн, 1988), проведенных на сухих дрожжах, была обнаружена способность супероксида в газовой фазе вызывать восстановление цитохромов с, в и а также у высушенных клеток, выявленная по возрастанию поглощения этих клеток в полосах 550, 562 и 603 нм.

б) Влияние на хемотаксис перитонеалъных макрофагов. Подвижность лейкоцитов периферической крови, обусловленная хемотаксисом и миграцией к очагам тканевой деструкции, является составляющей компонентой общей системы реактивности организма (Белокриницкий, 1987). Продукты перекисного окисления липидов способны выступать в

качестве как стимуляторов, так и ингибиторов клеточных реакций, в том числе хемотаксиса лейкоцитов (Kitagava, Takaku, 1981; Elstner, 1990). Так, пероксид водорода в относительно высоких концентрациях (~0,7 мМ) ингибирует миграцию и пролиферацию кератиноцитов человека (O'Toole et al., 1996). Как стимуляция, так и ингибирование подвижности лейкоцитов дополняют комплекс физиологических реакций воспаления и заживления ран. Действие супероксида газовой фазы как потенциального регулятора хемотаксиса лейкоцитов in vitro в литературе описано не было. Известно, однако, что в ряде случаев наблюдалось ускорение заживления кожных ран после их обработки отрицательными аэроионами (Портнов, Пуце, 1976).

Электрохимическая ячейка для генерации супероксида (см. рис. 1) оказалась удобным инструментом для изучения влияния супероксида на лейкоцитарный хемотаксис по методу, описанному в работе Boyden (1962). Перитонеальные макрофаги мышей (2-Ю6 клеток мл"1) ресуспендировали в среде, состоящей из 90% среды Хенкса и 10% сыворотки и помещали в нижнюю полость ячейки (10), а газообразный супероксид генерировали в верхней полости (6), отделенной микропористым фильтром „Millipore" SMWP 01300 с размером пор 8 мкм (8). После инкубации, фиксирования и окрашивания (Меньшиков, 1987) подсчитывали число клеток, мигрировавших из суспензии на верхнюю поверхность фильтра. Была обнаружена двухфазная реакция клеток. В течение первой фазы (9,2 ± 0,3 мин) наблюдался положительный хемотаксис в направлении источника супероксида. Во второй фазе (9,5 ± 0,7 мин) проникшие на верхнюю сторону фильтра клетки мигрировали обратно в суспензию, проявляя тем самьм хемофобную реакцию. Наслоение на верхнюю поверхность фильтра раствора СОД на любом этапе первой фазы хемотаксиса прерывало реакцию и обращало направление хемотаксиса. Введение в исходную среду каталазы предотвращало обращение хемотаксиса; неионизированный кислород незначительно влиял на хемотаксис макрофагов (рис. 5). Таким образом, нами было впервые обнаружено действие газообразного супероксида как лейкоцитарного хемоаттрактанта. По аналогии с данными, приведенными выше, и с учетом изменений клеточной реакции в присутствии СОД и каталазы, можно предположить, что обращение хемотаксиса (хемофобная реакция) связано с неспецифическим повреждающим действием пероксида водорода как продукта дисмутации супероксида. Эти результаты и выводы находятся в соответствии с данными о стимулирующем подвижность клеток сперматозоидов действии низких концентраций супероксида (de Lamirande et al., 1997) и угнетении этих реакций низкими концентрациями пероксида водорода (O'Toole et al., 1996).

Длительность воздействия, мин

Рис. 5. Влияние газообразного Ог*- на хемотаксис перитонеальных макрофагов мышей.

Приведены результаты экспериментов, где СОД вводили либо на 6-й, либо на 9-й минуте; 2*10б клеток/мл среды; 20°С; 1Гвыс = (-)2,8 ±0,1 кв; 1=1 мкА; скорость генерации супероксида 0,2 мкМ/мин; добавки: СОД (5 ед/мл), каталаза (1 мкМ).

в) Влияние на заживление ран в эксперименте. Экспериментальной моделью, объединяющей местную реакцию тканей, лейкоцитарные реакции in situ и бактериостатическое действие форм активированного кислорода может служить заживление экспериментальных ран (Knighton et al., 1986). Хорошо известно, что процесс заживления ран включает эксудативную, пролиферативную и репаративную фазы (Knighton et al., 1984). Эти фазы коррелируют с пиками потребления кислорода участка повреждения. Одной из важных функций кислорода является т.н. „очищающая", связанная с дезинфекцией раневой поверхности и позволившая сформулировать роль кислорода как неорганического „антибиотика", бактериостатическое действие которого обусловлено продукцией форм активированного кислорода лейкоцитами (Elstner, 1990). Известно также, что значительная часть потребляемого раневой поверхностью кислорода расходуется на интенсификацию процесса образования элементов соединительной ткани, а именно гликопротеинов в -экссудативной фазе и протеогликанов и коллагена - в более поздней репаративной фазе (Elstner, 1990). Модулирующее действие активированного кислорода сопровождается усилением липопероксидации и угнетается альфа-токоферолом. Воздействие экзогенных окислителей в нетоксичных дозах и концентрациях способствует ускорению процесса заживления ран (Murrell et al., 1990).

В исследовании на крысах нами было показано, что 30-минутная обработка экспериментальной раневой поверхности экзогенным супероксидом не влияет на экссудативную фазу процесса заживления, ускоряет на 18% (тенденция) пролиферативную и на 48% (р < 0,05) репаративную фазы заживления по сравнению с нейтральным кислородом. Одновременно было отмечено возрастание прочности соединительной ткани, определяемой по отрыву имплантированного в рану платинового кольца. Эти изменения происходили на фоне уменьшения показателя микробной обсемененности раны. Так, на 5-е сутки эксперимента на стерильных оттисках с поверхности ран было обнаружено 12,5 ± 4,6 микробных тел/см2 после обработки раны потоком супероксида против 258,2 ± 62,1 у животных, обработанных кислородом (р < 0,001). В обсуждении этих данных мы высказали предположение, что помимо активации лейкоцитарных реакций и образования угнетающего размножение бактерий пероксида водорода, супероксид в этих экспериментах мог играть роль фактора активации регуляторного гена „oxyR" фибробластов (Christman et al., 1989), стимулируя, таким образом, коллагенообразование и процессы пролиферации. Позднее эффективность терапии долгонезаживающих ран экзогенным супероксидом была продемонстрирована нами у 6 больных после ампутации нижней конечности.

г) Влияние на клетки APUD-системы. APUD-система привлекла наше внимание в связи с положительными результатами лечебного применения ингаляций супероксида у больных бронхиальной астмой, а также с ранее опубликованными работами (Krueger, Smith, 1959; Krueger et al., 1962), связывающими механизм действия отрицательных аэроионов с обменом серотонина in situ в тканях дыхательного тракта животных (Krueger, Sigel, 1981). APUD-система играет важную, хотя и недостаточно выясненную, роль в приспособительных реакциях организма. Специфическими функциями клеток APUD-системы являются поглощение предшественников, синтез, накопление и декарбоксилирование биогенных аминов, в том числе серотонина (Райхлин и др., 1983), окислительное деаминирование которых может сопровождаться повышением уровня эндогенного окислительного стресса. В этих же структурах происходит выработка пептидных гормонов (Яглов, Ломоносова, 1985), участвующих в поддержании и регуляции тонуса гладкой мускулатуры трахео-бронхиального тракта и проницаемости сосудистой стенки (Кветной, 1981).

В экспериментах на крысах в условиях хронического 30-дневного воздействия (60 минут ежедневно) экзогенным Oi'~ было обнаружено увеличение числа и насыщенности гранулами секрета APUD-клеток тканей трахео-бронхиального тракта (соответственно, в 2,4 и 2,6 раза, в обоих случаях р < 0,01 к контролю). Эти данные могут служить указанием на возможность элиминации из регионального кровотока медиаторов воспаления (например, серотонина и/или гистамина) и локального уменьшения окислительного стресса, расширяя

тем самым круг адаптивных реакций, вовлеченных в механизмы лечебного действия экзогенного супероксида у больных бронхиальной астмой. Поскольку в силу наличия электрического заряда и короткого времени жизни проникновение анион-радикала СЬ*- в глубокие отделы трахео-бронхиального тракта представляется маловероятным, полученные результаты могут быть объяснены локальными клеточными реакциями на пероксид водорода, образующийся в результате дисмутации супероксида в насыщенной парами воды атмосфере вдыхаемого воздуха. Образование пероксида водорода можно было бы предположить также в упомянутой работе (Kellogg, 1979), в связи с чем не вполне понятно описанное авторами уменьшение токсического действия отрицательных аэроионов при добавлении СОД. Образованием низких концентраций пероксида водорода можно также непротиворечиво объяснить, в частности, известные из данных литературы реакции клеток бронхиального дерева и легких на ингалируемые отрицательные аэроионы, в частности, неоднократно описанное явление стимуляции отрицательными аэроионами двигательной активности мерцательного эпителия бронхов, что способствует выведению слизи (Krueger, Smith, 1958; 1959). Известно, например, стимулирующее активность двигательного аппарата клеток действие низких (< 10 мкМ) концентраций пероксида водорода, наблюдаемое у физиологически полноценных сперматозоидов (Маньковская, Серебровская, 1998). Аналогичные наблюдения были сделаны нами в предварительных исследованиях активности мерцательного эпителия препарата бронхов быка при воздействии продуктами ксантиноксидазной реакции. Рассмотренные под таким углом зрения, описанные в этой части работы результаты наших исследований могут служить дополнительными доказательствами идентичности основного биологически активного фактора отрицательных аэроионов с анион-радикалом супероксида, образование которого в пуле продуктов отрицательной ионизации кислорода было нами продемонстрировано выше.

2.3. МОДИФИКАЦИЯ АКТИВИРОВАННЫМИ ФОРМАМИ КИСЛОРОДА ПОРОГОВ РЕАГИРОВАНИЯ СЕНСОРНЫХ СИСТЕМ

а) Модификация временного порога восприятия запаха. Химические раздражители органов чувств могут оказывать стимулирующее или транквилизирующее влияние на организм, воздействуя тем самым на процессы регуляции интегративного поведения, при этом, например, прямая связь рецепторов обонятельной системы с гипоталамической областью и с лимбической системой обусловливает формирование эмоционального и вегетативного компонентов реакции на эти раздражители (Staubli, 1987). Нами было обнаружено модифицирующее влияние экзогенного супероксида на временной порог восприятия запаха. В качестве интегрального ответа на ингалируемый экзогенный супероксид регистрировали изменения пространственной синхронизации биопотенциалов

ЭЭГ у индивидов с различными типами полушарного реагирования после предъявления обонятельных раздражителей.

В группах из клинически здоровых профессиональных дегустаторов запахов и неспециалистов (20 и 73 испытуемых) по характеристикам пространственной синхронизации биопотенциалов мозга (изменение показателей а-индекса в ЭЭГ, коэффициента корреляции первой производной ЭЭГ, величины постоянного потенциала мозга в каждом полушарии при нагрузках, преимущественно адресованных либо левой, либо правой гемисферам), были отобраны "правополушарные" и "левополушарные" индивиды. Уровни конституционально-личностной тревожности и актуальной реактивной тревоги определяли по методике, описанной в работе Ханина (1978); границы высокого и низкого уровней оценивались величиной 40 баллов.

Нами было установлено, что у дегустаторов-профессионалов реакция в правом полушарии на предпочитаемый запах и в левом полушарии на отвергаемый запах (в зависимости от типа полушарного реагирования) проявляется сразу после предъявления раздражителей, тогда как у неспециалистов эти реакции проявляются лишь на 3-й минуте воздействия. Таким образом было обнаружено существование исходно низких временных порогов восприятия запахов у профессиональных дегустаторов. После 15-минутной ингаляции экзогенного супероксида различия между группами исчезли, при этом появление ЭЭГ-ответов у неспециалистов возникало уже на первой минуте подачи запахового раздражителя. Поскольку у дегустаторов-профессионалов существенных изменений установлено не было, был сделан вывод о понижении временного порога восприятия запаха у испытуемых-неспециалистов под влиянием ингаляций экзогенного супероксида.

б) Уменьшение порогов восприятия вкуса. Известно, что отрицательные ионы кислорода при локальном действии in situ способны модулировать скорость обмена серотонина, как это было показано на препаратах трахеи кролика и пищевода лягушки (Krueger, Sigel, 1981). Известно также, что вкусовые почки позвоночных содержат популяцию серотонинсодержащих клеток, выполняющих трофическую функцию (Есаков и др., 1976). Предполагается, что контролируемые субстанцией Р реакции высвобождения и обратного захвата серотонина вовлечены в процессы синаптической передачи возбуждения в структурах вкусовой почки (Соловьева, Есаков, 1984).

Модификация активированными формами кислорода чувствительности хеморецепторных структур была продемонстрирована нами в исследовании порогов восприятия вкусовых модальностей при раздражении вкусовых хеморецепторов. В экспериментах на 18

добровольцах, проведенных по двойной слепой схеме, изучали влияние 10-минутной локальной аппликации экзогенного супероксида или кислорода (контроль) на изменение порогов чувствительности рецепторов сладкого, кислого и соленого вкуса при нанесении адекватных раздражителей на области преимущественной вкусовой чувствительности языка. Установленные предварительно пороги чувствительности составляли 10,3 ± 1,3 мМ для сахарозы, 2,3 ± 0,7 мМ для лимонной кислоты и 9,4 ± 2,1 мМ для NaCl. Было обнаружено понижение порогов вкусового восприятия, соответственно, на 185 ± 39%, 101 ± 7% и 101 ± 9% (во всех случаях р < 0,01 к индивидуальному контролю). У части испытуемых эксперимент был повторен с использованием в качестве источника супероксида ксантин-ксантиноксидазной смеси, применяемой для генерирования супероксида in vitro. Здесь было таже обнаружено понижение порогов восприятия NaCl и лимонной кислоты на 76,9 ± 8,7% и 155,5 ± 26,6% (р < 0,01 к индивидуальному контролю). Эти данные могут свидетельствовать в пользу модифицирующего чувствительность сенсорных хеморецепторных нейронов действия активированных форм кислорода. В качестве возможных механизмов эффекта рассматривается модификация этими продуктами тканевого метаболизма серотонина и/или активация субстанция-Р-зависимой системы, участвующей в реализации трофических влияний на чувствительные нейроны вкусового аппарата.

в) Усиление антиноцицептивного (болеутоляющего) действия анальгетиков. Роль специфических химических свойств активированных форм кислорода в модификации активности сенсорных нейронов была продемонстрирована также в условиях стимуляции рецепторов слизистой оболочки носовой полости газообразным супероксидом и пероксидом водорода. В постановке этих экспериментов мы основывались на впервые обнаруженном нами эффекте усиления (потенцирования) супероксидом болеутоляющего действия анальгетиков (Goldstein, 1996: Pat. DE 195 14 522; Goldstein et al., 1996; 1997).

В неоднократно воспроизведенных экспериментах с применением различных анальгетиков и моделей боли было обнаружено, что ингаляция супероксида может потенцировать действие наркотических и ненаркотическйх анальгетиков при предъявлении таких болевых стимулов как химическое раздражение тканей (формалиновый тест по Abbott et al., 1995) или механическое давление на лапу животного (Рандалл-Селитто-тест; Khasar et al., 1995). Были использованы наркотические (морфин, омнопон, тримеперидин) и ненаркотические (анальгин, баралгин, аспирин, диклофенак, вольтарен) анальгетики, антагонист морфиновых рецепторов налоксон, необратимые ингибиторы МАО фенипразин и ниаламид. Во всех случаях было обнаружено усиление активированными формами кислорода антиноцицептивного действия анальгетиков (рис. 6).

о1Налоксон; о^Напоксон + Ог*"; оЗ Налоксон + морфин; П^Налоксон + морфин + О2"; Морфин + Оз"

о о. о с

40-

30-

I 20-|

0 ю

® 10 -

1 01 3 л ш о С

-10-1 ингаляция 50 мин ^

30 60

1 р1-^4-Инъекция (морфин) г

120 150 180 Время (мин)

"Г

210 240 270

Рис. 6. Потенцирование экзогенным супероксидом антиноцицептивного действия морфина у крыс и ингибирование эффекта налоксоном.

1*ап<1а11-ЗеНПо-1ез1; величина критического давления (исх.) 147,9 ± 13,0 г; супероксид: скорость генерации 0,2 мкМмин"', ингал. 50 мин; дозы морфина и налоксона: по 0,5 мг/кг, в/бр; в каждой группе п > 10; *) р < 0,05 к контролю. ■

Ингибирование этих реакций ниаламидом и налоксоном свидетельствует о вовлечении МАО-зависимых процессов и опиатных рецепторов в ЦНС.

Учитывая, что в условиях этих экспериментов постулировалось локальное взаимодействие супероксида с рецепторными структурами слизистой оболочки носовой полости, примененная модель могла способствовать выяснению вопроса о роли свободнорадикальной природы анион-радикала кислорода в обнаруженном эффекте. При этом предполагалось, что исчезновение эффекта в результате элиминации 0/~ (ферментативная дисмутация в присутствии СОД) может свидетельствовать в пользу свободнорадикальной природы механизма формирующихся антиноцицептивных реакций. Усиление физиологического эффекта могло бы служить свидетельством того, что действующим агентом выступает пероксид водорода как первый относительно стабильный продукт дисмутации супероксида. В исследованиях на крысах с применением омнопона было показано, что сочетание ингаляции О2" с эндоназальной аппликацией СОД

действительно усиливает анальгетическое действие омнопона. Взаимосвязь этого эффекта с ферментативной дисмутацией О2*- была. подтверждена при замене О?*" на пероксид водорода. Эндоказольные аппликации растворов пероксида водорода в сочетании с омнопоном вызывали идентичный эффект, который закономерно исчезал при эндоназальной аппликации каталитических количеств каталазы (рис. 7).

71.1+-6.9

(1) контроль

(2) омнопон (3) 02-/омнопон

(4) СОД/ 02-/омнопон (5) Н202/омнопон

(6) кат./Н202/омнопон

Продолжительность болевой реакции, мин

Рис. 7. Модулируемое СОД и каталазой усиление супероксидом и пероксидом водорода

анальгетических эффектов омнопона у крыс. Формалиновый тест; скорость генерации Ог*~ : 0,2 мкМмин*1; ингал.: 60 мин; омнопон: 0,125 мг/кг, в/бр; Н202: [2*10'5 М], 2*25 мкл; СОД: 100 ед/мг белка, 2*25 мкл; каталаза: 50 ед/мг белка, 2*25 мкл. В контр.оле п = 12, в остальных группах п = 7; p;i ws. 2,3,4) < 0,05.

Поскольку результаты исследований на животных не всегда находят подтверждение в применении к человеку (Kilo et al., 1995), нами было проведено исследование усиления супероксидом болеутоляющего действия низких (50% от терапевтических) доз наиболее распространенных ненаркотических анальгетиков анальгина, диклофенака и аспирина по схеме с двойным плацебо в модели боли у человека (12 практически здоровых добровольцев обоего пола (6/6) в возрасте от 20 до 49 лет). Болевое воздействие осуществляли дозированным давлением на лунку ногтя мизинца (анальгезиметр Рандалл-Селитто). Было показано, что ранее установленные основные закономерности сохраняются в исследовании на человеке. Так, на фоне приема анальгина (метамизол) и истинной ингаляции экзогенного супероксида зарегистрировано весьма стабильное снижение болевой чувствительности в течение всего интервала тестирования, достоверное относительно всех контрольных серий (рис. 8).

12,54—4,1

4.S+-2.1

2.2+-1,8 2.1+-1,8

12,7+-3,0

Следует особо отметить, что антииоцицептивное действие анальгина на фоне ингаляций экзогенного О2" проявляется сразу после окончания ингаляции, сохраняясь не менее трех часов. Учитывая, что после орального приема максимальная концентрация анальгина в плазме крови достигается, в среднем, через два часа, болеутоляющие эффекты в начале и в конце тестирования подтверждают вывод о наибольшей эффективности экзогенного супероксида в усилении действия низких доз анальгетика. Аналогичные результаты были получены в сочетании ингаляций супероксида с аспирином, тогда как болеутоляющее действие диклофенака изменилось незначительно, что нашло в работе объяснение особенностями механизмов действия этого противовоспалительного средства.

Таким образом, в этой части работы с применением in vivo методов ингибиторного анализа было показано, что физиологические эффекты, развивающиеся в ответ на назальную аппликацию супероксида газовой фазы, обусловлены свободнорадикальной химической активностью ион-радикала О2" при взаимодействии последнего со слизистой оболочкой носовой полости. Из данных литературы известно, что у высокоорганизованных животных в основе разнообразных физиологических и биохимических реакций на действие отрицательных аэроионов может быть вовлечение в ответные реакции организма центров нейрогуморальной регуляции - гипоталамуса и гипофиза (Wasilewski et al., 1955; Gualtierotti, 1968; Olivereau, Bousquet, 1974; Olivereau, 1976). Известно также, что афферентные входы гипоталамуса анатомически и функционально тесно связаны с рецепторами слизистой оболочки носовой полости (Mendoza, 1989; Trotier et al., 1996). С другой стороны, ядра гипоталамуса тесно связаны с подкорковыми структурами мозга (мезолимбическая система, область базальных ганглиев, гипофиз), входящих в сложный комплекс физиологических нейро-гуморальных реакций, участвующих в формировании различных модальностей ноцицептивных ответов животных и в восприятии боли у человека (Mitchell, Gratton, 1992; Halpern, 1987).

В работе была продемонстрирована принципиальная возможность модуляции супероксидом порога чувствительности рецепторов (вкусовые рецепторы) и порогов восприятия специфических (запах) и неспецифических (боль) раздражителей. Эти данные согласуются с развивающимися в последние годы представлениями о роли клеточного редокс статуса и активированных кислородных интермедиатов в процессах передачи сигнала на клеточном уровне. Показано, что стимулирующее действие форм активированного кислорода связано с Са2+-сигнальной системой клетки (Suzuki et al., 1997) и что эти оксиданты вовлечены в такие клеточные процессы, как стимуляция экспрессии генов (Ramasarma, 1990), функционирование кальциевого насоса, проницаемость мембран, стимуляция аденилатциклазы и ингибирование фосфодиэстераз (Siflinger-Birnboim et al., 1992, 1996; Seeger

et al., 1995). Следует также отметить, что супероксид и пероксид водорода способны влиять на текучесть мембран (Yamaoka et al., 1992) и электрическое сопротивление (Olesen, I9S7) мембранных структур, кесяецифически модифицируя проницаемость и, возможно, взаимодействие рецепторов мембран со специфическими лигандами и чувствительность к внеклеточным сигналам.

О Метамизол + плацебо (ингалятор); © Метамизол + verum (ингалятор); О Плацебо (раствор) + плацебо (ингалятор); 0 Плацебо (раствор) + verum (ингалятор)

Время (мин)

Рис. 8. Потенцирование ингалируемым экзогенным супероксидом антиноцицепции,

вызванной применением анальгина (метамизол) у человека. КапсЫЬЗеПшНест (давление на лунку ногтя мизинца руки); супероксид-ингалятор рго-тИа!4'. *) р < 0,05 к группе (плацебо+ложная ингаляция); #) р < 0,05 к группе (плацебо+истинная ингаляция); &) р < 0,05 к группе (анальгетик+ложная ингаляция); ©) р < 0,05 истинная ингаляция к исходному фону. Доза анальгина: 5 мг/кг.

Аппроксимируя эти результаты на эндоназальные аппликации экзогенного супероксида и пероксида водорода, правомерно предположить неспецифическую стимуляцию формами активированного кислорода хеморецепторов слизистой оболочки носовой полости. Последующие физиологические реакции будут зависеть как от типа рецепторных структур

(обонятельный эпителий, вомероназальный орган, окончания тройничного нерва), так и от вовлеченных представительств в структурах головного мозга.

2.4. ОБЩЕФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ, БИОФИЗИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ДЕЙСТВИЯ АКТИВИРОВАННЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА

а) Активация гипоталамо - гипофизарного комплекса. С учетом полученных нами данных, в работе была предпринята попытка проследить влияние ингаляций экзогенного супероксида на изменения в гипоталамо-гипофизарном комплексе и зависимых от этой регуляторной системы реакций организма. Исследовали ультраструктурные изменения в адено- и нейрогипофизе крыс, а также гистологическое строение надпочечников и тимуса животных, динамику изменений массы тела и весовые коэффициенты органов. Животные получили десять 60-минутных ингаляций Ог*~ в потоке кислорода или кислорода (контроль). Было обнаружено вызванное повторными ингаляциями О2"" (но не кислорода) возрастание числа аденоцитов, продуцирующих адаптогенные гормоны аденогипофиза. Количество адренокортикотропоцитов возросло в 1,88 раза (р < 0,05), тиреотропоцитов - в 1,27 раза (0,1

< р < 0,05, тенденция), в обоих случаях при некотором увеличении насыщенности клеток гранулами секрета. Возрастание продукции АКТГ нашло впоследствии подтверждение в повышении продукции эндогенного кортизола у больных бронхиальной астмой, леченных ингаляциями экзогенного супероксида. Активация тиретропной функции нашла отражение в повышении на 17% (р < 0,05) потребления кислорода митохондриями ткани печени животных, обнаруженном нами в независимом исследовании после повторных ингаляций экзогенного супероксида и высоких (106 см"3), но не близких к естественным (103 см"3) концентраций отрицательных аэроионов. Было также установлено уменьшение в 3,1 раза (р '

< 0,05) числа лактотропин-продуцирующих клеток, что могло иметь следствием функциональную активацию дофаминэргической системы. Этот вывод в дальнейшем нашел подтверждение в результатах исследования нейропротекторного действия эндоназальных аппликаций пероксида водорода у животных, получавших разрушающий допаминэргические нейроны нейротоксин МФТП (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин). В сочетании с обнаруженным в данной работе угнетением моноаминоксидазной активности тканей гипоталамуса и базальных ганглиев мозга, эти результаты могут использованы для объяснения впервые обнаруженного нами лечебного действия эндоназальных аппликаций активированных форм кислорода у больных с симптомокомплексом паркинсонизма.

Явления функционального напряжения и активации транспорта и выведения в кровь нейрогормонов под действием ингаляций Ог" были обнаружены также в нейрогипофизе, секреторные элементы которого представлены нервными терминалями, берущими начало в

супраоптическом и паравентрикулярном ядрах гипоталамуса В функциональной связи с изменениями в гипоталамо-гипофизарном комплексе могут находиться также обнаруженные в эксперименте диффузная гиперплазия лимфоидной ткани тимуса, а также умеренная гиперплазия коркового слоя надпочечников. В последнем случае наблюдалось также некоторое увеличение массы органа (на 22%; 0,05 < р < 0,1, тенденция).

Таким образом, функциональная активация адено- и нейрогипофиза, вызванная повторными ингаляциями экзогенного супероксида, позволяет объяснить значительную часть установленных в работе физиологических эффектов экзогенного супероксида. Активация гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы и увеличение эндогенной продукции АКТГ может объяснить природу влияния отрицательных аэроионов (Скоробогатова, 1991) и, повидимому, экзогенного супероксида на возбудимость ЦНС, что может сопровождаться повышением чувствительности гипоталамических нейронов к входящим сенсорным импульсам и укорочением латентных периодов ответных реакций (Северьянова, 1998). Эти явления нашли отражение в описанных выше и в последующих наших исследованиях.

б) Экзогенный С>2*~ как адаптоген к действию гипероксии и ксенобиотиков. Адаптация к слабым и/или кратковременным повторным стрессорным воздействиям лежит в основе увеличения мощности центральных и периферических стресс-лимитирующих систем, в том числе механизмов антиокислительной защиты (Меерсон, Пшенникова, 1988; Гуляева, 1989). С другой стороны известно, что адаптогенные эффекты сильного адаптогена, каким является женьшень, в значительной мере реализуются на гипоталамическом уровне (Фулдер, 1985). С учетом особенностей биологического действия экзогенного супероксида, нами были исследованы адаптогенные эффекты этого радикала при воздействии гипербарического и нормобарического кислорода, а также ксенобиотиков (фенобарбитал и закись азота).

Известно, что в условиях нормобарической гипероксии (>98% 02) продолжительность жизни мышей ограничивается в среднем тремя сутками, что обусловлено легочной токсичностью кислорода (Smith et al., 1988). В наших экспериментах продолжительность жизни мышей линии СЗН в аналогичных условиях составляла 71,4 ± 1,8 ч. В супероксид-содержащей кислородной среде этот показатель возрастал до 89,5 ± 1,6 ч, т.е. на 25,3% (р < 0,05). Адаптивные изменения в легочной ткани, вызванные ингаляциями супероксида, были продемонстрированы также в другой постановке экспериментов, где было патоморфологически выявлено предотвращение супероксидом развития эмфизематозных изменений в легких крыс, вызванных одно- и трехкратной 60-минутной экспозицией в чистом кислороде.

Гипербарическая оксигенапия (ГБО) является эффективным методом лечения заболеваний, связанных с тканевой гипоксией (Ефуни и др., 1986) Практическое применение этого метода, однако, имеет ограничения в связи с усилением окислительного стресса (Dennog et al., 1999) и истощением антиокислительных систем организма. Роль окислительного стресса в токсичности гипербарического кислорода была подтверждена нами в цикле исследований, где было впервые установлено участие фермента с СОД-активностью - церулоплазмина, а также антиокислительной системы плазмы крови церулоплазмин/трансферрин (ЦШТР) в регуляции уровня окислительного стресса irt vivo у животных (крысы, мыши), экспонированных в ГБО. Было также показано, что система ЦП/TP дополняет эндогенные антиокислительные механизмы, представленные СОД, каталазой, системой глутатиона и а-токоферолом (Тбгбк et al, 1986; Crouch et al., 1988) и вовлеченные в адаптивные защитные реакции в условиях ГБО. Здесь следует отметить, что применение антиоксидантов для фармакологической коррекции связанной с ГБО свободнорадикальной патологии, как это неоднократно подчеркивалось, оказывается малоэффективным (Петровский, 1993). В этой связи нами был разработан и испытан альтернативный способ неспецифического повышения устойчивости организма к ГБО, основанный на адаптации животных экзогенным супероксидом.

Количество предварительных ингаляций

Рис. 9. Влияние предварительного воздействия экзогенным Ог"~ на показатель выживаемости ЬТ<о в условиях ГБО.

Мыши; ингаляции СЬ"~ или СЬ (контроль): ежедн. по 60 мин в течение 1 - 5 суток; ГБО: 3 ати чистого кислорода; скорость линейного подъема и снижения давления кислорода в барокамере 0,3 атм мин'1 при длительности каждого этапа 10 минут. *) и **) = р <0,05 и р < 0,01 к контролю

Учитывая, что в сложный комплекс адаптационного процесса, помимо антиокислительных, вовлечены также нейрофизиологические и биохимические механизмы, для сравнения исследовали адаптивное действие элеутерококка - известного адаптогена растительного происхождения (Брехман, 1981). В этом исследовании было выявлено умеренное адаптогенное действие средних доз экстракта элеутерококка, в значительной мере, однако, обусловленное этанолом. Адаптогенное действие экзогенного супероксида было выражено значительно сильнее: выживание мышей в ГБО после 3-кратной ингаляции достигало 100% и сохранялось на высоком уровне в последующие сроки. Этот эффект не был связан с ингаляцией собственно кислорода (рис. 9).

Адаптогенную активность экзогенного супероксида к действию ксенобиотиков изучали на примерах веществ с умеренными наркотизирующими свойствами, различающихся по механизмам действия (фенобарбитал, закись азота). Исследование проводили на животных с разными типами поведенческого реагирования (Ротенберг, Аршавский, 1984). Характерное седативное действие фенобарбитала (60 мг/кг, per os, в течение 4-х дней) нашло отражение в снижении интегральной двигательной и мотивационно-поисковой активности у „активных" и, в значительно меньшей степени, у „пассивных" мышей. Ингаляции супероксида (60 минут в день в течение 4-х дней) также вызывали умеренный седативный эффект у „активных", но не у „пассивных" животных. При сочетанном действии этих факторов, ингаляции супероксида элиминировали действие фенобарбитала, полностью восстанавливая исходное поведение „активных" животных в открытом поле. У „пассивных" животных показатели поведения во всех случаях не выходили за пределы вариабельности. Нами было показано, что различная реакция „активных" и „пассивных" животных при сочетанном действии экзогенного супероксида и фенобарбитала, помимо генотипических особенностей типов реагирования у этих животных, могла быть связана с различиями в скорости метаболизма фенобарбитала, гидроксилирование которого осуществляется цитохромом Р450 микросомной фракции клеток печени. Так, было установлено, что повторные ингаляции экзогенного супероксида на 67% (р < 0,05) уменьшают содержание цитохрома Р450 у "активных" животных, но не оказывают влияния на уровень этого фермента у "пассивных".

Участие ЦНС в супероксид-зависимом повышении толерантности к наркотикам было продемонстрировано в экспериментах с закисью азота - наркотизирующим агентом, который не подвергается метаболической трансформации цитохромом Р450. Бьша выявлена модификация экзогенным О2*" как возбуждающего, так и угнетающего действия закиси азота, причем, как и в случае с фенобарбиталом, модифицирующее действие супероксида было наиболее отчетливо выражено в фазе угнетения.

Приведенные в этой части работы результаты свидетельствуют, что адаптогенное действие экзогенного супероксида реализуется с вовлечением процессов липопероксидации и механизмов нейро-гуморальной регуляции на уровне ЦНС. В повышении толерантности к токсическому действию кислорода на первый план выступает, повидимому, предотвращение эндогенного окислительного стресса тканей мозга, в основе которого может лежать описанное ниже ингибирование моноаминоксидаз и предотвращение, тем самым, повышения уровня эндогенного пероксида водорода (Гаришвили, Горкин, 1978). Известно также, что фенобарбитал, взаимодействуя с а-субъединицей комплекса рецептора ГАМК, повышает мембранный потенциал нейронов и подавляет освобождение возбуждающих нейротрансмитгеров, что приводит к затруднению распространения нервного импульса (Mutschler, 1996), в связи с чем в механизмах повышения супероксидом толерантности к фенобарбиталу основную роль может играть также отмеченное выше АКТГ-зависимое облегчение синаптической передачи.

в) Адаптогенные эффекты Ог~ у больных бронхиальной астмой. Сложные взаимоотношения между активированными формами кислорода с одной стороны, и клетками и тканями с другой послужили основанием для пересмотра распространенных представлений об исключительно токсичных эффектах кислородных интермедиатов (Davies, 1993; McCord, 1995). На смену устоявшемуся мнению об абсолютной целесообразности повышения антиокислительной обеспеченности тканей приходит стратегия поддержания уравновешенного баланса окислительных и антиокислительных систем организма (McCord, 1995). Особое значение эти представления могут иметь для выработки новых стратегий в лечении заболеваний, в этиологии которых значительное место занимают нарушения окислительного статуса пораженных органов и систем организма. Одним из таких заболеваний является бронхиальная астма: Принято считать (Jarjour, Calhoun, 1994), хронический воспалительный процесс в бронхах и легких у больных астмой связан с усилением эндогенного образования гранулоцитами и макрофагами форм активированного кислорода с последующим повреждением тканей и формированием гиперреактивности бронхов (Nolte, 1989; Kanazawa et al., 1996).

В диссертационной работе приведены результаты проведенных нами двух исследований лечебного применения ингаляций супероксида у взрослых и детей с атопической формой бронхиальной астмы. Общее число больных 128 человек, у взрослых стаж болезни превышал 10 лет. Была также обследована группа из 8 здоровых добровольцев, получавших аналогичные ингаляции 0{~у генерируемого в потоке кислорода (ингалятор Sartron -прототип ингалятора pro-inhal®) или в воздухе (ингалятор pro-inhal®, патент DE 195 12 228,

торговый знак DE 395 22 963). Все испытуемые получили в среднем двадцать 15-минутных ингаляций в течение 8 недель.

В исследовании на взрослых были обнаружены изначальные достоверные различия между больными астмой и здоровыми испытуемыми по показателям содержания восстановленного глутатиона (GSH3pn, медиана, 8,4 и 6,2; р < 0,001) и активности СОД (СОД2ри, медиана, 34,0 и 28,5; р < 0,02) в эритроцитах, а также люминол-зависимой хемилюминесценции лейкоцитов периферической крови (Люм-ХЛ, медиана, 3,85 и 4,33; р < 0,05). После завершения курса ингаляций, различия между этими группами в СОДэР„ и Люм-ХЛ не выявлялись, а в GSH,P„ уменьшились до статистически незначимых. Улучшение показателей антиокислительного статуса крови больных сопровождались улучшением легочных функций, уменьшением лейкоцитоза и повышением уровня эндогенного кортизола. Были выявлены отрицательные корреляции между изменением показателей антиокислительного статуса и спирометрическими параметрами у леченных больных. Так, с уменьшением СОДэри возрастали значения Vemax (г = - 0,57; р < 0,05) и Veso (г = - 0,45; р < 0,05), тогда как исходно положительная корреляция между СОДэри и гиперреактивностью бронхов (г = 0,41; р < 0,04) исчезла. Приведенные данные были нами интерпретированы как уменьшение зависимости организма от факторов, стимулирующих гиперреактивность бронхов и активирующих антиокислительную защиту, т.е. как отражение уменьшения эндогенного окислительного стресса. Этот вывод подтверждается также выявленной тенденцией уменьшения в крови у астматиков Глуэри, повышение которого, как известно (Trush, Kensler, 1991), коррелирует с усилением окислительного стресса.

Лечебное действие экзогенного Ог'" было подтверждено также в плацебо-контролируемом исследовании на детях. В этой работе получило подтверждение сделанное нами ранее наблюдение, а именно прямая зависимость клинического улучшения от степени исходного ограничения функции внешнего дыхания (Гольдштейн и др., 1997; Rehberg et al., 1997). В целом, было показано, что улучшение общего состояния, восстановление легочных функций и клинических показателей крови у астматиков после курсовых ингаляций супероксида может являться следствием усиления продукции эндогенных противовоспалительных факторов, в частности, эндогенного кортизола, а также тренировки окислительного статуса больных и связанного с этим восстановления нарушенного равновесия между уровнем процессов перекисного окисления и состоянием антиокислительных механизмов. В формировании этих изменений определенная роль может принадлежать относительно стабильному продукту дисмутации Ог" - пероксиду водорода, способному индуцировать адаптивные изменения в глубоких отделах дыхательного тракта.

Кроме того, важную роль могут играть описанные выше адаптивные изменения APUD-системы.

г) Влияние на окислительный стресс и моноаминоксидазные системы мозга. Полученные данные послужили основой для дальнейшего исследования вовлечения гипоталамуса, экстерорецепторный афферентный вход которого берет начало от сенсорных нейронов слизистой оболочки носовой полости, в физиологические реакции, стимулированные экзогенным супероксидом. Особый интерес представляло исследование активности моноаминоксидаз (МАО) и изменений уровня нейромедиаторных моноаминов, побочным продуктом окислительного деаминирования которых в норме является пероксид водорода. Этот продукт образуется, в частности, в катализируемых МАО реакциях окисления серотонина и дофамина и рассматривается в качестве основной причины повышения уровня пероксидации и свободнорадикального повреждения дофаминэргических нейронов в базальных ганглиях при болезни Паркинсона (Rajagopalan, 1980; Cohen et al., 1985).

Исследование показало, что ингаляции супероксида и эндоназальные аппликации низких (5-10'5М) концентраций пероксида водорода могут способствовать нормализации поведенческих реакций животных и уменьшению окислительного стресса тканей мозга, и что в основе этих адаптивных реакций может лежать ингибирование активности моноаминоксидаз. Это было показано в исследованиях: i) активности МАО-А и МАО-B в гипоталамусе и базальных ганглиях мозга, ii) восстановления пероксидом водорода уровня дофамина и продуктов его метаболизма и предотвращения развития морфологических изменений в черной субстанции и стриатуме, вызванных нейротоксином МФТП (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин) и iii) показателей окислительного стресса (МДА, ДК) в тканях мозга и поведенческой активности животных в условиях нагрузки нейролептиком резерпином. Так, при продолжительном воздействии экзогенным супероксидом у крыс было выявлено угнетение активности МАО-B в гипоталамусе и базальных ганглиях и МАО-А в гипоталамусе, сопровождавшееся уменьшением напряженности окислительного стресса в этих структурах (табл. 1).

МАО-зависимая активация моноаминэргических систем мозга нашла свое отражение в антирезерпиновом действии ингаляций активированных форм кислорода. Так, было установлено, что супероксид и пероксид водорода при эндоназальном воздействии уменьшают окислительный стресс и нормализуют повышенную активность МАО-B в гипоталамусе и базальных ганглиях, вызванные десимпатизацией животных резерпином и восстанавливают резерпин-зависимое угнетение спонтанной двигательной активности. Эти результаты согласуются с представлениями об участии серотонинэргических механизмов в

реакциях ЦНС на воздействие отрицательными аэроионами (Diamond et а!., 1980). Заслуживает внимания тот факт, что антирезерпиновые эффекты изученных доз активированных форм кислорода выражены практически в одинаковой степени, что подтверждает роль свободнорадикальной природы иона кислорода в биологической активности отрицательных аэроионов и свидетельствует в пользу общности физиологических механизмов действия экзогенного Ог" и отрицательных аэроионов.

Таблица 1. Ингибирование различных субстратных форм моноаминоксидазы и уменьшение окислительного стресса в базальных ганглиях и гипоталамусе крыс после повторных ингаляций экзогенного Ог*" (30 суток, 4 часа ежедн.). Животные из контрольной группы ингалировали неионизированный кислород, М ± т.

Показатель Группа животных Базальные ганглии Гипоталамус

МАО-А (серотониновая) (нмоль/мг белка в мин) Контроль 0,28 ± 0,02 0,99 ± 0,08

Опыт 0,34 ± 0,02 0,28 ±0,03**'

МАО-В (бензиламиновая) (нмоль/мг белка в мин) Контроль 0,65 ± 0,05 0,93 ± 0,07

Опыт 0,45 ±0,03*' 0,54 ± 0,05**'

МДА (нмоль/г сырого веса) Контроль 551 ±28 142 ±8

Опыт 348 ±15*' 158 ± 7

ДК (опт.плотн./мг ткани) Контроль 0,100 ±0,006 0,0143 ±0,007

Опыт 0,038 ± 0,003*' 0,0026 ± 0,0004*'

Обозначения: *' р < 0,05; **' р < 0,01; везде к соотв. контролю; попых = 7; п контроль= 8.

Защитное действие эндоназальных аппликаций пероксида водорода было обнаружено также у животных, подвергнутых действию нейротоксина МФТП. Известно (Медведев, Типтон, 1997), что токсичность МФТП обусловлена свободнорадикальной активностью его метаболита - радикала МРР+. У животных МФТП индуцирует дегенеративные изменения и гибель нейронов в черной субстанции и уменьшение содержания дофамина в стриатуме. У крыс биохимические и структурные изменения, вызванные МФТП, сопровождаются нарушением поведенческих реакций и развитием признаков депрессивного поведения. У человека аналогичные нейродегенеративные изменения характерны для болезни Паркинсона, поражающей до 6% населения старше 60 лет (Голубев и др., 1999). Принято считать, что в обоих случаях в основе нейродегенеративных изменений лежит МАО-В-зависимое усиление окислительного стресса и разрушение дофамина в ядрах базальных ганглиев (Halliwell, 1994; Ebadi et al., 1995; Merrill, Jonakait, 1995). Одним из возможных

путей торможения развития этой патологии у человека является ингибирование активности МАО-В.

С использованием МФТП-модели нами были изучены эффекты „профилактического" и „терапевтического" применения эндоназальных аппликаций пероксида водорода. Было показано, что в обоих способах применения происходит компенсация МФТП-зависимого уменьшения продукции дофамина и его метаболитов в структурах базапьных ганглиев (табл. 2), а также восстановлению спонтанной поведенческой активности животных.

Морфометрические признаки дегенеративных изменений (Аврущенко, 1994) в ткани неостриатума у МФТП-обработанных животных нашли отражение в снижении общей плотности популяции нейронов на 23,5% и в увеличении на 32,5% числа морфологически измененных нейронов. Наиболее чувствительными оказались свободные нейроны (снижение на 25,1%, р < 0,005), тогда как популяция нейронов с сателлитной глией не претерпела изменений. „Лечебное" применение пероксида водорода полностью предотвращало МФТП-зависимое функциональное выпадение и морфологические изменения нейронов. Нейропротекторный эффект в группе „профилактика" был выражен слабее, однако и в этом случае повреждения структур были выражены в значительно меньшей степени по сравнению с отмеченными у животных, получавших только МФТИ.

Таблица 2. Влияние эндоназальных аппликаций пероксида водорода на

содержание дофамина (ДА), дезоксифенилуксусной (ДОФУК) и гамма-ванилиновой (ГВК) кислот в стриатуме и среднем мозге крыс (нг/г ткани), получавших нейротоксин МФТП (25 мг/кг, в/бр.). М ± т, значения округлены до целых.

Группы животных ДА ДОФУК ГВК

стриатум средний мозг стриатум средний мозг стриатум средний мозг

Контроль (интактный) 5291 ±90 474 ± 14 1976 ±58 182 ±6 1328 ±35 257 ±12

"МФТП" 3159 ±221 **> 195 ± 18 **) 925 ±105 **> 100 ±6 **) 705 ±95 **) 110 ±6

Н202 "Профилактика" 4849 ±99 «Я) 399 ±10 »«) 1256 ±90 «) 204 ±19 ») 1187 ±25 *) 209 ± 10 »)

Н202 "Лечение" 4963 ±57 383 ±22 М) 1368 ±45 170 ±9 *> 1148 ±22 225 ±11

Обозначения: **' = р < 0,001 по сравнению с группой "Контроль"; *' = р < 0,05 и = р < 0,001 по сравнению с группой "МФТП".

В черной субстанции было выявлено МФТП-зависимое снижение на 35,6% количества нейронов различных типов и увеличение на 51,2% числа морфологически измененных

нейронов, полностью предотвращаемые "лечебным" и частично - "профилактическим" применением пероксида водорода. Коррекция вызванных МФ'ГП нарушений была отмечена также в исследовании поведенческих реакций животных.

В целом, результаты исследования доказывают важную роль экзогенных активированных форм кислорода в сохранении структуры ткани базальных ганглиев мозга, а также в регуляции и восстановлении нарушенной функциональной активности изученных нейротрансмиттерных систем, свидетельствуя также о вовлечении сенсорных нейронов слизистой оболочки носовой полости в механизмы восприятия регуляторного действия активированных кислородных интермедиатов.

д) 02" и пероксид водорода в лечении паркинсонизма. С избыточным образованием пероксида водорода и, возможно, гидроксильного радикала в результате активации МАО-В нейроглии базальных ганглиев принято связывать нейродегенеративные изменения при болезни Паркинсона (Cohen, 1984; Jenner et al., 1992). Этот процесс сопровождается утратой пигмент-содержащих дофаминэргических нейронов черной субстанции и уменьшением продукции тормозного нейромедиатора дофамина Rojas-Castaneda et al., 1994). В диссертационной работе приводятся результаты клинических наблюдений и двух клинических (в т.ч. одного плацебо-контролируемого) исследований лечебного действия эндоназальных аппликаций активированных форм кислорода у более чем 80 больных с симптомокомплексом паркинсонизма.

Плацебо-контролируемое исследование с применением ингаляторов Ог~ pro-inhal® было проведено в группе из 40 больных. Результаты лечения оценивали по стандартной шкале UPDRS (Unified Parkinson Disease Rating Scale). Клиническое улучшение было зарегистрировано у 20 больных в группе с ингаляцией Ог~ против 11 больных в группе плацебо (р < 0,05). В другом исследовании на 12-ти больных с лекарственным паркинсонизмом была установлена терапевтическая эффективность спрея на основе раствора пероксида водорода. Клиническое улучшение проявилось в значительном уменьшении тремора, уменьшении мышечной ригидности и неусидчивости (акатизии), улучшении вегетативной симптоматики (уменьшении сальности лица и слюнотечения), оживлении мимики и ослаблении проявлений депрессии. Важно подчеркнуть, что во всех случаях лечебный эффект развивался на фоне отмены общепринятых фармакологических корректоров (циклодол, паркопан).

Установленные в работе механизмы лечебного действия активированного кислорода при паркинсонизме имеют много общих черт с фармакологическим действием селегилина (депренила), первого из применяемых в терапии паркинсонизма ингибитора МАО-B (Кнолл,

1997). К этим общим механизмам действия могут быть отнесены уменьшение эндогенного пероксидного стресса и индукция эндогенной антиокислительной защиты в тканях ЦНС, а также торможение активности МАО-B в базальных ганглиях и в гипоталамусе. Последнее позволяет также предположить возможность уменьшения токсических эффектов экзогенных и/или эндогенных нейротоксинов путем предупреждения их селективного захвата в нервные окончания и повреждения нейронов. Кроме того, нами была продемонстрирована принципиальная возможность активации дофаминэргической системы мозга экзогенным С>2*~ за счет уменьшения супрессии дофаминовых рецепторов лактотропным гормоном аденогипофиза - функциональным антагонистом дофамина.

3. АТМОСФЕРНЫЙ СУПЕРОКСИД КАК ЖИЗНЕННО НЕОБХОДИМЫЙ ФАКТОР

ЕСТЕСТВЕННОЙ ВОЗДУШНОЙ СРЕДЫ

Ранее было уже отмечено, что представления о роли активированных форм кислорода и окислительного стресса in vivo в норме разработаны недостаточно. В предыдущих разделах были приведены свидетельства биологически «целесообразной» и важной роли, которую могут играть экзогенные по происхождению и воздействию кислородные радикалы. В полной мере, однако, ответ на вопрос о биологической роли основного из них, супероксидного радикала О2", можно было получить в исследованиях переносимости животными условий элиминации этого фактора из атмосферного воздуха (депривации).

Опыты были поставлены более чем на 150 животных (крысы, мыши) и воспроизведены на каждом виде животных в четырех повторностях. Элиминация анион-радикала Ог*" в составе аэроионов основывалась на нейтрализации электрического заряда частиц. Была разработана и изготовлена экспериментальная камера с постоянной нейтрализацией аэроионов как из поступающего извне, так и из содержащегося внутри камеры воздуха. В диссертации приведены параметры воздушной среды (содержание аэроионов, СО2, NH3) в депривационных камерах и в контроле. Комплекс методов оценки включал электронно-микроскопическое исследование адено- и нейрогипофиза, показатели пероксидного стресса (супероксиддисмутазная и каталазная активность, содержание МДА в тканях мозга и в крови) и ряд физиологических показателей. Основным результатом исследования было установление 100%-ной гибели животных в условиях депривации. Средняя продолжительность жизни депривированных животных составила 16,2 ± 0,9 суток (мыши) и 23,0 ±1,1 суток (крысы). Из ранних патологических изменений были отмечены угнетение спонтанной двигательной активности и исследовательского поведения. В последующие сроки у животных были отмечены нарастающие нарушения координации движений и груминга, а также потеря веса, вызванная уменьшением и/или прекращением потребления

пищи и воды, уменьшение тонуса скелетной мускулатуры (дрожание конечностей), сильное выпадение шерсти, развитие конъюнктивита, уменьшение ректальной температуры. Со стороны внутренних органов у депривированных животных были отмечены эрозивные изменения и язвы в слизистой оболочке желудка и практически полная инволюция тимуса. Исследование динамики изменений СОД и каталазной активности в тканях мозга и в эритроцитах выявило резкое ухудшение уровня ферментативной антиокислительной защиты и повышенное содержание МДА в эритроцитах периферической крови в предтерминальный (14-е сутки) период (рис. 10).

* *

130 , 128

ВДМгри)

Рис. 10. Динамика изменений активности ферментов СОД и каталазы и содержания МДА в ткани мозга и эритроцитах мышей на 7-е (левый столбец) и 14-е (правый столбец) сутки депривации. В каждой группе п = 7. *) Р < °-05 11 **) р < 0,01 к исх.

Электронно-микроскопическое исследование аденогипофиза крыс на 10-е сутки депривации выявило выраженные нарушения в количестве и относительном составе аденоцитов различных типов, а также резкое возрастание числа дегенерировавших аденоцитов (табл. 3).

В гормон-продуцирующих клетках аденогипофиза было отмечено появление изменений субклеточных структур, характерных для алоптоза (сморщивание цитоплазмы при сохранении целостности клеточной мембраны, конденсация ядерного хроматина, набухание митохондрий). Дегенеративные изменения в нейрогипофизе депривированных животных заключались в преобладании нейросекреторных элементов в стадии истощения при резком уменьшении числа этих структур в стадиях накопления и умеренной секреции нейрогормонов (рис. 11).

СОД (мозг)

СОД (эры)

Кат агаза (эри.)

Таблица 3. Влияние депривации атмосферного супероксида на процентное содержание аденоцитов различных типов в аденогипофизе крыс (10-е сутки депривации, М ± т).

Группа животных ФЗК Гранулярные клетки ДК

СТГ- АКТГ- ТТГ ФСГ- /лг- ЛТГ-

Депривация (п = 5) 12,6 ± 1,8 5,5 ±0,7 8,2 ± 1,7 9,5 ± 1,1 6,6 ±0,7 5,2 ±0,8 52,4 ±5,3

Р(супероксид к контролю) <0,05 <0,001 недостов. <0,001 <0,01 <0,05 <0,001

Контроль (п = 7) 5,3 ±0,7 28,0 ±3,2 9,7 ±1,9 24,4 ±4,1 20,3 ±3,4 12,0 ± 1,8 0,3 ±0,1

Обозначения аденоцитов: ФЗК- фолликулярно-звездчатые; СТГ- соматотропин-продуцирующие; АКТГ- продуцирующие адренокортикотропный гормон; ТТГ-продуцирующие тиреотропный гормон; ФСГ-/ЛГ- продуцирующие фолликуло-стимулирующий и лютеинизирующий гормоны; ЛТГ- продуцирующие лактотропный гормон; ДК - дегенерирующие.

Рис. 11. Изменения в ультраструктурном строении нейрогипофиза и соотношение фаз нейросекреторной активности у контрольных и депривированных крыс на 10-е сутки депривации атмосферного супероксида.

Слева: а и b - ультраструюурное строение; справа: а' и Ь' - соотношение функциональных фаз нейросекреторной активности нейрогипофиза контрольных и депривированных крыс, асс, as, ms и ex, соответственно, фазы аккумуляции, активной и умеренной секреции и истощения; eg -разрушенные гранулы; sm - набухшие митохондрии, М ± ш.

В целом, патофизиологическая картина изменений в гипофизе депривированных животных отражает состояние сильно выражгккоги функционального истощения железы, т.н. пангипопитуитаризм (Daniels, Martin, 1987). Известно, что аналогичный комплекс изменений может быть вызван рядом других факторов, таких, как иммобилизация или холод (Arshavskaya-Popovich, Polenov, 1989), и представляет характерную реакцию организма на действие сильных стрессоров. Основным и контролируемым стресс-фактором в условиях описанных экспериментов была практически полная элиминация атмосферного супероксида из вдыхаемого воздуха. С целью дополнительного подтверждения жизненно важной роли этого радикала, в нескольких экспериментах было предпринято обогащение воздушной среды газообразным супероксидом. Было показано, что таким образом возможно предотвратить гибель животных, если восстановление воздушной среды предпринято до возникновения необратимых изменений в гипофизе, обычно не позднее половины общего срока выживания животных в условиях депривации.

Результаты этого исследования продемонстрировали жизненно важную роль газообразного супероксида внешней среды. Этот вывод подтверждается также результатами проведенного в работе комплекса исследований биологической активности экзогенного супероксида. В целом, полученные в диссертационной работе данные.могут способствовать формированию новых представлений о биологической роли этого радикала, а также других активированных форм кислорода как экзогенного, так и метаболического происхождения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ процессов образования естественных атмосферных и искусственных аэроионов позволил нам высказать гипотезу о том, что в состав пула отрицательно заряженных газовых ионов входит супероксидный анион-радикал кислорода О2*". Приведенными в диссертационной работе результатами исследований доказано существование в окружающей воздушной среде анион-радикала супероксида, входящего в состав атмосферных газовых ионов. Основные физико-химические свойства, биохимические реакции и биологическая активность экзогенного супероксида идентичны супероксидному анион-радикалу Ог", образование которого сопровождает различные процессы клеточного метаболизма (Halliwell, Gutteridge, 1988; Elstner, 1991; McCord, 1995).

Для биофизических и физиологических исследований экзогенного супероксида, а также для целей медицинской апробации и лечебного применения этого радикала был разработан генератор газообразного супероксида, свободного от побочных продуктов ионизации газов, таких как озон, окислы азота, синглетный кислород. С применением комплекса общепринятых методов исследования (спектрофотометрические методы, метод акцепторов,

ингибиторный анализ) в химических моделях, а также in vivo на микроорганизмах, клетках, тканях и целостном организме животных было показано, что основной продукт ионизации, образующийся в коронном разряде в воздухе, смеси азот/кислород и в кислороде проявляет при взаимодействии с клетками и тканями свойства, характерные для супероксидного анион-радикала кислорода Ог"~. На основании полученных данных было сделано заключение об идентичности основного биологически активного продукта отрицательно заряженных газовых ионов с супероксидным радикалом метаболического происхождения.

Было установлено, что биологическое действие экзогенного супероксида и/или продукта его дисмутации - пероксида водорода во всех изученных случаях качественно идентично действию отрицательных аэроионов, отличаясь от последних высокой физиологической активностью и стабильностью. Было также показано, что изученные активированные формы кислорода при ингаляционном пути поступления в организм и возбуждении сенсорных структур слизистой оболочки носовой полости способны модулировать функции центральных механизмов нейроэндокринной регуляции, а также нейромедиаторных дофаминэргической и серотонинэргической систем. Обнаруженное в работе активирование структур гипоталамо-гипофизарного комплекса в ответ на ингаляции экзогенного супероксида может лежать в основе формирования адаптогенных эффектов ингалируемого радикала. Последнее нашло проявление в предотвращении и/или ослаблении повреждающего действия физико-химических (гипербарический и нормобарический кислород) и химических (нейротоксин МФТП, нейролептик резерпин, другие ксенобиотики) факторов. Впервые показано, что ингалируемый супероксид, в сочетании с воздействием повреждающих интенсивностей стресс-факторов, удлиняет стадию резистентности, обеспечивая более продолжительную и устойчивую жизнедеятельность в условиях действия стрессоров. В работе продемонстрировано, что биологические ответы на воздействие изученных стрессоров, а также активированных форм кислорода, зависят от типологических характеристик животных, существенно различаясь у «активных» и «пассивных» особей. На примере сочетанных физиологических эффектов экзогенных активных форм кислорода и биологически активных соединений с центральными механизмами действия (ненаркотические и наркотические анальгетики) показана возможность модификации супероксидом и пероксидом водорода специфической фармакологической активности последних.

В работе приведены доказательства и закономерности изменений эндогенного окислительного стресса в ответ на эндоназальные воздействия исследованных форм кислородных интермедиатов. К ним относятся результаты исследований продуктов свободнорадикальных реакций и активности антиокислительных систем в организме

животных и человека. Приведены примеры применения ингаляций кислородных иптсрмедиатов для активации защитных антиокислительных и других стресс-лимитирующих систем в норме и патологии. Показано, что в описанных условиях применения газообразный супероксид и низкодозированный пероксид водорода не вызывают проявлений общетоксического, а также выраженного раздражающего действия на слизистые носовой полости, дыхательных путей и конъюнктиву глаза животных, что может свидетельствовать об отсутствии взаимосвязи между наблюдаемыми биологическими эффектами активированных форм кислорода и проявлениями их токсического и/или повреждающего действия.

В рамках поставленных в работе задач была экспериментально исследована биологическая роль свободнорадикальной формы кислорода - супероксидного анион-радикала внешней среды в условиях физиологической нормы. Было показано, что в условиях депривации и удаления из воздушной среды отрицательных аэроионов как основного естественного источника экзогенного супероксида, у депривированных животных развиваются дегенеративные изменения в центрах нейрогуморальной регуляции, являющиеся причиной вторичных патологических изменений и ускоренной гибели животных. Искусственное обогащение деионизированной воздушной среды супероксидом позволяет предотвратить вызванные депривацией патологические изменения и гибель животных. Таким образом, была впервые продемонстрирована жизненная потребность млекопитающих в регуляторном действии супероксидного радикала кислорода из внешней среды.

Полученные в работе экспериментальные результаты свидетельствуют о мультипотентности исследованных экзогенных форм активированного кислорода как биологически активных факторов внешней среды. Универсальность и многосторонность действия этих факторов, установленная в условиях физиологических экспериментов, нашла дальнейшее подтверждение в их лечебном действии. На примерах таких впервые обнаруженных в работе эффектов, как потенцирование антиноцицептивного действия анальгетиков, активация эндокринной функции аденогипофиза и моноаминэргических систем мозга продемонстрировано вовлечение центральных нейрогуморальных регуляторных механизмов в биологические ответы на эндоназальные аппликации экзогенных активированных форм кислорода. Выявлена однотипность проявлений клинического улучшения у больных бронхиальной астмой, получавших ингаляции газообразного супероксида, с таковыми, описанными в литературе и полученными при ингаляциях отрицательных аэроионов, что подтвердило наше первоначальное предположение о свободнорадикальной природе активного компонента пула отрицательных

аэроионов и позволило сформулировать новые представления о механизмах лечебного действия этих факторов.

Оценивая полученные в диссертационной работе результаты с позиций эволюционного детерминизма, потребность многоклеточного организма в экзогенном супероксиде может, на наш взгляд, быть следствием глубоких закономерностей, отражающих сложившиеся в процессе эволюции взаимоотношения между клеткой (организмом) и внешней средой. Основываясь на такой интерпретации полученных в работе результатов, мы выдвинули гипотезу, согласно которой зависимость аэробной клетки от присутствия в окружающей среде активированных форм кислорода могла возникнуть уже на раннем, „докислородном", этапе эволюции, и что эндогенное образование супероксида современными жизненными формами отражает эволюционно сформировавшуюся потребность клеток многоклеточных организмов в активных кислородных интермедиатах. Эта гипотеза, подробно изложенная в диссертации, аргументирована данными литературы о роли физических источников энергии (световое излучение Солнца, радиоактивные источники литосферы и атмосферы, электрические разряды) в процессах фотолиза, радиолиза и электролиза воды (Тойоте, 1979; Ма^иПБ, 1981) и в абиогенном образовании активированных форм кислорода (Брасье, Соломон, 1987). Возникшее на самых ранних этапах формирования клетки, взаимодействие этих продуктов с зарождающейся протоплазмой могло сохраниться в эволюции путем интегрирования в метаболические процессы примитивных клеток и найти отражение в многочисленных клеточных функциях активированных форм кислорода у современных организмов.

Используя изложенные выше соображения, представляется возможным дать объяснение известным (ЕЬЩег, 1990; МсСогс!, 1995) фактам многообразия внутриклеточных источников супероксида у современных эукариотических клеток. В рамках предлагаемой гипотезы предполагается, что существование известных внутриклеточных процессов и реакций, ведущих к образованию активированных форм кислорода, является отражением потребности аэробных, в первую очередь, эукариотических, клеток в этих биологически активных кислородных интермедиатах. Функцию наиболее стабильного и непосредственно связанного с аэробным метаболизмом источника активных кислородных интермедиатов стали выполнять митохондрии, «научившиеся» очень тонко и изящно регулировать не только соотношение продукции кислорода и супероксида (Скулачев, 1996), но также, возможно, ключевой в эволюции механизм г -> К-перехода (Скулачев, 1999).

На основе предложенного подхода в гипотезе рассматривается также роль супероксиддисмутаз, в первую очередь эволюционно более древних Ре-СОД и Мп-СОД, которая могла заключаться первоначально в регуляции потока супероксида в клетку из

внешней среды, а также в контролируемом образовании пероксила водорода в области наружной клеточной мембраны. В пользу сформулированной нами гипотезы могут свидетельствовать новые данные об участии супероксида и пероксида водорода в регуляции таких основных клеточных функций, как проницаемость клеточных и митохондриальных мембран (Rao et al., 1997; Ochoa et al., 1990; Siflinger-Bimboim et al., 1992; Siflinger-Bimboim et al., 1996), работа Ca2+ насосов (Grover et al., 1992), клеточный (Wang et al., 1998) и митохондриальный (Tanaka et al., 1996) мутагенез, клеточная подвижность (de Lamirande et al., 1997; Baiardi et al., 1997; Маньковская, Серебровская, 1998), стимуляция (Huahua et al., 1991) и угнетение (Cantoni et al., 1994) роста и дифференцировки клеток (Fraser et al., 1996), апоптоз (Dobmeyer et al., 1997). С биологической точки зрения наиболее важным представляется участие активированных форм кислорода в клеточном делении (Murrell et al., 1989; Nicotera et al., 1994) - процессе, формирование которого в эволюции предшествовало появлению фотосинтеза и клеточной продукции супероксида (Margulis, 1981). Таким образом, изложенные представления позволяют объяснить природу формирования зависимости клеточного метаболизма от активированных кислородных интермедиатов.

Продемонстрированная в работе потребность организма животных в содержании экзогенного супероксида в атмосферном воздухе может представлять собой отражение этой сформировавшейся в эволюции зависимости и послужить основой для дальнейшей разработки вопроса о биологической роли свободнорадикальных состояний для нормального функционирования организма.

ВЫВОДЫ

1. Приведены экспериментальные доказательства идентичности общебиологических и физиологических эффектов Ог*~ воздушной среды и отрицательных аэроионов.

2. Разработан генератор отрицательно заряженных газовых ионов кислорода. С применением комплекса общепринятых биофизических и биохимических методов исследования показано, что в условиях первичной ионизации в коронном разряде кислорода и/или азота с последующим выдувом продуктов ионизации в кислород, в пуле отрицательно заряженных газовых ионов содержится продукт, по всем изученным показателям идентичный супероксидному анион-радикалу Ог*". Авторские права на способ и устройства для генерации О2" в газовой фазе для исследовательских целей и терапевтического применения защищены двумя патентами.

3. Показано, что экзогенный супероксид обладает физиологической активностью при ингаляционном способе применения. СОД и катапаза, нанесенные на слизистую оболочку носовой полости в сочетании с экзогенным супероксидом, модифицируют эти

физиологические ответы; замена Ог*~ пероксидом водорода воспроизводит физиологическую активность супероксидного радикала. Физиологическая активность Ог*" и пероксида водорода при эндоназальных аппликациях проявляется на основных регуляторных системах организма, включая ВНД, нейротрансмиттерные системы мозга, эндокринную и иммунную системы.

4. Показано, что экзогенный супероксид проявляет адаптогенные свойства, повышая устойчивость организма к действию экстремальных интенсивностей различных физических и химических факторов. Адаптогенное действие Ог*" реализуется на физико-химическом, биохимическом и физиологическом уровнях, включая процессы перекисного окисления липидов, механизмы антиокислительной защиты, моноаминэргические системы мозга, эндокринную регуляцию.

5. Впервые обнаружено, что 02*~ и Н202 при эндоназальном воздействии i) угнетают активность моноаминоксидаз МАО-А и МАО-B в гипоталамусе и базальных ганглиях мозга, активируя дофаминэргическую и серотонинэргическую нейротрансмиттерные системы и уменьшая уровень эндогенного окислительного стресса в этих структурах мозга; ii) обладают нейропротекторным действием в моделях паркинсонизма, таких как нейролептическое действие резерпина и нейротоксическое действие МФТП и iii) активируют антиноцицептивные механизмы ЦНС, усиливая болеутоляющее действие анальгетиков различной природы.

6. Показано, что в условиях непрерывной депривации атмосферного супероксида у экспериментальных животных развиваются патологические нарушения в подкорковом гипоталамо-гипофизарном комплексе, обнаруживаемые в форме структурных изменений в нейро- и аденогипофизе и являющиеся причиной нарушения физиологических функций и гибели животных. Патогенное действие депривации может быть предотвращено введением в воздушную среду экзогенного 02*~. Эти данные подтверждают нашу гипотезу о жизненно важной роли атмосферного супероксида для реализации основных жизненных функций у млекопитающих в норме.

7. В клинических исследованиях впервые показана терапевтическая активность эндоназальных воздействий Ог" и Н202 у человека: i) при лечении болезни Паркинсона и лекарственного паркинсонизма; ii) в модели экспериментальной боли и iii) при лечении атопической формы бронхиальной астмы. Первые два способа защищены патентами.

В. Выдвинута гипотеза о роли 02*~ и Н2О2 абиотического происхождения в эволюции клетки, а также изложены новые представления о роли рецепторов слизистой оболочки

носовой полости в рецепции и реализации на уровне организма регуляторного действия этих активированных форм кислорода.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванов И.И., Бузас С.К., Гольдштейн Н.И. Изучение кинетики хемилюминесценции в реакциях ингибированного окисления ненасыщенных жирных кислот. В кн.: "Сверхслабые свечения в биологии", M., 1969, с. 26.

2. Бузас С.К., Гольдштейн Н.И., Иванов И.И., Тарусов Б.Н. О механизмах хемилюминесценции в реакциях окисления молекулярным кислородом ненасыщенных жирных кислот. В кн.: "Сверхслабые свечения в биологии", М. 1969; с. 26-27.

3. Мерзляк М.Н., Петрусевич Ю.М., Гольдштейн Н.И. Хемилюминесцентное исследование липидов в начальный период после облучения ионизирующей радиацией. В кн. ¡"Сверхслабые свечения в биологии", М., 1969, с. 42.

4. Гольдштейн Н.И., Бузас С.К., Иванов И.И., Волегов А., Тарусов Б.Н. Хемилюминесценция липидов различных органов мышей линий СэН и С57. В кн.:"Сверхслабые свечения в биологии", М., 1969; с. 14.

5. Бузас С.К., Гольдштейн Н.И., Иванов И.И., Тарусов Б.Н. Исследование хемилюминесценции липидов из митохондрий печени крыс после однократного подкожного введения канцерогенов. В кн.: "Сверхслабые свечения в биологии", М., Наука, 1969; с. 52-60.

6. Бузас С.К., Гольдштейн Н.И., Мерзляк М.Н., Кочур H.A., Тарусов Б.Н. О возможной биологической роли токоферола и продуктов его окисления с точки зрения их алтиокислительных свойств. Тез. докл. 2 Всесоюзн. биохим. съезда, Ташкент, 1969.

7. Мерзляк М.Н. Бузас С.К., Гольдштейн Н.И., Иванов И.И., Тарусов Б.Н. Хемилюминесценция в реакциях окисления жирных кислот и липидов. В кн.: "Проблемы биофотохимии", М., МГУ, 1970; с. 17-18.

8. Busas S., Goldstein N., Ivanov I., Koshanov N., Petrusevich Yu., Tarusov B. The role of tocopherols in radiosensitivity of animals. 4-e Congres International de Radiobiologique et de Physicochemique des Rayonements. Book of abstracts. Evion, 1970, № 129, 37.

9. Иванов И.И., Бузас C.K., Гольдштейн Н.И., Тарусов Б.Н. Применение активаторов для изучения механизмов хемилюминесценции при окислении жирных кислот и липидов. Биофизика, 1971; 16,4, с. 735-737.

10. Мерзляк М.Н. Гольдштейн Н.И., Бузас С.К., Галкина С.И., Иванов И.И., Тарусов Б.Н. Оценка возможностей кинетического хемилюминесцентного метода при изучении перекисного окисления липидных систем. 4-й Международный биофизический конгресс. М„ 1972; кн. 4, с. 357.

11. Бузас С.К., Гольдштейн Н.И., Иванов И.И. Механизмы хемилюминесценции при окислении жиров и жирных кислот. В кн.: "Сверхслабые свечения в биологии", М., Наука, 1972, с. 52-60.

12. Гольдштейн Н.И., Рыболовлев Ю.Р., Бузас С.К., Иванов И.И. Тарусов Б.Н. Исследование хемилюминесценции липидов из митохондрий печени крыс после однократного введения канцерогенов. В кн.: "Сверхслабые свечения в биологии", М., Наука, 1972; с. 151-153.

13. Иерусалимский А.П., Гольдштейн Н.И. Влияние повторно-кратковременного воздействия статического электрического поля и электризации на содержание сульфгидрильных групп в крови белых крыс. В кн.: "Проблемы клинической биофизики", Рига, Зинатне, 1972; с. 59-66.

14. Гольдштейн Н.И., Синельщикова М.П., Хинценберг Я .А. Влияние статических электрических полей на лейкергию у белых крыс. В кн.: "Проблемы клинической биофизики", Рига, Зинатне, 1972; с. 51-54.

•

15. Гольдштейн Н.И., Феоктистова Р.П., Чеботаренок И.Н. Экспериментальная установка и камера для изучения влияния СЭП и электризации на лабораторных животных. В кн.: "Проблемы клинической биофизики", Рига, Зинатне, 1972, с. 37-41.

16. Бузас С.К. Гольдштейн Н.И., Иванов И.И. Механизмы хемюпоминесценции при окислении жиров и жирных кислот. В кн.: "Сверхслабые свечения в биологии" , М., Наука, 1972; с. 52-60.

17. Гольдштейн Н.И., Бузас С.К., Мерзляк М.Н. Иванов И.И., Петрусевич Ю.М. Изучение хемилюминесцентным методом влияния рентгеновского излучения на липидные антиокислители животных. В кн.: "Сверхслабые свечения в биологии", М., Наука, 1972; с. 144-147.

18. Портнов Ф.Г., Гольдштейн Н.И., Иерусалимский А.П., Райт Э.Я., Синелыцикова М.П. Исследование воздействия статического электрического поля на организм в эксперименте. В кн.: "Защита от вредного воздействия статического электричества в народном хозяйстве. Северодонецк", 1973; с. 73.

19. Мерзляк М.Н., Гольдштейн Н.И., Бекенева Г.П., Бузас С.К., Иванов И.И., Тарусов Б.Н. К вопросу о роли токоферола и продуктов его окисления при лучевом поражении. В кн.: "О механизмах природной и модифицированной радиочувствительности", М., МГУ, 1973, с. 118-126.

20. Портнов Ф.Г., Иерусалимский А.П., Гольдштейн Н.И., Райт Э.Я., Синелыцикова М.П. Биологическая активность электростатических полей, действующих в постоянном и интермиттирующем режимах. В кн.: "Физико-химические основы действия физических факторов на живой организм", М., Наука, 1974; с. 101-103.

21. Портнов Ф.Г., Гольдштейн Н.И., Иерусалимский А.П., Райт Э.Я., Синелыцикова М.П. К вопросу об адаптации при действии электростатических полей. В кн.: "Физико-химические основы действия физических факторов на живой организм", М., Наука, 1974; с. 104-106.

22. Гольдштейн Н.И., Портнов Ф.Г., Иерусалимский А.П., Райт Э.Я., Синелыцикова М.П. Экспериментальное исследование биологического действия статических электрических полей различной напряженности. В кн.: "Физико-химические основы действия физических факторов на живой организм" , М., Наука, 1974; с. 96-101.

23. Гольдштейн Н.И., Портнов Ф.Г., Иерусалимский А.П., Райт Э.Я., Синелыцикова М.П., Бирк М.Б. О механизме действия статических электрических полей. В кн.: "Физико-математические и биологические проблемы действия электромагнитных полей и ионизации воздуха", Ялта, 1975; т. 2, с. 160-163.

24. Портнов Ф.Г., Гольдштейн Н.И., Иерусалимский А.П., Райт Э.Я., Синелыцикова М.П. Исследование воздействия статического электрического поля на организм в эксперименте. В кн.: "Защита от вредного воздействия статического электричества", М., НИИТЭХИМ, 1975; с. 124-127.

25. Портнов Ф.Г., Гольдштейн Н.И., Иерусалимский А.П., Райт Э.Я., Синелыцикова М.П. Бирк М.Б. Переокисление в тканях крыс после вдыхания аэроионов положительной полярности. В кн.: "Свободнорадикальное окисление в норме и патологии" , М., Наука, 1976; с. 155-156.

26. Портнов Ф.Г., Гольдштейн Н.И., Иерусалимский А.П., Райт Э.Я., Синелыцикова М.П. Экспериментальное изучение влияния электростатических полей на процессы перекисного окисления в организме. В кн.: "Свободнорадикальное окисление в норме и патологии", М., Наука, 1976, с. 153-155.

27. Портнов Ф.Г., Гольдштейн Н.И., Сондоре A.A., Сорокин Ю.А., Маркарова Н.Г. Усиление перекисного окисления как показатель повреждения печени в острой гипоксии. В кн.: "Свободнорадикальное окисление в норме и патологии", М., Наука, 1976; с. 157-159.

28. Гольдштейн Н.И., Иерусалимский А.П., Райт Э.Я., Синелыцикова М.П., Бирк М.Б. Кумулятивное действие электростатических полей. В кн.: "Проблемы клинической биофизики" , Рига, Зинатне, 1977; с. 18-27.

29. Портнов Ф.Г., Гольдштейн Н.И. Некоторые методологические вопросы проблемы биологического действия факторов электронно-ионкой технологии. В KH.t 'Проблемы клинической биофизики", Рига, Зинатне, 1977; с. 5-S.

30. Гольдштейн К.И. Некоторые биофизические аспекты биологической активности электростатических полей. В кн.: "Проблемы клинической биофизики", Рига, Зинатне, 1977; с. 10-17.

31. Гольдштейн Н.И. Устойчивость некоторых биосубстратов и их моделей к перекисному окислению в атмосфере аэроионов. В кн.: "Клеточная и субклеточная патология печени", Рига, Зинатне, 1982; с. 91-96.

32. Азизова O.A., Гольдштейн Н.И., Шинкаренко Л.И. Изучение методом термохемилюминесценции тканевых липидов в условиях ГБО. "Использование ГБО в анестезиологии и реаниматологии". Материалы Всесоюзн. конференции, М., 1985.

33. Гольдштейн Н.И., Шинкаренко Л.И. Возможность применения хемилюминесцентных методов для оценки состояния здоровья. "Проблемы оценки функциональных возможностей человека и прогнозирование здоровья". Тез. докл. Всесоюзной конференции, 3-5 декабря 1985; с. 114.

34. Гольдштейн Н.И., Сондоре Л.И., Шинкаренко Л.И., Жемчугова Т.Л. Изменения процесса перекисного окисления в условиях действия гипербарической оксигенации. В кн.: "Биологические мембраны и патология клетки", Рига, 1986; с. 101-106.

35. Шинкаренко Л.И., Козлов A.B., Гольдштейн Н.И., Азизова O.A., Владимиров Ю.А. Антиоксидантная система церулоплазмин - трансферрин при гипербарической оксигенации у крыс. Бюлл. экспериментальной биол. и медицины, 1987; 9, с. 281-283.

36. Шинкаренко Л.И., Гольдштейн Н.И., Козлов A.B., Азизова O.A. Применение метода электронного парамагнитного резонанса в изучении регуляторной роли церулоплазмина и трансферрина сыворотки крови животных в условиях действия гипербарической оксигенации. В кн.: "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине", Рига, 1988; с. 190-201.

37. Гольдштейн Н.И., Скардс И. Влияние модифицированного кислорода на оксилительный метаболизм дрожжей. В кн.: "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине", Рига, 1988; с. 272-277.

38. Гольдштейн Н.И. Аэроионы: возможная роль активных форм кислорода в механизмах биологического действия. В кн.: "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине", Рига, 1988; с. 80-108.

39. Г-ольдштейн Н.И., Шинкаренко Л.И., Сондоре Л.И., Зирнис А.Я., Андреев Г.Н. Информативность некоторых биофизических и биохимических методов исследования крови в оценке токсического действия лечебных режимов ГБО. "Гипербарическая оксигенация (Новое в практике и теории)". Тезисы 4-го симпозиума, М., 10-12 октября 1989; с. 159-160.

40. Вартанян O.A., Козлов A.B., Шинкаренко Л.И., Гольдштейн Н.И., Азизова O.A., Владимиров Ю.А. Изучение роли системы церулоплазмин - трансферрин в регуляции перекисного оксиления липидов сыворотки крови при различных режимах гипербарической оксигенации. Вопросы медицинской химии, 1989; 1,с. 31-35.

41. Arshavsky V., Goldstein N., Aroncika В., Konstantinova О., Raits E. Ka smarza ietekme trauksmes limeni personam ar dazadu puslozu reagesanas tipu. Latv.Arsts, 1991; 2, p.77-80.

42. Мерзляк M.H., Иванова Д.Г., Решетникова И.В., Гужова Н.В., Гольдштейн Н.И. Индуцированная пероксидом водорода люминолзависимая хемилюминесценция раневых диффузатов листьев картофеля. Биохимия, т. 56, вып. 10, с. 1798-1804.

43. Goldstein N.I., Goldstein R.N., Merzlyak M.N. Negative air ions as a source of superoxide. Int. J. Biometeorol. 1992, 36, pp. 118-122.

44. Goldstein N., Rehberg G., Lewin Т., Klefisch F.-R., Korkina L. Inhalation von gasförmigem Superoxid: Neue Aspekte in der Asthmatherapie. Österreichische Gesellschaft für Lungenerkrankungen und Tuberkulose. Gmunden, 1995.

45. Goldstein N., Rehberg G., Lewin Т., Klefisch F.-R., Korkina L. Inhalation gasförmigen Superoxids induziert antiasthmatische Mechanismen. Pneumologie, № 2, 1995; S. 338.

46. Goldstein N., Rehberg G., Lewin Т., Klefisch F.^R. Die nasale Inhalation von gasförmigem Superoxid verbessert eingeschränkte spirometrische Werte und Befinden asthmakranker Kinder. Atemwegs- und Lungenkrankheiten, 1996; 11, S.589.

47. Goldstein N., Baumann S., Lewin Т., Rehberg G., Kamensky A., Dubinin V., Konstantinova 0. Exogenous gaseous superoxide potentiates the antinociceptive effect of opioid analgesic agents. Inflammation Researsch, 1996; 45, pp. 473-478.

48. Goldstein N., Rehberg G., Voskresenskaya O., Levitskaya N., Dubinin V., Kamensky A. Die Inhalation von Superoxid potenziert die analgetische Wirkung niedrig dosierter Analgetika bei Menschen. Der Schmerz, 1997; Band 11, Heft 1, S. 67.

49. Goldstein N., Rehberg G., Lewin Т., Klefisch F.-R. Die nasale Inhalation von gasförmigem Superoxid verbessert eingeschränkte spirometrische Werte und Befinden asthmakranker Kinder. Atemwegs- und Lungenkrankheiten, 1997; 8, S. 437-438.

50. Goldstein N., Arshavskaya T. Is atmospheric superoxide vitally necessary? Accelerated death of the animals in a quasi-neutral electric atmosphere. Biosciences, 1997; 52c, pp. 396-404.

51. Goldstein N., Rehberg G., Lewin Т., Klefisch F.-R. Adjuvante Inhalationstherapie des Asthma bronchiale mit exogenem Superoxid. Physikalische Medizin, 1997; 7, S. 138-140.

52. Гольдштейн H., Реберг Г., Клефиш Ф.-Р. Ингаляция супероксида как адьювантный метод лечения детей, больных бронхиальной астмой. Проблемы туберкулеза, 1997; 6, с. 54-58.

53. Гольдштейн Н., Реберг Г., Клефиш Ф.-Р. Супероксид в адьювантной терапии детей, больных бронхиальной астмой. Тез. докл. на 3 съезде научн.-мед. ассоциации фтизиатров, М., 1977.

54. Goldstein N. Exogenous superoxide is a vital necessary component of the environment. Aerosols: science, devices, software & technologies of the former USSR. 1998; Vol. 4a, No2, pp. 40-41.

55. Гольдштейн H., Реберг Г., Клефиш Ф.-Р., Коркина JI. Применение газообразного супероксида в лечении больных с бронхо-легочной патологией. Проблемы туберкулеза, 1999, №6, с.

56. Goldstein N. Verfahren und Einrichtung zur Erzeugung von definierten ionisierten Gasen bzw. Gasgemischen. Patent DE 41 12 459; 1991.

57. Goldstein N. Verfahren und Vorrichtung zur Erzeugung von gasförmigen Sauerstoffanionen-Radikalen. Patent DE 195 12 228; 1995.

58. Goldstein N., Lewin T. Sauerstoffanionenradikale enthaltende therapeutische Mittel und deren Verwendung zur Schmerzbehandlung. Patent DE 19 514 522; 1995.

59. Goldstein N. Sauerstoffanionenradikale und/oder deren Folge- und Abbauprodukte enthaltende therapeutische Mittel und deren Verwendung zur Behandlung von Morbus Parkinson. Patent DE 197 08 643; 1997.

Информация о работе

Гольдштейн, Наум Исаакович
доктора биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Биофизические аспекты физиологического действия экзогенного О2 на животных ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Биофизические аспекты физиологического действия экзогенного О2 на животных"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биофизические аспекты физиологического действия экзогенного О2 на животных
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика