Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

АУТОИММУННЫЕ ПРОЦЕССЫ У САМЦОВ, ИХ ВЫЯВЛЕНИЕ И УСТРАНЕНИЕ С ЦЕЛЬЮ УЛУЧШЕНИЯ ВОСПРОИЗВОДСТВА

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "АУТОИММУННЫЕ ПРОЦЕССЫ У САМЦОВ, ИХ ВЫЯВЛЕНИЕ И УСТРАНЕНИЕ С ЦЕЛЬЮ УЛУЧШЕНИЯ ВОСПРОИЗВОДСТВА"

Л-¿СУ4ЧУ

всесоюзный ордена трудового красного знамени

научно-исследовательский институт животноводства

На правах рукописи

КОЧЕТКОВ Александр Александрович

УДК 636.082.453 и 636.612.017.1'

АУТОИММУННЫЕ ПРОЦЕССЫ У САМЦОВ, ИХ ВЫЯВЛЕНИЕ И УСТРАНЕНИЕ С ЦЕЛЬЮ УЛУЧШЕНИЯ ВОСПРОИЗВОДСТВА

06.02.01 — разведение, селекция и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

дубров ицы, московской обл. 1988

>■ '--г.-." - ' —

Работа выполнена в Отделе биологии воспроизведения и искусственного осеменения Всесоюзного научно-исследовательского института животноводства.

Научный руководитель — доктор биологических наук,

профессор И. И. Соколовская

Официальные оппоненты — доктор биологических наук

И. Я. ШИХОВ;

кандидат биологических наук В. В. ЖАРКИН.

Ведущее учреждение — Литовский научно-исследовательский

институт животноводства.

Защита диссертации состоится «

Мл.

в_на заседании специализированного совета

Д 020.16.01 при Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес: 142012. Московская обл., Подольский р-н, нос. Дубровицы.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан «

л«™« 1 т г.

Ученый секретарь специализированного соаета

доктор с/х н^'х:* - А. И. Филатов

X; ОЫЦАЯ 2АРАКГЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1, Актуальность проблема. Применение достижений иммунологии воспроизведения для повышения оплодотворяющей способности семени производителей и снижения эмбриональной смертности их потомства может быть одним из перспективных путей выполнения задачи увеличения продукции животноводства, поставленной 2ХУ11 съездом . КПСС и Продовольственной программой СССР.

По мере формирования живчиков в процессе сперматогенеза на их поверхности появляются специфические протеины, обладающие антигенным действием. Проникая в кровь самцов, они вызывают реакцию им-мунокомнетентных клеток. Однако, воспроизводительные способности самцов не нарушаются из-зз. наличия гематотеотикулярного иммунного барьера между кровеносными капиллярами и извитыми семенными канальцами, Механические, физико-химические или микробные нарушения этого барьера ведут к проникновению аутоантител в семенные канальца» что в свою очередь вызывает временное или стойкое бесплодие самцов, (Н.И.Соколовская, В.К.Милованов, 1901; С.С.РаЯцина, 1985).

Проблема аутоиммунноети самцов имеет большое практическое значение в связи с широким использованием ценных производителей на Госплемпредприятиях при искусственном осеменении. Своевременное выявление, предупреждение и устранение аутоиммунных форм нарушения воспроизведения самцов настоятельно необходимо для повышения эффективности воспроизводства стада.

1.2. Цель исследований — улучшение воспроизводительной способности самцов сельскохозяйственных животных на основе разработки технологически премлемой системы тестов для оценки аутоиммунных явлений в\0рганизме самцов, полноценности их эякулятов и поиска путей.предупреждения и устранения аутоиммунности бкков-прйизвади-телей.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

I» Установить происхождение антигенов семени, антитела к которым вызывают снижение* воспроизводительной способности самцов, а также'этап воспроизведения на котором они действуют.

2. Проанализировать антигенный состав семенной плазмы самцов с учетом их защитного, спермообволакивающего действия.

3. Разработать сперлоспециническую систему тестов для выявления аутоиммунности самцов в гуморальных и клеточных реакциях.

J-M/W

ЬЛ-.I

I ■ >< ' f l /ivi. '.

■ "■! ■"■■■■ ОДЛКЛ t - " - ",C K.'l. tt.'Jír.W !. i., ft.

4. Выяснить г практических условиях возможность устранения аутоиммунности быков-производате ле й путем обогащения их организма жирорастворимыми витаминами.

1.3. Научная новизна. Выяснено происхождение антигенов семени, антитела к которая снижают качество эяцулятов к эмбриональную выживаемость потомства, а также критический этап эмбриогеяе зй,

Эксперше нтально установлены эффективные иммунологические методы выявления аутоиммунностл самцов к антигенам различных компонентов эякулята.

Разработай метод анализа наличия спедоообвоаакяващих антигенов г семенной плазме и их локализации на поверхности живчиков.

1.4. Практическая ценность. Экспериментально доказана и реализована в практических условиях возможность устранения аутоиммунных нарув&шй воспроизведется быков путем стабилизации их гема-тотестикулЛрдах барьеров скармливанием белково-витаминной смеси.

Предложена технологичная система тестов для определения биологической' полноценности эяяулятов в иммунологических реакциях: гуморальной РОС и клеточной &-РОК.

1.5. Апробация работы. .Материалы диссертации доложены на научных конференциях Отдела бзологии воспроизведения и искусственного осеменения с/х животных ВИЖа (1985, 1986, 1907 гг.), на производственном совещания специалистов ЦСИО Госагропрома СССР в 1987 г., на конференции молодых ученых и специалистов ЛСХИ (Ленинград, 1986 г.), на 2-й Республиканской конференции аядрологов (Цхалтубо, 1986 г.), на 3-м Всесоюзном симпозиуме по иммунологии воспроизведения о международным участием (Киев, 5987 г.), на 7-м Международном симпозиуме по иммунологии воопроиэьедения (Варна, Болгария, 1988 г.).

По материалам двссертахии опубликовано 8 статей. Па "Способ повышения эффективности использования быков-производителей путем применения белково-витаминной смеси (ЕВЗ), снижающей аутоиммунность" получено удостоверение на рацпредложение Л739-13/490 от 23.06.88 Г. ВШО по плевделу в животноводстве Госагропрома СССР,

1.6. Объем работы. Диссертация излажена на 118 страницах машинописного текста и содержит 20 таблиц, 3 фотографии и II,рисунков.

Она состоят из введения, обзора литературы, описания цела и задач исследования, изложения результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических предложение. Список литература содержит 208 наименований, из них 149 на иностранных языках.

1.7. Список сокращений.

БВС белково-витаминная смесь

ВЗЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГТБ - гематотестикулярный барьер

Ж-РОК - реакция роз е ткообраз ования с аутологичнши живчиками

кД - килодальтокы

№ • - молекулярная масса

ПААГ - полвакридамиднай гель

ЕАФ - полный адъювант Фрейнда

РЕГЛ - реакция бласттрансформашш лимфоцитов

РОС - реакция оседания живчиков в аутосьгворотке крови

шш - секреты добавочных половых желез

OI - семенная плазма -

ш - экстракт живчиков

Э-РОК реакция розеткообразованая о эритроцитами барака

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ.

Лабораторные опыты'проведены в Отделе биологии воспроизведения и искусственного осеменения с/х животных ВДЕа в 1985-1987 гг. с использованием 47 самцов и 131 самки кроликов породы Шмпань. Б производственных исследованиях, выполненных на ЦСИО с/х животных Госагропрома СОСР, было использовано 150 быков-ороиэводителей. Все исследования проводили согласно схеме на рисунке I. Качество семени изучали традиционными методами по о<й>еаду эякулята, общем}' содержаний в нем живчиков и их подвижности (В.К.Мило-ванов, 1961). Состояние акросом оценивали акроскопическкм методом разработанным в Отделе биологии воспроизведения ВИЗКа (И.И.Соколовская и др., 1981), Всего было взято и проанализировано более 7СЮ эякулятов кроликов.

Дня иммунизации самцов использовали экстракт живчиков, плазму семени или секреты добавочных половых желез от заранее вазэктоми-

Иодельше опыта (столики)

| Качество эякулятов и клеточный ищу нный ответ|

1

Подбор аналогов) |Вазэктомия

Приготовление Э1 и СП

Контроль

I

Взятие СДП1

Выделение

эпщдащмальншс

живчиков

Юшнизацги:, 31. Си или СШ

Приготовление антисаворотох

ВЭЗСХ (гель-фильтрацая) диск-электрофорез

и

по-Лешш

Клеточный имущ! ответ: Э-РОК, 14Ш, РШ

Качество эякулятов: объем, содержание живчиков, их подвижность и состояние акросш

Результаты осеменения: опло-дотворяемость, эмбриональная выживаемость,'окролы

Анализ

распределения 9 спе^ооОволаваг-щих антигенов

Производственные исследования (быки) РОС О 1 | РОС 4-16)

3__1П

Югеточше иммунные реакции: Э-РОК, Ж-РОК, РШ_

Качество эякулятов: объем, оодеркавле ■ живчиков, их содвшшость

Биохимический анализ крови: общий белок, каротин, калыши, неорганический фосфор, резервная щелочность

ВЗИ и диск-электрофореа по-Леммли

I__L

| Контрольные быки ] Аутоиммунные быки |

| Скарштаание ЕВС

Клеточный и гуморальный иммунный ответ; РОС, Э-РОК, 1-РОК

Качество эякулятов: объем, содержание живчиков, ихводвилшость, лоз пригодного для криохонсервирования семени

Биохимический анализ крови: общий белок, каротин, кальций, неорга-_ каческий фосфор

Результата осеменения: стельность от двукратного осеменения в одну охоту

рованных половозрелых кроликов. Сашов имцунизяровали в ковъюк-тішу глаза so Н.О.Зуйкяцкслду (i960) с полным адьювантом Фрейнда. Контрольным оямцам вводили I3E JiaCI.

Популяцию Т-лимфоцитов выявляли в реакции спонтанного розетко-образования с эритроцитами барана (Э-РОК), как описано у И.И.Соколовской л др. (1985). Дяя повышения специфичности применяли вариант реакции-роэетнообраэования С.С.Райпяной и др. tl977> в нашей модификации, где в качестве индикаторных частиц использовали собственные живчики исследуемого самца (2-РОК). функциональную активность клеточной иммунной системы самцов оценивали в реакции Дласттрансформаши лимфоцитов iPETJT) (K.Theetrup-Federeen, 1976).

Для изучения влияния иммунизации самцов кроликов на оплодотворяющую способность семени, эмбриональную выживаемость и рождаемость потомства, через 10-15 суток после окончания иммунизации осеменяли одковозрастных семок той же породы. Оплодотворяющую способность семени оценивали-через 24 часа йо доле шлодотвореквых яйцеклеток, суда по'наличию шаров дробления, Эмбриональную выживаемость потомства после имплантации оценивали по соотношению . числа желтых тел- и эмбрионов через две недели после осеменения.

Белковый состав семенной плазмы и секретов добавочных половых желез изучали методом ВЭЗОС (гель-фиътрацией) на инертном оборудовании фирмы ЛКБ, Пведая. Образцы элювровали буферами pH 6,8-7,4 через колонку TSK G30003W со скоростями 0,2-1,0 мл/мин. Поглощение, измеряли при 280 нм (Л.А.Остерман, 1985). Правильность . определения молекулярных масс белков контролировали вертикальным диск-электрофорезом по-Леммли в пластинах полиакриламидного геля, как описано у Б.Такача (1Э81).

Для идентификации спермообводакивающего действия антигенов из различных фракций семенной плазмы кроликов применяли разработанную нами методику. На первом этапе отмытые эпидидималыше живчики, никогда не контактировавшие с СЯГГЇ, инкубировали с каждой' из фракций семенной плазмы, выделенной гель-фильтрацией. На втором етапе использовали метод непрямой-иммунофлуоресценции, как описано у Л.Форни (1981).

Поскольку работа с быками-производителями проводилась на хоздоговорной основе, семя, взятое высококвалифицированными техниками, как и данные по его характеристикам, результатам осеменения коров и биохимическим показателям сыворотки крови быков получали

на ЦШО с/х животных.

Как основной метод выявления спонтанной аутоиьмуннооти быков использовали гуморальную реакцию оседания живчиков (РОС) в лунках панелей.для титрования при добавлении аутосыворотки крови и комплемента морской свинки (Р.Н.Ойвадис, А.й.Абплов, 1983). Вгков о выявленными аууоантителами к живчикам в дальнейшем исследовали описанными выше клеточными иммунологическими методами Ж-РОК, РВТЛ и Э-РОК.

Предоставленный для оаытов быкам о выявленной аутоиммунностью и контрольной группе в течение трех месяцев окармливали разработанную нома белково-витаминную смесь (ЕВС)♦ До начала и после окончания опыта анализировали месячные даяние по характеристикам эякудятов, состоянию иммунной системы и биохимическим показ ателш сыворотки крови быков.

Статистиче скую обработку данных проведали с помощью критерия Стыодента для целых чисел и долей, корреляционного и регрессионного анализов (Г.Н.Зайцев, 1984).

5. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

5.1. Специфичность методов выявления иммунного ответа организма самца на введение антигенов семени.

Основной задачей данного опыта было изучение специфичности клеточных методов выявления аутоиммунности после иммунизации самцов различными компонентами эякулята; экстрактом живчиков (ЭЖ), семенной плазмой (СП) и секретами добавочных половых желез (СДПЖ).

Данные сравнения специфичности методов розеткообраэованил с эритроцитами барана (Э-РОК) и аутологичными живчиками (Ж-РОК), а также бласттрансформации лимфоцитов (РЕ1Л) представлены в таблице

I.

Из таблицы X видно, что иммунизация самцов всеми антигенными •группами привела к сенсибилизации лимфоцитов, однако активация клеточного иммунного ответа по разному выявлялась разл;мныыи методами.

В Э-РОК все антигенные группы в одинаковой степени вызвали сенсибилизацию Т-лиглфоцитов, то есть эта реакция не была специфичной для выявления клеточного иммунного ответа на антигены

эякулята» РБТЛ выявляла только активацию клеточной иммунной системы на ¿алее иммуногенные антигены СЩШ, то есть имела, низку» чувствительность.

Таблица I.

Специфичность методов выявления клеточного шцунного ответа после иммунизации самцов кроликов различными антигенными труппами эякулята

Иммуни- :-Ш-:-ШЕ-

о„1ТТ.в ;Сам-:Лимфо-:из них:Сам-:Ллмфо—:иэ них заши .цов :цитов :|э_рок;цов :цитоэ :»-РОК

РБПГ

Сам-:Лимфо-: из них цов :цитов :£бласт

Контроль 12 5100 23,1 6 1700 5,9 3 500 50,2

Алло-СЯПЖ 3 900 34,V30-* 3 600 5,2 3 500 42,0х

Алло-Ш 6 2700 30,3 600 II,З30® 3 500 50,4

Алло-ЭЖ 3 600 35,Б3™* 3 600 IS.CF21 не исследовали

хххї р<0,001і р<0,05.

Таким образом, из всех примененных методов лишь реакция Х-РОК оказалась шсокоспецифичной для выявления сенсибилизации Т-лимфоцитов к собственным антигенам живчиков, в меньшей степени - к антигенам семенной плазмы.

5.2. Действие иммунизации самцов компонентами семе'нй на характеристики эякулятов.

С целью выяснить происхождение антигенов семени, антитела к которым вызывают снижение качества аякулятов, в сравнительном опыте изучили влияние иммунизации самцов кроликов*секретами добавочных половых делез, ауто- или аллошгазмой семени ка характеристики эякулятов (Таблица 2).

Из таблицы 2 видно, что отрицательное действие на характеристики эякулятов оказала только иммунизация самцов семенной ллазмой, но не СУЩИ, Следовательно, антигены, против которых сенсибилизирована иммунная система самцов, имеют тестияулярное, либо эпиди-димальное происхождение. По-видимому, это собственные антигены живчиков, попадающие в семенную плазму в результате проте олити-ческой или механической деструкции живчиков, особенно в процессе их отделения от плазмы центрифугированием.

Таблица 2.

Действие различных типов иммунизации самцов на характеристики их эякулятов

{Всего:Подвижность: Объем :Живчиков в:Живчиков о Группы :эяку-: живчиков : эякулята: эякуляте :целой акро-:лятов: (доля) : (мл) : (млн.) :сомой Ш

1 —11 — У '"■—'------------------------I-------—I.

Контроль. 15 0,6±0,04 0,34±0,03 106±14 85,4+1,7 Иммунизация

^ЯЕШ 15 0,8+0,05 0,35*0,04 *П4*15 89,7*0,7

Контроль 15 0,9+0,02 0,66±0,07 123±13 88,0^1,3

""да" 15 О.^.ОВ**1 0,45±0,08 103±18 56, 2+2,330™

Контроль 30 0,8+0,02 0,50+0,03 138±П 84,5+1,1

^^адаю^^ .30 0,7±0,03х 0,47*0,02 99± 9**. 82,6+1,4

р<0,05; хх)_р<0,01; ^ р<0,001.

Наиболее подверженными действию иммунизации оказались уже сформировавшиеся постмейотические живчики, что выразилось в снижении их. подвижности на 12-65? и количества живчиков о неповрежденной акросомой на 32# после аутоиммунизаши семенной плазмой. По-видимому, процесс аутоиммунного повреждения происходит уже после выхода живчиков из извитых семенных канальцев, где они. заношены мощным гематотеотикулярыым иммунным барьером, то есть в эпидидимдсе или в эякуляте.

Учитывая значительную вариабельность реакции самцов на иммунизация, связанную о индивидуальными особенностями защитной функции их ГГБ, необходим индивидуальный анализ влияния! иммунизации на сперматогенез каждого самца. С этой целью опытные данные по активности сперматогенеза экстраполировали подходящей теоретической. . кривой, рассчитывали ее .уравнение по метолу средних квадратов в определяли сроки максимального воздействия иммунизации'на содержание живчиков в эякулята* и сроки восстановления.этого показателя до исходного уровня.

Изменение содержания живчиков в эякулятах достаточно хорошо описывается уравнением параболы второго порядка У=А0 +А|Х где А0- среднее содержание' живчиков в эякулятах до иммунизации;

А^ и ¿2 - коэффициенты уравнения, отражающие скорость падения и восстановления изучаемого показателя.

Рисунок г.

Изменение содержания живчиков в эякулятах кролика после иммунизации плазмой семени

Результаты регрессионного анализа (Рисунок 2Ї показали, что. максимальное снижение количества живчиков в эякулятах наступает через 25-30 суток после начала антигенной стимуляции, а через 35-45 суток после ее прекращения содержание живчиков в эякулятах возвращается к нормальному уровню.

Таким образом, при отсутствии постоянной антигенной стимуляции и нарушений гематотестикулярного барьера, уже через месяц после прекращения поступления антигена восстанавливается нормальный сперматогенез. Поэтому появление сломанной аутоиныуняости у самцбв-прокзэояителей сельскохозяйственных животных не дает основания для выбраковки самца, а лишь указывает на необходимость отстранения его зякулятов от использования до стабилизации ГТЕ и устранения аутоиммунности.

5.3. Этапы воспроизведения, чувствительные к введению антигенов семени различного происхождения.

В проведенных ранее опытах было показано достоверное влияние ишуниЗациа самцов экстрактом живчиков а семенной плазмой на результаты окролов (И.Й.Соколовская и др., 1982)» Для того, чтобы установить этап воспроизведения на котором происходит снижение результативности осеменения, а также происхождение соответствующих антигенов, было изучено сравнительное действие иммунизации самцов кроликов СЩШ и СП на результата осеменения самок»

Изучение действия .иммунизации самцов на оплодотворяющую способность их живчиков показало, что как в опытной, так и в контрольной группе отсутствовали неоплодотворенные оошты, и все извлеченные эмбрионы находились на стадии 2-4-х блаотомеров. Оцлодотворяемость* составила 94-100? в контроле и 98-10С$ в опыте. Следовательно, действие ищунизацкя самцов.семенной плазмой на воспроизведение проявляется на эмбриональной стадии.

Таблица 3.

Действие аллоиммунизащги самцов кроликов СЦШЖ и СП на результаты осеменения самок

Имплантация эмбрионов

Группы

Рождаемость крольчат

;0се- г% су- :Эмбри-:£ к ;0семе-: % ;мене-:кроль-;онов ¡числу :нено ;окролов ;но ;ных :на :желтнх:самок ; ;самок:самок ¡самку ; тел : :

Крольчат на самку

Контроль 12 Юлм^пгаация

Разность

Иммунизация СД1Ш

91,7 8,0+0,3 90,7

6 83,3 6,4+0,7 62.0 -8,4+16 -1,6х -8,7±43

4 75,0 8,0^0,6 92,3 Разность! -16,7+19 О +1,6+6

13 92,3 7,8±0,4

16 81,2 6,%0»5 -11,1±12,9 -1,8х*

16 . 87,5 6,9*0,5 -4,8±ХХ,3 '-0,9

р<0,05! ^ р<0,01.

. Аллошмунизация самцов семенной плазмой [Таблица 3) вызвала как достоверное снижение на 113% числа новорожденных крольчат.*в расчете на самку, так и на 2СЙ числа имплантировавшихся эмбрионов. В то же время, иммунизация самцой СДПЖ не вызвала заметных

изменений »тих показателей.

Таким образом, антигены, антитела.к которым вызывают снижение результативности осеменения, имеют тестикулярное, либо ВДИДИДИ-мальное дррнсхояденВД и вызывают эмбриональную смертность потомства на яредимплантационкой стадии, Судя по соотношению числа желтых тел и имплантировавшихся эмбрионов, эмбриональные потери в результате действия антител к живчикам составляют Э-1СЙ.

Можно сделать' вывод, что антигены живчиков необходимы для нормального эмбрионального развития потомства на предимплантационкой стадии. С этой точки зрения получают объяснение факты и предположения, описанные ранее в литературе:

I. Частичная общность антигенов эмбрионов и живчиков (Н.М.Решетникова, И.И.Соколовская, 1371} A.C.lfenge, S.H.Flemmlng, 1978) иожет быть вызвана антигенами живчиков, вносимыми при оплодотворении.

г. После оплодотворения антигены живчиков распределяются по поверхности зиготы; а обработка оплодотворенных ооцитов анти-спермальной сывороткой вызывает комшгемент-з ависши й лизис IOCS ранних эмбрионов (L.M.Wiley, 1987).

3. Учитывая прекращение партеногенетического развития млекопитающих после стадии бластоцисты, р.soupart (1981) предположил, что живчик может привносить в ооцит информацию, определяющую нормальное, развитие эмбрионов.

4. Предположено,.'что для образования бластоцисты необходима специальная информация, которая может кодироваться мембраной . бластомеров ( L.Izqulerdo, 1977). Возможно, что по крайней мере часть этой информации составляют поверхностные антигены живчиков, встраивающиеся в мембрану зиготы.

Таким образом, анализ полученных Нами и литературных данных позволяет заключить, что поверхностные антигены плазматической мембраны живчиков тестикулярного, либо эпидидимального происхождения имеют важное значение как экзогенетические факторы, необходимые для нормального эмбрионального развития потомства на предимплантационной стадии.

5.4. Белковый и антигенный состав семенной плазмы.

Белковый состав СДЮ1, семенной плазмы интактннх и иммунизированных экстрактом живчиков кроликов (Рисунок 3), а также семенной

Рисунок 2. Хроматограмма распределения белков семенной плазмы иммунизированного самца кролика: элюат - 0,1М ФБ, рй 6,8; скорость эдации -0,2 мл/мин; образец - 100 мкл 1:1.

§

плазмы быка с повышенным титром в РОС: элюат - 0,1М ФБ, рИ 6,8; скорость элвдии -0,2 мл/мин; образец - 100 мкл 1:3.

плазмы быков с повышенными титрами антител в РОС (Рисунок 4) и без них изучали метод см ВЭЖХ (гель-фильтрацией). Молекулярные массы белков уточняли диск-злектрофорезом в 7,5% ЛААГ по-Леммли.

Методом ВЭЖЗС в семенной плазме и СДПЖ кроликов выявляется до 17 белковых пиков (Таблица 4).

Таблица 4.

Молекулярные массы (в килодальтонах) основных белков семени кроликов

: Семенная плазма :

0(11111 І рольного І рованного І Истотник и характеристика белка ; самца ; самца :

более 300 более 300 более 300 Олесь нескольких белков около 300 около ¿00 около 300 СДПЖ

- - 150 Иммуноглобулин 0

107 107 ■ 107 СДПЖ

90,5 90,5 — Антиген из СДПЖ

77 77 77 СДПЖ

67 - — Слерлообволакввающий белок, СДПЖ

— 35 35 Белок семенников или эпщдадимиеа

30 30 30 СДПЖ

20 20 20 СДПЖ

15 15 15 СДПЖ

11,5 11,5 11,5 СДПЖ

- 10 - . Антиген семенников или адядядиниса

- 8,4 8,4 Белок семенников иди эпидидимиса

7 - - Спермообволакиваший белок из СДПЖ

6 6 6 СДПЖ

2,5 2,5 — Антиген из СДПЖ

Из таблиыы 4 видно, что белки с №л около 10?, 77, 30, 20, 15, 11,5 и 6 кД имеются как в семенной плазме, так и в СВД2 и, следовательно, происходят из секретов добавочных половых желез. Белки с 67 и 7 «И также происходят из СДПЖ, но соответствующие им пики отсутствуют на хроматограммах семенной плазмы. По-видимому, это спермообволакизающие белки, которые удаляются вместе с живчиками при отделении плазмы семени. Белки с Мм 35 и 8,4 кД

имеют тестикуяярное, или эпвдидЕмальное происхождение, поскольку отсутствуют в СДПЖ. Иммунизация самцов не -оказывает заметного. влияния на содержание этих белков в семени.

Заметное снижение в результате иммунизации концентрации белков тестикулярного, либо эпидакямального происхождения с Йл 90,5 и 2,5 кД, а также белка с Мм 10 кД, происходящего из СЦЦЖ, указывает на их антигенность, По-вядимоыу, образуя комплексы с присутствующими в семени антителами, они элюируют из колонки с пиками, <3 соответствующими высокомолекулярным белкам.

Появляющийся только на хроматограммаіх иммунизпрованных самцов белок с Ш 150 кД является иммуноглобулином с , что указывает л

на возможность применения метода ЮЖХ для выявления аутоиммуннос-ти у самцов кроликов,

Молекулярные массы белков семенной ллазш быков после уточнения диск-электрофоре з ом представлены в таблице 5.

Таблица 5.

Молекулярные массы основных- белков семенной плазмы быков

Номер : Молекулярная масса ; : Номер : Молекулярная масса пика : в халодальтонах : : пика : в килодальтонах

I. более 300 10, 13,0 - 14,1

2. около 300 II. И,2 - 11,7

3. ИЗ - 150 12. 9,2 - 10,1

4. 95,3- 97,7 13. 7,6 - 8,5'

5. 68,8- 73,4 14. 6,9 - 7,1

6. 55,6 15. 5,7

7. 46,8 16. 4,4 - 4,6

8. 21,5- 25,1 17. 2,6 - 2,8

9. 18,0- 19,2 18. 1,6 - 1,9

Из таблицы 5 видно, что семенная плазма быков, даже с повышенными титрами антител в РОС, не ссдёрягот выраженного пика;, соответствующего XgG , как это наблюдалось у кроликов после иммунизации.

5.5. Выявление спермообволакивающих антигенов семенной плазмы кроликов на поверхности хивчиков.'

Для изучения способности антигенов семенной плазмы кроликов

абсорбироваться ва поверхности эпидидимальных живчиков применяли разработанную нами методику. На первом этапе живчики инкубировали с каждым из девяти основных белков СП, выделенных гель-фильтрацией и сконцентрированных до 1-5 мг/мл. На втором этапе использовали метсд непрямой шмунофлуоресценши, подсчитывая число живчиков, проявивших интенсивную флуоресценцию различных участков сравнительно с эпидидимальными живчиками, не'инкубированными с белками, семенной плазмы. ..

Инкубация живчиков с не фракционированными СДПЖ или Ш значительно снижала флуоресценцию акросоыного участка. По-видимому, большая часть антигенов акросомы представлена собственными антигенами живчиков, а не сперыообволакивающими антигенами СДПЖ которые препятствуют контакту поверхностных антигенов живчиков с антителами после обработки специфической антисывороткой.

Рисунок 5.

Участки абсорбции спернообвсдакиващнх антигенов семенной плазмы кролика на поверхности эшошдимальшх живчиков

Тонкий анализ с использованием фракционированных белков семенной плазмы показал (Рисунок 5), что на разных структурах живчика абсорбируются различные антигены, причем высокомолекулярные антигены -локализуются в основном на головке, а низкомолекулярные -по всей поверхности живчика.

Белки с Мм 30-35 и 8-10 кД либо не способны абсорбироваться на мембранах живчиков, либо не имеют антигенных детерминант.

Таким образом, разработанный нами метод с применением инкубации эпшшдимальных дявчиков с очищенными белками семенной плазмы позволяет выявить не только антигенноеть различных белков, но и их способность абсорбироваться на разных участках живчика.

5.6. Выявление и устранение аутоиммунности.к семени у быков-производителей.

Ранее было установлено, что высокие титры аутоантител в гуморальной -реакции оседания живчиков (РОС) отрицательно коррелируют с результативностью осеменения семенем этих быков (Р.Н.Ойвадлс и др., 1980). В наших опытах исследовали 150 быков-^проиэводителей ШИО с/х животных с целы» разработки технологичной тест-системы для выявления аутоиммуквости не только гуморальным, но и клеточным методом, а также способа устранения аутоиммунности быков.

Из 150 обследованных методом РОС быков у 96 (65,4,?) аутоим-мунность отсутствовала полностью, у 35 (23, —' проявилась в титре 4, а у 17 (II,- в повышенных титрах от 8'до 16.

Девятнадцать быков с выявленной аутоиммунностью в разных титрах и столько же их -аналогов без неё дополнительно исследовали в клеточных методах спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Э-РОК) и аутологичными живчиками (К-РОК), а также в реакции йласттрансфорлации лимфоцитов (РБТЛ)Данные опытов представлены в таблице 6.

Таблица 6,

Шраженность реакций Ж-РОК, Э-РОК и РБТЛ у быков в зависимости от титров РОС

T|T£i:Bcero:

Д-РОК

быков:Лиыфо-:из них :цитов : ЯЙ-РОК

Э-РОК

РБТЛ

Лимфо-: цитов :

из них ;Лимфо-: 2S-P0K ;цитов :

из них 6 бласт

О 4

8-16

19 12 7

3800 0,8*0,2 2400 Б,^,?13™ 1400 S.lTo.S3™*

3800 2400 1400

14,9+1,7 23,7*3,8х 25,2+5,2

3800 88,2+1,5 2400 78,5+3,3х 1400 82,6+2,2х

х) р<0,05; хис5 р<0,001.

Из таблицы 6 видно, что у быков с положительной РОС процент ■Ж-РОК был достоверно в 8-10 раз "выше, чем у быков о отрицательной РОС, причем количество Т-лимфоцитов, сенсибилизированных к поверхностным антигенам живчиков, увеличивался по мере возрастания титров РОС при коэффициенте корреляции +0,846 (р <0,001).

Содержание в периферической крови активных лимфоцитов, шявля-: емых методом РБТЛ, достоверно повышалось по мере увеличения титров

РОС, что также свидетельствует об активации иммунной системы-быков. Однако, уровень значимости (р<0,05), значительно ниже, чем в Ж-РОК, а корреляции между данными методов РОС и РЕ1Л не установлено,

.Увеличение числа сенсибилизированных Т-димфоцитов, выявляемое в реакции Э-РОК, наблюдалось при высоких титрах РОС, но было статистически недостоверным из-за высокой вариабельности числа розеткообразуицих Т-^лимфоцитов. Корреляция +0,379 с гуморальным методом РОС у этой реакции значительно меньше, чем у Ж-РОК,

Следовательно, у быков, как и у кроликов, сдермоспецвфическим клеточным методом оказалась реакция Ж-РОК, тогда как метода РЕПГ и Э-РОК в большей степени отражают общее состояние иммунной системы' самцов.

При анализе аутоиммунности быков-производителей на Тосплем-предприятиях целесообразно применять методы РОС и Ж-РОК. Обе реакции специфичны для выявления аутоиммунности, к антигенам живчиков, но. характеризуют разные компоненты иммунитета — гуморальный и клеточный.

Вила изучена связь аутоиммунности к живчикам у быков на качество их эякулятов и среднемесячный выход замороженного семени (Таблица 7).

Таблица 7.

Влияние аутоиммунного состояния быков на характеристики их эякулятов и месячную спермопродукцшо

Титры РОС

лрлК : Число : Подвиг-: Елвчиков : Доз пригодного к

¡годных: ность :в эяку- : замораживанию семени :эяку- :живчи- :лятах, : , <г __;лятов : ков ; млрд. ; * **

О 1,1+0,2 347 0,8 6,14+0,06 3110 100 4 - 16 6,2*0,4 540 0,8 5,6^0,06 2051 65,9

Разность +5,1зах -7 О -О.б!*** -1059 -^МД^.О***

^^^ р<0,001; по 18 быков в группе.

Из таблицы 7 видно, что у аутоиммунных быков достоверно понижено на 7,В% содержание живчиков в эякулятах и на 34,1% - коли-'чество доз пригодного для криоконсервирования семени. ' Поскольку аутоиммунные нарушения воспроизведения самцов всегда

связаны с ослаблением защитной функции их гематотестикулярных барьеров, а они в свою очередь могут быть обусловлены общими обменными процессами в организме, была проанализирована связь между некоторыми биохимическими показателями крови быков и состоянием их иммунной системы (Таблица 8),.

Таблица 8.

Влияние аутоиммунного состояния быков на биохимические показатели их крови

Группа

Kaрди.

gg !ЩнХ" \ Кальций

Неорганический Фо^ор,

Контрольные 0,354±0,03 8,84+0,16 282+8 Аутоиммунные 0,193+0,04 8,29+0,15 293+8 Разность -0,161^ -0,55х +11

8,75+0,41 4,50f0,27 9,97+0,36. 5,42+0,34 +1,22х +0,98х

р<0,05; р<0,001; по 18 быков в группе.

Из таблицы 8 видно, что наличие аутоиммунных процессов в организме быков связано с достоверным'снижением содержания в сыворотке их крови каротина и общего белка. Это дало нам основание для попытки усиления защитной функции ГТВ самцов с аутоиммунностью применить разработанную нами белково-витаминчу» смесь (ВВС),

ВВС скармливали контрольным и аутоиммунным быкам в течение трех месяцев, что привело к достоверному повышению содержания в сыворотке их крови каротина на 0,137 мг? (Р<0,01) и общего белка на 1,04 (р<0,001).

Анализ распределения быков (Рисунок 6) по титрам РОС и содержанию каротина в сыворотке крови до и после опыта показал, что скармливание ЕВС привело к увеличению до нормы содержания каротина в крови быков. Одновременно из крови 12 быков были полностью элиминированы аутоантитела к живчийам, выявляемые в РОС, а у остальных шести быков их титр снизился с 8-16 до 2-4.

Витаминизация быков (Таблица 9) статистически достоверно понизила число розеткообразуххшх Т-лимфоиитов как в снермоспецп-фаческоЕ реакции Е-Р0К, так и в неспецифкческой реакции Э-Р0К у аутоиммунных самцов.

Каротин, мг;С

Рисунок 6, Распределение быков по содержанию каротина в сыворотка крови к титрам РОС до и после скармливания ВВС.

Таблица 9.

Активность иммунного ответа и характеристики эякулятов у быков до и после скармливания БЗС

Группы

Живчиков в :д^цригодного ^^ :к замораживанию

эякуляте, ¡семени в месяц |

млрд. :Всего : %

До опыта 15,5±1,0 5,^0,6 4,77±0,12 1635 100 После опыта ^»(¿О.б*** 1,9+0,4ХХХ 5,85+0,09х** 2651 КЙ***

Р<0,001; по 18 быков в группе.

Таким образом, хотя витаминизация вообще стимулирует реакции гуморального и клеточного иммунитета (А.Д.ПЛецитый, В.Г.Фомина, 1978; Д.Н.Лазарева, Е.6.Алехин, 1985 и др.), но сникает специфические реакции на антигены живчиков у аутоиммунных самцов. Эти факты можно объяснить влиянием БВС иа стабилизацию ГТЬ быков после чего прекращается сенсибилизация иыкунной системы к антигенам живчиков и антитела к ним элиминируют из крови.

Креме.того, скармливание быкам БВС привело к значительному повышении численности живчиков в эякулятах, что в свою очередь вызвало увеличение выхода доз семени, пригодного для криоконсер-вирования.

Поскольцг ранее нами было показано снижение на 1Т% результативности осеменения 50 тыс. коров семенем аутоиммунных быков, мы проанализировали влияние скармливания ЕЭС на результаты осеменения с учетом изменения титров РОС у быков проявлявших аутоиммунность (Таблица 10).

Таблица 10.

Действие скаршливания быкам Ш? на изменение титров РОС и результативность осеменения коров

Титш: РОС

До опыта:После опыта

;0семе-:Стельных после двукратного Висов ¡вено ¡осеменения в одну охоту ¡коров : Всдго .

X

0 0 12 9223 6592

2 - 16 0 5 ГШ 1331

8 - 16 2-4 5 3568 2276

71,5 + 0,5 77,8 ^ 1,0 *** .63,4 * 0,8 ^

Как видко из таблицы 10, результативность осеменения семенем быков, у "которых скармливание ЕВС привело к полной элиминации аутоантител к живчикам из крови, увеличилась на 6.ІЇ по сравнению с контролем и на 14,4$ по сравнению с семенем быков, у которых аутоиммунноеть не была полностью устранена.

Таким образом, скармливание разработанной нами белково-витеминяой смеси оказалось достаточным для усиления защитной »< функции гематотесикулярных барьеров и полного устранения в связи

с этим аутоимцунности к антигенам живчиков у большинства быков.

б. ШВСШЫ.

I* Антигеш секретов добавочных половых желез вызывают синтез 1 антител в организме самцов, но не влияют на качество и количество

выделяемого ими семени, а такте на эмбриональное развитие потомства.

2. Антигены семени, антитела к которым вызывают снижение качества и количества семени, а также эмбриональной выживаемости потомства самцэв, имеют тестикулярноеі шбо эпидидимальное происхождение.

3. Эмбриональная смертность, вызываемая антителами к антигенам живчиков, наступает на предимплантационной стадии, а поверхностные антигены плазматической мембраны живчиков имеют важное значение экзогенетических факторов, необходимых для портального эмбрионального развития на яредимплантационной стадии.

4. Для выявления аутоищукности быков-производителей наиболее специфичны гуморальная реакция оседания живчиков в аутосыворотке крови (РОС) и клеточная реакция розеткообразования с яутологич-ными живчиками (Ж-РОК). Метод бдасттрансформации лимфоцитов (РЕГЛЇ и реакция спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Э-РОК) характеризуют активацию иммунной системы самцов, но не. специфичны для обнаружения аутоиммунности быков к антигенам живчиков.

5. Скармливание белково-витаминной смеси (ВВС) быкам, проявляющим аутоиммунность к живчикам, усиливает защитную функцию их гематотестикулярных барьеров, что приводят к снижению гуморальной и клеточной аутоиммунно с ти, активации сперматогенеза и повышает результативность осеменения коров гдубокозамороженным семенем.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Для обнаружения еутоишуннооти быков-производителей к антигенам живчиков использовать на Госплемпредприятиях слермоспецвфи-ческие иммунологические метода: РОС для выявления гуморальной составляющей.иммунитета и &-PQK для выявления его клеточной составляющей. .

2. Использовать разработанную нами белково-витамикную смесь

для устранения и предупреждения аутоиммунных нарушений воспроиз- ч

водительной способности быков,

8. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТИЛЕ ДИССЕРТАЦИИ.

*

I. Orvalle R.K., Abiloу А.I., Косbetкот A.A. 'Antibodies to seminal piвета and their influence on ejaculates character end Insemination resulta./ J. reprod. Immunol.- 1986,- Sappl. Jum.-P. 29.

2. Кочетков A.A., Соколовская И.И. Антигены семенной плазмы кроликов и их влияние на воспроизводительную способность самцов/ Материалы 2-й Респ. конф. андрологов. Цхалтубо, октябрь 1986 г.// Тбилиси: Мицнаереба.- 2986.- с. 62-64.

3. Кочетков A.A., Соколовская И.И. Антигены живчиков и семенной плазмы в связи.с эмбриональной выживаемостью./ Идаунологвя репродукции. Тр. 3-го Всес. симп. с межд, участием. Киев, октябрь 1987. г.//Киев,- 1987,- с. 47-48. .

4. Соколовская И.И., Ойвадис Р.Н., Кочетков A.A. и др.' Моделирование связей иммунного ответа организма самцов и самок с воспроизведением./ Там же, с. 71-72,

, 5. Соколовская И.И., Абалов А.И., Ойвадис Р.Н., Кочетков A.A. Антитела к семенной плазме кроликов и их влияние на результативность осеменения./ Вести, с/х науки,— 1988.- iff?.— с. 83-88.

5. Kochetкот A.A., Abiloy A.I., Oyvadle R.K. Antiорега antibodies in malee and embryos mortality./ Amer. J. reprod. Immunol, uicrobioi.- igaa.- v.i6.-,p»64. .

7. Sokolovefcaya I.I., Kochetкот A.A., Oyvadiff R.H, Method of eperm-coating antigens localized./ Amer. J.reprod. Immunol. Itlcro-biol.- 1988.- T.ie.- p.58.

Подписано в печать І4.Т2.88. Л-38В23 Зан. 67у. Объем 1,0 п.л. Тираж ТОО экз.

Типография ВНИИТЭМР Г. Щербинка.