Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов

Николаев, Юрий Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов"

о г.

у! На правах рукописи

Николаев Юрий Александрович

АУТОРЕГУЛЯЦИЯ СТРЕССОВОГО ОТВЕТА МИКРООРГАНИЗМОВ

Специальность 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

1 0 Мдр 2011

МОСКВА-2011

4840262

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РЛН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Г.И. Эль-Регистан

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Р.Н. Ивановский Доктор биологических наук, профессор Д.Н. Островский Доктор биологических наук А.Г. Меденцев

Ведущая организация - Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук

Защита диссертации состоится «28» марта 2011 в 14 ч на заседании Диссертационного совета Д002.224.01 при Учреждении Российской академии наук Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, Москва, просп. 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Автореферат разослан февраля 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

Д002.224.01 к.б.н.

Т.В. Хижняк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Проблема адаптации организмов к изменяющимся условиям окружения является одной из центральных в биологии. Наибольшей приспособляемостью к флуктуациям окружающей среды обладают микроорганизмы, исследованиям механизмов адаптации которых посвящено множество оригинальных работ и обзорных материалов [Хочачка, Сомеро, 1988; Henge-Aronis, 1993; Фео-филова, 2003]. Основное внимание уделяется внутриклеточным событиям формирования стрессового ответа: экспрессии генов стрессовых регулонов (rpoS, oxyR, SOS-ответа, и др.) [Matin 1992; Hengge-Aronis and Loewen, 1994; Бут, 2005], биосинтезу ферментов, пигментов и метаболитов антиоксидантной защиты клетки [Davies, 1987; Меденцев с соавт., 2005; Октябрьский, Смирнова, 2007], механизмам репарации и стабилизации ДНК [Martinez, Kolter, 1997; Farewell et al., 1998; Головлёв, 1999], изменению в составе дыхательной цепи [Акименко, 1995; Меденцев с соавт., 1999; Jean et al., 2004; Бирюкова с соавт., 2008, 2009] переключению метаболических потоков на синтез стрессовых липидов, углеводов и белков, прежде всего «молекулярных шаперонов», контролирующих фолдинг и стабилизирующих макромолекулы белков [Меденцев с соавт., 2001; Causton et al., 2001; Феофилова, 1992, 2003; Головлев, 2003; Мельников, Ротанова, 2010].

С другой стороны, в последнее время получило признание представление о популяции микроорганизмов как о своеобразной многоклеточной системе, сущностным свойством которой является взаимодействие отдельных клеток, когда их согласованная деятельность направлена на достижение общего результата [Shapiro, Dworkin, 1997; Олескин с соавт., 2000; Волошин, Капрельянц, 2004]. Описан целый ряд примеров популяционного поведения, контролируемого низкомолекулярными внеклеточными микробными метаболшами-ауторегуляторами (АР) [Aaronson, 1981]. Под внеклеточными ауторегуляторами понимают метаболиты, которые образуются всеми или частью клеток популяции, выделяются в окружающую среду и воздействуют на клетки популяции, вызывая их качественные изменения [Stephens, 1986; Хохлов, 1988]. Ауторегуляторы контролируют важные жизненные явления у микроорганизмов: биолюминесценцию у светящихся бактерий [Fuqua et al., 1994; Visick, McFall-Ngai, 2000]; морфогенез и продукцию антибиотиков у стрептомицетов [Хохлов, 1988]; синтез факторов вирулентности патогенными бактериями [Whiteley et al., 1999; Бухарин с соавт. 2005]; роение (swarming) бактерий [Shapiro, Dworkin, 1997]; автолиз, образование и прорастание покоящихся форм [Хохлов, 1988; Wirth et al., 1996; Dworkin, 1996; Sudo et al., 1997; Kaprelyants et al., 1999; Эль-Регистан с соавт., 1983; 1998; 2005]. Достижения в этой области биологии бактерий, сформировавшейся в самостоятельное направление - химическую экологию, отражены в ряде обзоров и монографий [Aaronson, 1981; Хохлов, 1988; Shapiro, Dworkin, 1997; Барбье, 1987; Shapiro et al., 1997, 1998; Kaprelyantz et. al., 1999, 2005; Бухарин с соавт., 2005].

В исследовании АР выделяют три этапа: первый - их обнаружение в биотестах, специально разрабатываемых для каждого случая [Aaronson, 1981]. На этом этапе, как правило, используют культуральные жидкости, вытяжки из клеток и подобные субстанции. Разработка нового биотеста может приводить к обнаруже-

нию новых АР. На втором этапе производят выделение и идентификацию химических соединений, ответственных за биологические эффекты АР. На последнем этапе исследуют механизмы действия идентифицированных ауторегуляторов.

Среди многочисленных ауторегуляторов недостаточно исследованы те, которые имеют функции адаптогенов - веществ, контролирующих компенсаторно-приспособительные реакции микроорганизмов к стрессовым воздействиям и развитие культур в неоптимальных условиях роста.

К началу диссертационной работы (начало 1990х годов) лишь некоторые коллективы выполняли исследования, посвященные участию внеклеточных адаптогенов (ВА) в приспособлении бактерий к неблагоприятным условиям. Исследования ВА, как правило, не носили систематического характера. Вместе с тем адаптивный потенциал микроорганизмов, занимающих все возможные экологические ниши, предполагает наличие ауторегуляторного контроля систем адаптации к изменениям окружающих условий. Известны следующие внеклеточные ауторегуляторы, участвующие в развитии адаптивных реакций микроорганизмов: гомосеринлакто-ны и производные тетрагидрофурана некоторых морских вибрионов, способству-щие их адаптации к голоданию и ряду стрессоров [Srinivasan et al., 1998; McDougald et al., 2003; Mostertz et al., 2004; Krin et al., 2006]; протекторы белковой природы у Escherihia coli [Rowbury, Goodson, 2001]; осмопротекторы, содержащиеся в лизатах клеток галобактерий [Кокоева, Плакунов, 1993]; антимутагены молочнокислых бактерий белковой и небелковой природы [Воробьёва с соавт., 1993, 2005]; внеклеточные адаптогены тиобацилл, представленные аминокислотами [Пивоварова с соавт., 1991]. Однако, наличие приведённых примеров не давало целостной картины значимости участия внеклеточных адаптогенов в жизни микроорганизмов, их роль в стрессоадаптации оставалась малоисследованной. Отмеченная малоисследованность внеклеточных адаптогенов в совокупности с их определённым функциональным многообразием и наличием у микроорганизмов различных таксономических групп, а также высоким потенциалом практического применения обусловили актуальность изучения микробных внеклеточных адаптогенов - их обнаружение с применением биотестов (защитных эффектов при сублетальных и летальных воздействиях и развитии культур в неоптимальных условиях), определение химической природы, исследование механизмов действия.

Исследуя физиологию псевдомонад, автор обнаружил, что у них существенно выражена обратимая адгезия - первая фаза формирования биоплёнок, занимающих важное место в жизнедеятельности бактерий [Marshall, 1996; O'Toole et al., 2000], а также важных для биотехнологии и медицины [Ильина с соавт., 2004]. Возможность ауторегуляторного контроля обратимой адгезии бактерий и важность этого феномена для практической деятельности обусловили интерес к исследованию ау-торегуляции обратимой адгезии бактерий в рамках настоящей работы.

роста к переживанию. В этой связи интересна ситуация с исследованием авторегуляторов образования покоящихся форм (ПФ), факторов db которые контролируют адаптивные реакции второго типа, связанные со сменой стратегии развития и переходом клеток в покоящееся состояние. Эти соединения представлены у ряда бактерий алкилоксибензолами (АОБ) [Эль-Регистан с соавт., 1980; Бухарин с со-авт., 2005; Мулюкин, 2010]. Механизмы, посредством которых АОБ контролируют развитие анабиотического состояния ПФ заключаются в стабилизации клеточных мембран [Капрельянц с соавт., 1987], ингибировании активности ферментов [Колпаков с соавт., 2000], а также в индукции фенотипической диссоциации популяции, связанной с состоянием покоя [Ильинская с соавт., 2002]. Можно было ожидать участия АОБ в и стрессоадаптации первого типа - без изменения стратегии развития культур, т.е. в адаптации растущих культур к неблагоприятным физико-химическим условиям среды и смене условий развития. Представляло интерес исследовать феноменологию и механизмы стрессопротекторного действия АОБ на разных уровнях - молекулярном, клеточном, популяционном. Интерес к АОБ также обусловлен их широким распространением в мире растений и микроорганизмов [Kozubek, Tyman, 1999]; они могут быть также обнаружены в плазме крови человека в наномолярных концентрациях [Ross et al., 2010].

Исходя из вышеизложенного были сформулированы цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было исследовать закономерности ауторегуляции адаптации микроорганизмов к неблагоприятным и повреждающим воздействиям и изменениям условий роста: (1) феноменологию ауторегуляции адаптивных реакций, (2) химическую природу внеклеточных адаптогенов, (3) механизмы действия внеклеточных адаптогенов.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить с помощью разработанных нами биотестов феноменологию участия внеклеточных адаптогенов в адаптации микроорганизмов про- и эукариот к стрессорным воздействиям различной природы.

2. Выявить функции внеклеточных адаптогенов в обратимой адгезии клеток бактерий как адаптивной реакции на стресс новой среды. Определить химическую природу внеклеточных адаптогенов, контролирующих обратимую адгезию клеток. Выяснить роль обратимой адгезии в стрессоустойчивости микроорганизмов.

3. Изучить роль алкилоксибензолов как внеклеточных адаптогенов микроорганизмов к сублетальным и летальным воздействиям стрессоров различной природы (тепловому, окислительному, осмотическому) в зависимости от структуры и концентрации алкилоксибензолов.

4. Исследовать механизмы действия алкилоксибензолов в: регуляции активности и стабильности ферментных белков, антиоксидантной защите клеток, активации генов стрессовых регулонов, а также контроле фенотипической вариабельности как адаптивном потенциале популяции.

Научная новизна работы.

С применением разработанных биотестов продемонстрирована способность микроорганизмов различных таксономических групп в процессе развития продуцировать специфические внеклеточные метаболиты - адаптогены, способствующие приспособлению микроорганизмов к неблагоприятным воздействиям или изменяющимся условиям существования. ВА контролируют компенсаторно-приспособительные реакции микроорганизмов как при стрессах, запрограммированных в цикле развития микробных культур (голодании, смене среды роста), так и при незапрограммированных стрессорных воздействиях разной природы (термическом, окислительном, осмотическом, токсическом). Ауторегуляция стрессового ответа имеет место при воздействиях разной интенсивности: рост-замедляющих, рост-прекращающих, летальных. Установлено, что ВА, имеющие различные функции, представлены соединениями разных классов - насыщенными углеводородами, липоциклопептидами, алкилоксибензолами, белками.

Впервые описаны феноменологически, выделены и идентифицированы внеклеточные адаптогены нового типа, контролирующие адгезивные свойства клеток в условиях стресса новой среды. Регуляторы адгезии представлены у Р. Аиогевсет н-алканами и протеазами, у В. Искет/огт13 — липоциклопептидом. Показано влияние физико-химических факторов на величину обратимой адгезии клеток. Доказана защитная функция обратимой адгезии клеток при воздействии стрессоров.

Установлена роль алкилоксибензолов как адаптогенов, защищающих клетки бактерий и дрожжей от стрессорных воздействий различной природы (теплового шока, у-облучения, фотоокисления). Выявлена адаптивная функция АОБ в обеспечении активного роста микроорганизмов при значениях температуры и рН, неоптимальных для роста и близких к границам толерантности. Обнаружено, что формирование стрессового ответа сопряжено с повышением биосинтеза АОБ. Показана зависимость адаптогенных эффектов АОБ от их структуры и концентрации. Механизм протекторного действия АОБ включает их функционирование как модификаторов белков, эффективных перехватчиков активных форм кислорода (АФК), включая синглетный кислород, активаторов экспрессии стрессовых оперо-нов (808-ответа и г/>о5-регулона стационарной фазы). Доказана способность АОБ направленно модифицировать структуру ферментных белков, что приводит к изменению их каталитической активности и повышению операционной и функциональной стабильности. Короткоцепочечные АОБ (С7-АОБ) повышают активность ферментов в широком диапазоне концентраций, а длинноцепочечные (С 12-АОБ) -при низких концентрациях повышают активность, а при более высоких - ингиби-руют её. Повышение каталитической активности определяется возрастанием амплитуд равновесных флуктуаций атомов в белковой глобуле. Показана антиокси-дантная активность АОБ, продукты окисления частично идентифицированы; они сохраняют антиоксидантные свойства и способность модифицировать белки, действуя при меньших концентрациях, чем нативные АОБ.

Обнаружено концентрационное влияние длинноцепочечных АОБ на изменение популяционного спектра бактериальных культур как способ реализации их адаптивного потенциала.

Доказанная видонеспецифичность внеклеточных адаптогенов может обеспечивать их адаптогенные функции на уровне сообщества.

Полученные результаты существенно расширяют современные знания о биологии микроорганизмов в области саморегуляции стрессового ответа и приспособлении микробных популяций к новым или неблагоприятным условиям окружения. На их основе сформулировано положение о системе внеклеточных адаптогенов микроорганизмов: «Микроорганизмы обладают системой ауторегуляции адаптации к неблагоприятным факторам среды разной природы и интенсивности. Эта система включает внеклеточные метаболиты - адаптогены, оказывающие действие на генном, молекулярном, клеточном и популяционном уровнях». Предлагается считать внеклеточные адаптогены самостоятельной группой биологически активных веществ, функция которых - контроль адаптации микробной популяции к неблагоприятным факторам окружающей среды или новым условиям роста.

Практическая значимость

1. Полученные в работе результаты могут быть использованы для разработки эффективных способов направленной регуляции роста промышленных штаммов и сообществ микроорганизмов и повышения биосинтеза биологически активных веществ; способов антиоксидантной защиты про- и эукариотных организмов; для совершенствования методов борьбы с микробной контаминацией и биообрастаниями. Регуляторы адгезии могут быть использованы для предупреждения образования биопленок и при создании средств защиты материалов.

2. На основе природных АОБ и их химических производных разработаны способы: (а) стабилизации и направленного изменения активности ферментных белков; (б) ингибирования ферментативной и микробной активности в. бродильных производствах с целью консервации продукта, в частности при производстве пива, кумыса, кваса, молочнокислых продуктов; (в) защиты материалов от биоповреждений. На основе материалов диссертации получены патенты РФ (1Ш № 02329300 от 26.12.2006 и 1Ш № 2400069 от 11.06.09), подготовлены и поданы 4 заявки на патенты РФ (№ 2009109569 от 17.03.09; № 2009134293 от 15.09.09; № 2010108915 от 11.03.10; № 2010108916 от 11.03.10).

3. На основе информации о структуре и механизмах действия АОБ созданы: (1) серия биоцидных препаратов ИНМИОЛ, предназначенных для защиты материалов от биоповреждений и (2) серия препаратов СИДОВИТ для обработки семян и посевов с целью защиты от фитопатогенной микрофлоры, повышения урожайности, всхожести, лёжкости зерна и его технологических свойств. Препараты ИНМИОЛ и СИДОВИТ успешно испытаны в полевых условиях, что подтверждено соответствующими актами.

4. Часть материалов диссертации включена в курс «Промышленная микробиология», читаемый на кафедре микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова, а также вошла в учебное пособие «Основы динамической биохимии» (Плакунов, Николаев, 2010).

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены в виде устных или стендовых сообщений и обсуждались на: Int. Symp. on Bacteriology and Appl. Microbiology, Paris, 2002; Int. Symp. on Subsurface Microbiology, Copenhagen, 2002; Всероссийской научно-технической конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства их реализации», Москва, 2003; Втором Московском Международном Конгрессе «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития», Москва, 2003; 35th COSPAR Scientific assembly, Paris, France, 2004; Второй международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал, Пермь-Казань-Пермь, 2005; 15th IUPAB and 5th EBSA International Biophysics Congress, 2005, Montpellier, France; Всероссийской молодёжной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2005; Пятой Национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования наноматериалов и наносистем (РСНЭ НАНО-2005), Москва, 2005; Конференции «Коммуникация у бактерий», Москва, 2005; Третьей научно-практической конференции "МЕДБИОТЕК", Москва, 2006.; VI национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов, Москва, 2007; Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем», Саратов, 2007; Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты», Москва, 2008.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 60 работ, в том числе 35 экспериментальных статей и 5 обзоров в печатных изданиях, рекомендованных ВАК, 1 учебное пособие (монография), 13 тезисов конференций, 2 патента РФ, 4 заявки на патенты РФ.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, экспериментальная часть (материалы и методы исследования, результаты и обсуждение), практическое значение, заключение, выводы, список литературы, приложения; изложена на 351 стр., содержит 105 рисунков, 42 таблицы. Список литературы включает 642 работ, в том числе 437 на английском языке.

Место выполнения работы и личный вклад соискателя. Основная часть работы выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, в лабораториях классификации и хранения уникальных микроорганизмов (зав. лаб. чл.-корр. РАН В.Ф. Гальченко), нефтяной микробиологии (зав. лаб. д.б.н. С.С. Беляев), почвенной микробиологии (зав. лаб. д.б.н. Н.С. Паников). Часть результатов получена при выполнении совместных работ с Институтом химической физики им. Н.Н.Семёнова РАН (д.ф.н. Ю.Ф. Крупянский), кафедрами микробиологии и биофизики МГУ им. М.В. Ломоносова (д.б.н. Л.И. Воробьева, к.б.н. М.Г. Страховская), Московским государственным университетом пищевых производств (д.т.н. М.В. Гернет, к.б.н. Е.Ф. Шаненко, асп. И.А. Конаныхина), Институтом биоорганической химии РАН (д.х.н. С.Г.Батраков), Российским химико-технологическим университетом им. Д.И. Менделеева (д.б.н. И.А. Крылов|, асп. С.С. Хабибулин),

Российским государственным аграрным университетом - МСХА им К.А. Тимирязева (к.б.н. Т.И. Шатилова), Казанским институтом биохимии и биофизики Казанского НЦ РАН (к.б.н. Ю.В. Гоголев), Институтом клеточного и внутриклеточного симбиоза УРО РАН г. Оренбург (чл.-корр. РАН О.В. Бухарин, д.б.н. Н.В. Немцова, к.б.н. Н.Б. Перунова), Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (д.б.н. В.И. Дуда, к.б.н. Н.Е. Сузина), ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (д.б.н. A.C. Миронов, к.б.н. Т.А. Воейкова). Часть работы выполнена во время стажировки автора в университете г. Абердин, Великобритания.

Личный вклад соискателя состоял в планировании и проведении исследований, анализе и обобщении полученных результатов, их оформлении для публикаций.

Финансовая поддержка. Работа проводилась при финансовой поддержке РФФИ (гранты 03-04-48403-а; 04-04-49710-а; 05-04-48977-а; 05-04-49520-а; 06-08-01469-а; 07-04-01011а; 07-04-12121-офи; 08-04-90305-Вьет-а; 08-04-99078-р-офи), а также Фонда Уэлкама и Королевского общества Великобритании, НАТО.

Защищаемые положения:

1. Микроорганизмы различных таксономических групп обладают способностью синтезировать специфические метаболиты - внеклеточные адаптогены (ВА), функцией которых является регуляция эффективности компенсаторно-приспособительных реакций, обеспечивающих адаптацию микробных популяций к изменяющимся или неблагоприятным условиям окружения.

2. Стрессы, запрограммированные в циклах развития микробных культур, и стрессорные воздействия окружающей среды, являются факторами, стимулирующими биосинтез микробных адаптогенов.

3. Обратимая адгезия клеток суспензионных культур является формой их адаптации к стрессорам разной природы. Ауторегуляторы адгезии концентрационно контролируют переходы между стадиями обратимой адгезии и планктонного существования.

4. Микробные алкилоксибензолы могут обладать функциями адаптогенов. Защитные эффекты АОБ в зависимости от их химической структуры реализуются как протекция клеток микроорганизмов от повреждающих воздействий или как сигнал тревоги для мобилизации защитных ресурсов клеток. Функции АОБ как сигналов тревоги опосредуются через контроль экспрессии генов стрессовых ре-гулонов. Механизм протекторного действия АОБ включает их функционирование как структурных модификаторов ферментных белков, а также как антиоксидантов.

5. Фенотипическая диссоциация популяции, составляющая её адаптивный потенциал, регулируется алкилоксибензолами, которые контролируют развитие определённого варианта.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы основан на анализе 638 источников, содержит 6 глав, в которых рассматриваются типы стрессоров, типы ответов микроорганизмов на стрессорные воздействия, механизмы адаптации микроорганизмов, в том числе к

конкретным стрессорам, связь факторов межклеточной коммуникации и стрессового ответа микроорганизмов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Бактерии: Escherichia coli МС4100, MJF274 и MJF276; Micrococcus luteus NCIMB 13267; Pseudomonas fluorescens NCIMB 9046 (NCIMB, Абердин, Великобритания); E.coli c600, Bacillus licheniformis штамм № 12 (ФНЦ ГНИ ГСПМ); Bacillus subtilis BKM-B 428; Pseudomonas aeruginosa (каф. микробиологии МГУ); дрожжи Saccharomyces cerevisiae (ИНМИ РАН) и Candida utilis BKM-Y 1668; зелёные микроводоросли Chlamydomonas reinhardtii Dang (каф. биофизики МГУ). Бактерии выращивали на глюкозо-минеральных (К 120 и М9) или сложных органических сред ах (LK, LB, МПБ); дрожжи - на сусле (3.5°Бл), в колбах на качалке (100-180 об/мин) при оптимальных температурах роста; водоросль C.reinhardtii - на среде Прата или М9 при постоянном освещении (1000 Лк) в статических условиях.

Микробиологические методы. Оптическую плотность (ОЩ - светорассеяние клеточной суспензии измеряли нефелометрически (/1=540, 600 или 650 нм, 1=10 мм, Specord, Германия). Массу сухих клеток (МСК) определяли после их высушивания до постоянной массы в течение 24 часов при температуре 105°С. Жизнеспособность клеток определяли по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве клеточных суспензий из ряда десятичных разведений на агари-зованные среды. Термоустойчивость клеток определяли после прогрева клеточных суспензий в ультратермостате «UV-10» при соответствующих температурах в течение определённого времени с последующим определением числа КОЕ. Радиоустойчивость клеток определяли по сохранению ими жизнеспособности (КОЕ) через 30 мин и 2 часа после у-облучения интенсивностью 194 рад/с (установка ГУРХ 100000, у-б0Со). Устойчивость дрожжей к синглетному кислороду ('О-Л определяли в клетках, фотосенсибилизированных хлорином при их облучении монохроматическим лазером с Х=662 нм (20 мВт/см2) [Peng et al., 1997] с последующим определением числа КОЕ. Устойчивость к антибиотикам бактерий определяли, рассчитывая индекс ингибирования роста культуры 1Е=(1-ДОПопьпМОПкотр)х100. Микроскопические наблюдения проводили в микроскопе «Amplival» (Германия) с фазово-контрастным устройством. Скорости роста и иные показатели роста бактериальных культур при изучении действия адаптогенов определяли по: 1) динамике светорассеяния их культур (Я,=540, 600 или 650 нм, Specord (Германия), КФК-2, КФК-56М (РФ), PyeUnicam (Великобритания)); 2) численности колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве аликвот культур на плотные среды (МПА, сусло-агар и др.); 3) интенсивности дыхания - выделению С02 (ИК-анализатор «Инфра-лит», Германия).

Биохимические и физико-химические методы. В качестве химических аналогов микробных АОБ использовали алкилрезорцины С7-АОБ (5-метилрезорцин) и С12-АОБ (4-гексилрезорцин) (99% чистоты, синтезированные в МГУТХТ). Соединения вносили в реакционные среды в виде раствора в воде или этаноле или в

виде водорастворимых K-солей. Концентрацию АОБ в образцах определяли с помощью колориметрической реакции с диазониевым производным 3,3'-диметоксибензи-дина (реактивом Fast Blue В Salt diazotized (FBB), Sigma) [Tluscik et al., 1981]. Количество белка определяли колориметрически по методу Лоури [Lowry et al., 1951] или в реакции с Кумаси синим (Fluka) [Bradford, 1976]. Активность трипсина (Sigma) определяли модифицированным методом Ансона [Грачева с соавт., 1982]. Значения Кга и Vmax трипсина определяли из зависимостей Лайнуи-вера-Бэрка. Активность а- и ß-амилаз (Fluka) определяли по количеству образующихся при гидролизе крахмала редуцирующих веществ с 3,5-динитросалициловой кислотой (Fluka) [Грачева с соавт., 1982]. Вязкость растворов белков определяли вискозиметрическим методом [Алейникова, Рубцова, 1988]. Степень набухания белка определяли по модифицированной методике [Зимон, Лещенко, 2001]. Гель-фильтрацию растворов белков проводили на колонке (35,0x2,5 см), заполненной сефадексом G-75 (Chemapol). Продукты окисления АОБ определяли методом хро-мато-масс-спектрометрии (ХМС) на масс-спектрометре модели 5973 с газовым хроматографом модели 6890 (Hewlett Packrd, США), для детекции свободных радикалов использовали ЭПР-спектрометр (ESR 70-03 XD/2, Bruker BioSpin). Для идентификации разделенных веществ использовали спектральные библиотеки NIST98 и Wiley275. О физико-химических свойствах микробных адаптогенов судили по сохранению/потере ими биологической активности после: 1) инкубации при pH 1 или 11; 2) прогревания (100°С, 20 мин; 3) инкубации с протеиназой К (иммобилизованной на стекле, BDH, UK)(0,2 мг/мл, 2 ч, 30°С); 4) адсорбции на гидрофобном носителе (картридж Sep-Pak С18, Millipore, UK) с последующей элюцией метанолом. Молекулярную массу адаптогенов оценивали методом ультрафильтрации (фильтр Centriplus с мембраной YM Millipore, UK, для молекул с М=3-10 кДа; камера типа "Amicon", Россия, с мембранами Diaflo РМ-10, с порогом отсечения молекул с М<10 кДа). Антиоксидантную активность АОБ определяли по реакции обесцвечивания красителя дихлорфенолиндофенолята натрия в присутствии препаратов, а также на приборе «Цвет Яуза-01-AA». Молекулярную динамику лизоцима, модифицированного С7-АОБ и С12-АОБ, исследовали методами Рэлеевского рассеяния Мёссбауэровского излучения (РРМИ), диффузного рассеяния рентгеновских лучей (ДРРЛ) и молекулярно-динамического компьютерного моделирования (МДКМ) (в лаборатории молекулярной динамики ИХФ им. H.H. Семёнова РАН, д.ф.н., проф. Ю.Ф. Крупянский).

Генетические методы. Генотоксическое (мутагенное) или антимутагенное действие алкилоксибензолов выявляли в стандартном тесте без метаболической активации [Marón, Ames, 1983] с ауксотрофным по триптофану штаммом В1733 Bacillus subtilis trpA5. Предварительно оценивали рост-ингибирующую активность алкилоксибензолов (С7-, С12-АОБ) по их влиянию на развитие этого штамма. Для исследования влияния АОБ на активность стрессовых генов SOS-ответа (iimiiD) и фо5-рсгулона (osmE) были получены тестерные штаммы на основе E.coli сбОО thi, thr, leu A pro-lac со встроенной малокопийной плазмидой pJEL246, несущей гибридные опероны umuD::lacZ и osmE::lacZ (во ВНИИГенетика, д.б.н., проф. A.C. Миронов). Об уровне экспрессии стрессовых генов судили по активно-

сти ß-галактозидазы, которую определяли по расщеплению субстрата (о-нитрофспил-р-галактопиранозида) [Миллер, 1976].

Методы идентификации микробных антиадгезинов. Антиадгезины P.fluorescens получали твердофазной экстракцией культуральной жидкости на колонке с гидрофобным сорбентом (Sep-Pak С18, Millipore) и идентифицировали методом хромато-масс-спектрометрии на хроматографе 6890 и масс-спектрометре 5973 (Hewlett Packard) с использованием спектральных библиотек Willey275 и NIST98 по программе ChemStation (Hewlett Packard). Антиадгезины B.licheniformis получали методами колоночной хроматографии на силикагеле L100/160 (Lachema, Чехия) и тонкослойной хроматографии на пластинах с силикагелем (Merck, Германия) с выявлением аминной, амидной, эфирной, диольной, фосфатной групп [Vaskovsky, Latyshev, 1975; Kates, 1986]. Состав жирных кислот определяли методом ХМС [Batrakov et al., 2003]. Аминокислотный состав определяли методами ТСХ и ХМС. ИК-спектры снимали на спектрометре Specord 71 (Carl Zeiss, Германия), в таблетках КВг. Спектры |3С-ЯМР получали на установке Unity Plus instrument (Varían, США) [Batrakov et al., 2003].

Биотесты для обнаружения ВА. Для выявления ВА. влияющих на рост микроорганизмов. в тест-культуры опытных вариантов фазы экспоненциального роста вносили культуральные жидкости (КЖ) (до 50% об.) от культур, подвергшихся действию стрессора (тетрациклин, окислитель N-этилмалеимид (NEM), выдерживание при 44-50°С или 5-15°С в течение 1 ч) или от культур, растущих в обычных, не стрессовых, условиях - контрольные варианты. КЖ получали, отделяя клетки центрифугированием и мембранной фильтрацией (0 пор 0.2 мкм). О наличии ВА судили по изменению скорости роста или по уменьшению лаг-периода опытных и контрольных культур, растущих в стрессовых или стандартных условиях, соответственно. Результаты были представлены количественно. Защитный эффект (К) выражали как K=Ki+K2, где Ki - степень восстановления скорости роста, К2-степень сокращения лаг-периода; K,=(nnp-|iMm,)/ (р„аКс-Цмин); K2=(t-tnp)/t, где цмакс -скорость роста контрольной культуры в отсутствие стрессора, цми„ - скорость роста в опыте в присутствии стрессора, цпр - скорость роста в присутствии стрессора и протектора (тестируемой КЖ), t - продолжительность лаг-периода в присутствии стрессора, ^-продолжительность лаг-периода в присутствии тестируемой КЖ. К=1 означает полное элиминирование стрессового воздействия, К=0 - отсутствие протекции. Наличие факторов ускоренной адаптации к новой среде определяли в биотестах с перенесением культур, выращенных на богатой среде, на новую, глю-козо-минеральную среду; о наличии фактора Xi судили на основании биотестов с NEM (сокращение периода задержки роста); о наличии фактора Хц судили по замедлению роста экспоненциально растущих тест-культур и повышению жизнеспособности в присутствии NEM.

Наличие ВА, влияющих на адгезию псевдомонад и бацилл, определяли по разнице в величине ОП культур лаг-фазы, после инокулирования отмытыми клетками экспоненциально растущей культуры без (контроль) или с добавлением (опыт) КЖ (50% об) экспоненциальной культуры. Начальная ОП составляла 0.050.1 ед. (Pye-Unicam SP-450 UV/VIS, с ценой деления шкалы 0.01). Адгезию клеток

характеризовали по показателям: величины адгезии, рассчитываемой по формуле: (ОПнач-ОПмин)/ОПнач, где ОПнач и ОПыин - ОП в момент засева и в момент достижения минимальной ОП (максимальной адгезии), соответственно; времени удержания - времени, прошедшего от момента внесения инокулята до начала схода клеток с поверхности культиватора, что регистрировалось по резкому возрастанию ОП культуры. За 1 ед. антиадгезина принимали такое его количество в 1 мл, которое приводило к снижению адгезии клеток в опытной культуре в 2 раза по сравнению с контрольной. Наличие летучих метаболитов P.jluorescens, влияющих на адгезию клеток, определяли по ОП тест-культуры в свежей среде при подаче в колбу воздуха от культуры-источника. Устойчивость адгезированных клеток (B.licheniformis) к окислительному стрессу (NEM, 200 цМ, 20 мин) определяли по численности КОЕ в суспензии клеток, десорбированных с использованием стеклянных шариков (d= 1 -2 мм, встряхивание на качалке, 1мин).

Расчёт ы и статистическая обработка данных. Эксперименты проводили в 3-5 повторных опытах с 2-3 параллельными вариантами в каждом. Статистические расчёты проводили на ПЭВМ с использованием программ Статграф и Excell-2003. На графиках представлены результаты типичных физиологических (ростовых) экспериментов; на остальных иллюстрациях и в таблицах приведены средние арифметические значения. При сравнении групп данных по критерию Стьюдента их считали различающимися для р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследование состояло из трёх частей, соответствующих трём основным этапам исследования ауторегуляторов. На первом этапе (этапе поиска новых адапто-генов с применением биотестов) исследовали феноменологию ауторегуляции адаптации у ряда микроорганизмов - про- и эукариот к стрессорным воздействиям разной природы и интенсивности. На втором этапе (выделения и идентификации адаптогенов) исследовали аутореуляцию малоисследованной формы адаптации микроорганизмов - обратимой адгезии и идентифицировали вещества - ауторегу-ляторы адгезии. В третьей части описаны адаптогенные функции и механизмы действия алкилоксибензолов, известных ранее как ауторегуляторы образования покоящихся форм микроорганизмов.

Глава 1. Роль внеклеточных ауторегуляторов в адаптации микроорганизмов про- и эукариот к стрессу новой среды, неоптимальным параметрам роста и шоковым воздействиям_

Доказана способность микроорганизмов различных таксономических групп в присутствии стрессоров разной природы и силы (вызывающих снижение скорости роста, остановку роста, биоцидный эффект) продуцировать внеклеточные метаболиты, участвующие в защите клеток от этих стрессоров.

1.1. Адаптогены к стрессам, замедляющим рост бактерий

На этом этапе работы для описания адаптогенов использовали биотесты, выделения веществ, ответственных за биологический эффект, не проводили. В экс-

периментах культуральные жидкости (КЖ), содержащие адаптогены - «стрессовые» КЖ, получали от культур после воздействий: антибиотика тетрациклина (50 мкМ); повышенной (44-48°С) или пониженной (5-15°С) температур; окислителей (Н202 и ЫЕМ, 10 мкМ). Биологические эффекты этих КЖ проверяли при действии на тест-культуры следующих стрессоров: тетрациклина (50 мкМ), №С1 (0.7 М), ИЕМ (10 мкМ), повышенной температуры (44°С) (рис.1).

Рис. 1. Рост Е.соН без и с внесением «стрессовой» КЖ (после действия тетрациклина) при действии различных стрессоров: а - тетрациклина (100 мкМ), б -Н202 (500 мкМ), в - ЫЕМ (10 мкМ), г -№С1 (0.7 М), д - Т=44°С. 1 -добавление свежей среды роста, 2 -добавление «стрессовой» КЖ, 3 - рост в отсутствие стрессора при Т=37°С.

Воздействия стрессоров различным образом влияли на рост Е. coli. I. При внесении тетрациклина или инкубации при высокой температуре рост бактерий продолжался без периода задержки, но с меньшей скоростью (рис. 1 а, д). Скорость роста в контрольных вариантах (без стрессовой КЖ) снижалась с 0.8-0.9 ч'1

до 0.45 ч'1 в присутствии тетрациклина и до 0.45-0.6 ч"' при тепловом шоке. II. В присутствии окислителей - Н202 и NEM, рост останавливался и после периода задержки возобновлялся со скоростью, близкой к первоначальной (рис. 1 б, в). Период задержки роста составлял 3-4 ч для Н202 и 2-3 ч для NEM. III. При осмотическом шоке (NaCl 0.7 М) наблюдали задержку роста на 0.5-1.5 ч, после чего рост продолжался с пониженной скоростью 0.2 ч"1 (рис. 1 г).

Во всех стрессовых ситуациях в опытных вариантах добавление (50% об.) «стрессовой» КЖ, полученной при тетрациклиновом стрессе, способствовало адаптации культур: превышение скорости роста по сравнению с контролем (без «стрессовой» КЖ) в условиях тетрациклинового стресса составило 20-50%; в условиях температурного стресса - 15-60%; период восстановления экспоненциального роста сократился при окислительном стрессе, вызванном Н202, на 1-2 ч, вызванном NEM - на 1.5-2.5 ч, при осмотическом шоке - на 1 ч. Отметим, что при действии окислителей (рис. 1 б, в) скорость роста тест-культур под влиянием «стрессовой» КЖ полностью восстанавливалась, что можно объяснить вероятной антиоксидантной активностью ВА.

Образование защитных экзометаболитов клетками E.coli было показано в условиях других стрессорных воздействий: внесении NEM (окислительный стресс), инкубации при низкой (5-15°С) или высокой (44-48°С) температурах (холодовой или тепловой стресс, соответственно). Протекторные эффекты полученных в этих условиях КЖ были проверены при действии на тест-культуру различных стрессоров. Величины защитного действия различных «стрессовых» КЖ в различных стрессовых условиях представлены в табл. 1.

Установлено (рис. 1, табл. 1), что «стрессовые тетрациклиновая и NEM» КЖ защищали клетки E.coli, от действия тех же стрессоров - теплового шока и окислителей, практически полностью снимая их рост-ингибирующее действие, однако не защищали клетки от тетрациклинового стресса и минимально - от осмотического шока. «Холодовая» КЖ была эффективна против термо- и осмотического стрессов, не действовала при тетрациклиновом стрессе и оказывала минимальный эффект в условиях NEM-стресса. Наибольшими защитными свойствами от действия всех испытанных стрессоров обладала тетрациклиновая КЖ.

Таблица 1. Величины защитного эффекта К* культуральных жидкостей E.coli, получен-

Стрессор при получении «стрессовой» КЖ Стрессовые условия испытания КЖ

NEM Тетрациклин 44°С NaCl

Окислитель, 0.85 0 0.25 0.05

Тетрациклин 1.0 0.15 0.23 0.28

Нагрев (44-48°С) 0.65 0 0.23 0.05

Холод (5-15°С) 0.15 0 0.25 0.23

Защитный эффект рассчитывали по формуле К=К1+К2, как описано в методах исследования. К! отражал степень восстановления скорости роста, К2 - сокращение периода задержки перед восстановлением экспоненциального роста.

Различия в действии «стрессовых» КЖ могут быть обусловлены поликомпо-нентностью внеклеточных адаптогенов, как это имеет место для галобактерий и E.coli [Кокоева, Плакунов, 1996; Вахитов, 2007]. Не менее вероятно, что стрессо-протекторами являются соединения, обладающие антиоксидантной активностью, нейтрализующие избыток образующихся активных форм кислорода, уровень которых различен в различных стрессовых условиях. Этому предположению не противоречат наблюдения, показавшие, что E.coli в стрессовых условиях выделяет в окружающую среду низкомолекулярные SH-содержащие метаболиты-антиоксиданты [Воробьёва с соавт., 1995; Октябрьский, Смирнова, 2007].

Таким образом, в условиях стресса конкретного типа (тетрациклинового или другого) клетки бактерий выделяют внеклеточные метаболиты, способствующие более эффективной адаптации к этому, а также другим типам стресса (окислительному, осмотическому и тепловому).

I.2. Адаптогены к стрессам бактерицидной интенсивности

Была выявлена способность бактерий образовывать в условиях более сильного стрессорного воздействия, вызывающего частичную потерю клетками жизнеспособности (сублетальной температуры 48-50°С), внеклеточные метаболиты, защищающие клетки при воздействии стрессоров бактерицидной интенсивности (условное - название фактор Хп). Добавление такой «стрессовой» КЖ E.coli к экспоненциально растущей культуре E.coli (50% об) снижало скорость её роста с 0.82±0.07 ч"1 до 0.13±0.15 ч'1 (на 80-90 %). Отметим, что КЖ от культур, подвергшихся более мягкому нагреванию (44-48°С) (содержащих адаптогены с условным названием фактор X]), таким рост-замедляющим действием не обладали. Адапто-генная функция фактора Хц была выявлена в опыте, результаты которого представлены на рис. 2.

В две культуры с одинаковой ОП - контрольную и опытную, имеющую сниженную скорость роста вследствие 1.5-часовой прединкубации с фактором Хп, вносили окислитель (NEM, 200 мкМ). В результате окислительного стресса численность клеток в контрольном варианте быстро снижалась (со скоростью 1.7 lg/час). Добавление КЖ, содержащей фактор Хп, непосредственно перед внесением NEM (без прединкубации), замедляло более чем в 2 раза скорость гибели культуры в течение первого часа (до 0.7 lg/час), после чего скорость отмирания становилась такой же, как в контроле. Прединкубация клеток (1.5 час) со стрессовой КЖ до внесения NEM многократно усиливала защитный эффект: первоначальная скорость отмирания была в 8 раз ниже, чем в контроле (0.2 против 1.7 lg/час), а количество КОЕ через 3 часа инкубации выше в 1000 раз.

Оба фактора, X] и Хц, имели массу менее 10 кДа, были устойчивы при pH 1 и

II, различались устойчивостью при хранении (4°С, 7 сут.) и кипячении (10 мин.) -в этих условиях Xi был нестабилен, Хц - стабилен. Они также различались условиями образования и защитными эффектами (рис. 3, 4): Xi имел функции адапто-гена-протектора прямого действия, Хц - индуктора, запускающего систему адаптивных реакций для повышения жизнеспособности клеток после необходимой прединкубации с ним (рис. 2,4).

Таким образом, при воздействии одного и того же стрессора, в зависимости от его дозы, микроорганизмы реализуют два пути защиты (адаптации), различающиеся химической природой синтезируемых внеклеточных адаптогенов и механизмами их защитного действия: при умеренном, рост-замедляющем, действии стрессора реализуется система протекторной защиты, при рост-останавливаю-щем, сублеталыюм, действии стрессора - система индукции адаптивных ресурсов.

КОЕ,

Рис. 2. Влияние «стрессовой» КЖ Е.соН (условия получения - тепловой шок, 48-50°С) на отмирание клеток в присутствии 200 мкМ ЫЕМ. 1- контроль без добавления «стрессовой» КЖ; 2 - в присутствии «стрессовой» КЖ, добавленной одновременно с внесением ЫЕМ; 3 - как 2, но КЖ добавлена за 1.5 ч до внесения КЕМ.

Отн. ед.

Рис. 3. Накопление внеклеточных адаптогенов у Е.соН в ходе теплового стресса. 1 - температура; 2 - относительное содержание веществ, поглощающих при 270 нм, отражающее степень повреждения клеток; 3 - содержание фактора Хг. 4 - содержание фактора Хп.

Рис. 4. Зависимость активности факторов Xi и Хп E.coli от их концентрации. По оси абсцисс - концентрация факторов в % от их концентрации в исходной КЖ (соответствует %-ному содержанию КЖ). По оси ординат - их активность в % от максимальной.

1.3. Адаптогены к стрессу новой среды

В биотесте на стресс новой среды клетки культуры Е.соН, экспоненциально растущей в богатой органической среде LB, отмытые от среды роста, переносили в свежую глюкозо-минеральную среду К120, без добавления (контроль) или с добавлением КЖ (50% об.) от культуры, росшей экспоненциально на среде К120

(опыт). Биотест более эффективен при использовании малых доз инокулята (0.5 % об.).

Смена состава питательной среды вызывала задержку роста в контрольном варианте на 6-7 часов, тогда как в опытных вариантах лаг-период сокращался до 1 часа, что указывало на наличие в КЖ растущей культуры фактора адаптации к новой среде (ФАНС). Этот фактор начинал внеклеточно накапливаться уже через 10 минут после внесения инокулята в свежую среду роста, был термолабилен и полностью разрушался за 30 мин при 120°С (рис. 5).

1.4. Внеклеточные адаптогены разных микроорганизмов

Способность микроорганизмов продуцировать внекле-

Рис. 5. Рост Е.соИ после перенесения отмытых клеток из среды ЬВ в среду К120 с и без внесения КЖ.

точные адаптогены: факторы Xi_ Хц и ФАНС, защищающие клетки от стрессорных воздействий, была продемонстрирована также для других бактерий (P.fluorescens и В. subtilis и дрожжей (С. utilis).

P.fluorescens синтезировала адаптоген прямого действия - фактор Xi, который повышал устойчивость бактерий в условиях супраоптимальных температур, высоких и низких значений pH, а также фактор адаптации к новой среде; оба метабо-Таблица 2. Эффективность перекрёстного действия вне- лита представлены низкоклеточных факторов адаптации (ФАНС, Хь Хн) E.coli, молекулярными амфи-В.subtilis и С.utilis. фильными соединениями

небелковой природы. Псевдомонада также образовывала вещества, подавляющие её адгезию (см. гл. 2). Все три фактора адаптации бактерий В.subtilis и E.coli (ФАНС, X] и Хц) обладали перекрестным действием между собой, но не с C.utilis, на которую действовал только фактор X! E.coli (табл. 2). C.utilis продуцировала ФАНС, действую-

Объект получения «стрессовой» КЖ Фактор Тест-объект воздействия «стрессовой» КЖ

B.subtilis E.coli C.utilis

B.subtilis ФАНС + + -

X, + + -

Хп + + -

E.coli ФАНС + + -

X, + + +

Хп + + -

C.utilis ФАНС + + -

X, - - -

Хп + - -

+/- - наличие или отсутствие эффекта в биотесте.

щий на обе бактерии, а также Хп, действующий только на B.subtilis.

Приведенные результаты демонстрируют способность микроорганизмов различных физиологических групп синтезировать внеклеточные факторы адаптации, синтез которых стимулируется стрессорными воздействиями разной природы и разной интенсивности как запланированными в цикле развития культур (стресс новой среды), так и неблагоприятными факторами среды - воздействиями токсикантов, экстремальных значений температуры, pH, солёности. Механизмы защитного действия внеклеточных адаптогенов различаются (протекция или индукция).

Выявленное перекрёстное действие внеклеточных адаптогенов предполагает, что в микробном сообществе имеют место межвидовые взаимодействия, осуществляющиеся с участием низкомолекулярных видонеспецифичных метаболитов, и обеспечивающие его устойчивое функционирование.

Один из типов ауторегуляторов, антиадгезины, были более детально исследованы на втором этапе работы.

Глава 2. Ауторегуляция бактериальной адгезии_

Обратимая адгезия микробных клеток в погружённых культурах является формой их адаптации к стрессу новой среды и контролируется внеклеточными ау-торегуляторами с активностью антиадгезинов._

Жизнь в прикрепленном состоянии является одной из стратегий обитания бактерий в разных экотопах, а адгезия является универсальной адаптивной реакцией, повышающей защищенность микроорганизмов в неблагоприятных для роста или повреждающих условиях. Исследования адгезии, в основном, посвящены изучению факторов, усиливающих прикрепление клеток [Marshall, 1985, 1996]. Механизмы снижения клеточной адгезии изучены недостаточно. Информации о регуляции первого этапа адгезии, её обратимой стадии, до наших работ не было. Обратившись к вопросу обратимой адгезии бактерий мы исследовали её ауторегуляцию и роль в ответе P. fluorescens и B.licheniformis на стресс новой среды.

2.1. Регуляция обратимой адгезии клеток Pseudomonas fluorescens

Обратимое прикрепление клеток планктонной культуры Р. fluorescens к стеклу культиватора проявлялось при переносе активно растущих на среде М9 бактерий в свежую среду того же состава и усиливалось при использовании малых количеств инокулята (0п6оо=0.07-0.1). Процесс визуализировался характерным видом кривой роста "с провалом" в течение первого часа после внесения инокулята (рис. 6). После наблюдаемого снижения численности клеток в водной фазе (участок 1) следовала фаза восстановления ОП суспензии за счет быстрого схода клеток с поверхности стекла (участок 2), после чего культура продолжала экспоненциальный рост с той же скоростью, что и контрольная (участок 3). Цикл адгезии-схода проходил за время, меньшее времени генерации клеток.

Важным элементом обратимой адгезии оказалось существование тонкого механизма её регуляции. Пунктирная кривая 4 на рис. 6 отражает рост опытной культуры в присутствии КЖ (50% об) от собственной экспоненциально растущей культуры псевдомонады. Ингибирование адгезии клеток внесением КЖ экспонен-

циальной культуры обусловлено наличием в ней ауторегуляторов, снижающих адгезивные свойства псевдомонад. Антиадгезины культуральной жидкости были идентифицированы (гл. 2.3).

ОПбОО

0,01

0,1

Рис. 6. Рост культуры Р. Аиогежет в среде М9. 1 - снижение ОП культуры, вызванное адгезией клеток на стенках культиватора, 2 -возрастание ОП за счет схода клеток, 3 - экспоненциальный рост культуры, 4 - рост опытной культуры в присутствии КЖ экспоненциально растущей культуры (50% об.) или антиадгезина, полученного из КЖ или препарата антиадгезина - смеси углеводородов, в концентрации 15 мкг/л.

2.2. Регуляция обратимой адгезии клеток Bacillus licheniformis

Для клеток В. licheniformis, как и для клеток псевдомонад, характерны высокие адгезионные свойства. Обратимая адгезия бацилл наблюдалась в лаг-фазе роста при стрессе свежей или новой по составу среды (замене глюкозы на ацетат). В большей степени адгезия была выражена в условиях двойного стресса - если в дополнение к смене среды роста неоптимальными для роста были значения температуры, pH, солёности, концентрации ионов Са2+ (рис. 7). Для всех вариантов роста бацилл в неблагоприятных условиях установлена обратная зависимость скорости роста культуры и величины адгезии клеток. В условиях, приближающихся к неростовым, адгезия приобретала необратимый характер. Было показано, что концентрация и вид источника углерода в новой среде влияют на степень адгезии бактерий. Так, клетки В.licheniformis, выросшие в среде с глюкозой, обеспечивающей рост с высокой скоростью, и перенесенные в среду с ацетатом или в голодную среду, быстро прикреплялись к стеклу сосуда.

В регуляции адгезии задействованы механизмы, связанные как с подвижностью клеток, так и усилением синтеза адгезинов в неоптимальных условиях роста. Внесение в голодающую по углероду культуру В.licheniformis 603 антибиотиков (хлорамфеникола и доксициклина), нарушающих синтез белка, снижало количество прикреплённых клеток. Это можно объяснить нарушениями в синтезе поверхностных адгезинов, аналогично описанным эффектам ингибирования хлорамфе-николом прикрепления к твердой поверхности морских бактерий [Раилкин, 1998] и действия ванкомицина и тейкопланина на адгезию стафилококков [Carcenty-Etess et al., 1993; Drago et al., 2003]. Полученные результаты согласуются с данными об адаптивном значении адгезионного фенотипа при голодании у морских вибрионов и спирилл [Kjellerberg, 1984], Acinetobacter sp. [James et al., 1995], позволяющего утилизировать молекулы органического вещества, сорбированные по-

верхностыо [Morgan, Dow, 1986; Marshall, 1996], и снизить энергетические затраты на передвижение [Паников, 1991].

о 50 100

[NaCl], г/л

Рис. 7. Влияние температуры (а), концентрации №С1 (б) и концентрации Са2+ (в) на рост (1) и адгезию (2) В. Искепх^пп 'к.

Основная информация о широко известной высокой стрессоустойчивости прикреплённых клеток микроорганизмов относится к биопленкам с развитым мат-риксом, что определяется фенотипами клеточной персистентности или покоя, а также защитными свойствами матрикса [Olson et al., 2002; Jefferson, 2004; Льюис, 2005]. О стрессоустойчивости обратимо прикрепленных бактерий сведений до наших исследований не было. Повышенная устойчивость обратимо адгезирован-ных клеток В. licheniformis была продемонстрирована в экспериментах при летальном воздействии на них сильного окислителя (NEM, 200 мкМ): доля выживших клеток в субпопуляции прикрепленных к стеклу бактерий оказалась в 10 раз выше по сравнению с неприкрепленными (рис. 8).

Повышение устойчивости адгезированных клеток может быть обусловлено изменением уровня экспрессии стрессовых генов. Например, при контакте с поверхностью в клетках P.aeruginosa усиливается экспрессия генов, ответственных за выработку альгината и супероксиддисмутазы [Donlan, 2002; Sauer et al., 2002]. He исключено также, что контакт клетки с поверхностью индуцирует генерализо-

5 100

10 -

1 -

ванные фазовые переходы мембранных структур, влияющие на их устойчивость и функциональную активность [Конев, 1987].

Таким образом, обратимая адгезия является способом быстрого реагирования микроорганизмов на стресс без изменения стратегии жизни в противоположность необратимой адгезии. В состоянии обратимой адгезии организм получает возможность выбора: вернуться к прежнему, планктонному способу существования с высокой скоростью роста, но и высокой чувствительностью к действию неблагоприятных

Рис. 8. Численность жизнеспособных клеток (КОЕ) ФактоРов> или перейти к при

„,.,.,.-- крепленному существованию с

В. испетюгти в суопопуляциях свободно плаваю- _ „

,,, /оч „ более низкои скоростью роста,

щих (1) и прикрепленных (2) клеток до и после воз- / '

действия окислителя (ЫЕМ, 200 мкм): 1:100 и 1:10- н0 с повышенной устоичиво-

величина снижения концентрации КОЕ, соответст- стью к повреждающим воздей-

венно. ствиям.

о Ш х О

0,1

1 7> V 1.ЮО

^ «е. ^ 1:10 ^0,9 0,8

1 I

Исходно После обработки МЕМ

2.3. Идентификация химической структуры внеклеточных регуляторов адгезии псевдомонад и бацилл*

Идентификация действующего начала любого ауторегулятора является необходимым этапом его исследования, так как информация о химической структуре и свойствах вещества позволяет повысить как эффективность исследования механизмов его действия и выяснения роли в развитии микробных популяций, так и рекомендовать пути практического применения.

2.3.1. Антиадгезины псевдомонад

Регуляторы с функциями антиадгезинов, контролирующие сход адгезирован-ных клеток Р. Аиогеясет в водную фазу, были выделены из КЖ экспоненциально растущих культур и идентифицированы методом хромато-масс-спектрометрии как смесь высокомолекулярных насыщенных неразветвленных углеводородов (УГВ) с длиной цепи 21-33 атомов углерода (табл. 3). Суммарная концентрация УГВ в КЖ культуры Р. Аиогеьсет составляла 10-15 мкг/л (0.1-3.0 мкг/л отдельных индивидуальных компонентов смеси). Внесение препаратов очищенной фракции, а также индивидуальных УГВ в культуру бактерий в условиях стресса новой среды приводило к уменьшению количества адгезированных клеток аналогично действию

* Исследования проводили совместно с д.х.н. |С.Г. Батраковым], о чём автор помнит с глубокой благодарностью

КЖ (рис. 6). При этом снижение адгезии клеток сопровождалось усилением их агрегации в водной фазе.

Другой внеклеточный антиадгезин P.fluorescens, присутствующий в КЖ, был определён как белок с протеолитической активностью. Внесение в растущую культуру КЖ, содержащую белковый антиадгезин, приводило к подавлению адгезии клеток с одновременной активацией протеоли-за и нарастанием в среде концентрации белка. Внесение в культуру псевдомонад модельного антиад-гезина, протсиназы К, воспроизводило действие экспоненциальной КЖ -происходило значительное снижение адгезии клеток.

Так как клетки псевдомонад имеют на клеточной поверхности адгезины глико-протеиновой природы [Christensen et al., 1985; Read, Costerton, 1987], то наиболее успешным инги-бирование адгезии клеток было при одновременном действии обоих антиадгези-нов, содержащихся в КЖ псевдомонад - УГВ и протеазы.

Контроль адгезии грамотрицательных бактерий в условиях стресса новой среды, по-видимому, осуществляется двумя путями. Низкомолекулярные гидрофобные ауторегуляторы, н-алканы, блокируют липкие концы клеточных адгезинов и препятствуют прилипанию клетки к поверхности. Кроме того, они способствуют формированию в водной фазе тяжелых многоклеточных агрегатов за счет слипания клеток друг с другом, что также не способствует адгезии клеток на поверхности. Антиадгезины второго типа - протеазы, разрушают белковую часть молекулы адгезина, отщепляя его липкий конец, что препятствует адгезии и способствует сходу прикрепленных клеток.

2.3.2. Антиадгезины бацилл

Другим организмом, для которого определили химическую природу антиад-гезина, были бактерии В. licheniformis. На основании результатов ИК-спектроскопии, 'Н- и 13С-ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии в сочетании с методами химического и энзиматического гидролиза бациллярный антиадгезин был идентифицирован как циклический липопептид, кольцевая часть которого составлена 7 аминокислотными остатками, а липидная - остатками 3-гидроксижирных кислот (рис. 9). Циклогептапептид ацилирован 3-гидроксижирной кислотой по N-терминальной аминокислоте L-Asp. Жирная ки-

Таблица 3. Углеводороды (н-алканы) в составе антиад-

гезина P.fluorescens.

Число Название Концентра- Раствори-

атомов ция в КЖ мость (нг/

С (нг/мл) мл воды)

21 н-хенэйкозан 0,9 16

22 н-докозан 0,8 13

23 н-трикозан 1,0 8,9

24 н-тетракозан 1,4 6,3

25 н-пентакозан 1,1 4,5

26 н-гексакозан 3,0 3,8

27 н-гептакозан 1,2 2,6

28 н-октакозан 1,2 2,1

29 н-нонакозан 1,0 1,6

30 н-триконтан 0,8 1,3

31 н-хентриаконтан 0,5 1,0

32 н-дотриаконтан 0,2 0,8

33 н-тритриаконтан 0,1 0,6

слота представлена смесью гомологов (13:0 -17:0 с п-, изо- и антеизо- цепями), её 3-ОН группа этерифицирована С-терминальной аминокислотой, L-Leu. Вещество такой структуры выделено впервые.

Антиадгезин обнаружен в культуральной жидкости и частично связан с клетками (2:1). Связанный с клетками липоцик-лопептид составлял 57% от общей массы экстрагируемых внеклеточных липидов. При его концентрации в культуральной жидкости 1.6 мкг/мл он полностью подавлял адгезию клеток В. licheniformis к стеклу (показано в прямом опыте).

Следует отметить, что ли-поциклопептиды другой, но сходной структуры (лихенизины, сурфактины) были обнаружены у некоторых других грамположи-тельных бактерий как биосурфак-танты с неизвестной биологической функцией бактерий [Konz et al., 1999; Doekel, Marahiel, 1999; Yakimov et al., 1999]. С описанием липоциклопептида В. licheniformis 603 стала известной, по крайней мере, одна из функций этих липо-пептидов - регуляция адгезии. Кроме того, антиадгезин В. licheniformis проявлял выраженную антимикробную активность против клеток Corynebacterium variabilis, обладающих гидрофобизированной поверхностью. Полученные нами результаты объясняют данные Колари [Kolari et al., 2001] об ингибировании образования биоплёнки Deinococcus geothermalis при совместном культивировании или добавлении бесклеточного экстракта В. licheniformis.

Полученные в данном разделе исследований результаты позволяют сделать ряд заключений о роли и механизмах начального этапа бактериальной адгезии. При глубинном культивировании бактерий их адаптивной реакцией на внезапные изменения условий роста (температуры, концентрации NaCl, Са2+ и др.), состава среды или голодание является процесс прикрепления клеток к поверхности культиватора. При изменении условий роста в диапазонах, толерантных для вида, адгезия является обратимой, за пределами границ толерантности - необратимой. В состоянии обратимой адгезии микроорганизмы более устойчивы к стрессорным воздействиям. Процесс обратимой адгезии находится под популяционным контролем, который осуществляется с участием внеклеточных низкомолекулярных метаболитов. В экспоненциально растущей бактериальной культуре ингибиторы бактериальной адгезии концентрационно регулируют как стадию прилипания клеток к поверхности, так и стадию их схода для возврата к планктонному существованию.

__со

см, снрн /w7cli

qx>i

сн£нрнн i-Глу

СО L-Вал

Т^С". /СН

jCH,), жк

,сС

dp соон ХГЧ'ИДЧ со

L Г'

L-Лей Clicifp —

f^x" СО CjH NlT

сн;Ян

1 СИ,

со

' CHCHr-tF

сн,

CH^H,

/ T СНД

CH,

Рис. 9. Структура антиадгезина В. licheniformis.

Глава 3. Эффективность и механизмы защитного действия алкилоксибен-золов как внеклеточных адаптогенов_

Микробные алкилоксибензолы могут обладать функциями адаптогенов, защитные эффекты которых в зависимости от их химической структуры и концентрации реализуются как протекция микроорганизмов от повреждающих воздействий или как сигнал тревоги для мобилизации адаптивных ресурсов клеток.

Группа внеклеточных микробных ауторегуляторов (факторы с^), участвующих в контроле развития микробных культур, была описана в ИНМИ РАН до начала наших исследований как аутоиндукторы анабиоза микроорганизмов, вызывающие переход клеток в состояние покоя и представленные у бактерий смесью гомологов алкилоксибензолов (АОБ) класса алкилрезорцинов, а у дрожжей - ти-розолом [Осипов с соавт., 1985; Светличный с соавт., 1986; Батраков с соавт., 1993; Мулюкин с соавт., 1996; Мулюкин, 2010]. В растущей микробной культуре запланированные стрессы, развивающиеся вследствие исчерпания источников питания или высокой клеточной плотности, сопровождаются повышением концентрации АОБ, что служит сигналом для перехода культуры в стационарную фазу с последующим образованием покоящихся цистоподобных клеток [Пронин с соавт., 1982; Бабусенко с соавт., 1991; Лойко с соавт., 2002; Мулюкин с соавт., 1996; Биг-та е1 а1., 2006; Мулюкин, 2010]. Описанные биологические эффекты АОБ предполагали их участие в реакциях адаптации вегетативных клеток микроорганизмов к незапланированным стрессорным воздействиям, в частности, к неблагоприятным физико-химическим факторам среды.

3.1. Влияние стресса на динамику накопления АОБ в микробной культуре

Одним из указаний на адаптогенные функции АОБ является повышение их концентрации при развитии стрессового ответа клеток. Эти данные были получены на модели бактерии М. Ыет, у которой аутоиндукторы анабиоза представлены алкилоксибензолами класса алкилрезорцинов [Мулюкин с соавт., 1996; Мулюкин, 2010], что позволяло количественно определять их содержание в КЖ и клетках по результатам специфической колориметрической реакции с красителем РВВ [ТИкак й а!., 1981].

После сублетального температурного шока (45°С, 15 мин) в экспоненциально растущей опытной культуре во время остановки роста (50 мин, реакция на шок) количество внеклеточных АОБ резко увеличивалось, тогда как в контроле их концентрация не менялась (рис. 10 б). Выход культуры из стресса был сопряжен с возрастанием уровня АОБ в клетках при одновременном снижении их содержания в среде. В культуре, подвергнутой шоку, суммарное количество вне- и внутриклеточных АОБ увеличилось на 35% по сравнению с контролем, что отражает реакцию клеток микрококка на стрессорное воздействие (табл. 4).

Таким образом, развитие стрессового ответа бактерий М. Ыем сопряжено с повышением биосинтеза АОБ, внеклеточный пул которых служит для их перераспределения между клетками популяции и средой. Это предполагало, что повыше-

Таблица 4. Суммарное содержание вне- и внутриклеточных АОБ на единицу массы су-

Время отбора пробы, ч роста Количество АОБ, мг/г МСК (%)

Контроль Опыт

До термообработки, 5 ч 0.95 (100) 0.95 (100)

После термообработки, 6 ч 1.06(100) 1.43 (135)

Начало стационарной фазы роста, 11 ч 1.24(100) 1.53 (123)

Рис. 10. Влияние термошока (прогрев при 45°С, 15 мин.) на рост (а) и удельную концентрацию (б) внеклеточных (кж) и внутриклеточных (кл) АОБ M. luteus. Обозначения: 1 - контроль без прогрева; 2 - термошок; 3 - как 2, но за 30 мин до шока вносили 4 мМ С7-АОБ; 4 - как 3, но с 8 мМ С7-АОБ; 5 - как 3, но с 12 мМ С7-АОБ; кл(к) - АОБ в клетках в контроле; кл(о) - АОБ в клетках в опыте; кж(к)- АОБ в КЖ в контроле; кж(о) - АОБ в КЖ в опыте. Стрелкой сверху указан момент начала прогрева. Стрелками снизу указаны моменты определения концентрации АОБ - на 5, 6, 9 и 11 ч роста культуры.

ние концентрации внеклеточных АОБ в микробной культуре, в том числе при их экзогенном внесении, будет способствовать защите клеток от стрессового воздействия, что было продемонстрировано в нижеописанных экспериментах.

3.2. Зашита микроорганизмов алкилоксибензолами в стрессовых условиях

3.2.1. Защита микроорганизмов от воздействий летальной и сублетальной интенсивности

Протекторные функции АОБ зависят от их структуры и концентрации.

В экспериментах в качестве модельных АОБ были использованы два гомолога - амфифильный С7-АОБ (5-метилрезорцин) и более гидрофобный С12-АОБ (4-гексилрезорцин). Выбор этих соединений обоснован тем, что у микроорганизмов встречаются как амфифильные водорастворимые АОБ - тирозол у дрожжей, гид-рохиноны и АОБ с радикалами С2-С8 у псевдомонад и микрококка, так и гидро-

100

^ 60 -ё

Й 40 20

Па , ГЬ

□ Н202 О Прогрев

О.

фобные - большинство бактериальных АОБ [Батраков с соавт., 1993; КогиЬск, Тушап, 1999; Stasiuk, КогиЬек, 2010; Мулюкин, 2010]. Именно две эти группы АОБ с различной водорастворимостью и представляют С7- и С12-АОБ. АОБ с идентичным по структуре фенольным ядром и близкими по длине радикалами С2-С5 обнаружены у М.1и1еиа [Мулюкин, 2010].

Протекторные функции АОБ были доказаны в опытах с прединкубацией культуры микрококка фазы линейного роста с химическим аналогом фактора (1, этих бактерий - С7-АОБ, который вносили за 30 мин до термошока (рис. 10а). Протекторное действие АОБ имело концентрационно-зависимый характер с максимумом эффекта при концентрации 12 мМ; развитие культуры после термошока проходило без задержки роста, наблюдавшейся в контрольной культуре, хотя и с более низкой скоростью.

Стрессопротекторное действие АОБ было также продемонстрировано на другом модельном объекте, дрожжах S.cerevisiae, в условиях температурного (45°С, 30 мин) и окислительного (Н202, 100 мМ, 30 мин) воздействий летальной интенсивности, которые приводили к гибели значительной части клеток популяции (75-80% и 9092%, соответственно). В опытных вариантах АОБ вносили за 2 часа до стрессового воздействия. Показано, что короткоцепочеч-ный С7-АОБ в концентрациях 2-5 мМ повышал устойчивость клеток дрожжей к перекиси водорода в 2-5 раз (рис. 11), тогда как более гидрофобный С12-АОБ, напротив, в концентрациях 5-300 мкМ понижал её (рис. 12). Аналогичное, противоположное, действие С7-АОБ и С12-АОБ проявляли в отношении дрожжей, подвергнутых термошоку (45°С, 30 мин) (рис. 11, 12).

2 5 10

С7-АОБ, мМ

Рис. 11. Влияние С7-АОБ на устойчивость клеток Хсегеушяе к воздействию Н202 (100 мМ, 30 мин) и прогреву (45°С, 30 мин).

О «

30 25 20 -15 • 10 -5 -0

□ Н202 В Прогрев

дд

15 50 С12-АОБ, мкМ

150

300

Рис. 12. Влияние С12-АОБ на устойчивость клеток 5.сегеуише к воздействию Н202(100мМ, 30 мин) и прогреву (45°С, 30 мин).

Отмеченные различия в эффектах гомологов С7- и С12-АОБ объясняются различиями в молекулярных механизмах их действия в качестве структурных модификаторов белков и степенью антиоксидантной активности (подробно изложено в разделе 3.3). Способность АОБ модифицировать структуру ферментных белков приводит к повышению их стабильности и изменению каталитической активности в сторону как активации, так и ингибирования, что зависит от концентрации АОБ и степени их гидрофобности: ингибирующим действием, в основном, обладают более гидрофобные гомологи АОБ (С12-АОБ), активирующим - амфифильные (С7-АОБ) (равно как и продукты их окисления). Это обусловливало более активное функционирование защитных и репарационных систем клетки в случае с С7-АОБ и, напротив, их ингибирование в случае с С12-АОБ, и таким образом, потенцирование биоцидного действия стрессоров.

Хотя температурный стресс (как и многие другие) у микроорганизмов сопровождается накоплением активных форм кислорода [Sugiyama, 2000; Смирнова, 2001; Рихванов, 2003], но в защите клеток от прямого окислительного стресса, по-видимому, большую роль в суммарном протекторном действии С7-АОБ играет его более выраженная, чем у С12- АОБ, антиоксидантная активность. Поэтому оптимальная концентрация С7-АОБ (5 мМ), одинаковая для защиты клеток от обоих стрессов, обеспечивала 5-кратное увеличение КОЕ при воздействии Н202 и только

Таким образом, синергизм или антагонизм действия стрессора (Н202 или термошока) и определённого гомолога АОБ обусловливали защиту клеток при действии С7-АОБ или стресспо-тенцирующий эффект в присутствии С12-АОБ. С последним связаны регуляторные эффекты длинноцепочечных АОБ на стадии отмирания культуры и образования анабиотических покоя-Рис. 13. Протекторное действие С7-АОБ при щихся форм [Мулюкин, 2010]. окислительном стрессе дрожжей S. cerevisiae (у- Также отметим экологическое облучение, доза 50 крад, жизнеспособность опре- значение не только стрессопро-деляли через 2 ч после облучения). текторной, но и стресспотенци-

рующей функций АОБ для растительно-микробных биоценозов. Обнаруженная способность длинноцепочечных АОБ потенцировать действие стрессоров может быть выгодна для организмов, их продуцирующих, как средство борьбы с конкурентами или паразитами. Так, известно, что в семенах растений содержится много длинноцепочечных алкилокси-бензолов класса алкилрезорцинов [Kozubek, Tyman; 1999; Stasiuk, Kozubek, 2010], в присутствии которых жизнедеятельность фитопатогенной микрофлоры будет сильно подавлена.

2-кратное - при термошоке (рис. 11, 12).

130

120 -

о*-

о no -

100 -

90 I 1 1 I 1 | | ' 1 | 1 |

0 1 4 8 10 11 13

С-7 АОБ, мМ

Выявленные эффекты действия длинноцепочечных АОБ были использованы нами при разработке серии препаратов, предназначенных для защиты материалов от биоповреждения, а также способа стабилизации микробных препаратов.

Возможность эффективного адаптогенного действия С7-АОБ в защите клеток от стрессоров различной природы, вызывающих развитие окислительного стресса, была продемонстрирована в опытах с дрожжами 5. сегеуише. В первой серии экспериментов стресс индуцировали у-облучением. С7-АОБ вносили в культуру дрожжей фазы линейного роста за 30 мин до облучения дозой 50 крад: при концентрациях АОБ 11-13 мМ число жизнеспособных клеток увеличивалось на 2030% (по сравнению с контролем без внесения АОБ) (рис. 13).

В другой модели повреждающим агентом был синглетный кислород, который генерировался в фотосенсибилизированных (хлорином е6) клетках, при их облучении лазером (к=662 нм). В опытных вариантах в культуру дрожжей кроме хлорина вносили С7-АОБ за 30 мин до облучения. Оптимальной для протекции была концентрация 8 мМ, при которой для достижения гибели 75% клеток требовалась доза облучения в 3.5 раза большая, чем для достижения такой же гибели незащищенных клеток (12 и 3.5 Дж/см2, соответственно)(рис. 14).

Таким образом, обнаружено, что увеличение концентрации короткоцепочечных амфифильных АОБ в пролиферирующих культурах микроорганизмов защищает клетки от стрессорных воздействий сублетальной и летальной интенсивности (прогрев, действие окислителей, у-радиации, фотоокисление), что выражается в повышении их устойчивости и сохранении пролиферативной способности.

3.2.2. Роль алкилоксибензолов в адаптации микроорганизмов к неоптимальным

условиям роста_

Помимо защиты от стрессорных воздействий сублетальной и летальной интенсивности алкилоксибензолы эффективно влияют на повышение физиологической активности клеток в неоптимальных для роста условиях._

Адаптогенное действие такого типа было продемонстрировано для низкотемпературного брожения дрожжей 5. сегеушае в условиях осмотического стресса

КОЕ, %

100

80 • \

60 -

20 • -

0 1

0 2 4 6 8 10 12 Доза, Дж/см2

Рис. 14. Дозовые кривые выживаемости клеток дрожжей сеге1ч$1ае, обработанных за 30 мин до облучения (Я. = 662 нм): 1 — только хлорином еб; 2 — хлорином е6 и С7-АОБ (8 мМ); 3 - уровень, соответствующий 25% выживших клеток.

Убыль СВ, г/200 мл

2 4 6 8 10 Время брожения, сутки

(высокого осмотического давления) который создавали, повышая содержание сухих веществ в сусле до 16%, что в 1.5 раза выше, чем в обычном сусле (11%), используемом в традиционном пивоварении. В опытных вариантах инокулят инкубировали в течение 2 часов с С7-АОБ (4 мМ). Культивирование вели в микроаэробных условиях в течение 11 суток при температуре 6°С. В контрольных вариантах (без С7-АОБ) повышение плотности сусла до 16% снижало интенсивность брожения на 20%, тогда как предобработка С7-АОБ повышала интенсивность развития дрожжей на 25-30% (по урожаю на 8-11 сутки роста) по сравнению с их развитием на 11%-ном сусле (рис. 15). Аналогичное ростстимулирующее действие короткоцепочечных АОБ продемонстрировано в отношении бактерий P. fluorescens и P. aeruginosa при их развитии в неоптимальных для роста условиях. При внесении как С12-АОБ (50 мкМ), так и С7-АОБ (0.25 мМ) в среду роста урожай клеток P. fluorescens возрастал на 10% и 30%, соответственно, в условиях культивирования бактерий при заще-лочении среды (рН 9.5), когда скорость роста культуры в контроле была снижена на 80-90% по сравнению с оптимальными значениями рН (рН 5.5-7.5).

Адаптогенное действие препарата «Сидовит», разработанного нами на основе АОБ, исследовали в модели роста нефтеокисляющей бактерии Р. aeruginosa в среде М9 с ацетатом в качестве источника углерода в условиях повышенной солености, имитировавшей действие природного стрессора (рис. 16). В вариантах с содержанием в среде 1% NaCl скорость роста бактерий была снижена на 30% по сравнению с ростом в оптимальных условиях, при содержании NaCl более 5% роста не наблюдали. В опытных вариантах с внесением препарата «Сидовит» 10 мг/л наблюдали возрастание скорости роста на 62% (урожай возрастал на 40%). В условиях нормы солёности (без добавления

Рис. 15. Влияние С7-АОБ (4 мМ) на устойчивость дрожжей 5. сегеушае к осмотическому стрессу. 1 - рост на 11%-ном сусле; 2 - рост на 16%-ном сусле; 3 - как 2, но клетки инокулята прединкубированы с С7-АОБ в течение 2 ч.

Рис. 16. Влияние препарата Сидовит (10 мг/л) на скорость роста P. aeruginosa в жидкой среде М9 с ацетатом при разных концентрациях NaCl. 1- контроль, 2 - опыт.

NaCl) эти показатели в присутствии препарата АОБ также увеличивались, но в меньшей степени - на 28% и 20%, соответственно.

В другой серии экспериментов - при изменении температурного режима культивирования P. aeruginosa, скорость роста снижалась на 25% при 10°С, а при 40°С - на 50% от максимальной в контроле (при 28-30°С) (рис.17).

Таким образом, адаптоген-ный эффект АОБ при развитии микробных культур в неоптимальных условиях роста выражается в существенном повышении пролиферативной активности клеток при «дозах» стрессора (рН, солёности, температуры), приближающихся к границам толерантности для вида.

Адаптогенная эффективность препарата АОБ «Сидовит», о чём судили по возрастанию скорости роста бактериальной культуры, зависела от степени неоптимальности температуры. Она была минимальной при температурной норме роста 28°С (возрастание скорости - 17%) и увеличивалась к границам температурного диапазона роста: при 10 и 40°С, когда скорость роста в контроле была снижена на 75 и 50%, соответственно, стимуляция скорости роста составила 4055% (рис. 17).

В прикладном аспекте препараты алкилоксибензолов можно рекомендовать для повышения эффективности применения бакпрепаратов, используемых для биоремедиации почв.

3.3. Механизмы действия АОБ как адаптогенов

Говоря о механизме действия того или иного фактора или соединения, имеют в виду совокупность установленных причинно-следственных связей, объясняющих выявленный эффект через физические и химические свойства фактора (соединения) и изменения метаболизма клетки. С этих позиций рассмотрено участие алкилоксибензолов в развитии стрессового ответа микроорганизмов.

3.3.1. Функционирование алкилоксибензолов в качестве структурных модификаторов и стабилизаторов белков

Одним из основных уровней формирования стрессового ответа клеток является повышение стабильности и сохранение функциональной активности кле-

Рис. 17. Влияние препарата АОБ «Сидовит» на скорость роста P. aeruginosa в жидкой среде М9 при разных температурах. 1 - контроль (без АОБ), 2-е АОБ, 10 мг/л, 3 - эффективность препарата, повышение скорости роста, в % от контроля.

точных макромолекул и, прежде всего, ферментных белков. В работе исследовали влияние различающихся гидрофобностью гомологов С12- и С7-АОБ на стабильность и изменение каталитической активности модельных ферментов - трипсина, а- и Р-амилаз. Эффекты АОБ зависели от их структуры, концентрации и времени прединкубации с белком, необходимого для «созревания» нового конформера. В низких концентрациях гидрофобный С12-АОБ на 20-30% повышал, а в широком диапазоне более высоких концентраций - ингибировал активность ферментов (рис. 18, а). Амфифильный С7-АОБ повышал ферментативную активность во всём диапазоне испытанных концентраций (рис. 186).

Активность, % а

0 0,03 0,05 0,25 0,5 1 1,5 2 С12-АОБ, мМ

Активность, б

С7-АОБ, мМ

Рис. 18. Концентрационная зависимость и влияние продолжительности прединкубации трипсина с С12-АОБ (а) и С7-АОБ (б) на его протеолитическую активность. Время прединкубации с АОБ: 1-10 мин, 2-40 мин.

Сопряжённо с изменением активности модифицированных ферментов развивалась их устойчивость к денатурирующим воздействиям: функциональная стабильность — сохранение каталитической активности после снятия стрессорного воздействия, и операционная стабильность - сохранение активности при неоптимальных параметрах катализа (рН, температуры). Активность нестабилизирован-ного трипсина после тепловой денатурации (60°С, 10 и 20 мин) снижалась до 20 и 5%, а в комплексах с С12-АОБ сохранялось до 50% от активности фермента до термообработки (рис. 19а). Радиостабильность трипсина при у-облучении дозой 12.7 крад повышалась в комплексах с С7-АОБ (4.8-9.6 мМ) в 3.5-7 раз (рис.196). Действие С12- и С7-АОБ на амилазы имело аналогичный характер. Модификация структуры ферментов при их комплексообразовании с С7-АОБ обусловливала существенное расширение температурного и рН диапазонов активного катализа (операционная стабильность), в котором ферментативная активность была равна или превышала активность при оптимальных значениях температуры и рН в контрольных вариантах (табл. 5, рис. 20).

Показанное сопряжение повышения стабильности ферментов с ингибирова-нием их каталитической активности отмечается в подавляющем большинстве работ по энзимологии и в патентной литературе. Однако, в опытах с менее гидрофобным гомологом, С7-АОБ, нами был обнаружен необычный эффект стабилиза-

ции ферментов (например, повышения термо- и радиостабильности трипсина) одновременно с возрастанием их каталитической активности (рис. 19). Диапазон эффективных белокмодулиругощих концентраций С7-АОБ составил 0.5-13 мМ, что сопоставимо с данными, полученными в экспериментах по защите Хсегеуйше от окислительного стресса (8-13 мМ), термопротекции М. 1и1ет (8-12 мМ) и стимуляции роста Р-Аиогезсепъ в неоптимальных условиях (0.5 мМ). Отметим, что в условиях у-облучения активность трипсина в комплексах с С7-АОБ не только не снижалась, вследствие действия радиации, но даже превышала активность в контроле.

Активность, (ед.акт./мг белка)х103

□ - 1; П-2-,

0,8

0,6

тЬ---1

Ь —

0,4 0,2

1и

0 0,025 0,05 0,25 0,5 С12-АОБ, мМ

Рис. 19. Термостабильность (а) и радиостабильность (б) трипсина в комплексах с АОБ. а - время прединкубации с С12-АОБ 40 мин, длительность прогревания при 60°С: 1 (пустые столбики) — контроль без прогрева; 2 (тёмные столбики) — 10 мин; 3 (заштрихованные столбики) — 20 мин;

б - время прединкубации с АОБ 40 мин, доза у-облучения 12.7 крад: 1 (пустые столбики) -активность необлученного трипсина; 2 (заштрихованные столбики) - активность облученного трипсина; 3 - значение активности необлученного и необработанного АОБ фермента; 4 -значение активности облученного и необработанного АОБ фермента.

Таблица 5. Влияние С7-АОБ на изменение температурного и рН-диапазонов катализа

Фермент Концентрация С7-АОБ, мМ Диапазон температур, °С, * Диапазон РН,*

Трипсин 0(контроль) 45 7.8

0.8 40-55 7.0-10.5

4.8 25-65 -

а-амилаза 0(контроль) 55 6.9

0.64 44-55 5.2-7.4

1.6 23-65 5.0-7.5

(3-амилаза 0 (контроль) 40 4.8

0.64 17-54 4.3-6.7

5.6 13-57 4.0-7.1

*- В указанных диапазонах активность стабилизированных АОБ ферментов была равна или превышала значения их максимальной активности в контроле (при оптимальных значениях температуры и рН).

Различия в изменениях активности стабилизированных АОБ ферментов коррелировали с изменениями их кинетических характеристик. При взаимодействии трипсина как с С12-, так и с С7-АОБ константа Михаэлиса-Ментен незначительно снижалась (95 и 93 мМ) по сравнению с Кт контрольного варианта (100 мМ), что отражает сохранение степени сродства модифицированных ферментов к субстрату. Однако, Vmax достоверно изменялась по сравнению с контролем (2.1 мкмоль/мин*мг белка): а) на 30% снижалась при взаимодействии трипсина с 0.25 мМ С12-АОБ (1.4 мкмоль/мин*мг белка) и б) на 75% повышалась при комплексообразовании с С7-АОБ (3.2 мМ) (3.7 мкмоль/мин*мг белка).

Таким образом, в опытах in vitro показана способность химических аналогов АОБ как микробных адаптогенов в зависимости от их структуры и концентрации направленно модифицировать структуру ферментных белков, что приводит к повышению их функциональной и операционной стабильности и изменению каталитической активности в сторону как активации, так и ингибирования в зависимости от структуры АОБ.

3.3.2. Изменение физико-химических свойств белков, модифицированных алкил-

оксибензолами_

Наблюдаемые эффекты АОБ на активность и стабильность ферментов могут объясняться влиянием АОБ на физико-химические и молекулярно-динамические (структурные) свойства белков.

В экспериментах с желатином были установлены существенные изменения его вязкости и набухания в широком диапазоне рН при модификации С7- и С12-АОБ.

Минимальные значения вязкости раствора желатина в контрольном и опытных вариантах отмечены при рН 6,0, что соответствует изоэлектрической точке белка. Повышение вязкости растворов желатина наблюдалось в присутствии обоих АОБ, но в разных интервалах рН: для С7-АОБ - при значениях рН<6,0, для С12-АОБ - в областях рН 3,0-5,5 и 7,0-10,0.

С7-АОБ несколько снижал степень набухания желатина (относительно контроля) в области рН 5-6, но повышал её в при рН<4, практически не влиял на набухание белка в нейтральной и щелочной среде. С12-АОБ снижал степень набуха-

30 мин) на изменение активности (5-амилазы при различных рН. 1 - контроль (без АОБ); 2 - 0.64 мМ; 3 - 5.6 мМ.

ния желатина в слабокислой среде (рН 5-6) и существенно повышал в интервалах рН 2-4 и 7-9.

Изменения свойств белка в области рН<6 в присутствии С7- и С12-АОБ могут быть обусловлены образованием водородных связей между протежированными молекулами белка и АОБ. В области рН>7, когда образование водородных связей ингибировано, на изменение свойств белка влиял только С12-АОБ, способный к гидрофобным взаимодействиям за счет алкильного радикала.

Важным показателем изменения свойств белков является их гидрофобность. Влияние АОБ на этот показатель было исследовано на модели лизоцима. Обработка лизоцима С7-АОБ приводила к возрастанию показателя гидрофобности (ПГ) (определяемому по распределению АОБ в системе хлороформ : вода) на 25% при всех испытанных концентрациях АОБ. Более выраженное действие на изменение ПГ лизоцима оказывал С12-АОБ. В результате взаимодействия белка с С12-АОБ его гидрофобность возрастала относительно контрольного варианта до четырех раз.

Таким образом, структурная модификация белка вследствие его взаимодействия с АОБ приводит к изменениям его взаимоотношений с водой, что должно отражаться на функциональной активности белка.

3.3.3. Молекулярные механизмы действия алкилоксибензолов на белки*

Для понимания молекулярных событий, приводящих к сопряженным повышению функциональной стабильности и активности ферментов, были исследованы молекулярные механизмы взаимодействия модельного фермента лизоцима с АОБ методом Рэлеевского рассеяния Мёссбауэровского излучения (РРМИ). Этим методом определяется доля упругого рассеяния излучения (Гр, от 0 до 1), по которой судят о величине амплитуды равновесных флуктуации атомов в белке (отражающей степень активности фермента). Данные РРМИ (рис. 21) и параллельно проводимого диффузного рассеяния рентгеновских лучей (ДРРЛ) показали, что в области относительно малых концентраций С7- и С12-АОБ (десятки молекул на глобулу лизоцима), при которых возрастает активность лизоцима, существенно увеличиваются амплитуды флуктуаций атомов, особенно в присутствии С7-АОБ, ослабевают внутримолекулярные водородные связи. Макромолекула становится более «рыхлой» (ф<0.3) при меньшей степени гидратации (Ь>0.35 и 0.45 для С7- и С12-АОБ, соответственно), в отличие от нативного, немодифицированного лизоцима (рис. 21). При этом разрыхление молекулы не имеет характера денатурации, что было зафиксировано методом ДРРЛ. Очевидно, эти изменения отражают возрастание конформационной подвижности белка, что объясняет повышение активности фермента в присутствии АОБ.

Обнаруженное возрастание амплитуды флуктуаций атомов в макромолекуле фермента, хорошо согласующееся с повышением функциональной активности,

* Исследования проведены совместно с д.х.н. профессором Ю.Ф. Крупянским, (ИХФ им. H.H. Семёнова РАН), за что автор выражает ему глубокую благодарность.

не объясняет повышения функциональной стабильности модифицированных ферментов. Объяснение повышению стабильности лизоцима в присутствии АОБ было найдено при использовании результатов молекулярно-динамического компьютерного моделирования (МДКМ). Стабилизация происходит, прежде всего, за счёт нековалентного связывания молекул обоих АОБ с функциональными поверхностными группами лизоцима посредством водородных связей и кулоновских сил, а в случае С12-АОБ — и дополнительных гидрофобных взаимодействий. Согласно компьютерному моделированию системы «лизоцим-вода-АОБ», для С12-АОБ имеет место эффект «предпочтительной гидратации» белка [ХЗекко, ТцтзЬеЯ", 1981], когда несвязанные с белком молекулы АОБ располагаются во 2-3м гидрат-ных слоях, образуя за счёт слипания гидрофобных радикалов мицеллу, окружающую молекулу белка и препятствующую её разворачиванию. В результате также уменьшаются равновесные флуктуации атомов, снижается активность и стабилизируется молекула фермента. Один из возможных механизмов стабилизирующего действия С7-АОБ заключается в том, что его молекулы, не связанные с белком,

формируют так называемые «стэ-кинг-образования» типа стопок тарелок. Это не мешает функционированию фермента, а при достаточной протяжённости такие тяжи стэкингов стабилизируют макромолекулу, повышая её устойчивость к денатурирующим воздействиям.

Таким образом, шапероноподоб-ные (протекторные и белок-ста-билизирующие) и активирующие функции С7- и С12- АОБ могут быть обусловлены: их взаимодействием с макромолекулами белков посредством нековалентных связей - водородных, гидрофобных и электростатических; изменением взаимодействия макромолекул белков с водой; образованием специфических структур АОБ.

3.3.4. Функционирование алкилоксибензолов как антиоксидантов

Учитывая важную роль в стрессоустойчивости микроорганизмов системы неферментативной защиты клеточных структур от повреждающего действия АФК, образующихся при стрессорных воздействиях различной природы, были исследованы механизмы протекторного действия АОБ как антиоксидантов.

Прямое антиоксидантное действие АОБ, проявляемое в защите клеток от окислителей и излучений (раздел 3.2.1), было подтверждено определением анти-оксидантной активности С7- и С12 АОБ, которая составляла 2 и 1.5 единицы в квертициновом эквиваленте (КЭ), и 3 и 2 единицы в эквиваленте галловой кислоты (ЭГК), соответственно.

«р

Рис. 21. Зависимости доли упругого рассеяния ^р) от степени гидратации (Ь) чистого лизоцима (1) и модифицированного С7-АОБ (2) и С12-АОБ (3).

Антиоксидантное действие АОБ, как и других фенольных антиоксидантов, обусловлено их способностью к многостадийному окислению в присутствии кислорода воздуха [Рогинский, 1988; Бурлакова, 2005], что визуально детектируется как развитие розовой окраски их растворов. Исследования методом аналитической ВЭЖХ и ХМ С состава продуктов окисления С7-АОБ показали динамичные превращения нативных молекул АОБ с образованием хроматографически более «легких» и «тяжелых» фракций. Последние представляли собой конденсированные продукты окисления (бифенильные и терфенильные производные) вплоть до высокомолекулярных темноокрашенных нерастворимых полимерных соединений, более полярных, чем нативный С7-АОБ. Антиоксидантная активность окисленных продуктов АОБ составляла 115-150% КЭ и ЭГК.

Продукты окисления С7-АОБ, так же как и нативный АОБ, повышали активность ферментов, при этом эффективные концентрации окисленного С7-АОБ были ниже, чем неокисленного, и составили 8.0-12.9 мМ для трипсина и 9.6-12.9 мМ для ß-амилазы (повышение активности ферментов на 80-100%). Это свидетельствует о большей эффективности окисленных форм С7-АОБ в модификации структуры, что повышает адаптогенную активность АОБ во время стресса. Аналогичным образом, окисленные производные С12-АОБ обладали более высокой физиологической активностью, чем нативные молекулы. Это увеличивает стресспотен-цирующую активность высоких концентраций С12-АОБ (рис. 12), что было использовано при разработке способов деконтаминации материалов и консервации ряда пищевых продуктов. Окисленные формы АОБ в некоторых условиях могли проявлять прооксидантные свойства.

Таким образом, нативные АОБ и их окисленные формы являются эффективными антиоксидантами. Продукты окисления АОБ сохраняют свои свойства структурных модификаторов белков, проявляя стабилизирующие эффекты при меньших концентрациях, чем нативные АОБ, и принимая участие в клеточном ответе микроорганизмов на стрессовые воздействия.

3.3.5. Роль алкилоксибензолов в контроле экспрессии стрессовых генов_

Обнаружена способность алкилоксибензолов контролировать защитные функции микроорганизмов путем регуляции уровня экспрессии стрессовых генов. Установлена зависимость регуляторных эффектов АОБ от их структуры (длины алкильного радикала) и концентрации._

В работе использовали тестерные штаммы, сконструированные на основе бактерий Е. coli С 600 thi, thr, leu Д (pro-lac), несущих транскрипционные векторы (штаммы ит250 и os250) с гибридными оперонами umuD-lacZ и osmE-lacZ.

Роль АОБ в регуляции экспрессии генов SOS-ответа (umuD) и г/?о5-регулона стационарной фазы (osmE) изучали путем определения уровня экспрессии гибридных оперонов в соответствующих стрессовых условиях и при экзогенном внесении АОБ, оценивая активность /5-галактозидазы. В клетках тестерных штаммов при воздействии УФ-облучения (шт. ит250), приводящего к остановке роста культуры, но не снижающего численность КОЕ, или в условиях голодания (шт. os250) активность ß- галактозидазы увеличивалась в 2 раза, что свидетельствовало о реа-

лизации SOS-ответа и активации гро5-регулона. Дозозависимое (в диапазоне 50500 мкМ) действие длинноцепочечных С12-АОБ на повышение экспрессии (в 2-3 раза) стрессовых генов до такой же величины, что и при действии естественных стрессоров (УФ-облучение, голодание), свидетельствует о сигнальной функции АОБ как алармонов (сигналов тревоги) (рис. 22). Повышение уровня регуляции гена osmE (до 2 раз) в присутствии С12-АОБ (250-500 мкМ) позволяет считать его веществом, контролирующим /-роЛ'-зависимуго регуляцию и включение стационарной фазы (табл. 6). Приведенные данные позволяют сделать заключение о неспецифической активации стрессовых регулонов АОБ, реализующейся на уровне транскрипции. Подчеркнём, что речь идёт не об индукции стрессовых регулонов, а об активации (на десятки %) уже функционирующих (индуцированных) регулонов, аналогично тому, как это описано для ряда оперонов E.coli [Gutierrez et al., 1987; Ткаченко с соавт., 2009].

Таблица 6. Активность /3-галактозидазы в клетках, содержащих транскрипционный вектор с геном osmE, после действия С12-АОБ._

Концентрация С12-АОБ, мкМ Активность /3-галактозидазы, ед/мин (изменение базового уровня активности, раз) в фазу роста

Экспоненциальная Стационарная

0 1882.0(1) 2800.0(1)

5 1660.0(0.88) 2408 (0.86)

25 1675.0(0.89) 2660.0 (0.95)

50 1693.0.(0.89) 3266.0(1.16)

175 2512.0(1.33) 4049.0(1.44)

350 3636.0(1. 93) 6022.0 (2.15)

Рис. 22. Активность Р-галактозидазы в клетках Е.соИ, несущих плазмиду с гибридным опе-роном u/я«D-/дcZ, после действия УФ-облучения (к) или С12-АОБ. Серые столбики - базовый уровень активности. Цифрами обозначено изменение активности (раз), в присутствии С12-АОБ.

Действие короткоцепочечного гомолога С7-АОБ качественно отличалось от эффектов С12-АОБ: в концентрациях (80-800 мкМ) он вызывал достоверное снижение экспрессии генов обшЕ и итиИ. Прединкубация (30 мин) клеток с С7-АОБ защищала их от УФ-облучения, что фиксировалось как снижение экспрессии гена итиЭ (в 2 раза относительно контроля без облучения и в 4 раза относительно облучённых клеток) (рис. 23). Полученные результаты объясняют эффекты АОБ при

повышении их концентрации в микробной культуре при стрессах, вызванных тепловым шоком (гл. 3.1) и голоданием [Светличный с соавт., 1986; Мулюкин с со-авт., 1996].

В следующей серии экспериментов изучали регуляторное действие препарата «Сидовит» (на основе АОБ) на экспрессию стрессовых генов в ситуациях, моделирующих условия, неоптимальные для роста бактериальных культур. В опытах с Е.соН шт. оз250 в качестве стрессора использовали 1.5% ИаС1 (концентрацию, которая воспринимается этим микроорганизмом как стрессовая [Оийеп^ ^ а1., 1987] и при которой скорость роста понижена. Прединкубация (30 мин) культуры штамма 0.5250 с препаратом (25-500 мкг/мл) до внесения ЫаС1 приводила к изменению экспрессии гена озтЕ по сравнению с контрольным вариантом (без внесения АОБ). Эффекты зависели от концентрации препарата. В вариантах с предин-кубацией клеток с препаратом АОБ «Сидовит» (100-500 мкг/мл) отмечено увеличение активности /?-галактозидазы - реакция, характерная для эффекта предадап-тации (табл. 7).

Таким образом, защитные эффекты АОБ включают как протекторную компоненту (рис. 23), так и реакции предадаптации (табл. 7), что зависит от природы стрессора. Так, возникающий вследствие УФ-облучения избыток АФК нейтрализуется АОБ как ловушками этих повреждающих частиц, что обусловливает протекторный эффект АОБ. В то же время при внесении избытка ИаС1 прединкубация клеток с АОБ обеспечивает повышение адаптивной функции организма (преда-даптацию), но протекторная компонента защитного действия АОБ не выражена.

Рис. 23. Активность (3-галактозидазы в клетках Е.соН, несущих плазмиду с гибридным опероном итиО -1асг, предобработанных С7-АОБ (30 мин) а затем облучённых УФ. Серые столбики - базовый уровень активности. Цифрами обозначено изменение активности (раз) в присутствии С7-АОБ.

Анализ собственных и литературных данных позволяет предложить следующие молекулярные механизмы действия АОБ в контроле стрессового ответа клетки: 1) длинноцепочечные АОБ могут активировать экспрессию белка ЯесА (ЗОЗ-регулон), контролирующего экспрессию гена итиО, что согласуется с данными Маргулис с соавт. [2003]; 2) возможно непосредственное взаимодействие АОБ с белком ЯесА, которое приводит к его активации: модифицированный активный ЯесА связывается в вилке репликации с одноцепочечной ДНК, инактиви-

Таблица 7. Активность /3-галактозидазы в клетках Е. соЧ, содержащих репортерный ген /-роЛ'-рсгулона стационарной фазы, при действии препарата АОБ Сидовит, в условиях повышенной солености (1.5% ЫаС1), ед/мин (предадаптация с АОБ - 1ч, внесение ЫаС1 - 10 мин, постинкубация - 10 мин). В скобках - изменение активности (раз) относитель-

Концентрация препарата, мкг/мл Активность фермента ед./мин (изменение уровня экспрессии к варианту без АОБ, раз)

без ШС1 с№С1

0 5920(1.0) 6556(1.0)

25 6166 9(1.04) 6565 (1.00)

50 6730(1.13) 6586(1.00)

100 9846(1.66) 7673 (1.17)

250 10439(1.76) 7036 (1.07)

500 7981 (1.34) 5490 (0.83)

тивирует репрессорный белок ЬехА, что обуславливает активацию экспрессии ЛесА-зависимых генов БОБ-ответа [РпеёЬег§ е! а1., 1995]; 3) АОБ участвуют в ре-докс-регуляции клетки, играющей большую роль в стрессовых реакциях [Октябрьский с соавт., 2007]: с одной стороны - как низкомолекулярные антиоксидан-ты, с другой - как редокс-чувствительные эффекторы, регулирующие активность белковых факторов транскрипции [2о1оШкЫпа е1 а1., 2003].

З.З.б. Фенотипическая диссоциация как адаптивный потенциал микробной популяции_

Фенотипическая диссоциация популяции, составляющая её адаптивный потенциал, контролируется алкилоксибензолами, что проявляется как преимущественное развитие определённого варианта._

Фенотипическая диссоциация составляет адаптивный потенциал популяции, что определяется различиями диссоциантов (вариантов) в: 1) пищевых потребностях; 2) диапазоне толерантности к физико-химическим условиям среды; 3) ростовых и физиолого-биохимических характеристиках; 4) устойчивости к повреждающим воздействиям; 5) продуктивности по внеклеточным ауторегуляторам и чувствительности к ним [Милько, Егоров, 1991; Головлёв, 1998; Милько, Ники-тенко,1998; Максимов с соавт.,1999]. Адаптационная роль диссоциативных переходов выявляется при смене условий роста микроорганизмов, что особенно выражено в процессе колонизации организма-хозяина симбиотрофным (патогенным) микробным партнером или в пролонгированных неоптимальных для роста условиях, когда недоминантный диссоциант имеет возможность не только реализоваться, но и проявить в новых условиях свои физиологические и морфологические преимущества. Ранее была показана зависимость между типом покоящихся форм (ПФ) бактерий и степенью вариабельности популяционного спектра при их прорастании. Отмечено, что наибольшей нестабильностью генотипа обладают цисто-подобные покоящиеся клетки (ЦПК) [Дорошенко с соавт., 2001], образование которых контролируется алкилоксибензолами [Дуда с соавт., 1982; Мулюкин с соавт., 1996, 1997; Мулюкин, 2010].

Вопросы регуляции диссоциативных переходов рассмотрены на примере В. НсИет/огт15 (промышленного продуцента протеаз). После рассева на твердой питательной среде цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) этих бактерий, полученных в культуре доминантного Я-варианта под действием препарата С12-АОБ (2.5 мМ), в первом пассаже были выделены диссоцианты: Я (69,2%), Яя (12,8%), М (1,4%), и Б (16,6%) (суммарная доля минорных фенотипов в популяции вегетативных клеток контрольных стационарных культур не превышала 4%). Выделенные варианты были тождественны вариантам, полученным традиционным методом многократных пассажей на плотных средах [Кузнецов, 1972, 1974] и различались как морфологическими признаками, так и физиолого-биохимическими свойствами, в том числе протеолитической способностью (табл. 8).

Таблица 8. Основные физиолого-биохимические характеристики диссоциантов

В. Искеп1/опп1.ч.

■—---__- Диссоцианты Параметры ' ___ Ят 8 М

Продолжительность лаг-фазы ,ч 3 4 5 4

тах, 1 0,45 0,35 0,3 0,35

Урожай, ООмакс 2,6 1,6 1,5 1,9

Время выхода на стационар, ч 14 10 13 13

Протеолитическая активность, ед./л 0,42 0,37 1,2 0,1

Таблица 9. Основные направления диссоциации доминантного Я-варианта В. ИсИеп1/огт1$ шт. 103 при действии на

Таким образом, свойство покоящихся клеток бактерий прорастать на плотных средах гетерогенной по диссоциативному спектру популяцией колоний может быть использовано для быстрого скрининга диссоциантов, в том числе, представляющих биотехнологический интерес.

С целью возможной стабилизации определенного фенотипа было исследовано влияние С12-АОБ на диссоциативную активность культур В. \icheniformis, засеваемых эндоспорами, которые используются как ино-кулят в соответствующих микробиологических производствах.

Прединкубация (1-3 ч) эндоспор различного возраста (степени созревания) с С12-АОБ существенно влияла на индекс диссоциации развиваю-

эндоспоры инокулята С12-АОБ.

Концентрации Основные

С12-АОБ, инду- направления

цирующие диссоциацию, мМ диссоциации

3-суточные споры

0 11-11+8(73.2+6,8%)

0.25 Я->8+М (8,76%)

2.5 Я->8+М (4,11%)

5 Я->8 (1,98%)

10 Я->8 (8,3%)

7-суточные споры

0 Я->Я (85%)

0.25 И->8 (36,6%)

2.5 (31,18%)

5 Я->8 (43,2%)

10 (30,43%)

щихся на плотной среде популяций (табл. 9). Так как воздействию АОБ подвергались только споры инокулята, а культуры росли в стандартных условиях, обнаруженный эффект относится преимущественно к феномену индукции диссоциативных переходов, а не к селекции отдельных вариантов, уже имеющихся в популяции спор. Дополнительное селектирующее действие С12-АОБ было показано в опытах с его внесением в агаризованную среду для рассева эндоспор (7-сут), когда в выросшей популяции доля минорного Б-варианта составила 39.7% (табл. 10).

Можно заключить, что С12-АОБ в зависимости от его концентрации в микробной культуре и физиологического возраста клеток - реципиентов контролирует диссоциативную способность культуры, обеспечивая стабильность развития определенного фенотипа или расщепление популяции на различающиеся варианты. Селектирующее действие АОБ (продемонстрированное для В.Пскет/отгя) может быть обусловлено различиями в продуктивности АОБ и чувствительности к ним разных диссоциантов, что было показано ранее для В.сегеия [Дорошенко с соавт., 2005].

Таблица 10. Диссоциация доминантного варианта (Ят) В. ИсИем/огти 103 под действием С12-АОБ, внесённого в плотную среду роста (при рассеве на индекс диссоциации). Посев 7-суточными спорами._'

С12-АОБ, мкМ КОЕхЮ7/мл Индекс диссоциации на колониально-морфологические варианты, %

Яш М Б

Контроль 8.4±1.6 81.2 2.4 2.3 4.1

25 5.8±1.1 59 1.3 0 39.7

50 3.4±0.6 72.6 5.1 1.3 21

Возможны следующие механизмы действия С12-АОБ в регуляции фенотипи-ческой диссоциации бактерий: 1) действие АОБ как структурных модификаторов белков, участвующих во внутригеномных перестройках и функционирующих на уровне образования транскриптов; 2) непосредственное взаимодействие с ДНК [КотиЪек, Тушап, 1999; Давыдова с соавт., 2005; 2006], обусловливающее модификацию генетического материала (в тесте Эймса нами была показана мутагенная активность С12-АОБ), что согласуется с данными [Маргулис с соавт., 2002] и позволяет рассматривать длинноцепочечные АОБ как эндогенные мутагены, которые могут индуцировать обратимые перестройки генетического материала.

Глава 4. Практическая значимость полученных результатов

Практическая значимость результатов, полученных в ходе выполнения работы определяется: 1) получением новых знаний фундаментального характера о регуляции и механизмах адаптивных реакций микроорганизмов, которые используются в курсе «Промышленная микробиология», читаемом на кафедре микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова и включены в учебное пособие «Основы динамической биохимии» [Плакунов, Николаев, 2010]); 2) использованием выявленных закономерностей регуляции адаптивных реакций микроорганизмов для совершенствования существующих и создания новых технологий (биотехнологий),

основанных на использовании ферментов, микроорганизмов и сельскохозяйственных растений; 3) показанной эффективностью применения химических препаратов, созданных на основе АОБ, как модификаторов белков, антимикробных агентов, регуляторов микробной диссоциации и стабилизаторов микробных препаратов

По результатам работы созданы серия биоцидных препаратов ИНМИОЛ, предназначенных для защиты материалов (в т.ч., нефтепродуктов) от биодеградации и серия препаратов СИДОВИТ для обработки семян и посевов с целью защиты от фитопатогенной микрофлоры, повышения урожайности, всхожести, лёжко-сти зерна и его технологических свойств (для приготовления солода). Препараты ИНМИОЛ и СИДОВИТ успешно испытаны в полевых и производственных условиях, что подтверждено соответствующими актами: Института «ТатНИПИнефть» (применение препарата ИНМИОЛ привело к подавлению микробной активности и к замедлению скорости биокоррозии стали на 75%); ООО «Ибредьсолод» и ЗАО «Вороновский завод по производству солода» (применение препарата «Сидовит» существенно улучшило качество пивоваренного солода); ООО «Зерноком-Денисово» (обработка посевов ячменя препаратом «Сидовит» обеспечила увеличение урожая зерна на 3 ц/га (10%) с одновременной защитой растений от поражения фитопатогенными грибами); ООО «Новые технологии» (применение препарата «Сидовит» позволило сохранить до 100% урожая яблок при их хранении в течение 5 мес, тогда как в контрольном варианте сохранилось 15% урожая).

Полученные в работе результаты могут быть использованы для разработки: а) приёмов направленной регуляции роста промышленных штаммов и сообществ микроорганизмов, повышения их продуктивности; б) способов антиоксидантной защиты про- и эукариотных организмов; в) методов борьбы с микробной контаминацией и биообрастаниями; г) препаратов и способов модуляции активности ферментов; д) антимикробных препаратов медицинского назначения.

Высокий потенциал практического применения препаратов на основе АОБ отражен в двух патентах и 4 заявках на патенты РФ. Патент № 2006146075 от 26.12.2006 описывает способ получения засевных дрожжей, повышения качества солода и пива; патент № 2400069 от 11.06.2009 и заявка на изобретение № 2009109569 от 17.03.2009 описывают способы защиты материалов от микробного разрушения, основанные на применении новых препаратов на основе природных АОБ и их производных; заявка на изобретение № 2009134293 от 15.09.2009 описывает способ получения биологически активного компонента для ухода за кожей; заявки на изобретение № 2010108915 от 11.03.2010 и № 2010108916 от 11.03.2010 описывают способы направленного изменения активности и стабильности ферментных белков. Все заявки проходят экспертизу по существу.

Экономический эффект от применения препаратов на основе АОБ в масштабах России может составить около 30 млрд. рублей в год.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа развивалась по этапам логического пути, свойственного для исследования внеклеточных ауторегуляторов: 1) выявление биологических функций новых ВА или новых свойств у ранее известных ауторегуляторов с использованием биотестов; 2) химическая идентификация внеклеточных адаптоге-нов, описанных на основании биотестов; 3) исследование механизмов действия адаптогенов с использованием химически чистых адаптогенов или их аналогов.

Полученные в работе данные продемонстрировали способность микроорганизмов различных таксономических групп в процессе развития их культур продуцировать внеклеточные адаптогены, способствующие их приспособлению к стрес-сорным воздействиям разной природы, как «запрограммированным» в цикле развития микробных культур (голоданию, смене среды роста), так и «незапрограмми-рованным» (термальному, окислительному, осмотическому, токсическому) разной интенсивности: рост-замедляющей, рост-прекращающей, летальной. ВА представлены соединениями разных классов - насыщенными углеводородами, липоцикло-пептидами, алкилоксибензолами, белками и др. На основании биотестов были определены механизмы действия ВА и условия, при которых они проявляют своё действие: адаптогены-протекторы и нейтрализующего действия, а также эффекторы (например, регуляторы адгезии) эффективны при стрессорных воздействиях, приводящих к замедлению роста; регуляторы - индукторы стрессового ответа и стрессовых белков включаются на границах толерантности для вида, т.е. в рост-останавливающих условиях; при условиях, выходящих за пределы ростовых, т.е. при начинающейся гибели клеток, проявляются биологические функции регуляторов, контролирующих образование покоящихся форм и фенотипическую диссоциацию.

ВА являются биологически активными веществами надвидового уровня действия, поэтому показанная видонеспецифичность действия ВА обеспечивает их адаптогенные функции на уровне сообществ.

Следует отметить ВА нового типа, антиадгезины, которые были впервые описаны феноменологически, а затем выделены и идентифицированы как н-алканы и протеазы у псевдомонады и липоциклопептиды у бацилл. Обратимая адгезия клеток усиливается в неоптимальных условиях роста и при перенесении в новую среду, при этом клетки приобретают повышенную стрессоустойчивость. Описание природы, свойств и функций антиадгезинов важны для развития исследований колониального и биоплёночного роста бактерий, типичных в природных условиях, включая возможности регуляции биоплёночного развития патогенов.

Для одного из ВА, алкилоксибензолов, защищающего клетки микроорганизмов от стрессорных воздействий различной природы (термального, радиационного, окислительного), исследованы механизмы протекторного действия на молекулярном, клеточном и популяционном уровнях. Адаптогенные эффекты АОБ зависят от их структуры и концентрации. Механизм протекторного действия АОБ на молекулярном уровне включает пост-трансляционную модификацию белков, перехват активных форм кислорода (АФК), на клеточном уровне - регуляцию защитных систем клетки, включая активацию экспрессии генов стрессовых регуло-

нов; на популяционном уровне АОБ контролируют диссоциативный спектр популяции.

Связывание АОБ с ферментными белками приводит к изменению их каталитической активности и повышению стабильности. Короткоцепочечные АОБ повышают активность ферментов в широком диапазоне концентраций, а длинноце-почечные - при низких концентрациях повышают активность, а при более высоких - ингибируют её. Повышение каталитической активности определяется повышением конформационной (междоменной) подвижности модифицированной молекулы фермента.

АОБ являются эффективными антиоксидантами, способными к многостадийному окислению. Продукты окисления также проявляют антиоксидантные свойства и способны к модификации активности и стабильности белков, причём являются более активными, чем исходные АОБ.

Длинноцепочечные АОБ активируют стрессовые регулоны, что повышает стрессоустойчивость клеток, а также влияют на популяционный спектр бактериальных культур, что способствует реализации их адаптивного потенциала в условиях действия стрессоров и новой среды.

Полученные результаты существенно расширяют современные знания о биологии микроорганизмов в области саморегуляции стрессового ответа и приспособления микробных популяций к новым или неблагоприятным условиям окружения. Сформировано представление о внеклеточных адаптогенах, как о биологически активных веществах, функцией которых является контроль адаптации микробной популяции к неблагоприятным факторам окружающей среды или новым условиям роста. Основной фундаментальный вывод работы: «Микроорганизмы обладают специфической системой ауторегуляции адаптации к неблагоприятным факторам среды разной природы и интенсивности. Эта система включает внеклеточные метаболиты разной природы, оказывающие адаптогенное действие на молекулярном, клеточном и популяционном уровнях».

Работа планируется быть продолженной в направлениях: а) расширения спектра внеклеточных адаптогенов - на основе их поиска с применением новых биотестов; путём выявления адаптогенных функций у уже описанных ауторегуля-торов; идентификации ранее описанных, но не выделенных ауторегуляторов; б) исследования роли низкомолекулярных соединений в регуляции активности макромолекул (нуклеиновых кислот, белков) и молекулярно-физических основ этой регуляции; в) исследования роли воды в регуляции активности живых систем и возможности целенаправленного управления этим процессом.

Выводы

1. Установлено, что в стрессовых условиях микроорганизмы как про-, так и эука-риоты (в частности, представители pp. Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas, Escherichia, Candida) синтезируют внеклеточные метаболиты, способствующие адаптации микроорганизмов к тому же самому или другим типам стрессорных воздействий. Внеклеточные адаптогены имеют видонеспецифичный и дозозави-

симый характер действия и представлены соединениями различной химической природы с различными механизмами действия.

2. Синтез внеклеточных адаптогенов стимулируется стрессорными воздействиями разной природы и разной интенсивности, как запланированными в цикле развития культур (стресс новой среды), так и неблагоприятными факторами окружающей среды (воздействием токсикантов, экстремальными значениями температуры, рН, солёности и др.).

3. Доказана адаптогенная функция обратимой адгезии как ответа планктонных популяций бактерий на стресс новой среды и условия, не благоприятствующие росту (повышенные температура, концентрации №С1, Са2+ и др.). В состоянии обратимой адгезии микроорганизмы более устойчивы к стрессорным воздействиям.

4. Обнаружен новый тип внеклеточных адаптогенов бактерий - ингибиторы бактериальной адгезии, которые концентрационно регулируют как стадию прилипания клеток к поверхности, так и стадию обратного их перехода к планктонному существованию. Антиадгезины идентифицированы как липоциклопептиды (у В.Искет/огтгя), а также смесь н-алканов (С21-С33) и белков с протеолитической активностью (у Р./1иогевсепх).

5. Установлено, что микробные алкилоксибензолы могут обладать функциями адаптогенов, защитные эффекты которых при стрессорных воздействиях и в зависимости от их химической структуры и концентрации реализуются как: (1) протекция микроорганизмов от повреждающих воздействий (короткоцепочеч-ные алкилоксибензолы) или (2) сигнал для мобилизации защитных ресурсов клетки (длинноцепочечные алкилоксибензолы). Выявлено адаптогенное действие короткоцепочечных алкилоксибензолов при развитии культур микроорганизмов в неоптимальных для роста условиях. Адаптогенный эффект АОБ максимально выражен при дозах стрессора (рН, соленость), приближающихся к границам толерантности для вида.

6. Установлена способность АОБ в зависимости от их структуры и концентрации направленно модифицировать структуру ферментных белков, что обусловливает стимуляцию или ингибирование каталитической активности одновременно с повышением их функциональной и операционной стабильности.

7. Обнаружена способность АОБ в зависимости от их структуры регулировать экспрессию стрессовых генов - БОБ-ответа и гро5-регулона стационарной фазы, обусловливая протекторный эффект (короткоцепочечные АОБ) или функционируя как сигналы тревоги (длинноцепочечные АОБ) для реализации защитных ресурсов клеток, активируя экспрессию стрессовых генов.

8. Установлена способность длинноцепочечных АОБ концентрационно контролировать диссоциативную способность бактериальных культур, составляющую адаптивный потенциал популяции, обеспечивая стабильность развития определенного варианта или индуцируя диссоциативные переходы.

Публикации по теме работы

Экспериментальные статьи

1. Николаев Ю.А. Защитное влияние тетрациклинчувствительного штамма Escherichia coli на рост тетрациклин-устойчивого штамма в присутствии тетрациклина при совместном культивировании. // Микробиология. 1996. Т. 65, Вып. 6. С. 759-763.

2. Николаев Ю.А. Множественный защитный эффект экзометаболита (экзометаболитов), выделяемого Escherichia coli при обработке тетрациклином. // Микробиология. 1996. Т.65. Вып.6, С. 764-768.

3. Николаев Ю.А. Участие внеклеточных метаболитов в адаптации Escherichia coli к стрессам. //Микробиология, 1997, Т. 66, Вып. 1, С.38-41.

4. Николаев Ю.А. Обнаружение двух новых внеклеточных адаптогенных факторов у Escherichia coli К-12. // Микробиология, 1997. Т. 66, Вып. 6, С. 785-789.

5. Николаев Ю.А. Сравнительное изучение свойств двух внеклеточных протекторов, выделяемых Escherichia coli при повышенной температуре. //Микробиология. 1997. Т. 66, Вып. 6, С. 790-795.

6. Николаев Ю.А., Воронина H.A. Перекрестное действие внеклеточных факторов адаптации к стрессу у микроорганизмов. // Микробиология, 1999. Т. 68. № 1. С. 45-50.

7. Николаев Ю.А., Проссер Дж. И. Внеклеточные факторы, влияющие на адгезию Pseudomonas ßuorescens на стекле. // Микробиология, 2000. Т. 69 . № 2. С. 231-236 .

8. Николаев Ю.А., Проссер Дж. И. Свойства адгезина и антиадгезина Pseudomonas ßuorescens. II Микробиология, 2000. Т. 69. No 2. С. 237-242 .

9. Николаев Ю.А., Милько Е.С. Адгезивные и ростовые свойства R- и S-диссоциантов Pseudomonas ßuorescens. II Микробиология, 2000. Т. 69. № 2. С. 293-294 .

10. Николаев Ю.А., Проссер Дж. И., Виттли Р.И. Регуляция прилипания клеток Pseudomonas ßuorescens к стеклу летучими соединениями, выделяемыми культурой. // Микробиология, 2000. Т.69 № 3. С. 352-355.

11. Николаев Ю.А., Проссер Дж. И. и Паников Н.С. Внеклеточные факторы адаптации к неблагоприятным условиям среды в периодической культуре Pseudomonas ßuorescens. II Микробиология, 2000. Т.69 . № 5. С. 629-635.

12. Николаев Ю.А., Паников Н.С., Лукин С.М., Осипов Г.А. Насыщенные С21-С33 углеводороды - авторегуляторы адгезии Pseudomonas ßuorescens на стекле. // Микробиология, 2001. Т. 70. №2. С. 174-181.

13. Паников Н.С. и Николаев Ю.А. Рост и адгезия Pseudomonas ßuorescens в периодической культуре: кинетический анализ действия внеклеточных антиадгезинов. // Микробиология, 2002. Т. 71. № 5. С. 619-628.

14. Николаев Ю.А., Паников Н.С. Внеклеточная протеаза как регулятор адгезии Pseudomonas ßuorescens.ИМтиро5иолотш,2002."С.1\ .№ 5. С.629-634.

15. S.G. Batrakov, Т.А. Rodionova, S.E. Esipov, N.B. Polyakov, V.l. Sheichenko, N.V. Shek-hovtsova, S.M. Lukin, N.S. Panikov, Yu.A. Nikolaev. A novel lipopeptide, an inhibitor of bacterial adhesion, from the thermophilic and halotolerant subsurface Bacillus licheniformis 603.//Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids, 2003, V.1634, Iss. 3,P. 107-115.

16. Родионова Т.А., Шеховцова Н.В., Паников Н.С. и Николаев Ю.А. Рост и адгезия Bacillus licheniformis в зависимости от условий культивирования.// Микробиология. 2003. Т. 72. №4. С. 521-527.

17. Степаненко И.Ю., Страховская М.Г., Беленикина Н.С., Николаев Ю.А., Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Ревина A.A., Эль-Регистан Г.И. Защита Saccharomyces cerevisiae алкилок-сибензолами от окислительного и радиационного поражения. И Микробиология 2004. Т. 73. №2. С. 204-210.

18. Родионова Т.А., Николаев Ю.А. Защитное действие обратимой адгезии термофильной бактерии Bacillus licheniformis 603 от N-этилмалеимида. // Микробиология. 2004. Т. 73. №6. С. 133-134.

19. Степаненко И.Ю., Мулюкин A.JI., Козлова А.Н., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Роль алкилоксибензолов в адаптации Micrococcus luteus к температурному шоку. // Микробиология. 2005. Т. 74. № 1. С. 26-33.

20. El-Registan G.I., Mulyukin A.L., Nikolaev Y.A., Stepanenko I.Y., Kozlova A.N., Martirosova, E.I., Shanenko E.F., Strakhovskaya M.G., Revina A.A. The role of microbial low-molecular-weight autoregulatory factors (alkylhydroxybenzenes) in resistance of microorganisms to radiation and heat shock. // J. Adv. Space Res. 2005. V. 36, Iss. 9, P. 1718-1728.

21. Милько E.C., Хабибуллин C.C., Николаев Ю.А., Козлова А.Н., Эль-Регистан Г.И. Динамика роста и состава популяций смешанных культур R-, S- и М-диссоциантов Pseudomonas aeruginosa. // Микробиология. 2005. Т. 74. № 4. С. 475-482.

22. Хабибуллин С.С., Николаев Ю.А., Лойко Н.Г., Голод H.A., Милько Е.С., Воейкова Т.А., Эль-Регистан Г.И. Ауторегуляция фенотипической диссоциации у Bacillus licheniformis. Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиологии. 2006. № 6. С. 9-13.

23. Suzina N.E., Mulyukin A.L., Dmirtiev V.V., NikolaevY.A., ShorokhovaA.P., Bobkova Y.S., BarinovaE.S., PlakunovV.K., El-RegistanG.I., Duda V.l. The structural bases of long-term anabiosis in non-spore-forming bacteria. Adv.SpaceRes.2006.V.38.P. 1209-1219.

24. Мартиросова Е.И., Николаев Ю.А., Шаненко Е.Ф., Крупянский Ю.Ф., Лойко Н.Г., Эль-Регистан Г.И. Использование алкилоксибензолов для повышения активности и стабильности ферментов// Химическая технология. 2007. № 6. С. 250-256.

25. Конаныхина И.А., Шаненко Е.Ф., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Разработка способов защиты пивоваренных дрожжей от теплового шока // Пиво и напитки. 2007. № 1. С. 18-19.

26. Конаныхина И.А., Шаненко Е.Ф., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Разработка способов защиты пивоваренных дрожжей от осмотического стресса.// Хранение и переработка сельхозсырья. 2007. № 3. С. 40-41.

27. Конаныхина И.А., Шаненко Е.Ф., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Стабилизация дрожжей Saccharomyces cerevisiae. // Хранение и переработка сельхозсырья. 2007. № 8. С. 44-45.

28. Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Эль-Регистан Г.И., Николаев Ю.А., Ненова C.B., Молостов Е.В., Кириллов Д.А. Влияние химического аналога внеклеточных микробных авторегуляторов на антилизоцимную активность бактерий.//Журн. микробиол., эпидемиол., им-мунобиол. 2007. № 6. С. 3-6.

29. Николаев Ю.А., Плакунов В.К., Воронина H.A., Немцева Н.В., Плотников А.О., Гоголева O.A., Муравьева М.Е., Овечкина Г.В. Влияние бактерий-спутников на рост Chlamydomonas reinhardtii в альго-бактериальном сообществе // Микробиология. 2008. Т. 77. № 1.С. 89-95.

30. Николаев Ю.А., Лойко Н.Г., Степаненко И.Ю., Шаненко Е.Ф., Мартиросова Е.И., Плакунов В.К., Козлова А.Н., Борзенков И.А., Коротина O.A., Родин Д.С., Крупянский Ю.Ф., Эль-Регистан Г.И. Изменение физико-химических свойств белков, модифицированных алкилоксибензолами // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т. 44. № 2. С. 159167.

31. Конаныхина И.А., Шаненко Е.Ф., Лойко Н.Г., Николаев Ю.А.,Эль-Регистан Г.И. Регулирующее действие микробных АОБ различной структуры на стрессовый ответ дрож-жей.//Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т. 44, № 5, с. 571-575.

32. Петровский A.C., Дерябин Д.Г., Лойко Н.Г., Михайленко H.A., Кобзева Т.Г., Канаев П.А., Николаев Ю.А., Крупянский Ю.Ф., Козлова А.Н., Эль-Регистан Г.И. Регуляция ал-

килоксибензолами функциональной активности лизоцима // Микробиология. 2009. Т. 78. №2. С. 176-185.

33. Голод H.A., Лойко Н.Г., Лобанов К.В., Миронов A.C., Воейкова Т.А., Гальченко В.Ф., Николаев Ю.А. Эль-Регистан Г.И. Роль микробных ауторегуляторов - алкилоксибензо-лов в контроле экспрессии стрессовых регулонов // Микробиология. 2009. Т. 78. № 6. С. 731-741.

34. Николаев Ю.А., Борзенков И.А., Калинин М.В., Воронина Н.В., Тарасов А.Л., Плакунов В.К., Беляев С.С., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Антимикробные свойства феноль-ных липидов. Прикладная биохимия и микробиол. 2010. Т. 46. №2. С. 172-179.

35. Николаев Ю.А., Тарасов А.Л., Борзенков И.А., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Роль алкилоксибензолов в адаптации бактерий к неблагоприятным условиям роста// Микробиология. 2010. Т. 79. №6. С. 760-766.

Обзоры

1. Николаев Ю.А. Внеклеточные факторы адаптации бактерий к неблагоприятным условиям среды. // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т.40. № 4. С.387-397.

2. Николаев Ю.А., Мулюкин А.Л., Степаненко И.Ю., Эль-Регистан Г.И. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 489-496.

3. Эль-Регистан Г.И., Мулюкин А.Л., Николаев Ю.А., Сузина Н.Е., Гальченко В.Ф., Дуда В.И. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов // Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 446-456.

4. Николаев Ю.А., Плакунов В.К. Биопленка-«город микробов» или аналог многоклеточного организма?//Микробиология. 2007.Т.76. № 2. С. 149-163.

5. Плакунов В.К., Николаев Ю.А. Микробные биопленки - перспективное направление современной биотехнологии // Вода: химия и экология. 2008. № 2. С. 11-13.

Учебное пособие

1. Плакунов В.К., Николаев Ю.А. Основы динамической биохимии. М. Логос, 2010.

Изобретения

1. RU № 02329300 от 26.12.2006. Способ получения засевных дрожжей. Конаныхина И.А., Шаненко Е.Ф., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И.

2. RU № 2400069 от 11.06.2009. Способ защиты материалов от микробного разрушения. Эль-Регистан Г.И., Николаев Ю.А., Калинин М.В., Гальченко В.Ф., Борзенков И.А., Козлова А.Н., Мулюкин А.Л., Гернет М.В., Шаненко Е.Ф., Воронина H.A., Кочеткова A.A., Шатилова Т.И.

Заявки на изобретение

1. № 2009109569 от 17.03.2009. Способ защиты материалов от микробного разрушения, Эль-Регистан Г.И., Николаев Ю.А., Калинин М.В., Гальченко В.Ф., Борзенков И.А., Козлова А.Н., Мулюкин А.Л., Гернет М.В., Шаненко Е.Ф., Воронина H.A., Кочеткова A.A.

2. № 2009134293 от 15.09.2009, Способ получения биологически активного компонента для средства, предназначенного для ухода за кожей и компонент, полученный этим способом. Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И.

3. № 2010108915 от 11.03.2010, Способ направленного изменения активности ферментных белков, Эль-Регистан Г.И., Николаев Ю.А., Калинин М.В., Гальченко В.Ф., Гернет М.В., Шаненко Е.Ф., Лойко Н.Г., Дерябин Д.Г., Головлёва Л.А., Соляникова И.П., Мартиросо-ва Е.И.

4. № 2010108916 от 11.03.2010, Стабилизатор ферментных белков Эль-Регистан Г.И., Николаев Ю.А., Калинин М.В., Гернет М.В., Шаненко Е.Ф., Лойко Н.Г.

Тезисы конференций

1. Rodionova Т.A., Nikolaev Yu.A., Shekhovtsova N.V., Panikov N.S. Reversible adhesion of Bacillus licheniformis is an active adaptive response to unfavourable growth conditions// Int. Symp. on Bacteriology and Appl. Microbiology, Paris, 2002.

2. Rodionova T.A., Shekhovtsova N.V., Panikov N.S., Ryzhikova I.A., Turova T.P., Nikolaev Y.A. Isolation and identification of microorganisms which are primary colonizators of solid surfaces in parametrical borehole// Int. Symp. on Subsurface Microbiology, Copenhagen, 2002. P. 51.

3. Степаненко И.Ю., Шишкина М.Л., Мартиросова Е.И., Шаиенко Е.Ф., Витол И.С., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Механизм действия алкилоксибензолов на физико-химические свойства белков. // В сб. докладов всероссийской научно-технической конференции-выставки «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства их реализации». Москва. 2003. С. 195-199.

4. Эль-Регистан Г.И., Крылов И.А., Николаев Ю.А., Шаненко Е.Ф., Воейкова Т.А., Ревина А.А., Мулюкин А.Л. Роль алкилоксибензолов в стрессоустойчивости микроорганизмов и перспективы их использования для биотехнологии // Материалы 2го Московского Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. 10-14 ноября 2003. С. 266.

5. El-Registan G.I., Mulyukin A.L., Nikolaev Yu.A., Stepanenko I.Yu., Shanenko E.F., Strakhovskaya M.G., Revina A.A. The role of microbial low-molecular-weight autoregulatory factors (alkylhydroxybenzenes) in resistance of microorganisms to radiation. // Abstract 35th CO-SPAR Scientific assembly. Paris, France. 2004. http//www. cosis. net./abstract/COSPAR04/00353/ COSPAR04-A-00353-1 .pdf.

6. Эль-Регистан Г.И., Николаев Ю.А., Степаненко И.Ю., Мулюкин A.JI., Мартиросова Е.И., Шаненко Е.Ф. Роль алкилоксибензолов в стрессоустойчивости клеток микроорганизмов и механизмы их протекторного действия //Вторая международная конференция «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал. Пермь-Казань-Пермь. 2005. С. 108-109.

7. Мартиросова Е.И., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Использование алкилоксибензолов в процессах повышения активности стабильности ферментов //Всероссийская молодёжная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва. 2005. С. 96-97.

8. Крупянский Ю.Ф., Ещенко Г.В., Михайлюк М.Г., Есин С.В., Коротина О.А., Окишева Е.А., Родин Д.С., Нокс П.П., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Структурно-динамичесие характеристики белков: влияние гидратации и химических шаперонов. Тезисы докладов Пятой Национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования наноматериалов и наносистем. Москва, 2005. с.60.

9. Krupyanskii Yu.F., Mikhailyuk M.G., Esin S.V., Korotina O.A., Okisheva E.A., Knox P.P., Nikolaev Yu.A., El - Registan G. I. Effects of hydration and interactions with chemical chaperones on protein dynamics. European Biophysics J. V.34, № 6, 2005, p.615.

10. Ю.Ф.Крупянский, О.А.Коротина, Н.Г.Лойко, Ю.А.Николаев, Д.С.Родин, Г.И.Эль-Регистан Изучение механизма поспрансляционной модификации белков // Материалы третьей научно-практической конференции "МЕДБИОТЕК". Москва. 2006. С. 51.

11. Ю.Ф. Крупянский, Коротина О.А., Есин С.В., Михайлюк М.Г., Родин Д.С., Дембо К.А., Волков В.В. Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Эффекты взаимодействия химических шаперонов с ферментами: изменение структуры, динамики и функциональной активности // Тезисы докладов VI национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов. Москва. 2007. С. 46.

12. Голод Н.А., Лойко Н.Г., Козлова А.Н., Николаев Ю.А. Популяционная вариабельность молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus АТ-41 и Lactococcus lactis ТБ-2 //Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем». 25-27 сентября 2007. Саратов. С. 45.

13. Голод Н.А., Лойко Н.Г., Козлова А.Н., Николаев Ю.А. Дунин Д.А., Нематов А.Л.,Эль-Регистан Г.И. Популяционная вариабельность молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus АТ-41 и Lactococcus lactis ТБ-2 // Материалы Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты». 11-13 мая. Москва. 2008. С. 80.

Формат 60x90/16. Заказ 991. Тираж 100 экз. Подписано в печать 08.02.2011 г.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Николаев, Юрий Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Определения - типы стрессов и стрессоры.

1.1 Признаки стресса у микроорганизмов.

1.2 Типы стрессоров (по способам поражения клетки).

2. Типы ответов микроорганизмов на стрессорные воздействия.

3. Механизмы и уровни адаптации.

3.1. Химический уровень.

3.2. Молекулярно-биологический и биохимический уровень.

3.2.1. Роль гроБ-регулона в защите клеток от стрессоров разной природы.

3.2.2. Роль белков теплового шока в защите от стрессоров разной природы.

3.2.3. Изменения на биохимическом уровне.

3.3. Клеточный уровень.

3.3.1. Образование покоящихся форм как экстремальный ответ на стрессорные воздействия.

3.3.2. Персистеры.

3.4. Популяционный уровень.

3.4.1. Явление диссоциации.

3.4.2. Биоплёнки.-.

3.5. Фазы и продолжительность адаптации.

4. Адаптации микроорганизмов к конкретным стрессорам.

4.1. Окислительный стресс.

4.2. Тепловой стресс (гипертермия).

4.3. Холодовой стресс.

4.4. Стресс голодания (истощения питательных веществ).

4.5. Осмотический стресс и повышенная солёность.

4.6. Воздействие нескольких стрессоров.

5. Коммуникация и стресс.

5.1. Феноменология и значение коммуникации.

5.2. Механический способ передачи информации.

5.3. Физический способ передачи информации.

5.4. Химический способ передачи информации (химическая коммуникация).

5.4.1. Ауторегуляторы развития миксобактерий.

5.4.2. Ауторегуляторы цитодифференцировки и синтеза вторичных метаболитов стрептомицетов. .

5.4.3. Плотностные регуляторы.

5.4.4. Двухкомпонеитные сигнальные системы.

5.4.5. Ауторегуляция стационарныхрегулонов грамполоэ/сительных бактерий.

5.4.6. Ауторегуляторные факторы й} и с12роста и клеточной дифференцировки микроорганизмов.

5.4.7. Ауторегуляторы адаптации к неблагоприятным условиям роста.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов"

Актуальность. Проблема адаптации организмов к изменяющимся условиям окружения является одной из центральных в биологии. Наибольшей приспособляемостью к флук-туациям окружающей среды обладают микроорганизмы, исследованиям механизмов адаптации которых посвящено множество оригинальных работ и обзорных материалов [Хочачка, Сомеро, 1988; Henge-Aronis, 1993; Феофилова, 2003]. Основное внимание уделяется внутриклеточным событиям формирования стрессового ответа: экспрессии генов стрессовых регу-лонов (rpoS, oxyR, SOS-ответа, и др.) [Matin 1992; Hengge-Aronis and Loewen, 1994; Бут, 2005], биосинтезу ферментов, пигментов и метаболитов антиоксидантной защиты клетки [Davies, 1987; Меденцев с соавт., 2005; Октябрьский, Смирнова, 2007], механизмам репарации и стабилизации ДНК [Martinez, Kolter, 1997; Farewell et al., 1998; Головлёв, 1999], изменению в составе дыхательной цепи [Акименко, 1995; Меденцев с соавт., 1999; Jean et al., 2004; Бирюкова с соавт., 2008, 2009] переключению метаболических потоков на синтез стрессовых липидов, углеводов и белков, прежде всего «молекулярных шаперонов», контролирующих фолдинг и стабилизирующих макромолекулы белков [Меденцев с соавт., 2001; Causton et al., 2001; Феофилова, 1992, 2003; Головлев, 2003; Мельников, Ротанова, 2010].

С другой стороны, в последнее время получило признание представление о популяции микроорганизмов как о своеобразной многоклеточной системе, сущностным свойством которой является взаимодействие отдельных клеток, когда их согласованная деятельность направлена на достижение общего результата [Shapiro, Dworkin, 1997; Олескин с соавт., 2000; Волошин, Капрельянц, 2004]. Описан целый ряд примеров популяционного поведения, контролируемого низкомолекулярными внеклеточными микробными метаболитами-ауторегуляторалш (АР) [Aaronson, 1981]. Под внеклеточными ауторегуляторами понимают метаболиты, которые образуются всеми или частью клеток популяции, выделяются в окружающую среду и воздействуют на клетки популяции, вызывая их качественные изменения [Stephens, 1986; Хохлов, 1988]. Ауторегуляторы контролируют важные жизненные явления у микроорганизмов: биолюминесценцию у светящихся бактерий [Fuqua et al., 1994; Visick, McFall-Ngai, 2000]; морфогенез и продукцию антибиотиков у стрептомицетов [Хохлов, 1988]; синтез факторов вирулентности патогенными бактериями [Whiteley et al., 1999; Бухарин с соавт. 2005]; роение (swarming) бактерий [Shapiro, Dworkin, 1997]; автолиз, образование и прорастание покоящихся форм [Хохлов, 1988; Wirth et al., 1996; Dworkin, 1996; Sudo et al., 1997; Kaprelyants et al., 1999; Эль-Регистан с соавт., 1983; 1998; 2005]. Достижения в этой области биологии бактерий, сформировавшейся в самостоятельное направление — химическую экологию, отражены в ряде обзоров и монографий [Aaronson, 1981; Хохлов, 1988;

Shapiro, Dworkin, 1997; Барбье, 1987; Shapiro et al., 1997, 1998; Kaprelyantz et. al., 1999, 2005; Бухарин с соавт., 2005]. В исследовании АР выделяют три этапа: первый - их обнаружение в биотестах, специально разрабатываемых для каждого случая [Aaronson, 1981]. На этом этапе, как правило, используют культуральные жидкости, вытяжки из клеток и подобные субстанции. Разработка нового биотеста может приводить к обнаружению новых АР. На втором этапе производят выделение и идентификацию химических соединений, ответственных за биологические эффекты АР. На последнем этапе исследуют механизмы действия идентифицированных ауторегуляторов.

К началу диссертационной работы (начало 1990х годов) лишь некоторые коллективы выполняли исследования, посвященные участию внеклеточных адаптогенов (ВА) в приспособлении бактерий к неблагоприятным условиям. Исследования ВА, как правило, не носили систематического характера. Вместе с тем адаптивный потенциал микроорганизмов, занимающих все возможные экологические ниши, предполагает наличие ауторегуляторного контроля систем адаптации к изменениям окружающих условий. Известны следующие внеклеточные ауторегуляторы, участвующие в развитии адаптивных реакций микроорганизмов: гомосеринлактоны и производные тетрагидрофурана некоторых морских вибрионов, способствуйте их адаптации к голоданию и ряду стрессоров [Srinivasan et al., 1998; McDougald et al., 2003; Mostertz et al., 2004; Krin et al., 2006]; протекторы белковой природы y Escherihia coli [Rowbury, Goodson, 2001]; осмопротекторы, содержащиеся в лизатах клеток галобакте-рий [Кокоева, Плакунов, 1993]; антимутагены молочнокислых бактерий белковой и небелковой природы [Воробьёва с соавт., 1993, 2005]; внеклеточные адаптогены тиобацилл, представленные аминокислотами [Пивоварова с соавт., 1991]. Однако, наличие приведённых примеров не давало целостной картины значимости участия внеклеточных адаптогенов в жизни микроорганизмов, их роль в стрессоадаптации оставалась малоисследованной. Отмеченная малоисследованность внеклеточных адаптогенов в совокупности с их определённым функциональным многообразием и наличием у микроорганизмов различных таксономических групп, а также высоким потенциалом практического применения обусловили актуальность изучения микробных внеклеточных адаптогенов - их обнаружение с применением биотестов (защитных эффектов при сублетальных и летальных воздействиях и развитии культур в неоптимальных условиях), определение химической природы, исследование механизмов действия.

Исследуя физиологию псевдомонад, автор обнаружил, что у них существенно выражена обратимая адгезия - первая фаза формирования биоплёнок, занимающих важное место в жизнедеятельности бактерий [Marshall, 1996; O'Toole et al., 2000], а также важных для биотехнологии и медицины [Ильина с соавт., 2004]. Возможность ауторегуляторного контроля обратимой адгезии бактерий и важность этого феномена для практической деятельности обусловили интерес к исследованию ауторегуляции обратимой адгезии бактерий в рамках настоящей работы.

При рассмотрении стрессоадаптации выделяют две группы приспособительных реакций активно развивающихся организмов - с изменением и без изменения стратегии жизни [Бухарин с соавт., 2005]. В первом случае организмы остаются в том же, хотя бы и менее активном, состоянии, продолжают развитие; во втором случае происходит смена стратегии жизни - как правило, переход от активного роста к переживанию. В этой связи интересна ситуация с исследованием ауторегуляторов образования покоящихся форм (ПФ), факторов dj, которые контролируют адаптивные реакции второго типа, связанные со сменой стратегии развития и переходом клеток в покоящееся состояние. Эти соединения представлены у ряда бактерий алкилоксибензолами (АОБ) [Эль-Регистан с соавт., 1980; Бухарин с соавг., 2005; Мулюкин, 2010]. Механизмы, посредством которых АОБ контролируют развитие анабиотического состояния ПФ заключаются в стабилизации клеточных мембран [Капрельянц с соавт., 1987], ингибировании активности ферментов [Колпаков с соавт., 2000], а также в индукции фенотипической диссоциации популяции, связанной с состоянием покоя [Ильинская с соавт., 2002]. Можно было ожидать участия АОБ в и стрессоадаптации первого типа - без изменения стратегии развития культур, т.е. в адаптации растущих культур к неблагоприятным физико-химическим условиям среды и смене условий развития. Представляло интерес исследовать феноменологию и механизмы стрессопротекторного действия АОБ на разных уровнях - молекулярном, клеточном, популяционном. Интерес к АОБ также обусловлен их широким распространением в мире растений и микроорганизмов [Kozubek, Tyman, 1999]; они могут быть также обнаружены в плазме крови человека в наномолярных концентрациях [Ross et al., 2010].

Исходя из вышеизложенного были сформулированы цель и задачи исследования.

Цель работы - исследовать закономерности ауторегуляции адаптации микроорганизмов к неблагоприятным и повреждающим воздействиям и изменениям условий роста: (1) феноменологию ауторегуляции адаптивных реакций, (2) химическую природу внеклеточных адаптогенов, (3) механизмы действия внеклеточных адаптогенов.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи.

Задачи исследования:

Научная новизна работы.

Впервые описаны феноменологически, выделены и идентифицированы внеклеточные адаптогены нового типа, контролирующие адгезивные свойства клеток в условиях стресса новой среды. Регуляторы адгезии представлены у Р. Аиогезсет н-алканами и протеазами, у В. ИсИет/огтгз - липоциклопептидом. Показано влияние физико-химических факторов на величину обратимой адгезии клеток. Доказана защитная функция обратимой адгезии клеток при воздействии стрессоров.

Установлена роль алкилоксибензолов как адаптогенов, защищающих клетки бактерий и дрожжей от стрессорных воздействий различной природы (теплового шока, у-облучения, фотоокисления). Выявлена адаптивная функция АОБ в обеспечении активного роста микроорганизмов при значениях температуры и рН, неоптимальных для роста и близких к границам толерантности. Обнаружено, что формирование стрессового ответа сопряжено с повышением биосинтеза АОБ. Показана зависимость адаптогенных эффектов АОБ от их структуры и концентрации. Механизм протекторного действия АОБ включает их функционирование как модификаторов белков, эффективных перехватчиков активных форм кислорода (АФК), включая синглетный кислород, активаторов экспрессии стрессовых оперонов (БОБ-ответа и гро^-регулона стационарной фазы). Доказана способность АОБ направленно модифицировать структуру ферментных белков, что приводит к изменению их каталитической активности и повышению операционной и функциональной стабильности. Короткоцепочечные АОБ (С7-АОБ) повышают активность ферментов в широком диапазоне концентраций, а длинно-цепочечные (С12-АОБ) - при низких концентрациях повышают активность, а при более высоких - ингибируют её. Повышение каталитической активности определяется возрастанием амплитуд равновесных флуктуаций атомов в белковой глобуле, отражающей возрастание конформационной (междоменной) подвижности белковой глобулы. Показана антиоксидант-ная активность АОБ, продукты окисления частично идентифицированы; они сохраняют ан-тиоксидантные свойства и способность модифицировать белки, действуя при меньших концентрациях, чем нативные АОБ.

Обнаружено концентрационное влияние длинноцепочечных АОБ на изменение попу-ляционного спектра бактериальных культур как способ реализации их адаптивного потенциала.

Полученные результаты существенно расширяют современные знания о биологии мик-^ роорганизмов в области саморегуляции стрессового ответа и приспособлении микробных популяций к новым или неблагоприятным условиям окружения. На их основе сформулировано положение о системе внеклеточных адаптогенов микроорганизмов: «Микроорганизмы обладают системой ауторегуляции адаптации к неблагоприятным факторам среды разной природы и интенсивности. Эта система включает внеклеточные метаболиты - адаптогены, оказывающие действие на генном, молекулярном, клеточном и популяционном уровнях». Предлагается считать внеклеточные адаптогены самостоятельной группой биологически активных веществ, функция которых - контроль адаптации микробной популяции к неблагоприятным факторам окружающей среды или новым условиям роста.

Основные положения, выносимые на защиту:

4. Микробные алкилоксибензолы могут обладать функциями адаптогенов. Защитные эффекты АОБ в зависимости от их химической структуры реализуются как протекция клеток микроорганизмов от повреждающих воздействий или как сигнал тревоги для мобилизации защитных ресурсов клеток. Функции АОБ как сигналов тревоги опосредуются через контроль экспрессии генов стрессовых регулонов. Механизм протекторного действия АОБ включает их функционирование как структурных модификаторов ферментных белков, а также как антиоксидантов.

Фенотипическая диссоциация популяции, составляющая её адаптивный потенциал, регулируется алкилоксибензолами, которые контролируют развитие определённого варианта.

Практическая значимость и реализация результатов работы.

1. Полученные в работе результаты могут быть использованы для разработки эффективных способов направленной регуляции роста промышленных штаммов и сообществ микроорганизмов и повышения биосинтеза биологически активных веществ; способов антиок-сидантной защиты про- и эукариотных организмов; для совершенствования методов борьбы с микробной контаминацией и биообрастаниями. Регуляторы адгезии могут быть использованы для предупреждения образования биопленок и при создании средств защиты материалов.

2. На основе природных АОБ и их химических производных разработаны способы: (а) стабилизации и направленного изменения активности ферментных белков; (б) ингибирования ферментативной и микробной активности в бродильных производствах с целью консервации продукта, в частности при производстве пива, кумыса, кваса, молочнокислых продуктов; (в) защиты материалов от биоповреждений. На основе материалов диссертации получены патенты РФ (RU № 02329300 от 26.12.2006 и RU № 2400069 от 11.06.09), подготовлены и поданы 4 заявки на патенты РФ (№ 2009109569 от 17.03.09; №> 2009134293 от 15.09.09; № 2010108915 от 11.03.10; №2010108916 от 11.03.10).

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены в виде устных или стендовых сообщений и обсуждались на: Int. Symp. on Bacteriology and Appl. Microbiology, Paris, 2002; Int. Symp. on Subsurface Microbiology, Copenhagen, 2002; Всероссийской научно-технической конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства их реализации», Москва, 2003; Втором Московском Международном Конгрессе «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития», Москва, 2003; 35th COSPAR Scientific assembly, Paris, France, 2004; Второй международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал, Пермь-Казань-Пермь, 2005; 15th IUPAB and 5th EBSA International Biophysics Congress, 2005, Montpellier, France; Всероссийской молодёжной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2005; Пятой Национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования наноматериалов и наносистем (РСНЭ НАНО-2005), Москва, 2005; Конференции «Коммуникация у бактерий», Москва, 2005; Третьей научно-практической конференции "МЕД-БИОТЕК", Москва, 2006.; VI национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов, Москва, 2007; Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем», Саратов, 2007; Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты», Москва, 2008.

Место выполнения работы и личный вклад соискателя. Основная часть работы выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, в лабораториях классификации и хранения уникальных микроорганизмов (зав. лаб. чл.-корр. РАН В.Ф. Гальченко), нефтяной микробиологии (зав. лаб. д.б.н. С.С. Беляев), почвенной микробиологии (зав. лаб. д.б.н. Н.С. Паников). Часть результатов получена при выполнении' совместных работ с Институтом химической физики им. Н.Н.Семёнова РАН (д.ф.н. Ю.Ф. Крупянский), кафедрами микробиологии и биофизики МГУ им. М.В. Ломоносова (д.б.н. Л.И. Воробьева, к.б.н. М.Г. Страховская), Московским государственным университетом пищевых производств (д.т.н. М.В. Гернет, к.б.н. Е.Ф. Шаненко, асп. И.А. Конаныхина), Институтом биоорганической химии РАН (д.х.н. |С.Г.Батраков|), Российским химико-технологическим университетом им.

Д.И. Менделеева (д.б.н. [И.А. Крылов|, асп. С.С. Хабибулин), Российским государственным аграрным университетом - МСХА им К.А. Тимирязева (к.б.н. Т.И. Шатилова), Казанским институтом биохимии и биофизики Казанского НЦ РАН (к.б.н. Ю.В. Гоголев), Институтом клеточного и внутриклеточного симбиоза УРО РАН г. Оренбург (чл.-корр. РАН О.В. Бухарин, д.б.н. Н.В. Немцова, к.б.н. Н.Б. Перунова), Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (д.б.н. В.И. Дуда, к.б.н. Н.Е. Сузина), ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (д.б.н. A.C. Миронов, к.б.н. Т.А. Воейкова). Часть работы выполнена во время стажировки автора в университете г. Абердин, Великобритания.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 60 работ, в том числе 35 экспериментальных статей и 5 обзоров в печатных изданиях, рекомендованных ВАК, 1 учебное пособие (монография), 13 тезисов конференций, 2 патента РФ, 4 заявки на патенты РФ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Николаев, Юрий Александрович

выводы

1. Установлено, что в стрессовых условиях микроорганизмы как про-, так и эукариоты (в частности, представители pp. Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas, Escherichia, Candida) синтезируют внеклеточные метаболиты, способствующие адаптации микроорганизмов к тому же самому или другим типам стрессорных воздействий. Внеклеточные адаптогены имеют видонеспецифичный и дозозависимый характер действия и представлены соединениями различной химической природы с различными механизмами действия.

3. Доказана адаптогенная функция обратимой адгезии как ответа планктонных популяций бактерий на стресс новой среды и условия, не благоприятствующие росту (повышенные температура, концентрации NaCl, Ca и др.). В состоянии обратимой адгезии микроорганизмы более устойчивы к стрессорным воздействиям.

4. Обнаружен новый тип внеклеточных адаптогенов бактерий - ингибиторы бактериальной адгезии, которые концентрационно регулируют как стадию прилипания клеток к поверхности, так и стадию обратного их перехода к планктонному существованию. Антиадге-зины идентифицированы как липоциклопептиды (у B.licheniformis), а также смесь н-алканов (С21-С33) и белков с протеолитической активностью (у P.fluorescens).

5. Установлено, что микробные алкилоксибензолы могут обладать функциями адаптогенов, защитные эффекты которых при стрессорных воздействиях и в зависимости от их химической структуры и концентрации реализуются как: (1) протекция микроорганизмов от повреждающих воздействий (короткоцепочечные алкилоксибензолы) или (2) сигнал для мобилизации защитных ресурсов клетки (длинноцепочечные алкилоксибензолы). Выявлено адаптогенное действие короткоцепочечных алкилоксибензолов при развитии культур микроорганизмов в неоптимальных для роста условиях. Адаптогенный эффект АОБ максимально выражен при дозах стрессора (pH, соленость), приближающихся к границам толерантности для вида.

7. Обнаружена способность АОБ в зависимости от их структуры регулировать экспрессию стрессовых генов - SOS-ответа и гро£-регулона стационарной фазы, обусловливая протекторный эффект (короткоцепочечные АОБ) или функционируя как сигналы тревоги (длинноцепочечные АОБ) для реализации защитных ресурсов клеток, активируя экспрессию стрессовых генов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа развивалась по этапам логического пути, свойственного для исследования внеклеточных ауторегуляторов: 1) первоначально выявляют биологические функции новых внеклеточных адаптогенов или находят новые свойства у ранее известных ауторегуляторов с использованием биотестов; 2) затем проводится химическая идентификация внеклеточных адаптогенов, описанных на основании биотестов; 3) на третьем этапе исследуют механизмы действия адаптогенов с использованием выделенных химически чистых адаптогенов или их аналогов; и, наконец, результаты исследования могут найти прикладное значение. Важно подчеркнуть, что изучение АР невозможно без использования биотестов, специальных экспериментальных систем, использующих те или иные организмы в определённых условиях. Не будет преувеличением сказать, что новый биотест может привести к обнаружению нового АР или новой функции у ранее известного АР. Наши исследования развивались по указанным трем направлениям и были успешно развиты в практическом аспекте.

Полученные в ходе выполнения работы данные продемонстрировали способность микроорганизмов различных таксономических групп в процессе развития их культур продуцировать специфические внеклеточные метаболиты - адаптогены (ВА), способствующие приспособлению микроорганизмов к неблагоприятным воздействиям или изменяющимся условиям существования, в том числе — к повышению жизнеспособности клеток. ВА концентрационно контролируют компенсаторно-приспособительные реакции микроорганизмов как при стрессах, запрограммированных в цикле развития микробных культур (голодания, смены среды роста, исчерпания жизненного пространства), так и при незапро-граммированных стрессорных воздействиях разной природы (термальном, окислительном, осмотическом, токсическом). Ауторегуляция стрессового ответа имеет место при воздействиях разной интенсивности: рост-замедляющих, рост-прекращающих, летальных. ВА, имеющие различные функции, представлены соединениями разных классов - насыщенными углеводородами, липоциклопептидами, алкилоксибензолами, белками, летучими соединениями. При этом ВА разной природы могут оказывать схожее действие - так, антиадгезинами псевдомонад являются протеазы и н-алканы, а ВА с антиоксидантными свойствами могут быть представлены АОБ (наши данные) или ЭН-содержащими соединениями (литературные данные).

Алкилоксибензолы и ряд неидентифицированных ВА бактерий являются видонеспе-цифичными, что обеспечивает их адаптогенные функции на уровне сообществ. Прямое перекрёстное действие ВА было продемонстрировано для бактерий, дрожжей и водорослей.

Внеклеточные антиадгезины, ВА нового типа, контролирующие адгезию клеток, впервые описаны феноменологически, выделены и идентифицированы. Обратимая адгезия клеток усиливается в неоптимальных условиях роста и при перенесении в новую среду. Обратимая адгезия защищает клетки от воздействия стрессоров (окислителя ЫЕМ). Регуляторы адгезии Р. Аиогезсет и В. \icheniformis были идентифицированы как н-алканы и протеазы (Р. АиогеБсет) и липоциклопептид (В. Нскет/огпш).

На примере одного из типов ВА, алкилоксибензолов, детально исследованы феноменология и механизмы протекторного антистрессорного действия на молекулярном, генетическом и популяционном уровнях.

Алкилоксибензолы защищают клетки бактерий и дрожжей от стрессорных воздействий различной природы (теплового шока, у-облучения, фотоокисления), а также расширяют температурный и рН-диапазоны активного роста. В ходе стрессового ответа происходит повышение биосинтеза АОБ, аналогично некоторым из неидентифицированных ВА Е.соИ, В.яиЫШБ и Р.Аиогезсет. Адаптогенные эффекты АОБ зависят от их структуры и концентрации. Механизм протекторного действия АОБ на молекулярном уровне включает их функционирование как модификаторов белков и как эффективных перехватчиков активных форм кислорода (АФК), включая синглетный кислород.

Связывание АОБ с ферментными белками приводит к изменению их каталитической активности и повышению операционной и функциональной стабильности. Короткоцепо-чечные АОБ (С7-АОБ, метилрезорцин) повышают активность ферментов в широком диапазоне концентраций, а длинноцепочечные (С12-АОБ, гексилрезорцин) - при низких концентрациях повышают активность, а при более высоких - ингибируют её. Повышение каталитической активности определяется повышением конформационной (междоменной) подвижности, особенно в присутствии С7-АОБ. Обнаруженное противоречие между экспериментально наблюдаемым повышением функциональной стабильности ферментов и снижением их структурной стабильности требует своего разрешения в будущих работах.

При функционировании АОБ как ловушек АФК происходит их многостадийное окисление. Продукты окисления частично идентифицированы, они, как и нативные АОБ, проявляют антиоксидантные свойства и способны к модификации активности и стабильности белков, причём являются более активными модификаторами, чем исходные АОБ.

АОБ влияют на популяционный спектр бактериальных культур, что способствует реализации их адаптивного потенциала в стрессовых условиях и новых условиях жизни. Показана мутагенная активность длинноцепочечных АОБ и её корреляция с интенсивностью диссоциативных переходов. Протекторное или стресс-потенцирующее действие различных гомологов АОБ определяется их различным действием на активность экспрессии стрессовых регулонов: SOS — ответа и rpoS - регулона.

Анализируя феноменологию действия описанных в настоящем исследовании ВА в совокупности с их химической природой и физико-химическими свойствами, а также привлекая данные литературы (табл. 2), по механизму действия можно выделить следующие типы внеклеточных микробных адаптогенов:

1) индукторов защитных механизмов клетки, действие которых проявляется после известного лаг-периода;

2) протекторов прямого действия, участвующих в стабилизации субклеточных структур, действующих без лаг-периода;

3) регуляторов эффективности защитных реакций клеток, например, адгезии;

4) нейтрализующего действия, в том числе с десмутагенной и антиоксидантной активностью.

Индукция — один из наиболее изученных типов действия адаптогенов, когда они в ответ на стрессорное воздействие инициируют включение или стимулируют развитие защитных или приспособительных реакций организма. Как правило, под индукцией понимают появление нового белка (белков) или существенную стимуляцию его (их) синтеза, и этот феномен хорошо исследован [Бут, 2005]. Подобным действием из описанных выше ВА обладают факторы адаптации к новой среде и Хц, длинноцепочечные АОБ (гл. 3), а также многие из описанных в литературе В А [Бут, 2005; Rowbury at al, 1998, 1999, 2000, 2001]. Одним из сущностных свойств адаптогенов-индукторов является необходимость времени на развитие ответа после их воздействия.

Другой тип действия ВА, более быстрый, адаптация с участием протекторов. Протекторным действием обладают внеклеточные метаболиты, которые непосредственно посредством физико-химических взаимодействий с клеточными структурами и макромолекулами осуществляют их стабилизацию от повреждающих воздействий. Так действуют осмопротекторы глицин-бетаин, эктоин [Welsh, 2000], алкилоксибензолы. Возможно, таким механизмом действия обладает и описанный фактор Xi E.coli, В. subtilis и Р. fluorescens. В экстремальных ситуациях протекторы играют важную защитную роль, поскольку они действуют гораздо быстрее, по сравнению с индуцибельными системами защиты, включающими рецепцию и трансдукцию сигнала с последующей экспрессией соответствующих функциональных белков. Протекторы обеспечивают быструю гибкую адаптацию, тогда как индукторы - долговременную, и, действующую в более жестких стрессовых ситуациях. Обе системы защиты дополняют друг друга.

Некоторые из рассмотренных выше ВА, такие как низкомолекулярные алкилокси-бензолы, фактор Хь обнаруживший антиоксидантные свойства, десмутагены пропионово-кислых бактерий [Воробьева с соавт., 1993; Воробьева, Абилев, 2002], низкомолекулярные метаболиты тиобацилл, снижающие токсическое действие Мо6+ [Пивоварова с соавт., 1991] и некоторые другие, относятся к факторам нейтрализующего действия. По молекулярному механизму действия они принципиально отличаются от протекторов: протекторы предотвращают повреждающее действие стрессорных факторов за счет связывания с субклеточными структурами и биополимерами и их стабилизации. Нейтрализаторы обезвреживают молекулы самого стрессора, как правило, химической природы, до его контакта с клеткой.

И, наконец, к последней группе адаптогенов - регуляторам (не индукторам и не протекторам) относятся микробные внеклеточные метаболиты, контролирующие адгезию псевдомонад и бацилл, которые влияют («оказывают эффект») на адгезионные и когези-онные свойства клеток, что приводит к смене места их локализации.

Некоторые ВА оказывают одновременно несколько эффектов, являясь, таким образом, полимодальными по механизму действия (множественного действия). К таким адап-тогенам относятся АОБ, обладающие свойствами нейтрализаторов-антиоксидантов, протекторов-стабилизаторов макромолекул и клеточных мембран, а длинноцепочечные АОБ -также и индукторами.

Таким образом, полученные при выполнении работы результаты демонстрируют способность микроорганизмов различных таксономических групп образовывать специфические внеклеточные метаболиты - адаптогены, способствующие приспособлению микроорганизмов к неблагоприятным воздействиям физической или химической природы или изменяющимся условиям существования. ВА участвуют в адаптации микроорганизмов как при стрессах, запрограммированных в цикле развития микробных культур (голодания, смены среды роста, исчерпания жизненного пространства), так и при незапрограммиро-ванных стрессорных воздействиях разной природы (термальном, окислительном, осмотическом, токсическом). Ауторегуляция стрессового ответа имеет место при воздействиях разной интенсивности: рост-замедляющих, рост-прекращающих, летальных.

ВА, имеющие различные функции, представлены соединениями разной химической природы - насыщенными углеводородами, липоциклопептидами, алкилоксибензолами, белками, летучими соединениями (табл. 2). При этом ВА разной природы могут оказывать схожее действие. Так, антиадгезинами псевдомонад являются протеазы и н-алканы и не-идентифицированные летучие компоненты, а ВА с антиоксидантными свойствами могут быть представлены АОБ (гл. 3) или БН-содержащими соединениями [Воробьёва с соавт., 1995; Октябрьский, Смирнова, 2007].

Важно, что внеклеточные адаптогены бактерий являются видонеспецифичными, что обеспечивает их адаптогенные функции на уровне сообщества. Прямое перекрёстное действие ВА было продемонстрировано для бактерий, дрожжей и водорослей.

Обнаружение схожих (или одинаковых) по выполняемой функции внеклеточных адаптогенов к стрессам у систематически разных микроорганизмов позволяет считать их наличие важным биологическим феноменом, наряду с внеклеточными - ауторегуляторами других типов - гомосеринлактонами [Б^иа е1 а1., 1994; Л^юк, МсРа11-^а1, 2000], факторами морфогенеза и продукции антибиотиков у стрептомицетов [Хохлов, 1988]; факторами дифференцировки бактерий [Бухарин с соавт., 2005], регуляторами реактивации покоящихся форм бактерий [КаргеИуаМг е! а1., 2005] и другими [Волошин, Капрельянц, 2004].

Относительно АОБ можно заключить, что они являются полимодальными универсальными микробными внеклеточными адаптогенами, а с учетом их высокого содержания в растениях — адаптогенами более высокоорганизованных систем. Они обнаружены у широкого круга объектов (микроорганизмы, растения), действуют на микроорганизмы разных таксономических групп (бактерии, грибы). Их адаптогенное действие проявляется на всех уровнях организации живой материи - физическом (молекулярном), молекулярно-генетическом, клеточном, популяционном.

Полученные результаты существенно расширяют современные знания о биологии микроорганизмов в области саморегуляции стрессового ответа и приспособлении популяций к новым или неблагоприятным условиям окружения. На их основе сформировано представление о внеклеточных адаптогенах, как о биологически активных веществах, выделяемых в отдельную группу на основе их биологической функции — контроля адаптации микробной популяции к неблагоприятным факторам окружающей среды или новым условиям роста. Внеклеточные адаптогены представлены соединениями разной химической природы - алкилоксибензолами, белками, гликопротеинами, липопептидами, насыщенными углеводородами, гомосеринлактонами, рядом низкомолекулярных метаболитов (аминокислоты, органические кислоты, нуклеотиды и др.). Значительная их часть к настоящему времени не идентифицирована (табл. 42). Из известных 26 примеров внеклеточных адаптогенов в настоящей работе исследованы 9.

На основе результатов настоящей работы может сформулирована концепция внеклеточных адаптогенов микроорганизмов: «Микроорганизмы обладают специфической системой ауторегуляции адаптации к неблагоприятным факторам среды разной природы и интенсивности. Эта система включает внеклеточные метаболиты-адаптогены разной природы, оказывающие действие на генетическом, молекулярном, клеточном и популяцион-ном уровнях».

В зависимости от силы стрессора в стрессоадаптации принимают участие различающиеся по механизмам действия внеклеточные адаптогены: протекторы и нейтрализующего действия - при минимальных стрессовых воздействиях, приводящих к замедлению роста, эффекторы (например, регуляторы адгезии) - при нарастании степени негативного действия; индукторы (термин применён в широком смысле значения) - на границе толерантности для вида, т.е. в рост-останавливающих условиях; регуляторы образования покоящихся форм и фенотипической диссоциации - при воздействиях, выходящих за пределы толерантности для вида, т.е. в условиях начинающейся гибели клеток (рис. 105).

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Николаев, Юрий Александрович, Москва

1. Aaronson S. Chemical communication at the microbial level. CRC Press Inc., Boca Raton. 1981. V.l,2.

2. Aburatani S., Horimoto K. Elucidation of the relationships between LexA-regulated genes in the SOS response // Genome Inform. 2005. VЛ6. № l. p. 95 105.

3. Acs L. Uber die mitogenetische Strahlung der Bacterien // Centr. f. Bact. I Abt. Orig. 1931. V.120. P.116.

4. Aersten A., Michielis C.W. Mrr investigates the SOS response after high pressure stress in Escherichia coli // Mol. Microbiol. 2005. V. 58 (5). P. 1381-1391.

5. Aldea M., Hernandezchico C., Delacampa A.G., Kushner S.R., Vicente M. Identification, cloning, and expression of bolA, an fisZ-dependent morphogene of Escherichia coli // J. Bacteriol. 1988. V. 170. № 11. P. 5169-5176.

6. Allan V.J.M., Callow M.F., Macaskie L.E., Paterson-Beedle M. Effect of nutrient limitation and phosphate activity of Citrobacter sp. // Microbiology. 2002. V. 148. P. 277-288.

7. Alloing G., Martin В., Granadel С., Claveris J.P. Development of competence in Streptococcus pneumoniae: pheromone autoinduction and control of quorum-sensing by the oligopeptide permease // Mol. Microbiol. 1998. V. 21. № 1. P. 75-83.

8. Alper, S., Dufour A., Garsin D.A., Duncan L., Losick R. Role of adenosine nucleotides in the regulation of a stress-response transcription factor in Bacillus subtilis // J. Mol. Biol. 1996. V. 165Л 77.

9. Anderl J.N., Franklin M.J., Stewart P.S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprpfloxacin // Antimicrob. Agents and Chemother. 2000. V. 44. № 7. P.l818-1824.

10. Anson M. L. The estimation of pepsin, trypsin, papain and catepsin with hemoglobin // J. Gen. Physiol. 1938. V. 22. P. 79-82.

11. Arakawa Т., Ejima D., Kita Y, Tsumoto K. Small molecule pharmacological chaperones: From thermodynamic stabilization to pharmaceutical drugs. // Biochim Biophys Acta. 2006. V. 1764. №11. P. 1677-1687.

12. Atlung Т., Hansen F.G. Low-temperature-induced DnaA protein synthesis does not change initiation mass in Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. 1999. V. 181. № 18. P.5557-5562.

13. Azachi M., Sadka A., Fisher M., Goldshlag P., Gokhman I., Zamir A. Salt induction of fatty acid elongase and membrane lipid modifications in the extreme halotolerant alga Dunaliella salina // Plant Physiol. 2002. Vol. 129. P. 1320-1329.

14. Azam T.A., Ishihama A. Twelve species of the nucleoid-associated protein from Escherichia coli (Sequence recognition specificity and binding affinity) // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. №46. P. 33105-33113.

15. Azam T.A., Iwata A., Nishimura A., Ueda S., Ishihama A. Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid // J. Bacteriol. 1999. V. 181. № 20. P. 6361-6370.

16. Bacteria as multicellular organisms. // Eds. D.A. Shapiro, M. Dworkin. N-Y.: Oxford Univ. Press. 1997. 456 p.

17. Balaban N.Q., Merrin J., Chait R., Kowalik L., Leibler S. Bacterial persistence as a pheno-typic switch//Science. 2004. V. 305(5690). P. 1622-1625.

18. Bam N.B., Cleland J.L., Randolph T.W. Molten globule intermediate of recombinant growth hormone stabilization with surfactants // Biotechnol. Prog. 1996. V.12. №6. P. 809801.

19. Bandow J.E., Hecker M. Proteomic profiling of cellular stresses in Bacillus subtilis reveals cellular networks and assists in elucidating antibiotic mechanisms of action. Prog. Drug Res. 2007. V.64. No 79. P. 81-101.

20. Bansal T., Englert D., Lee J., Hedge M., Wood T.K., Jayaraman A. Differential effects of epinephrine, norepinephrine and indole on Escherichia coli 0157:H7 chemotaxis, colonization and gene expression // Infect. Immun. 2007. V.75. P. 4597-4607.

21. Barnard A.M., Bowden S.D., Burr T., Coulthurst S.J., Monson R.E., Salmond G.P. Quorum sensing, virulence and secondary metabolite production in plant soft-rotting bacteria. Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci. 2007. V. 362. No 1483. P. 1165-1183.

22. Baron M.A. Uber mitogenetische Strahlung bei Protisten.// Roux' Archiv. 1926. V. 108. P. 617.

23. Bassler B.L., Wright M., Showalter R.E., Silverman, M.R. Intercellular signalling in Vibrio harveyi: sequence and function of genes regulating expression of luminescence // Mol. Microbiol. 1993. V. 9. P. 773-786.

24. Bassler B.L., Wright M., Silverman M.R. Multiple signalling systems controlling expression of luminescence in Vibrio harveyi: sequence and function of genes encoding a second sensory pathway//Mol. Microbiol. 1994a. V. 13. P. 273-286.

25. Bassler B.L., Wright M., Silverman. M.R. Sequence and function of LuxO, a negative regulator of luminescence in Vibrio harveyi // Mol. Microbiol. 19946. V. 12. P.403-412.

26. Benov L., Fridovich I. Superoxide dismutase protects against aerobic heat shock in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1995. V. 177. № 11. P. 3344-3346.

27. Bhamre S., Gadea B.B., Koyama C.A., White S.J., Fowler R.G. Anaerobic recA-, umuC-dependent pathway of spontaneous base-pair substitution mutagenesis in Escherichia coli II Mutat. Res. 2001. V. 473. P. 229-247.

28. Biebl H., Schwab-Hanisch H., Sproer C., Lunsdorf H. Propionispora vibrioides, nov. gen., nov. sp., a new gram-negative, spore-forming anaerobe that ferments sugar alcohols // Arch. Microbiol.2000. V. 174. P. 239-247

29. Bigger J.W. Treatment of staphylococcal infections with penicillin//Lancet. 1944. V. 11. P. 497-500.

30. Biophoton emission. Multi-author review//Experientia. 1988.V.44. No7. P. 543-630.

31. Biophotonics and coherent systems in biology. Eds. Beloussov L.V., Voeikov V.L., Mar-tynyuk V.S. Springer. N-Y. 2007.

32. Bisset K. A. Bacteria. 1952. E. & S. Livingstone Ltd. Edinburgh, Scotland.

33. Blomberg L., Henriksson A., Conway P.L. Inhibition of adhesion of 1 Escherichia coli 0 K88 to piglet ileal mucus by 1 Lactobacillus 0 spp.// Appl.Environ.Microbiol. 1993. V.59. No l.P. 34-39.

34. Böckelman U., Szewzyk U., Grohmann E. A new enzymatic method for the detachment of particle associated soil bacteria// J. Microbiol. Meth. 2003. V. 55. P. 201-211.

35. Bos R., van der Mei H.C., Busscher H.J. Physico-chemistry of initial microbial adhesive interactions its mechanisms and methods for study // FEMS Microbiol. Rev. 1999. V. 23.P. 179-230.

36. Bose S., Dutko J.A., Zitomer R.S. Genetic factors that regulate the attenuation of the general stress response of yeast // Genetics. 2005. V. 169. P. 1215-1226.

37. Boucher S., Klauck E., Fischer D., Lucassen M., Jung K., Hengge-Aronis R. Regulation of RssB-dependent proteolysis in Escherichia coli: a role for acetyl phosphate in a response regulator-controlled process // Mol. Microbiol. 1998. V. 27. P. 787-795.

38. Bowden M.G., Kaplan H.B. The Myxococcus xanthus lipopolysaccharide O-antigen is required for social motility and multicellular development // Mol. Microbiol. 1998. V. 30. № 2. P. 275-284.

39. Boyd A., Chakrabarty A.M. Role of alginate liase in cell detachment of Pseudomonas aeruginosa. //Appl. Environ, microbiol. 1994. V.60. P. 2355-2359.

40. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding// Analyt. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

41. Brand S. S., Vik A,, Friedman L., Kolter R. Biofilms: the matrix revisited// Trends Microbiol. 2005. V. 13. P. 20-26.

42. Brandi A., Pietroni P., Gualerzi C.O., Pon C.L. Post-transcriptional regulation of CspA expression in Escherichia coli // Mol. Microbiol. 1996. V. 19. № 2. P. 231-240.

43. Brandi A., Pon C.L., Gualerzi C.O. Interaction of the main cold shock protein CS7.4 (CspA) of Escherichia coli with the promoter region of HNS // Biochimie. 1994. V. 76. № 10-11. P. 1090-1098.

44. Brandner J.P. Kroos L. Identification of the W 4400 regulatory region, a developmental promoter of Myxococcus xanthus // J. Bacteriol. 1998. V. 180. № 8. P. 1995-2002.

45. Bright J.J., Fletcher M. Amino acid assimilation and electron transport system activity in attached and free-living marine bacteria // Appl Environ Microbiol. 1983. V. 45. № 3. P. 818-825.

46. Briolant V., Reysset G. Identification of the Clostridium perfringens genes involved in the49. adaptive response to oxidative stress // J. Bacteriol. 2002. V. 184. № 9. P. 2333-2343.

47. Broek D., Chin-A-Woeng F.C., Bloemberg G.V., Lugtenberg J. J. Role of RpoS and MutS in phase variation of Pseudomonas sp. PCL1171 // Microbiology. 2005. - V.151. -P.1403-1408.

48. Brown C.R., Hong-Brown L.Q., Biwersi J., Verkman A.S. Chemical chaperones correct the mutant phenotype of the AF508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein // Cell Stress and Chaperones. 1996. V. 1. №2. P. 117-125.

49. Browne N., Dowds B.C.A. Heat and salt stress in the food pathogen Bacillus cereus // J. Appl. Microbiol. 2001. V. 91 № 6. P. 1085-1094.

50. Bsat N., Herbig A., Casillas-Martinez L., Setlow P., Helmann J.H. Bacillus subtilis contains multiple Fur homologues: identification of the iron uptake (Fur) and peroxide regulon (PerR) repressors // Mol. Microbiol. 1998. V. 29. P. 189-198.

51. Burke P.V., Raitt D.C., Allen L.A., Kellogg E.A., Poyton R.O. Effects of oxygen concentration on the expression of cytochrome c and cytochrome c oxidase genes in yeast // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 14705-14712.

52. Burshard R.P. and Sorongon M.L. A gliding bacterium strain inhibits adhesion and motility of another gliding bacterium strain in marine biofilm // Appl. Environm. Microbiol. 1998. V. 64. P. 4079-4083.

53. Callahan S.M., Dunlap P.V. LuxR- and acyl-homoserine-lactone-controlled non-lux genes define a quorum-sensing regulon in Vibrio fischeri. J Bacteriol. 2000 May;182(10):2811-22

54. Calvio C., Osera C., Amati G., Galizzi A. Autoregulation of swrAA and motility in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 2008. V.190. No 16. P. 5720-5728.

55. Cashel M., Rudd K.F. The stringent response // Escherichia coli and Salmonella typhi-murium / Eds. Neidhardt F.C. et al. Washington DC: ASM Press, 1987. P.1410-1438.

56. Causton H.C., Ren B., Koh S.S., Harbison C.T., Kanin E., Jennings E.G., Lee T.I., True H.L., Lander E.S., Young R.A. Remodeling of yeast genome expression in response to environmental changes // Mol. Biol. Cell. 2001. V. 12. P. 323-337.

57. Characklis W.G. Microbial fouling: a process analysis, in: Fouling of heat transfer equipment. Somerscales E.F.C., Knudsen J.G. eds. Hemisphere, 1981. Washington D.C. P. 251291.

58. Chater K. Genetics of differentiation in Streptomyces.// Aim. Rev. Microbiol. 1993. V. 47. P. 685-713.

59. Chen L., Keramati L., Helmann J.D. Coordinate regulation of Bacillus subtilis peroxide stress genes by hydrogen peroxide and metal ions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 8190-8194.

60. Cho B.K., Knight E.M., Palsson B.O. Transcriptional regulation of the fad regulon genes of Escherichia coli by ArcA // Microbiology. 2006. V. 152. P. 2207-2219.

61. Christiansen B.E., Kjosbakken J., Smidsrod O. Partial chemical and physical characterization of two extracellular polysaccharides produced by marine periphytic Pseudomonas sp. Strain NCMB2021 // Appl. Environ. Microbiol. 1985. V.50. № 4. P. 837-845.

62. Claiborne A. Catalase activity // Handbook of Methods for Oxygen Radical Research. Boca Raton: CRC Press. 1986. P. 283-284.

63. Clark J.B. Slime as a possible factor in cell clumping in Nocardia corallina. // J. Bacteriol. 1958. V. 75. №4. P. 400-402.

64. Clarke M.B., Hughes D.T., Zhu C., Boedeker E.C., Sperandio V. The QseC sensor kinase: a bacterial adenergetic receptor. // PNAS USA. 2006. V.103. P. 10420-10425.

65. Cohen F.E. and Kelly J.W. Therapeutic approaches to protein-misfolding diseases. // Nature, 2003. v. 426, №18. p.905-909.

66. Cohen S.S., What do the polyamines do? //Nature, 1978. V. 274. 209-210.

67. Costerton J.W., Geesey G.G., Cheng K.J. How bacteria stick// Sci Amer. 1978. V. 238. P. 86-95.

68. Costerton J.W., Lewandowski Z.L., DeBeer D., Caldwell D., Korber D., James G. Biofilms, the customized microniche//J.Bacteriol. 1994. V. 1176. P. 2137-2142.

69. Craig I.A., Weissman J.S., Horwich A.L. // Heat shock proteins and molecular chaperones: mediators of protein conformation and turnover in the cell. Cell, 1994, V.78, P. 365-372.

70. Cripps R.E., Work E. The accumulation of extracellular macromolecules by Staphylococcus aureus grown in the presence of sodium chloride and glucose. J. Gen. Microbiol. 1967. 49. № l.P. 127-37.

71. Crowe L.M., Womersley C., Crowe J.H., Reid D., Appel L., Rudolph A. Prevention of fusion and leakage in freese-dried liposomes by carbohydrates. // Biochimica et Biophysica Acta. 1986. V. 861. P. 131-140.

72. Davey M.E., Caiazza N.C., O'Toole G.A. Rhamnolipid surfactant production affects biofilm architecture in Pseudomonas aeruginosa PAOl// J.Bacteriol. 2003. V. 185. P. 1027-1036.

73. Davidson J.F., Schiestl R.H. Cytotoxic and genotoxic consequences of heat stress are dependent on the presence of oxygen in Saccharomyces cerevisiae // J. Bacteriol. 2001. V. 183. №15. P. 4580-4587.

74. Davidson J.F., Whyte B., Bissinger P.H., Schiestl R.H. Oxidative stress is involved in heat-induced cell death in Saccharomyces cerevisiae // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93 №10 P. 5116-5121.

75. Davies K.J.A. Protein damage and degradation by oxygen radicals // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 9902-9907.

76. Davies, D. G., Parsek M. R., Pearson J. P., Iglewski B. H., Costerton J. W., Greenberg E. P. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm // Science. 1998. V. 280. P. 295-298.

77. De Beer D., Stoodley P. Microbial Biofilms. Springer-Verlag. New York. 2004.

78. Demain A.L., Vaishnav P. Involvement of nitrogen-containing compounds in beta-lactam biosynthesis and its control. Crit. Rev. Biotechnol. 2006. V. 26. No. 2. P. 67-82.

79. Diamant S., Eliahu N. Rosenthal D., Goloubinoff P. Chemical chaperones regulate molecular chaperones in vitro and in cells under combined salt and heat stresses. J. Biol. Chem. 2001. V. 276. No 43. P. 39586-39591.

80. Diamant S., Eliahu N., Rosenthal D., Goloubinoff P. Chemical chaperones regulate molecular chaperones in vitro and in cells under combined salt and heat stresses // J Biol Chem. 2001. V. 276. № 43. P. 39586-39591.

81. Donlan R.M. Biofilms: microbial life on surfaces. // Emerg. Infect. Dis. 2002. V.8, №9, P.881-890.

82. Drago L., De Vecchi E., Nicola L., Gismondo M.R., Antimicrobial activity and interference of tobramycin and chloramphenicol on bacterial adhesion to intraocular lenses // Drugs exp. Clin. Res. 2003. Vol. 29. № 1. P. 25-35.

83. Ducan S., NystrOm T. Bacterial senescence: stasis results in increased and differential oxidation of cytoplasmic proteins leading to developmental induction of the heat shock regu-lon. // Genes and Development. 1998. V.12. P. 3431-3441.

84. Dunny G.M., Leonard B.A.B. Cell-cell communication in gram-positive bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 1997. V. 51. P. 527-564.

85. Dworkin M. Recent advances in the social and developmental biology of the myxobacteria // Microbiol Rev. 1996. V. 60. C. 70-102.

86. Dworkin M., Gibson S.M. A system for studying rapid microbial morphogenesis: Rapid formation of mycrocysts in Myxococcus xanthus // Science. 1964. V. 146. P. 243-245.

87. Dybvig K. DNA rearrangements and phenotypic switching in prokaryotes. Mol. Microbiol. 1993. V. 10. P.465-471.

88. Edwards U., Rogall T., Bloeker H., Ende M.D., Boeettge E.G. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes, characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA. // Nucl. Acids Res. -1989.-V.17. P. 7843-7853.

89. Eisenstark A., Calcutt M.J., Becker-Hapak M., Ivanova A. Role of Escherichia coli rpoS and associated genes in defense against oxidative damage. Free Radic. Biol. Med. 1996. V. 21. No 7. P. 975-993.

90. Esposito D., Del Vecchio P., Barone G. Interaction with natural polyamines and thermal stability o DNA. A DSC study and a theoretical reconsideration // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 2606-2613.

91. Farr S.B., Kogoma T. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella ty-phimurium//Microbiol. Rev. 1991. V. 55. P. 561-585.

92. Feucht A., Errington J. ftsZ mutations affecting cell division frequency, placement and morphology in Bacillus subtilis // Microbiology. 2005. - V. 151. - P.2053-2064.

93. Fiddaman P.J., Rossal S. The production of antifungal volatiles by Bacillus sub-tilis.//J.Appl.Bacteriol. 1993. V.74. P. 119-126.

94. Flahaut S., Frere J., Boutibonnes P., Auffray Y. Relationship between the thermotoler-ance and the increase of DnaK and GroEL synthesis in Enterococcus faecalis ATCC19433 //J. Basic Microbiol. 1997. Vol. 37. P. 251-258.

95. Flavier A.B., Clough S.J., Schell M.A., Denny T.P. Identification of 3-hydrixypalmitic acid methyl ester as a novel autoregulator controlling virulence in Ralstonia solana-ceum.//Mol. microbiol. 1997. V.26. No 2. P.251-259.

96. Flemming H.-C., Schaule G., Microbielle werkstoffzerstorung biofilm und biofouling in wasrigen systemen // Werkst, und Korros. 1994. №1. S.40-53.

97. Fletcher M. Bacterial adhesion (mechanisms and significance) Editors D.C. Savage M. Fletcher. N-Y., London: Plenum Press. 1985. P.339-362.

98. Foster P.L. Stress responses and genetic variation in bacteria. Mutat. Res. 2005. V. 569. № 1-2. P. 3-11.

99. Fournier B., Hooper D.C. A new two-component system involved in adhesion, autolysis and extracellular proteolytic activity of Staphylococcus aureus // J. Bacteriol. 2000. V.182. № 14. 3. 3955-3964.

100. Fournier M., Dermount Z., Durand M.C., Dolla A. A new function of the Desulfovibrio vulgaris Hildenborough Fe. hydrogenase in the protection against oxidative stress // J.Biol. Chem. 2004. V. 279. №. 3. P. 1787-1793.

101. Freeman J.A., Bassler B.L. Sequence and function of LuxU: a two-component phos-phorelay protein that regulates quorum sensing in Vibrio harveyi // J. Bacteriol. 1999 a. V. 181. P. 899-906.

102. Freeman J.A., Bassler B.L. A genetic analysis of the function of LuxO, a two-component response regulator involved in quorum sensing in Vibrio harveyi // Mol. Microbiol. 1999 6.V. 31. P. 665-677.

103. Freeman J. A., Lilley B.N., Bassler. B.L. A genetic analysis of the functions of LuxN: a two-component hybrid sensor kinase that regulates quorum sensing in Vibrio harveyi // Mol. Microbiol. 2000. V. 35. P. 139-149.

104. Fridovich I. Superoxide dismutases // Ann. Rev. Biochem. 1975. V. 44. № 1. P. 147159.

105. Fridovich I. The biology of oxygen radicals // Science. 1978. V. 201. P. 875-880.

106. Friedberg E.C., Wagner R., Radman M. Specialzed DNA polymerases, cellular survival, and genetics of mutations //Science. 2002. V. 296. P. 1627 1630.

107. Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E.P. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators // J. Bacteriol. 1994. V. 176. № 2. P. 269-275.

108. Gasch A.P., Spellman P.T., Kao C.M., Carmel-Harel O., Eisen M.B., Storz G., Botstein D., Brown P.O. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes // Mol. Biol. Cell. 2000. V. 11. P. 4241-4257.

109. Gekko K., Timasheff S.N. Thermodynamic and kinetic examination of protein stabilization by glycerol Biochemistry, 1981, v. 20, P. 4667-4676.

110. Gentry D. R., Hernandez V.J., Nguyen L. H., Jensen D. B., Cashel M. Synthesis of the stationary-phase sigma factor as is positively regulated by ppGpp // J. Bacteriol. 1993. V. 175. P. 7982-7989.

111. Gerth K. and Reichenbach H., Induction of myxospore formation in Stigmatella auran-tiaca (Myxobacteriales). General characterization of the system., Arch.Microbiol., 1978, vol. 117, pp. 173 179.

112. Gerth K., Metzger R., Reichenbach H. Induction of in Stigmatella aurantiaca (myxobac-teria): Inducers and inhibitors of myxospore formation, and mutants with a changed sporulation behavior // J. Gen. Microbiol. 1993. V. 139. №4. P. 865-871.

113. GeseniusH. Uber Stoffwechselwirkungen von Gurwitsh-Strahlen //Biochem. Z. 1930. V. 225. P. 328.

114. Gilles R. "Compensatory" organic osmolytes in high osmolarity and dehydration stresses: History and perspectives. // Comparative biochemistry and physiology A-physiology, 1997, Vol. 117, No.3, P.279-290.

115. Gilles-Gonzalez M.A., Gonzalez G. Perutz M.F., Kiger L., Marden M.C., Poyart C. Heme-based sensors, exemplified by the kinase FixL, are a new class of heme protein with distinctive ligand binding and autoxidation//Biochem. 1994. V. 33. P. 8067-8073.

116. Gilles-Gonzalez M.A., Gonzalez G. Signal transduction by hemecontaining PASdomain proteins // J. Appl. Physiol. 2004. V. 96. P. 774-783.

117. Girard G., Bloemberg G.V. Central role of quorum sensing in regulating the production of pathogenicity factors in Pseudomonas aeruginosa. Future Microbiol. 2008. V.3., No 1. P. 97-106.

118. Goldstein J., Pollit N.S., Inouye M. Major cold shock protein of Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. USA. 1990. V. 87. № l. p. 283-287.

119. Gong W., Hao B., Mansy S.S., Gonzalez G., Gilles-Gonzalez M.A., Chan M.K. Structure of a biological oxygen sensor: a new mechanism for heme-driven signal transduction // PNAS Biochem. 1998. V. 95. P. 15177-15182.

120. Gordon A.S., Millero F.J. Electrolite effect on an estuatine bacterium // Appl. Environ. Microbiol. 1984. V.47. № 3. P.459-499.

121. Gorin G., Wang S.F., Papapavlou L. Assay of lysozyme by its lytic action on M. lyso-deikticus cells// Anal. Biochem. 1971. V. 39. P. 113-127.

122. Gouesbet G., Jan G., Boyaval P. Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus thermotoler-ance// Lait. 2001 V. 81. №1-2. P.301-309.

123. Graf E., Empson K., Eaton J. Phytic acid —- a natural antioxidant // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 11647-11650.

124. Graumann P., Marahiel M.A. Some like it cold: response of microorganisms to cold shock// Arch. Microbiol. 1996. V. 166. P. 293-300.

125. Gray K.M. Intercellular communication and group behavior in bacteria // Trends Microbiol. 1997. V.5. № 5. P. 184-188.

126. Gurwitsch A., Gurwich L. Uber den Ursprung der mitogenetischen Strahlen. // Roux' Archiv. 1925. V. 105. P. 470.

127. Gutierrez C., Barondess J., Manoil C., Beckwith J. The Use of Transposon TnphoA to Detect Genes for Cell Envelope Proteins Subject to a Common Regulatory

128. Stimulus. Analysis of Osmotically Regulated Genes in Escherichia coli // J. Mol. Biol. 1987. V. 195. P. 289-297.

129. На H.C., Sirisoma N.S., Kuppusamy P. The natural polyamine spermine functions directly as a free radical scavenger // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 1114011145.

130. Hamamoto Т., Kaneda M., Horikoshi K., Kudo T. Characterization of a protease from a psychritroph Pseudomonas fluorescens 114 // Appl. Environ. Microbiol. 1994. V.60. № 10. P. 3878-3880

131. Harris E.H. The Chlamydomonas Sourcebook. Academic Press, Inc., San Diego, CA, USA, 1989.

132. Harrison J.J., Ceri H., Roper N.J., Badry E.A., Sproule K.M., Turner R.J. Persister cells mediate tolerance to metal oxyanions in Escherichia coli// Microbiology. 2005. V.151. P. 3181-3195.

133. Harrison J.J., Turner R.J., Ceri H. Persister cells, the biofilm matrix and tolerance to metal cations in biofilm and planktonic Pseudomonas aeruginosa//Environ. Microbiol. 2005. V. 7. P. 981-994.

134. Hecker M, Volker U. General stress response of Bacillus subtilis and other bacteria. // Adv. Microb. Physiol. 2001. V. 44. № 1. P. 35-91.

135. Hengge-Aronis R. Back to log phase: 6s as a global regulator in the osmotic control of gene expression//Mol. Microbiol. 1996. V. 21. P. 887-893.

136. Hengge-Aronis R. Survival of hunger and stress: the role of rpoS in early stationary phase gene regulation in Escherichia coli // Cell. 1993. V. 72. P. 165-168.

137. Hengge-Aronis R., Loewen P.C. The role of the sigma factor {sigma} S (KatF) in bacterial global regulation // Annu.Rev.Microbiol. 1994. V. 48. P.53-80.

138. Herbert K.C., Foster S.J. Starvation survival in Listeria monocytogenes: Characterization of the response and the role of known and novel components // Microbiology. 2001 V. 147. №8. P. 2275-2284.

139. Hidalgo E., Bollinger J., Bradley T.M., Walsh C.T., Demple B. Binuclear 2Fe-2S. clusters in the Escherichia coli SoxR protein and role of the metal centers in transcription // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 20908-20914.

140. Hidalgo E., Demple B. Adaptive responses to oxidative stress: the SoxRS and OxyR regulon. In: Regulator of gene expression in Escherichia coli / Ed. Lin E., Linch A. Austin: R.G. Landes Company, 1996. P. 435-452.

141. Horionuchi S., Beppu T. A-factor as a microbial hormone that controls cellular differentiation and secondary metabolism in Streptomyces griseus. // Mol. Microbiol. 1994. Y. 12. P. 859-864.

142. Horionuchi S., Beppu T. Regulation of secondary metabolism and cell differentiation in Streptomyces: A-factor as a microbial hormone and the afsR protein as a component of two-component regulatory system.// Gene. 1992. V. 115. P. 167-172.

143. Horn G., Hofweber R., Kremer W., Kalbitzer H.R. Structure and function of bacterial cold shock proteins. Cell. Mol. Life Sci. 2007. V. 64. 12. P.1457-1470.

144. Hossain M.M., Nakamoto H. Role for the cyanobacterial HtpG in protection from oxidative stress // Current Microbiol. 2003. V. 46. № 1. P. 70-76.

145. Hounsa C.G., Brandt E. , Thevelein J., Hohmann S., Prior B.A. Role of trehalose in survival of Saccharomyces cerevisiae under osmotic stress // Microbiology. 1998. Vol. 144. P. 671-680.

146. Huang-Mo S., Yasbin R.E. Adaptive, or stationary-phase, mutagenesis, a component of bacterial differentiation in Bacillus subtilis // J. Bact. 2002. V. 184. № 20. P. 5641-5653.

147. Huisman G.W., Kolter R. Sensing starvation: a homoserine lactone dependent signaling pathway in Escherichia coli // Scince. 1994. V. 265. P. 537-539.

148. Hussain N.H., Goodson M., Rowbury R.J. Recent advances in biology: intercellular communication and quorum sensing in microorganisms. //Science Progress. 1998. V. 81. No l.P. 69-80.

149. Igarashi K. Physiological functions of polyamines and regulation of polyamine content in cells // Yakugaku Zasshi J. Pharm. Soc. J. 2006. V. 126. P. 455-471.

150. Ihihama A. Adaptation of gene expression in stationary phase bacteria // Curr.Opin.Genet.Develop. 1997.V. 7. P. 582-588.

151. Imlay J.A., Fridovich I. Assay of metabolic superoxide production in Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1991a. V. 266. P. 6957-6965.

152. Imlay J.A., Fridovich I. Superoxide production by respiring membranes of Escherichia coli//Free Radic. Res. Comms. 1991b. V. 12-13. P. 59-66.

153. Itokawa H., Miyashita T., Morita H., Takeya K., Hirano T., Homma M., Oka K., Structural and conformational studies of Ile7. and [Leu7] surfactins from Bacillus subtilis natto // Chem. Pharm. Bull. 1994. Vol. 42. P. 604-607.

154. Jacob F., Monod J. Genetic regulator}' mechanisms in the synthesis of proteins // J. Mol. Biol. 1961 V.3.P. 318-356.

155. James G.A., Korber D.R., Caldwell D.E., Costerton J.W. Digital image analysis of growth and starvation responses of surface colnizing Acinetobacter // J. Bacterid. 1995. Vol. 177. №4. P. 907-915.

156. Jamieson D.J., Storz G. Transcriptional regulators of oxidative stress response. In: Oxidative stress the molecular biology of antioxidant defenses / Ed. Scandalios J.G. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor, 1997. P. 91-115.

157. Janison C. Some aspects of SOS-response system a critical survey //Acta Biochim. Pol. 2001. V. 48. P. 599-610.

158. Jean D., Briolant V., Reysset G. Oxidative stress response in Clostridium perfringens // Microbiology. 2004. V.150. № 5-6. P. 1649-1659.

159. Jefferson K.K. What drives bacteria to produce a biofilm?//FEMS Microbiol. Lett. 2004. V. 236. P. 163-173.

160. Jenkins D. E., Chaisson S. A., Matin A. Starvation-induced cross protection against osmotic challenge in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1990. Vol. 172. №. 5. P. 2779-2781.

161. Jiang W., Hou Y., Inouye M. CspA, the major cold-shock protein of Escherichia coli, is an RNA chaperone //J. Biol. Chem. 1997. V. 272. № 1. P. 196-202.

162. Jones P.G., Inouye M. RbfA, 30S ribosomal binding factor, is a cold-shock protein whose absence triggers the cold-shock response // Mol. Microbiol. 1996. V. 21. № 6. P. 1207-1218.

163. Jones P.G., Inouye M. The cold-shock response — a hot topic // Mol. Microbiol. 1994. V. 11. №5. P. 811-818.

164. Jones P.G., Krah R., Tafuri S.R., Wollfe A.P. DNA gyrase, CS7.4, and the cold shock response in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1992b. V. 174. № 18. P. 5798-5802.

165. Jones P.G., Mitta M., Kim W.J., Inouye M. Cold shock inducts a major ribosomal-associated protein that unwinds double-standed RNA in Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 76-80.

166. Jones P.G., VanBogelen R.A., Neidhardt F.C. Induction of proteins in response to low temperature in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1987. V. 169. № 5. P. 2092-2095.

167. Juan S.M., Cazzulo J.J. The extracellular protease from Pseudomonas fluorescens // Ex-perientia. 1976. V. 32. №. 9. P. 1120-1122.

168. Kaiser D., Losick R. How and why bacteria talk to each other // Cell. 1993. V. 79. P. 873-885.

169. Kandror O., Goldberg A.L. Trigger factor is induced upon cold shock and enhances viability of Escherichia coli at low temperature // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 4978-4981.

170. Kaplan J. B., Meyenhofer M. F., Fine D. H. Biofilm growth and detachment of Acti-nobacillus actinomycetemcomitans // aJ. Bacteriol. 2003. V. 185. P. 1399-1404.

171. Kaplan J. B., Ragunath C., Ramasubbu N., Fine D. H. Detachment of Actinobacillus actinomycetemcomitans biofilm cells by an endogenous beta-hexosaminidase activity // J. Bacteriol. 2003. V. 185. P. 4693-4698.

172. Kaprelyants A.S. and Kell D.K. Do bacteria need to communicate each other for growth?// Trends in Microbiology. 1996. V.4. № 6. P.237-242.

173. Kaprelyants A.S., Mukamolova G.V., Kell D.B. Estimation of dormant Micrococcus luteus cells by penicillin lysis and by resuscitation in cell-free spent culture medium at high dilution.//FEMS Microbiology letters. 1994. V.115. P.347-352.

174. Kastaniotis A.J., Mennella T.A., Konrad C., Torres A.M., Zitomer R.S. Roles of transcription factor Mot3 and chromatin in repression of the hypoxic gene ANB1 in yeast // Mol. Cell. Biol. 2000. V. 20. P. 7088-7098.

175. Keren I., Kaldalu N., Spoering A., Wang Y., Lewis K. Persister cells and tolerance to antimicrobials//FEMS Microbiol. Lett. 2004. V. 230. P. 13-18.

176. Keren I., Shah D., Spoering A., Kaldalu N., Lewis K. Specialized persister cells and the mechanism of multidrug tolerance in Escherichia coli//J. Bacteriol. 2004. V. 186. P. 81728180.

177. Keyer K., Gort A.S., Imlay J.A. Superoxide and the production of oxidative DNA damage//J. Bacteriol. 1995. V. 177. P.6782-6790.

178. Kilstrup M., Jacobsen S., Hammer K., Vogensen F.K. Induction of heat shock proteins DnaK, GroEL and GroES by salt stress in Lactococcus lactic // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 179. № 17. P. 5471-5481.

179. Kim S.K. and Kaiser D. Purification and properties of Myxococcus xanthus C-factor, an intercellular signaling protein, Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 1990, vol.87, pp. 3635-3639.

180. Kim S.K. and Kaiser D., C-factor has distinct aggregation and sporulation thresholds during Myxococcus xanthus development, J. Bacteriol., 1991, vol. 173, pp. 1722-1728.

181. Kim, S.K., Kaiser, D., and Kuspa, A., Control of cell density and pattern by intercellular signaling in Myxococcus development.//Annu. Rev. Microbiol., 1992, vol.46, pp. 117-139.

182. Kjelleberg S., Hermansson M. Starvation-induced effects on bacterial surface characteristics // Appl. Environ. Microbiol. 1984. V.48. P. 497-503.

183. Kleerebezem M, Quadri L.E. Peptide pheromone-dependent regulation of antimicrobial peptide production in Gram-positive bacteria: a case of multicellular behavior. Peptides. 2001. V. 22. No 10. P. 1579-1596.

184. Kogoma T. Stable DNA replication: Interplay between DNA replication, homology recombination, and transcription// Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997. V. 61. P. 212-238.

185. Kolari M., Nuutinen J., Salkinoja-Salonen M.S. Mechanisms of biofilm formation in paper machine by Bacillus species: the role of Deinococcus geothermalis // J. of Ind. Microbiol. And Biotechnol. 2001. V. 27. №. 6. P. 343-351.

186. Kolenbrander P. E. Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems //Annu. Rev. Microbiol. 2000. V. 54. P. 413-437.

187. Konz D., Doekel S., Marachiel M.A. Molecular and biochemical characterization of the protein controlling biosynthesis of the lipopeptide lichenysin // J. Bacteriol. 1999. Vol. 181. № 1. P. 133-140.

188. Kozubek A. Tyman N. Resorcinol lipids, the natural non-isoprenoid phenolic amphi-philes and their biological activity // Chem. Rev. 1999. V.99. №1. P. 1-31.

189. Krin E., Chakroun N., Turlin E., Givaudan E., et al., Pleiotropic role of quorum-sensing autoinducer 2 in Photorabdus luminescens II Appl. Env. Microbiol. 2006. V. 72. P. 64396451.

190. Kroes I., Lepp P. W., Relman D. A. Bacterial diversity within the human subgingival crevice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P.14547-14552.

191. Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects. 3rd ed. New York: Marcel Dekker, 2004.

192. Lai L.C., Kosorukoff A.L., Burke P.V., Kwast K.E. Metabolic-state dependent remodeling of the transcriptome in response to anoxia and subsequent reoxygenation in Saccharo-myces cerevisiae // Eukaryot. Cell. 2006. V. 5. № 9. P. 1468-1489.

193. Lamark T., Rokenes T., McDougall J., Strom A.R. The complex bet promoters of Escherichia coli: regulation by oxygen (ArcA), choline (Betl), and osmotic stress // J. Bacteriol. 1996. V. 178.№6. P. 1655-1662.

194. Lange R., Hengge-Aronis R. Growth phase-regulated expression of bolA and morphology of Escherichia coli cells is controlled by the novel sigma factor, cts (rpoS) // J. Bacteriol. 1991. V. 173. P.4474-4481.

195. Lange R., Hengge-Aronis R. Identification of a central regulator of stationary-phase gene expression in Escherichia coli // Mol. Microbiol. 1991. V. 5. P. 49-59.

196. Lange R., Hengge-Aronis R. The cellular concentration of the os subunit of RNA polymerase in Escherichia coli is controlled at the levels of transcription, translation, and protein stability// Genes Dev. 1994. V.8. P.1600-1612.

197. Laplace J.M., Sauvageot N., Hartke A., Auffray Y. Characterization of Lactobacillus collinoides response to heat, acid and ethanol treatments // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 51 № 5. P. 659-663.

198. Larsen H., The family Halobacteriaceae. In: The Procoryotes. Pergamon press. N-Y.1981. V.l.

199. Laue B.E., Gill R.E. Using a phase-locked mutant of Myxococcus xanthus to study the role of phase variation in development //J. Bacteriol. 1995. - V. 177, №14. - P. 40894096.

200. Lazazzera B.A., Kurtser I.G., McQuade R.S., Grossman A.D. An Autoregulatory Circuit Affecting Peptide Signaling in Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 1999, V. 181, No. 17. P. 5193-5200.

201. Leandro P., Lechner M.C., Tavarec de Almeida I., Konecki D. Glycerol increases the yield and activity of human phenylalanine hydroxylase mutant enzymes produced in a pro-catyotic expression system // Mol. Gen. Metab. 2001. V. 73. P/ 173-178.

202. Leblanc L., Leboeuf C., Leroi F., Hartke A., Auffray Y. Comparison between NaCl tolerance response and acclimation to cold temperature in Shewanella putrefaciens // Current Microbiol. 2003. V. 46. P. 157-162.

203. Leblond P., Denuyter Ph., Moutier L., Laakel N., Decaris B., Simonet J.N. Hipervari-ability, a new phenomenon of genetic instability, related to DNA amplification in Strepto-myces ambofaciens // J. Bacteriol. 1989. V.171, №1. P.419-423.

204. Ledda L., Ferrara L., Scaloni A. Differential proteomic analysis in the study of pro-karyotes stress resistance Ann 1st Super Sanita 2005;41(4):459-468.

205. Lee J., Jayaraman A., Wood T.K. Indole as an inter-species biofilm signal mediated by SdiA // BMC Microbiology. 2007. V. 7. P. 42.

206. Lee M., Morrison D.A. Identificstion of a new regulator in in Streptococcus pneumoniae linking quorum sensing to competence for genetic transformation // J. Bacteriol. 1999. V. 181. № 16. P. 5004-5016.

207. Lee P.C., Bochner B.R., Ames B.N. AppA, heat shock stress and cell oxidation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. V. 80. P. 7596-7600.

208. Lentzen G., Schwarz T. Extremolytes: Natural compounds from extremophiles for versatile applications.//Appl Microbiol Biotechnol. 2006 V. 72. № 4. P. 623-634.

209. Levis K.' Pathogen resistance as the origin of kin altruism//J. Theor. Biol. 1998. V. 193. P. 359-363.

210. Lewis K. Programmed Death in Bacteria // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. V. 64. № 3. P. 503-514.

211. Li Y.-H., Hanna M.N., Svensater G., Ellen R.P., Cvitkovitch D.G. Cell density modulates acid adaptation in Streptococcus mutans: implication for survival in biofilms // J.Bacteriol. 2001. V.183. № 23. Pio6875-6884.

212. Lichtenthaler H.K. Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes. Meth. Enzymol., 1987. V. 148. P. 350-382.

213. Lorens N.J.M., Tormo A., Martínez-García E. Stationary phase in gram-negative bacteria// FEMS Microbiol. Rev. 2010. V. 34, Iss. 4, P. 476-495.

214. Loewen P.C., Hengge-Aronis R. The role of the sigma factor Ds (KatF) in bacterial global regulation//Annu. Rev. Microbiol. 1994. V. 48. P. 53-80.

215. London J. Bacterial adhesines // Ann. Rep. Med. Chem. 1991. V. 26. P. 229-237.

216. López-García P., Forterre P. DNA topology and the thermal stress response, a tale from mesophiles and hyperthermophiles. Bioessays. 2000. V. 22. No. 8. P. 738-746.

217. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall RJ. Protein measurement with Folin phenol reagent.//J.Biol. Chem. 1951. V.193. P. 265-275.

218. Lund P.A. Microbial molecular chaperones. Adv. Microb. Physiol. 2001. V. No 44. P. 93-140.

219. Lvte M., Frank C.D., Green B.T. Production of an autoinducer of growth by norepine-frine cultured Escherishia coli 0 0157:H7.//FEMS Microbiol Lett. 1996. V.139. P. 155-159.

220. M. Kates, Techniques in Lipidology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, 2nd edn., Elsevier Science, Amsterdam, 1986.

221. Ma M., Eaton J.W. Multicellular oxidant defense in unicellular organisms.// Proc Natl Acad USA. 1992. V.89.P. 7924-7928.

222. Macario A.J. L., Lange M., Ahring B.K., De Macario E.C. Stress genes and proteins in the Archaea // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. Vol. 63. No. 4 P. 923-967.

223. MacLeod, F. A., Guiot S. R., Costerton J. W. Layered structure of bacterial aggregates produced in an upflow anaerobic sludge bed and filter reactor//Appl. Environ. Microbiol. 1990. V.56.P. 1598-1607.

224. Magnuson R., Solomon J., Grossman A.D. Biochemical and genetic characterization of a competence pheromone from B. subtilis // Cell. 1994. V. 77. P. 207-216.

225. Malin G., Lapidot A. Induction of synthesis of tetrahydropyrimidine derivates in Strep-tomyces strains and their effect on Escherishia coli in responce to osmotic and heat-stress.//J. of Bacteriol. 1996. V.178. Iss.2. P.385-395.

226. Mamson M.D., Armitage J.D., Hoch J.A., Macnab R.M. Bacterial locomotion and signal transduction//J. Bacteriol. 1998. V. 180. № 5. P. 1009-1022.

227. Manoil C. and Kaiser D. Purine-eontaining compounds, including cyclic adenosine 3' 5'-monophosphate, induce fruiting body formation in Myxococcus xanthus by nutritional imbalance, J. Bacteriol., 1980, vol. 141, pp. 374 380.

228. Maries-Wright J., Lewis R.J. Stress responses of bacteria. Curr. Opin. Struct. Biol. 2007.V. 17. No 6. P. 755-760.

229. Marshall K.C. Adhesion as a Strategy for Access to Nutrients// Bacterial Adhesion. (Molecular and ecological diversity). Wiley-Liss. N-Y. 1996. P. 59-88.

230. Marshall K.C. Mechanisms of Bacterial Adhesion at Solid-Water Interfaces// Bacterial Adhesion. Mechanisms and Physiological significance. Plenum Press. New York, London. 1985. P.133-157.

231. Martinez A., Kolter R. Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps // J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 5188-5194.

232. Martino P.D., Fursy R., Bret L., Sandurararju B., Phillips R.S. Indole can act as an extracellular signal to regulate biofilm formation of Escherichia coli and other indole-producing bacteria//Can. J. Microbiol. 2003. V.49. № 7. P. 443-449.

233. Matin A. // Physiology, molecular biology and applications of the bacterial starvation response. J. of Appl. Bacteriol. Symposium Supplement., 1992, V.73, P49S-57S.

234. Matin A., Molecular analysis of starvation stress in Escherichia coli // FEMS Microbiol. Ecol., 1990, vol. 74, pp. 185-196.

235. Matin, A., Physiology , molecular biology and applications of the bacterial starvation response // J.Appl.Bact. Symp.Suppl., 1992, vol. 57, pp. 49-57.

236. Matson M., Armitage J., Hoch J., Macnab R. Bacterial locomotion and signal transduction. J. Bacteriol. 1998. V.180. №5. P. 1009-1022.

237. Matsuhashi M., Shindo A., Ohshima H., Tobi M., Endo S., Watanabe H., Pankrushina A.N, Cellular signals regulating antibiotic sensitivities of bacteria // Microbial drug resistance. 1996. Y.2, № 1, p.91-93.

238. Maximilien R.,. de Nys R., Holmstrom C., Gram L., Crass K.,. Kjelleberg S., Steinberg P.D. Chemical mediation of bacterial surface colonisation by secondary metabolites from the red alga Delisapulchrall Aquat.Microb. Ecol. 1998. V. 15. P. 233-246.

239. Miller M.B., Bassler B.L. Quorum sensing in bacteria. Ann. Rev. Microbiol. 2001. V.55. P.165-199.

240. Mireles J.R., Toguchi A., Harshey R.M. Salmonella enterica serovar typhimurium swarming mutants with altered biofilm-forming abilities: surfactin inhibits biofilm formation//J.Bacteriol. 2001, V. 183. P. 5848-5854.

241. Mobile DNA / Eds. Berg D.E. et.al.Washington D.C.: Amer.Soc.Microbiol. 1989. - P. 972.

242. Morello J.-P., Petaja-Repo,U.E., Bichet,D.G. and Bouvier,M. Pharmacological chaper-ones: a new twist on receptor folding. Trends Pharmacol. Sci., 2000. V. 21. P. 466-469.

243. Morikawa M. Beneficial biofilm formation by industrial bacteria Bacillus subtilis and related species // J. Biosci. and Bioengin. 2006. V. 101. P. 1-8.

244. Morita, R.Y., Bioavailability of energy and its relationship to growth and starvation survival in nature, Can. J.Microbiol, 1988, vol. 34, no. 4, pp. 436 -441.

245. Morris J.G. Bacterial shock responses. // Endeavour, New Series. 1993. V.17. № 1. P.2-6.

246. Moskvin O.V., Kaplan S., Gilles-Gonzalez M.A., Gomelsky M. Novel heme-based oxygen sensor with a revealing evolutionary history // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. №39. P. 28740-28748.

247. Mostertz J., Scharf M., Hecker M., Homuth G. Transcriptome and proteome analysis of Bacillus subtilis gene expression in response to superoxide and peroxide stress. // Microbiology (UK). 2004. V. 150. P.497-512.

248. Moyed H.S., Bertrand K.P. hipA, a newly recognized gene of Escherichia coli K-12 that affects frequency of persistence after inhibition of murein synthesis// J.Bacteriol. 1983. V. 155. P. 768-775.

249. Murray K.D., Bremer H. Control of the spoT-dependent ppGpp synthesis and degradation in Escherichia coli // J. Mol. Biol. 1996. V. 259. P. 41-57.

250. Musumeci, F., Scordino, A., Triglia, A., Blandino, G. and Milazzo, I. 1999. Intercellular communication during yeast cell growth, Europhys. Lett. 47(6), pp. 736-742.

251. Nealson K.H., Hastings J.W. Bacterial bioluminescence: its control and ecological significance // Microbiol. Rev. 1979. V. 43. P. 496-518.

252. Nikolaev Yu.A., EI-Registan G.I., Desu S.B. Distant interaction during germination of Bacillus subtilis spores. Biophotonics and coherent systems in biology. Eds. Beloussov L.V., Voeikov V.L., Martynyuk V.S. Springer. N-Y. 2007. P. 159-166.

253. Nunoshiba T., Hidalgo E., Cuevas C.F.A., Demple B. 2-Stage control of an oxidative stress regulon — the Escherichia coli soxR protein triggers redox-inducible expression of the soxS regulatory gene // J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 6054-6060.

254. Nystrom T. Starvation, cessation of growth and bacterial aging. Curr. Opin. Microbiol. 1999. V. 2. No 2. P.214-219.

255. Nystrom T. To be or not to be: the ultimate decision of the growth-arrested bacterial cell // FEMS Microbiol. Rev. 1998. V. 21. P. 283-290.

256. Nystrom T., Flardh K., Kjelleberg T., Responses to multiple-nutrient starvation in marine Vibrio sp. strain CCUG// J. Bacteriol., 1990, vol.172, pp. 3903-3909.

257. Nystrom T., Neidhardt F.C. Cloning, mapping and nucleotide sequencing of a gene encoding a universal stress protein in Escherichia coli // Mol. Microbiol. 1992. V. 6. P. 31873198.

258. Nystrom T. Stationary phase physiology.//Ann.Rev. of Microbiol. 2004. V. 58. P. 161181.

259. Okabe S., Ito T., Satoh H. Sulfate-reducing bacterial community structure and their contribution to carbon mineralization in a wastewater biofilm growing under microaerophilic conditions//Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V. 63. P. 322-334.

260. Oleskin A.V. Social behavior of microbial populations. // J.Basic Microbiol. 1994. V.34. No 6. P. 425-439.

261. Olson M.E., Ceri H., Morck D.W., Buret A.G., Read R.R. Biofilm bacteria: formation and comparative susceptibility to antibiotics//Can. J. Vet. Res. 2002. V. 66. P. 86-92.

262. O'Toole G. A., Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development // Mol. Microbiol. 1998. V. 30. P. 295-304.

263. Paerl H.W., Pinckney J.L. A mini-review of microbial consortia: their roles in aquatic production and biogeochemical cycling//Microb. Ecology. 1996. V. 31. P. 225-247.

264. Panoff J.-M., Thammavongs B., Gueguen M. Cold stress responses in mesophilic bacteria CY 972069 // J. Cryobiol. 1998. V. 36. P. 75-83.

265. Park J.-I., Grant C.M., Davies M.J., Dawes I.W. The Cytoplasmic Cu,Zn superoxide dis-mutase of Saccharomyces cerevisiae is required for resistance to freeze-thaw stress. // J Biol Chem., 1998. V. 273, Iss. 36, P. 22921-22928.

266. Parkinson J.S., Kofoid E.C. Communication modules in bacterial signalling proteins // Annu. Rev. Genet. 1992. V. 26. P. 71-112.

267. Parsell D.A., Lindquist S. The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins // Ann. Rev. Genet. 1993. V. 27. P. 437-496.

268. Penfold W.J. On the Nature of Bacterial Lag. // J. Hyg. 1914. V. 14. P. 215-241.

269. Perego M. A peptide export-import control circuit modulating bacterial development regulates protein phosphatases of the phosphorelay // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. №16. P. 8612-8617.

270. Periago P.M., van Schaik W., Abee T., Wouters J. A., Identification of proteins involved in the heat stress response of Bacillus cereus ATCC 14579 // Appl. Envir. Microbiol. 2002. V. 68. P. 3486-3495.

271. Pesci E.C., Milbank J.B.J., Pearson J.P., McKnight S., Kendle A.S., Greenberg E.P., Quinolone signaling in the cell-to-cell communication system of Pseudomonas aeruginosa. // PNAS USA. 1999. V. 96. P. 11229-11234.

272. Petaja-Repo U.E., Hogue M., Bhalla S., Laperriere A., Morello J.P., Bouvier M. Ligands act as pharmacological chaperones and increase the efficiency of delta opioid receptor maturation // EMBO J. 2002 V. 21. № 7. P. 1628-1637.

273. Plaza del Pino I.M., Sanchez-Ruiz J.M. An osmolyte effect on the heat capacity change for protein folding // Biochemistry. 1995.V. 34. P. 8621-8634.

274. Popp F.A, Li K.H., Mei W.P., Galle M. Neurohr R. Physical aspects of biophotons. // Experientia. 1988. V.44.No7. P. 576-585.

275. Pratt L. A., Kolter R. Genetic analysis of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili// Mol. Microbiol. 1998. V. 30. P. 285-293.

276. Primm T.P., Andersen S.J., Mizrahi V., Avarbock D., Rubin H. Barry C.E. The stringent response of Mycobacterium tuberculosis is required for long-term survival // J . Bacteriol. 2000. V. 182. 17. P.4889-4898.

277. Pringle J.H., Fletcher M., Ellwood D.C. Selection of attachment mutant during contini-ous culture of Pseudomonas fluorescens and relationship between attachement ability abd surface composition // J. Gen. Microbiol. 1983. V.129. №. 8. P.2557-2569.

278. Purevdorj-Gage B., Costerton W.J., Stoodley P. Phenotypic differentiation and seeding dispersal in non-mucoid and mucoid Pseudomonas aeruginosa biofilms // Microbiology. — 2005. V.151.P. 1569-1576

279. Rachid S., Olsen K., Witte W., Hacker J., Ziebuhr W. Effect subinhibitory antibiotic concentrations on polysaccharide intercellular adhesion expression in biofilm-forming

280. Staphylococcus epidermidis // Antimicrob. Agents Chemoter. 2000. V. 44. № 12. P.3357-3363.

281. Rahn 0. Ueber den Einfluss der Stoffwechselprodukte auf das Wachstum der Bakterien. // Zentr. Bakt. Parasitenk., 1906. II, 16, P. 417-429 and 609-617.

282. Rahn O. Invisible radiations of organisms. // Gebruder Borntaeger, Berlin, 1936.

283. Rao N., Kornberg A. Inorganic polyphosphate supports resistance and survival of stationary phase Escherichia coli//J. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 1394-1400.

284. Read R.R., Costerton J.W. Purification and characterization of adhesive exopolysaccha-rides from Pseudomonas putida and Pseudomonas fluorescens // Can. J. Microbiol. 1987. V. 33. P. 1080-1090.

285. Reusch R.N. and Sadoff, H.L., 5n-Alkylresorcinols from encysting Azotobacter vine-landii: Isolation and characterization.//!. Bacteriol. 1979. V. 139. pp. 448- 453.

286. Reusch, R.N., Sadoff H.L., Novel lipid components of the Azotobacter vinelandii cyst membrane //Nature, 1983, V. 302, N. 5905. P. 268-270.

287. Rice K.C., Bayles K.W. Death's toolbox: examining the molecular components of bacterial programmed cell death. Mol. Microbiol. 2003. V.50, № 3. P. 729-38.

288. Rice K.C., Bayles K.W. Molecular control of bacterial death and lysis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2008. V. 72. № 1. P.85-109.

289. Rickard A. H., Gilbert P., High N. J., Kolenbrander P. E., Handley P. S. Bacterial coag-gregation: an integral process in the development of multi-species biofilms // Trends Microbiol. 2003. V.ll. P. 94-100.

290. Roberts M.F. Osmoadaptation and osmoregulation in archaea: update 2004. // Front Biosci. 2004. V. 9. P. 1999-2019.

291. Rosenberg E. microbial surfactants. CRC Crit. Rev. Biotechnol. 1986. V.3. P. 109-132.

292. Rosenbluh A., Rosenberg E. Role of autocide AMI in development of Myxococcus xan-thus //J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 4307-4314.

293. Ross A.B., Redeuil K., Vigo M., Rezzi S., Nagy K. Quantification of alkylresorcinols in human plasma by liquid chromatography/tandem mass spectrometry // Rapid Comm. in Mass Spectrometry. 2010. V. 24, Iss. 5, p. 554-560.

294. Rowbury R.J. Extracellular sensors and inducible protective mechanisms // Trends Microbiol. 1999. V. 7. № 9. P. 345-346.

295. Rowbury R.J. Life science up-date. Do we need to rethink our ideas on the mechanisms of inducible process in bacteria?//Science Progress. 1998. V. 81. №3. P. 193-204.

296. Rowbury R.J. Humphrey T.J., Goodson M. Properties of an L-glutamate-indueed acid tolerance response which involves the functioning of extracellular induction components.// J. Appl. Microbiol. 1999. V 86. P. 325-330.

297. Rowbury R.J. Killed cultures of Escherichia coli can protect living organisms from acid stress. // Microbiology. 2000. V. 146, № 8, P. 1759-1760.

298. Rowbury R.J., Goodson M. Extracellular sensing and signaling pheromones switch-on thermotolerance and other stress responses in Escherichia coli // Science Progress. 2001. V. 84. P. 205-233.

299. Rowbury R.J., Goodson M. Induction of acid tolerance at neutral pH in log-phase Escherichia coli by medium filtrates from organisms grown at acidic pH //Lett. Appl. Microbiol. 1998. №26. P. 447- 451.

300. Rowbury R.J., Hussain N.H. The role of regulatory gene products in alkali sensitization by extracellular medium components in Escherichia coli // Lett. Appl. Microbiol. 1998. № 27. P. 193-197.

301. Rusting R.L. Why do we age // Sei. Amer. 1992. V. 267. P. 86-95.

302. Salmon K.A., Hung S.-P., Steffen N.R., Krupp R., Baldi P., Hatfield G.W., Gunsalusa R.P. Global gene expression profiling in Escherichia coli Kl2. Effects of oxygen availability and Acr A//J. Biol. Chem. 2005. V. 280. №15. P. 15084-15096.

303. Salmond G.P.C., Bycroft B.W., Stewart G.S.A.B., Williams P. The bacterial "enigma": cracking the code of cell-cell communication.//Mol. Microbiol. 1995. V.16. № 4. P. 615-624.

304. Samartzidou H., Mehrazin M., Xu Z.H. Benedic M.J., Delcour A.H. Cadaverine inhibition of porin plays a role in cell survival at acidic pH // J. Bacteriol. 2003. V. 185. P. 13-19.

305. Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. Molecular cloning. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989. V. 3. P. A. 3.

306. Sauer K., Camper A.K., Erlich G.D., Costerton J.W., Davies D.G. Pseudomonas aeruginosa displys multiple phenotypes during development as a biofllm // J. of Bacteriol. 2002. Vol. 184. №4. P. 1140-1154.

307. Saunders J. N. The genetic basis of phase and antigenic variation in bacteria // Antigenic Var. Infec. Diseases. Oxford. 1986. P.57-76.

308. Schein C.H. Solubility as a function of protein structure and solvent components // Bio/technology. 1990. V. 8. P. 308-317.

309. Schmidt G., Zink R. Basic features of the stress response in three species of bifidobacteria: B.longum, B.adolescentis, and B.breve // Int. J. Food Microbiol. 2000 V. 55 P. 41-45.

310. Schumann W. The Bacillus subtilis heat shock stimulon. Cell Stress Chaperones. 2003. V. 8. No 3. P. 207-217.

311. Sewertzowa L.B. Uber den Einflub der mitogenetischen Strahlen auf die Vermehrung der Bacterien.//Boil. Zentralbl. 1929. V. 49. P. 212-225.

312. Shapiro D.A., Dworkin M. (Eds.). Bacteria as multicellular organisms / N-Y.: Oxford Univ. Press, 1997. 456 p.

313. Shapiro J.A. The significances of bacterial colony patterns // BioEssays. 1995. V. 17. № 7. P. 597-607.

314. Sheffler I.E. Mitochondria. Wiley-Liss. N-Y. 1999. P. 367.

315. Shimkets, L.J. and Dworkin, M., Excreted adenosine is a cell-density signal for the initiation of fruiting body formation in Myxococcus xanthus, Devel. Biol., 1981, vol. 84, pp. 51-60.

316. Skorko-Glonek J., Zurawa D., Kuczwara E., Wozniak M., Wypych Z., Lipinska B. The Escherichia coli heat shock protease HtrA participates in defense against oxidative stress // Mol. Gen. Genet. 1999. V. 262. № 2. P. 342-350.

317. Smithies W.R., Gibbons N.E. The deoxyribose nucleic acid slime layer of some halo-philic bacteria. // Can. J. Microbiol. 1955. V.l. № 8. P. 614-621.

318. Solomon J.M., Grossman A.D. Who's competent and when: regulation of natural genetic competence in bacteria // Trends Genet. 1996. T. 12. № 1. P. 150-155.,

319. Solyanikova I.P., Konovalova E.I., El-Registan G.I., Solovieva L.A. Effect of alkylhy-droxybenzenes on the properties of dioxygenases.// J. of Env. Sei. and Health. 2010. V.45. P. 844-852.

320. Somero G.N. Adaptations to High Hydrostatic Pressure. //Annual Review of Physiology. 1992. V. 54, P. 557-577.

321. Sousa E.E.S., Tuckerman J.R., Gonzalez G., Gilles-Gonzalez M.A. DosT and DevS are oxygen-switched kinases in Mycobacterium tuberculosis // Protein Sei. 2007. V. 16. P. 1708-1719.

322. Spector M.P. The starvation-stress response (SSR) of Salmonella. Adv. Microb. Physiol. 1998. V. 40. P. 233-279.

323. Spoering A.L., Lewis K. Biofilm and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials//J. Bacteriol., 2001. V. 183. P. 6746-6751.

324. Spreti N., Di Profio P., Marie L., Bufali S., Brinchi L., Savelli G. Activation and stabilization of a-chymotrypsin by cationic additives. // Eur. J. Biochem. 2001. V. 268, P. 64916497.

325. Srinivasan S., Ostling, J., Charlton, T., de Nys, R., Takayama, K., Kjelleberg, S. Extracellular signal molecule(s) involved in the carbon starvation response of marine Vibrio sp. strain S14. J Bacteriol. 1998. V. 180, P. 201-209.

326. Srivatsan A., Wang J.D. Control of bacterial transcription, translation and replication by (p)ppGpp. // Curr. Opin. Microbiol. 2008. V. 11. № 2. P. 100-105.

327. Stasiuk M., Kozubek A. Biological activity of phenolic lipids. Cell. Mol. Life Sci. 2010. V. 67. P. 841-860.

328. Stephens K., Pheromones among prokaryotes // CRC Crit. Rev. Microbiol., 1986, vol. 13, no. 4, pp. 308-344.

329. Stevenson L.G., Rather P.N. A novel gene involved in regulating the flagellar gene cascade in Proteus mirabilis. J. Bacteriol. 2006. V. 188. No 22. P. 7830-7839.

330. Stok J.B., Ninfa A.J., Stosk A.N. Protein phosphorilation and regulation of adaptive responses in bacteria//Microbial. Rev. 1989. V. 53. № 4. P. 450-490.

331. Stoodley P., Dodds I., Boyle J. D., Lappin-Scott H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure // J. Appl. Microbiol. 1999. vol. 85. P. 19-28.

332. Stoodley P., Wilson S„ Hall-Stoodley L., Boyle J.D. Lappin-Scott H.M., Costerton J.W. Growth and detachment of cells clusters from mature mixed-species biofilmss // 2001. V. 67. No. 12. P. 5608-5613.

333. Storz G., Hengge-Aronis R. Bacterial stress responses. Washington: ASM Press DC; 2000.

334. Storz G., Tartaglia L.A., Ames B.N. Transcription regulator of oxidative stress-inducible genes: direct activation by oxidation // Science. 1990. V. 248. P. 189-194.

335. Storz G., Toledano M. Regulation of bacterial gene expression in response to oxidative stress // Methods in Enzymology. 1994. V. 236. Part B. P. 196-207.

336. Stozky G., Schenck S. Volatile organic compounds and microorganisms. // CRC Critical review in microbiology. 1976. V. 4. No 4. P.333-382.

337. Sudo S.Z., Dworkin M. Comparative biology of procaryotic resting cells // Adv. Microbiol. Physiol. 1973. V.9. P. 153 224.

338. Sugiyama K., Izawa S., Inoue Y. The Yaplp-dependent induction of glutathione synthesis in heat shock response of Saccharomyces cerevisiae // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 20. P. 15535-15540.

339. Summer K-H., Goggelmann W. Mutagenesity of l-fluoro-2,4-dinitrobenzene is affected by bacterial glutatione.//Mutat Res. 1980.V.70. P. 173-178.

340. Sutherland I. W.,. Hughes K. A., Skillman L. C., Tait K. The interaction of phage and biofilms// FEMS Microbiology Letters. 2004 V.232. P. 1-6.

341. Sutherland I.W. Biofïlm exopolysaccharides: a strong and and sticky framework // Microbiology. 2001. V. 147. P. 3-9.

342. Svensater G., Sjogreen B., Hamilton I.R. Multiple stress responses in Streptococcus mu-tans and the induction of general and stress-specific proteins // Microbiol.-UK. 2000. V. 146. Part l.P. 107-117.

343. Tartaglia L.A., Storz G. and Ames B.N.// Identification and molecular analysis of oxyR-regulated promoters important for the bacterial adaptation to oxidative stress. Mol. Biol., 1989, V.210, P. 709-719.

344. Tatzelt J., Prusiner S.B., Welch W.J. Chemical chaperones interfere with the formation of scrapie prion protein// EMBO J. 1996. V. 15. № 23. P. 6363-6373.

345. Timasheff S.N. Water as ligand: preferential binding and exclusion of dénaturants in protein unfolding 1992, v. 31, p. 9857-9864.

346. Tkachenko A., Nesterova L., Pshenichnov M., The role of natural polyamine putrescine in defence against oxidative stress in Escherichia coli. // Arch. Microbiol. 2001. V. 176. P. 155-157.

347. Tluscik F., Kozubek A., Mejbaum-Katzenellenbogen W. Alkylresorcinols in rye (Secale cereale L.) grains //Act. Soc. Bot. Pol. 1981. V. 54. № 7. P. 645-651.

348. Tran L.T., Inoue Y., Kimura A. Oxidative stress response in yeast: purification and some properties of a membrane-bound glutathione peroxidase from Hansenula mrakii // Biochem. Biophys. Acta. 1993. V. 1164. P. 166-172.

349. Turakhia M.H., Kooksey K.E., Charaklis W.G. Influence of a calcium-cpecific chelant on biofilm removal.// Appl.Environ.Microbiol. 1983. V.46. P. 1236-1238.

350. Y.E. Vaskovsky, N.A. Latyshev, Modified Jungnickel's reagent for detecting phospholipids and other phosphorus compounds on thin-layer chromatograms, J. Chromatogr. 115 (1975) 246-249.

351. Van der Vies S.M., Georgopoulos C. Regulation of chaperonin gene expression // Chap-eronins (Series: Cell Biology, A Series of Monographs). 1996. P. 137-166.

352. Van der Woude M., Bäumler A.J. Phase and Antigenic Variation in Bacteria // Clinical Microbiology Reviews. 2004. Vol. 17, No. 3. P. 581-611

353. Van Loosdrecht M.C.H. Bacterial Adhesion. Wageningen. 1988. 200 p.

354. Van Zyl P.J., Kilian S J., Prior B.A. The role of an active mechanism in glycerol accumulation during osmoregulation by Zygosaccharomyces rouxii // Appl. Microbiol. Biotech-nol. 1990. V. 34 № 2. P. 231-235.

355. Vandevivere P., Kirchman D.L. Attachments stimulatesexopolysoccharide synthesis by a bacterium. //Appl.Environ.Microbiol. 1993.V.59.No 10. P. 3280-3286.

356. Varon, M., Teitz, A., and Rosenberg, E., Myxococcus xanthus autocide AMI, J.Bacteriol., 1986, vol. 167, pp. 356-361.

357. Vater J. Lipopeptides, an attractive class of microbial surfactants // Progr. Colloid. Po-lym. Sci. (Poly. Colloid Syst.) 1986. Vol. 72. P. 12-18.

358. Velicer G., Kroos L., Lenski R.E. Developmental cheating in the social bacterium Myxococcus xanthus //Nature. 2000. V. 404. C. 598-601.

359. Velraeds M.M., van der Mei H.C., Reid G., Busscher H.J. Inhibition of initial adhesion of uropathogenic Enterococcus faecalis by biosurfactants from Lactobacillus isolates // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. P. 1958-1963.

360. Visick K.L., McFall-Ngai M.J. An exclusive contrast specificity in the Vibrio fischeri -Euprymna scolopes partnerst. // J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 1779-1787.

361. Vorobjeva L.I., Khodarv E.Yu., Cherdinceva T.A. The study of induced antimutagenesis of propionic acid bacteria. // J. Of Microbiol. Metii. 1996. V. 24. P. 249-258.

362. Wagner M., Loy A., Nogueira R., Purkhold U., Lee N., Daims H. Microbial community composition and function in wastewater treatment plants// Antonie Leeuwenhoek. 2002. V. 81. P.665-680.

363. Wang B., and Kuramitsu H. K. A pleiotropic regulator, Frp, affects exopolysaccharide synthesis, biofilm formation, and competence development in Streptococcus mutans. Infect. Immun. 2006. V. 74. P. 4581-4589.

364. Wang D., Ding X., Rathr P.N. Indole can act as an extracellular signal in Escherichia coli //J. Bacteriol. 2001. V.183. P. 4210-4216.

365. Wang J.Y., Syvanen M. DNA twist as a transcriptional sensor for environ-mental changes //Mol. Microbiol. 1992. V. 614. P. 1861-1866.

366. Ward D. M., Ferris M. J., Nold S. C., Bateson M. M. A natural view of microbial biodiversity within hot spring cyanobacterial mat communities // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62. P. 1353-1370.

367. Watnick P. I., Kolter R. Steps in the development of a Vibrio cholerae biofilm//Mol. Microbiol. 1999. V. 34. P. 586-595.

368. Watson S.P., Clements M.O., Foster S.J. Characterization of starvation-survival response of Staphylococcus aureus // J. Bacteriol. 1998. V. 180. № 7. P. 1750-1758.

369. Webb J. S., Thompson L. S., James S., Charlton T., Tolker-Nielsen T., Koch B., Givskov M., Kjelleberg S. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development//J. Bacteriol. 2003. V. 185. P. 4585^1592.

370. Weber M.H., Marahiel M.A. Bacterial cold shock responses. Sci. Prog. 2003.V. 86. Pt. 1-2. P.9-75.

371. Ween O., Gaustad P., Havarstein L.S. Identification of DNA binding sites for ComE, a key regulator of natural competence in Streptococcus pneumoniae // Mol. Microbiol. 1999. V. 33. №4. P. 817-827.

372. Wei J.-R., Tsai Y.-H., Horng Y.-T., Soo P.-C., Hsieh S.-C., Hsueh P.-R., Horng J.-T., Williams P., Lai H.-C. A Mobile Quorum-Sensing System in Serratia marcescens. J. Bacteriol. 2006.V. 188. P. 1518-1525.

373. Weinack O.M., Snoeyenbos G.H., Smyser C.F. A supplemental test-system to measure competitive exclusion of Salmonellae by native microflora in chicken gut. // Avian. Dis. 1979. V. 23. № 4. P. 1019-1030.

374. Welch T.J., Farewell A., Neidhardt F.C. and Bartlett D.H.// Stress response of Escheri-hia coli to elevated hydrostatic pressure. J. Bacteriol., 1993, V. 175, № 22, P.7170-7177.

375. Welch W.J. and Brown C.R. Influence of molecular and chemical chaperones on protein folding. // Cell Stress Chaperones. 1996. V. 1. № 2. P. 109-115.

376. Welsh D.T. Ecological significance of compatible solute accumulation by microorganisms: from single cells to global climate. // FEMS Microbiol. Rev. 2000. V. 24. P. 263-290.

377. Wessman G.E. and Miller D.J. Biochemical and Physical Changes in Shaken Suspensions ofPasteureliapestis. //Appl Microbiol. 1966. V. 14. № 4. P. 636-642.

378. Wheatley R.E., Millar S.E., Griffits D.W. The production of volatile organic compounds during nitrogen transformation in soils.// Plant and soil. 1996. V. 181. P. 163-167.

379. Whitehead N.A., Barnard A.M.L., Slater H., Simpson N.J.L., Salmond G.P.S. Quorym-sensing in Gram-negative bacteria //FEMS Microbiol. Rev. 2001. V. 25. P. 365-404.

380. Whiteley M., Lee K.M., Greenberg E.P. Identification of genes controlled by quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1999. V. 96. № 24. P. 13904-13909.

381. Wick L.M., Egli T. Molecular components of physiological stress responses in Escherichia coli. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004.V.89. P. 1-45.

382. Wildiers E. Nouvelle substance indispensable au développement de la levure. // La Cellule, 1901.V. 18, P. 313-333.

383. Williams H.N., Kelly J.Y., Baer M.L., Turng E.F.// Can. J. Microbiol. 1992. V. 41. P. 1142-1147. ,

384. Winkler K., Kienle I., Burger M., Wagner L.C., Holzier H. Metabolic regulation of the trehalose content of vegetative yeast // FEBS Lett. 1991. V. 291. № 2. P. 269-272.

385. Wireman, J. W., Dworkin M. Developmentally induced autolysis during fruiting body formation by Myxococcus xanthus. // J. Bacteriol. 1977. V. 129. P. 798-802.

386. Wirth R., Muscholl A., and Wanner G. The role of pheromones in bacterial interactions.// Trends in Microbiology. 1996. V. 4. P.96-103.

387. Wiuff C., Zappala R.M., Regoes R.R., Garner K.N., Baquero F., Levin B.R., Phenotypic tolerance: antibiotic enrichment of noninherited resistance in bacterial populations //Antimicrob. Agenta Chemother. 2005. V. 49. P. 1483-1494.

388. Wolff L.K., Ras G. Einige Untersuchungen über die mitogenetischen Strahlen von Gur-witsch.// Centr. Bact. I Orig. 1931. V. 123. P. 257.

389. Woods M.L., Bonfïglioli R., MsGee L.A. Georgopoulos C. Synthesis of select group of proteins by Neisseria gonorrhoeable in response to thermal stress // Infect, and Immun. 1990. V. 58. №3. P. 719-725.

390. Woojin K.S., Perl L., Hyeon P.J., Tandianus J.E., Noel D.W. // Assessment of stress response of the probiotic Lactobacillus acidophilus. Current Microbiol. 2001. V. 43. № 5. P. 346-350.

391. Yakimov M.M., Abraham W.-R., Meyer H., Guiliano L., Golyshin P.N. Structural characterization of lichenysin A components by fast atom bombardment tandem mass spectrometry // Biochim. Biophys. Acta. 1999. № 1438. P. 273-280.

392. Yakimov M.M., Timmis K.N., Wray V., Fredrickson H.L. Characterization of a new lipopeptide surfactant produced by thermotolerant halotolerant subsurface Bacillus licheni-formis В AS 50 // Appl. Env. Microbiol. 1995. Vol. 61. № 5. P. 1706-1713.

393. Yarmolinsky M.B. Programmed cell death in bacterial populations // Science. 1995. V. 267. P. 836-837.

394. Zgurskaya H.I., Keyhan M., Matin A. The DS level in starving Escherichia coli cells increases solely as a result of its increased stability, despite decreased synthesis // Mol. Microbiol. 1997. V. 24. P. 643-651.

395. Zheng M., Aslund F., Storz G. Activation of the OxyR transcription factor by reversible disulfide bond formation // Science. 1998. V. 279. P. 1718-1721.

396. Zheng M., Storz G. Redox sensing by prokaryotic transcription factors // Biochem. Pharmacol. 2000. V. 59. № 1. P. 1-6.

397. Zhou Y., Gottesman S. Regulation of proteolysis of the stationary-phase sigma factor RpoS //J. Bacteriol. 1998. V. 180. № 5. P. 1154-1158.

398. Zitomer R.S., Lowry C.V. Regulation of gene expression by oxygen in Saccharomyces cerevisiae//Microbiol. Reviews. 1992. V. 56. №1. P. 1-11.

399. Zobell C.E. The effect of solid surfaces upon bacterial activity//J.Bacteriol. 1943. V.46. P.39- 56.

400. Zobell C.E. The influence of solid surfaces upon the physiological activities of bacteria in sea water//J. Bacteriol. 1937. V.33. P. 86.

401. Zuckerberg A., Diver A., Peeri Z., Gutnik D.G., Rosenberg E. Emulsifier of 1 Ar-throbacterO RAG-1: chemical and physical roperties.//Appl.Environ.Microbiol. 1979. V.37. P. 414-420.

402. Адхья С. Регуляция экспрессии генов: опероны и регулоны. В книге: Современная микробиология. Прокариоты. Под ред. Ленгеллера Й., Древса Г., Шлегеля Г. М. Мир. 2005. Т. 1.

403. Акименко В.К„ Альтернативные оксидазы микроорганизмов, М. : Наука, 1989, 263 с.

404. Алейникова Т.Л., Рубцова Г.В. Руководство к практическим занятиям по биологической химии / Под. ред. А.Я. Николаева М.: Высшая школа, 1988. 239 с.

405. Алиханян С.И. Селекция промышленных микроорганизмов. М: Наука. — 1968. -С.14.

406. Анализ рынка пива в России в 2002-2008 гг., оценка влияния кризиса и прогноз на 2009-2010 гг. Электронный ресурс, http://mi.aup.ru/res/98/562949956961398.html

407. Андреищева Е.Н., Соарес М.И.М., Звягильская М.А. Энергетический обмен дрожжей Candida (Yarrowia) lipolytica в норме и при солевом стрессе // Физиология растений. 1997. Том 44. №5. С. 658-664.

408. Ануфриев Л.Ф. К вопросу о диссоциации в культуре В. thuringiensis var.dendrolimus в жидких и твердых среды среды. В кн. Биология микроорганизмов и их использование в народном хозяйстве. Иркутск. 1979. - С. 118-121.

409. Арзуманян В.Г., Воронина Н.А., Плакунов В.К., Беляев С.С. Степень галофильно-сти Rhodococcus erythropolis и Halobacterium salinarum определяется парциальным давлением кислорода// Микробиология. 2000. Т. 68. №2. С. 290-292.

410. Бабусенко Е.С., Эль-Регистан Г.И., Градова Н.Б., Козлова А.Н., Осипов Г.А. Исследование мембранотропных ауторегуляторных факторов метанокисляющих бактерий //Успехи химии. 1991. Т. 60. Вып.11. С. 2362 2373.

411. Багаева Т.В., Золотухина Л.М. Образование углеводородов сульфатредуцирую-щими бактериями в условиях хемолитогетеротрофного роста. // Микробиология, 1994. Т.63 .No 6. С. 993-995.

412. Баснакьян И.А. Стресс у бактерий. М. Медицина. 2003. 136 с.

413. Батраков С.Г., Придачина Н.Н., Кругляк Е.Б. и др. Необычный полиольный липид, 2-С^-талопиранозил-5-алкил-(С19-С21)-резорцин, из азотфиксирующей бактерии Azotobacter chroococcum.// Биоорг. химия. 1982. Т.8. С. 980-986.

414. Батраков С.Г., Эль-Регистан Г.И., Придачина Н.Н., Ненашева В.А., Козлова А.Н., Грязнова М.Н., Золотарева И.Н., Тирозол ауторегуляторный фактор dl Saccharomyces serevisiae // Микробиология. 1993. Т. 62. Вып. 4. С. 633 - 638.

415. Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомонозы // М.: Медицина, 1990.-С. 224.

416. Биологические проблемы старения и замедение старения антиоксидантами. Сб. Итоги науки и техники. Сер. Общие проблемы биологии. Под ред. Бурлаковой Е.Б. и Наджаряна Т.Л. Т. 5. М. ВИНИТИ. 1986. С. 1-240.

417. Бирюкова Е. Н., Аринбасарова А. Ю., Меденцев А. Г., Адаптация дрожжей Yar-rowia lipolytica к этанолу. // Микробиология, 2009, Т. 78, № 2, С. 186-191.

418. Бирюкова Е.И., Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. Устойчивость дрожжей Yarrowia lipolytica к окислительному стрессу. // Микробиология. 2006. Т. 75. № 3. С. 293-298.

419. Бирюкова E.H., Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. Изменение дыхательной активности клеток дрожжей Yarrowia lipolytica в условиях окислительного и теплового стрессов // Микробиология. 2008. Т. 77. № 4. С. 448—452.

420. Большой толковый словарь русского языка. Гл. ред. С.А. Кузнецов. С-Пб.: «Норинт», 2000. 1536 с.

421. Бояркин А.Н. Быстрый метод определения активности пероксидазы // Биохимия. 1951. Т. 16. С. 352-355.

422. Брюханов А.Л., Нетрусов А.И. Аэротолерантность строго анаэробных микроорганизмов: факторы защиты от окислительного стресса. // Прикладная биохимия и микробиология. 2007. Т.43. № 6. С. 635-652.

423. Бурлакова Е.Б. Биоантиоксиданты: вчера, сегодня, завтра. Биологическая кинетика. Сб. обзорных статей. М., 2005. Т. 2. С. 10-45.

424. Бут А. Адаптация к экстремальным средам. В кн. Современная микробиология. Прокариоты. В 2х томах. Т. 2. С. 122-146. М. Мир. 2005.

425. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина. 2005. 367 с.

426. Бухарин О.В., Гриценко В.А. Экологическая детерминированность внутривидового разнообразия патогенных бактерий // Журн. микробиол., эпдемиол. и иммунобиол. — 2000. № 1.С. 103-106.

427. Варвашевич Т.Н., Ковтун Г.Ю., Никифорова Л.С., Сидорова В.Е., Богомазова Т.В. Возможные механизмы адаптации микробных популяций к низким положительным температурам // Микробиол. журн. 1991. Т. 53. № 1. С. 22-27.

428. Веселова Т.В., Веселовский В.А. Стресс у растений (Биофизический подход) М. Изд. МГУ. 1993. 144 с.

429. Волошин С.А., Капрельянц A.C. Межклеточные взаимодействия в бактериальных популяциях//Биохимия. 2004. Т. 69.№11. С. 1555-1564.

430. Воробьёва Л.И. Стрессоры, стрессы и выживаемость бактерий. Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т.40. № 3. С. 261-269.

431. Воробьева Л.И., Абилев С.К. Антимутагенные свойства бактерий // Прикл. биохимия и микробиология. 2002. Т. 38. № 2. С. 115-127.

432. Воробьева Л.И., Алтухова Е.А., Наумова Е.С., Абилев С.К. Десмутагенное действие культуральной жидкости, полученной в результате пропионовокислого брожения //Микробиология. 1993. Т. 62. №. 6. С. 1093-1100.

433. Воробьева Л.И., Ходжаев У.Ю., Пономарева Г.М. Внеклеточный белок Luteococcus japonicus subsp. casei реактивирует клетки, инактивированные ультрафиолетовым облучением и нагреванием // Микробиология. 2003. Т. 72. №. 4. С. 482487.

434. Воробьева Л.И., Чердынцева Т.А., Абилев С.К. Антимутагенное действие бактерий против мутагенеза, индуцируемого 4-нитрохинолон-1-оксидом у Salmonella ty-phimurium // Микробиология. 1995. Т.64. №. 2. С. 228 233.

435. ВоюцкийС.С. Курс коллоидной химии. М. «Химия», 1975. С. 189.

436. Гейдебрехт О.В., Арзуманян В.Г., Плакунов В.К., Беляев С.С. Влияние степени аэрации среды на галотолерантность дрожжей родов Candida,' Rhodotorula и Malassezia // Микробиология. 2003. Т. 72. №3. С. 312-319.

437. Гёсслер К. О сущности жизни. М. Прогресс. 1984. 187 с.

438. Головлев Е.Л. Введение в биологию стационарной фазы бактерий // Микробиология. 1999. Т. 68. № 5. С. 623-631.

439. Головлев Е.Л. Метастабильность фенотипа у бактерий // Микробиология. 1998. -Т. 67, №2. С. 149-155.

440. Головлев Е.Л. Реакция бактериальных клеток на холодовый шок на уровне динамики хромосомы, транскрипции и трансляции // Микробиология. 2003. Т. 72. № 1. С. 5-13.

441. Грачева И. М. «Технология ферментных препаратов» М. «Элевар» 2000. 511с.

442. Грачева И.М., Грачев Ю.П., Мосичев М.С., Борисенко Е.Г., Богатков C.B., Гернет М.В. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. С. 36-57, 186-198.

443. Гурвич A.A. Проблема митогенетического излучения как аспект молекулярной биологии. Москва. Медицина. 1968.

444. Гурвич А.Г, Гурвич А.Д. Митогенетическое излучение: физикохимические основы и приложения в биологии и медицине. М. Медгиз. 1945.

445. Гусева М.А., Эпова Е.Ю., Ковалёв Л.И., Шевелёв А.Б. Изучение механизмов адаптации дрожжей Yarrowia lipolytica к щелочным условиям среды методами протеоми-ки.// Прикладная биохимия и микробиология. 2010. Т.46. № 3. С. 336-341.

446. Дедюхина Э.Г., Желифонова В.П., Ерошин В.К. Углеводороды микроорганизмов. //Успехи микробиологии. 1980. Т. 15. С. 84-98.

447. Демкипа Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях // Микробиология. 2000. Т. 69. №3.383-388.

448. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И., Звягинцев Д.Г. Репродуктивные покоящиеся формы Arthrobacter globiformis// Микробиология. 2000. Т. 69. №3. С. 377382.

449. Деткова E.H., Болтянская Ю.В. Осмоадаптация галоалкалофильных бактерий: роль осморегуляторов и возможность их пратического применения. // Микробиология. 2007. Т. 76. № 5. С. 581-593.

450. Доронина Н.В., Сахаровский В.Г., Драчук C.B., Троценко Ю.А. Органические ос-мопротекторы аэробных умеренно галофильных метилобактерий // Микробиология. 1998. Т. 67. №4. С. 458-463.

451. Дорошенко Е.В., Лойко Н.Г., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Горнова И.В., Эль-Регистан Г.И. Характеристика диссоциантов Bacillus cereus шт. 504 // Микробиология. 2001. Т. 70. № 6. С. 811-819.

452. Дуда В.И., Пронин C.B., Эль-Регистан Г.И., Капрельянц A.C., Митюшина Л.Л. Образование покоящихся рефрактерных клеток у Bacillus cereus под воздействием ау-торегуляторного фактора // Микробиология. 1982. Т. 51. № 1. С. 77 81.

453. Ждан-Пушкина С.М. Основы роста культур микроорганизмов. Ленинград.: Изд. Лен. Ун-та. 1983. 234 с.

454. Жизнь микробов в экстремальных условиях. Под ред. Кашнера Д. М.Мир.1981. 520 с.

455. Жилина Т.Н., Турова Т.П., Кузнецов Б.Б., Кострикина H.A., Лысенко A.M. Osenia sivashensis sp. nov. новая умеренно галофильная анаэробная бактерия из лагун Сиваша// Микробиология. 1999. Т. 68. № 4. С. 519-527.

456. Звягинцев Д.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями. М. Изд-воМГУ. 1973.

457. Звягинцев Д.Г., Гузев B.C., Гузева И.С. Адсорбция микроорганизмов в связи с этапами их развития //Микробиология. 1977. Т. 46. № 2. С. 295-299.

458. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меныцикова Е.Б. Окислительный стресс: биохимический и патофизиологический аспекты. М.: МАИК Наука/Интерпериодика, 2001. 343 с.

459. Зимон А.Д., Лещенко Н.Ф. Коллоидная химия. М.: АГАР, 2001. 320 с.

460. Иерусалимский Н.Д. Проблема онтогенеза бактерий и пути к ее разрешению // Тр. ИНМИ АН СССР, 1951. С. 5-43. (Обязательно процитировать)

461. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Биоплёнки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития// Генетика. 2004. Т. 40. С. 1445-1456.

462. Казначеев В.П., Михайлова Л.П. Биоинформационная функция естественных электромагнитных полей. Наука. Новосибирск. 1985.

463. Казначеев В.П., Михайлова Л.П. Сверхслабые излучения в межклеточных взаимодействиях. Наука. Новосибирск. 1981.

464. Калакуцкий Л.В., Агре Н.С. Развитие актиномицетов. М.: Наука, 1977. 286 с.

465. Капрельянц A.C., Скрыпин В.И., Эль-Регистан Г.И., Островский Д.Н., Дуда В.И. Изменение структурного состояния мембран M. lysodeikticus под влиянием препаратов ауторегуляторных факторов dl // Прикл. биохим. и микробиол., 1985, Т.21, № 31. с. 378-381.

466. Карпекина Т.А., Степаненко И.Ю., Крылова Е.И., Козлова А.Н., Грачёва И.М., Эль-Регистан Г.И. Участие микробных алкилоксибензолов в регуляции автолитиче-ской деструкции дрожжевых клеток // Микробиология. 2002. Т. 71. № 5. С. 611-618.

467. Кейтс М. Техника липидологии. М. Мир. 1975.

468. Кокоева М.В., Плакунов В.К. Возможность модификации осмочувствителыюсти экстремально-галофильных архебактерий. //Микробиология. 1993. Т.62. № 5. С. 825834.

469. Комарова Т.И., Поршнева О.В., Коронелли Т.В. Образование трегалозы клетками R- и S-вариантов Rhodococcus erythropolis // Микробиология. 1998. Т. 67. № 3. С. 428431.

470. Конев C.B. Структурная лабильность мембран и регуляторные процессы. М. Наука и техника. 1987. 240 с.

471. Конев C.B., Аксенцев C.JL, Черницкий Е.А., Кооперативные переходы белков в клетке. Минск. Наука и техника. 1970. 230 с.

472. Конев C.B., Мажуль В.М. Межклеточные контакты. Минск. Наука и техника. 1977. 290 с.

473. Коновалова Е.Ю., Эль-Регистан Г.И., Бабьева И.П. Динамика и накопление ауторегуляторных факторов di и d2 дрожжами Rhodosporidium toruloides. II Биотехнология. 1985, № 3. С. 71 74.

474. Краткий аналитический отчёт "Рынок лакокрасочных материалов". (27.04.2010) -с сайта http://www.himtrade.ru/info/st8.htm

475. Кузнецов В.Д. Изучение изменчивости актиномицетов продуцентов антибиотиков Антибиотики. 1972. Т. 17. № 7. С. 666-674.

476. Кузнецов В.Д. Спонтанная изменчивость актиномицетов продуцентов антибиотиков и стабилизация их биосинтетической активности и таксономических свойств / Док. дис. ИНМИ АН СССР. 1974.

477. Кунтиков Е. И., Горленко В. М. Взаимозависимость гало- и термотолерантности у аноксигенных фототрофных бактерий // Микробиология. 1998. Т. 67. №3. С. 298-304.

478. Ланка Э., Пансеграу В. Обмен генетической информацией между микрорганизма-ми. В кн. Современная микробиология. Прокариоты. В 2х томах. Т. 1. С. 473-502. М. Мир. 2005.

479. Ленгелер Й., Постма П. Общие регуляторные сети и пути передачи сигналов. В кн. Современная микробиология. Прокариоты. В 2х томах. Т. 2. С. 608-614. М, Мир. 2005.

480. Лойко Н.Г., Козлова А.Н., Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.И. Низкомолекулярные ауторегуляторы бактерий Thioalkalivibrio versutas и Thioalkalimicrobium aerophilum // Микробиология. 2002. Т. '71. № 3. С. 308-315.

481. Лущак В.И. Окислительный стресс и механизмы защиты от него у бактерий // Биохимия. 2001. Т. 55. № 5. С. 592-609.

482. Лыоис К. Персистирующие клетки и загадка выживания биопленок // Биохимия. 2005.Т. 70. С. 327-336.

483. Максимов В.Н., Милько Е.С., Ильиных И.А. Влияние углеродного, азотного и фосфорного питания на рост R-, S- и М-диссоциантов Pseudomonas aeruginosa в смешанных культурах // Микробиология. 1999. Т. 68, № 4. С. 485-490.

484. Максимов В.Н., Милько Е.С., Ильиных И.А. Влияние углеродного, азотного и фосфорного питания на рост R-, S- и М-диссоциантов Pseudomonas aeuginosa // Микробиология. 1999 б. Т.68. № 2. С. 206-210.

485. Мальцев П. М. Химико-технологический контроль производства солода и пива. М., «Пищевая промышленность», 1976. 446с.

486. Мартиросова Е. И., Карпекина Т. А., Эль-Регистан Г. И. Модификация ферментов естественными химическими шаперонами микроорганизмов // Микробиология 2004. Т. 73. №5. С. 708-715.

487. Матвеева Н.И, Воронина H.A., Борзенков И.А., Плакунов В.К., Беляев С.С. Состав и количественное содержание осмопротекторов в клетках нефтеокисляющих бактерий при разных условиях культивирования // Микробиология. 1997. Т. 66. №1. С. 3237.

488. Матыс В.Ю., Барышникова Л.М., Головлев Е.Л. Адаптация к стрессовым условиям у представителей родов Rhodococcus и Gordona // Микробиология. 1998. Т. 67. №6. С. 743-747.

489. Меденцев А.Г., Акименко В.К. Развитие и активация цианидрезистентного дыхания у дрожжей Yarrowia lipolytica // Биохимия. 1999. Т. 64. № 8. С. 1123-1131.

490. Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. Адаптация фитопатогенного гриба Fusarium decemcellulare к окислительному стрессу // Микробиология. 2001. Т. 70. №1. С. 34-38.

491. Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. Биосинтез нафтохиноновых пигментов грибами рода Fusarium // Прикладная биохимия и микробиология, 2005, Т. 41, №5, С. 573-577.

492. Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. Регуляция и физиологическая роль цианидрезистентной оксидазы у грибов и растений // Биохимия. 1999. Т. 64. Вып. 11. С. 1457-1472.

493. Мейсель М.Н. О биологическом действии ионизирующих излучений на микроорганизмы. Действие облучения на организм. Докл. сов. делегации на Междунар. конф. по мирн. использов. атомн. энергии. Изд-во АН СССР, 1958. С. 78-111.

494. Мейсель М.Н., Кондратьева Т.М. О ранних изменениях в клетках культур тканей под влиянием рентгеновских лучей // Вопросы радиобиологии. 1956. С. 314-324.

495. Мельников Э. Э., Ротанова Т. В. Молекулярные шапероны // Биоорганическая химия, 2010, Т. 36, № 1, С. 5-14.

496. Меньшикова Е.Б., Зенков Р.К., Реутов В.П. Оксид азота и NO-синтазы в организме млекопитающих при различных функциональных состояниях // Биохимия. 2000. Т. 65. №4. С. 485-503.

497. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М. Мир, 1976. С. 436.

498. Милько Е.С., Егоров Н.С. Гидрофильно-гидрофобные и адгезивные свойства диссоциантов Rhodococcus rubropertinctus//Микробиология. 1994. Т. 63. Вып. 2. С. 382-384.

499. Милько Е.С., Егоров Н.С. Влияние физико-химических факторов среды на рост диссоциантов некоторых грамположительных бактерий // Биол. науки. 1992. № 5. С. 89-96.

500. Милько Е.С., Егоров Н.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации. М.: Изд-во МГУ, 1991. 142 с.

501. Милько Е.С., Ильиных И.А. Влияние пониженных концентраций углерода, азота и фосфора в среде на динамику роста трех диссоциантов Pseudomonas aeruginosa //Микробиология. 2001. Т. 70. № 5. С. 607-610.

502. Милько Е.С., Никитенко J1.A. Влияние физико-химических факторов среды на рост диссоциантов Pseudomonas aeruginosa // Прикл. биохим. и микробиол. 1998. Т. 34. №2. С. 171-174.

503. Мулюкин A.JI. «Покоящиеся формы неспорообразующих бактерий: свойства, разнообразие, диагностика». Диссертация и автореферат на соискание степени доктора биологических наук. Москва. 2010.

504. Мулюкин A.JL, Козлова А.Н., Капрельянц А.С., Эль-Регистан Г.И. Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторного фактора dl в культуральной жидкости и клетках Micrococcus luteus II Микробиология. 1996. Т. 65. Вып. 1. С. 20-25.

505. Мулюкин A.JL, Луста К.А., Грязнова М.Н., Бабусенко Е.С., Козлова А.Н. Дужа М.В., Митюшина Л.Л., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм в автолизирующихся суспензиях микроорганизмов // Микробиология. 1997. Т. 66. №1. С. 42-49.

506. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н., Козлова А.Н. Дужа М.В., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Bacillus cereus и Micrococcus luteus //Микробиология. 1996.Т. 65. №6. С. 782-789.

507. Мунблит В.Я., Тальрозе В.Л., Трофимов В.И. Термоинактивация микроорганизмов. // Москва. Наука. 1985. С. 174.

508. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии. М. Academia. 2005. 608 с.

509. Николаев Ю.А. Дистантные информационные взаимодействия у бактерий. // Микробиология, 2000. Т.69. № 5. С. 597-605.

510. Носкин JI.A., Бреслер С.Е., Смирнова И.С., Суслов A.B. Исследование индукции и репарации повреждений ДНК в гепатоцитах крыс, возникающих под действием рентгеновского излучения //Радиобиология. 1982. Т. 22. № 1. С. 44-50.

511. Обзор фармацевтического рынка по итогам первого полугодия 2009 г. http://www.remedium.ru/analytics/review/articles/detail.php ?ID=33921

512. Обзор ЦМИ «Фармэксперт» Коммерческий сектор российского фармрынка по итогам 2007 г., http://www.pharm-medexpert.ru/rating3.php

513. Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Редокс-регуляция клеточных функций // Биохимия. 2007. Т. 72. Вып. 2. С. 158-174.

514. Олескин A.B., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология. 2000. Т.69. № З.С. 309—327.

515. Олескин A.B., Кировская Т.А. Популяционно-коммуникативное исследовательское направление в микробиологии // Микробиология. 2006. Т.75. № 4. С. 1-6.

516. Осипов А.Н., Азизова O.A., Владимиров Ю.В. Активные формы кислорода и их роль в организме //Успехи биологической химии. 1990. Т. 31. С. 180-208.

517. Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.И., Светличный В.А., Козлова А.Н., Дуда В.И., Ка-прельянц A.C., Помазанов В.В. О химической природе ауторегуляторного фактора d Pseudomonas carboxydoflava.//Микробиология. 1985. Т. 54. Вып.2. С. 186-190.

518. Островский Д.Н. Новые участники окислительного стресса у бактерий // Успехи биологической химии.' 1997 а. Т. 37. С. 147-169.

519. Островский Д.Н. Окислительный стресс у бактерий. 53-е Баховское чтение. Москва, 1997 б. 23 с.

520. Паников Н.С. Кинетика роста микроорганизмов: Общие закономерности и экологические приложения. М.: Наука, 1991. 311с.

521. Пивоварова Т. А., Джансугурова P.C., Каравайко Г.И. Роль экзометаболитов в устойчивости Thiobacillus ferrooxidans к молибдену // Микробиология. 1991, Т.60, № 4. С. 609-615.

522. Пирог Т.П., Гринберг Т.А., Малашенко Ю.Р. Защитные функции экзополисахари-дов, синтезируемых бактериями Acinetobacter sp. // Микробиология. 1997. Т. 66. Вып. 3. С. 335-340.

523. Плакунов В. К., Арзуманян В. Г., Воронина Н. А., Беляев С. С. Взаимосвязь кинетики роста и дыхания у родококков в присутствии высоких концентраций солей // Микробиология. 1999. Т. 68. №1. С. 40-44.

524. Плакунов В.К. Основы энзимологии. М.: Логос, 2001. 128 с.

525. Плакунов В.К., Гейдебрехт О.В., Шелемех О.В. Множественный стресс у микроорганизмов: зло или благо? Труды ИНМИ РАН. Вып. XII. 2004. М: Наука. С. 361-375 (обзор).

526. Плакунов В.К., Шелемех О.В., Кислородная регуляция метаболизма у микроорганизмов // Микробиология. 2009. Т. 78. № 5. С. 592-604.

527. Популярная медицинская энциклопедия (http://medicine-enc.net)

528. Прозоров А. А. Феромоны компетентности у бактерий. // Микробиология. 2001. Т. 70. № 1.С. 5-14.

529. Прозоров A.A. Дифференцировка клеток и ее регуляция при генетической трансформации у бактерий // Микробиология. 1997. Т. 66 . № 1. С. 5-13.

530. Прозоров A.A. Рекомбиногенные перестройки генома бактерий, и адаптация к среде обитания // Микробиология. 2001. Т. 70. № 5. С. 581-594.

531. Пронин C.B., Эль-Регистан Г.И., Шевцов В.В., Дуда В.И., Устойчивость покоящихся цистоподобных форм Bacillus cereus к воздействию высокой температуры, ультрафиолетовых лучей и низкомолекулярных спиртов // Микробиология. 1982, Т.51, С. 314-317.

532. Работнова И.Л., Позмогова И.Н., Баснакьян И.А. // Итоги науки и техники. Серия микробиология. Т. 11. М.: ВИНИТИ. 1981. 214 с.

533. Раилкин А.И. Процессы колонизации и защита от биообрастания. С.-Пб: изд-во СпбГУ. 1998. 272 с.

534. Рапопорт А.И., Пузыревская О.М., Саубенова М.Г. Полиолы и устойчивость дрожжей к обезвоживанию //Микробиология. 1988. Т. 52. № 2. С. 329-331.

535. Рихванов Е.Г., Варакина Н.Н., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Войников В.К. Действие ингибиторов цитохроксидазного комплекса на термоустойчивость дрожжей // Микробиология. 2003. Т. 72. № 2. С. 174-179.

536. Рихванов Е.Г., Варакина Н.Н., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Киселева В.А., Войников В.К. Изменение дыхания при действии теплового шока на дрожжи Saccharomyces cerevisiae // Микробиология. 2001. Т. 70. №4. С. 531-535.

537. Рихванов Е.Г., Варакина Н.Н., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Киселева В.А., Войников В.К. Влияние азида натрия на устойчивость к тепловому шоку Saccharomyces cerevisiae и Debaryomyces vanriji // Микробиология. 2001а. Т. 70. № 3. С. 300-304.

538. Рогинский В.А. Фенольные антиоксиданты: реакционная способность и эффективность. М.: Наука, 1988. 247 с.

539. Романовская В.А., Соколов И.Г., Малашенко Ю.Р., Рокитко П.В. Мута-бельность эпифитных и почвенных бактерий рода Methylobacterium и их резистентность к ультрафиолетовому ионизирующему излучению // Микробиология. 1998. Т. 67. № 1. С. 106-115.

540. Рощина Е.К., Добролеж О.В., Петров JI.H. Спектрофлуориметрический анализ Escherichia coli в процессе хранения в физиологическом растворе. // Микробиология, 1984. Т. 53. №6. С. 1016-1020.

541. Рощина Е.К., Петров JI.H. Выделение белка во внеклеточное пространство как неспецифическая реакция Escherichia coli на стресс. // Микробиология, 1997. Т. 66. № 2. С. 179-184.

542. Рубан E.JI. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas. М. Наука, 1986

543. Ряпис JI.A. Клоновая, фазовая изменчивость бактериальных видов и их связь с проявлениями эпидемического процесса // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммуно-биол. 1995. № 1. С. 109-111.

544. Светличный В.А., Романова А.К., Эль-Регистан Г.И. Изучение количественного содержания мембраноактивных ауторегуляторов при литоавтотрофном росте Pseudomonas carboxydoflava. // Микробиология. 1986. Т.55. С. 55-59.

545. Светличный В.А., Эль-Регистан Г.И., Романова А.К., Дуда В.И., Характеристика ауторегуляторного фактора d2, вызывающего автолиз клеток Pseudomonas carboxydoflava и Bacillus cereus// Микробиология. 1983. т. 52, с. 33 38.

546. Селье Г. Стресс без дистресса. М.: «Прогресс», 1982. 125 с.

547. Смирнова Г. В., Закирова О. Н., Октябрьский О. Н. Роль антиоксидантных систем в отклике бактерий Escherichia coli на тепловой шок // Микробиология. 2001. Т. 70. №5. С. 595-601.

548. Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., Глутатион у бактерий // Биохимия. 2005. Т. 70, Вып. 11, с. 1459-1473.

549. Смирнова Т.А., Диденко JI.B., Азизбекян P.P., Романова Ю.М. Структурно-функциональная характеристика бактериальных биоплёнок. // Микробиология. 2010. Т. 79. № 4. С. 435-446.

550. Соболева Е.В., Гусева А.Н. Химия горючих ископаемых. Изд. МГУ. 1998.

551. Советский энциклопедический словарь. Москва. Советская энциклопедия. 1989. С.617.

552. Современная микробиология. Прокариоты. В 2х томах. М. Мир. 2005.

553. Сузина H. Е., Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Шорохова А.П., Дмитриев В.В., Бари-нова Е.С., Мохова О.Н., Эль-Регистан Г.И., Дуда В.И. Тонкое строение покоящихся клеток некоторых неспорообразующих бактерий // Микробиология. 2004. Т. 73. № 4. С. 516-529.

554. Теппермен Дж., Теппермен X. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. М. Мир. 1989. 659 е.;

555. Терёшина В.М., Меморская A.C. Адаптация Flammulina velutipes к гипотермии в природных условиях: роль липидов и углеводов. // Микробиология. 2005. Т. 74. № 3. С. 329-334.

556. Терёшина В.М., Меморская A.C., Котлова Е.Р., Феофилова Е.П. Состав мембранных липидов и углеводов цитозоля в условиях теплового шока у Aspergillus niger. // Микробиология. 2010. Т. 79. № 1. С. 45-51.

557. Ткаченко А.Г., Нестерова Л.Ю. Полиамины как модуляторы экспрессии генов окислительного стресса у Escherichia coli // Биохимия. 2003. Т. 68. Вып. 8. С. 10401048.

558. Ткаченко А.Г., Пожидаева О.Н., Шумков М.С. Роль полиаминов в формировании множественной антибиотикоустойчивости Escherichia coli в условиях стрессорных воздействий // Биохимия. 2006. Т. 71. С. 1287-1296.

559. Ткаченко А.Г., Салахетдинова О.Я., Пшеничнов М.Р. Обмен путресцина и калия между клеткой и средой как фактор адаптации Escherichia coli к гиперосмотическому шоку // Микробиология. 1997. Т. 66. № 3. С. 329-334.

560. Ткаченко А.Г., Салахетдинова О.Я., Пшеничнов М.Р. Роль транспорта путресцина и калия в адаптации Escherichia coli к голоданию по аммонию // Микробиология. 1996. Т. 65. №6. С. 740-744.

561. Ткаченко А.Г., Чудинов А.А. Обмен полиаминами между клеткой и средой как один из факторов, определяющих развитие культур Escherichia coli // Микробиология. 1989. Т. 58. Вып. 4. С. 584-590.

562. Ткаченко А.Г., Шумков М.С., Ахова А.В. Адаптивные функции полиаминов Escherichia coli при сублетальных воздействиях антибиотиков // Микробиология. 2009. Т. 78. С. 32-41.

563. Феофилова Е.П. Торможение жизненной активности как универсальный биохимический механизм адаптации микроорганизмов к стрессовым воздействиям // Прикл. биохим. и микробиол. 2003. Т. 39. №1. С. 5-24.

564. Феофилова Е.П. Трегалоза, стресс и анабиоз // Микробиология. 1992. Т.61. Вып. 5. С. 741-755.

565. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Хохлова Н.С., Меморская А.С. О различных механизмах биохимической адаптации мицелиальных грибов к температурному стрессу: изменения в составе углеводов цитозоля // Микробиология. 2000. Т. 69. Вып. 5. С. 606-611.

566. Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов. М.: Мир, 1980. 432 с.

567. Филимонова М.Н., Губская В.П., Нуретдинов И.А., Бенедик М.Дж, Богомольная Л.М., Андреева М.А., Лещинская И.Б. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens. Роль ионо Mg2+ в механизме гидролиза // Биохимия. 1997. Т. 62, Вып. 9. С. 1148-1154.

568. Фунтикова Н.С., Карасевич Ю.Н. Период задержки роста дрожжей Candida tropicalis на феноле. //Микробиология. 1981. Т.50. №. 4. С. 655-658.

569. Хохлов A.C. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы. М: Наука. 1988. 272 с.

570. Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. М.: Мир, 1988,- 568 с.

571. Шайтан К.В., Терешкина К.Б. Молекулярная динамика белков и пептидов. М: Ойкос, 2004, с. 103.

572. Шапиро Д.А. Бактерии как многоклеточные микроорганизмы.// В мире науки. 1988. № 8. С.46-54.

573. Шелемех О.В., Гейдебрехт О.В., Плакунов В.К., Беляев С.С. "Кислородная регуляция" состава дыхательной цепи дрожжей Debaryomyces hansenii при множественном стрессе // Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 562-569

574. Шеховцова Н.В., Звягинцев Д.Г., Паников Н.С., Кинетика роста Arthrobacter globi-fîrmis и Pseudomonas fluorescens на средах со стеколоволокном // Микробиология, 1992. Т.62, № 6. С. 995-1003.

575. Шпаков А.О. Сигнальные молекулы бактерий непептидной природы QS-типа. // Микробиология. 2009. Т. 78. № 2. С.163-175.

576. Электронная биржа http://offers.tradedir.ru/goods/foods/grain/

577. Электронная энциклопеция Википедия http://ra.wikipedia.0rg/wiki/3epH0BbieKyjibTypbi

578. Электронный ресурс http://medi.ni/doc/6100406.htm

579. Электронный ресурс http://www.niopik.ru/products/disinfection/review/;

580. Электронный ресурс http://www.optimadent.ru;

581. Электронный ресурс Анализ рынка ферментов в России в 2009 году. http://www. bioinformatix.ru/interesnoe/ryinok-fermentov-v-ozhidanii-peremen.html

582. Электронный ресурс для расчёта степени гомологий последовательностей ДНК -http: // www. ncbi. nlm. nih. gov / blast / Blast, cqi

583. Электронный ресурс Росстата http://www.gks.ru

584. Эль-Регистан Г.И., Цышнатий Г.В., Дужа М.В., Пронин C.B., Митюшина JI.JI., Савельева Н.Д., Капрельянц A.C., Соколов Ю.М. Регуляция роста и развития

585. Pseudomonas carboxydoflava специфическими эндогенными факторами // Микробиология. 1980. Т. 49. № 4. С. 561-565.

586. Ю. Кротов. Предельно допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде. Справочник. Изд-во НПО Профессионал, С-Пб. 2003.

587. Юркевич Д.И., Кутушенко В.П. Медузомицет (чайный гриб): научная история, состав, физиология и метаболизм // Биофизика. 2002. Т. 47. С. 1116-1129.

Информация о работе

Николаев, Юрий Александрович
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы