Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Белоксинтезирующая система осевых органов семени фасоли

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Белоксинтезирующая система осевых органов семени фасоли"

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЯ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукошки

К03ЕК0 Людмила Евгеньевна

БЕЛОКСИНТЕЗИРЭТОЩАЯ СИСТЕМА ОСЕВЫХ ОРГАНОВ СЕМЕНИ ФАСОЛИ

( 03.00.12 - физиология растений )

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев, 1991

Работа выполнена в отделе физиологии растении Института ботаники им. Н. Г. Холодного АН Украины

Научный руководитель: доктор биологических наук МУСАТЕНКО Л. И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук ТРОЯНВ.М.

кандидат биологических наук ЕРАЛОН A.B.

Ведшая организация: Льговский государственный университет им.И.Франко

Защита состоится " "Jf ^1тУт. в " часов на заседании Специализированного согета Д. 016.57.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук

при Институте физиологии растений и генетики АН Украины

£

по адресу: 252022, Киев, ул.Еасильковская, 31/17.

С диссертацией можно ознакомиться б библиотеке Института физиологии растений и генетики АН Украины

Автореферат .разослан " Wb&^ß igg/r.

Ученый секретарь. Специализированного совета, кандидат биологических наук

ГРУХАНОВ

В. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение процессов, обеспечивающих подготовку семян к прорастанию всегда пршлекало пристальнее внимание исследователей. При этом особенности метаболизма семени, позволяющие ему завершить созревание, перейти к поною, прорасти при благоприятных условиях и развиться во взрослое растение, остаются все еще мало изученными.

Подготовка семени к прорастанию происходит в ходе эмбриогенеза и высыхания семени. Частью этого сложного процесса является синтез запасных белков ' и запасание сформированных мРНК, которые, по-видимому, играют важную роль в реактивации трансляции при набухании семени. Роль этих белков и мРНК в прорастании трактуется неоднозначно. Недостаточно ясно их участие в подготовке ростовых процессов.

В органах зародышевой оси прорастающего семени ростовые процессы отличаются по характеру и по времени реактивации. Клетки гипокотиля начинают растягиваться при достижении необходимой степени оводненности [Обручева, 1990]. Растяжение гипокотиля обеспечивает разрыв семенной кожуры и вынос корня на поверхность. 1<1итотическая активность клеток корня возобновляется после йаклевывания семени. А пролиферация и растяжение клеток (зародышевого листа начинаются через определенный период после Начала митозов в корне [Ситник и др., 107?; Обручева, 19321. Столь разительные различия в ростовых процессах зародышевых органов позволяют ожидать определенной органоспешгфичности экспрессии генома. Исходя из представления о семени, как о целостном организме, отдельные части которого подчинены общим закономерностям развития, важно понять соотношение общего в метаболизме семени и специфики развития каждого органа. В этом отношении весьма информативным является изучение синтеза РНК и белка км« ключевого звена в метаболизме организма.

При переходе семян от созревания к прорастанию должны происходить значительные изменения в экспрессии генома. Экспрессия генов, обеспечивающих синтез запасных веществ, должна снижаться, а синтез ферментов, участвующих в мобилизации запасных Ееществ, и синтез белков, необходимых для роста зародыша, должен увеличиваться. Решение этих вопросов актуально для понимания Молекулярных механизмов, обеспечивающих высокое качество семян, так

как энергия прорастания коррелирует с активностью белоксинтезиругащей системы в начальный период прорастания [Решала et ai., 1979; Bray, Smith, 19851.

Существуют многочисленные свидетельства в пользу того, что эти процессы могут регулироваться на уровне фитогормонов и их рецепторов. Значительную роль отболят абсцизовой кислоте (АЕК), так как динамика ее содержания в тканях семени тесно коррелирует с ходом развития и с определенными изменениями в генной экспрессии, б частности, синтезом запасных белков и, возможно, синтезом префорьшрованных мРНК и их маскированием [Dure, Harris, 1977]. Механизм регулирующего действия АБК пока еще мало понятен. Экзогенная АБК подавляет прорастание семян. Таким же эффектом обладает и предполагаемый регулятор роста растений - жасмоновая кислота (ЖК) [Далешшя, Зембднер, 1S89], действие которой на белоксинтезирующую систему семян практически не изучено. В этой связи для выяснения механизмов действия этих веществ весьма интересно их сравнительное изучение. Актуальность таких исследований усиливается поиском природных веществ, способных регулировать процессы созревания и прорастания семян.

Дели ц задачи исследования. Основной целью данной работы было изучение особенностей функционирования белоксинтезирующей системы осевых органов семени фасоли в связи с прекращением ростовых процессов и переходом к покою при созревании, а также с выходом из покоя и реактивацией ростовой активности в период прорастания. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи.

1. Определить изменение активности белоксштезирующей системы и набора синтезируемых полипептидов зародышевой оси созревающего семени при переходе от активного роста к покою.

2. Оценить вклад преформированных и новосинтезированных мРНК в трансляцию на каждой стадии прорастания, охарактеризовать кодируемые ими поллпептиды.

3. Сравнить изменение трансляционной активности и набора синтезируемых шшшептидов в осевых органах, характеризующихся различным типом и временем реактивации роста в ходе прорастания семени.

4. Оценить роль оводненности клеток в переключении экспрессии генома при прорастании.

5. Исследовать в модельной системе АЕК- п ЖК-зависимне процессы б характере генной экспрессия семени.

Научная новизна работы.

Установлено, что снижение активности белоксинтезирующей системы зародышевой оси семени фасоли при завершении созревания сопровождается уменьшением продуктивности суммарной РНК в бесклеточной системе трансляции, а также качественными изменениями в наборе транслируемых мРНК в направлении снижения интенсивности синтеза полипептшюв с pi 5,85-6,85 и активацией синтеза полипептидов с pl>7, преобладающих в зародыше зрелого сухого семени. Определено, что преформированные мРНК являются основными транслируемыми мРНК в зародышевой оси в фазу набухания, а мРНК, синтезированные de novo в этот период, идентичны преформированным. Осевые органы обладают набором преформированннх мРШ, обеспечивающих синтез аналогичных полипептидов. В лаг-фазу ведущая роль в синтезе белка переходит к новооинтезированным мРНК. Начинают синтезироваться белки о pi 5,85-6,85, которые становятся доминирующими в Фазу растяжения. Однозначно показано, что в органах с различной ростовой активностью картина белкового синтеза имеет сходный характер и изменяется синхронно в ходе прорастания семени.

Установлено, что низкий уровень оводненности клеток зародышевой оси, поддерживаемый искусственно, препятствуя инициации растяжения клеток гигокатиля, сохраняет синтез белков, характерных для Фазы набухания, на транскрипционном уровне.

Впервые показано, что действие' экзогенных АБК и JKK на активность белоксинтезирующей системы зародышевой оси вызывает эффекты различной направленности и степени выраженности в зависимости от этапа развития семени и носит органоспеиифичный характер. При совместном их действии соблюдается принцип аддитивности по отношению к набору синтезируемых белков. Определены эффекты экзогенных АБК и ЖК в отношении состава белков, синтезируемых в осевых органах на различных этапах жизни семени. Впервые определено, что экзогенная ЖК активирует синтез белков, характерный для растущих тканей. Синтез белков, индуцируемых экзогенной АБК, коррелирует с подавлением инициации растяжения клеток гипокотиля даже при наличии белкового синтеза, поддерживаемого экзогенной ЖК. Подавление прорастания семени фасоли в присутствии ЖК связано с резким подавлением интенсивности транскрипции и трансляции. Установлено влияние экзогенной ЖК на .синтез различных классов РНК.

Полученные результата расширяют знания об изменениях в синтезе

белка осевых органов семени на ключевых етапах развития и о возможности регуляции таких изменений водным статусом и экзогенной обработкой АБК и ЖК, а также обогащают представление о влиянии природных- регуляторов роста - АБК и ЖК - на экспрессию генома семян.

Апробация работы состоялась на заседании отдела физиологии растений Института ботаники им. Н. Г. Холодного АН Украины и на заседании научно-методического семинара отдела физиологии роста и развития Института физиологии растений и генетики АН Украины. Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых и исследователей Института ботаники им. Н. Г. Холодного АН Украины (Канев, 1089), на II Всесоюзном съезде физиологов растений (Минск, 1990), на Всесоюзном рабочем совещании по программе 'Тегуляторы роста и развития растений" (Москва, 1991), на 14-й Международной конференции по регуляторам роста растений (Амстердам, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 155 страницах машинописного текста, содержат 3 таблицы и 24 рисунка, Библиография включает 252 наименования, из них 195 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работу проводили с семенами белой спаржевой фасоли /Phaaeolua vulgaris Ь./, сорта "Белозерная". Семена стерилизовали с поверхности этанолом, при необходимости отделяли одну семядолю и инкубировали необходимое время в темноте при 28°С на фильтровальной бумаге, смоченной дистиллированной водой или раствором соответствующего регулятора роста, содержащих стрептомицин ( 50 мг/л).

Определение концентраций рострегулирующих веществ, ингибирую-5Шх прорастание семян. Определяли действие ' АБК ( 10"%, 10~5М, кНм) ; ЖК (5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 мг/л) ; полиэтилеагликоля (ПЭГ). ММ6000 (10, 20, 30, 40%). В чашку Петри помещали по 20 семян. Подсчитывали количество проросших семян через 18, 20, 22, 24 часа после начала набухания ( ИНН) • Через 24 часа ЛНН измеряли длину зародышевых осей проросших семян.

Постановка опытов о мечеными предшественниками. Перед мечением

зародышевые оси отделяли от семядоли и помещали в раствор меченого соединения (^Е-метионина, ^Н-уршшна), с сохранением варианта опыта, на необходимый период. При определении аффективной ингибирумцей синтез мРНК концентрации «-аманитина зародышевые оси, изолированные из сухих зрелых семян, помещали на 3 часа в раствор, содержащий ^Н-уршшн и ч-амакптин (5, 10, 20, 50 или 100 мг/л).

Обработка меченых зародышевых осей. После окончания периода инкубации с меченым соединением зародышевые осп отмывали холодной дистиллированной водой, при необходимости препарировали на зародышевые органы на льду, взвешивали, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°0. Замороженный материал измельчали в охлажденной ступке в присутствии среды для гомогенизации (0,1 М трнс-HCl рН 7,4, содержащий 25 мМ КС1 и 10 мМ MgCl.3). В опыте с мечением бежа в гомогенизационнум среду добавляли протеопротектор ШСФ (50 мг/л). Центрифугат использовали для определения радиоактивности в ТХУ-растЕориыом и ТХУ-осаждаемом материале и для подготовки белков к электрофорезу.

Определене радиоактивности в ТХУ-осаждаемом и ТХУ-растворимом материале. Радиоактивность в ТХУ-осаждаемой фракции измеряли с помощь.» метода бумажных дисков [Капа, Novelli, 1961]. Определение радиоактивности в ТХУ-растворимом материале проводили по [Гумилевская и др., 19841, Измерение радиоактивности проводили с помощью сшгатилляционного счетчика 1S-100C ("Beekman", США), Долю включения меченого соединения в РНК или белок определяли как отношение среднестатистических значении включения к поглощению.

Выделение РНК из зародышевых осей проводили фенольно-детергентным методом с использованием буферного растЕора 0,05 М трис-HCl рН 7,6, содержащего 0,01 М MgCl3 и 0,06 М КС1.

Фракционирование РНК в градиенте концентраций сахарозы 10-2-5» проводили по [Дощанов и др., 19751. Перед нанесением на градиент РНК растворяли в буфере для выделения РНК. Пробы центрифугировали в течение 4-х часов при 38000 об/мин в роторе SW-40 центрифуги L5-50 ("Beekman", США) при температуре 20°0. После фракционирования градиента в каждой фракшш спектрофотометрически измеряли оптическую плотность при 260 нм и определяли радиоактивность РНК.

Бесклеточная система трансляции. Трансляцию In vitro анализировали в бес-клеточной системе на основе лизата ретикулоцитов .кролика, приготовленной по [Клеменс, 1937].

Определение концентрации бежа в растворах проводили по методу

[bowry et al., 1951J, используя коммерческий реактив Фолина, и по методу [Bredford, 19761 в микромодификацш.

Электрофоретическое разделение белков проводили в полиакриламшшом геле (ПААГ) в .присутствии DS-Na по модифицированному методу ILaemmli, 1970]. Двумерный электрофорез белков проводили в ПААГ по модифицированному методу CO'Parrell, 1975]. Первым направлением разделения белков было пзоэлектрофокусирование, вторым - электрофорез в ПААГ-DS-Na. Молекулярные массы белков определяли по [Weber, Osborn, 1969].

Для получения радиоавтографов меченых белков гели высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой. Для получения флюорограым гели перед высушиванием импрегнировали "Amplify".

Статистическую обработку результатов проводили методом дисперсионного анализа о использованием пакета программ "Statgraflcs"((STSC, Канада),

РЕЗУЛЬТАТУ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Синтез белка при созревании семени. Задачей данного раздела работы было определение состояния белоксинтезирующей системы зародышевой оси в связи со снижением ростовой активности семени, переходом его в состояние покоя и подготовкой к прорастанию. С этой целью трансляционную активность изучали в экспериментах in vivo и in vitro. Подавление роста и начало обезвоживания клеток сопровождается снижением активности белоксинтезирущего аппарата. Такие изменения могут свидетельствовать как о снижении уровня синтеза цитоплазматических РНК [Мусатенко и др., 1985], так и о постепенном. маскировании мРНК в нетранслируемой форме. Снижается продуктивность в бесклеточной системе трансляции тотального препарата РНК, выделенного из зародышевых осей на 30-й, 40-й и 50-й день эмбриогенеза. В созревающих семенах фасоли соотношение синтеза рРНК/мРНК в зародышевой оси изменяется в пользу мРНК С Мусатенко и др., 1985]. Поэтому снижение продуктивности РНК может быть связано с уменьшением доли поли(А)+РНК в суммарной мРНК к концу созревания. Показана высокая удельная активность трансляции РНК из зародышевых осей сухих зрелых семян. Возможно, что мРНК более стабильна по сравнению с остальными классами РНК в период высыхания семени.

Компонентный состав синтезируемых полипептидов претерпевает в ходе созревания значительные изменения. Постепенное снижение синтеза большой группы полипептидов широкого диапазона мол. ы. и pi

в интервале 5,85-6,85 происходит одновременно с активацией синтеза полипептилов с более щелочной pi, преобладающих в зародыше зрелого семени.

2.Зависимость синтеза белка от синтеза мРНК йй ПШ2 ПЕН прорастании. Определение интенсивности синтеза бежа при набухании зародыша в условиях подавления синтеза мРНК с использованием а-аманитина в течение первых 9 часов (рис.1) позволило установить, что реактивация трансляции в зародышевой оси семени фасоли происходит за счет запасенных матриц, которые, по-видимому, являются в фазу набухания основными транслируемыми мРНК. В лаг-фазу ведущая роль б синтезе белка постепенно переходит к мРНК, синтезированным de novo, которые и должны обеспечивать подготовку зародышевой оси к началу роста, а именно - к растяжению клеток гипокотиля.

Спектр полипептидов, синтезировании в зародышевой оси в фазу набухания на воде и в присутствии а-аманитина (рис. 2а), подтверждает предположение о том, что основными транслируемыми мРНК в этот период являются преформированные. Полипептиды, синтезированные на преформированных мРНК, идентичны ряду мажорннх белков зрелого сухого семени (рire. 26), активный синтез которых

Рис.1. Влияние а-аманитина на синтез белка в зародышевых осях • Фасоли, Среда набухания: 1 - Н?0 (контроль); 2 - раствор «•-амаш'ти-на (20 ыг/л). Этапы прорастании: I - Фаза набухания; II - лаг-Фаза.

® в^вз s

кДа 92-

67-

NI

и I

in

« I

«Г

I

g S ® 2 I I

р"

4330-

/

в

20,114,4-

* /

926?"

V

433080,114,4-

'Я V

AT I

/ i*

/ /

Рис. 2а. Флюорограмма двумерного электрофореза белков зародышевой оси, синтезируемых в фазу набухания.

Fnc.26. Электрофореграмма белков зародышевой оси сухого семени.

приурочен к завершающему этапу созревания. Основная часть новосинтезировашшх мРНК по своим кодирующим свойствам сходна с набором мРНК, запасенном в сухом зародыше. Возобновление синтеза мРНК, подобных преформированннм, при гидратации зародыша свидетельствует о важной физиологической роли кодируемых ими белков как для завершающих этапов созревания, когда семя высыхает, так и для фазы набухания, когда клетки не достигли необходимой степени оводненности. Возможно, эти белки участвуют в стабилизации клеточных структур при пониженной оводненности клеток.

3.Синтез бежа в осевых органах семени при прорастании. Для характеристики общей тенденции изменений в белоксоттезирующей системе органов зародышевой оси при прорастании семени синтез белка изучали в середине каждого этапа прорастания: фазы набухания, лаг-фазн и фазы растяжения. Интенсивность синтеза белка значительно различается по зародышевым органам и максимальна во все сроки в корне. В ходе прорастания синтез белка активируется во всех органах; в меньшей степени - в гипокотиле, клетки которого уже запрограммированы на растяжение [Обручева, 19821, начинающееся при достаточной оводненности, и, по-видимому, не требуют значительной активации биосинтетнческих процессов. В зародышевых корне и листе интенсивность синтеза возрастает в значительно большей степени. Начало ростовых процессов в этих органах требует значительной активации синтеза белка.

Набор синтезируемых белков в органах весьма близок и изменяется синхронно во всех органах вне зависимости от типа ростовых процессов и времени их реактивации. Белки, синтез которых связан о выходом из покоя, характеризуются широким диапазоном р1 от 6,85 до 10,25. В лаг-период значительно усиливается накопление белков- с р1 5,85-6,85 (рис.3), синтез которых становится доминирующим в фазу растяжения.

4. Действие ПЭГ. АБК и Ж на синтез белка и £НК в связи с подавлением прорастания семян. Целью данного раздела работы было изучение белоксинтезирующей активности зародышевой оси семени Фасоли с использованием в качестве инструмента исследования природных регуляторов роста (АБК и !КК) и неметаболического ингибитора прорастания (полиэтиленгликоля, ПЭГ, мол. м. 6000),не влияющего непосредственно на процессы транскрипции и трансляции. Предварительно проведено определение концентраций этих Ееществ, ингибирутощих прорастание семян Фасоли (ГШ30*), АБК (10_4М)и ЖК

а

ю . I

кДа 926743305'

20,1"

В®в

1Л 1Л

п «-1

1Л

. I..

<0 I

' -.У

Ч

ш ч*

в

^ «Г с<г I „ I,

О й « »

С5 «ч

i - /

14,4"

1110.3 Флюорограмма двумерного электрофореза белков гшгакотиля, синтезируемых в начале фазы растяжения.

(2"10~5М). В связи о тем, что при этом подавлялось растяжение клеток гшгакотиля, то интенсивность процессов транскрипции и трансляции и состав синтезируемых белков в осевых органах изучали в начальный период фазы растяжения . в присутствии ингибирующих концентраций ПЭГ, АЕК и Ж. Регуляторы роста присутствовали в среде с начала набухания семени.

Изменения белонсинтезирующей активности клеток при подавлении прорастания семени в присутствии ПЭГ, АЕК и Ж резко различны. Высокое осмотическое давление ЗОж-ного ПЭГ и вследствие этого низкая (около 48%) оводнетостъ тканей зародышевой оси препятствуют переключению вкспрессии генома на подготовку растяжения клеток гшгакотиля (рис.5а). Некоторое снижение активности трансляции в присутствии АЕК (1сг4м) (рис.4) сопровождается стимуляцией синтеза белков (рис.56), идентичных белкам, синтезируемым в фазу набухания (А,В,1,К,Ь, см. рис.2а), а также инициацией синтеза некоторых других белков, содержащихся в большом количестве в зрелом сухом семени (С,Б,Г, ,1, см. рис. 36), синтез которых характерен для позднего эмбриогенеза. Поглощение еоды остается при этом на низком

6

- и -

Flic. 4. Влияние ЖК. и АЕК на интенсивность синтеза бежа в органах зародышевой оси семени фасоли.Среда набухания: а - контроль (НО); б - Ж (3»10_3М); в - ЖК (2"Ю М); г -АБК (10_4М); д - АЕК (10"4М) + ЖК (2'10~5М). 1 - ..гипокотиль; 2 - корень; 3 - лист.

уровне. Это может свидетельствовать о том, что ингибирутацее действие экзогенной АБК в первую очередь осуществляется через изменение экспрессии генома, и АБК-зависимые белки играют в подавлении растяжения важную роль.

Впервые показано, что ингибирование прорастания семян фасоли в присутствии ЖК (2»10~3М) связано со -значительным подавлением транскрипции {табл.) и трансляции (рис. 4) не только в гипоношпе, растяжение которого тормозится, но и в других органах зародышевой оси. Возможно, это является частью более значительных нарушений метаболизма. Заслуживает внимания тот факт, что ЖК в концентрации 2»10"5М, поддерживая прорастание семян на близком к контролю уровне, оказывает стимулирующий эффект на синтез белка во всех ' органах зародышевой оси (рис.4) и на синтез всех классов РНК в пшокотиле и корне (табл.). В присутствии Ж активируется синтез бежа, присущий растущим тканям (рис. 5в). Можно предполагать участие жасмонатов в активации синтеза белков, присущего растущим тканям, in vivo. Безусловно, такое предположение требует в дальнейшем тщательной проверки. Эти белки отличны от АЕК-зависимнх белков, сходство с которыми наблидалось - при индукции старения листьев CParthler, .1989]. В связи с этим стоит подчеркнуть, что жасмонаты способны индуцировать синтез вегетативных' запасных

1П! и

8

1П 1П! I «Я I II I

ю. а.

ь., I

а ее

«¿1 «Га*

Г I Г

Ш'

0 си

5 3 рц

1 I

кДа 92 г

67-

433020,1-14,4-

•_✓

к /

■ чй?

о

N И*

кДа 9267433020,114,4-

в'ва

1п <о из I I I

т . п

N. I

'л

Щ;

у л.

в* I.

8? в? 1

ь

(8

05 I

о гэ

0

1

/

рИ

Рис.5а,б, Флюорограмма двумерного электрофореза белков гнпо-котиля, синтезируемых в начале фазы растяжения.

Среда набухания; а - ГОГ (30%), б - ЯК (2»10~5М).

o W^ÍD in in tn той

fÍ « t t 4 Я. o pfl

[p tn|¡0 Na СО СО Cíejl-rtr

кДа 9267-

I I i

i i

%

433020,114,4-

У

s

9267433020,1- '

14,4-

уТГ / "

С

* As

V -Vi ¡ ¿i

ШШ: i'

'•1 '. v* '

' к i

ff.

щ

Iii

л fr I

Среда набухания: в - АБК ( 10 Ю, г

. флоорограмма беЛК0В ГШ°"

АБК (10"4М)+ЖК (2-ЮМ).

Табл. Активность синтеза разных классов РНК в осевых органах семени Фасоли в присутствии ЖК (включение ^Н-уридина б 1 мкг РНК пика при фракционировании РНК в сахарозном градиенте).

Орган : Фракция :Радиоактивность, имп/мин - 1 мкг РНК

: РНК к2о ЖК 2»10"5М ЖК 2»10~3Н

Гипокотиль 25 S 1402-9 2094*84 95*4

17 S 1760*79 1998*35 100*2

шзкомолек.

РНК • 1802*91 3630*309 242*21

Корень 25 S 2842-70 4401*83 179*6

17 S 3204*35 6233*152 343*16

низкомолек.

РНК 3437*90 5860*88 384*15

Лист 25 S 4455*43 4103*103 424*41

17 S 5824*70 5794*55 773*12

низкомолек.

РНК 4474*211 4741*54 817*4

Для оценки различий между любыми частным! средними НСР0 95= 91? имп/мин » 1 мкг РНК.

белков, служащих для временного резервирования азота при его избытке в растущих тканях [Staswick, "1989аJ. Их мРНК не были обнаружены в зрелом сухом семени. Эти белки интенсивно накапливались одновременно с деградацией запасных белков в семядолях проростков сои (Staswick, 1990], появлялись в зародышевых осях сои между 12 и 24 .часами прорастания [Mason, Mullet, 19903. Синтез их характерен для молодых растущих тканей. Возможно, полипептиды, синтез которых активируется в присутствии ЖК в зародышевой оси фасоли, относятся к втой группе белков.

Уровень интенсивности синтеза белка при совместном действии ЖК (2»10 М) ■+ АБК (10""%) в первую очередь определяется присутствием в среде ЖК, а АБК лишь усиливает ее действие (рис.4). При действии ЯК (2»10~5Ы) + АБК (10~%) на набор 'Синтезируемых белков соблюдается принцип аддитивности (рис.бг). Подавление растяжения пшокотиля при высокой оводненности тканей (73s), высокой интенсивности трансляции и наличии синтеза белков, активируемого в ■

присутствии Ж (2»Ю_5М), происходило, очевидно, благодаря синтезу АЕК-зависимых белков. На основании этого можно предположить, что участие АБК в регуляции генной экспрессии в связи с подготовкой созревающих семян к покою может заключаться в индукции синтеза как запасных белков, так и белков, связанных с подавлением роста и развитием устойчивости к высушиванию в зародышах.

5. Изменения в синтезе белка зародышевой осп созревающего семени под влиянием АБК и ЖК. Изучали влияние экзогенных АЕК и Ж в

---М------.

концентрациях Ю М, 10 °М, 10 М на активность белоксинтезирующей системы зародышевой оси. Семена собирали на 30-й, 40-й и 50-й день эмбриогенеза, лишали одной семядоли и помещали на раствор регулятора роста на 2 часа. Затем зародышевые оси изолировали и инкубировали с раствором ^Э-метионина в течение 2-х часов о сохранением вариантов опыта. Характер эффекта экзогенных АБК и Ж на активность белоксинтезирующей системы зависит от стадии эмбриогенеза и от концентрации экзогенных веществ (рис.6). На этапе завершения синтеза запасных веществ и остановки ростовых процессов (50-тый день после опыления - ДПО) как АЕК, так и Ж во Есех концентрациях усиливают и поглощение З-метионина, и интенсивность трансляции.

Компонентный состав белков, синтезируемых в присутствии АЕК

<1 — Л

(10 М) и ЖК (10 Ш б зародышевой оси, изучали на этапах созревания 30 и 50 ДПО. Характерной особенностью действия Ж на обоих этапах является активация синтеза белков с р1 5,85-6,85. При этом Ж не препятствует синтезу других полипептидов, присущи данному периоду развития. Действие АБК зависит от фазы онтогенеза. В ЗО-дневных зародышах резко снижается интенсивность синтеза. При этом синтез новых белков не обнаружен. А в зародышевых осях 50-дневных семян, в которых синтез белков с р1 5,85-6,85 подавлен, АБК индуцирует' активный синтез белков, присутствующих в большом количестве в зрелом сухом семени.' Действие смеси АЕК (10~^М) + Ж (10~4М) выявило аддитивность их эффекта на состав синтезируемых белков. Каждый из изученных этапов • в разной степени благоприятствует большему проявлению, или АЕК-,- или ЯК-зависимых процессов. В семенах 30-дневного возраста, в которых активны ростовые процессы, в большей степени' проявляется влияние Ж. При снижении уровня метаболизма в период перехода к покою (50 ДПО) более яркими являются АБК-зависимне изменения.

х1а

3 -

сл. И

В Я

и

О ЕШШ 1 ЕШЗ г

к

и

«

п и

и <а

ЕШШИ

гио.в, Влияние АБК и ЖК на интенсивность включения (1) и погло-

ос

щения (2) ■ З-метионина в зародышевых осях созревающего семени.

Этапы созревания: А - 30ДП0, Б - 40ДП0, В - 50ДП0. В среде присутствовали: а - 11,0 (контроль); б - АЕК (10~6М); в - АБК (10"5М); г - АЕК (10'4М); д - ЖК (ю_еМ); е - ЖК (10~5М); ж - !КК (10"4М);

з - АБК (10"4М) + ЖК I10"4М).

В процентах приводится доля включенного °"3-метионина.

6. Изменения в синтезе бежа осевых органов прорастающего семени под влиянием АБК и Исследование особенностей действия АЕК и ЖК на интенсивность трансляции в зародышевых органах прорастющих семян проводилось в период 20-22 часа ПНН, предваряющий момент проклегивания кореша, когда в зародышевое оси кроме растяжения клеток гипокотиля начинается пролиферация глеток корня, а зародышевые листья еще находятся в относительном покое. Перед периодом мечения (20-22 часа ПНН) проводили прединкубацию с гормоном в течение 2-х часов аналогично предыдущему эксперименту. До прединкубации семена набухали на воде в стандартных условиях. Доля включенного 353-метионина (рис.7) свидетельствует о разнонаправленном действии АЕК и ЖК в органах с различным типом роста. Наиболее яркий стимулирующий е^ект в присутствии ЖК (10~%) проявляется в корне, характеризующемся меристематической активностью. Синтез белка в листе, рост которого начинается лишь через несколько часов, подавляется ЖК. Ж в концентрашш 10~4М, поддерживая активность синтеза белка в корне на уровне контроля, вызывает значительное снижение его в гипокотиле и листе. АБК вызывает стимуляцию синтеза бежа в растущих органах (гипокотиле и

Рис.7. Влияние АБК и ш на интенсивность синтеза бежа в осевых органах семени перед наклевыЕанием.

В среде набухания присутствовали: а - (контроль); б - АБК (10"6М); в - АЕК (10~5М); г - АБК (10"4М); д - ЖК (10_бМ); е - ЖК (1СГ5М); ж - ЖК (10"4М); з - АЕК" (10_4М). + Ж (10 .

корне). Присутствие в среде набухания АЕК (10~4М) + ЖК (10~4М) вызывает активащш синтеза белка в гипокотиле и корне в противоположность индивидуальным эффектам этих веществ.

В период, предваряющий наклевывайте семени, компонентный состав синтезируемых белков не изменяется при экзогенном влиянии АЕК (1сНм) и ЖК (1СГ4М). В присутствии АБК (10~4М) снижается интенсивность синтеза полипептидов с pi 5,85-6,85 без явной активащш синтеза других полипептидов. Сходным образом она действует п в 30-дневных зародышевых осях при созревании. Очевидно, в активно растущих тканях состав синтезируемых белков не подвержен влиянию АЕК'.

БЫВОДИ

1. Показана специфика функционирования белоксинтезирующей сис1емы семени фасоли, характеризующемся вынужденным покоем. К моменту полного созревания семени клетки обладают набором преформированных мРНК, трансляция которых начинается с момента гидратации и обеспечивает в фазу набухания основной синтез белка, необходимый для выхода из состояния покоя. В дальнейших изменениях белкового синтеза все большее значение имеет синтез РНК de novo.

2. В органах с различным типом роста картина белкового синтеза имеет сходный характер и изменяется синхронно в ходе развития семени, что свидетельствует об общем механизме регуляции.

3. Снижение активности белоксинтезирующей системы клеток зародышевой оси в период подготовки семени к метаболическому покою сопровождается изменением продуктивности суммарной РНК в бесклеточной системе трансляции и значительными переменами в наборе транслируемых мРНК в направлении активации синтеза белков о более щелочной pi.

4. Обнаружены белки, синтезируемые в фазу набухания в гипокотиле, корне и . листе, которые идентичны белкам, преобладающим в зародышевой оси. зрелого сухого семени, что указывает на их необходимость для поддержания жизнеспособности клеток при пониженной оводненности.

5. Для растущих зародышевых осей при созревании и прорастании семени характерен актишгай синтез белков с р! 5,85-6,85, который стимулируется экзогенной жасмоновой кислотой.

6. Необходимым условием переключения экспрессии генома на программу подготовки ростовых '.ipoueccoB в зародышевой оси при прорастании является достаточная оводненность тканей.

7. Изменение активности белокспнтезирущей системы зародышевой оси

и ее органов под действием экзогенных абетшзовой и касмоновсн кислот зависит от этапа онтогенеза и носит органоспецифичннй характер. Наблшалась аддитивность их влияния на набор синтезируемых полипептидов.

8. Синтез белков, преобладающих в зародышевой оси з^лого сухого семени и сопутствующих подавлению инициации рас.'яжения при прорастании, индуцируется экзогенной АЕК на завершающих этапах созревания и при прорастании. Это может свидетельствовать о регулирующей роли АЕК в экспрессии генома созревающего семени при переходе от активного роста к покою,

9. Подавление прорастания семян фасоли жасмоновой кислотой сопровождается резким снижением интенсивности транскрипции и трансляции, вероятно, вследствие более общих нарушений метаболизма.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Скуратова (Козеко) Л. Е., Мусатенко Л. И. Роль синтеза мРНК и бежа б прорастании семени,- (.Препринт / Ин-т ботаники АН У0СР).-Kkse: Наукова думка, 1990.- 31 с.

2. Шкуратова (Козеко) д.е., Мусатенко Л.I. Роль преформованих мРЩ у розвитку нас!ння //Укр. ботан. журн. - 1991,- 48, 1.- 0.71-73,

3. Шкуратова (Козеко) Л.Е., Мусатенко Л. И. Соотношение участия пре-формированньтх и новосинтезированных гиРНК в белковом синтезе зародышевой оси в первые часы прорастания семени фасоли //Докл. АН УССР. - 1991.- 2.- 0.150-152.

4. Шкуратова (Козеко! Л.Е., Яковченко Е.В., Нестерова А.Н,Мусатенко Л.И. Влияние абсшзовой и жасмоновой кислот на синтез РНК и белка в зародышевой оси семени Фасоли //Тез. докл. рабоч. совещ. "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 16-18 июля 1991г.).-М.-1991.-0.3.;

5. Shkuratova (Kozeko) I.E., Bereatetsky V.A. AbsCisic and jasmonic acids influence on the synthesis' oi FKA and protein in Phaaeolus vulgaris I. embryo axis //Abatracts 14th Intern. Conference on Plant Growth Substances . (Netherlands, Amsterdam, 1991).-Amaterclam.- 1991.- P.109. ■

6. Шкуратова (Козеко) Л. E., Мусатенко Л.И. Влияние жасмоновой кислого на синтез РНК в органах зародышевой оси прорастающего семеня фасоли //Докл. ATi УССР.1991.- В печати. • ' ' . •

7. Шкуратова (Козеко) Л.Е.,Яковченко Е.В.,Нестерова А. Н,Мусатенко Л. И. Влияние абсцпзоЕой и жасмоновой кислот на синтез белка в

зародышевой оси семени фасоли в начале фазы растяжения //Материалы рабоч. совещ. "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 16-18 июля 1991г.).- М.- 1991,- В печати, 8. Козеко Л.Е., Берестешшй В.А., Мусатенко Л.И. Дейстййе абсцизовой и жасмоновой кислот на синтез РНК и белка в зародышевой оси прорастающего семени фасоли //Физиология растений,- В печати.

Подп. в печ. 22 .10.91. Формат 80x34/16. Бумага тип. Офс. печать. Уел.печ.л. 1,39. Усл.кр.-отт. 1,39.. Уч.изд.л. 1,0. Тираж 100 екз. Зэк. 318 ■ Бесплатно.

Отпечатано в Институте математики АН Украины. 552601, Киев 4, ГСП. та, Репина, 3