Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Белковый обмен растений при стрессе
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации по теме "Белковый обмен растений при стрессе"
На правах рукописи
РГ6 лДОкСЮТОВА Наиля Назибовна
о в ФЕВ 1998
БЕЛКОВЫЙ ОБМЕН РАСТЕНИЙ ПРИ СТРЕССЕ
03.00.12 — Физиология растений
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
МОСКВА 1998
Работа выполнена в лаборатории метаболизма белко Казанского института биологии К.НЦ РАН.
Научный консультант — академик РАН, профессо И. А. Тарчевский.
Официальные оппоненты: доктор биологических нау!
профессор М. Н. Кондратьев; доктор биологических нау!
профессор Н. П. Кораблева; доктор биологических нау! профессор А. Н. Павлов.
Ведущая организация — Институт физиологии растени имени К. А. Тимирязева РАН. л
Защита состоится . . . о£ 1998 1
в 4 ^ГМ час на заседании диссертационного совет Д 120.35.07 в Московской сельскохозяйственной акадёми имени К- А. Тимирязева.
Адрес: 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., Ученый совет ТСХА.
С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.
Автореферат разослан
/
1998 I
Ученый секретарь диссертационного совета
'О
А. С. Лосев;
✓
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Продуктивность растений зависит от многих внутренних и внешних факторов. Современные интенсивные сорта и гибриды сельскохозяйственных культур обладают высоким потенциалом продуктивности, но многие из них недостаточно устойчивы к болезням и неблагоприятным факторам среды (Шевелуха, 1992; Velich, 1993; Кумаков, 1995; и др.). Вследствие экстремальных условии, вызываемых периодическими засухами, колебаниями температуры, фитопатогенами и другими факторами среды, в различных районах страны почти ежегодно на больших площадях нарушается формирование урожая сельскохозяйственных культур, что в конечном итоге приводит к его потерям.
От действия неблагоприятных факторов (эколого-климатических и биогенных) потери урожайности сельскохозяйственных культур могут доходить до 50-80% от генетически обусловленной продуктивности (Boyer, 1982). Это заставляет уделять проблемам адаптации растений к действию неблагоприятных факторов особое внимание.
Исследования по физиологии адаптации растений имеют большую историю, начало' которой положено в прошлом столетии (Sachs, 1864). Собранная за многие годы информация свидетельствует об уникальной способности растений выживать и расти в различных неблагоприятных условиях (Levitt, 1980 a,b; Ayres, 1984; Метлицкий, Озерецковская, 1985; Matters, Scandalios, 1986; Sachs, Но, 1986; Rhodes, 1987; Войников, Иванова, 1988; Korableva et al„ 1989; Neumann et al„ 1989; Колесник, 1991; Кулаева и др., 1991; Блехман, Шеламова, 1992; Тарчевский, 1993 и др.). Ответ растений на воздействие различных по природе стрессоров особенно интересует исследователей по нескольким причинам. Во-первых, растения, в отличие от животных, более зависимы от мест обитания. Во-вторых, деятельность человека увеличивает количество и меру воздействия стрессоров на растения. В третьих, все чаще растения испытывают комплексное воздействие нескольких стресс-факторов. Все это определяет актуальность задачи выяснения механизмов повышения устойчивости к действию различных стрессоров и формирования иммунитета к патогенным организмам.
При действии неблагоприятных факторов окружающей среды растение претерпевает многочисленные структурные и функциональные изменения, среди которых особую роль играет реакция генетического аппарата (Сатарова, 1978; Levitt, 1980 a, b; Кулаева, 1981, 1982, 1985;
Войников, Иванова, 1988; Neumann et al., 1989; Войников, Боровский, 1994; и др.). Проявлением этой реакции является изменение как интенсивности синтеза различных белков, так и их набора. Последнее свидетельствует о "включении" ранее не задействованных генов, кодирующих синтез белков, играющих особую роль в устойчивости растений.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение интенсивности синтеза белков в процессе повышения устойчивости к неблагоприятным' факторам и формирования иммунитета при патогенезе, изменения их набора и по возможности - деградации белков.' Главное внимание было сосредоточено на анализе специфических и неспецифических ответных реакций растений на действие абиогенных и биогенных стресс-факторов. В связи с представлениями о напряженном .энергетическом режиме клеток изучалось влияние АТФ на содержание и синтез белков. Все больше данных свидетельствует о функционировании в растениях систем вторичных посредников и пс .тому было предусмотрено исследовать и влияние цАМФ (в сопоставлении с АТФ).
Исходя из указанной цели, были поставлены следующие основные задачи:
- изучить интенсивность синтеза растворимых белков растений, определить локализацию синтеза отдельных полипептидов в. клетке, выявить особенности действия некоторых ингибиторов (хлорамфе-никола и циклокегсимида) и активаторов (гибберелловой кислоты) трансляции на синтез белка;
- выявить изменения в синтезе белка зерновок пшеницы в условиях засухи;
- исследовать влияние экзогенных АТФ, цАМФ и абсцизовой кислоты на синтез белков в условиях засухи, так как при этом изменяется энергетический режим клетки, ее гормональный статус и содержание эндогенного цАМФ; ,
- изучить действие биогенного стрессора-микоплазмы Acholeplasma laidlawii 118 на синтез белков растений ;
-.выяснить вклад отдельных участников сигнальных систем растений (жасмоната и салицилата) в индуцированное микоплазмами образование белков;
- изучить влияние на синтез белков растений выделенных нами ранее цикадинов - .новых физиологически активных белков из экскрета личинок иикады-пенницы Aphrophora costalis Mats.
Научная новизна работы. В работе впервые показано, что -реди растворимых белков хлоропластов имеются два полипептида 67 и 105 кД с необычно высокой удельной радиоактивностью. Содержание их было небольшим, что позволило сделать вывод об их малом времени жизни и возможной роли в оперативной регуляции метаболизма, что предполагало значительное (большее, чем у других полипептидов) изменение удельной радиоактивности при действии на растения различных факторов. Это подтвердилось в опытах с исследованием влияния света, темноты, ингибиторов (хлорамфеникола и циклогексимида) и активаторов (гибберелловой кислоты и экзогенного АТФ) трансляции на включение меченых аминокислот в растворимые белки хлоропластов.
Впервые показано участие цАМФ в регуляции синтеза зерновок пшеницы в условиях засухи. цАМФ повышал интенсивность синтеза альбуминов, глобулинов, глиадинов сверх уровня контроля. Стимулирующее влияние экзогенного цАМФ проявилось в концентрации на порядок более низкой, чем АТФ, особенно в случае низкомолекулярных полипептидов с мол. массами 12, 15, 19, 26 и 33 кД. Экзогенный цАМФ приводил к снижению интенсивности синтеза стрессовых полипептидов 14, 64 и 77 к,",.
Впервые выявлено сильное увеличение содержания полипептидов 19 и 83 кД и появление полипептида 38 кД в инфицированных культурой микоплазмы Acholeplasma laidlawii 118 растениях гороха.
Был выяснен вклад таких участников сигнальных систем растений как жасмонат, салицилат и его аналог сукцинат в индуцированное микоплазмами образование белков.
Впервые обнаружено, что янтарная кислота, обладающая ростсти-мулирующими свойствами, является ингибитором каталазы и по своему действию на растения может считаться миметиком салицилата.
Показано, что ответ растений на действие абиогенных и биогенных факторов включал как неспецифические реакции (такие, например, как появление белка 38 кД), так и специфические. Все исследовавшиеся органические кислоты (жасмонат, салицилат и сукцинат) неспецифически индуцировали образование полипептидов II, 38, 42, 72 кД, в то время как мнкоплазменная инфекция - лишь один из этих полипептидов (38 кД).
Впервые исследовались выделенные нами ранее новые физиологически активные белки из экскрета личинок цикады-пенницы Aphro-phora costalis Mats,-названные нами цикадинами. Показано, что цика-дины регулируют синтез белков а растении и обладают ростстиму-
«
лирукицимп, антистрессовыми и фунгицидкымн свойствами. Установ лено, чго цикадины индуцировали появление новых полипептидов 11 23, 36, 38, 42, 72 и 120 кД. Цикадины проявляли хитиназную и про теиназную активности.
Научно-практическая значимость работы. Исследованные нам1 янтарная кислота и цикадины расширяют ассортимент экологичесю чистых стимуляторов роста. Мы провели производственные испытани) и крупномасштабное внедрение янтарной кислоты как антистрессовой препарата во многих районах республики Татарстан. Внедрение янтар ной кислоты в практику сельского хозяйства с целью повышен»: урожайности злаковых и овощных культур проводилось совместно ( Министерством сельского хозяйства РТ по государственной иннова ционной программе "Освоение производства экологически чистогс биохимического стимулятора растений и животных - янтарной кислоть и разработка на ее основе методов повышения урожайности сельскохо зяйственных культур и продуктивности животноводства", созданной пс постановлению кабинета министров РТ (N 153 от 29.03.93 г.).
Обнаруженные нами фунгицидные свойства белков цикадинов да ют дополнительное обоснование перспективности применения в прак тике сельского хозяйства цикадинов как биологическогг эффективной средства против патогенных грибов. Индуцированное стресс-факторам! образование хитиназы у растений может служить очень чувствительиык тестом на появление системной устойчивости у растительных вытяжек.
Исследования выполнялись по грантам РФФИ N 94 -04-12894-а » N 95-04-11515, ведущей научной школы N 96-15-97940, а также гранта!. Академии наук Татарстана. Полученные результаты использовались i учебном процессе при чтении лекций на кафедрах физиологии растеши и биохимии Казанского государственного университета.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Обнаруженные нами высокие удельные радиоактивности неко торых полипептидов (при небольшом содержании), а также их больша: чувствительность к изменяющимся условиям окружающей среды 1 внутриклеточной обстановки позволяют отнести их к оперативным ре гулят'орам обмена веществ или к полипептидам, тесно связанным с та кими регуляторами.
2. Исследования влияния инфицирования микоплазмами, абиоген ных стрессоров и различных экзогенных полипептидов, олигопептидо! и органических кислот позволяют сделать заключение, что экспресси: новых белков включает в себя как неспецифические ответные меха
1измы (проявляющиеся при всех воздействиях), так и специфич-ские, сарактерные для меньшего числа или одного вида воздействий.
3. Полученные нами данные дают основания считать, что в осуществлении неспецифической индукции синтеза новых полипептидов тринимают участие сигнальные системы, включающие липоксигеназное 1ревращение ненасыщенных жирных кислот, "окислительный взрыв" (в гом числе накопление перекиси водорода), циклонуклеотидный информационный канал и протеинкиназные реакции фосфо-рилирования полипептидов.
4.Некоторые природные соединения (например, цикадины, янтарная и салициловые кислоты) могут использоваться в качестве стимуляторов роста или фунгицидов благодаря включению сигнальных (в том числе защитных) систем растений.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзном симпозиуме "Азотный и белковый обмен растений" (Тбилиси, 1978), на 4 и 5 Республиканских конференциях "Физиологические основы повышения продуктивности и устойчивость зерновых культур" (Алма-Ата, 1980; Целиноград, 1984), на Всесоюзной конференции "Устойчиво-ть к неблагоприятным факторам среды и продуктивность растений" (Иркутск, 1984), на 8 Всесоюзном симпозиуме по водному режиму растений (Ташкент, 1984), на Всесоюзном симпозиуме "Связь метаболизма углерода и азота при фотосинтезе" (Пущино, 1985), на V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), на 6 Конгрессе Федерации Европейских обществ физиологов растений (Югославия, Сплит, 1988), на Всесоюзной конференции "Регуляторы роста и развития растений (Киев, 1988), на Всесоюзном симпозиуме "Физиология семян" (Душанбе, 1988), на II съезде ВОФР (Минск, 1990), на I и II Рабочих совещаниях "Применение янтарной кислоты в медицине и растениеводстве" (Пущино, 1992; Казань, 1993), на 10 Международном конгрессе Всемирной организации мнкоплазмологов (Франция, Бордо,
1994), на III Международной конференции "Регуляторы роста н развития растений" (Москва, 1995), на I Евразийском симпозиуме по биотехнологии (Турция, Анкара, 1995), на II Республиканской конференции "Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан" (Казань,
1995), на 8 Международном конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (Израиль, Иерусалим, 1996), на симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнологии" (Москва, 1997), на II съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), на Международной конференции "Молекулярная биология растений в
стрессовых условиях" (Польша, Познань, 1997), на семинарах и итоговых научных конференциях KHLI РАН (Казань, 1978 -1997).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 65 работ (общее число публикации 76).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 236 страницах машинописного текста (включая иллюстрации и список литературы) и состоит из введения, трех глав, заключения и выводов. В работе представлены 23 таблицы и 45 рисунков. Список литературы включает 554 наименований, из них 365 иностранных.
ОБЪЕКТЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объектами для экспериментов служили изолированные хлоро-пласты гороха, каллус сои, колеоптили и зерновки пшеницы, проростки гороха, редиса; целые растения разных родов, видов и сортов (корни, листья, стебли и репродуктивные органы). В зависимости от конкретной задачи работы, объектами изучения были также штаммы микромицетов. Основные исследования проведены на х^оропластах гороха, зерновках пшеницы и проростках гороха. По мере выполнения поставленных задач выбор объектов усложнялся (от хлоропластов до растений). Выделение хлоропластов производили по методу, описанному Филипповой (1967).
В качестве объекта для получения белково-пептидной фракции использовали экскрет личинки-пениицы Aphrophora costalis Mats. Белки экскрета, названные нами в дальнейшем цикадинами, выделяли хроматографическим методом (Скоупс, -1985), фракционирование их вели с помощью ВЭЖХ. Радиоактивность просчитывали на флуоресцентном счетчике "Дельта-300" (США), обладающем высокой эффективностью учета числа радиоактивных частиц.
Содержание цАМФ определялось согласно Gilman (1970). Экстракция и очистка АБК проводилась согласно методике (Косаковская, Майдебура,1989).
Фосфорилирование белков проводили за 2 часа инкубации на ела-" бом рассеяном свету проростков гороха в растворах с 32р.0ртофосфор-ной кислоты и эффекторов. Разделение фосфорилированных белков проводили методом электрофореза с последующей радиоавтографией.
Протеинкиназная активность определялась во фракциях гомоге-ната согласно Kikkawa et al. (1983). Каталазную активность определяли согласно Simins et al. (1994). Хитиназную активность определяли по методу Чигалейчик и Пириевой (1976) и Trudel, Asselin (1989). ДНК-
азную и РНКазную активности определяли по методу, описанном.* Банниковым и др. (1988). Протеиназная активность и активность ингибиторов протеиназ оценивали по методам, описанным Кладницкой и др. (1996).
Проростки гороха инфицировали клетками микоплазмы, вводя в нижнюю часть стебля микрошприцем 10 мкл культуры. За развитием инфекции следили с помощью ДНК-ДНК-гибридизации с использованием специфичного зонда рА1 для обнаружения Acholeplasma laidlawii (Bchsenius et al., 1990). Все эксперименты проводились в 3-х кратной биологической повторности. Большинство данных обработано статистически с помощью программы Statgraf, а графики построены в программе Microsoft Graph. В таблицах и графиках данные представлены как средние ± среднеквадратичная ошибка.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Действие ингибиторов и активаторов трансляции на синтез белков хлоропластов
Oähiin. из важнейших процессов, определяющих продуктивность растений, является формирование фотосинтетического аппарата листьев, в частности, развитие белоксинтезируюшей системы хлоропластов. К настоящему времени общепринято положение о том, что формирование структуры и функционирование фотосинтетического аппарата растений находится под двойным генетическим контролем, осуществляемым ядром и генетической системой хлоропластов (Ellis, 1977, 1981; Bottomley, Bohnert, 1982; Dean, Leech, 1982; Leto et al., 1982; Мокро-hocob, 1983; Насыров и др., 1983; Филиппович, 1985, 1987; Keegstra et a!.,1989; Smeekens et al., 1990; Douwe de Boer, Weisbeck, 1991; Portis, 1992). Координированность ответной реакции клеток растений на внешнее воздействие обеспечивается тесной кооперацией двух генетических систем (ядра и пластид), но взаимодействие этих систем в ответ на изменение условий - вопрос еще недостаточно изученный.
Содержание белков в клетках растений определяется разницей скоростей их синтеза и деградации (Дин, 1981; Schlee, 1986; Lamattina et al., 1987; Veierskov, Thimann, 1988; Голяновская и др., 1989; Vierstra, 1989, 1993; Блехман, Шеламова, 1992; Fischer, Feller, 1994; Callis, 1995). Важно отметить, что при одном и том же содержании белка может быть медленный синтез и распад и быстрый синтез и распад, но в последнем случае имеет место большая скорость оборота белка. Изотопный
подход предопределил очень интересные выводы, касающиеся скоростей оборота различных полипептидов растворимых белков хло-ропластов. Мы не определяли абсолютных скоростей оборота отдельных полипептидов, но оценивали это качественно, в сопоставимом плане по величинам удельной радиоактивности отдельных полипептидов, поскольку одним из показателей времени жизни белков, новообразованных и) меченых аминокислот, является их удельная радиоактивность.
Используя электрофоретическое разделение растворимых белков хлоропластов гороха, был выделен 31 полипептид. С помощью ингиби- 1 торов белкового синтеза была установлена локализация их образования. В таблице 1 представлены характерные полипептиды, отличающиеся друг от друга содержанием и удельной радиоактивностью. Два полипептида 67 и 105 кД обращают на себя внимание тем, что содержание белка в них очень мало, а включение '^С-аминокислот достаточно интенсивное. Полипептиды, имеющие наивысшую удельную радиоактивность, по сравнению с дру.ими белками, по-видимому, быстро синтезируются и распадаются, имеют наиболее высокую скорость "самообновления". Высокое значение скоростей синтеза и распада характерно для ферментов "быстрого реагирования", имеющих значение оперативных регуляторов обмена, содержание которых должно в большей степени следовать за изменением окружающей среды и'внутри-клеточной обстановки.
Нельзя полностью исключить возможность того, что высокая удельная радиоактивность этих полнпептидов объясняется их последующими посттрансляционными превращениями (модификацией). Если принять это положение, то продуктами посттрансляционной модификации должны быть белки, имеющие большее время жизни и поэтому меньшую удельную радиоактивность вследствие разбавления вновь образованных меченых белков предшествующими нерадиоактивными молекулами. '
. Следует отметить, что если иметь в виду возможность постгрансля--ционной модификации полипептидов с высокой удельной радиоактивностью, то тогда этот процесс более выражен в хлоропластах, т.к. из шести полипептидов с высокой удельной радиоактивностью четыре синтезируются в хлоропластах, а два в цитоплазме.
Изменение условий внешней среды может действовать на обмен белков опосредованно, через изменение гормонального статуса. Накоплено много экспериментальных данных, свидетельствующих об участии
Табл..ца 1
Включение ^С-аминокислот (аланина-14с и глицина-'^С) в лолипептиды хлоропластов
Удельная радио-
Молекулярная Локализация Содержание активность(тыс.
масса, кД генов белка, % имп/мин*мг белка)
107 П 0,27 37
105 П 0,09 333
102 П 0,36 ш
98 П 0,27 120
90 П 0,36 97
88 Г 0,38 125
85 П 2,00 12
67 Г 0,05 300
55 П 26,40 6
42 Г 4,20 6
38 не установл. 4,10 7
22 Г 10,50 3
14 Г 5,70 8
11 П 9,00 1
Г - геном. П - пластом
Стандартное отклонение не превышало 5% от среднеарифметической величины
фитогормонов в регуляции экспрессии генов в растительных клетках, о влиянии их на синтез белка (Кораблева, Метлицкий, 1978; Кулаева, 1982, 1985, 1995; Полевой, 1985, 1986; Baulcombe et al„ 1986; Муромцев и др., 1987; Chandler, 1988; Guilfoyle, Hagen, 1988; Кефели и др., 1989; Parthier, 1989; Кораблева, 1990; Thomas, 1991; Новиков, Войесса, 1995; и др.). Рядом авторов было показано, что гибберелловая кислота (ГК), повышает ДНК-зависимый синтез мРНК и синтез белка (Martin, North-cote, 1982, 1983; Wasilewska et al., 1982; Килев и др., 1983; Тираиуян, Паносян, 1983; Артюшевский н др., 1986).
Известно, что одним из основных мест образования и локализации гиббереллинов являются хлоропласты. Мы исследовали влияние ГК на синтез различных фракций хлоропластных -белков, поскольку показано, что гибберрелины оказывают положительное влияние на функциони-
ровинне фоюсинтетнческого аппарата клеток (Похлебаев, 1981, 1982; Муромцев, Агнистикова, 1984; Скоробогатова, Якушкина, 1986).
Сопоставление действия гибберелловой кислоты с действием хло-рамфеникола и циклогексимида может дать ответ на степень влияния ГК на геном и пластом. ГК может вызывать не только сильную активацию синтеза многих полипептидов (М.м. 11, 14, 22, 34, 38, 42, 63, 76, 107 и 108кД), но и сильное (в 2-3 раза) торможение синтеза трех полипептидов (М.м. 90, 104, 105кД). Два из них синтезируются в хлороплас-тах (М.м. 90 и 105кД), так как ингибируются хлорамфениколом.
Наблюдавшееся нами при использовании фитогормона изменение, интенсивности синтеза полипептидов, образованных в хлоропластах, позволяет заключить, что ГК или вторичный посредник проникает в хлоропласты и вызывает индуцированные гормоном изменения в экспрессии генов. Могло бы сказаться затруднение переноса гормона или вторичного посредника (цАМФ или иного) в хлоропласт из-за барьерной функции его оболочки, но в этом случае активирующего действия ГК на пластом не должно быт:, или он должен быть существенно меньше, чем на геном. Это бы проявилось в отсутствии или незначительности активации тех белков, образование которых подавляется хлорамфениколом.
В зависимости от внешних условий (освещенности, температуры, обезвоживания) могут изменяться как суммарная интенсивность, так и соотношение интенсивностей образования АТФ в ходе различных реакций фосфорилирования, что должно отражаться на синтезе и деградации белков. В настоящее время установлено, что свет вызывает активный синтез хлоролластных рРНК и мРНК (Nelson et al., 1984; Sasaki et al., 1984; Gallagher et al., 1985; Inamine et al., 1985; Tobin, Sil-verthorne, 1985; Manzara, Gruissem,l988; Thompson, 1988; Gilmartin et al., 1990; Shirley, Meagher, 1990; Simpson, Herrera-Estrella, 1990), усиление образования 70S рибосом (Breidenbarh, 1990), синтеза структурных и ферментных белков (Ellis et al., 1984; Berry et al., 1986; Klein et al., 1988; Gamble et al., 1989; Thompson, White, 1991; Portis, 1992), что свидетельствует о возбуждении под влиянием света матричной активности генетического аппарата. Во многих работах показано, что свет повышает активность ферментов цикла Бенсона- Кальвина с помощью образующихся в хлоропластах АТФ или восстановителя (Ferreira, Davies 1987; Strensand, Portis, 1987; Kobza, Seemann, 1988; Robinson, Portis, 1988; Campbell, Ógren, 1990; Pearcy, Seemann, 1990; Thompson, White 1991). Установлено, что при интенсивном освещении наблюдается уси-
ление не только синтеза, но и деградации белков и увеличение их оборачиваемости (Alaniz, Brocchi, 1986).
Помещение растений в темноту приводит к развитию процессов старения, сопровождающихся деградацией белка, активацией протеаз (Sabater, 1983; Lamattina et al., 1985; Ferreira, Davis, 1987; Van Loon et al., 1987).
Одним из распространенных подходов к изучению влияния изменения энергетического режима на интенсивность метаболических процессов является использование экзогенного АТФ. Мы исследовали включение ' ^С-аминокислот в растворимые белки хлоропластов в темноте и на свету и зависимость радиоактивности белков от экзогенного АТФ.
Обнаружена группа полипептидов, радиоактивность которых в 2,53,0 раза снижалась при помещении проростков в темноту (I I, 34, 36, 38, 55, 79, 85, 90, 102, 105 кД). В меньшей степени это относится к полипептидам 12, 14, 17, 22, 26, 76, 88, 92, 96, 98 кД. Интересно, что имеется небольшое число полипептидов, радиоактивность которых не зависела от света: 18, 31, 42, 63, 67, 104 кД. Не было обнаружено случаев достоверного повышения радиоактивности полнпептидов при помещении проросткоь в темноту.
Повышение радиоактивности многих полипептидов хлоропластов наблюдалось в варианте "темнота + АТФ" по сравнению с вариантом "темнота": 11, 12, 14, 22, 26, 29, 34, 36, 38, 55, 76, 79, 85, 88, 90, 96, 98, 102, 105 кД. У некоторых полппептидов оно достигало уровня светового варианта, а в случае трех полнпептидов (Мм 29, 85 н 104 кД) даже несколько превышало его.
Наши данные - не первый зарегистрированный случай влияния экзогенного АТФ на энергозависимые процессы в тканях растений in vivo (Тарчевский н др., 1980; Чулановская и др., 1981; Белова, 1982; Карабаев, Глаголева, 1982; Miller, Price, 1982; Liu, Jagendorf, 1985; Mitos, Roy, 1985; Schmidt, Mishkind, 1986; Keegslra et al., 1989). Описано повышение с помощью экзогенного АТФ интенсивности фотосинтеза при низких освещенностях и действии неблагоприятных факторов, но ннгибнрованне - при достаточно высоких освещенностях (Заленский и др. 1979; Глаголева и др., 1981; Тарчевскнй, 1982). В наших опытах этому соответствует факт снижения экзогенным АТФ радиоактивности многих полипептидов у освещаемых растеннй: 11, 12, 14, 19, 42, 76, 79, 85, 90, 92, 102, 105, 107кД. Экзогенный АТФ не оказывал или почти не оказывал влияния на радиоактивность полнпептидов 26, 38, 67, 69,
98кД., а в случае двух полипептидов (Мм 96, 104кД ) наблюдалось даже некоторое ее увеличение.
Следует отметить, что значительная доля радиоактивности в поли-пептпдах появлялась в первые два часа, когда все растения находились в одинаковых условиях. Наблюдаемые различия по радиоактивности отдельных полипептидов произошли в последующие два часа, когда внешний раствор уже не был радиоактивным. В этих условиях, естественно, продолжался синтез белка из ранее поглощенных '^С-амино-кислот и, по-видимому, большой вклад в содержание '^С в полипептидах вносят и процессы деградации ранее образованных белков.
Высокая удельная радиоактивность полипептидов 67 и 105 кД предполагала значительное (большее, чем у других полипептидов) изменение ее при действии на растения различных факторов. Это подтвердилось в опытах с исследованием влияния света и темноты, ингибиторов (хлорамфеникола и циклогексимида) и активаторов (гибберелловой кислоты и экзогенного АТФ) трансляции на включение меченых аминокислот в растворимые бел'-и хлоропластов.
Синтез белков зерновок пшеницы а условиях засухи
При выборе эколого-климатических факторов мы остановились на почвенной засухе, поскольку значительная часть сельскохозяйственных растений культивируется в районах несбалансированного йодного режима почвы. Кроме того, в последние годы засухи участились в различных регионах нашей страны и одним из таких районов, периодически подверженных действию атмосферной и почвенной засухи, является республика Татарстан. В наших исследованиях засуху создавали путем прекращения полива растений пшеницы в фазе формирования зерновок до достижения 30% полной влагоемкости почвы. Почвенная засуха снижала суммарную общую и удельную радиоактивности белков всех отличающихся по растворимости фракций зерновок.
При выяснении влияния засухи на синтез отдельных полнпе1ттидо8 водо-солсрастворимых белков (рис. 1) картина оказалась не столь-однозначна. Почвенная засуха снижала удельную радиоактивность большинства полипептидов, особенно 38 и 40 кД (в 6-12 раз) и увеличивала - полипептидов 14, 64 и 77 кД. Наиболее значительно возрастала удельная радиоактивность полнпептида с мол.массой. 77 кД (почти в 3 раза). Вероятно, последний принадлежит к семейству стрессовых белков 70 кД, куда относятся полипептиды с мол. массой 70-80 кД (Neumann et al., 1989).
Удельная радиоактивность, имп\мин мг белка
Рис. I. Включение МС -леицина в полипептиды водо-солерастворимои фракции зерновок пшеницы в различных условиях влагообеспечения. 1 - контроль, 2 - засуха
Возникал вопрос, в чем причина торможения синтеза большинства полнпептидов? При действии почвенной засухи энергетический режим растительной клетки становится напряженным, поскольку затормаживается образование АТФ в ходе фотосннтетического и окислительного фосфорилирования и усиливается его расходование на поддержание клеточных структур (Тарчевскнн и др., 1975) и градиентов различных веществ (Иванченко и др., 1978).
Добавление экзогенного АТФ (10-ЗМ) приводило к снижению интенсивности синтеза тех полипептидов (рис.2), образование которых в условиях засухи стимулировалось (в частности, с мол.массами 14, 64, 77 кД). Самый заметный эффект торможения был обнаружен у полипептида с мол. массой 77 кД. Удельная радиоактивность многих полипептидов, синтез которых подавлялся обезвоживанием, при действии АТФ возрастала в 2-3 раза. Экзогенный АТФ оказывал влияние на образование как ннзкомолекулярных, так и высокомолекулярных полипептидов, т.е. подтверждается роль АТФ как энергетического субстрата для синтеза отдельных полипептидов.
Если раньше считалось, что в процессах трансляции АТФ играет преимущественно субстратную-энергетическую роль (обеспечивая транспорт и накопление аминокислот в местах их активации, образование
Удельная радиоактивность, nuiiUiiiH мг белка 1200 -■
woo - -
»00 - ■
мо -•
400 -■
200 --
14 64 77 Мол.м*сеа,кД
1 2 J 12 3 12 3
Рис. 2. Влияние АТФ на включение '^С-лейцина в полипептиды зерновок пшеницы в условиях различного водробеспечения. 1 - контроль. 2 - засуха, 3 - засуха + АТФ
непосредственных субстратов синтеза белков (аа-тРНК) и работу рибосом), то в последнее время выясняются важные регуляторные функции АТФ (I образующихся с его участием других нуклеотидов, являющихся вторичными посредниками: ГТФ и цАМФ (АтгИеш, 1977; Яворская, Калинин, 1984; Хусаинов, 1987; Денчева, 1990; Яворская, 1990; Каримова, 1994; Во1ше11, 1995).
Известно, что они могут выступать в роли регуляторов активности ферментов, участвующих в синтезе белков, например, аминоацил-тРНК-еннтетазы, пептидилтрансферазы; интенсивности и направленности процесса транскрипции; мембранного транспорта. '
Обнаружено, что система циклических нуклеотидов активно-функционирует в растениях в стрессовых условиях, в частности, показано увеличение содержания цАМФ в условиях пониженной температуры (Яворская, 1990), при отделении ткани от целого растения (Каримова, 1994) или удалении клеточной стенки (ЬоБОуауа е1 а!., 1988). Изменение уровня цАМФ обусловливает нарушение цАМФ-зависимого фосфорнлирования белков-ферменгов, принимающих участие в процессах транскрипции и трансляции.
Для выяснения возможности реализации этого пути мы опре, ..ляли уровень эндогенного цАМФ в зерновках пшеницы, находящихся в различных условиях водообеспечения и исследовали влияние экзогенного цАМФ (10"4М) на синтез белков.
Определение уровня эндогенного цАМФ в зерновках пшеницы, находящихся в различных условиях водообеспечения, показало, что дефицит влаги в почве приводит к некоторому увеличению содержания цАМФ, что согласуется с имеющимися в литературе данными об увеличении содержания цАМФ в клетках растений при действии различных стрессовых факторов (Драговоз, 1991; Каримова, 1994).
В условиях засухи цАМФ, поступление которого в клетку доказано (Яворская и др., 1981), также действовал на синтез полипептидов зерновок пшеницы, однако влияние его проявилось- в концентрации, на порядок более низкой, чем АТФ, а эффект превысил действие АТФ. Оказалось, что экзогенный цАМФ вызывал усиление суммарного синтеза белков, стимулировал в условиях засухи синтез низкомолекулярных полипептидов с Мм от 12 до 40 кД, образование которых затормаживалось при обезвоживании.
Поскс :ьку в условиях ограниченного водоснабжения под влиянием цАМФ происходило более значительное включение ' ^С-лешшна в низкомолекулярные полипептиды по сравнению с высокомолекулярными, мы попытались установить локализацию синтеза этих двух групп полипеппгдов с использованием ингибиторов белкового синтеза. Обнаружено, что хлорамфеникол тормозил синтез преимущественно высокомолекулярных компонентов, а циклогексимид - низкомолекулярных, что подтверждается данными литературы (Карасев и др., 1991).
Таким образом, экзогенный цАМФ оказывал наиболее значительное дейстзие на синтез низкомолекулярных полипептидов, синтезируемых на 80S рибосомах цитоплазмы.
В последнее время появилось много публикаций, п которых сообщается об участии сигнальных систем клеток (в том числе цАМФ-снстемы) в формировании ответа растений на действие патогенных микроорганизмов. Это послужило основанием для наших исследований белкового метаболизма при патогенезе.
Действие микоплазмеиной инфекции и жасмо/гата на синтез белкоз растений
Одним из наиболее важных последствий инфицирования растений различными патогенными микроорганизмами является экспрессия генов
устойчивости и сиигез различных белков, от которых зависит формирование иммунитста.Обычно изучается действие грибов и бактерий, содержащих клеточные стенки, и вирусов на синтез белков растения-хозяина. Наш интерес к микоплазмам, самым малым прокариоти-ческим организмам, лишенных клеточной стенки, вызван с одной стороны, их уникальной структурной организацией, а с другой, практической значимостью и полной неизученностью влияния на белковый метаболизм.
Электрофоретическое разделение белков на ПААГ позволило обнаружить в инфицированных культурой микоплазмы растениях гороха сильное увеличение содержания полипептидов 83 ,19 kD и появление полипептида 38 kD.
Как уже отмечалось выше, под влиянием стрессоров (абиогенных и биогенных) происходит изменение гормонального статуса растения, что приводит к повышению содержания стрессовых гормонов: абсцизовой, жасмоновой кислот и этилена.
Одним из следствий инфицирован, i растений различными патогенами является индуцирование липоксигеназного пути и образование одного из стрессовых гормонов-жасмоната ( Blechert et al. ,1995, Doares et al., 1995),способного вызывать экспрессию генов устойчивости к патогенам (Creelman, Mullet, 1995). Сопоставление особенностей синтеза белков растений при инфицировании микоплазмами и при обработке экзогенным жасмонатом позволило получить дополнительную информацию о механизме формирования ответа на инфекцию.
Результатом действия на растения гороха экзогенной жасмоновой кислоты было увеличение включения радиоактивной метки в белки. При разделении полипептидов с помощью электрофореза было обнаружено индуцированное жасмонатом образование двух новых полк-пептидов 38 и 42 kD.
Если учесть, что образование нового, индуцированного жасмонатом белка 38 kD наблюдается и при инфицировании микопЛазмами (рис. 3), то можно сделать вывод, что заражение растений включает классический, характерный для биогенного стресса, катаболнческий липндный сигнальный путь: активация фосфолипазы А2 —> освобождение линолената из фосфолипидов мембран липоксигеназное превращение его в 13-пероксилиноленат -> образование жасмоновой кислоты в результате гидропероксид-циклазной и сопутствующих реакций ( Vick, Zimmerman, 1987;Гречкнн, 1992 ; Тарчевский, 1993) активация генов устойчивости -> образование жасмонат-индуцированных белков ->
формирование местной и системной устойчивости к патогенам (Neu mann et а!., 1989; Sembdner, Parthier, 1993; Reinbotheet al. ,1994 ).
*Д
4$_
2S_
17Я тгТз
1
-83
-38
-19
кД
J2 -38
Z
3
Рис.3. Влияние мнкоплазменной инфекции и жасмоновон кислоты на набор и содержание полипептидов. I - контроль, 2 - микоплазменная инфекция, 3 - жасмоновая кислота
Так как жасмонат вызывал индукцию образования лишь одного из трех микоплазма-индуцированных белков, то можно предположить, что он является только частью сигнальной системы, приводящей к формированию иммунитета растений гороха ( Тарчевский и др., 1996).
Влияние салициловой кислоты на синтез белков растений В последние годы появляется все больше данных об особой роли салициловой кислоты в патогенезе растений (Raskin, 1992; Delaney et al.,I994; Chen et a!., 1995). Обнаружено повышение в десятки раз содержания салициловой кислоты под влиянием патогенов (Malamy et al.,1990; Metraux et al., 1990), различных элиситоров, перекиси водорода (Gaffney et a!., 1993; Leon et al.,1995) и, наоборот, повышение содержания перекиси водорода под влиянием экзогенной салициловой кислоты (Kauss.Jeblick, 1995) . Было показано, что салициловая кислота - это эффективный ингибитор каталазы(С1)еп et al., 1993). Предполагается, что под влиянием патогенов или элиситоров активируется оксидаза плазмалеммы, катализирующая образование перекиси водорода из НАДФН и молекулярного кислорода (Tenhaken et at. 1995) . Ингибиро-вание каталазы перекрывает основной канал расходной части баланса
перекиси водорода и вызывает ее накопление, что приводит не только к интоксикации патогенов, но и к целому ряду важных для развития иммунитета последствий, например, к сверхчувствительности и последующей некротизации инфицированных клеток (Levine et al., 1994)1 укреплению клеточных стенок в результате пероксидазных сшивок белков и углеводов( Bradley et al., 1992; Brisson et al., 1994). Считается, что перекись водорода и индуцирующий ее накопление салицилат могут выступать и в роли сигналов, вызывающих в неинфицированных клетках экспрессию защитных генов и образование ряда "патогенинду-цированных белков" (PR белков), от которых зависят локальная и, системная устойчивость растений (Antoniw, White, 1980; Hooft van Huijsduijnen, et al.!986; Raskin, 1992;. Gaffney et al.,1993; Delaney et al.,I994; Chen etal., 1995).
В связи с тем, что мы начали исследование не анализировавшихся ранее механизмов ответной реакции растений на микоплазменную инфекцию и имея в виду, что салициловая кислота и в этом случае может принимать участие в формировани.. иммунитета растений, была поставлена задача выяснить, как экзогенная салициловая кислота влияет на синтез белков в листьях гороха.
Мы исследовали влияние экзогенной салицилово/r кислоты на полипептидный спектр и на включение '^С-аминокислот в отдельные полипептиды. Оказалось, что происходит очень сильное повышение содержания полипептида 29 кД (рис. 4) из группы кислых белков, а также увеличение набора щелочных белков, среди которых появляются новые полипетиды 38 и 42 кД (рис. 5).
Интересные результаты были получены при изучении включения меченого лейцина в отдельные полипептиды (рис. 4 и 5). Во-первых, не все полипептиды, проявившиеся, на гелях, вызывали почернение рентгеновской пленки, из чего можно сделать вывод об относительно низкой интенсивности их образования (68, 57,45, 25 и 21 кД в группе кислых белков и 40, 31, 27, 23, 22 и 18 кД - в группе щелочных бблков). Во-вторых, наблюдался и обратный эффект - появление полос на радио- • автографах в тех местах, где полипептиды на гелях не проявлялись, например, 53 -у кислых и 72 кД -у щелочных белков .
Полипептиды 11 кД и 72 кД (очень интенсивно метящийся) в группе щелочных белков можно считать сашщилат-индуцировакными, так как они не наблюдаются на радиоавтографах гелей контрольного варианта. Полипептид S3 кД обнаруживается и в контрольном и опытном вариантах, причем его радиоактивность в контрольном варианте
«а .
кД
17.£
1275"
53 29
Рис. 4. Диаграмма влияния салициловой кислоты на набор и содержание кислых белков (А) и их радиоактивность (Е).
1 - контроль, 2- салициловая кислота. Слева - молекулярные массы белков-маркеров, справа - салицилат-индушфованных белков.
*Д
Б7_ 45
25_
17.8
12ТЗ
«Д
42
-за
кД
-72
-42 -38 -29
-19 -П
Рис. 5. Диаграмма влияния салициловой кислоты на набор и содержание щелочных белков (А) и их радиоактивность (Б).
1 - контроль, 2 - салициловая кислота. Слева - молекулярные массы белков-маркеров, справа - салицилат-индуцированных белков.
1
- наивысшая среди всех полипептидов. В варианте с обработкой салициловой кислотой он тоже вызывает сильное почернение рентгеновской пленки.
Полипептиды 53 и 72 кД можно отнести к белкам с высокой скоростью оборота (turnover), отличающимся интенсивным образованием (что определяет их высокую радиоактивность) и быстрым распадом (что приводит к столь низкому содержанию этих полипептидов, что они не проявляются на гелях). Обычно такие соединения играют в обмене веществ роль оперативных регуляторов, достаточно чутко реагирующих на изменение внутриклеточной или внешней ситуации.
Интересно, что салицилат-индуцированному кислому белку 29 кД сопутствовала его очень высокая радиоактивность, наивысшая среди всех рассматриваемых полииептидов. В то же время, не обнаруживалось высокой радиоактивности в полппсптидах 38 и 41 кД. Не исключено, что в двух последних случаях салициловая кислота не столько усиливала синтез этих полнпептидов, сколько подавляла интенсивность их деградации. Быть может, установленный ранее факт стимулирования салицилатом образования ингибиторов протеиназ (Jung et al., 1993) белковой природы свидетельствует о возможности действия некоторых из этих ингибиторов не только на протеиназы патогена, но и на некоторые протеиназы растения-хозяина. В связи с этим необходимо отметить, что исследователями уделяется неоправданно мало внимания на изменение интенсивное!., расходных реакций баланса сигнальных соединений (цАМФ, фосфорнлированных белков и др.) и патоген-инду-цнрованных белков. В то же врем", в растениях имеются эффективные механизмы контроля этих реакций, о чем свидетельствуют ингиби-рование каталазы салицилатом, возможности регуляции активности фосфодизстеразы, фосфопротеинфосфатаз и протеиназ. Нами не установлено случаев полной репрессии салицилатом образования полнпептидов, характерных для контрольного варианта, наблюдалось лишь сильное снижение содержания полипептида 27 кД.
Действие янтарной кислоты на синтез белков В число испытуемых соединений была включена янтарная кислота, которая, как мы показали, обладает антистрессовым действием. Нами были проведены производственные испытания и крупномасштабное внедрение янтарной кислоты как антистрессового препарата во многих районах республики Татарстан.
При сравнении молекулярных структур янтарной и салициловой кислот просматривается некоторое сходство, в связи с чем мы обратились с просьбой к чл.-корр РАН А.Н.Гречкнну рассчитать расстояние между гидроксильными группами этих соединении и перекиси водорода. Молекулярные модели Н2О2, салициловой и янтарной кислот были построены с помощью программы "Oxford molecular modelling program". Оказалось,что близость расстояний между гидроксильными группами во всех трех молекулах позволяет предполагать, что салициловая и янтарная кислоты могут связываться с активным центром каталазы (рис.6), выступая в роли конкурентных ингибиторов в реакции разложения перекиси водорода.
Обработка экзогенным сукцинатом растений гороха показала результаты, аналогичные тому, что было получено при действии сали-цилага; индуцировалось два новых полипептида 38 и 42 кД.
1 2 3
Рнс.6 Схема взаимодействия активного центра каталазы с перекисью водорода [I], салициловой [2] и янтарной [3] кислот.Е - Каталаза
При исследовании действия салициловой и янтарной кислот на катала^нуго активность было обнаружено, что оба соединения снижали разложение НэОэ, т.е. являются ингибиторами каталазы, причем инги-бирующее действие сукцнната было даже более выраж.нным.
Это заставляет считать, что янтарная кислота является природным биохимическим миметиком салициловой кислоты и в этом качестве может приводить в действие (наподобие салшшлата) механизмы форми-
ровання системной устойчивости растений к действию патогенов и неспецифической устойчивости к различным стрессорам. По всей вероятности, этим и объясняется положительное действие на устойчивость и продуктивность сельскохозяйственных растений обработок препаратами янтарной кислоты. Об этом свидетельствует и тот факт, что янтарная кислота действует в небольших концентрациях и проявл)..г эффект длительного последействия. Если бы сукцинат действовал в качестве субстрата, активирующего дыхание (как интермедиат цикла Кребса), то потребовались бы, во-первых, гораздо большие концентрации и,во-вторых, не наблюдалось бы длительного последействия после его одноразового применения.
На основании собственных результатов и данных литературы нами предлагается обобщенная схема взаимодействия с растениями мико-плазм и действия органических кислот (жасмоновой, салициловой и янтарной ), приводящего к экспрессии генов устойчивости и синтезу кодируемых ими защитных белков (рис. 7).
Физиологически активные белки цикадины, их свойства и действие на белковый обмен растений Одним из важных компонентов экологических систем являются растительноядные животные-насекомые. В ответ на механическое повреждение, вызываемое ими, растения испытывают биогенный стресс (Кислин, 1991; Yokoyama, Tanpakushitsu, 1994). Это ответная речкция, состоящая из большого количества звеньев, включая экспрессию генов и образование кодируемых ими защитных белков.
Известно, что основными переносчиками микоплазмепной инфекции являются цикады. Представляется особенно важным то, что механическое повреждение тканей растений хоботком личинки цикады-пешшцы облегчает инфицирование растений.
Экологами нашего института было обнаружено изменение состава почвенной фауны под действием стекающего пенистого экскрета личинок цикады-пенницы Aphrophora costalis Mats. Биохимический анализ экскрета, проведенный нами в лабораторных условиях, показал, что его основными компонентами, обладающими физиологической активностью, являются белки.
Мы впервые выделили и охарактеризовали новые белки , названные нами в дальнейшем цикадинами, из экскрета личинок цикады-пенницы ивовой , широко распространенной в Среднем Поволжье (Максютова и др., 1992 ). Оказалось, что они обладают ростстимулирующими свой-
«КАСКОНОВАЯ кислота
ИИШЛАЭМА С^ИЧИЛОВАЯ (^гивнторы
| катала.
ЯНТАРНАЯ кислота
| Элиеигсры |
Липаза
1
РЕЦЕПТОРЫ
Липаза
лог
83
• АДЕНИЛАТЦИХЛАЗА-
ВЛ
■Оксидаза
Оксидаза
• Жасмонат
ОДОМЛЕЙНА
Окислительный
"взрыв" Хгталаэа
Н0|, НО*. //
нго2 -нго +1 ог
ГЕНОМ
38, 42 кДз 19, 38, 83 кЛа 38, 42, 110, 120 »Да
Жасмонат иняуии- Кикоплазна ииау- Салицилат и сухцикат рованимг белки цироаанные белки иидуцированпые Белхл
ДОГ - липокемгеиазы; .ВЛ - вторичные посредники
Рис. 7. Схема взаимодействия растений с микоплазмами и действия органических кислот
ствами. Привес каллуснои ткани сои при обработке цнкадинами составил 163% от контроля. Укоренение черенков роз повышалось в 3 раза при выдерживании их в растворе цикадинов. Данный способ укоренения черенков был внедрен в Казанском совхозе "Декоративные культуры".
Предпосевная обработка семян пшеницы цнкадинами в концентрации 10"3 мг/мл приводила к повышению содержания сырого протеина и сырой клейковины. Увеличение данных показателей связано со стимуляцией синтеза запасных белков, входящих в состав клейковины, на последних этапах налива зерна.
В вегетационных опытах были обнаружены антистрессовые свойства цикадинов. В фазе молочной спелости создавали засуху путем прекращения полива до достижения 30% полной влагоемкостн почвы. Освобожденные из колоса зерновки сразу же помечали в раствор леГщнна, в опытном варианте к нему добавляли цнкаднны в концентрации 10"3 мг/мл. Цнкаднны не только снимали ингнбирующий эффект обезвоживания, но н приводили к стимуляции синтеза белков зерновок пшеницы. На использование цикадинов как регулятора синтеза белков растений имеется российский патент N 1734758 (Максютова и др., 1993).
Наши предыдущие опыты с экзогенными сапицилатом и, особенно, с сукцннатом показали, что одно/| из причин их положительного действия на продуктивность при экзогенной обработке растений можег счшаться влияние этих соединений на сигнальные системы клеток, приводящее к формированию системной устойчивости к патогенам и, как следствие, к повышению урожайности. В растениях контрольного варианта степень зараженности патогенами могла быть выше.
Фнтопагогенные грибы относятся к числу факторов внешней среды (биогенных), способных оказывать существенное влияние на метаболизм растений (Метлицкий и др., 1974; Озерецковская и др., 1986, 1994: Метлицкин, 1987; КогаЫе\а е! а1., 1989; Проценко и др., 1993; Тарчевский, 1993; Андреев, Талиева, 1996; Карпук,1996; Проценко, 1996; Чка :иков, 1996 и др.).
Предпосевная обработка семян пшеницы цнкадинами приводила и к снижению степени поражения гельминтоспориозьой гнилью и септо-риозом что заставило нас провести специальное исследование влияния цикадинов на развитие культур патогенных грибов. Использовались широко распространенные возбудители болезней сельскохозяйственных растений. Исследовалась чувствительность большого набора пато-
генных микромицетов к цикадинам. Зона подавления роста для разных патогенов составляла от 2 до 10 мм, при этом нарушался рост патогена и наблюдалась задержка спорообразования.
В наших экспериментах было обнаружено, что цикадины проявляли хитииазную активность (рис. 8). Контролем служила культуральлая жидкость энтеробактерий Serratia marcescens, которая обладает сильно выраженной хитнназной активностью. Зоны гидролиза гликольхитина наблюдали в УФ-свете в виде темных пятен на голубом флуоресцирующем фоне.
Рис. 8. Определение хитиназной активности цикадинов.
1 - контроль (культуральная жидкость энтеробактерий S.marcescer").
2 - цикадины (0.2 мг/мл)
а
Совместно с сотрудниками Казанского университета и Института биохимии имени А.Н.Баха определялась активность и других ключевых ферментов: ДНКазы, РНКазы, протеиназ и ингибиторов протенназ. Показано, что цикадины проявляли протеиназную активность, так как при инкубации цикадинов с казенном в течение 72 часов наблюдалось гидролитическое расщепление последнего. В работе по совместной с нами программе сотрудниками лаборатории проф. В.В. Мосолова установлено, что фракции цикадинов 15 и 20 кД являются сернновыми про-теиназами. ДНКазная и РНКазная активности в цикадинах не были обнаружены. Они не обладали также свойствами ингибиторов протеиназ.
Показано, что цикадины регулируют синтез белков в растении, они индуцировали появление новых полипептидов 11, 23, 36, 38, 42, 72 и 120 кД. Обращает на себя внимание цнкаднн-индуцированное образование полипептида 38 КД, как и при инфицировании растений микоплазмами. Судя по литературным данным, полученным на разных растительных объектах, полипептид 38 кД является хитиназой.
Для дальнейшего и более детального изучения цикадинов проводили хроматографическое разделение их методом ВЭЖХ. В ходе фракционирования было получено пять пиков белков и поли (олиго)- пептидов. Было обнаружено, что обработка исследуемыми растворами 1 и 5 фракции приводила к стимуляции синтеза белка зерновок пшеницы, а мнгибирующая активность наблюдалась при действии растворов 2, 3 » 4 фракций.
Имеется обширная информация о регуляторных пептидах животной клетки, обладающих ростстнмулирующими и иммуно-корреги-рующими свойствами (Ашмарнн, Обухова, 1986; Чнпенс, Вегнер, 1986; Минченко, 1988; Джалиашвнли, 1989; Харченко и др., 1990). В развитие этих представлений в нашей лаборатории проводились опыты с ди- и трипептидами (триГлн, диГли, Ала-Вал, диАла, Гли-Ала), оказывающими стимулирующее действие на рост корней 'Пахомова, Руднева, 1988) и олигопептидами (энкефалинамн).
Предполагается, что энкефалины - пептидные гормоны животных могутвллять на рост каллусной ткани и служить медиаторами при морфогенезе корней и почек (К1ашЫ, 1983, 1985).
Сравнение влияния мог- и лей-энкефалинов на синтез белков растений показало, что лей-энкефалин почти не оказывал влияния на включение '^С-лейцина в белки листьев редиса при всех используемых концентрациях, в то время как мет-энкефалин приводил к изменению интенсивности синтеза белк<"
Энкефалины, как и многие другие физиологически активные пептиды животных образуются в виде предшественников с большим молекулярным весом, частичный прогеолиз которых приводит к появлению функционально активных молекул. Долгое время ферментативное расщепление полипептидов рассматривали как потерю всех их биологических функций. Однако, после выяснения биохимических механизмов посттрансляционного нроцессинга поллпептидов процесс ограниченного распада белков стали оценивать как один из основных путей образования физиологически активных пептидов.
Учитывая , что синтез и распад представляют собой две стороны единого процесса метаболизма, можно предположить, что и в растении возможно образование физиологически активных пептидов при катаболизма белков, которые могут играть определенную роль в регуляции синтеза белка.
Наши исследования и работы других авторов показывают, что у растений существуют полипептиды, отличающиеся очень высокой ско-
ростью распада, малым временем жизни. По-видимому, они, в первую очередь, и являются источником потока все уменьшающихся при действии эндопептндаз олигопептидов, некоторые из которых обладают достаточно высокой физиологической активностью, наподобие, например, продуктов деградации гормонов тимуса-тнмопентина н др. (Чипенс, Вегнер, 1986).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При выполнении диссертационной работы изучали влияние неблагоприятных абиогенных и биогенных факторов на синтез белков в различных растительных объектах. Представляется чрезвычайно важным, что ответ растений на эти факторы включал как неспецифические реакции (такие, например, как появление белка 38 кД), так н специфические (например, появление полипептидов 23 и 36 кД при действии цикадинов на растения). Это еще раз подтверждает возможность протекания в растительных организмах совокупности ответных реакций, . которые получили название адаптационного енндрома или стресса.
Как известно, адаптационный синдром представляет собой развертывающуюся во времени совокупность неспецпфических ответных реакций растений на действие неблагоприятных факторов. Число установленных неспецпфических ответных реакций постоянно возрастает (Кеитапп « а1., 1989; Гордон, 1992; Тарчевскин, 1993; и др.). К числу наиболее важных неспецифических изменений можно отнести следующие: фазность в развертывании во времени ответа на чействие стрессора; усиление катаболизма липидов и биополимеров; изменение проницаемости мембран клеток для ионов; повышение в цитоплазме содержания ионов кальция; подкисление цитоплазмы; снижение общей интенсивности синтеза биополимеров и липидов; синтез стрессовых белков и стрессовых липидов; интенсификация синтеза компонентов клеточных стенок - лигнина, суберина, кутина, каллозы, богатого окси-пролином белка; повышение содержания гормонов - абсцизовой и жасмоновой кислот; продукция этилена; повышение содержания свободных радикалов, ооразование в ответ на действие биострессоров (бактерий, грибов, вирусов, насекомых) элиситоров, фитоалексинов, патоген-индуцированных белков (хитина-', (3-1,3 -глюканаз, ингибиторов протеиназ и т. д.) и другие реакции.
Результаты наших исследований позволили дополнить этот список еще несколькими реакциями. Одним из наиболее ярко проявляемых примеров неспецифического ответа растений на инфицирование мико-
плазмами к экзогенные сигналы может считаться появление нового белка 38 кД, который, судя по всему, является хитиназой. Важно отметить, что в результате действия различных абиотических стрессоров в растениях появляются одинаковые белки, а значит экслресси-руются одни и те же гены , характерные для ответной реакции на патогены. Усиливается синтез специфических стрессовых соединен,]й, способствующих повышению устойчивости клеток. В случае действия патогенов может наблюдаться, наоборот, сильное увеличение чувствительности клеток вокруг места внедрения патогена и их гибель, что повышает устойчивость организма, так как создает препятствия для дальнейшего распространения инфекции.
По-видимому, в ходе эволюции возникла и закрепилась "профилактическая" антипатогенная реакция на ослабление растений под влиянием обезвоживания, повышенной и пониженной температур, которые могут привести к более легкому инфицированию патогенами.В этом причина общих неспецифических ответных реакций на действие и абиотических, и биотических стрессоров. Об общности (неспецифичности) ответа свидетельствует и тот факт, что в нем задействованы сходные сигнальные систе. :ы:
1 - циклонуклеотпдная
2 - кальцин - фосфоннозитольная
3 - липпдная (липокенгеназная)
4 - окендазная (сопровождающаяся накоплением Н2О2)
Можно предположить, что перечень сигнальных систем в ближайшие годы будет увеличен.
Схема включения различных сигнальных систем очень сходна. Сигнал, поступающий к поверхности клетки (гормоны, элиситоры и т.д.), взаимодействует с рецептором плазмалеммы, что приводи, к изменению конформации обращенной внутрь клетки части рецептора и активации связанного с ним фермента, например, аденилатциклазы, фосфолипазы С, фосфолипазы А 2 и, наконец , оксид азы, локализованной в плазмалемме. В первом случае образующийся цАМФ активирует протеинкнназы, приводящие к экспрессии генов. Во втором случае происходит накопление кальция в цитоплазме, активация Са-зависимых (Са-кальмодулин-завйсимых) протеинкиназ. В третьем случае образуются различные оксигенированные производные линолевой и лнноленовой кислот, в частности , жасмоновая кислота (Гречкин, 1992). В наших совместных с проф. Ф.Г.Каримовой исследованиях было показано, что жасмонат вызывает изменение как общей интенсивности
фосфорилирования, так и изменение соотношения фосфорилн-рованности различных полипептидов. В четвертом случае накопление Н2О2 или действие экзогенной салициловой или янтарной кислот тоже приводят к изменению фосфорнлирования белков. Известно, что с фосфорилированием белков связана экспрессия генов, кодирующих синтез белков, определяющих формирование устойчивости и к абиогенным, и к биогенным стрессорам.
Наши исследования дают основание полагать, что все упомянутые сигнальные системы чествуют в формировании иммунитета на действие микоплазм, но, по всей вероятности, каждая из них вносит определенную часть в его формировании, например, жасмонат или салицилат индуцируют только часть белков, образующихся при инфицировании микоплазмами. Вышесказанное не означает, что сигнальные системы не могут взаимодействовать друг с другом и изменять действие друг друга. Известно, например, что гидропероксидные формы ненасыщенных жирных кислот (липидная сигнрчьная система) является Са-ионофорами, способными переносить Са2+ извне внутрь клетки, в цито-золь, и, таким образом, способствуют активации Са2+-сигнальной системы (Ье$11ет, 1987).
Анализ системы (растение - личинка цикады-пеннниы - патогенные грибы, паразитирующие на насекомых и на растениях), дает основание считать, что одним из важных компонентов этой системы (за исключением растений) является хитин, образующий покровы насекомых и клеточные стенки микроскопических грибов. Проведенные нами исследования позволяют, заключить, что вероятной причиной подавления роста патогенных грибов в пене цикады является хитиназная активность цикадинов. Действительно , хитнназы могут, во-первых, способствовать размягчению покровов самой личинки -пенницы и ее росту,' во-вторых, разрушать хитин клеточных стенок грибов и .поэтому, затормаживать (или прекращать) развитие микромицетов, паразитирующих как на личинке-пеннице, так и на растениях.
Это, пожалуй, один и наиболее эффективных механизмов воздействия на патоген, так как хитиназа может разрушать клеточную стенку гриба снаружи, в то время как ДНКазам и РНКазам необходимо преодолеть такие барьеры, как, например, клеточная стенка и клеточная мембрана для того, чтобы воздействовать на ДНК и РНК патогена. Этим возможно и объясняется отсутствие ДНКазной и РНКазной активностей у цикадинов.
Обнаруженная нами протеиназная активность цикадинов может обеспечить разрушение ферментов-гидролаз, выделяемых патогенными грибами.
Подавление фнтопатогенных грибов цикадпнами, по-видимому, препятствует проникновению инфекции внутрь растения через поврежденные личинкой ткани листьев. Инфицирование растения патогенными грибами могло бы затруднить питание личинки полноценной пищей (раствором сока проводящих пучков растений, содержащим набор Сахаров, аминокислот, органических кислот и т. д.). Известно, что многие патогенные грибы колонизируют, в первую очередь, проводящие сосуды растений.
Необходимо отмстить, что набор ответов растений на действие самых различных стрессоров ограничен. Эволюция отобрала сравнительно небольшое число ответов, которые используются почти для всех случаев. Разумеется, есть и специфика в ответе растения, т. е. степень "жесткости" ответов не абсолютна.
Итак, проведенные нами исследования особенностей влияния различных неблагоприятных факторов на синтез белков в хлоропластах, семенах и проростках позволили существенно дополнить общую картину развертывания защитных реакции растения в ответ на абиогенные и биогенные стрессоры, выявить неспецифнческие и специфические черты ^того ответа, показать участие в нем некоторых компонентов сигнальных систем, в том чипе функционирующих в клетках животных, Последнее позволяет еще раз подчеркнуть общность стресс-реакций ) животных и растительных организмов.
ВЫВОДЫ
!. Впервые среди растворимых белков хлоропластов проростков го роха выявлены два полипепгида 67 и 105 кД с необычно высокой удель ной радиоактивностью и небольшим содержанием, что позволяет су дить об их малом времени жизни.
2. Почвенная засуха снижала удельную радиоактивность белко) всс.с фракций зерновок пшеницы и большинства водо-солерастворимы: полипептидов, особенно 38 и 40 кД и увеличивала удельную радио активность полипептидов 14, 64 и 77 кД, которые, по-видимому, отно сятся .с соответствующим семействам стрессовых белков. Экзогенны: АТФ вызывал повышение радиоактивности у первой группы поли пептидов и снижение - у полипептидов второй группы.
3. У растений при почвенной засухе цАМФ повышал интенсивность синтеза альбуминов, глобулинов, глнадинов сверх уровня контроля. Стимулирующее влияние экзогенного цАМФ проявилось в концентрации на порядок более низкой, чем используемый АТФ, особенно в случае низкомолекулярных полипептпдов с мол. массами 12, 15, 19, 26 и 33 кД. Экзогенный цАМФ приводил к снижению интенсивности синтеза стрессовых полипептидов 14, 64 и 77 кД. Разнонаправленное действие цАМФ и АТФ показано для полипептидов 53 и 70 кД.
4. Впервые обнаружено сильное увеличение содержания полипептидов 83 и 19 кД и появление полипептида 38 кД в инфицированных культурой микоплазмы Acholeplasma laidlawii 118 пастеннях гороха
5. Показано индуцированное жасмонатом образование двух новых полипептидов 38 и 42 кД. Жасмонат вызывал индукцию образования лишь одного из трех микоплазма-индуцированных белков, что заставляет считать его только частью сигнальной системы, приводящей к формированию иммунитета растений гороха.
6. Установлено, что салициловая кислота очень сильно повышала содержание полипептида 29 кД из группы кислых белков и увеличивала набор щелочных белков, среди которых появлялись новые полипептиды ЗС и 42 к Д. Обнаружены салицилат-индуцируемые полипептиды -i 1 и 72 кД . Полипептиды 11,53 и 72 кД характеризовались высокой удельной радиоактивностью. Салициловая кислота не столько усиливала синтез полипептидов 38 и 42 кД, сколько подавляла интенсивность их деградации,
7. Впервые обнаружено, что янтарная кислота является ингибитором каталазы и по своему действию на растение может считаться миметиком салицилата. Влияние янтарной кислоты на содержание и синтез полипептидов было аналогичным действию салицилата.
8. Впервые показано, что все исследовавшиеся органические кислоты (жасмонат, салицилат и сухцинат) неспецифически индуцировали обраование полипептидов 11, 38, 42, 72 кД, в то время как мико-плазменная инфекция - лишь о дли из этих полипептидов (38 кД).
9. Показано, что цихадины, впервые выделенные нами ранее новые физиодогически активные белки из экскрета личинок цикады пенницы Aphrophora costalis Mats, регулируют сицтез белков в растении (индуцируют появление новых полипептидов И, 23, 36, 38. 42, 72, 120 кД) и обладают ростстимулирующими, антистрессовыми и фунгицидными свойствами. Цикадины проявляли хитиназную и протеиназную активности.
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Максютова H.H., Тарчевскнн И.А. Изменение интенсивности синтеза белков зерновок пшеницы от времени суток. // Физнол. растений. 1975. Т. 22, N 2. С. 289-294.
2. Тарчевский И.А., Чиков В.И., Андрианова Ю.Е., Иванова А.П., Максютова H.H. Основные методы и некоторые результаты комплексного изучения продукционных процессов у пшеницы. Сб."Фи-зиолого-генетические основы повышения продуктивности зерновых культур". М.: Колос. 1975. С.282-291.
3. Белова Л.П., Максютова H.H., Тарчевский И.А. Влияние хлорамфеникола и цнклогексимнда на синтез белков различных фракций пшеницы. Физнол. растении. 1978. Т.25, N 2. С. 230-235.
4. Белова Л.П., Максютова H.H., Тарчевскк.! И.А. Некоторые особенности механизма образования белков различных фракциий и возможности интенсификации их синтеза. Сб."Производство и использование растительного белка". Краснодар. 1981. С. 83-84.
5. Максютова H.H., Мартынова Т.Б. Изучение полипептндного состава белков хлоропластов, выделенных в водные и неводные среды. Деп. ВИНИТИ N3553-82, 1982. 17 с.
6. Тарчевский И.А., Максютова H.H., Андрианова Ю.Е., Лозовая В.В. Физиолого-биохимические процессы, лимитирующие образование урожая у пшен..цы в зависимости от условий выращивания. Сб. "Повышение продуктивности и устойчивости зерновых культур". Алма-Ата.: Наука. 1983. С.57-50.
7. Мартынова Т.Б., Максютова H.H. Влияние почвенной и атмосферной засухи на содержание белка различных фракций и включение |4С-амннокнслот в белки. Деп. ВИНИТИ N 772-84, 1984. 11 с.
8. Мартынова Т.Б., Максютова H.H., Тарчевский И,А., Хаби-буллина Л.Н. Действие хлорамфеникола и циклогексимнда на синтез растворимых белков хлоропластов гороха. Н Физнол. и биохим. культ. растений. 1985. Т. 17, N 6. С. 539-543.
9. Максютова H.H. О механизмах действия засухи на синтез белков у растений. С§. "Условия среды и продуктивности растений". Иркутск. 1985. С. 82-85.
10. Максютова H.H., Мартынова Т.Б., Тарчевский И.А. Действие гибберелловой кислоты на синтез растворимых белков хлоропластов гороха. // Физиол. и биохим. культ, растений. 1987. Т.19, N 4. С. 348-352.
11. Maksyutova N.N., Martynova T.B. Effect of gibberellic acid on the synthesis of soluble proteins of pea chloroplasts. Abstr.of 6 til Congress of the federation of European societies of plant physiology (FESPP), 4-10 September 1988. Split Yugoslavia. 7.36.
12. Викторова Л.В., Максютова Н.Н., Ионов Э.Ф. Особенности синтеза белков зерновок пшеницы у сортов, контрастных по технологическим свойствам Н Агрохимия. 1989. N 4. С. 63-66.
13. Максютова Н.Н., Викторова Л.В., Тарчевский И.А. Действие АТФ и цАМФ на синтез белков зерновок пшеницы. // Физиол. и био-хим. культ, растений. 1989. Т.20, N 6. С. 582-586.
14. Викторова Л.В., Максютова Н.Н. Ьлияние фитогормонов на синтез белков зерновок пшеницы в условиях последействия засухи. Сб. "Физиология семян: формирование, прорастание, прикладные аспекты. Душанбе.: Даниш. 1990. C.3I4-318.
15. Максютова Н.Н., Мартынова Т.Б., Панкратова С.И., Магсу-мова P.M., Курбанова С.Г. Физиологически активное средство для регуляции биосинтеза белка. Информационный листок. N 256-91 от 5.07.91.
16. Мартынова Т.Б., Максютова Н.Н., Киямова Н.А. Действие эккефалинов на синтез белков в листьях редиса. Деп. ВИНИТИ. N 1783-В-92. 1992.
17. Максютова Н.Н., Мартынова Т.Б., Панкратова С.И., Коса-кович Е.В. Физиологически активные б4лкн экскрета личинок цикады-пенницы. И Биохимия. 1992. Т.57, N 6. С. 833-837.
18. Максютова Н.Н., Викторова Л.В., Хабибуллина Л.Н. Регуляция синтеза белка фитогормонами в условиях засухи. Тез. докл. II съезда ВОФР. Москва. 1992. С. 40.
19. Максютова Н.Н., Мартынова Т.Б., Панкратова С.И. Способ регуляции биосинтеза белка в растении. Авторское свидетельство N 1734758 от 22Л 1.92.
20. Максютова Н.Н., Мартынова Т.Б., Панкратова С.И. Способ регуляции биосинтеза белка в растении. Патент N 1734758 от 14.04.93.
21. Maksyutova N.N., Victorova L.V. Effect of abscisic acid on proteir synthesis in wheat cariopsis. Abstr. of International Simposium Phisiology of abscisic acid, Pushchino 25-28 cctober 1993. P.353.
22. Максютова H.H., Викторова Л.В. Стимуляция синтеза белков зерновок пшеницы в связи с улучшением качества зерна в условиях засухи. // Сб. Водообмен и устойчивость растений. 1993. КГУ, Казань. С. 129-132.
23. Яковлева В.Г., Максютова Н.Н., Чернов В.М. Полипептидный состав проростков гороха инфицированных Acholeplasma laidlawii sp 118. Тез. яокл. Ill съезда ВОФР. С-Петербург. 1993. С. 776.
24. Викторова Л.В., Максютова Н.Н. Действие экзогенных АТФ и цАМФ на синтез белков зерновок пшеницы в условиях засухи. Там же С. 16.
25. Yu.Andrianova, N. Maksyutova, 1. Tarchevsky, V.Chemov, О. Chernova, V.Yakovleva. The mycoplasma influence oil plant metabolism. // Abstr.of XV International Botanical Congress, Tokyo, Japan august 28 to September 3, 1993, N 3138. P.353.
26. Tarchevsky, O.A. Chernova, V.M. Chernov, Yu.E. Andrianova, Yu. Gogolev, N.N. Maksyutova, V.G. Yakovleva, L. Lasareva, F.G. Kari-mova. The mycoplasma influence on plant metabolism. U Abst. of the 10 th International Congress of the 10 M. Bordeaux, France, 19-26 july. 1994. 10 M Letters, vol.3.P.90.
27. Викторова Jl.В., Максютова Н.Н., Кузьмина Г.Г., Ионов Э.Ф. Влияние абецнзовой кислоты на синтез белков в зерновках пшеницы.// Физиод. и биохнм. культ, растеннй. 1995. Т.27, N1-2. С.26-30.
28. Максютова Н.Н. Викторова Л.В., Каримова Ф.Г. Действие АТФ и цАМФ на синтез белков зерновок пшеницы в условиях засухи.// Физнол. и биохим. культ, растений. 1995 . Т.27, N4C.292-297.
29. Н.Н.Максютова, Л.В.Викторова, Е.В.Косакович. "Ростсти-мулирующее действие цнкадинов, физиологически активных белков, на растения пшеницы". Тез. докл. Ill Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений." , Москва, 27-29 июля 1995. С.123.
30. Л.В.Викторова, В.Г.Яковлева, Е.В.Косакович, Н.Н.Максютова, Ю.Е.Андрианова. "Влияние янтарной кислоты на ростовые процессы яровой пшеницы". Там же С. 185.
31. Tarchevsky I., Grechkin A., Karimova F., Maksyutova N.. Zabo-tina O., Yarin A., Fazliyev F. The influence of intermediates degradation of biopolymer and lipid on plant cell functions//Karadeniz J. of Medical Sciences. 1995. V. 8, N 4, P.245-246.
32. Каримова Ф.Г., Чернов B.M., Максютова H.H., Яковлева В.Г., Мурсалимова Н.У., Мухаметчин А.Т. "Фосфорилирование и синтез белков гороха при его инфицировании микоплази:ами Acholeplasma laidlawii 118"// Тез. докл. II Республиканской конференции "Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан". 1995. С. 72.
33. Максютова Н.Н., Андрианова Ю.Е., Яковлева В.Г., Мартынова Т.Е., Косакович Е.В., Киямова Н.А., Викторова Л.В., Тарчевский
И.А. "Ростстимулирующее действие экзогенной янтарной кислоты на растения" II Там же С.76-77.
34. N.N.Maksyutova, T.B.Martynova, I.A.Tarchevsky Comparison of light-driven and ATP-driven synthesis of chloroplasts soluble proteins in pea plants.//Abstr. of symposium Physicalchemical basis of plant physiology, 5-8 february, 1996. Penza. Puschino. 1996. P.3I.
35. Андрианова Ю.Е.. Сафина Н.И., Максютова H.H., Кадош-никова И.Г. Влияние янтарной кислоты на продуктивность сельскохозяйственных растений, урожай и его качеств oil Агрохимия. 1996. N 89. C.118-123.
36. Тарчевский И.А., Максютова Н.Н., Яковлева В.Г. Влияние салициловой кислоты на синтез белков проростков гороха II Физиол.растений .1996. Т.43, N 5. С.667-670.
37. Тарчевский И.А., Максютова Н.Н., Яковлева В.Г., Чернов В.М. Микоплазма-индуцированные и жасмонат-индуцированные белки растений гороха II ДАН РАН 1996. Т.350, f. 4. С.544 - 545.
38. Maksyutova N., Yakovleva V., Tarchevsky I..Chernov V., Cher-nova O/'Synthesis of new polypeptide inducec. by pathogen and some organic acids Karadeniz Journal of Medical Sciences . 1996. V.9, N 2. -P. 98-103.
39. Tarchevsky I., Maksyutova N., Yakovleva V., Gogoiev Y., Chernov V., Chernova O. Mycoplasma induced proteins and genome rearrangements in plants // Abstr. of 11 th Congress of IOM, Florida, USA 12-19 july 1996.ЮМ Lett. V. 4, P.258.
40. Tarchevsky 1., Maksyutova N., Yakovleva V., Go^olev Y., Chernov V., Chernova O. Mycoplasma-plant system: pathogen induced proteins and genome rearrangements. // Abstr. of 8 th International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division, Jerusalem, Israel, 18-23 august, 1996. P. 80.
41. Tarchevsky I., Maksyutova N., Yakovleva V., Chernov V. The influence of mycoplasma infecting and the action of exogenous salicylic and jasmonic acids on set and protein synthesis of pea plants II Abstr.of 10th FESPP Congress "Fron Molecmar Mechanisms to the Plant: an Integrated Approach", Firenze, Italy, 9-13 September , 1996, P.289.
4z. Maksyutova N.,.Martynova Т.,Tarchevsky I. Influence of АТБ on the protein synthesis of chloroplasts in diferent conditions of light regime // Ibid. P. 106.
43. Tarchevsky I., Maksyutova N., Yakovleva V.,. Chernov V., Chernova O. Mycoplasma infections and biogenic stress in plants // Abs. of 5th
International Workshop on Phytoplasmas, Peking, China, 24-28 october, 1996, P.37.
44. Тарчевский И.А., Гречкин A.H., Каримова Ф.Г., Максютова
H.H. Сигнальные системы клеток растений. II Тез. докл. II съезда биохимического общества РАН, 19-23 мая 1997 Москва. С.46.
45. Максютова H.H., Яковлева В.Г., Тарчевский И.А., Чернов В.М. Образование микоплазм-нндуцированных белков в растениях // Там же С 275.
46. Tarchevsky I.A., Grechkin A.N., Karimova F.G., Maksyutova N.N., Chernov V.M., Chemova O.A., Yakovleva V.G. On the molecular mechanisms of interaction between plants and mycoplasmas // Abstr. of International Conference "Molecular biology of plants under environmental stress", Poznan, Poland, 17-19 September, 1997, P. 109.
47. Maksyutova N.. Victorova L., Tarchevsky I. Effect of exogenous energetic, signal and hormonal factors on protein synthesis of wheat caryopses under drought conditions // Ibid P.20.
48. Yakovleva V.G., Maksyutova N.N., Karimova F.G., Tarchevsky
I.A. Influence of salicylic, jasmonic and succinic acids on protein synthesis and phosphorylation in pea plants II Ibid P.l 12.
'бъем 2'А п. л.
Заказ 9
Тираж 100
Типография Издательства МСХА 127550, Москва, Тимирязевская ул., 44
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Максютова, Наиля Назибовна, Москва
ц ob
ъ.С
казанский институт биологии кнц ран
л I ( Г\
На правах рукописи
Максютова Наиля Назибовна
БЕЛКОВЫЙ ОБМЕН РАСТЕНИЙ ПРИ СТРЕССЕ
03.00.12 - физиология растений
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук
Научный консультант - академик РАН И.А.Тарчевский
Москва 1997
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ...................................................................................... 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Синтез и деградация белков.......................................... 12
1.2. Действие стрессовых факторов на транскрипцию
и трансляцию................................................................ 23
1.3. Гормоны стресса............................................................ 32
1.4. Биогенный стресс........................................................... 37
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты исследований.................................................. 45
2.1.1. Выделение хлоропластов...................................... 47
2.1.2. Выращивание каллуса........................................... 48
2.1.3. Выделение цикадинов............................................ 48
2.2. Методы исследований
2.2.1. Электрофоретическое разделение белков............ 49
2.2.2. Определение радиоактивности............................ 49
2.2.3. Определение содержания цАМФ......................... 50
2.2.4. Определение фосфорилирования белков............... 50
2.2.5. Определение содержания АБК............................. 50
2.2.6. Определение чувствительности микромицетов к цикадинам............................................................. 51
2.2.7. Определение активности ферментов.................. 51
2.2.8. Другие измерения.................................................. 52
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Действие ингибиторов и стимуляторов трансляции на синтез белков хлоропластов
3.1.1. Синтез растворимых белков хлоропластов........ 53
3.1.2. Действие хлорамфеникола и циклогексимида на синтез белков хлоропластов................................ 56
3.1.3. Действие гибберелловой кислоты на синтез белков хлоропластов....................................................... 64
3.1.4. Влияние затемнения и экзогенного А ТФ на содержание 14с в белках хлоропластов............................ 69
3.2. Синтез белков зерновок пшеницы в условиях засухи.
3.2.1. Влияние А ТФ и цАМФ на синтез белков зерновок пшеницы в условиях засухи................................... 77
3.2.2. Влияние абсцизовой кислоты на синтез белков в зерновках пшеницы в условиях засухи.................. 86
3.3. Действие микоплазменной инфекции и жасмоната на синтез белков растений.................................................. 95
3.4. Влияние салициловой кислоты на синтез белков растений....................................................................... 109
3.5. Действие янтарной кислоты на синтез белков растений....................................................................... 119
3.6. Физиологически активные белки цикадины, их свойства и действие на белковый обмен растений.
3.6.1. Ростстимулирующие свойства цикадинов........ 134
3.6.2. Фунгицидные свойства цикадинов...................... 139
3.6.3. Ферментативные активности цикадинов......... 147
3.6.4. Действие цикадинов на синтез белков растений.Л 53
3.6.5. Хроматографический анализ цикадинов............. 162
3.6.6. Действие олигопептидов на синтез белков растений............................................................. 167
ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................ 171
ВЫВОДЫ...................................................................................... 176
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................... 178
ВВЕДЕНИЕ
Продуктивность растений зависит от многих внутренних и внешних факторов. Современные интенсивные сорта и гибриды сельскохозяйственных культур обладают высоким потенциалом продуктивности, но многие из них недостаточно устойчивы к болезням и неблагоприятным факторам среды (Шевелуха, 1992; Velich, 1993; Кумаков, 1995; и др.). Вследствие экстремальных условий, вызываемых периодическими засухами, колебаниями температуры, фитопатогенами и другими факторами среды, в различных районах страны почти ежегодно на больших площадях нарушается формирование урожая сельскохозяйственных культур, что в конечном итоге приводит к его потерям.
От действия неблагоприятных факторов (эколого-климатических и биогенных) потери урожайности сельскохозяйственных культур могут доходить до 50-80% от генетически обусловленной продуктивности (Boyer, 1982). Это заставляет уделять проблемам адаптации растений к действию неблагоприятных факторов особое внимание.
Исследования по физиологии адаптации растений имеют большую историю, начало которой положено в прошлом столетии (Sachs, 1864). Собранная за многие годы информация свидетельствует об уникальной способности растений выживать и расти в различных неблагоприятных условиях (Levitt, 1980 a,b; Ayres, 1984; Метлицкий, Озерецковская, 1985; Matters, Scandalios, 1986; Sachs, Но, 1986; Rhodes, 1987; Войников, Иванова, 1988; Korableva et al., 1989; Neumann et al., 1989; Колесник, 1991; Кулаева и др., 1991; Блехман, Шеламова, 1992; Тарчевский, 1993 и др.). Ответ растений на воздействие различных по природе стрессоров особенно интересует исследователей по нескольким причинам. Во-первых, растения, в отличие от животных, более зависимы от мест обитания. Во-вторых, деятельность человека увеличивает количество и
меру воздействия стрессоров на растения. В третьих, все чаще растения испытывают комплексное воздействие нескольких стресс-факторов. Все это определяет актуальность задачи выяснения механизмов повышения устойчивости к действию различных стрессоров и формирования иммунитета к патогенным организмам.
При действии неблагоприятных факторов окружающей среды растение претерпевает многочисленные структурные и функциональные изменения, среди которых особую роль играет реакция генетического аппарата (Сатарова, 1978; Levitt, 1980 а, Ь; Кулаева, 1981, 1982, 1985; Войников, Иванова, 1988; Neumann et al., 1989; Войников, Боровский, 1994; и др.). Проявлением этой реакции является изменение как интенсивности синтеза различных белков, так и их набора. Последнее свидетельствует о "включении" ранее не задействованных генов, кодирующих синтез белков, играющих особую роль в устойчивости растений.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение интенсивности синтеза белков в процессе повышения устойчивости к неблагоприятным факторам и формирования иммунитета при патогенезе, изменения их набора и по возможности - деградации белков. Главное внимание было сосредоточено на анализе специфических и неспецифических ответных реакций растений на действие абиогенных и биогенных стресс-факторов. В связи с представлениями о напряженном энергетическом режиме клеток изучалось влияние АТФ на содержание и синтез белков. Все больше данных свидетельствует о функционировании в растениях систем вторичных посредников и поэтому было предусмотрено исследовать и влияние цАМФ (в сопоставлении с АТФ).
Исходя из указанной цели, были поставлены следующие основные задачи:
- изучить интенсивность синтеза растворимых белков растений, определить локализацию синтеза отдельных полипептидов в клетке, выявить особенности действия некоторых ингибиторов (хлорамфе-никола и циклокегсимида) и активаторов (гибберелловой кислоты) трансляции на синтез белка;
- выявить изменения в синтезе белка зерновок пшеницы в условиях засухи;
- исследовать влияние экзогенных АТФ, цАМФ и абсцизовой кислоты на синтез белков в условиях засухи, так как при этом изменяется энергетический режим клетки, ее гормональный статус и содержание эндогенного цАМФ;
- изучить действие биогенного стрессора-микоплазмы Acholeplasma laidlawii 118 на синтез белков растений ;
- выяснить вклад отдельных участников сигнальных систем растений (жасмоната и салицилата) в индуцированное микоплазмами образование белков;
- изучить влияние на синтез белков растений выделенных нами ранее цикадинов - новых физиологически активных белков из экскрета личинок цикады-пенницы Aphrophora costalis Mats.
Научная новизна работы. В работе впервые показано, что среди растворимых белков хлоропластов имеются два полипептида 67 и 105 кД с необычно высокой удельной радиоактивностью. Содержание их было небольшим, что позволило сделать вывод об их малом времени жизни и возможной роли в оперативной регуляции метаболизма, что предполагало значительное (большее, чем у других полипептидов) изменение удельной радиоактивности при действии на растения различных факторов. Это подтвердилось в опытах с исследованием влияния света, темноты, ингибиторов (хлорамфеникола и циклогексимида) и активаторов (гибберелловой кислоты и экзогенного АТФ) трансляции
на включение меченых аминокислот в растворимые белки хлороп-ластов.
Впервые показано участие цАМФ в регуляции синтеза зерновок пшеницы в условиях засухи. цАМФ повышал интенсивность синтеза альбуминов, глобулинов, глиадинов сверх уровня контроля. Стимулирующее влияние экзогенного цАМФ проявилось в концентрации на порядок более низкой, чем АТФ, особенно в случае низкомолекулярных полипептидов с мол. массами 12, 15, 19, 26 и 33 кД. Экзогенный цАМФ приводил к снижению интенсивности синтеза стрессовых полипептидов 14, 64 и 77 кД.
Впервые выявлено сильное увеличение содержания полипептидов 19 и 83 кД и появление полипептида 38 кД в инфицированных культурой микоплазмы Acholeplasma laidlawii 118 растениях гороха.
Был выяснен вклад таких участников сигнальных систем растений как жасмонат, салицилат и его аналог сукцинат в индуцированное микоплазмами образование белков.
Впервые обнаружено, что янтарная кислота, обладающая ростсти-мулирующими свойствами, является ингибитором каталазы и по своему действию на растения может считаться миметиком салицилата.
Показано, что ответ растений на действие абиогенных и биогенных факторов включал как неспецифические реакции (такие, например, как появление белка 38 кД), так и специфические. Все исследовавшиеся органические кислоты (жасмонат, салицилат и сукцинат) неспецифически индуцировали образование полипептидов 11, 38, 42, 72 кД, в то время как микоплазменная инфекция - лишь один из этих полипептидов (38 кД).
Впервые исследовались выделенные нами ранее новые физиологически активные белки из экскрета личинок цикады-пенницы Aphro-phora costalis Mats, названные нами цикадинами. Показано, что цика-
дины регулируют синтез белков в растении и обладают ростстиму-лирующими, антистрессовыми и фунгицидными свойствами. Установлено, что цикадины индуцировали появление новых полипептидов И, 23, 36, 38, 42, 72 и 120 кД. Цикадины проявляли хитиназную и про-теиназнуто активности.
Научно-практическая значимость работы. Исследованные нами янтарная кислота и цикадины расширяют ассортимент экологически чистых стимуляторов роста. Мы провели производственные испытания и крупномасштабное внедрение янтарной кислоты как антистрессового препарата во многих районах республики Татарстан. Внедрение янтарной кислоты в практику сельского хозяйства с целью повышения урожайности злаковых и овощных культур проводилось совместно с Министерством сельского хозяйства РТ по государственной инновационной программе "Освоение производства экологически чистого биохимического стимулятора растений и животных - янтарной кислоты и разработка на ее основе методов повышения урожайности сельскохозяйственных культур и продуктивности животноводства", созданной по постановлению кабинета министров РТ (К 153 от 29.03.93 г.).
Обнаруженные нами фунгицидные свойства белков цикадинов дают дополнительное обоснование перспективности применения в практике сельского хозяйства цикадинов как биологического эффективного средства против патогенных грибов. Индуцированное стресс-факторами образование хитиназы у растений может служить очень чувствительным тестом на появление системной устойчивости у растительных вытяжек.
Исследования выполнялись по грантам РФФИ N 94 -04-12894-а и N 95-04-11515, ведущей научной школы N 96-15-97940, а также грантам Академии наук Татарстана. Полученные результаты использовались в учебном процессе при чтении лекций на кафедрах физиологии растений и биохимии Казанского государственного университета.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Обнаруженные нами высокие удельные радиоактивности некоторых полипептидов (при небольшом содержании), а также их большая чувствительность к изменяющимся условиям окружающей среды и внутриклеточной обстановки позволяют отнести их к оперативным регуляторам обмена веществ или к полипептидам, тесно связанным с такими регуляторами.
2. Исследования влияния инфицирования микоплазмами, абиогенных стрессоров и различных экзогенных полипептидов, олигопептидов и органических кислот позволяют сделать заключение, что экспрессия новых белков включает в себя как неспецифические ответные механизмы (проявляющиеся при всех воздействиях), так и специфические, характерные для меньшего числа или одного вида воздействий.
3. Полученные нами данные дают основания считать, что в осуществлении неспецифической индукции синтеза новых полипептидов принимают участие сигнальные системы, включающие липоксигеназное превращение ненасыщенных жирных кислот, "окислительный взрыв" (в том числе накопление перекиси водорода), циклонуклеотидный информационный канал и протеинкиназные реакции фосфо-рилирования полипептидов.
4.Некоторые природные соединения (например, цикадины, янтарная и салициловые кислоты) могут использоваться в качестве стимуляторов роста или фунгицидов благодаря включению сигнальных (в том числе защитных) систем растений.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзном симпозиуме "Азотный и белковый обмен растений" (Тбилиси, 1978), на 4 и 5 Республиканских конференциях "Физиологические основы повышения продуктивности и устойчивость зерновых культур" (Алма-Ата, 1980; Целиноград, 1984), на Всесоюзной конференции
"Устойчивость к неблагоприятным факторам среды и продуктивность растений" (Иркутск, 1984), на 8 Всесоюзном симпозиуме по водному режиму растений (Ташкент, 1984), на Всесоюзном симпозиуме "Связь метаболизма углерода и азота при фотосинтезе" (Пущино, 1985), на V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), на 6 Конгрессе Федерации Европейских обществ физиологов растений (Югославия, Сплит, 1988), на Всесоюзной конференции "Регуляторы роста и развития растений (Киев, 1988), на Всесоюзном симпозиуме "Физиология семян" (Душанбе, 1988), на II съезде ВОФР (Минск, 1990), на I и II Рабочих совещаниях "Применение янтарной кислоты в медицине и растениеводстве" (Пущино, 1992; Казань, 1993), на 10 Международном конгрессе Всемирной организации микоплазмологов (Франция, Бордо, 1994), на III Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1995), на I Евразийском симпозиуме по биотехнологии (Турция, Анкара, 1995), на II Республиканской конференции "Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан" (Казань, 1995), на 8 Международном конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (Израиль, Иерусалим, 1996), на симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнологии" (Москва, 1997), на II съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), на Международной конференции "Молекулярная биология растений в стрессовых условиях" (Польша, Познань, 1997), на семинарах и итоговых научных конференциях КНЦ РАН (Казань, 1978 -1997).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 65 работ (общее число публикаций 76).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 236 страницах машинописного текста (включая иллюстрации и список литературы) и состоит из введения, трех глав, заключения и выводов. В
работе представлены 23 таблицы и 45 рисунков. Список литературы включает 554 наименований, из них 365 иностранных.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Синтез и деградация белков
Механизм биосинтеза белзсов со всем разнообразием их биологической активности и видовой специфичности является одной из крупнейших проблем биохимии. Сегодня мы уже многое знаем о процессе белкового синтеза, что определяется не только его очевидной важностью, но и появлением и совершенствованием эффективных методов исследования белков , таких, как радиоактивные изотопы, электрофорез, изоэлектрофокусировка, хроматография, определение последовательности расположения аминокислот с помощью аминокислотного анализатора и т.д.
Содержание белков в клетках растений (рис.1), определяется соотношением скоростей их синтеза и деградации (Дин, 1981; Schlee, 1986; Lamattina et al., 1987; Veierskov, Thimann,1988; Голяновская и др., 1989; Vierstra, 1989, 1993; Блехман, Шеламова, 1992; Fischer, Feller, 1994; Callis, 1995). Несмотря на то, что на разное время жизни белков обратили внимание достаточно давно, только в последние годы стали появляться данные о причинах изменения интенсивности деградации различных белков растительных клеток. Изучение катаболизма белков сопряжено с гораздо большими трудностями, чем исследования их синтеза, этим и объясняется, что большинство исследований белкового метаболизма посвящено изучению синтетических процессов и значительно меньше - процессу катаболизма. Существует еще одна причина, предопределяющая гораздо меньшее число публикаций, касающихся этой стороны обмена веществ - недооценка функциональной роли деградации белков. Хотя распад белков по сравнению с синтезом, на первый взгляд, выглядит "рас
-
Максютова, Наиля Назибовна
-
доктора биологических наук
-
Москва, 1997
-
ВАК 03.00.12
- Водный обмен и адаптация растений кукурузы к засухе
- Динамика содержания гормонов в проростках пшеницы при изменении температуры
- Адаптивные особенности белковых комплексов хлоропластов пшеницы
- Азот в белках прорастающих семян лиственниц Гмелина и сибирской
- Гормональная регуляция уровня дегидринов в растениях пшеницы в условиях обезвоживания
