Атомно-силовая микроскопия: от бактериальных клеток до нуклеиновых кислот и белков

Мачулин, Андрей Валериевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Атомно-силовая микроскопия: от бактериальных клеток до нуклеиновых кислот и белков
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Атомно-силовая микроскопия: от бактериальных клеток до нуклеиновых кислот и белков"

О'

На правах рукописи

ЬЛ-

МАЧУЛИН АНДРЕЙ ВАЛЕРИЕВИЧ

АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ: ОТ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ДО НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И БЕЛКОВ

03.01.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 3 ЛЕК 2012

Пушино- 2012

005057012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук и в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте белка Российской академии наук.

Научные руководители:

доктор физико-математических наук, профессор [Сердюк Игорь Николаевич] доктор физико-математических наук Хечинашвили Николай Николаевич

Официальные оппоненты:

Буданцев Аркадий Юстианович - доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, заведующий лабораторией функциональной гистохимии

Васильев Виктор Дмитриевич - доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка РАН, г.н.с. персональной группы В. Д. Васильева

Ведущая организация:

НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова».

Защита диссертации состоится «20» декабря 2012 г. в 14.00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д002.038.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан «19» ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук / ¡г'ЬР , / Смолихина Татьяна Ивановна

На правах рукописи

МАЧУЛИН АНДРЕЙ ВАЛЕРИЕВИЧ

АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ: ОТ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ДО НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И БЕЛКОВ

03.01.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2012

Научные руководители:

доктор физико-математических наук, профессор |Сердюк Игорь Николаевич] доктор физико-математических наук Хечинашвили Николай Николаевич

Официальные оппоненты:

Буданцев Аркадий Юстианович — доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, заведующий лабораторией функциональной гистохимии

Ведущая организация:

Автореферат разослан «19» ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук / т

Смолихина Татьяна Ивановна

Общая характеристика работы

Диссертационная работа посвящена применению и развитию метода атомно-силовой микроскопии (АСМ) для исследования морфологических свойств бактериальных клеток и макромолекулярных структур.

В настоящей работе проведено подробное исследование морфологии поверхности фототрофных пурпурных бактериальных клеток Rhodobacter sphaeroides, трансформированных растительным геном ipt. Полученные данные позволили существенно расширить представление о влиянии данной трансформации на клеточную подвижность, капсульные структуры вокруг клеток, а также на состав клеточной стенки данного вида бактерий.

Метод АСМ был также апробирован в исследовании отдельных белков, молекул ДНК, а также белок-белковых и ДНК-белковых комплексов.

В данной работе на примере природного амилоидогенного белка YB-1 показаны возможности совместного использования методов аналитического ультрацентрифугирования (АУ) и АСМ для исследования полиморфизма и кинетики образования сформированных белковых структур.

Метод АСМ был применен для визуализации сайт-специфического связывания молекул ДНК с никующей эндонуклеазой Nt.BspD6I. Данная нуклеаза является уникальным по своим функциям ферментом, уже нашедшим широкое применение в ряде биотехнологических методов. Подобраны условия и соотношение ДНК/белок, которые позволили с высоким разрешением визуализировать образовавшийся ДНК-белковый комплекс.

Проведенная экспериментальная работа охватывает широкий круг научных проблем. Полученные результаты расширяют современные представления о влиянии генетических мутаций на морфологию фототрофных бактериальных клеток, а также о структурной организации макромолекулярных комплексов: образование фибрилл амилоидогенным белком YB-1 и образование комплекса ДНК-никаза. Разработанные в диссертационной работе подходы могут быть использованы в качестве методической основы для

исследования одиночных биологических объектов разного уровня организации методом АСМ. Актуальность работы

Благодаря высокому пространственному разрешению на сегодняшний день основным инструментом для изучения рельефа поверхности в нанометровом масштабе является АСМ. Развитие этого метода открыло принципиально новые возможности в исследовании структуры и локальных биофизических свойств биологических объектов различного уровня организации.

АСМ предоставляет уникальную возможность по визуализации одиночных макромолекул, находящихся в атмосферных условиях или физиологических буферных растворах, в режиме реального времени. С помощью данного метода можно исследовать отдельные белки и молекулы ДНК, а также белок-белковые и ДНК-белковые комплексы, особенности их образования и специфического взаимодействия. Большим преимуществом данного метода является небольшое количество используемого при работе образца. Другими словами, исследования могут проводиться на одиночных молекулах. Кроме того, получаемые изображения макромолекулярных частиц могут быть полезны для оценки однородности образца, а также для выявления реального расположения составляющих компонентов наблюдаемых частиц.

Однако, при всех достоинствах этого метода существует и ряд недостатков, главным из которых является отсутствие одновременной информации о всей поверхности, поскольку в каждый момент времени мы имеем информацию только от участка препарата, непосредственно регистрируемого АСМ-зондом. Кроме того, при взаимодействии сканирующего зонда с поверхностью, часто происходит ее деформация, а ряд внешних факторов, таких как акустические шумы и механические колебания, могут внести искажения в получаемые изображения.

Стоит отметить, что если методология получения изображения клеточных объектов с помощью АСМ на сегодняшний день отработана и дает хорошие

результаты, то для более мелких биообъектов, таких как белки и нуклеиновые кислоты приходится подбирать индивидуальные условия приготовления образца. Например, основной проблемой при исследовании ДНК-белковых комплексов является тот факт, что для непосредственной визуализации необходимо подбирать условия одновременного взаимодействия молекулы ДНК с белком и с поверхностью подложки.

Таким образом, поскольку не существует универсального подхода к исследованию биологических объектов методом АСМ, развитие методов препарирования и анализа биообъектов разных уровней организации является актуальной задачей. Полученные в работе результаты имеют важное значение для развития представлений об особенностях поверхности микроорганизмов (влияние мутаций на морфологию поверхности фототрофных клеток) и структурной организации биополимеров (образование фибрилл амилоидогенным белком YB-1, образование комплекса ДНК-никаза), а методики, используемые в данной работе могут быть использованы для детального анализа клеточных и белковых систем. Цель и задачи работы

Целью данной работы было применение метода атомно-силовой микроскопии для исследования бактериальных клеток и макромолекул. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать морфологические особенности бактериальных клеток и

влияние на них генной трансформации.

Для этого необходимо:

- подобрать условия для визуализации фототрофных бактерий Rhodobacter sphaeroides

- идентифицировать влияние //^-трансформации на морфологию поверхности клеток бактерий Rhodobacter sphaeroides

2. Исследовать процесс фибриллообразования белком YB-1, в том числе:

- определить объем отдельных белковых молекул белка YB-1 путем анализа экспериментально измеренных параметров на АСМ-изображениях и сравнить его с гидродинамическим объемом

- исследовать структуры, образуемые белком YB-1 в различных ионных условиях методами АСМ и АУ

3. Исследовать сайт-специфическое связывание ДНК с никующей эндонуклеазой Nt.BspD6I:

- подобрать оптимальные условия для получения изображения ДНК-белкового комплекса высокого разрешения

- выявить особенности механизма взаимодействия ДНК с никующей эндонуклеазой

4. Предложить методики препарирования микроорганизмов и макромолекулярных комплексов разного уровня организации для АСМ.

Научная новизна диссертации

При исследовании пурпурных бактерий Rhodobacter sphaeroides:

- показано, что /^/-трансформация приводит к практически полной утрате жгутиков клетками

- установлено, что /^/-трансформация приводит к изменению наружного слоя внешней мембраны, что обусловлено изменением структуры и состава липополисахаридов

При исследовании белка YB-1 с помощью методов АСМ и АУ:

- показано, что свежеприготовленный белок YB-1 находится в глобулярной мономерной форме и ионные условия не влияют на его конформацию в растворе

- установлено, что в растворе свежеприготовленного белка его неструктурированные N- и С- домены располагаются компактно вокруг домена холодового шока

- показано, что структурной единицей инициирующей возникновение

протофибрилл и последующее развитие процесса образования протяженных

фибрилл является димерная форма белка YB-1

- показано, что белок YB-1 в условиях высокой ионной силы (2М LiCl) может формировать морфологически различные протяженные структуры

При исследовании механизма комплексообразования между ДНК и белком:

- установлено, что через пять минут после инкубации раствора ДНК с никазой Nt.BspD6I происходит их взаимодействие и образуется ДНК-белковый комплекс; взаимодействие ДНК с белком происходит в ожидаемом месте связывания

- показано, что высота молекулы ДНК рядом с местом связывания белка соответствует высоте одноцепочечной молекулы ДНК, что согласуется с особенностью ферментативной активности никазы

- обнаружено, что через 90 минут инкубации раствора ДНК с белком происходит расщепление ДНК в месте связывания белка на два сегмента (1/3 и 2/3 длины)

Научно-практическая значимость

1. На основе полученных данных разработаны рекомендации, позволяющие исследовать морфологию клеточных бактериальных поверхностей.

2. Данные, полученные при исследовании морфологических особенностей фототрофной пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides, существенно расширяют представления об изменениях, происходящих при ipt-трансформации данных клеток.

3. На основе данных, полученных при исследовании белка YB-1 методами АСМ и АУ установлено, что в растворе свежеприготовленный белок находится в компактной форме; структурной единицей инициирующей процесс фибриллообразования является димерная форма белка YB.

4. В ходе исследования сайт-специфического связывания между ДНК и ферментом никазой были подобраны ионные условия, а также соотношение концентраций ДНК к белку в конечном растворе, что позволило с высоким разрешением визуализировать образовавшийся ДНК-белковый комплекс.

Основные положения, выносимые на защиту

1. //«-трансформация фототрофной пурпурной бактерии ШойоЪас1ег зр1шего1с1ез приводит к практически полной утрате жгутиков в трансформированных клетках, а также к изменению наружного слоя внешней мембраны.

2. Белок УВ-1 формирует различные структуры в условиях высокой ионной силы (2М иС1), что свидетельствует о характерном для амилоидогенных фибрилл полиморфизме.

3. Свежеприготовленный белок УВ-1 находится в глобулярной мономерной форме и ионные условия не влияют на его конформацию в растворе.

4. В растворе свежеприготовленного белка его неструктурированные № и С-домены располагаются компактно вокруг домена холодового шока

5. Структурной единицей инициирующей возникновение протофибрилл и последующее развитие процесса образования протяженных фибрилл является димерная форма белка УВ-1.

6. Инкубация раствора ДНК с никующей эндонуклеазой приводит к связыванию ДНК с белком, который детектируется в ожидаемом месте связывания.

7. Никаза при специфическом связывании с молекулой ДНК вносит в нее одноцепочечный разрыв, который является характерной особенностью ферментативной активности этого белка.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были изложены в докладах на следующих конференциях:

XIX Пущинские чтения по фотосинтезу, Россия, Пущино, 15-19 июня 2009; 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых: Биология -наука XXI века, Россия, Пущино, 19-23 апреля 2010; I Международная научная конференция. Современное естествознание: вопросы и ответы. Россия, Санкт-Петербург, 30-31 августа 2011; XIX Международная научная конференция

студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов», 9-13 апреля 2012 года; 16-я Путинская международная школа-конференция молодых ученых: Биология - наука XXI века, Россия, Пущино, 16-21 апреля 2012 года; IV Съезд биофизиков России, Россия, Нижний Новгород, 20-26 августа 2012 года Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 статьи в реферируемых журналах, входящих в список ВАК, и 6 тезисов докладов на конференциях Структура и объем диссертационной работы

Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов и списка литературы, включающего 211 наименований. Работа изложена на 153 страницах и содержит 60 рисунков и 1 таблицу.

Основное содержание работы

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформулирована цель работы, обсуждается новизна и практическая значимость полученных результатов.

В главе 1 представлен обзор литературы по теме диссертационной работы. В обзоре описаны основные особенности атомно-силового микроскопа, связанные с его конструкцией и режимами работы, подготовка и проведение эксперимента. Большое внимание уделено основным методикам препарирования биологических образцов для АСМ. Кроме того, описаны возможности АСМ в исследованиях бактериальных клеток, молекул белков и нуклеиновых кислот, а также их комплексов. В данной главе также описаны особенности выбранных объектов исследования.

Глава 2 посвящена особенностям обработки и анализу АСМ-данных, поскольку при всем многообразии возможностей, которые дает метод АСМ, в процессе исследования поверхности различных материалов и при интерпретации полученных результатов возникает ряд сложностей. Часть из них вызвана артефактами (искажениями изображения исследуемого объекта, обусловленными конструктивными особенностями прибора и ограничениями

режима работы), а часть — внесением в конечное изображение дополнительной картины, связанной с физическими особенностями как объекта исследования так и подложки.

На примере мономеров белка YB-1 частиц в данной работе проведено сравнение объема белковой молекулы, рассчитанной из экспериментально измеренных параметров на АСМ-изображениях с гидродинамическим объемом, полученным методом АУ.

В главе 3 описываются материалы и методы, используемые в работе для подготовки к исследованию выбранных объектов.

В главе 4 представлены экспериментальные данные, полученные при исследовании выбранных объектов.

Первая часть главы 4 посвящена АСМ-исследованию морфологических особенностей бактериальных клеток. Приведено исследование влияния генной трансформации на фототрофные клетки. В настоящее время метод АСМ активно применяется для исследования морфологии бактериальных клеток, локализации их поверхностных компонентов, изучения механических свойств клеточной стенки [Casuso et al., 2011], определения сил взаимодействия между отдельными молекулами. У фотосинтезирующих пурпурных бактерий этим методом подробно изучена структура фотосинтетического аппарата [Scheming et al., 2009], структура и динамика отдельных белков фотосинтезирующих мембран [Liu et al., 2011].

Цитокинины — растительные гормоны, регулирующие процесс деления клеток, были обнаружены практически во всех живых организмах. Ключевым ферментом синтеза цитокининов является изопентенилтрансфераза, которая кодируется геном ipt. В /р/-трансгенных растениях табака нерегулируемая экспрессия гена биосинтеза цитокининов вызывает как изменение их морфологии, так и понижение содержания хлорофилла и фотосинтетической активности [Алексеева, 2000]. В геноме Rhodobacter sphaeroides ген изопентинилтрансферазы обнаружен не был. Для выяснения влияний ipt гена на

физиологические процессы фототрофной пурпурной бактерии была проведена ее трансформация методом конъюгации.

Ранее, различными биохимическими методами и методом электронной микроскопии было показано, что ^/-трансформация фототрофной пурпурной бактерии Rhodopseudomortas palustris приводит к подавлению биосинтеза бактериохлорофилла, изменению соотношения фотосинтезирующих комплексов, корового и светособирающего, а также к изменениям в форме колоний и структуре клеточной стенки этой бактерии [Сердюк и др., 2007]. Аналогичные изменения наблюдали и в /р/-трансформанте Rhodobacter sphaeroides. В данной работе было проведено сравнение морфологии и поверхности трансформированных клеток и клеток дикого типа и Rhodobacter sphaeroides. У модифицированных бактерий выращенных анаэробно наблюдалось существенно меньшее или полное отсутствие жгутиков, что коррелирует с гораздо меньшей подвижностью клеток-трансформантов, наблюдаемой в световом микроскопе.

При исследовании модифицированных бактерий выращенных аэробно также наблюдалось существенно меньшее или полное отсутствие жгутиков. Еще одним отличием трансформированных клеток от клеток дикого типа являлось присутствие вокруг клетки слизистой структуры. Судя по толщине этого образования (около 1 мкм), плотному прилеганию к клеточной стенке и четкому очертанию границ его можно отнести к капсульным структурам. Капсулы образуются в определенных условиях выращивания бактерий, иногда неблагоприятных. Они защищают клетки бактерий от механических повреждений, высыхания, создают дополнительный осмотический барьер, могут выполнять функцию запасных питательных веществ, препятствуют адсорбции бактериофагов на клетках [Stukalov et al. 2008]. По-видимому, в нашей работе неблагоприятным фактором, вызывающим образование капсул у генетически модифицированных бактерий являлась сама //^-трансформация бактериальной клетки. Изменения в метаболизме клетки, вызванные

трансформацией, обусловили необходимость адаптации бактерий к их обычной среде выращивания (рис.1).

А Б

О мкм 1 2 3 0 мкм 1 2 3

Рис. 1. АСМ-изображения одиночных клеток Юю/ЗоЬас/ег ¡ркаегогйех (аэробное выращивание). (А) клетки дикого типа, (Б) 1^¡-трансформированные клетки. Режим боковой подсветки.

АСМ-изображения поверхности клеток двух типов ЯЬос1оЬас1ег зрИаегоЬЛез представлены на рисунке 2. Из рисунка видно, что внешний слой клеток дикого типа представлен протяженными, волнистыми структурами. Похожие структуры наблюдаются и у трансформирмантов ЯИснЛоЬаМег 5рИаего1с1е$ (рис. 2 Б), но они более короткие, свернуты в кольца или полукольца, и имеют более плотную упаковку. Такие изменения в структуре наружного слоя внешней мембраны клеток трансформантов являются следствием изменений в структуре и составе липополисахаридов.

Рис. 2. АСМ-изображения поверхности клеток Юю<1оЪас1ег зрИаего1с1е8. (А) клетки дикого типа, (Б) 1^-трансформированные клетки.

Также, в данной части приведены результаты исследования сложноорганизованного фотосинтетического аппарата фототрофных бактерий. Отработанные методики работы с трансформированными клетками и их хроматофорами в дальнейшем позволят визуализировать с высоким разрешением взаимное расположение светособирающих комплексов фотосинтетического аппарата /рг-трансгенных фототрофных бактерий с целью построения структурной модели хроматофора трансформированного типа.

Вторая часть Главы 4 посвящена исследованию с помощью АСМ и АУ амилоидогенных белков, а именно особенностям их самоорганизации и влияния на этот процесс внешних условий. В качестве объекта исследования был использован амилоидогенный белок YB-1 (молекулярная масса 36 кДа) -ДНК и РНК-связывающий белок, участвующий в различных внутриклеточных процессах [Елисеева и др., 2011]. Этот белок состоит из трех основных доменов: N-домена (1-52 а.о.), центрального эволюционно консервативного домена холодого шока CSD (53-129 а.о.) и протяженного С-домена (131-324 а.о.), состоящего из чередующихся положительно и отрицательно заряженных кластеров (по 25-30 а.о. каждый). Этот белок входит в группу природно-неструктурированных белков, которые либо полностью не структурированы, либо содержат большие неструктурированные области. К этой же группе относятся прионные белки, а также развернутый ß-амилоидный полипептид, отвечающий за болезнь Альцгеймера, и а-синуклеин, отвечающий за болезнь Паркинсона и другие болезни старческого слабоумия. Все эти конформационные изменения обусловлены появлением аномальных свойств белков вследствие изменения их пространственной структуры.

Однако для того, чтобы приблизиться к пониманию процесса фибриллогенеза белка YB-1, необходимо выявить параметры протофибрилл, определяющих их функциональное состояние и упаковку в протяженные фибриллы. Кроме того, определение влияния внешних условий на процесс фибриллогенеза даст возможность получать фибриллы с регулируемыми свойствами.

Для исследования кинетики образования фибрилл белка YB-1 в данной работе были использованы методы АСМ и АУ.

а г.,

0.0 um 0.5

1.0

20 W

г 3 А 5 6 7 8

s, ед. Сведберга

Г 0.0 цт 0.5 1.0

0.6 пт 0.5

0.4

0.3

0.2

0.1 0.1

Рис. 3. (А) седиментационный профиль белка YB-1 в условиях высокой ионной силы (2 М ЫС1). Основной график иллюстрирует распределение седиментационной постоянной, а вложенный график иллюстрирует распределение молекулярной массы. (Б) АСМ изображение мономеров белка YB-1 в условиях высокой ионной силы (2М HCl). (В) седгшентационный профиль белка YB-1 в условиях умеренной ионной силы (150мМ KCl). Основной график - распределение седиментационной постоянной, а вложенный график — распределение молекулярной массы. (Г) АСМ изображение мономеров белка YB-1 в условиях умеренной ионной силы (150мМ KCl).

Седиментационный анализ свежеприготовленного белка YB-1 в условиях высокой ионной силы 2М LiCl приведен на рисунке ЗА. Как видно из рисунка, распределение по константе седиментации и по молекулярной массе унимодально. Вычисляемая величина константы седиментации i составляет, ■S20w = 2.72 S. Вычисляемая молекулярная масса М составляет 35.3 кДа, что всего лишь на 2% меньше теоретической величины, рассчитанной из первичной последовательности (36 кДа). Константа седиментации равная 2.72 S соответствует глобулярному белку в растворе. Седиментационный анализ белка YB-1 в условиях умеренной ионной силы 150мМ KCl (свежеприготовленный) дает константу седиментации равную 2.80 S, что также

соответствует глобулярному белку в растворе (рис. 3 В). Вычисляемая молекулярная массаМ при этом равна 36.2 кДа.

То, что свежеприготовленный белок находится в глобулярном состоянии подтверждается полученными АСМ изображениями мономеров белка на подложке (рис. 3 Б, Г). Таким образом, можно утверждать, что на начальном этапе ионные условия не влияют на конформацию белка в растворе. Кроме того, из этого следует, что в растворе неструктурированные N- и С- домены белка располагаются компактно вокруг домена холодового шока.

Рис. 4. (А) седиментационный профиль белка YB-1 после суток инкубации в растворе в условиях высокой ионной сипы (2М LiCl). Основной график - распределение седиментационной постоянной, вложенный график - распределение молекулярной массы. (Б) седиментационный профиль белка YB-1 после трех суток инкубации в растворе в условиях высокой ионной силы (2М LiCl). Основной график - распределение седиментационной постоянной, вложенный график - распределение молекулярной массы. (В) АСМ изображение фибрилл белка YB-1 после трех суток инкубации в растворе в условиях высокой ионной силы (2МLiCl).

После инкубации белка YB-1 в условиях высокой ионной силы 2 М LiCl в течение суток наблюдалось изменение седиментационного профиля (рис. 4 А). На рисунке видно второй меньший пик, константа седиментации которого соответствует димеру белка. Через трое суток точное определение константы седиментации становится невозможным, а молекулярная масса отдельных образованных в растворе структур становится 7-106 Да, что говорит о прошедшей в растворе процессе полимеризации вещества (рис. 4 Б). При этом структуры, наблюдаемые на АСМ-изображениях, представляют собой протяженные фибриллы, что коррелирует с полученными гидродинамическими данными (рис. 4 В), а также с полученными раннее данными других работ

[Селиванова О. М. и др. 2010, Guryanov S. G. et al. 2012].

В условиях умеренной ионной силы в процессе инкубации белок YB-1 коэффициент седиментации не изменялся, что свидетельствует об отсутствии процесса полимеризации.

Кроме того, во второй части главы 4 приводятся результаты исследования явления полиморфизма (внутриобразцовые варианты) амиллоидогенных белков. Так как полиморфизм в случае амилоидогенных фибрилл является одной из основных причин их устойчивости к разным внешним воздействиям, то в настоящее время этому явлению уделяется особое внимание [Petkova et al., 2005].

Характерный для амилоидогенных фибрилл полиморфизм зависит от способа получения препарата, источника (природный, рекомбинантный, синтетический), от условий приготовления и других параметров, вплоть до получения разных результатов в одних условиях с одним и тем же препаратом в разных лабораториях (или даже в одной лаборатории), что отмечается, например, при исследованиях Ар-пептида [Fandrich et al., 2011].

Структурные исследования белков, способных к фибриллообразованию, подтверждают, что полиморфизм отражает существование нескольких независимых и конкурирующих путей сборки, приводящих к агрегации. Кроме того, рядом авторов доказано, что полиморфизм также является отражением реальных структурных различий в молекулярной упаковке полипептидных цепей, что ведет к возможности существования нескольких видов протофибрилл и, как следствие, разнообразию сформированных фибрилл.

В данной работе методом АСМ было показано, что инкубация полноразмерного белка YB-1 в 20 мМ Hepes-KOH, рН 7.6, 2 М LiCl приводит к образованию морфологически отличающихся друг от друга фибрилл в одинаковых условиях инкубации.

Для полноразмерного белка YB-1 в условиях высокой ионной силы можно было наблюдать две различные картины. На первой наблюдались длинные тяжи средней длины 6 мкм и высоты 3.6 нм (рис. 5 А). Они имеют тенденцию собираться в пучки. На второй наблюдались тяжи двух типов:

короткие тяжи средней длины 250 нм и высоты 3.5 нм, и короткие тяжи длиной менее 200 нм и средней высоты 7 нм (рис. 5 Б).

А Б

Рис. 5. АСМ-изображения фибрипл белка YB-1 в условиях высокой ионной силы 2 М LiCl. Концентрация белка ЗцМ.

Процесс олигомеризации и фибриллообразования происходит за счет электростатических, водородных и гидрофобных взаимодействий между молекулами белка с образованием димеров - начальных строительных блоков. Как было показано выше образование тяжей белком YB-1 происходит через эту стадию (образование димеров). Дальше димеры олигомеризуются в тетрамеры, октамеры и т. д. с образованием протофибрилл шириной 2-3 нм и длиной до 200 нм. Эти образования накапливаются в лаг-фазе, характерной для кинетики фибриллообразования. Окончание лаг-фазы связано с образованием протофибриллами фибрилл диаметром 7-8 нм. Длина фибрилл и особенности их морфологии при этом напрямую зависят от числа структурных протофиламентов. Такой тип реакции существенно отличается от типичных реакций сворачивания глобулярных белков, для которых один «набор» взаимодействий между аминокислотными остатками приводит к существованию одной упорядоченной конечной конформации.

В случае белка YB-1 явление полиморфизма является прямым следствием того факта, что это белок с большой долей неупорядоченности. Известно, что природно-неструктурированные белки не имеют определенной трехмерной структуры при физиологических условиях, а приобретают ее лишь после взаимодействия с различными лигандами [Сердюк, 2007]. Кроме того,

«приобретенная» структура часто зависит от вида лиганда, и при этом может сильно меняться. Т.е. можно говорить о своеобразном полиморфизме структур таких белков. Такое структурное разнообразие и своеобразная гибкость определяет многофункциональность таких белков, как и в случае белка YB-1.

Белок YB-1 в условиях высокой ионной силы, и что важно, с длинными неструктурированными областями на концах, образует как длинные, так и короткие тяжи. Отметим, что до сих пор не одним методом не было определено, как происходит взаимодействие мономеров белка. Возможны несколько вариантов, а именно последовательное взаимодействие N- домен к N-домену и С-домен к С-домену или поочередное взаимодействие N-домена с С-доменом. Кроме того возможен вариант при котором формирование димеров и далее тяжей происходит по средствам взаимодействия доменов холодового шока, при этом возможно "оборачивание" неструктурированных участков вокруг образованных структур.

Высокая ионная сила также может являться определяющим фактором для образованных полиморфных структур, поскольку электростатические взаимодействия приводят к значительным отклонениям в поведении системы от идеального, при этом активность белка начинает зависеть как от природы ионов, так и от общего состава раствора. Кроме того, С-концевой домен белковой молекулы представляет собой чередующиеся положительно и отрицательно заряженные кластеры (по 25-30 а.о. каждый).

Таким образом, различие в морфологии фибриллярных структур белка YB-1 обусловлено в значительной мере неупорядоченными областями, а также электростатическими взаимодействия буферного раствора с "заряженной" частью белковой молекулы.

В третьей части главы 4 приведены результаты исследования с помощью АСМ сайт-специфического связывания ДНК с никующей эндонуклеазой (никазой) Nt.BspD6I на уровне одиночных молекул.

Никазы, являющиеся уникальными по своим функциям ферментами, уже нашли применение в ряде биотехнологических методов, таких как

изотермическая реакция для амплификации олигонуклеотидов и геномной ДНК. Никаза Nt.BspD6I, имеющая молекулярную массу 70,8 кДа (604 а.о.), была выделена из штамма бактерий Bacillus species D6 [Железная и др., 2001]. Этот белок узнает в двухцепочечной ДНК последовательность 5'-GAGTC/5'-GACTC и расщепляет одну цепь, содержащую последовательность GAGTC на расстоянии 4-х нуклеотидов от сайта в сторону 3'-конца [Железная и др., 2009]. Внесение разрыва только в одну цепочку ДНК (никование) играет ключевую роль в таких важных биологических процессах как инициация репликации, рекомбинация и репарация. Пространственная структура никазы Nt.BspDöl была получена с высоким разрешением (1.8 Ä) [Kachalova et al., 2005]. Молекула представляет собой компактную глобулу с размерами 50x60*80 А. Структура состоит из трех доменов: N-концевого (состоящего из двух субдоменов), линкерного и С-концевого. На основании высокой степени структурного сходства субдоменов никазы с аналогичными доменами эндонуклеазы рестрикции FokI, структура которой определена в комплексе с ДНК, был сделан вывод о том, что именно N-концевой домен никазы является узнающим доменом [Wah et al., 1997]. Ферментативная активность никазы проявляется в присутствии ионов Mg2+ или Ni2+. При замене Mg2+ или Ni2+ на другие катионы никаза сохраняет способность связываться с узнаваемым сайтом, но утрачивает способность расщеплять одну цепь ДНК. Этот факт позволяет использовать никазу в качестве «удобного» объекта для изучения процесса образования ДНК-белкового комплекса, а также его характерных черт, таких как сайт-специфическое узнавание и связывание. Специфическая никующуя активность никазы была хорошо изучена и описана [Юнусова и др., 2006]. Тем не менее не были проведены структурные исследования сайт-специфического связывания никазы Nt.BspDöl с ДНК. С помощью АСМ нами были получены изображения молекул ДНК гена никазы длиной 920 н.п., наработаных с помощью ПЦР и содержащих сайт узнавания никазы, расположенный на расстоянии 600 н.п. от 5' конца ДНК (в 2 мМ NiCb).

Высота молекул ДНК составила 0.80±0.15 нм. Данная величина отличается от величины диаметра ДНК (около 2 нм). Занижение высоты происходит в результате взаимодействия между наконечником зонда и молекулой, а также между молекулой и поверхностью слюды, что неоднократно отмечено в литературе [Klinov et al., 2003]. Величина средней высоты белка, определенная из построенной гистограммы распределения высот, составила 0.47±0.01 нм. Гистограмма распределения контурных длин цепей ДНК позволила определить среднее значение контурной длины, которая оказалась равной 280±2 нм. Эта величина на 10% меньше значения теоретически рассчитанной для молекулы ДНК длиной 920 н.п. (310 нм). Это может быть объяснено тем, что на типичном поле сканирования одному пикселу соответствует примерно 3 нм длины молекулы ДНК. По этой причине молекула ДНК имеет изгибы, которые не могут быть разрешены на поле сканирования равном 1.5x1.5 мкм. Кроме того, удалось получить изображения отдельных молекул белка никазы.

При совместной инкубации (5 минут) ДНК с белком происходит их специфическое взаимодействие и образуется ДНК-белковый комплекс. На АСМ-изображениях можно наблюдать цепочки ДНК со связанным белком (рис. 6 А). Однако, несмотря на то, что соотношение между ДНК и белком в данном эксперименте 1:8 (белок в избытке), белок наблюдается не на всех нитях ДНК. Некоторое количество комплексов, видимо, диссоциируют в результате взаимодействия с поверхностью подложки, и на слюду адсорбировались отдельно молекулы ДНК и белка [Sorel et al., 2006]. Из АСМ-изображений видно, что белок «разделяет» цепь ДНК на два сегмента равных, примерно, 1/3 и 2/3 длины, что соответствует ожидаемому месту связывания (рис. 6 Б). Анализ профиля сечения непосредственно по месту связывания дает высоту 1.3 нм, что соответствует суммарной высоте отдельных молекул двуцепочечной ДНК и белка. Кроме того, высота молекул ДНК рядом с местом связывания соответствует высоте одноцепочечной молекулы ДНК, что согласуется с

внесением одноцепочечного разрыва никазой при комлексообразовании (рис. 6 В-Г).

а б

О.Оиа. 05

Рис. б. (А) АСМ-изображение комплекса ДНК с никазой при соотношении 1:8. Стрелками помечены образованные комплексы. Поле сканирования 1.5 х1.5 мкм. (Б) увеличенные изображения молекул комплекса. Стрелками отмечено положение белка. Поле сканирования 0.3x0.3 мкм. (В) Трехмерная проекция молекулы ДНК с белком. Стрелками показаны места сечения. (Г) профиль сечения поперек молекулы с рисунка В. Цифрам соответствуют профили на графике.

Таким образом, подобранные ионные условия, а также соотношение ДНК/белок позволили с высоким разрешением визуализировать образовавшийся после взаимодействия ДНК-белковый комплекс. Проведенное исследование подтвердило тот факт, что никаза специфически связывается с сайтом узнавания на молекуле ДНК и вносит в нее одноцепочечный разрыв, который является характерной особенностью ферментативной активности этого белка. Поскольку до сих пор не удалось получить пригодные для рентгеноструктурного анализа кристаллы комплекса ДНК с никазой, полученные в данной работе результаты являются первым наглядным подтверждением описанного ранее механизма взаимодействия ДНК с никующей эндонуклеазой.

При совместной инкубации (90 минут) ДНК с белком в соотношении 1:8 в 2 гпМ №С12 происходит расщепление ДНК на два фрагмента (короткий и

длинный). На полученных АСМ-изображениях на концах фрагментов ДНК наблюдались молекулы связанного белка. Построенная гистограмма распределения контурных длин фрагментов ДНК дала длину коротких фрагментов около 100 нм и длину длинных фрагментов около 200 нм. Суммарная длина средних значений наблюдаемых фрагментов дают общую длину равную 300 нм, что соответствует контурной длине нерасщепленной цепи ДНК (рис. 7).

а б

Рис. 7. (А) АСМ-изображение ДНК-белкового комплекса через 90 минут инкубации при комнатной температуре. Поле сканирования 3.5x3.5 мкм. Произошло расщепление ДНК на два фрагмента: длинный и короткий. (Б) гистограмма распределения контурных длин цепей ДНК. Средняя контурная длина коротких фрагментов ~100 нм, а длинных ~ 200 нм. Над пиками гистограммы показаны АСМ изображения соответствующих нитей ДНК

Последующие эксперименты показали, что уже после 30 минут инкубации ДНК-белкового комплекса происходит расщепление ДНК на те же фрагменты. Однако такое разрезание не наблюдается в растворе. Причины такого расхождения пока не ясны и требуют дальнейшего изучения.

В главе 5 формулируются основные методические положения, разработанные в диссертационной работе, для исследования бактериальных клеток и макромолекул методом АСМ. Предлагаются методики приготовления биологических образцов, с помощью которых можно получать равномерно нанесенный слой бактериальных клеток заданной плотности на подложке, а также вытянутые в одном направлении длинные молекулы на подложке, такие как ДНК и амилоидные фибриллы.

Выводы

1. Исследование особенностей /¿»/-трансформированных бактериальных

клеток показало, что:

- /^-трансформация приводит к изменению морфологии поверхности клеток бактерий ЯкойоЪасгег зр1шего1с1ез т.е. к изменению наружного слоя внешней мембраны, а также практически полной утрате жгутиков у таких клеток.

- изменение наружного слоя внешней мембраны, обусловлено изменением структуры и состава ее липополисахаридов

2. При исследовании особенностей белка УВ-1 показано, что:

- в растворе с высокой ионной силой белок УВ-1 образует фибриллы, морфологически отличаются друг от друга

- свежеприготовленный белок УВ-1 находится в глобулярной мономерной форме и ионные условия не влияют на его конформацию в растворе

- неструктурированные Ы- и С- домены белка УВ-1 располагаются компактно вокруг домена холодового шока

- структурной единицей инициирующей возникновение протофибрилл является димерная форма белка УВ-1

3. При исследовании сайт-специфического связывания ДНК с никующей

эндонуклеазой М.ВБрБб! установлено, что:

- инкубация раствора ДНК с никазой приводит к связыванию молекулы ДНК с белком, который располагается в ожидаемом месте связывания и «разделяет» цепь ДНК на два фрагмента (равных, примерно, 1/3 и 2/3 длины)

- высота молекулы ДНК рядом с местом связывания соответствует высоте одноцепочечной молекулы ДНК, что согласуется с особенностью ферментативной активности никазы

- через 90 минут инкубации раствора ДНК-никазы с белком происходит расщепление ДНК в месте связывания на два фрагмента. Однако, такое разрезание не наблюдается в биохимических экспериментах

Список публикаций по теме диссертации

1. Мачулин A.B.. Смолыгина Л.Д., Сузина Н.Е., Сердюк О.П. Исследование морфологии клеток дикого типа и //tf-трансформанта фототрофной пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides методами атомно-силовой и электронной микроскопии. Биофизика, 2012. Т57(1):88-92.

2. Мачулин A.B.. Дерюшева Е.И., Юнусова А.К., Железная Л.А., Сердюк И.Н. Исследование сайт-специфического связывания ДНК с никующей эндонуклеазой Nt.BspDöl на уровне одиночных молекул методом атомно-силовой микроскопии. Биофизика, 2012. Т57(3):432-436.

3. Мачулин A.B.. Хечинашвили H.H. Исследование кинетики образования фибрилл белка YB-1 с помощью методов атомно-силовой микроскопии и аналитического ультрацентрифугирования. Современные проблемы науки и образования, 2012. № 5, стр. 1-7; URL: www.science-education.ru/105-7164 (дата обращения: 16.10.2012).

4. Сердюк О.П., Смолыгина Л.Д., Мачулин A.B. Атомно-силовая микроскопия в исследованиях морфологии i/rt-трансгенных клеток фототрофной пурпурной бактерии Rps. palustris. Сборник тезисов XIX Пущинских чтений по фотосинтезу. (Пущино, 15-19 июня 2009), стр. 56

5. Мачулин A.B.. Сердюк О.П., Смолыгина Л.Д., Сердюк И.Н. Исследование влияния трансформации агробактериальным вектором, несущим ген биосинтеза цитокининов, на фототрофные пурпурные бактерии Rhodobacter sphaeroides. Сборник тезисов 14-ой Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». (Пущино, 19-23 апреля 2010), стр.211.

6. Мачулин A.B. Исследование особенностей строения фотосинтетического аппарата Rhodobacter sphaeroides методами сканирующей зондовой и электронной микроскопии. Сборник тезисов I Международной конференции «Современное естествознание: вопросы и ответы». (Санкт-Петербург, 30-31 августа 2011), стр. 33-38.

7. Мачулин A.B., Дерюшева Е.И., Юнусова A.K. Исследование сайт-специфического связывания ДНК с никующей эндонуклеазой Nt.BspDöl методом атомно-силовой микроскопии. Сборник тезисов XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». (Москва, 9-13 апреля 2012), стр. 43.

8. Мачулин A.B.. Дерюшева Е.И., Юнусова А.К. Визуализация комклекса ДНК с никующей эндонуклеазой Nt.BspDöl методом атомно-силовой микроскопии. Сборник тезисов 16-ой Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». (Пущино, 16-21 апреля 2012), стр. 130-131.

9. Сердюк О.П., Санникова Е.П., Смолыгина Л.Д., Иванова Е.П., Мачулин A.B. Исследование ЛПС и морфологии клеток дикого типа и грМрансформанта фототрофной пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides методом атомно-силовой микроскопии. Сборник тезисов IV Съезда биофизиков России. (Нижний Новгород, 20-26 августа 2012 года), стр. 267.

Подписано в печать:

16.11.2012

Заказ № 7873 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мачулин, Андрей Валериевич

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. АСМ как метод исследования в биологии.

1.1.1. Основные методы исследования биологических объектов и их структурных особенностей.

1.1.2. Атомно-силовая микроскопия.

1.1.2.1. Основы АСМ.:.

1.1.2.1.1. Зондовые датчики.

1.1.2.1.2. Оптическая система регистрации.

1.1.2.1.3. Система точного позиционирования.

1.1.2.1.4. Управляющая электроника.

1.1.2.2. Режимы измерения в АСМ.

1.1.2.2.1. Контактный режим АСМ.

1.1.2.2.2. Полуконтактный режим АСМ.

1.1.2.3. Микроскоп ИНТЕГРА Вита.

1.2. АСМ бактериальных клеток, белковых молекул и молекул ДНК.

1.2.1. Основные методики препарирования биологических образцов для АСМ.

1.2.2. Применение АСМ для исследования бактериальных клеток.

1.2.3. Возможности АСМ в исследованиях молекул нуклеиновых кислот, белков и их комплексов.

1.2.3.1. Нуклеиновые кислоты.

1.2.3.2. Белковые молекулы.

1.2.3.3. Амиллоидные фибриллы.

1.2.3.4. Комплексы белков и нуклеиновых кислот.

1.3. Объекты исследования.

1.3.1. Фототрофные пурпурные бактерии.

1.3.1.1. Общая характеристика фототрофных пурпурных бактерий.

1.3.1.2. Влияние ¿¿»¿-трансформации на клетки бактерий.

1.3.1.3. Фотосинтетический аппарат фототрофных пурпурных бактерий.

1.3.2. Белок УВ-1.

1.3.2.1. Амилоидогенные белки.

1.3.2.2. Общая характеристика белка УВ-1.

1.3.2.3. Фибриллы белка УВ-1.

1.3.3. Сайт-специфическое связывание никующей эндонуклеазы №.Взр061 с ДНК.

1.3.3.1. Никующая эндонуклеаза.

1.3.3.2. Модель комплекса никазы №.В8рБ61 с ДНК.

Глава 2. Теоретическая часть.

2.1. Обработка и представление полученной информации.

2.1.1. Обработка АСМ данных.

2.1.2. Представление АСМ данных.

2.1.3. Устранение общих искажений.

2.1.3.1. Выравнивание поля.

2.1.3.2. Усреднение по строкам.

2.1.3.3. Фильтрация шумов.

2.1.3.4. Восстановление поверхности с учетом формы иглы.

2.1.4. Анализ АСМ-изображений.

2.2. Калибровка атомно-силового микроскопа.

2.2.1. Тестирование на различных объектах.

2.2.2. Объем белковых молекул по АСМ-данным. Белок УВ-1.

Глава 3. Материалы и методы.

3.1. Фототрофные пурпурные бактерии.

3.1.1. Объекты исследования.

3.1.2. Среды для выращивания ЯЬосЬлЬаМег 5ркаего1с1е5.

3.1.3. Модификация генома Ююс1оЬа&ег 8ркаего1с1е8 методом конъюгации.

3.1.3.1. Конъюгация на агаризованной среде.

3.1.3.2. Конъюгация в жидкой среде.

3.1.4. Идентификация гена биосинтеза цитокининов.

3.1.4.1. Выделение ДНК.

3.1.4.2. Полимеразная цепная реакция.

3.1.5. Выделение и идентификация липополисахаридов.

3.1.5.1. Определение хемотипа культуры.

3.1.5.2. Получение беспигментной клеточной биомассы.

3.1.5.3. Выделение липополисахаридов.

3.1.6. Колориметрическое определение количественного содержания ЛПС.

3.1.7. Выделение О-специфического полисахарида.

3.1.8. АСМиТЭМ.

3.2. Белок YB-1.

3.2.1. Получение белка YB-1 и условия образование фибрилл.

3.2.2. Аналитическое ультрацентрифугирование.

3.2.3. Атомно-силовая микроскопия.

3.3. Сайт-специфическое связывание никующей эндонуклеазы Nt.BspD6I с ДНК.

3.3.1. Выделение плазмидной ДНК из Escherichia coli.

3.3.2. ПЦР-амплификация.

3.3.3. Получение компетентных клеток Escherichia coli.

3.3.4. Трансформация компетентных клеток Escherichia coli.

3.3.5. Выделение никазы N.BspD61.

3.3.6. Фрагмент гена никазы.

3.3.7. Приготовление ДНК-белкового комплекса.

3.3.8. Атомно-силовая микроскопия.

Глава 4. Экспериментальная часть.

4.1. Фототрофные пурпурные бактерии.

4.1.1. Исследование влияния трансформации на морфологию поверхности.

4.1.1.1. Модификации клеток Rhodobacter sphaeroides методом конъюгация.

4.1.1.2. ТЭМ и АСМ клеток Rhodobacter sphaeroides.

4.1.1.3. Определение хемотипа культуры.

4.1.2. Исследование фотосинтетического аппарата фототрофных бактерий.

4.1.3. Выводы.

4.2. Белок YB-1.

4.2.1. Анализ свежеприготовленного белка YB-1 в условиях высокой (2 М LiCl) и низкой (150 мМ KCl) ионных силах методами АУ и АСМ

4.2.2. Кинетика фибрилообразования белка YB-1.

4.2.3. Полиморфизм фибрилл белка YB-1 в условиях высокой ионной силы.

4.2.4. Выводы.

4.3. Сайт-специфическое связывание никующей эндонуклеазы Nt.BspD6I с ДНК.

4.3.1. Визуализация отдельных молекул ДНК.

4.3.2. Визуализация отдельных молекул никазы.

4.3.3. Визуализация сайт-специфического связывания ДНК с никующей эндонуклеазой.

4.3.4. Расщепление никазой двухцепочечной молекулы ДНК.

4.3.5. Выводы.

Глава 5. Методические положения.

5.1. Метод «раздавленной капли» для получения монослоя клеток для АСМ.

5.2. Упорядочивание макромолекулярных вытянутых структур.

5.2.1. ДНК.

5.2.2. Альбебетин.

Выводы.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Атомно-силовая микроскопия: от бактериальных клеток до нуклеиновых кислот и белков"

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) - один из видов сканирующей зондовой микроскопии, основанный на регистрации сил Ван-дер-Ваальса возникающих при взаимодействии зонда с поверхностью образца. С помощью атомно-силового микроскопа можно получать изображения как поверхностей твёрдых тел, так и биологических объектов (бактерий, вирусов и молекул). Получением изображений не ограничиваются возможности этого прибора. С помощью атомно-силового микроскопа можно изучать взаимодействие объектов между собой: измерять силы трения, упругости, адгезии, а также перемещать отдельные атомы, осаждать и удалять их с какой-либо поверхности. Таким образом, на сегодняшний день АСМ является одним из основных инструментов для изучения рельефа поверхности в нанометровом масштабе. Развитие этого метода открыло принципиально новые возможности в исследовании структуры и локальных биофизических свойств биологических объектов различного уровня организации.

АСМ предлагает уникальную возможность по визуализации одиночных макромолекул, находящихся в атмосферных условиях или физиологических буферных растворах, в режиме реального времени. С помощью данного метода можно исследовать отдельные белки и молекулы ДНК, а также белок-белковые и ДНК-белковые комплексы, особенности их образования и специфического взаимодействия. Огромным преимуществом данного метода над другими является небольшое количество используемого при работе образца. Другими словами, исследования зачастую проводятся на одиночных объектах. Изображения макромолекулярных частиц могут быть полезны для оценки их размеров, однородности и конформации, а также для выявления реального расположения составляющих компонентов наблюдаемых частиц.

Однако, при всех достоинствах этого метода существует и ряд недостатков, главным из которых является отсутствие одновременной 6 информации обо всей поверхности, - в каждый момент времени мы имеем информацию только от участка непосредственно регистрируемого зондом. Кроме того, при взаимодействии сканирующего зонда с поверхностью, часто происходит ее деформация, а ряд внешних факторов может внести дополнительные шумы и искажения в изображения.

Стоит отметить, что если методология получения изображения клеточных объектов с помощью АСМ на сегодняшний день хорошо отработана и дает хорошие результаты, то для более мелких биообъектов, таких как белки и нуклеиновые кислоты приходится подбирать индивидуальные условия приготовления образца. Например, основной проблемой при исследовании ДНК-белковых комплексов является тот факт, что для непосредственной визуализации необходимо подобрать условия одновременного взаимодействия молекулы ДНК с белком и с поверхностью подложки.

Таким образом, поскольку не существует однозначно определенного подхода к исследованию биологических объектов методом АСМ, развитие методов препарирования и анализа биообъектов разных уровней организации является актуальной задачей.

Целью данной работы является развитие методологии атомно-силовой микроскопии при исследовании бактериальных клеток и макромолекул.

В качестве объектов исследования были выбраны биологические объекты различных размеров и уровней организации, начиная от бактериальных клеток размером от 0.5-5 мкм до молекул белков и нуклеиновых кислот. Задачи, решаемые методом АСМ в этом диапазоне размеров, чрезвычайно разнообразны: идентификация микроорганизмов по их морфологии, визуализация и контроль образования фермент-субстратных комплексов, визуализация единичных биомолекул и многое другое.

В данной работе методом АСМ было проведено исследование морфологии поверхности фототрофных бактериальных клеток Rhodobacter sphaeroides, а также влияние на них генной zp¿-трансформации, обладающей гормональной активностью в бактериях и регулирующих их физиологические процессы. Преимуществом этих бактериальных клеток является секвенированный геном, наличие инструментария для генетической инженерии, хорошо охарактеризованный метаболизм, а также большая мембранная поверхность в аэробных и анаэробных условиях роста. Данные клетки могут служить прекрасной моделью для исследования процесса фотосинтеза, особенно его начальных стадий. Кроме того, пурпурные бактерии интересны для выяснения организации фотосинтезирующего аппарата, путей биосинтеза пигментов, метаболизма углерода, эволюции фотосинтеза. Для понимания механизмов этих процессов многие из экспериментов проводятся на мутантах.

Исследования амилоидогенных белков, а именно особенностей их самоорганизации и влияния на этот процесс внешних условий приобрели в последние годы большую актуальность в связи с тем, что такие нейродегенеративные заболевания как болезнь Альцгеймера и Паркинсона напрямую связаны с нарушением нормальных физиологических и появление аномальных свойств таких белков вследствие изменения их пространственной структуры. В данной работе в качестве объекта исследования был использован амилоидогенный белок YB-1 - ДНК и РНК-связывающий белок, участвующий в различных внутриклеточных процессах. Для исследования кинетики образования фибрилл белка YB-1 были использованы методы АСМ и аналитического ультрацентрифугирования (АУ). Данные методы помогают не только приблизиться к пониманию процесса фибриллогенеза белка YB-1, а также позволяют выявить параметры протофибрилл, определяющих их функциональное состояние и упаковку в протяженные фибриллы. Кроме того, определение влияния внешних условий на начальных стадиях процесса фибриллогенеза дает возможность получать фибриллы с регулируемыми свойствами.

Также, представляется перспективным применение АСМ для изучения межмолекулярных взаимодействий, таких, как комплексы ДНК с белками и 8 другими лигандами. Изучение этих объектов сопряжено с дополнительными трудностями, так как они менее стабильны, чем ДНК, к воздействию многих факторов. АСМ может дать дополнительную информацию об укладке нитей ДНК в составе комплексов, а также местах комплексообразования.

В данной работе АСМ использовалась для визуализации специфического связывания и места посадки белка никующая эндонуклеаза Nt.BspD6I (никаза) на молекулу ДНК. Никаза является гетеродимерной эндонуклеазой рестрикции, одна из субъединиц которой проявляет специфическую никующую активность: связывается с двухцепочечной ДНК и вносит разрыв в одну цепь на расстоянии 4-х нуклеотидов от сайта связывания. Интерес к исследованию комплекса ДНК-никаза обусловлен важной ролью, которую играет этот фермент в ряде таких биотехнологических методов, как, например, изотермическая реакция для амплификации олигонуклеотидов и геномной ДНК. Кроме того, структурных исследований сайт-специфического взаимодействия для комплекса ДНК-никаза до сих пор проведено не было.

Таким образом, возникает потребность в развитии методики АСМ исследования бактериальных клеток и макромолекул, а также в повышении достоверности результатов исследования путем компьютерной обработки полученных данных, что представляет собой большой интерес для современной биофизики.

Для выбранных объектов исследования решались следующие задачи:

1. Исследовать морфологические особенности бактериальных клеток и влияние на них генной трансформации.

Для этого необходимо было:

- подобрать условия для визуализации фототрофных бактерий Rhodobacter sphaeroides

- идентифицировать влияние zpi-трансформации на морфологию поверхности клеток бактерий Rhodobacter sphaeroides

2. Исследовать процесс фибриллообразования белком YB-1, в том числе:

- определить объем отдельных молекул белка YB-1 путем анализа экспериментально измеренных параметров на АСМ-изображениях и сравнить его с гидродинамическим объемом

- исследовать структуры, образуемые белком YB-1 в различных ионных условиях методами АСМ и АУ

3. Исследовать сайт-специфическое связывание ДНК с никующей эндонуклеазой Nt.BspD6I:

- подобрать оптимальные условия для получения изображения ДНК-белковых комплексов высокого разрешения

- выявить особенности механизма взаимодействия ДНК с никующей эндонуклеазой

4. Предложить методики исследования микроорганизмов и макромолекулярных комплексов разного уровня организации с помощью АСМ.

Полученные в работе результаты имеют важное значение для развития представлений о структурной организации микроорганизмов и биополимеров, а методики, используемые в данной работе могут быть использованы для детального анализа клеточных и ряда белковых систем.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Мачулин, Андрей Валериевич

Выводы

1. Исследование особенностей ¿/^-трансформированных бактериальных клеток показало, что:

- ¡¡^/-трансформация приводит к изменению морфологии поверхности клеток бактерий ШюйоЪаМег $ркаего1(1е5 т.е. к изменению наружного слоя внешней мембраны, а также практически полной утрате жгутиков у таких клеток.

2. При исследовании особенностей белка УВ-1 показано, что:

- в растворе с высокой ионной силой белок УВ-1 образует фибриллы, морфологически отличаются друг от друга

- неструктурированные 14- и С- домены белка УВ-1 располагаются компактно вокруг домена холодового шока

- структурной единицей инициирующей возникновение протофибрилл является димерная форма белка УВ-1

3. При исследовании сайт-специфического связывания ДНК с никующей эндонуклеазой №.В8рБ61 установлено, что:

Благодарности

Выражаю глубокую признательность и благодарность своим научным руководителям [Сердюку Игорю Николаевичу! и Хечинашвили Николаю Николаевичу за чуткое руководство, неоценимую моральную поддержку и помощь на протяжении всей нашей совместной работы. Приношу свою глубокую благодарность сотрудникам группы физики нуклеопротеидов ИБ РАН и лаборатории структуры и динамики биомолекулярных систем ИБК РАН в которых была выполнена данная работа. Особенно хочу поблагодарить Селиванову Ольгу Михайловну и Тимченко Александра Александровича за теплую атмосферу взаимовыручки.

Я признателен всем коллегам, с которыми велись совместные исследования за доброжелательность, активное сотрудничество и обсуждение результатов. Отдельно хочу поблагодарить Ольгу Петровну Сердюк и Людмилу Алексеевну Железную.

Особую благодарность выражаю своей супруге Евгении и дочке Полине.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мачулин, Андрей Валериевич, Пущино

1. Stephens D.J., Allan V.J. Light microscopy techniques for live cell imaging. // Science, 2003, -V. 300, -№ 5616 -pp. 82-86.

2. Beerden L., Flerackers E.L.M., Janssen H.J. Phase-contrast microscopy // European Journal of Physics, 1985, -V. 6, -№ 3 -pp. 139-142.

3. Chim S.S., Kino G.S. Three-dimensional image realization in interference microscopy. // Applied Optics, 1992, -V. 31, -№ 14 -pp. 2550-2553.

4. Kner P. et al. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. //Nature Methods, 2009, -V. 6, -№ 5 -pp. 339-342.

5. Gustafsson M.G.L. et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination // Biophysical Journal, 2008, -V. 94, -№ 12 -pp. 4957-4970.

6. Welford W.T. Polarized Light Microscopy // Journal of Modern Optics, 1979, -V. 26, -№ 9 -pp. 1132-1132.

7. Zeskind B.J. et al. Nucleic acid and protein mass mapping by live-cell deep-ultraviolet microscopy. // Nature Methods, 2007, -V. 4, -№ 7 -pp. 567-569.

8. Lunde C.S. et al. UV microscopy at 280 nm is effective in screening for the growth of protein microcrystals // Journal of Applied Crystallography, 2005, -V. 38, -№ 6 -pp. 1031-1034.

9. Wollny G. et al. Nanoscale depth resolution in scanning near-field infrared microscopy. // Optics Express, 2008, -V. 16, -№ 10 -pp. 7453-7459.

10. Hastings G. et al. Infrared microscopy for the study of biological cell monolayers. I. Spectral effects of acetone and formalin fixation. // Biopolymers, 2008, -V. 89, -№ 11 -pp. 921-930.

11. Egerton R. Physical Principles of Electron Microscopy. Springer, 2005, p. 202.

12. Binnig G. et al. Surface studies by scanning tunneling microscopy // Physical Review Letters, 1982, -V. 49, -№ 1 -pp. 57-61.

13. Binnig G., Rohrer H. Scanning tunneling microscopy // Surface Science, 1985, -V. 152-153,-№ 1 -pp. 17-26.

14. Binnig G., Quate C.F., Gerber C. Atomic force microscope // Physical Review Letters, 1986, -V. 56 -pp. 930-933.

15. Jean M. Saint et al. Van der Waals and capacitive forces in atomic force microscopies // Journal of Applied Physics, 1999, -V. 86, -№ 9 -pp. 5245.

16. Klinov D., Magonov S. True molecular resolution in tapping-mode atomic force microscopy with high-resolution probes // Applied Physics Letters, 2004, -V. 84, -№ 14 .pp. 2697.

17. Meyer G., Amer N.M. Novel optical approach to atomic force microscopy // Applied Physics Letters, 1988, -V. 53, -№ 12 -pp. 1045-1047.

18. Hansma P.K. et al. Tapping mode atomic force microscopy in liquids // Applied Physics Letters, 1994, -V. 64, -№ 13 -pp. 1738-1740.

19. Cleveland J.P. et al. Energy dissipation in tapping-mode atomic force microscopy // Applied Physics Letters, 1998, -V. 72, -№ 20 -pp. 2613.

20. Kleinschmidt A.K. Monolayer techniques in electron microscopy of nucleic acids molecules // Methods in Enzymology / ed. N.S. Colowick, O. Kaplan. New York: Academic Press, 1968. pp. 361-377.

21. Yang J., Takeyasu K., Shao Z. Atomic force microscopy of DNA molecules. // FEBS Letters, 1992, -V. 301, -№ 2 -pp. 173-176.

22. Dorobantu L.S., Gray M.R. Application of atomic force microscopy in bacterial research. // Scanning, 2010, -V. 32, -№ 2 -pp. 74-96.

23. Tamayo J. et al. High-Q dynamic force microscopy in liquid and its application to living cells. // Biophysical Journal, 2001, -V. 81, -№ 1 -pp. 526-537.

24. Doktycz M. AFM imaging of bacteria in liquid media immobilized on gelatin coated mica surfaces // Ultramicroscopy, 2003, -V. 97, -№ 1-4 -pp. 209-216.

25. Schneider S.W. et al. Rapid aldosterone-induced cell volume increase of endothelial cells measured by the atomic force microscope. // Cell Biology International, 1997, -V. 21, -№ 11 -pp. 759-768.

26. Plomp M. et al. In vitro high-resolution structural dynamics of single germinating bacterial spores. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007, -V. 104, -№ 23 -pp. 9644-9649.

27. Casuso I., Rico F., Scheuring S. Biological AFM: where we come from where we are - where we may go. // Journal of molecular recognition, 2011, -V. 24, -№ 3 -pp. 406-413.

28. Bolshakova A. V, Kiselyova O.I., Yaminsky I. V. Microbial surfaces investigated using atomic force microscopy. // Biotechnology Progress, 2004, -V. 20, -№ 6 -pp. 1615-1622.

29. Dubrovin E. V et al. Atomic force microscopy investigation of phage infection of bacteria. // Langmuir The Acs Journal Of Surfaces And Colloids, 2008, -V. 24, -№ 22 -pp. 13068-13074.

30. Casuso I. et al. Experimental evidence for membrane-mediated protein-protein interaction. // Biophysical Journal, 2010, -V. 99, -№ 7 -pp. L47-L49.

31. Vadillo-Rodriguez V., Schooling S.R., Dutcher J.R. In Situ Characterization of Differences in the Viscoelastic Response of Individual Gram-Negative and GramPositive Bacterial Cells // Journal Of Bacteriology, 2009, -V. 191, -№ 17 -pp. 5518-5525.

32. Dague E. et al. Chemical force microscopy of single live cells // Nano Letters, 2007, -V. 7, -№ 10 -pp. 3026-3030.

33. Alsteens D. et al. Organization of the mycobacterial cell wall: a nanoscale view. // Pfliigers Archiv European journal of physiology, 2008, -V. 456, -№ 1 -pp. 117-125.

34. Бондаренко B.M., Яминский И.В., Демин В.В. Различия в клеточной поверхности гибридных бактерий, выявляемые с помощью атомно-силовой микроскопии // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1997,-Т. 6-с. 15-18.

35. Surman S.B. et al. Comparison of microscope techniques for the examination of biofilms // Journal of Microbiological Methods, 1996, -V. 25, -№ 1 -pp. 57-70.

36. Steele A., Goddard D.T., Beech I.B. An atomic force microscopy study of the biodeterioration of stainless steel in the presence of bacterial biofilms // International Biodeterioration Biodegradation, 1994, -V. 34, -№ 1 -pp. 35-46.

37. Beech I.B. et al. The use of atomic force microscopy for studying interactions of bacterial biofilms with surfaces // Colloids and Surfaces, 2002, -V. 23 -pp. 231247.

38. Gunning P.A. et al. Comparative imaging of Pseudomonas putida bacterial biofilms by scanning electron microscopy and both DC contact and AC non-contact atomic force microscopy // Journal Of Applied Bacteriology, 1996, -V. 81, -№ 3 -pp. 276-282.

39. Auerbach I.D. et al. Physical morphology and surface properties of unsaturated Pseudomonas putida biofilms. // Journal of bacteriology, 2000, -V. 182, -№ 13 -pp. 3809-15.

40. Diaz C. et al. Have flagella a preferred orientation during early stages of biofilm formation?: AFM study using patterned substrates. // Colloids and surfaces B Biointerfaces, 2011, -V. 82, -№ 2 -pp. 536-542.

41. Bustamante C. et al. Circular DNA molecules imaged in air by scanning force microscopy. //Biochemistry, 1992, -V. 31, -№ 1 -pp. 22-26.

42. Hu J. et al. Imaging of Single Extended DNA Molecules on Flat // Langmuir, 1996, -V. 12, -№ 7 -pp. 1697-1700.

43. Lyubchenko Y.L., Shlyakhtenko L.S. AFM for analysis of structure and dynamics of DNA and protein-DNA complexes. // Methods San Diego Calif, 2009, -V. 47, -№ 3 -pp. 206-213.

44. Lyubchenko Y.L., Jacobs B.L., Lindsay S.M. Atomic force microscopy of reovirus dsRNA: a routine technique for length measurements. // Nucleic Acids Research, 1992, -V. 20, -№ 15 -pp. 3983-3986.

45. Schaper A., Pietrasanta L.I., Jovin T.M. Scanning force microscopy of circular and linear plasmid DNA spread on mica with a quaternary ammonium salt. // Nucleic Acids Research, 1993, -V. 21, -№ 25 -pp. 6004-6009.

46. Hansma H.G., Hoh J.H. Biomolecular imaging with the atomic force microscope. // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure, 1994, -V. 23,-№ i -pp. 115-139.

47. Hansma H.G. et al. Atomic force microscopy of single- and double-stranded DNA. //Nucleic Acids Research, 1992, -V. 20, -№ 14 -pp. 3585-3590.

48. Borovok N. et al. Poly(dG)-poly(dC) DNA appears shorter than poly(dA)-poly(dT) and possibly adopts an A-related conformation on a mica surface under ambient conditions. // FEBS Letters, 2007, -V. 581, -№ 30 -pp. 5843-5846.

49. Fang Y. et al. Solid-state DNA sizing by atomic force microscopy. // Analytical Chemistry, 1998, -V. 70, -№ 10 -pp. 2123-2129.

50. Ficarra E. et al. Automated DNA fragments recognition and sizing through AFM image processing. // IEEE Trans Inf Technol Biomed., 2005, -V. 9, -№ 4 -pp. 508-517.

51. Rivetti C., Guthold M., Bustamante C. Scanning force microscopy of DNA deposited onto mica: equilibration versus kinetic trapping studied by statistical polymer chain analysis. // Journal of Molecular Biology, 1996, -V. 264, -№ 5 -pp. 919-932.

52. Moukhtar J. et al. Probing persistence in DNA curvature properties with atomic force microscopy. // Physical Review Letters, 2007, -V. 98, -№ 17 -pp. 178101.

53. Pope L.H. et al. Intercalation-induced changes in DNA supercoiling observed in real-time by atomic force microscopy // Analytica Chimica Acta, 1999, -V. 400, -№ 1-3 -pp. 27-32.

54. Pastré D. et al. Study of the DNA/ethidium bromide interactions on mica surface by atomic force microscope: influence of the surface friction. // Biopolymers, 2005, -V. 77, -№ 1 -pp. 53-62.

55. Lyubchenko Y.L., Shlyakhtenko L.S. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. II Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1997, -V. 94, -№ 2 -pp. 496-501.

56. Murakami M., Hirokawa H., Hayata I. Analysis of radiation damage of DNA by atomic force microscopy in comparison with agarose gel electrophoresis studies. // Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2000, -V. 44, -№ 1-2 -pp. 31-40.

57. Lysetska M. et al. UV light-damaged DNA and its interaction with human replication protein A: an atomic force microscopy study. // Nucleic Acids Research, 2002, -V. 30, -№ 12 -pp. 2686-2691.

58. Yan L., Iwasaki H. Thermal Denaturation of Plasmid DNA Observed by Atomic Force Microscopy // Japanese Journal of Applied Physics, 2002, -V. 41, -№ 12 -pp. 7556-7559.

59. Zhu Y. et al. Atomic force microscopy studies on DNA structural changes induced by vincristine sulfate and aspirin. // Microsc Microanal., 2004, -V. 10, -№ 2 -pp. 286-290.

60. Mukhopadhyay R., Dubey P., Sarkar S. Structural changes of DNA induced by mono- and binuclear cancer drugs. // Journal of Structural Biology, 2005, -V. 150, -№ 3 -pp. 277-283.

61. Banerjee T., Mukhopadhyay R. Structural effects of nogalamycin, an antibiotic antitumour agent, on DNA. // Biochemical and Biophysical Research Communications, 2008, -V. 374, -№ 2 -pp. 264-268.

62. Fang Y., Höh J.H. Surface-directed DNA condensation in the absence of soluble multivalent cations. // Nucleic Acids Research, 1998, -V. 26, -№ 2 -pp. 588-593.

63. Hou S. et al. DNA condensation induced by a cationic polymer studied by atomic force microscopy and electrophoresis assay. // Colloids and surfaces В Biointerfaces, 2008, -V. 62, -№ 1 -pp. 151-156.

64. Chen A. et al. Direct visualization of telomeric DNA loops in cells by AFM // Surface and Interface Analysis, 2001, -V. 32, -№ 1 -pp. 32-37.

65. Lyubchenko Y.L. et al. Visualization of hemiknot DNA structure with an atomic force microscope // Nucleic Acids Research, 2002, -V. 30, -№ 22 -pp. 4902-4909.

66. Shlyakhtenko L.S. et al. Structure and dynamics of three-way DNA junctions: atomic force microscopy studies // Nucleic Acids Research, 2000, -V. 28, -№ 18 -pp. 3472-3477.

67. Bae A.-H. et al. Rod-like architecture and helicity of the poly(C)/schizophyllan complex observed by AFM and SEM. // Carbohydrate Research, 2004, -V. 339, -№2-pp. 251-258.

68. Sletmoen M., Stokke B.T. Structural properties of poly C-scleroglucan complexes. // Biopolymers, 2005, -V. 79, -№ 3 -pp. 115-127.

69. Schneider S.W. et al. Molecular weights of individual proteins correlate with molecular volumes measured by atomic force microscopy. // Pflugers Archiv European journal of physiology, 1998, -V. 435, -№ 3 -pp. 362-367.

70. Kiselyova O.I., Yaminsky I.V. Atomic force microscopy of protein complexes // Atomic Force Microscopy: Biomedical Methods and Applications / под ред. P.C. Braga, D. Ricci. : Humana Press, 2003. C. 217-230.

71. Caruso F., Furlong D., Kingshott P. Characterization of ferritin adsorption onto gold // Journal of Colloid and Interface Science, 1997, -V. 186, -№ 1 -pp. 129-40.

72. Mori O., Imae T. AFM investigation of the adsorption process of bovine serum albumin on mica // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 1997, -V. 9, -№ 1-2 -pp. 31-36.

73. Nakata S. et al. Chemisorption of proteins and their thiol derivatives onto gold surfaces: characterization based on electrochemical nonlinearity. // Biophysical Chemistry, 1996, -V. 62, -№ 1-3 -pp. 63-72.

74. Mou J. et al. Chaperonins GroEL and GroES CfroïïàeTatomic force microscopy //Biophysical Journal, 1996, -V. 71 -pp. 2213-2221.

75. Mou J. et al. High resolution surface structure of E.coli GroES oligomer by atomic force microscopy //FEBS Letters, 1996, -V. 381 -pp. 161-164.

76. Millier D.J. et al. Imaging purple membranes in aqueous solutions at sub-nanometer resolution by atomic force microscopy. // Biophysical Journal, 1995, -V. 68, -№ 5 -pp. 1681-1686.

77. Schabert F.A., Henn C., Engel A. Native Escherichia coli OmpF porin surfaces probed by atomic force microscopy. // Science, 1995, -V. 268, -№ 5207 -pp. 9294.

78. Scheuring S., Sturgis J.N. Chromatic adaptation of photosynthetic membranes. // Science, 2005, -V. 309, -№ 5733 -pp. 484-487.

79. Scheuring S., Sturgis J.N. Atomic force microscopy of the bacterial photosynthetic apparatus: plain pictures of an elaborate machinery. // Photosynthesis Research, 2009, -V. 102, -№ 2-3 -pp. 197-211.

80. Ando T. et al. A high-speed atomic force microscope for studying biological macromolecules in action. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001, -V. 98, -№ 22 -pp. 12468-12472.

81. Kodera N. et al. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy //Nature, 2010, -V. 468, -№ 7320 -pp. 72-76.

82. Gosal W.S. et al. Amyloid under the atomic force microscope. // Protein and Peptide Letters, 2006, -V. 13, -№ 3 -pp. 261-270.

83. Goldsbury C. et al. Multiple assembly pathways underlie amyloid-beta fibril polymorphisms. // Journal of Molecular Biology, 2005, -V. 352, -№ 2 -pp. 282298.

84. Jansen R., Dzwolak W., Winter R. Amyloidogenic self-assembly of insulin aggregates probed by high resolution atomic force microscopy. // Biophysical Journal, 2005, -V. 88, -№ 2 -pp. 1344-1353.

85. Benseny-Cases N., Côcera M., Cladera J. Conversion of non-fibrillar betasheet oligomers into amyloid fibrils in Alzheimer's disease amyloid peptide aggregation. // Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007, -V. 361,-№ 4-pp. 916-921.

86. Hoyer W. et al. Rapid self-assembly of alpha-synuclein observed by in situ atomic force microscopy. // Journal of Molecular Biology, 2004, -V. 340, -№ 1 -pp. 127-139.

87. Marek P. et al. Aromatic interactions are not required for amyloid fibril formation by islet amyloid polypeptide but do influence the rate of fibril formation and fibril morphology. // Biochemistry, 2007, -V. 46, -№ 11 -pp. 3255-3261.

88. Khurana R. et al. A model for amyloid fibril formation in immunoglobulin light chains based on comparison of amyloidogenic and benign proteins and specific antibody binding. // Amyloid, 2003, -V. 10, -№ 2 -pp. 97-109.

89. Hamada D. et al. Effect of an amyloidogenic sequence attached to yellow fluorescent protein. //Proteins, 2008, -V. 72, -№ 3 -pp. 811-821.

90. Hansma H.G. et al. Applications for atomic force microscopy of DNA. // Biophysical Journal, 1995, -V. 68, -№ 5 -pp. 1672-1677.

91. Hansma H.G. et al. Bending and straightening of DNA induced by the same ligand: characterization with the atomic force microscope. // Biochemistry, 1994, -V. 33,-№28-pp. 8436-8441.

92. Hamon L. et al. High-resolution AFM imaging of single-stranded DNA-binding (SSB) protein—DNA complexes // Nucleic Acids Research, 2007, -V. 35, -№ 8 -pp. e58.

93. Shi W.-X., Larson R.G. RecA-ssDNA filaments supercoil in the presence of single-stranded DNA-binding protein. // Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007, -V. 357, -№ 3 -pp. 755-760.

94. Guo C. et al. Atomic force microscopic study of low temperature induced disassembly of RecA-dsDNA filaments. // The Journal of Physical Chemistry B, 2008, -V. 112, -№ 3 -pp. 1022-1027.

95. Yang Y. et al. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions //Nucleic Acids Research, 2005, -V. 33, -№ 13 -pp. 4322^1334.

96. Jia Y. et al. Alpha-shaped DNA loops induced by MutS. // Biochemical and Biophysical Research Communications, 2008, -V. 372, -№ 4 -pp. 618-622.

97. Erie D.A. et al. DNA bending by Cro protein in specific and nonspecific complexes: implications for protein site recognition and specificity. // Science, 1994, -V. 266, -№ 5190 -pp. 1562-1566.

98. Valle M. et al. The interaction of DNA with bacteriophage phi 29 connector: a study by AFM and TEM. // Journal of Structural Biology, 1996, -V. 116, -№ 3 -pp. 390-398.

99. Hoischen C. et al. Escherichia coli low-copy-number plasmid R1 centromere parC forms a U-shaped complex with its binding protein ParR // Nucleic Acids Research, 2008, -V. 36, -№ 2 -pp. 607-615.

100. Wyman C. et al. Determination of heat-shock transcription factor 2 stoichiometry at looped DNA complexes using scanning force microscopy. // The European Molecular Biology Organization Journal, 1995, -V. 14, -№ 1 -pp. 117123.

101. Shin M. et al. DNA looping-mediated repression by histone-like protein TINS: specific requirement of Eg70 as a cofactor for looping // Genes & Development, 2005, -V. 19, -№ 19 -pp. 2388-2398.

102. Lushnikov A.Y. et al. DNA strand arrangement within the Sfil-DNA complex: atomic force microscopy analysis. // Biochemistry, 2006, -V. 45, -№ 1 -pp. 152-158.

103. Argaman M. et al. Phase imaging of moving DNA molecules and DNA molecules replicated in the atomic force microscope. // Nucleic Acids Research, 1997, -V. 25, -№ 21 -pp. 4379-4384.

104. Ohta T. et al. Atomic force microscopy proposes a novel model for stem-loop structure that binds a heat shock protein in the Staphylococcus aureus HSP70 operon. // Biochemical and Biophysical Research Communications, 1996, -V. 226, -№ 3 -pp. 730-734.

105. Murakami M. et al. Analysis of interaction between DNA and Deinococcus radiodurans PprA protein by atomic force microscopy. // Biochimica et Biophysica Acta, 2006, -V. 1764, -№ 1 -pp. 20-23.

106. Madigan M.T., Gest H. Growth of the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas capsulata chemoautotrophically in darkness with H2 as the energy source. // Journal Of Bacteriology, 1979, -V. 137, -№ 1 -pp. 524-530.

107. Кондратьева E.H. Фототрофные микроорганизмы. M.: Изд-во МГУ, 1989 с. 376.

108. Гусев М.В., Минеева JI.A. Микробиология. М.: Академия, 2003. с. 464.

109. Miller С.О. et al. Kinetin, a cell division factor from deoxyribonucleic acid // J. Am. Chem. Soc., 1955, -V. 77, -№ 5 -pp. 1392-1392.

110. Letham D.S. Zeatin, a factor inducing cell division isolated from Zea mays // Life Sci., 1963, -V. 2 -pp. 569-573.

111. Kakimoto T. Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate :ATP/ADP isopentenyltransferases. // Plant cell physiology, 2001, -V. 42, -№ 7 -pp. 677-685.

112. Takei K., Yamaya T., Sakakibara H. Arabidopsis CYP735A1 and CYP735A2 encode cytokinin hydroxylases that catalyze the biosynthesis of trans-Zeatin. // The Journal of Biological Chemistry, 2004, -V. 279, -№ 40 -pp. 41866-41872.

113. Cedzich A. et al. Characterization of Cytokinin and Adenine Transport in Arabidopsis Cell Cultures 1 OA. // Plant Physiology, 2008, -V. 148, -№ 4 -pp. 1857-1867.

114. Кузнецов B.B., Дмитриева Г.А. Физиология растений. M.: Высшая школа, 2006. с. 742.

115. Романов Г.А. Как цитокинины действуют на клетку // Физиология растений, 2009, -Т. 56 -с. 295-319.

116. Алексеева В.В. и др. Физиолого-биохимические особенности растений табака с агробактериальным геном изопентенилтрансферазы // Физиология растений, 2000, -Т. 47, -№ 3 -с. 408-415.

117. Simon R., Priefer U., Piihler A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria // Group, 1983, -V. 1, -№ 9 -pp. 784-791.

118. Cogdell R.J. et al. The structural basis of light-harvesting in purple bacteria // FEBS Letters, 2003, -V. 555, -№ 1 -pp. 35-39.

119. Shreve A.P. et al. Femtosecond energy-transfer processes in the B800-850 light-harvesting complex of Rhodobacter sphaeroides 2.4.1. // Biochimica et Biophysica Acta, 1991, -V. 1058, -№ 2 -pp. 280-288.

120. Sunde M. et al. Common core structure of amyloid fibrils by synchrotron X-ray diffraction // Journal of Molecular Biology, 1997, -V. 273, -№ 3 -pp. 729-739.

121. Nilsson M.R. Techniques to study amyloid fibril formation in vitro. // Methods San Diego Calif, 2004, -V. 34, -№ 1 -pp. 151-160.

122. Pedersen J.S., Andersen C.B., Otzen D.E. Amyloid structure—one but not the same: the many levels of fibrillar polymorphism. // The FEBS journal, 2010, -V. 277, -№22 -pp. 4591-4601.

123. Fàndrich M., Meinhardt J., Grigorieff N. Structural polymorphism of Alzheimer Abeta and other amyloid fibrils. // Prion, 2009, -V. 3, -№ 2 -pp. 89-93.142

124. Paravastu A.K. et al. Molecular structural basis for polymorphism in Alzheimer's beta-amyloid fibrils. // Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America, 2008, -V. 105, -№ 47 -pp. 18349-18354.

125. Petkova A.T. et al. Self-propagating, molecular-level polymorphism in Alzheimer's beta-amyloid fibrils. // Science, 2005, -V. 307, -№ 5707 -pp. 262265.

126. Venturoni M. et al. Investigations into the polymorphism of rat tail tendon fibrils using atomic force microscopy. // Biochemical and Biophysical Research Communications, 2003, -V. 303, -№ 2 -pp. 508-513.

127. Chamberlain A.K. et al. Ultrastructural organization of amyloid fibrils by atomic force microscopy. // Biophysical Journal, 2000, -V. 79, -№ 6 -pp. 32823293.

128. Morris A.M., Watzky M.A., Finke R.G. Protein aggregation kinetics, mechanism, and curve-fitting: a review of the literature. // Biochimica et Biophysica Acta, 2009, -V. 1794, -№ 3 -pp. 375-397.

129. Gosal W.S. et al. Competing pathways determine fibril morphology in the self-assembly of P 2 -microglobulin into amyloid // Journal of Molecular Biology, 2005, -V. 351, -№ 4 -pp. 850-864.

130. Bhak G., Choe Y.-J., Paik S.R. Mechanism of amyloidogenesis: nucleation-dependent fibrillation versus double-concerted fibrillation. // BMB reports, 2009, -V. 42, -№ 9 -pp. 541-551.

131. Kodali R., Wetzel R. Polymorphism in the intermediates and products of amyloid assembly. // Current Opinion in Structural Biology, 2007, -V. 17, -№ 1 -pp. 48-57.

132. Wetzel R., Shivaprasad S., Williams A.D. Plasticity of amyloid fibrils. // Biochemistry, 2007, -V. 46, -№ 1 -pp. 1-10.

133. Елисеева И.А. и др. Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1) и его функции // Успехи биологической химии, 2011, -Т. 51 -с. 65-132.

134. Evdokimova V.M. et al. The major protein of messenger ribonucleoprotein particles in somatic cells is a member of the Y-box binding transcription factor143family. // The Journal of biological chemistry, 1995, -V. 270, -№ 7 -pp. 3186— 3192.

135. Ruzanov P. V et al. Interaction of the universal mRNA-binding protein, p50, with actin: a possible link between mRNA and microfilaments. // Journal of Cell Science, 1999, -V. 112, -№ 2 -pp. 3487-3496.

136. Raffetseder U. et al. Splicing factor SRp30c interaction with Y-box protein-1 confers nuclear YB-1 shuttling and alternative splice site selection. // The Journal of Biological Chemistry, 2003, -V. 278, -№ 20 -pp. 18241-18248.

137. Okamoto T. et al. Direct interaction of p53 with the Y-box binding protein, YB-1: a mechanism for regulation of human gene expression. // Oncogene, 2000, -V. 19, -№ 8 -pp. 6194-6202.

138. Kloks C.P.A.M. et al. The solution structure and DNA-binding properties of the cold-shock domain of the human Y-box protein YB-1. // Journal of Molecular Biology, 2002, -V. 316, -№ 2 -pp. 317-326.

139. Ladomery M., Sommerville J. Binding of Y-box proteins to RNA: involvement of different protein domains. // Nucleic Acids Research, 1994, -V. 22, -№ 5 -pp. 5582-5589.

140. Kohno K. et al. The pleiotropic functions of the Y-box-binding protein, YB-1. // BioEssays news and reviews in molecular cellular and developmental biology, 2003, -V. 25, -№ 7 -pp. 691-698.

141. Ashizuka M. et al. Novel translational control through an iron-responsive element by interaction of multifunctional protein YB-1 and IRP2. // Molecular and cellular biology, 2002, -V. 22, -№ 18 -pp. 6375-83.

142. Safak M., Gallia G.L., Khalili K. Reciprocal interaction between two cellular proteins, Pura and YB-1, modulates transcriptional activity of JCVCY in glial cells // Molecular and Cellular Biology, 1999, -V. 19, -№ 4 -pp. 2712-2723.144

143. Safak M. et al. Physical and functional interaction between the Y-Box binding protein YB-1 and human polyomavirus JC virus large T antigen // Journal of Virology, 1999, -V. 73, -№ 12 -pp. 10146-10157.

144. Tompa P. Intrinsically unstructured proteins. // Trends in Biochemical Sciences , 2002, -V. 27, -№ ю -pp. 527-533.

145. Lobanov M.Y., Galzitskaya О. V. The Ising model for prediction of disordered residues from protein sequence alone. // Physical Biology, 2011, -V. 8, -№ 3 -pp. 035004.

146. Evdokimova V.M., Ovchinnikov L.P. Translational regulation by Y-box transcription factor: involvement of the major mRNA-associated protein, p50. // The international journal of biochemistry cell biology, 1999, -V. 31, -№ 1 -pp. 139-149.

147. Ozer J. et al. Isolation and characterization of a cDNA clone for the CCAAT transcription factor EFIA reveals a novel structural motif. // The Journal of Biological Chemistry, 1990, -V. 265, -№ 36 -pp. 22143-22152.

148. Skabkin M.A. et al. Structural organization of mRNA complexes with major core mRNP protein YB-1 // Nucleic Acids Research, 2004, -V. 32, -№ 18 -pp. 5621-5635.

149. Селиванова O.M. и др. Белок YB-1 обладает способностью образовывать протяженные нанофибриллы // Биохимия, 2010, -Т. 75, -№ 5 -с. 629-636.

150. Guryanov S.G. et al. Formation of Amyloid-Like Fibrils by Y-Box Binding Protein 1 (YB-1) Is Mediated by Its Cold Shock Domain and Modulated by Disordered Terminal Domains // PLoS ONE, 2012, -V. 7, -№ 5 -pp. e36969.

151. Железная JI.А. и др. Никующие эндонуклеазы // Успехи биологической химии, 2009, -Т. 49 -с. 107-128.

152. Ness J. Van, Ness L.K. Van, Galas D.J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003, -V. 100, -№ 8 -pp. 4504-4509.

153. Zheleznaya L.A. et al. Some properties of site-specific nickase BspD6I and the possibility of its use in hybridization analysis of DNA. // Biochemistry Biokhimiia, 2002, -V. 67, -№ 4 -pp. 498-502.

154. Bath J., Green S.J., Turberfield A.J. A free-running DNA motor powered by a nicking enzyme. // Angewandte Chemie International Edition, 2005, -V. 44, -№ 28 -pp. 4358-4361.

155. Roberts R.J. et al. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. // Nucleic Acids Research, 2003, -V. 31, -№ 7 -pp. 1805-1812.

156. Железная Л.А. и др. Сайт-специфическая никаза из штамма Bacillus species D6II Биохимия, 2001, -T. 66, -№ 9 с. 1215-1220.

157. Wah D.A. et al. Structure of the multimodular endonuclease Fokl bound to DNA. //Nature, 1997, -V. 388, -№ 6637 -pp. 97-100.

158. Kachalova G.S. et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of the site-specific DNA nickase Nb.BspD6I // Acta Crystallographica Section F Structural Biology And Crystallization Communications, 2005, -V. 61, -№ Pt 3 -pp. 332-334.

159. Yunusova A.K. et al. Nickase and a protein encoded by an open reading frame downstream from the nickase BspD6I gene form a restriction endonuclease complex. // Biochemistry Biokhimiia, 2006, -V. 71, -№ 7 -pp. 815-820.

160. Vanamee E.S., Santagata S., Aggarwal A.K. Fokl requires two specific DNA sites for cleavage. // Journal of Molecular Biology, 2001, -V. 309, -№ 1 -pp. 6978.

161. Winkler F.K. et al. The crystal structure of EcoRV endonuclease and of its complexes with cognate and non-cognate DNA fragments. // the The European Molecular Biology Organization Journal, 1993, -V. 12, -№ 5 -pp. 1781-1795.

162. Woerd M.J. Van Der et al. Restriction enzyme BsoBI-DNA complex: a tunnel for recognition of degenerate DNA sequences and potential histidine catalysis. // Structure London England 1993, 2001, -V. 9, -№ 2 -pp. 133-144.

163. Necas D., Klapetek P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis // Central European Journal of Physics, 2011, -V. 10, -№ 1 -pp. 181-188.

164. Villarrubia J.S. Algorithms for scanned probe microscope image simulation , surface reconstruction , and tip estimation // Journal Of Research Of The National Institute Of Standards And Technology, 1997, -V. 102, -№ 4 -pp. 425^154.

165. Williams P.M. Blind reconstruction of scanning probe image data // Journal of Vacuum Science and Technology B: Microelectronics and Nanometer Structures, 1996, -V. 14, -№ 2 -pp. 1557.

166. Арутюнов П.А., Толстихина A.JI., Демидов B.H. Система параметров для анализа шероховатости и микрорельефа поверхности материалов в сканирующей зондовой микроскопии // Диагностика материалов, 1998, -Т. 9, -№ 65 -с. 27-37.

167. Mummery L. Surface texture analysis // The handbook. : Hommelwerke GmbH, 1990.

168. Ratcliff G.C., Erie D.A. A novel single-molecule study to determine proteinprotein association constants. // Journal of the American Chemical Society, 2001, -V. 123, -№ 24 -pp. 5632-5635.

169. Edstrom R.D. et al. Direct visualization of phosphorylase-phosphorylase kinase complexes by scanning tunneling and atomic force microscopy. // Biophysical Journal, 1990, -V. 58, -№ 6 -pp. 1437-1448.

170. Hutner S.H. Organic growth essentials of the aerobic nonsulfur photosynthetic bacteria // J. Bact., 1946, -V. 52 -pp. 213.

171. Lindberg A.A., Hellerqvist C.G. Rough mutants of Salmonella typhimurium: immunochemical and structural analysis of lipopolysaccharides from rfaH mutants. //Journal of General Microbiology, 1980, -V. 116, -№ 1 -pp. 25-32.

172. Galanos C., Luderitz O., Westphal O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. // The Federation of European Biochemical Societies Journal, 1969, -V. 9, -№ 2 -pp. 245-249.

173. Кулылин В.А. и др. Улучшенный метод выделения липополисахаридов из грамотрицательных бактерий // Мол. генетика, 1987, -Т. 5 -С. 44-46.

174. Moran А.Р. et al. Chemical characterization of Campylobacter jejuni lipopolysaccharides containing N-acetylneuraminic acid and 2,3-diamino-2,3-dideoxy-D-glucose. //Journal Of Bacteriology, 1991, -V. 173, -№ 2 -pp. 618-626.

175. Janda J., Work E. A colorimetric estimation of lipopolysaccharides // Febs Letter, 1971, -V. 16 -pp. 343-345.

176. Kondo S. A Chemical Study of the Sugar Composition of the Polysaccharide Portion of Lipopolysaccharides isolated from Vibrio cholerae Non-01 from 02 to 0155 // System. Appl. Microbiol, 1997, -V. 20 -pp. 1-11.

177. Schuck P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and lamm equation modeling. // Biophysical Journal, 2000, -V. 78, -№ 3 -pp. 1606-1619.

178. Маниатис T, Фрич Э, Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование., 1984.

179. Inoue Н, Nojima Н, Okayama Н. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. // Gene, 1990, -V. 96, -№ 1 -pp. 23-28.

180. Lang F.S, Oesterhelt D. Gene Transfer System for Rhodopseudomonas viridis II Journal of bacteriology, 1989, -V. 171 -pp. 4425^1435.

181. Stukalov O. et al. Use of atomic force microscopy and transmission electron microscopy for correlative studies of bacterial capsules. // Applied and environmental microbiology, 2008, -V. 74, -№ 17 -pp. 5457-65.

182. Сердюк И.Н., Евсеева O.H. Новые возможности аналитического ультрацентрифугирования для анализа гидродинамических свойств белков // Успехи биологической химии, 2006, -Т. 46 -с. 349-372.

183. Selivanova О.М. et al. YB-1 is capable of forming extended nanofibrils. // Biochemistry Biokhimiia, 2010, -V. 75, -№ 1 -pp. 115-120.

184. Goldsbury C.S. et al. Polymorphic fibrillar assembly of human amylin. // Journal of Structural Biology, 1997, -V. 119, -№ 1 -pp. 17-27.

185. Bauer H.H. et al. Architecture and polymorphism of fibrillar supramolecular assemblies produced by in vitro aggregation of human calcitonin. // Journal of Structural Biology, 1995, -V. 115, -№ 1 -pp. 1-15.

186. Jiménez J.L. et al. The protofilament structure of insulin amyloid fibrils // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002, -V. 99, -№ 14 -pp. 9196-9201.

187. Uversky V.N., Fernández A., Fink A.L. Structural and Conformational Prerequisites of Amyloidogenesis // Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases Protein Reviews. NY: Springer US, 2006. pp. 1-20.

188. Fándrich M., Schmidt M., Grigorieff N. Recent progress in understanding Alzheimer's (3-amyloid structures. // Trends in Biochemical Sciences , 2011, -V. 36, -№ 6 -pp. 338-345.

189. Uversky V.N. Mysterious oligomerization of the amyloidogenic proteins. // The FEBS journal, 2010, -V. 277, -№ 14 -pp. 2940-2953.

190. Сердюк И.Н. Структурированные белки и белки с внутренней неупорядоченностью // Молекулярная биология, 2007, -Т. 42 -с. 287-313.

191. Knaus K.J. et al. Crystal structure of the human prion protein reveals a mechanism for oligomerization. // Nature Structural Biology, 2001, -V. 8, -№ 9 -pp. 770-774.

192. Janowski R. et al. 3D domain-swapped human cystatin С with amyloidlike intermolecular beta-sheets. // Proteins, 2005, -V. 61, -№ 3 -pp. 570-578.149

193. Liu C., Sawaya M.R., Eisenberg D. microglobulin forms three-dimensional domain-swapped amyloid fibrils with disulfide linkages. // Nature Structural & Molecular Biology, 2011, -V. 18, -№ 1 -pp. 49-55.

194. Sawaya M.R. et al. Atomic structures of amyloid cross-beta spines reveal varied steric zippers. //Nature, 2007, -V. 447, -№ 7143 -pp. 453-457.

195. Hansma H.G., Laney D.E. DNA binding to mica correlates with cationic radius: assay by atomic force microscopy. // Biophysical Journal, 1996, -V. 70, -№ 4-pp. 1933-1939.

196. Lyubchenko Y.L., Shlyakhtenko L.S., Ando T. Imaging of nucleic acids with atomic force microscopy. // Methods San Diego Calif, 2011, -V. 54, -№ 2 -pp. 274-283.

197. Pastre D. et al. Adsorption of DNA to mica mediated by divalent counterions: a theoretical and experimental study. // Biophysical Journal, 2003, -V. 85, -№ 4 -pp. 2507-2518.

198. Bezanilla M. et al. Motion and enzymatic degradation of DNA in the atomic force microscope. // Biophysical Journal, 1994, -V. 67, -№ 6 -pp. 2454-2459.

199. Klinov D.V., Dubrovin E.V., Yaminsky I.V. Substrate for Scanning Probe Microscopy of DNA: HOPG versus mica // Physics of Low-Dimensional Structures, 2003, -V. 3, -№ 4 -pp. 119-124.

200. Bustamante C Keller D Yang D. Scanning force microscopy of nucleic nucleoprotein assemblies // Current Opinion in Structural Biology, 1993, -V. 3, -№ 3 -pp. 363-372.

201. Sorel I. et al. The EcoRI-DNA complex as a model for investigating proteinDNA interactions by atomic force microscopy. // Biochemistry, 2006, -V. 45, -№ 49 -pp. 14675-14682.

Информация о работе

Мачулин, Андрей Валериевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2012
ВАК 03.01.02

Диссертация

Атомно-силовая микроскопия: от бактериальных клеток до нуклеиновых кислот и белков - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы