Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Бактериальное разнообразие снежного покрова ледника Монблан, содержащего почвенную пыль пустыни Сахара, и роль отдельных филотипов в его колонизации

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Бактериальное разнообразие снежного покрова ледника Монблан, содержащего почвенную пыль пустыни Сахара, и роль отдельных филотипов в его колонизации"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЧУВОЧИНА Мария Сергеевна

БАКТЕРИАЛЬНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ СНЕЖНОГО ПОКРОВА ЛЕДНИКА МОНБЛАН, СОДЕРЖАЩЕГО ПОЧВЕННУЮ ПЫЛЬ Г1УСТЫНИСАХЛРА, И РОЛЬ ОТДЕЛЬНЫХ ФИЛОТИПОВ В ЕГО КОЛОНИЗАЦИИ

Специальность: 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

4855417

-6 0КТ2011

Санкт-Петербург 2011

4855417

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Булат Сергей Алексеевич.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Турова Татьяна Павловна, Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН,

кандидат биологических наук Андронов Евгений Евгеньевич, Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН.

Ведущее учреждение: Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН.

Защита состоится " № 2011 г. в /¿/^чзсов на заседании.объединенного совета ДМ212.232.07 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, биолого-почвенный факультет, аудитория 4 .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета. Факс для отзывов:+7(81371) 32 303.

Автореферат разослан " " \ 1 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Е. И. Шарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время в результате молекулярно-экологических исследований микробных сообществ представления о границах жизни продолжают расширяться (Нетрусов и др., 2004). Ранее считавшийся практически стерильным снежный покров высокогорных и полярных ледников (в основном на окраинах) оказался пригодным для жизни целого ряда микроорганизмов (Sattler et al., 2008). Общая численность микроорганизмов снежного покрова высокогорья варьирует от 0,02 х 103 кл/мл (Zhang et al., 2010а) до 4 х 105 кл/мл (Alfreider et al., 1996; Segawa et al., 2005). Однако изучению микробного разнообразия поверхностного снега высокогорных ледников посвящены единичные работы (Segawa et al., 2005; Liu et al., 2009; Gonzalez-Toril et al., 2009; Zhang et al., 20106). В них показана корреляция как численности, так и разнообразия прокариот с концентрацией пыли, осажденной на ледник.

Крупнейшим источником почвенной пыли в атмосфере является пустыня Сахара (Moulin et al., 1997). Поднятие больших масс пыли способствует переносу микробиоты на значительные расстояния, приводя также к распространению микроорганизмов, патогенных по отношению к растениям, животным и человеку (Kellogg & Griffin, 2006). Воздействие пыли Сахары на различные экосистемы распространяется вплоть до Северной Европы (Franzen et al., 1994), Амазонии (Swap et al., 1992) и Карибского моря (Griffin, 2001,2003).

Органические компоненты пыли, а также железо и фосфор могут служить источниками питательных веществ и энергии для микробных сообществ (Herut et al., 2005; Pulido-Villena et al., 2008a). Тридцатилетние аналитические исследования ледникового керна Монблана (французские Альпы) показали, что повышенное содержание кальция во льду связано с регулярным переносом почвенной пыли из Северной Африки (De Angelis et al., 1991). Некоторые виды бактерий, перенесенные с пылью Сахары, способны развиваться в условиях холодных олиготрофных альпийских озер и принимать участие в формировании популяции бактерионейстона (Reche et al., 2009; Hervas & Casamayor, 2009). Осаждение пыли на горные ледники может вносить вклад в формирование микрофлоры снежного покрова за счет ее перенесения с пылью. Снежный покров высокогорных ледников и пустыня Сахара - экстремальные экониши, изучение микробного разнообразия которых представляет как научный, так и практический интерес.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - с помощью методов молекулярно-филогенетического анализа (полимеразная цепная реакция (ПЦР), рибо-типирование и секвенирование бактериальных генов 16S рРНК) провести изучение микробного разнообразия снежного покрова ледника Монблан, содержащего почвенную пыль пустыни Сахара, на примере четырех событий переноса пыли на ледник.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучение бактериального разнообразия в образцах снежного покрова ледника Монблан, содержащих почвенную пыль Сахары разного времени переноса и нахождения в снежном покрове (4 события переноса пыли).

2. Изучение бактериального разнообразия в снежном покрове ледника Монблан, не содержащем пыль Сахары, дополнительно методами выделения и изучения рРНК (контроль на почвенную пыль Сахары).

3. Сравнительное изучение бактериального разнообразия в образцах почвенной пыли Сахары после осаждения ее на разных высотах: снег высокогорного ледника и осаждение пыли в городе, одно и то же событие переноса пыли (контроль на почвенную пыль Сахары, занесенную на ледник).

4. Изучение бактериального разнообразия в образце песчаной пустынной почвы Сахары, отобранной в одном из возможных регионов - источников пыли (контроль на перенос почвенной пыли Сахары из пустыни на ледник в Альпах).

5. Сравнение бактериального разнообразия образцов: снежного покрова ледника, содержащего и не содержащего почвенную пыль Сахары; пыли Сахары, собранной в Гренобле (Франция); песчаной почвы Сахары.

6. Оценка вклада микрофлоры, перенесенной с пылью пустыни Сахара, в формирование микрофлоры снежного покрова в условиях ледника Монблан.

7. Оценка эффективности праймерных систем, амплифицирующих в ПЦР разные области гена 16S рРНК (V3-V5 и полноразмерный ген), в изучении микробного разнообразия.

Научная новизна. Впервые методом секвенирования бактериальных генов 16S рРНК (полноразмерного гена и его V3-V5 области) показано различие состава микроорганизмов (как на уровне видов, так и разделов) снежного покрова ледника Монблан, содержащего пыль Сахары от событий переноса в 2006, 2008 (2 события) и 2009 гг., как между событиями, так и в сравнении со снегом, не содержащим пыль Сахары. Выявлены бактериальные филотипы, которые могут участвовать в формировании микрофлоры снежного покрова горных ледников. Получены косвенные свидетельства метаболической активности при отрицательной температуре цианобактерии рода Stigonema, выявленной в снеге, не содержащем пыль Сахары. Полученные в работе последовательности генов 16S рРНК депонированы в международную базу данных NCBI под номерами НМ104591-НМ104622, HQ396527-HQ396619, HQ402563-HQ402566, JF832298-JF832350.

Практическая значимость. Результаты исследования вносят вклад в представление о формировании микробных сообществ в снежном покрове высокогорных ледников в присутствии пыли Сахары. Изучение микробного разнообразия снежного покрова высокогорных ледников позволяет очертить лимитирующие жизнь границы и факторы (в частности доступность воды при отрицательной температуре), а также способствует выявлению холодолюбивых экстремофилов, представляющих интерес для биотехнологии. Результаты работы закладывают основу для последующих сравнительных исследований микроорганизмов снежного покрова ледников высокогорья, а также почвы пустыни Сахара.

Апробация работы. Основные материалы работы были представлены на 13-й и 14-й Пущинских конференциях молодых ученых "Биология - наука 21-го века" (Пущино, 2009, 2010); SCAR/IASC IPY Open Science Conference "Polar Research - Arctic and Antarctic Perspectives in the International Polar Уеаг"(Санкт-Петербург, 2008); Interdisciplinary Congress "Interactions between the physico-chemical processes and microbiological processes in the environment" (Aubiere, France, 2008); конференции молодых ученых ОМРБ ПИЯФ им. Б. П. Константинова РАН (Гатчина, 2009, 2011); European Geosciences Union General Assembly (Vienna, Austria, 2009, 2010); Российско-французском семинаре по проблемам изучения ледяных кернов, палеоклимата и подледникового озера Восток (Антарктида) (Grenoble, Brest, Lyon (France), Санкт-

Петербург, 2008, 2009, 2010); Гляциологическом симпозиуме "Лед и снег в климатической системе" (Казань, 2010); VI Молодежной школе-конференции с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 7 тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (включающей методы, результаты исследования и обсуждения), заключения, выводов и списка литературы, включающего 394 источника. Работа изложена на 160 страницах и содержит 7 таблиц и 22 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служили образцы снега ледника Монблан (французские Альпы, 4250 м над у. м.), содержащего пыль Сахары, осажденную на ледник вследствие четырех событий переноса пыли в 2006, 2008 и 2009 гг.,(1) и образец снега, не содержащий пыль Сахары, а также дополнительно пыли Сахары, собранной в Гренобле вследствие события переноса в мае 2008 г., зафиксированного позднее на леднике'2', и песчаной пустынной почвы Сахары, отобранной в марте 2008 г. в окрестностях (10-15 км) оазиса Ксар Гилан (Тунис, Северная Африка)'31, табл. 1.

Среднегодовая температура воздуха на леднике Монблан составляет -11 °С (в летний период поднимается до 0 °С), а сезонная аккумуляция снежного покрова варьирует от 0,5 до 2,4 м водного эквивалента/год. Как правило, в весенне-летний период отмечается высокая частота пыльных бурь в Северной Африке, последствия которых можно наблюдать в виде дискретных слоев пыли в толще снежного покрова на леднике Монблан.

Снег плавили при комнатной температуре в "чистой" комнате класса 10000 в ламинарном кабинете класса 100 ЛГГОС (Франция). Для концентрирования биомассы путем центрифугирования использовали фильтрующие колонки Centriprep YM3 или Centricon Plus-70 ("Millipore", США) с мембранными фильтрами 3000 и 5000 Да соответственно. Процедуры деконтаминации описаны ранее (Булат и Алехина, 2008).

Выделение геномной ДНК и РНК проводили с помощью наборов PovverSoil DNA Isolation Kit и PowerWater RNA Isolation Kit соответственно, согласно протоколам фирмы-изготовителя ("МО BIO Laboratories", США). Контрольные экстракции проводили без добавления исследуемого образца. Получение ПЦР фрагментов полноразмерного гена 16SpPHK и его вариабельной области V3-V5 проводили с использованием универсальных праймеров w001mCFm/1492R и 338Fb/com2mod соответственно, как описано ранее (Bulat et al., 2004; Lavire et al., 2006). Контрольные реакции проводили без добавления ДНК-матрицы. Продукты ПЦР анализировали при помощи электрофореза в 1,6%-м агарозном геле с последующей окраской SYBR Gold ("Invitrogen", США) или бромистым этидием. ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) проводили с использованием набора SuperScript III One-Step RT-PCR System и полимеразой Platinum Taq DNA, следуя рекомендациям производителя ("Invitrogen", США), с использованием тех же праймеров, что в ПЦР (338Fb/com2mod). ПЦР-

111 Образцы снега, содержащего и не содержащего пыль Сахары, были отобраны сотрудниками Лаборатории гляциологии и геофизики окружающей среды (Франция) M. Debret, Е. Le Meur, В. Jourdain, D. Six и С. Vincent. <2' Образец собран С. А. Булатом и J. R. Petit (ЛГГОС, Франция).

iJ) Образец предоставлен сотрудником Университета Лион 1, Отдел экологии микроорганизмов (Франция) P. Normand.

продукты клонировали с использованием набора TOPO ТА Cloning Kit for Sequencing в соответствии с рекомендациями производителя ("Invitrogen", США). Отбор рекомбинантных клонов осуществляли путем прямой амплификации клонированных фрагментов с использованием грубых клеточных лизатов и вектор-специфичных (pCR-4) праймеров. Приготовление грубых клеточных лизатов из отдельных клонов осуществляли путем кипячения (10 мин) в 200 мкл лизирующего буфера (ТЕ-буфер (10 : 0,1), 150 мМ NaCl, > 0,1 % Triton Х-100). Клоны группировали методом риботипирования с помощью эндонуклеаз рестрикции A lui, Hpall и Нае III ("Fermentas", Литва). Разделение рестрикционных фрагментов осуществляли в 4,5%-м агарозном геле. Ампликоны, схожие по картине расщепления, объединяли в риботип и по 1-3 представителям от каждого секвенировали. ПЦР-продукты перед секвенированием очищали с помощью набора MinElute Purification Kit согласно рекомендациям производителя ("Qiagen", Германия). Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе коммерческой организации LGC Genomics GmbH (Берлин, Германия).

Редактирование нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы Chromas Lite 2.01 (http://www.technelysium.com.au). Наличие химерных структур проверяли с помощью программы CHIMERA_CHECK 2.7 (http://wdcm.nig.ac.jp/RDP/docs/chimera_doc.html). Выравнивание, сравнение и идентификацию последовательностей проводили с помощью программы CLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) и алгоритма nBLAST базы данных GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Последовательности клонов, показывающие > 98 % сходства и одинаковый перечень близкородственных последовательностей в GenBank, объединяли в один филотип. Последовательности филотипов, показывающие > 98 % сходства с последовательностями из библиотеки контаминантов (БК), созданной на основании результатов контрольных реакций (Bulat et al., 2004), относили к контаминантам и в дальнейшем не рассматривали. Филотипы, показывающие < 90 % сходства с известными таксонами, относили к неидентифицированным. Последние, при невозможности идентификации путем филогенетического анализа, относили к неклассифицируемым. Филотипы, показывающие > 98 % сходства с бактериями нормальной микрофлоры человека (например Grice et al., 2008,2009; Turnbaugh et al., 2009), маркировали как НА (Human Associated - "связанные" с человеком), а родственные (> 98 %) бактериям из холодных местообитаний относили к "холодолюбивым". Филогенетические дендрограммы строили методом "maximum parsimony" (MP) в программе MEGA4 (Kumar et al., 2008).

Статистическую оценку достаточности размера библиотеки клонов проводили путем расчета покрытия по Гуд (Good, 1953) и построения кривых зависимости количества филотипов в библиотеке от размера выборки в клонах с помощью программы aRarefact Win 1.3 (http://www.uga.edu/strata/sofhvare/anRareReadme.html). Расчет индексов Шеннона - Уивера и Чао 1 проводили в программе DOTUR 1.53 (Schloss & Handelsman, 2005). Степень различий клоповых библиотек оценивали с помощью расчета значения Р, используя функцию LIBSHUFF, в программе Mothur 1.15.0 (http://www.mothur.org/vviki/Main_Page).

Реконструкцию обратных траекторий переноса воздушных масс проводили с помощью модели HYSPLIT (NOAA ARL Website (http://www.arl.noaa.gov/ready.php), GDAS meteorological data).

Образец Место отбора пробы, дата Объем Концентрационный фактор Дата пыльной бури Время нахождения пыли в снеге, мес/глубина слоя пыли, см Мода частиц пыли , M км Численность клеток , мл"' Библиотека клонов гена 16S рРНК

область V3-V5 Полноразмерный ген

Образцы, содержащие пыль типа смектит

SDm05/2008 Монблан, 30.06.2008 345 мл х 176,3 05.2008 1,0/70-76 ~6 2,14 х 102 MB-SD f2SD

SD05/2008*" Гренобль, 28.05.2008 1,0 г н. п. 05.2008 н. п. ~ 9 н.д. SD -

SDm06/2008 Монблан, 30.06.2008 90 мл х 111,3 06.2008 0,25/4 - 7 -6,5 1,10 х 102 MB-SD2 -

Образцы, содержащие пыль типа иллит

SDm06/2006 Монблан, 10.09.2006 250 мл х 121,3 06.2006 3,5/139 ~6 н. д. МВ5 5f

SDm05/2009 Монблан, 20.05.2009 МЕГА х 1275 05.2009 0,25/5 - 15 ~ 4 0 MS5 MS5sf, MS5f

н. Д.

Dm08/2009 Монблан, 27.08.2009 МЕГА х 6035 н. п. н. п. ~3 2 MS7, MS7r MS7f

SS03/2008 Сахара (Ксар Гилан, Тунис), 03.2008 0,1 г н. п. н. п. н. п. н. п. н. д. SS -

н. п. - не применимо; н. д. - нет данных; МЕГА - до 8 л талой воды. * Приведены данные, полученные J-R. Petit (Chuvochina et al., 2011). ** Приведены данные, полученные D. Marie (Chuvochina et al., 2011).

*** Образец пыли Сахары, собранный в Гренобле в результате мокрого осаждения пыли вследствие переноса в мае 2008 г. Слой пыли, соответствующий этому событию, был отобран в снежном покрове ледника приблизительно через один месяц (SDm05/2008).

Минералогический состав почвенного образца остался неизвестен, так как содержание большого количества кварца не позволило определить в нем другие составляющие.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Происхождение почвенной пыли. Обратные траектории переноса воздушных

масс в июне 2006 г., мае и июне 2008 г. и мае 2009 г., а также данные элементного состава пыли(1) показали, что источником почвенной пыли, обнаруженной в снеге ледника Монблан, является Северная Африка (рис. 1). В снеге без пыли Сахары было также обнаружено незначительное количество пылевого материала, происходящего, по-видимому, из окружающих долин вследствие постоянной конвекции воздушных слоев.

Рис. 1. Обратные траектории переноса воздушных масс, достигших места сбора образцов (А - 80т05/2008, Б - 8Рт06/2008, В -50т06/2006, Г-80т05/2009) на леднике Монблан (черная звезда)

Молекулярно-филогенетический анализ микробного разнообразия:

использовали препараты суммарной ДНК, выделенной из снега, предварительно расплавленного и сконцентрированного в связи с малой клеточной биомассой в образцах (табл. 1). Для амплификации области УЗ-У5 (~ 590 п. н.) и полноразмерного гена 16Б рРНК (~ 1510 п. н.) использовали пары праймеров 338РЬ/сот2тос1 и \v001 тСРт/149211 соответственно. Суммарно для области УЗ-У5 было создано 8 библиотек клонов (библиотека УЗ-У5), а для полноразмерного гена - 4 библиотеки клонов (полноразмерная библиотека).

Изучение микробного разнообразия снега с пылью и без пыли Сахары путем анализа двух типов клоновых библиотек (УЗ-У5 и полноразмерной). В трех основных образцах снежного покрова с пылью Сахары от событий переноса пыли в июне 2006 г., мае 2008 г., мае 2009 г. и образце снега без пыли Сахары суммарно для двух типов клоновых библиотек было выявлено 90 и 25 филотипов соответственно (табл. 2). Доля филотипов, родственных (> 95 % сходства по нуклеотидной последовательности) известным таксонам, составила более 74 % независимо от типа клоновой библиотеки. Всего в четырех образцах снега было обнаружено 10 неидентифицированных филотипов (6 и 4 филотипа в УЗ-У5 и полноразмерных

Р. РогтепЬ и Б. СЬеуаШ1ег (Лаборатория атмосферных систем, Франция) - (ОшуосЫю е1 а!., 2011).

г

I библиотеках соответственно), а также 12 НА-филотипов, имеющих отношение к | нормальной микрофлоре человека.

Таблица 2. Характеристика клоновых библиотек УЗ-УЗ и полноразмерного (ПГ) типа

Тип минерала Иллит Смектит н. д.

Образец SDm05/2008 SDm06/2006 SDm05/2009 Dm08/2009

Тип библиотеки V3-V5" ПГ V3-V5 ПГ V3-V5 ПГ V3-V5 ПГ

Число филотипов/ клонов 19/38 23/48 12/40 12/40 20/60 10/57 17/40 12/34

Число БК-филотипов 0 1 1 1 2 1 3 1

Число "истинных" ф илотипов/кло нов 19/38 22/47 11/39 11/38 18/57 9/55 14/36 11/33

Индекс Шэннона - Уивера 2,67 (2,402,93) 2,87 (2,643,1) 2,04 (1,752,34) 2,04 (1,762,31) 1,67 (1,232,02) 1,08 (0,751,41) 1,92 (1,52,35) 1,41 (0,981,84)

Индекс Чао 1 24 (19,3345,1) 38,5 (26,2685,95) 12 (11,0921,68) 16 (11,7843,14) 22,2 (16,647,37) 11 (8,3930,99) 31 (16,9994,31) 24 (12,377,04)

Покрытие Гуд, % 74 75 92 87 74 93 75 79

Число НА-филотипов 3 0 2 1 5 1 0 0

* Обозначения библиотек, см. табл. 1.

Индексы разнообразия и покрытие рассчитывали для "истинных" филотипов, т. е. без учета БК-филотипов.

Судя по форме кривых, описывающих достаточность выборки для достоверного анализа видового состава образцов, больше половины возможных филотипов было охвачено созданными библиотеками (рис. 2). Анализ полноразмерных и библиотек I УЗ-У5 показал подобие результатов для трех из четырех образцов.

♦ МВ5 и 5f

MB-SD f2SD

количество клонов

количество клонов

ш

111]

Iii

т

pp*-

♦ MS5 ■MS5f

количество клонов

Ji

MS7 ' MS7f

количество клонов

Рис. 2. Кривые зависимости количества филотипов в библиотеке от размера выборки в клонах. На графиках приведено по две кривых, соответствующих библиотекам УЗ-У5 и полноразмерного типа

L

Среднее значение покрытия библиотек по Гуд составило 72 и 84 % для V3-V5 и полноразмерных библиотек соответственно. Индекс Шеннона - Уивера показал, что выборки клонов для библиотек двух типов фактически совпадают для двух из четырех образцов (табл. 2). Наибольшее разнообразие было обнаружено для снега с пылью Сахары от мая 2008 г. Отметим также подобие трех образцов снега с пылью Сахары, собранных в 2008 и 2009 гг., в плане доминирования филотипов раздела Actinobacteria.

Анализ микробного разнообразия образца снежного покрова с пылью Сахары, осажденной в июне 2006 г. (SDm06/2006, библиотеки МВ5, 5f) показал, что доли доминантных филотипов, принадлежащих Deinococcus-Thermus, Alphaproteobacteria и Cyanobacteria, были одинаковыми для V3-V5 и полноразмерной библиотек (табл. 3).

Таблица 3. Доминантные бактериальные филотипы (% от общего числа клонов в библиотеке), выявленные в образцах снежного покрова с пылью Сахары (БЭт) и без пыли Сахары (От) путем создания У3-У5 и полноразмерных (ПГ) библиотек гена 168 рРНК

Филогенетический раздел Тип минерала

иллит смектит н. д.

SDm05/2008 SDm06/2006 SDm05/2009 Dm08/2009

V3-V5' ПГ V3-V5 ПГ V3-V5 ПГ V3-V5 ПГ

Deinococcus-Thermus 0 0 43 43 0 0 0 0

Alphaproteobacteria 19 0 13 13 0 0 0 44

Firmicutes 0 58 0 0 0 33 0 0

Bacteroidetes 0 0 8 18 0 0 0 0

Actinobacteria 29 0 0 0 24 0 19 0

Cyanobacteria 0 0 8 8 0 0 0 0

Неклассифицируемые 0 0 10 0 0 0 0 0

Другие (минорные филотипы) 52 42 18 18 76 67 81 56

* Обозначения библиотек, см. табл. 1.

Большая часть доминантных филотипов совпала между библиотеками: это представители родов Deinococcus (филотипы МВ5-1 и 5f-3, 94-89 % сходства с D. radiophilvs-, МВ5-19 и 5f-16, 94% - D. radiomollis), Flexibacter (МВ5-18 и 5f-6, 84-85 %-F. flexilis) и Gluconacetobacter (МВ5-4 и 5f-l, 92-95 % - G. sacchari). Родственные минорные филотипы МВ5г-2 и 5f-13 (91,4-93 % сходства с Hymenobacter soli) были также обнаружены в библиотеках обоих типов. Доминантные цианобактериальные филотипы МВ5-20 и 5f-12 обнаруживали сходство с Anabaena cylindrica (93,3 %) и Phormidium pristleyi (97 %) соответственно. Значительное сходство в распределении и принадлежности большинства доминантных филотипов между библиотеками двух типов, по-видимому, обусловлено высокой степенью покрытия библиотек. То, что филотипы семейства Deinococcaceae составляли почти половину от общего числа клонов в библиотеках двух типов, а также тот факт, что бактерии этого семейства обнаружены ранее в Сахаре (De Groot et al., 2005; Chanal et al., 2006) и в холодных местообитаниях (Callegan et al., 2008), может указывать на размножение данных бактерий в снеге с пылью Сахары, находившейся там более трех месяцев.

В снежном покрове с пылью Сахары, осажденной в мае 2008 г. (SDm05/2008), по данным библиотек MB-SD и Í2SD, напротив, доминировали филотипы разделов Actinobacteria, Alphaproteobacteria и Firmicutes. Их распределение и таксономическая принадлежность в составе библиотек двух типов значительно отличались, несмотря на практически идентичное покрытие библиотек. Так, в библиотеке V3-V5 это были филотипы: 2SD-21 (99 % сходства с Blastococcus saxobsidens), 2SD-12 (99 % -

Geodermatophilus obscurus), 2SD-10 (97,7 % - Rubellimicrobium mesophilum) и 2SD-40 (97,5 % - Sphingomonas kaistensis). В полноразмерной библиотеке филотипы: Í2SD-104 (96 % сходства с Bacillus aminovorans), féSD-11 (97 % - В. macroides), Í2SD-33 (98 % -В. simplex), í2SD-bl4 (97 % - В. benzoevorans), Í2SD-87 (98 % - Ammoniphilus oxalaticus) и f2SD-a7 (99 % - Tumebacíllus permanentifrigoris). Сходство библиотек проявилось на уровне идентичных минорных филотипов - 2SD-29 и 12SD-4 (96-98,2 % сходства с В. niabensis). Один филотип оказался конспецифичен хлоропластной рДНК Pinns merkusii.

Микробный состав снежного покрова с пылью Сахары, осажденной в мае 2009 г. (SDm05/2009), согласно анализу библиотек MS5 и MS5f, был представлен в основном бактериями разделов Firmicutes (филотип MS5sf-2, 99 % сходства с Bacillus niacini) и Actinobacíeria (филотип MS5s-3, 99 % - Saccharothrix algeriensis). Значительное отличие в репрезентативности библиотек двух типов, по-видимому, является одной из причин различий состава филотипов. В библиотеках обоих типов были обнаружены филотипы, родственные (99 %) хлоропластной рДНК Picea sitchensis (MS5-3 и MS5f-3) и Queráis nigra (MS5s-20 и MS5sf-3).

По данным анализа V3-V5 (MS 7) и полноразмерной библиотек (MS7Í) в снежном покрове, не содержащем пыль Сахары (Dm08/2009), доминировали ранее не встреченные филотипы разделов Actinobacíeria (MS7-40, 95,6 % сходства с Conexibacter woesei) и Alphaproteobacteria (MS7f-15, реклассифицированный филотип). В составе обеих библиотек значительную долю занимали филотипы, родственные (99-100 %) хлоропластной рДНК Bartramiapomiformis (MS7-22), Syntrichia ruralis (MS7f-7, MS7f-2), Marchantía polymorpha (MS7f-21) и Thelypteris navarrensis (MS7-2).

Сравнение образцов снега с пылью и без пыли Сахары по объединенным данным двух типов клоновых библиотек: состав бактериальных видов и их распределение по филогенетическим разделам существенно варьировали среди трех образцов снежного покрова ледника Монблан с пылью Сахары (табл. 3). Даже в случае одного и того же раздела (например, Alphaproteobacteria) видовой состав образцов отличался. Таким образом, нами не было выявлено не только единого набора филотипов, но и общих разделов между тремя образцами снега с пылью Сахары, а также при их сравнении со снегом, ее не содержащим. Вместе с тем образцы 20082009 гг. сбора оказались сходны между собой: доминантные филотипы принадлежали Actinobacíeria, Firmicutes и Alphaproteobacteria. Общие филотипы, принадлежащие Blastococcus saxobsidens, Bacillus benzoevorans и хлоропластной рДНК Pinus merkusii, были обнаружены в снеге с пылью Сахары, осаженной в мае 2008 г. и мае 2009 г.

Во всех образцах снега, за исключением сбора 2006 г., было выявлено значительное количество клонов пластидного происхождения (в среднем до 66 %). Однако в снеге, содержащем пыль Сахары, хлоропластная рДНК принадлежала голо-и покрытосеменным деревьям родов Pinus, Picea и Quercus, а в снеге, не содержащем пыль Сахары, - мхам Bartramia, Synírichia, Marchantía и папоротнику Thelypíeris. По-видимому, идентификация пластидной рДНК может являться одним из индикаторов путей и источников переноса пылевого материала на ледник.

Отметим, что в 3 из 4 образцов снега (в большей мере с пылью Сахары) были выявлены в V3-V5 библиотеках бактерии семейства Geodermaíophilaceae {Geodermatophilus, Blastococcus и Modestob acter), тогда как в полноразмерных библиотеках - представители семейства Bacillaceae (Bacillus) (рис. 3). Представители обоих семейств имеют преимущества в переживании неблагоприятных условий и часто

обнаруживаются в аридных почвах и пыли Сахары. Это может свидетельствовать о более полном представлении данными образцами почвы Сахары.

ш

30лп05)2008 30т0512009 0т08/2009 30т05/2008 30т05/2009 Ст08/2009

шишт ¿мектцт штшп смектит

1 Сеос1егта(орЬИасеае □ ВасШасеае «другие А Б

Рис. 3. Распределение клонов, принадлежащих Оеос1егта1оркИасеае и ВасШасеае по отношению к общему числу клонов (без учета небактериальных клонов) в библиотеках У3-У5 (А) и полноразмерного (Б) типов соответственно. Другие - все остальные бактериальные клоны

Филогенетический анализ позволил приписать 7 из 10 неидентифицированных филотипов к следующим разделам: М87-15 - Саттарго1еоЬас1ег1а\ МВ5-18, 5Г-6, 5&-8 и М85з£18 — 280-1 — АсИпоЬааепа\ 5£-3 - Оетососсив-ТИегтив.

Филогенетическое положение филотипов М87-34, МЭ7-19 и М87Г-15, указанное в ОепВапк, было исправлено на А1рНарго1еоЬааепа. 12 НА-филотипов (разделы А^ИарШеоЬаМепа, Ве1арго1еоЬас1ег'ш, ЛУ/шси?«, АсйпоЬасгепа и 5ас/егогй?е/е^) были обнаружены в снеге с пылью Сахары, и ни одного подобного филотипа - в снеге, не содержащем пыль Сахары. Данный факт, по-видимому, связан с большим влиянием антропогенного фактора в пустыне, в отличие от высокогорного ледника.

Результаты, полученные с использованием двух типов клоновых библиотек, дополнили друг друга и позволили получить более полную картину микробного разнообразия исследуемых образцов. Различия, обнаруженные между У3-У5 и полноразмерными библиотеками, могут быть обусловлены двумя причинами: 1) степенью вырожденности праймеров и, как следствие, проявлением избирательности в амплификации; 2) во время воздушного транспорта клеток накоплением повреждений в их геномной ДНК, препятствующих амплификации полноразмерных копий рРНК генов и, как следствие, обогащением выборки короткими фрагментами гена.

Изучение дополнительных образцов путем анализа клоновых библиотек типа УЗ-У5. Для выявления причин различий в видовом составе вышеописанных образцов путем анализа библиотек типа У3-У5 было изучено 3 дополнительных образца: снега с пылью Сахары от июня 2008 г.; пыли Сахары, собранной в Гренобле; песчаной пустынной почвы Сахары. Кроме того, используя продукты ОТ-ПЦР, была создана РНК-библиотека клонов для снега, не содержащего пыль Сахары. Суммарно для 4 библиотек было выявлено 67 филотипов (табл. 4), из которых более половины (67 %) показали > 95 % сходства по нуклеотидной последовательности с известными таксонами.

При анализе дополнительных образцов было обнаружено 10 неидентифицированных филотипов, из них 4 удалось приписать разделам АсИпоЬааепа (МВ-802-18), Вас1его1<1е1ев (8Б24) и хлоропластной рДНК (8Б27 и 8Б18). Также обнаружены 6 других (по сравнению с 4 основными образцами) НА-филотипов,

принадлежащих АсИпоЬсиЯепа, УеггисотхгоЫош, А1рИарго1еоЬас1епа и Р^гткШез, в снеге с пылью Сахары от июня 2008 г., снеге без пыли Сахары и в пыли Сахары, собранной в Гренобле.

Тип минерала Иллит н. д.

Образец SDm06/2008 SD05/2008 DmO8/2009 SS03/2008

Библиотека MB-SD2 SD MS7r ss

Число клонов/филотипов 15/38 24/39 13/38 22/40

Число БК филотипов 2 0 5 0

Число "истинных" клонов/филотипов 13/29 24/39 8/17 22/40

Индекс Шэннона -Уивера 2,18 (1,81-2,55) 2,88 (2,59-3,17) 1,8 (1,39-2,22) 2,8 (2,52-3,08)

Индекс Чао 1 20 (14,45-46,8) 68,33 (36,08-180,03) 13 (8,78-40,14) 30,43 (23,48-56,91)

Покрытие Гуд, % 72 54 71 65

Число НА-филотипов 2 1 3 0

н. д, - нет данных.

Расчет индексов разнообразия и покрытия по Гуд проводили для БК филотипов.

истинных" филотипов, т. е. без учета

количество клонов

Рис. 4. Кривые зависимости количества филотипов в библиотеке от размера выборки. Приведены графики и обозначения для библиотек УЗ-У5-типа (см. табл. 4)

Статистическая оценка

репрезентативности библиотек показала покрытие большей части возможных филотипов для библиотеки МВ-802 и РНК-библиотеки М87г,

представляющих образцы снежного покрова с пылью Сахары от июня 2008 г. и снега, не содержащего пыль Сахары соответственно (табл. 4, рис. 4). Напротив, выборки библиотек ЭБ и оказались

недостаточными для охвата возможного разнообразия пыли Сахары, собранной в Гренобле, и почвенного образца Сахары.

Анализ микробного разнообразия образца снежного покрова с пылью Сахары, собранной в июне 2008 г. (SDm06/2008, библиотека MB-SD2) показал доминирование филотипов раздела Actinobacteria: MB-SD2-11 (99 % сходства с Geodermatophilus obscurus) и MB-SD2-35 (100 %- Cellulomonas cellaseá).

В пыли Сахары, собранной в мае 2008 г. в Гренобле (SD05/2008, библиотека SD), доминировали филотипы, принадлежащие Cyanobacteria (SD5, 93 % сходства с Anabaena planctónica; SD2, 96 % - Calothrix sp.) и Alphaproteobacteria (SD25, 95 % -Acidicaldus sp.). Пять филотипов принадлежали (96-99 % сходства) хлоропластной рДНК Stichococcus bacillaris (SD3), Chlorella saccharophila (SD13) и Pinus thunbergii (SD36).

Напротив, в песчаной пустынной почве Сахары (SS03/2008. библиотека SS) значительную часть составляли филотипы, принадлежащие Bacteroidetes. Два из них (SS28 и SS11) были родственны между собой и обнаруживали сходство (95 %) с Flavisolibacter ginsengisoli. Третий доминантный филотип (SS22) показал 98 % сходства с Adhaeribacter aquaticus.

Сравнение всех взятых в анализ образцов на примере клоновых библиотек типа V3-V5. Так как изучение дополнительных образцов (снега с пылью Сахары, осажденной на ледник в июне 2008 г.; пыли Сахары, осажденной в Гренобле в мае 2008 г.; песчаной пустынной почвы Сахары), а также РНК-библиотеки для образца снега, не содержащего пыль Сахары, проводили на примере библиотек V3-V5, для корректного сравнения с образцами снега, изученными ранее, взяты лишь библиотеки аналогичного типа (рис. 5).

Рис. 5. Филогенетическое дерево 123 филотипов (без учета филотипа М87-29 - мтДНК), выявленных путем амплификации УЗ-У5-области гена 168 рРНК (метод МР для 494 н. п., из которых 303 н. п. филогенетически информативны). Красными и черными кругами обозначены "общие" и неидентифицированные филотипы соответственно

Как было показано ранее, по объединенным данным библиотек двух типов микробный состав различался для образцов снега с пылью Сахары безотносительно минерального типа "смектит" или "иллит" (рис. 6). Однако если образцы снежного покрова с пылью Сахары типа "смектит" (80т06/2006 и 80ш05/2009) различались полностью, то для образцов с пылью Сахары типа "иллит" (8Бт05/2008 и 80т06/2008), отобранных с интервалом в 1 месяц, было выявлено сходство, которое проявлялось в

доминировании филотипов АсИпоЬас1ег1а, присутствии общих родов ЯиЬеШткгоЫит, СеойегтаЮрЫЫь и общего минорного филотипа, родственного (96,4 %) БрЫ^отопаь ка1з1е№15.

Отметим также подобие трех образцов снега с пылью Сахары от 2008-2009 гг. в плане доминирования филотипов раздела АсИпоЬас1ег1а. В снежном покрове с пылью Сахары, собранной в мае 2008 г. и мае 2009 г. был найден общий филотип, родственный (99 %) В1аз1ососсш эахоЬз1с1ет, а в снежном покрове с пылью Сахары, собранной в июне 2008 г. и мае 2009 г., - филотип, родственный (98 %) ЯиЬеШткгоЫит теворЫЫт. Как было отмечено ранее, в снеге, не содержащем пыль Сахары, также доминировали представители АсШоЬас1ег1а, но видовой состав отличался от снега с пылью Сахары.

МВ-ЭО МВ-Э02 ЭР

МВ5 МЭБ МЭ7 МБ?г

■ другие

Ш Неклассифицированные

□ Оешососсиь-ТИегтиэ

Ш ВлсЛсго|с1а1ег.

И СуапоЬас1еЕча

□ А1рИарго1еоЬас4епа

□ АсТ| поЬ л с^сг ¡а

рДНК рРНК 0т08/2009

сиокти-.п

Рис. 6. Соотношение доминантных бактериальных филотипов, выявленных путем создания библиотек У3-У5 для образцов снега, содержащих (БОш) и не содержащих пыль Сахары (От), образцов пыли, выпавшей в Гренобле (ЗБ), и почвы Сахары (вЭ). Другие - минорные бактериальные филотипы

Образцы пыли Сахары от события переноса в мае 2008 г., собранные на высоте ~ 200 м (Гренобль, 8005/2008) и 4250 м (Монблан, 80ш05/2008) над у. м., значительно различались по видовому составу, указывая как на возможную ассоциацию определенных видов микроорганизмов с частицами пыли разного размера, так и на вклад условий переноса пыли: осаждение одних и захват других видов микроорганизмов. Сходство образцов проявилось лишь в содержании двух минорных не идентичных друг другу филотипов рода ЫомоьрЫп^оЫит.

Микробный состав песчаной почвы Сахары (8803/2008) отличался как от образцов снега, содержащих пыль Сахары, так и образца пыли, собранной в Гренобле. Один общий филотип (98 % сходства с ЯиЬеШткгоЫит тезорИПит) был найден между почвенным образцом и снегом с пылью Сахары (события переноса июня 2008 г. и мая 2009 г.). Рода Оеос1егтМорЫ1ш, В1ав№сосси$ и Мос1е$1оЪас1ег, обнаруженные ранее в снеге с пылью Сахары, были также встречены в почвенном образце и пыли Сахары, осажденной в Гренобле.

Вариабельность состава микроорганизмов, переносимых с пылью из Сахары, по-видимому, является в большей степени следствием особенностей переноса пыли ветром, а не следствием происхождения пыли из конкретного источника. На это

указывают и различия в размере частиц пыли из разных образцов'". Время нахождения пыли в снежном покрове, хотя и незначительное по длительности, также могло повлиять на распределение отдельных групп бактерий в общем микробном пуле, при условии, что некоторые бактерии способны к размножению в снеге. Таким образом, по-видимому, каждое новое событие переноса пыли на ледник будет отличаться по видовому составу переносимых микроорганизмов. Для подтверждения выводов, сделанных на основе анализа дополнительных образцов снега, необходимо проведение более детального исследования с увеличением числа проб и выборок клоновых библиотек.

Сравнительный анализ бактериального разнообразия снега путем клонирования рДНК и рРНК. По данным анализа рРНК-библиотеки (MS7r) в снежном покрове, не содержащем пыль Сахары (Dm08/2009), доминировал филотип родственный (97 % сходства) цианобактерии Stigonema ocellatum. Из 8 выявленных филотипов 2 филотипа показали сходство (99-100 %) с хлоропластной рДНК Bryum argenteum (MS7r-10) и Thelypteris navarrensis (MS7r-38).

Таким образом, несмотря на то, что бактериальное разнообразие снежного покрова, не содержащего пыль Сахары, было изучено практически идентичным способом (ПЦР, праймеры и т. д.), таксономический состав филотипов между рДНК- и рРНК-библиотеками оказался отличен, за исключением группы хлоропластной рДНК из Viridiplantae (общий филотип - Thelypteris navarrensis). Находка доминантного филотипа, родственного цианобактерии Stigonema ocellatum в рРНК-библиотеке, может свидетельствовать в пользу размножения этой бактерии в снеге при отрицательной температуре.

Выявление филотипов - потенциальных колонизаторов снежного покрова ледника Монблан по результатам изучения образцов снега. В ходе недавних исследований обнаружено, что бактерии, переносимые с пылью Сахары, участвуют в формировании микрофлоры олиготрофных высокогорных озер (Hervas & Casamayor, 2009; Reche et al., 2009). С целью выявления микроорганизмов, способных к размножению в снежном покрове ледника Монблан, все филотипы (без учета НА-филотипов), обнаруженные в библиотеках двух типов 4 образцов снега, содержащего и не содержащего пыль Сахары, и библиотеке V3-V5 - дополнительного образца снега с пылью Сахары, исследовали путем анализа описания близкородственных последовательностей (> 98 % сходства) в GenBank.

В результате было идентифицировано 14 филотипов, конспецифичные последовательности которых были обнаружены ранее в различных холодных местообитаниях, в том числе в снеге полярных и высокогорных ледников, что говорит о космополитизме этих бактерий (рис. 7). Большая часть "холодолюбивых" филотипов принадлежала Cyanobacteria, за которыми следовали Proteobacteria, Actinobacteria и Firmicutes. Согласно анализу близкородственных штаммов к психрофильным/психротолерантным бактериям принадлежали филотипы родов Massilia, Phormidium, Tumebacillus и Clostridium. По характеру метаболизма ближайших штаммов можно предположить участие бактерий снежного покрова Монблан в циклах углерода и серы. Из обнаруженных кандидатов на размножение в снеге цианобактерии родов Stigonema, Anabaena, Phormidium и Chamaesiphon, по-видимому, могут обеспечивать первичной продукцией популяции хемоорганотрофных микроорганизмов.

(|) J. R. Petit (ЛГТОС, Франция) - (Chuvochina et al., 2011).

16

Статус "активной жизнедеятельности" представляется наиболее вероятным для цианобактерии Stigonema ocellalum, обнаруженной в рРНК-библиотеке.

Anabaena augstumalls SCMIDKE JAHNKE/4a (AJ630458) Stigonema ocellatum SAG48.90 (AJ544082) О +5 clone MS7r-17

Petalonema sp ANT.GENTNER2.8 (AY493624) (Lake, Antarctic) Anabaena cylindrica XP6B (AJ63M14)

• clone 5fr-'19*

O +3 clone MS5-20 Identical FJ490285.FJ490320 (Soil, Antarctic) Uncult bacterium AK4AB1 05A (GQ39ES95Udeglactated soil)

• clone 5f-17

_ft- Uncult Ant bacterium LB3-47 (AF07S163)(Lake, Antarctic)

92b- Uncult bacterium EplUMB29 (FJ849281) 76*- Chamaeslphon subg[lobosus PCC7430 (A Y1704721 _p^homldium^rijtleyi ANT.GENTNER2.4 (AY493580XUke, Antarctic)

Uncult Ant bacterium I

7V- Uncult Ant bacterium LB3-53 (AF076159)(Lake, Antarctic) r Massilia brevltalea byr23-80]EF546777) ■^-r ^assllia s^Asd M1A2 (FM955855)(Sedlments, Arctic)

ss' Uncult bacterium BF0001B010 (AM696984) J»r O Clone 2SD-34 identical Identical AF445680

L Devosia liml R-21940 (AJ786801] identical AY315165 (Subglaclal sediments) r Sphlngomonas dokdonensls KSC tot3a (DQ870682) ir O clone 2SD-2

"I Uncult bacterium G2-12 (EU152998XSnow, Tibet) Sphlngomonas echinoiaes GP50 (DQ118270) ■O +2 cli----------

{l._

i- Tumebaciilus permanentifrigoris Eurl 9.5 (DQ444975)(permafrost, Canada) -O clone 2SD-17 Identical EU931102,E0931049 (Soil, Antarctic)

Srossielia crvophlla NRRL B-16238INR 024954) i+2 clone MS5-34 identical EF016798 " Uncult bacterium zd1-46 (EU527133) (Snow, Tibet) _O clone MS5s-2

1H1 Pseudoclavibacter heivolus H187 (EF204391) Identical EU375384 (lake, Tibet)

.. one MB-SD2-1 ncult alphaproteobacterium 20C11(DQ3S6009VSoil, Antarctic)

' clone MS7M8 Identical Identical AJ506120, DQ521488 (Lake, Antarctic) (GQ39702S) (deglaciated soil)

Рис. 7. Филогенетическое дерево "холодолюбивых" филотипов, построенное на основании нуклеотидных последовательностей полноразмерного гена 16S рРНК и его УЗ-У5-области (черные и прозрачные круги соответственно) (метод MP для 485 н. п., из которых 191 и. п. филогенетически информативен), а также клонов/штаммов из холодных местообитаний

ВЫВОДЫ

1. Методом молекулярно-филогенетического анализа путем секвенирования генов 16S рРНК описано бактериальное разнообразие снежного покрова высокогорного ледника Монблан, содержащего пыль Сахары, на примере 4 событий переноса пыли (2006, 2008 и 2009 гг.). Впервые показано, что видовой состав и доминантные группы микроорганизмов существенно различаются между образцами снега. Причиной этого может являться не столько источник происхождения пыли, сколько условия ее переноса ветром из Северной Африки. Из 90 выявленных филотипов преобладали представители филогенетических разделов Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes, Deinococcus-Thermus, Bacteroidetes, Cyanobacteria.

2. Среди доминантных и минорных принадлежности выявлены кандидаты высокогорных ледников. "Холодолюбивые" Сахары включали рода Crossiella, Pseudoclavibacter, Modestobacter, Devosia, Sphingomonas, Massilia, Clostridium, Tumebaciilus, Phormidium, Chamaesiphon и Anabaena. В снежном покрове, не содержащем пыль Сахары, к "холодолюбивым" были отнесены представители родов Clostridium и Stigonema. Наиболее вероятными микроорганизмами, способными к размножению в снеге, следует считать представителей родов Massilia, Tumebaciilus, Phormidium и Stigonema.

филотипов различной таксономической на колонизацию снежного покрова филотипы в образцах снега с пылью

3. Анализом 16S рРНК была обнаружена цианобактерия рода Stigonema, для которой предполагается метаболическая активность при отрицательной температуре.

4. Установлено, что 10 % от всех выявленных филотипов были родственны представителям нормальной микрофлоры человека и 11 % оказались новыми таксонами, показав отдаленное сходство (< 90 %) с известными таксонами.

5. Применение двух праймерных систем, амплифицирующих в ПЦР полноразмерный ген 16S рРНК и его V3-V5 область, позволяет полнее охарактеризовать микробное разнообразие за счет различий в структуре и вырожденности праймеров.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Чувочина М. С., Алехина И. А., Норманн Ф., Пети Ж-Р., Булат С. А. Три события транспорта пыли из пустыни Сахара на ледник Монблан ассоциированы с разными бактериальными филотипами - колонизаторами снежного покрова // Микробиология. -2011.-Т. 80,№ 1.-С. 129-135.

2. Chuvochina M. S., Marie D„ Chevaillier S., Petit J. R., Normand P., Alekhina I. A., Bulat S. A. Community Variability of Bacteria in Alpine Snow (Mont Blanc) Containing Saharan Dust Deposition and Their Snow Colonisation Potential // Microbes Environ. - 2011. - Vol. 26, № 3. -P. 237-247.

Публикации в других изданиях

3. Чувочина M. С., Алехина И. А., Норманн Ф., Пети Ж-Р., Булат С. А. Структура микробных сообществ снежного покрова ледника Монблан (французские Альпы), содержащего слои пыли пустыни Сахары, и его бактериальная колонизация И VI Молодежная школа-конференция с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии". Москва, 25-27 октября 2010. - С. 123-125.

4. Chuvochina M., Alekhina I., Normand P., Petit J. R., Bulat S. Bacterial Fingerprint of Four African Dust Depositions in Alpine Snow Pack, Mont Blanc Glacier // International Glaciological Symposium. Kazan, Russia. 31 May - 4 June 2010. - P. 182.

5. Chuvochina M„ Alekhina I., Normand P., Petit J. R., Bulat S. Microbiological Fingerprint of African Dust Deposition in Alpine Snow Pack, Mont Blanc Summit // EGU 2010, Vienna, Austria. 2-7 May 2010. Geophys. Res. Abst., Vol. 12, EGU2010-13388.

6. Чувочина M. С., Алехина И. А., Норманн Ф., Пети Ж-Р., Булат С. А. Бактериальные филотипы, принесенные с пылью из пустыни Сахара на ледник Монблан, как потенциальные колонизаторы снежного покрова // "Биология - наука 21-го века". Сб. тезисов 14-й Пущинской школы-конференции молодых ученых. Пущино, 19-23 апреля 2010.-С. 273-274.

7. Чувочина М. С., Алехина И. А., Норманн Ф., Пети Ж-Р., Булат С. А. Микробные сообщества снежного покрова ледника Монблан, ассоциированные со слоями пыли пустыни Сахара // "Биология - наука 21-го века". Сб. тезисов 13-й Пущинской школы-конференции молодых ученых. Пущино, 28 сентября - 2 октября 2009. - С. 215-216.

8. Chuvochina M. S., Alekhina I. A., Normand P., Petit J. R., Bulat S. A. Microbial Communities Established on Mont Blanc Summit with Saharan Dust Deposition // EGU 2009, Vienna, Austria. 19-24 April 2009. Geophys. Res. Abst., Vol. 11, EGU2009-903-2.

9. Chuvochina M., Alekhina I., Normand P., Petit J. R., Bulat S. Microbial Diversity in Mont Blanc Snow Layers with Saharan Dust Deposition U Interactions Between the Physico-Chemical Processes and Microbiological Processes in the Environment, Aubière, France. 22-24 October 2008.-P. 55.

Отпечатано в типографии ПИЯФ РАН

188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 213, тир. 100, уч.-изд. л. 1; 02.09.2011 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чувочина, Мария Сергеевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОПРЕДЕЛЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Микроорганизмы в криобиосфере - факты и гипотезы.

1.2 Снежный покров: одна из экстремальных ниш микробной жизни.

1.3 Микробное разнообразие снежного покрова ледников.

1.3.1 Физико-химические факторы, контролирующие микробную жизнь в снежном покрове ледников.

1.3.2 Микробное разнообразие снежного покрова полярных ледников.'.

1.3.3 Микробное разнообразие снежного покрова горных ледников.

1.4 Роль почвенной пыли Сахары в глобальном распространении микроорганизмов.

1.4.1 Пыльные бури: мониторинг и идентификация зарождения.

1.4.2 Метод обратных траекторий.

1.4.3 Минералогический состав почвенной пыли.

1.4.4 Распределение частиц пыли по размерам.

1.4.5 Роль пыли в экосистеме.

1.4.6 Видовой состав микроорганизмов, переносимых пылью Сахары.

1.4.7 Видовой состав микроорганизмов, переносимых пылью из других аридных регионов Земли.

1.4.8 Микробная колонизация.

1.4.9 Негативные последствия переноса пыли для здоровья человека и экосистемы.

1.5 Микробное разнообразие почвенного покрова пустыни Сахара.

1.6 Статистические методы анализа в оценке биоразнообразия микробных сообществ.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Отбор проб.

2.2 Объекты исследований.

2.3 Подготовка проб.

2.4 Молекулярно-филогенетические методы анализа.

2.4.1 Экстракция геномной ДНК.

2.4.2 Экстракция геномной РНК.

2.4.3 Амплификация генов 168 рРНК.

2.4.3.1 ПЦР с использованием универсальных праймеров (область У3-У5).

2.4.3.2 ПЦР с использованием универсальных праймеров (полноразмерный ген).

2.4.3.3 ОТ-ПЦР с использованием универсальных праймеров (область УЗ-У5).

2.4.3.4 ПЦР с использованием вектор-специфичных праймеров для определения интеграции клонированных ПЦР-фрагментов в вектор.

2.4.4 Молекулярное клонирование.

2.4.5 Приготовление грубых клеточных лизатов из отдельных клонов.

2.4.6 Рестрикционный анализ ПЦР-фрагментов.

2.4.7 Секвенирование ПЦР-фрагментов.

2.5 Биоинформационный анализ данных.

2.5.1 Анализ нуклеотидных последовательностей.

2.5.2 Статистический анализ данных.58'

2.5.2.1 Статистическая оценка достаточности размера библиотеки клонов.

2.5.2.2 Расчет индексов разнообразия.

2.5.2.3 ЫВЗНОТР анализ: сравнение клоновых библиотек.

2.6 Идентификация источников зарождения пыльных бурь в Сахаре.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Происхождение почвенной пыли.

3.2 Молекулярно-филогенетический анализ микробного разнообразия.

3.2.1 Изучение микробного разнообразия снега с пылью и без пыли Сахары путем анализа двух типов клоновых библиотек (УЗ-У5 и полноразмерной).

3.2.1.1 Анализ микробного разнообразия образца снежного покрова с пылью Сахары от июня 2006 г.

3.2.1.2 Анализ микробного разнообразия образца снежного покрова с пылью Сахары от мая

2008 г.

3.2.1.3 Анализ микробного разнообразия образца снежного покрова с пылью Сахары от мая

2009 г.

3.2.1.4 Анализ микробного разнообразия образца снежного покрова, не содержащего пыль Сахары.

3.2.2 Изучение дополнительных образцов путем анализа УЗ-У5 клоновых библиотек.

3.2.2.1 Анализ микробного разнообразия образца снежного покрова с пылью Сахары от июня 2008 г.

3.2.2.2 Анализ микробного разнообразия образца снежного покрова, не содержащего пыль Сахары.

3.2.2.3 Анализ микробного разнообразия образца пыли Сахары, собранной в Гренобле.

3.2.2.4 Анализ микробного разнообразия образца песчаной почвы пустыни Сахара.

3.3 Сравнительный анализ микробного разнообразия исследуемых образцов.

3.3.1 Сравнение образцов снега с пылью и без пыли Сахары по объединенным данным двух типов клоновых библиотек.

3.3.2 Сравнение всех взятых в анализ образцов на примере У3-У5 клоновых библиотек.

3.3.3 Сравнительный анализ бактериального разнообразия снега путем клонирования рДНК и рРНК.

3.4 Выявление филотипов - потенциальных колонизаторов снежного покрова ледника

Монблан по результатам изучения образцов снега.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Бактериальное разнообразие снежного покрова ледника Монблан, содержащего почвенную пыль пустыни Сахара, и роль отдельных филотипов в его колонизации"

Актуальность проблемы

В настоящее время в результате молекулярно-экологических исследований микробных сообществ представления о границах жизни продолжают расширяться [Нетрусов и др., 2004]. Ранее считавшийся практически стерильным снежный покров высокогорных и полярных ледников (в основном на окраинах) оказался пригодным для жизни целого ряда микроорганизмов [Sattler et al., 2008]. Развитие сообществ водорослей и бактерий в снежном покрове может приводить к существенному снижению альбедо поверхности ледников, [например, Thomas & Duval, 1995; Takeuchi et al., 2001]. Общая численность микроорганизмов снежного покрова высокогорья варьирует от 0,02 х 103кл/мл [Zhang et al., 2010а] до 4 х 105 кл/мл [Alfreider et al., 1996; Sattler et al., 2001; Segawa et al., 2005]. Однако изучению микробного разнообразия поверхностного снега высокогорных ледников посвящены единичные работы [Segawa et al., 2005; Liu et al., 2009a; Gonzalez-Toril et al., 2009; Zhang et al., 20106]. В них показана* корреляция, как численности, так и разнообразия прокариот с концентрацией пыли, осажденной на ледник.

Известно, что крупнейшим источником почвенной пыли в атхмосфере является пустыня Сахара [Moulin et al., 1997]. Поднятие больших масс пыли способствует переносу микробиоты на значительные расстояния, приводя также к распространению микроорганизмов, патогенных по отношению к растениям, животным и человеку [Kellogg & Griffin, 2006]. Показано, что доля условно-патогенных для человека микроорганизмов в пыли может составлять от 10 до 27% [Griffin et al., 2001; Kellogg et al., 2004]. Массовая гибель кораллов в Карибском море по причине аспергиллёза связана с присутствием возбудителя Aspergillus sydowii в пыли, переносимой из Северной Африки [Weir-Brush et al., 2004]. Кроме того, с пылью переноситься пыльца растений, эндотоксины, микотоксины и токсичные металлы. Воздействие пыли Сахары на различные экосистемы может распространяется вплоть до Северной Европы [Franzen et al., 1994], Амазонии [Swap et al., 1992] и Карибского моря [Griffin et al., 2001,2003].

Органические компоненты пыли, а также железо и фосфор, могут служить источниками питательных веществ и энергии для микробных, в том числе гетеротрофных, сообществ [Herut et al., 2005; Pulido-Villena et al., 2008а]. Тридцатилетние аналитические исследования ледникового керна Монблана (Французские Альпы) показали, что повышенное содержание кальция во льду связано с регулярным переносом почвенной пыли из Северной Африки [De Angelis & Gaudichet, 1991]. Некоторые виды бактерий, перенесенные с пылью Сахары, способны развиваться в условиях холодных олиготрофных альпийских озер и принимать участие в формировании популяции бактерионейстона [Reche et al., 2009; Hervas & Casamayor, 2009]. Осаждение пыли на горные ледники может вносить вклад в формирование микрофлоры снежного покрова за счет ее перенесения с пылью. Снежный покров высокогорных ледников, как и пустыня Сахара, являются экстремальными для жизни эконишами, микробное разнообразие которых представляет интерес, как с точки зрения фундаментальных проблем адаптации (эволюции) микрофлоры к холодным и горячим условиям существования, так и для практического применения. Поэтому, в связи с важностью роли пыли в экосистеме альпийских высокогорных ледников, формирование микрофлоры снежного покрова высокогорных ледников под влиянием пыли пустыни Сахары, остается малоизученным и представляется весьма актуальным.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было, с помощью методов> молекулярно-филогенетического анализа (ПЦР, риботипирование и секвенирование бактериальных генов 16S рРНК), провести изучение микробного разнообразия снежного покрова ледника Монблан, содержащего почвенную пыль пустыни Сахара, на примере четырех событий переноса пыли на ледник.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучение бактериального разнообразия в образцах снежного покрова ледника Монблан, содержащих почвенную пыль Сахары разного времени переноса и нахождения в снежном покрове (4 события переноса пыли).

2. Изучение бактериального разнообразия в снежном покрове ледника Монблан, не содержащем пыль Сахары (дополнительно методами выделения и изучения рРНК) (контроль на почвенную пыль Сахары).

3. Сравнительное изучение бактериального разнообразия в образцах почвенной'пыли Сахары после осаждения ее на разных высотах (снег высокогорного ледника и осаждение пыли в городе; одно и то же событие переноса пыли) (контроль на почвенную пыль Сахары, занесенную на ледник).

4. Изучение бактериального разнообразия в образце песчаной пустынной почвы Сахары, отобранной в одном из возможных регионов-источников пыли (контроль на перенос почвенной пыли Сахары из пустыни на ледник в Альпах).

5. Сравнение бактериального разнообразия образцов: снежного покрова ледника, содержащего и не содержащего почвенную пыль Сахары; пыли Сахары, собранной в Гренобле; песчаной почвы Сахары.

6. Оценка: вклада микрофлоры, перенесенной с пылью пустыни* Сахара, в формирование микрофлоры снежного покрова в условиях ледника Монблан.

7. Оценка эффективности праймерных систем, амплифицирующих в ПЦР' разные области генаЛ68 рРНК (УЗ-У5 и полноразмерный ген), в изученитмикробного разнообразия.

Научная новизна

Впервые методом секвенирования бактериальных: генов: 168' рРНК (полноразмерного гена и его УЗ-У5 области) показано различие состава микроорганизмов (как на уровне видов, так и разделов) снежного покрова ледника Монблан, содержащего пыль Сахары; от событий переноса в. 2006, 2008; (2 события) и 2009 гг. как между событиями, так и в сравнении; со снегом, не содержащем пыль Сахары.

Впервые на основании сходства по нуклеотидной последовательности генов > 16Б рРНК выявленных в работе филотипов с известными: бактериями идентифицированы "холодолюбивые" бактерии — кандидаты, в. формирование; микрофлоры снежного покрова горных ледников:

Впервые путем анализа суммарной; 168 рРНК, выделенной из снежного покрова ледника Монблан, не. содержащего пыль Сахары, получены косвенные свидетельства метаболической активности при отрицательной температуре цианобактерии рода Б^опста.

Полученные в работе последовательности генов 168 рРНК депонированы в международную базу данных ЖВР под номерами НМ104591-НМ104622, Н(3396527-Н(3396619, Н(2402563-Н(3402566, ^832298-^832350;

Практическая значимость

Результаты настоящего исследования! вносят вклад в. представление о формировании микробных сообществ в снежном покрове высокогорных ледников в присутствии пыли Сахары. Привносит ли каждое событие переноса пыли одни, и те же (повторяющиеся) филотипы или всякий раз. новую микрофлору? Иными словами, существует ли единое ядро из общих филотипов в снежном покрове, содержащем пыль пустыни Сахара?

Кроме того, результаты сравнительного анализа микробного разнообразия снежного покрова при наличии или отсутствии пыли Сахары, важны для понимания того, насколько именно пыль Сахары влияет на формирование микробных сообществ, снежного покрова ледников.

В фундаментальном плане изучение микробного разнообразия снежного покрова высокогорных ледников позволяет очертить лимитирующие жизнь границы и факторы, среди которых — доступность воды при, отрицательной температуре. С практической точки зрения данное исследование позволяет выявить новые холодолюбивые экстремофилы, представляющих интерес для биотехнологии. Обнаруженные неидентифицированные микроорганизмы представляют новые неизвестные виды прокариот ("microbiota incognita"), расширяя наши представления о микробном разнообразии. Наконец, результаты данной работы закладывают основу для последующих сравнительных исследований микроорганизмов снежного покрова ледников высокогорья, а также почвы пустыни Сахара.

Апробация работы

Основные материалы работы были представлены на международных и российских конференциях и симпозиумах: 13-ой и 14-ой Пущинских конференциях молодых ученых "Биология-наука 21-го века" (Пущино, 2009, 2010); SCAR/IASC IPY Open Science Conference "Polar Research - Arctic and Antarctic Perspectives in the International Polar Уеаг"(Санкт-Петербург, 2008); Interdisciplinary Congress "Interactions between the physico-chemical processes and microbiological processes in the environment" (Aubiere, France, 2008); ежегодной конференции, молодых ученых ОМРБ ПИЯФ им. Б.П.Константинова РАН (Гатчина, 2009);

European Geosciences Union General Assembly (Vienna, Austria, 2009, 2010); Российскофранцузском семинаре по проблемам изучения ледяных кернов, палеоклимата и подледникового озера Восток (Антарктида) (Grenoble, Brest, Lyon, France; Санкт-Петербург, 2008, 2009, 2010); Гляциологическом симпозиуме "Лёд и снег в климатической системе" I

1 (Казань, 2010); VI Молодежной школе-конференции с международным участием

Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2010).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 7 тезисов. I

Место проведения работы и сотрудничество

Молекулярно-биологическая часть работы выполнена в лаборатории генетики эукариот i Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, Гатчина (зав., д.б.н.

В.Г. Королев), а также в лаборатории адаптации и патогенеза микроорганизмов (зав. M.F.

Cesbron Delauw, Университет Дж. Фурье, Франция) под руководством к.б.н. С.А. Булата.

Процедуры подготовки пробоотбора и последующей обработки образцов снега (плавление, концентрирование и пр.) проводили в сертифицированных по чистоте помещениях (класса

10000 с ламинаром класса 100) Лаборатории гляциологии и геофизики окружающей среды

Университет Дж. Фурье, Франция).

Образцы поверхностного снега собраны согласно предоставленным инструкциям со всеми предосторожностями против возможной контаминации сотрудниками ЛГГОС: М. Debret, Е. Le Meur, В. Jourdain, D. Six и С. Vincent. Образец песчаной пустынной почвы Сахары предоставлен сотрудником университета Лион 1, Отдела экологии микроорганизмов (ОЭМ, Франция) P. Normand. Образец пыли пустыни Сахара, осажденной в г. Гренобль, собран и предоставлен С.А. Булатом и J.R. Petit (ЛГГОС, Франция).

Бактериальные клеточные концентрации определены методом проточной цитофлуориметрии D. Marie на биологической станции в Роскоффе, БСР, (Франция) как описано ранее [Alekhina et al., 2007].

Культивирование микроорганизмов из образцов почвенной пыли Сахары, извлеченной из снежного покрова, выполнено P. Fournier (ОЭМ, Франция).

Определение минералогического состава образцов почвенной пыли и песчанной почвы пустыни проведено методом рентгеновской флуоресценции сотрудниками лаборатории атмосферных систем (ЛАС, Франция) P. Formenti и S. Chevaillier. Подсчет частиц пыли и определение их объемного распределения по размерам в исследуемых образцах проведено методом регистрации электрических импульсов на счетчике Coulter J.R. Petit (ЛГГОС, Франция). Моделирование процесса переноса пыли Сахары воздушными массами с помощью метода обратных траекторий выполнено автором при содействии H. Galee и S. Preunkert (ЛГГОС, Франция).

Работа выполнена при финансовой поддержке проекта ANR-07-Blan-0223-Lac Vostok.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ