Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

АТФазная активность и фосфолипиды в системе нейрон-нейроглия в норме и при судорогах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "АТФазная активность и фосфолипиды в системе нейрон-нейроглия в норме и при судорогах"

Р1 о им

2 О ЦОП

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

толстугпша татьяна ттлиппнл

АТФазная АКТИВНОСТЬ И ФОСФОЛИПИДЫ В СИСТЕМЕ НЕЙРОН-НЕЙРОГЛИЯ В НОРМЕ И ПРИ СУДОРОГАХ

специальность 03.СО. 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1995 г.

Работа выполнена в НИИ физиологии им. А.А.Ухтомского Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель - докт.биол.наук, вед.н.с. М.А.Флеров

Официальные оппоненты - докт.мед.наук, вед.н.с. Н.Г.Никульчева

канд.биол.наук, вед.н.с. Н.Ф.Синютина

Ведущее учреждение - Институт Физиологии им. И.П.Павлова РАН

Защита диссертации состоится "-/У- иимЯз в-7 0 час, на заседании диссертациошюго совета

_199<

в ^ (// час, на заседании диссертационного сбвета К 063.57.09 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете (199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9).

С диссертацией можно ознакомится в научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

.1 ✓f О» /У_х g g<f~r ш

Автореферат разослан " 'I и "_' '_199_> г.

Ученый секретарь диссертационного совета А.Г.Марков

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на значительный прогресс"в"изучении"АТФаз"ЦНС, до настоящего времени--------

они крайне слабо исследованы в соответствии с их принадлежностью к тем, или иным клеточным или субклеточным компартментам единой системы нейрон-нейроглия. В отличие от других органов, таких как печень, легкие и т.д., мозг представляет собой гетерогенную систему, состоящую из специфически дифференцированных единиц (Сар-кисов, Гельфанд, 1993). Эти единицы не обладают взаимозаменяемостью, но от слаженности их работы и взаимодополняемости зависит СОСТО.Т1ШО ЦНС.

Учитывая , что глиальные клетки преобладают в мозговых го-могенатах над нервными, приходится констатировать, что при исследовании биохимических процессов в ЦНС, мы отдаем предпочтение одной клеточной популяции - глиальной, над другой - нейрональ-ной.

Нейроны же являются основной структурно-функциональной единицей нервной системы ( Флеров, 1992). Они активно накапливают

информацию и передают ее в прилегающую или отстоящую глию ( Кля-ич, Романов, Туманова, 1995). Предполагается, что процессы приема, обработки и хранения информации в головном мозгу компартмен-тализованы. При этом глии отводится роль хранилища информации (Ройтбак,1993 ). Комплекс такого высокого порядка как система нейрон-нейроглия способен к саморегулированию, самопрограммированию и самонастройке,поэтому особый интерес представляет раздельное изучение особенностей состава и метаболизма нейронов и нейроглии.

Несмотря на обаирную литературу, посвященную молекулярным механизмам патогенеза эпилептической активности ( Глебов, Крыжа-новский, 1983, 1984), практически нет работ по обобщению данных изменения активности АТФаз при судорожных состояниях по сравнению с нормой в единой системе, состоящей из нейронов, их нервных окончаний и клеток нейроглии в сочетании с характеристикой фос-фолипидного микроокружения АТФаз, изменению метаболизма фосфоли-пидов и модификации мембранных липидов.

Цель и задачи исследований. Основной целью, которую мы поставили перед собой было изучение вклада нейрональных, нейроглиальных и синаптосомальных АТФаз в гомеос-таз мозга. Для достижения поставленной цели необходимо было ре-

шить следующие задачи:

1. Оценить АТФазную активность в нейронах, нейроглии и си-наптосоиах в норме.

2. Оценить различия в фосфолипидном составе нейронов, нейроглии и синаптосом.

3. Изучить влияние фосфолипаз на активность АТФаз, принадлежащих различным клеточным и субклеточным компартментам.

4. Определить изменение АТФазной активности при судорогах в нейронах, нейроглии и синаптосомах.

5. Проследить, как изменяются процессы перекисного окисления липидов и метаболизма фосфолипидов в микроокружении АТФаз при пикротоксиновых судорогах.

6. Исследовать изменение АТФазной активности в нейронах, нейроглии и в синаптосомах в восстановительный период.

Основные положения, выносимые на защиту. Проведенные нами исследования установили, что ней-рональная, нейроглиальная и синаптические фракции характеризуются строго индивидуальной АТФазной активностью. Поскольку эти различия выявляются не только в норме, но при эпилептическом состоянии, а также в восстановительный период, когда саморегуля-торные механизмы системы нейрон-нейроглия направлены на воссоздание нормального баланса в мозге, то можно говорить о специфической роли АТФаз каждой единицы системы нейрон-нейроглия.

Удалось выяснить, что незначительные изменения, регистрирующиеся для активности АТФаз гомогената мозга эпилептизированных животных в действительности скрывают разные изменения активностей АТФаз в клеточных и субклеточных структрурах. В глии Мд- и Ыа,К-АТФазы резко увеличивают свою активность при судорогах, в нейронах увеличивается активность только Мд-АТФазы, для нейро-нальной же Иа,К-АТФазы не обнаруживается изменений активности, что скорее всего связано с защитной ролью глии, направленной на удаление избыточного калия из межклеточного пространства ( Ройт-бак, 1993).

АТФазы фракций синаптических мембран и легких синаптосом при судорогах снижают свою активность, тогда как для фракции тяжелых синаптосом выявлено увеличение активностей АТФаз.

В восстановительный период отмечается значительное увеличение АТФазных активностей фракций нервных окончаний, тогда как в нейронах и нейроглии активности АТФаз снижаются и возвращаются к контрольным значениям. Разная направленность при экстремальной

ситуации и в восстановительный период изменения активностей АТФ -аз, принадлежащих разным компартментам системы нейрон-нейро1— лия, указывает на их различную роль в этой системе.

Особенности состава-и- метаболизма __ фосфолипидов нейронов,

нейроглии и нериных окончаний могут определять различия б активности АТФаз, принадлежащих к различным клеточным или субклеточным популяциям.

Так процентное содержание фосфатидилсерина во фракции тяжелых синаптосом в 1,5 раза ниже, чем во фракции синаптических мембран и легких синаптосом и близко по значению содержанию фосфатидилсерина в глиальной фракции. Отметим, что именно во фракции тяжелых синаптосск , также как и г клеточных фракциях, при судорогах, вызванных пикротоксином, наблюдалось увеличение АТФая-ной активности, в отличие от фракций синаптических мембран и легких синаптосом. Для остальных фосфолипидов нервных окончаний таких различий в процентном соотношении не обнаружено.

Найденный нами низкий уровень сфингомиелина в синаптических фракциях считается характерной чертой для возбудимых мембран. Интересно, что и для нейронов отмечается более низкий уровень сфингомиелина, чем для глиальнкх клеток.

Основными фосфолипидами для клеточных и субклеточных фракций являются фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин.

Достаточно высокое содержание фосфатидной кислоты во фракции нервных окончаний, по-видимому, связано с ее ролью ионофора. Кроме того фосфатидная кислота участвует в процессах деполяризации и высвобождения нейромедиаторов. Содержание фосфатидилинози-та в синаптических фракциях в 1,5-2 раза выше содержания фосфатидной кислоты. Это, вероятно, оправдано участием фосфатидилино-эита в переносе катионов и К+ и непосредственной связью гидролиза фосфатидилинозита с активность На,К-АТФаэы , а также в осуществлении ими якорной функции. Фосфатидилинозиты являются предшественниками вторичных мессенджеров.

В связи с особой ролью двух названных фосфолипидов, принадлежащих к одному фосфсинозитиднону циклу , оправдана их наивысшая ОУА в синаптических фракциях.

Высокая же ОУА лизофосфатидилхолина в этих субклеточных фракциях связана с тем, что лизофосфатидилхолин является промежуточным продуктом на пути синтеза такого важного нейромедиато-ра, каким является ацетилхолин. Большая скорость включения радио -активного предшественника в лизофосфатидилхолин может быть

обусловлена и тем,что этот фосфолипид может выступать в качестве эндогенного регулятора дофаминового рецептора ( 01i.vei.ra, 1984).

Фосфолипазы Аид, затрагивая неодинаковые группировки фос-фолипидов в микроокружении АТФаз, по-разному модифицирует активность последних: первая снижает активность На,К-АТФазы а вторая, напротив, активирует этот фермент.

Снижение Ка,К~АТФазной активности под влиянием фосфолипаз типа А является универсальным свойством как клеточных, так и субклеточных АТФаз.

Интенсивность перекисного окисления липидов не одинакова для разных клеток, принадлежащих системе нейрон-нейроглия, при физиологических условиях. На пике судорожной активности в нейронах отмечено снижение накопления диеновых, триеновых конъюгатов и оснований Шиффа, что соответствует теории фазного изменения процессов перекисного окисления липидов в ЦНС при стрессе ( Гуляева, 1989: Барабой, 1991). То, что в нейроглии аналогичным образом не снижается накопления данных продуктов перекисного окисления липидов у эпилептиэированных животных, может служить подтверждением ее защитной роли по отношению к нейронам ( Ройтбак, 1993) .

На основании полученных данных можно сделать вывод, что нейро-глиальные взаимоотношения направлены на саморегулирование и самонастройку, то есть на поддержание определенных гомеостати-ческих механизмов в мозге в целом.

Научная новизна. Впервые проведено комплесное исследование изменения активности АТФаз в единой системе нейрон-нервные окончания-глия при судорогах по сравнению с нормой и в восстановительный постэпилептический период в сочетании с данными по количественному распределению фосфолипидов в разных ком-партментах этой системы и с изменениями в метаболизме фосфолипидов и процессов перекисного окисления липидов.

В результате проведенных исследований установлено, что для отдельных элементов системы определяются различные АТФазные активности в норме, при судорогах, и в восстановительный период после их прекращения, что указывает на тесное взаимодействие и взаимодополнение различных компартментов мозга в процессах его саморегулировании через посредство АТФаз.

К такому же выводу можно прийти при изучении изменения процессов перекисного окисления липидов во время судорог , поскольку обнаружено, что глия может выполнять защитную роль от свобод-

- 5 -

ных радикалов по отношению к нейронам.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные по активно-стй~АТФаз~в"ноПро-глиальной системе в норме или -при- судорогах -позволят расширить наси представления о вкладе различных клеточных и субклеточных компартментов в обеспечение гомеостаза мозга в целом. Кроме того, результаты могут иметь значение лля практической медицины в решении проблем деятельности мозга и эпилептической активности. Представляется возможны?? использовать н.эя/и результата для осознания патогенетических механизмов взаимодействия отдельных компонентов ансамбля нейрон-нервные оконча-Т7'5т-"лт?рогл,?ет при шипрптиформнии актиьносги и

твенных средств, обладающих строго направленным конкретный адресным действием. Экспериментальные результаты и основные выводы использованы при составлении курса "Нейрохимия" для студентов биолого-почвенного факультета С-ПбГУ. Они включены в учебное пособие "Методы биохимических исследований", 1982 г.

Апробацияработы. Материалы диссертации доложены на II и III Всесоюзных симпозиумах " Структура, биосинтез и превращение 'иппдог" (Ленинград, 10 75: 197S J , ис ~г^сгл-.зттст-: симпозиуме "Кс. оёолизм белков ЦНС" (Днепропетровск , 197Р. на с^езмон симпозиуме по медицинской пнзимологии (Астрахань, 1'.<:'~<;, на v; иол^зре.шни биохимиков Прибалтийских роспубчик , БССР, Ленинграда f j, 1С<Ы), на Всесоюзной конференции пс биохимии нервней системы (Горькии, 148'/,), на Всесоюзном Соъе^ании ( Пущено, 19 9 0', ь.! Всесоюзной конференции "Доминантные механизмы по-i-еденчес.м'х .-.з.ттании" ( Ленинград, 1990), на Исссоюч,ной конференции Фармакологические коррекции гипоксических состоянии (Гродно , , m конференции по липидам ( Санкт-Петербург,

19 9 4), и нл 1лучных семинарах лаборатории бисхичии нерпной системы и обмена веществ и кафедры биохимии Санкт-Петербургского государственного университета.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19

О D С Т .

С б ъ е м и с т р у к тура работы. Диссертация состоит к-< введения, обзера литературы, описания метопов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы.Работа изложена на 208 страницах машинописного текста, включая 19 рисунков и 23 таблицы, список литературы включает 439 работ.

- б -

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты ставили на белых крысах-самцах массой 120-150 г.

Судороги вызывались внутрибрюшинным введением 0,25% пикро-токсина 0,2 мл на 100 гр массы животного.

При выделении нейрональной и нейроглиальных фракций одна проба содержала около 2 г коры, а при получении синаптических фракций одна проба содержала примерно 3 г коры.

При получении клеточных фракций кору больших полушарий тщательно измельчали бритвой на охлажденных стеклянных пластинках и суспендировали в растворе ПВП. Когда же проводили субклеточное фракционирование, кору больших полушарий гомогенизировали в теф-лоновом гомогенизаторе в среде выделения. Процесс выделения клеточных популяций в среднем занимал 5 часов, а субклеточное фракционирование - около 3 часов.

Обогащенные фракций нейронов и нейроглии получали по методу, предложенному селлинджером с соавт. в 1971 г. в модификации Флерова М.А.(1978). Для получения синаптических фракций использовали модифицированный Шевцовым с соавт. (1972) метод выделения субклеточных фракций (<3е ИоЬег^Б ,1962).

Выделенные нейрональные и нейроглиальные клетки,также как и синаптические фракции, отмывали от сахарозы и альбумина. В полученных клеточных и субклеточных фракциях определяли содержание белка по Лоури (Ьоигу et а1., 1951).

Для изучения АТФазной активности осадки клеточных и субклеточных фракций после промывки подвергали однократному замораживанию-оттаиванию (Глебов ,1971). Влияние липолитических ферментов на активность №,К-АТФазы синаптических фракций и частичная реактивация проводилась в соответствии с рекомендациями Шарпа (1974 ).

Экстракцию и очистку общей фракции липидов для дальнейшего определения содержания и метаболизма фосфолипидов проводили по методу Фолча (Го1сЬ et а1.,1957), при изучении же процессов пере-кисного окисления липидов , общие липиды экстрагировали по Кейт-су(1975) в модификации Шведовой (1992). Разделение фосфолипидов на отдельные фракции осуществлялось при помощи двумерной тонкослойной хроматографии (Уад1сЬага,1973). В качестве сорбента использовали отечественный силикагель марки КСК с размером частиц 20- 30 мк. Содержание отдельных фракций фосфолипидов определяли по методу Бартлетта (Ваг"ЬИ'Ь'Ь,1959) .

Применяя метод радиоактивной индикации, в качестве радиоак-

тивного предшественника использовали ацетат-2-14С из расчета 30 мкКи на 100 г массы животного и 60 минут радиоактивной экспозиции.

Определение содержания продуктов переписного окисления ли--------пидов- проводили следующими методами: малонового диальдегида - по

Владимирову, Арчакову,1972; а диеновых и триеновых конъюгатов проводили по методу Бабиджаева М.А. 1985 ), б модификации Шведовой A.A. (1992). Содержание оснований Шиффа определяли по методу Чио и Таппеля (Chio K.S., Tappel А.L.,1969) в модификации Шведовой A.A. (1992) .

Все подученные результаты обрабатывали статистически, применяя правила вариационной статистики, изложенные в работах Аш-кар:та •• ^-r^fii.rna H.A. (19«?) , ч также Рокицкого П.Ф.(1965).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как показали наши исследования, АТФазам каждой клеточной или субклеточной популяции отведена своя особая роль как в норме, так и при патологии.

Таблица 1

Сравнительные данные по изучению АТФазных активностей в клеточных и субклеточных фракциях в норме

( в ккМолях Рн на мг белка в час)

Об^ая АТФаэная а ктивность Mg Na , К

Нейроны 8 , 3 • о, 5 ь , 9 г 0 , 4 : , , 3 : с , ,4

Кейроглия ?Й , 3 + 1, , 3 18,7 + 0 , , 9 9 . 5 - р, , 9

Синалт.мембраны 35 ,9 о, 7 21 , 6 0 , , 8 15 , 3 1 п, , 3

Легкие синаптосомы 30 ,5 + 0, 7 20,4 + 0, ,6 10, ,1 ± о, , 4

Тяжелые синаптосомы 2 2 , 3 ± 1, 0 13 , 0 ± 1, 0 4 , , 4 - 0 , 3

— := - -----— = — I-------- —: — — —- -----

Из представленных в табл.1 данных видно - наименьшие активности АТФ -аз в норме отмечены для нейронов, причем активность (Мд"1"4") -ЛТ' -e.il' нейреглии в 3,5 рата вы™е, чек в нейронах, активность же N а,Г-АТФазы нейроглии выше, чем в нейронах ь 4,5 раза. Активность (Мдг+)-АТФазы субклеточных фракций скорее сраышка с таковой для глиальной фракции. Высокие значения активности Мд-АТФазы нервных окончаний связаны с тем, что она в этих структурах способствует захвату нейромедиаторов синаптическими везикулами. Вполне оправданы высокие значения На,К-АТФазы во фракции

синаптических мембран. Значения Ыа,К-АТФазы легких синаптосом и нейроглии почти совпадают.

Уже по показателям активности АТФаз, отноящимся к норме, можно утверждать, что АТФазы, принадлежащие к различным клеточным или субклеточным компартментам, а потому, выполняющие хоть и сходные, но индивидуальные функции не являются идентичными.

Поскольку фосфолипиды, наряду с ионами Са++ и циклическими нуклеотидами,как известно, являются частью интегральной системы регуляции клеточной активности, несомненно интересно сравнить фосфолипидный состав нейрональной фракции, глиальной фракции и синаптосомальных субфракций, принимая во внимание и тот факт, что свойства АТФаз, принадлежащих различным клеточным или субклеточным популяциям могут определятся липидным микроокружением.

I I н I 1 г ЕЛ СМ ^лс ЕЗтс

Рис.1 Сравнение процентного содержания фосфолипидов в клеточных и субклеточных фракциях. Установлено, что фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин являются основными фосфолипидами для всех клеточных и субклеточных фракций. Обращает на себя внимание тот факт, что для фракции тя-

желых синаптосом %-ное содержание фосфатидилсерина в 1,5 раза

ниже, чем во фракциях синаптических мембран и легких синаптосом, для остальных фосфолипидов нервных окончаний таких различий в ° -ном "соотношении- не~ обнаруживается7 В нейронах %-ное - содержание -сфингомиелина в з раза ниже, чем б глии. Низкий уровень СФМ отмечается и для синаптических фракций, что характерно для возбудимых мембран. Действительно, во фракциях нервных окончаний содержание сфингомиелина в 4,5-3 раза ниже, чем в глии и схоже с таковым для нейронов. Особого внимания заслуживает фосфатидная кислота синаптосом. Содержание последней в синаптических фракциях выше,чем в нейронах. Такой сравнительно более высокий уровень фппфяфилнои киспоты ь синаптических Ф^акиилх молче* быть связан с особой функцией нервных окончаний - переносом ь момент возбуждения ионов Са++ через ионофоры мембран нервных окончаний, поскольку самой фосфатидной кислоте приписываются свойства ионофора. Вероятно, высокий уровень содержания фосфатидной кислоты в синаптических фракциях связан и с участием ее в процессах деполяризации и освобождения нейромедиаторов в мозгу. Содержание фосфатидилинозита в субклеточных фракциях находится в ¡¡редела»: 5-о<°, что совпадает сс значениями, ¡¡слученными дя.с клеточных фракций нейронов и иейроглии (рис.1).

Метаболическую активность фосфолипидов, принадлежащих к различным клрточныч пни субклеточным структурам системы ч«и-рон-нейроглс.с, мы исследовали при введении радиоактивного ацота-та--2-1'*С сроком на 1 час.

Таблица 2

Отнсситеиьна л удельная радиоактивность фосфолипидов нейронов,нейроглии и синаптосом.

¡олилидъ: н 11Г си Л С ТС

ЛФХ 187 113 790 634 1316

СФМ 108 85 226 535 562

-1X 3 147 125 311 ',01

ей I Ъ 9 9 5 1211 ¡50 3 2 317

-С :? 7Г г ^ г» 6Г2 229

¿ЗА 1 2 о 3 6 184 27 4 14 8

ФК 404 277 2211 1145 593

При сравнении полученных нами данных по относительной удельной радиоактивности нейронов, нейроглии и синаптосои (табл.2) можно отметить значительно большую по величине активность для всех семи исследованных фосфолипидов нервных окончаний нежели тех же фосфолипидов клеточных фракций, при этом ,если для нейронов наивысшей ОУА обладают лизофосфатидилхолин(187) и фос-фатидная кислота(404), то для нейроглии наивысшей ОУА обладает фосфатидная кислота(277).

Для синаптических фракций наивысшая ОУА отмечается для трех фосфолипидов, а именно - фосфатидилинозита, фосфатидной кислоты и лизофосфатидилхолина. При внимательном рассмотрении ОУА фосфа-тидилинозитола и фосфатидной кислоты становится очевидной взаимозависимость обмена фосфатидной кислоты и фосфатидилинозитола в трех субклеточных фракциях, и можно высказать предположение о поочередности "запусков" фосфоинозитидных циклов в разных синаптических фракциях. Возможно, эта очередность в каждом конкретном случае зависит от характера ответа всей системы нейрон-нейроглия в целом на внешнее воздействие. В связи с особой ролью , выполняемой фосфатидной кислотой и фосфатидилинозитом в нервных окончаниях, становится понятной их высокая относительная удельная радиоактивность по сравнению с другими фосфолипидами именно в этих образованиях. Относительная удельная активность лизофосфатидилхолина синаптосом также в несколько раз выше, чем таковая нейронов и нейроглии, это связано, вероятно, с тем, что лизофос-фатидилхолин является промежуточным продуктом на пути биосинтеза ацетилхолина- основной транспортной формой ацетилхолина в головном мозгу, потребности в котором выше в нервных окончаниях.

Рассмотрев данные по метаболической активности фосфолипидов клеточных и субклеточных фракций, следует признать неоспоримым факт, что по уровню радиоактивности фосфолипиды нейронов и нейроглии значительно отличаются от таковой для синаптических фракций .

При изучении липолитического действия фосфолипазы Аз на АТФ -азную активность субклеточных фракций и нейроглиальной фракции, как и предполагалось, был найден универсальный ответ , заключающийся в с :ти АТФаз клеточных и субклеточных

структур(

Фосфолилаза Д , напротив, увеличива-•

ла ферментативную активность.

Таблица 3

Влияние фосфолипазы А2 на изменение АТФазной активности (в мкмолях Рн в час на мг белка) в синаптических фракциях.*

АТФазная активность Синаптические Легкие Тяжелые

мембраны синаптосомы синаптосомы

Общая контроль 32,4 ± 0,7 31,7 ± 1,0 35,1 ± 1,2

актив- фосфоли-

ность паза А2 18,3 ± 1,9 17,8 ± 1,2 20,4 ± 1,2

Мд-АТФ- контроль 25,5 ± 0,5 26,6 ±0,9 31,6 ± 1,1 аза фосфоли-

паза А2 16,6 ± 1,1 16,8 ± 3,0 19,4 ± 1,2

Иа,К-АТФ контроль 6,9 ± 0,3 5,1 ± 0,3 3,5+0,2 аза фосфоли-

паза А2 1,7 ± 0,2 1,0+0,2 1,0 ± 0,1

* - различия достоверны, р<0,05 ( по сравнению с контролем)

Таблица 4

Влияние фосфолипаз А2 и Д на АТФазную активность в нейроглии (в мкмолях Рн на мг белка в мин)

АТФазная активность Контроль Ф-за А2 Ф-за Д

* *

общая 6,03 ± 0,36 3,77 + 0,23 11,31 + 0,95

Уабаин-нечувствительная 3,39 ± 0,07 2,69 ± 0,15 7,73 ± 0,63* Уабаин-чувствительная 2,64 ± 0,29 1,08 ± 0,05* 3,58 + 0,3 2*

Итак, при физиологических условиях различные элементы системы нейрон-неироглия имеют не одинаковые активности АТФаз, сочетающиеся с не одинаковым составом фосфолипидов и метаболизмом.

При рассмотрении АТФазной активности нейронов, нейроглии и синаптосом на пике судорожной активности, вызванной пикротокси-ном, видно, что в нейронах, нейроглии и во фракции тяжелых синаптосом увеличивается АТФазная активность, в то время как во фракциях синаптических мембран и легких синаптосом наблюдается обратный процесс. Интересно отметить, что активность Ыа,К-АТФазы нейронов остается на прежнем уровне (табл.5).

Таблица 5

Сравнительные данные по изучению АТФазных активностей в клеточных и субклеточных фракциях при судорогах ( в мкМолях Рн/мг белка/час)

АТФазная активность Общая Мд На, К

Нейроны 14, ,6 + 0, ,8 11, ,2 + 0, ,7 2, ,9 + 0, ,3

Нейроглия 42, ,5 + 1, ,0 26, ,7 + 0, ,8 15, ,7 + 0, ,8

Синапт.мембраны 28, ,8 + 1, ,1 18, ,2 + о, ,9 ю, ,7 + 0, ,6

Легкие синаптосомы 25, ,4 + 1, ,3 19, ,0 + 1, ,7 6, ,4 + 0, ,8

Тяжелые синаптосомы 27, ,1 + 2, ,0 20, ,В + 2, ,3 6, ,3 + 0, ,8

Теперь уже установлено, что во время эпилептической активности нейроны теряют ионы К+ и приобретают Иа"1" , а глия , наоборот, приобретает ионы калия и теряет Ма+. Активация глиальной Ыа,К-АТФазы,таким образом,направлена в данном случае на поглощение клетками нейроглии ионов К+ .

Неодинаковая реакция АТФазных систем синаптосом на эпилептическое состояние, по-видимому, связана с тем, что разные си-наптические образования обладают разной способностью к медленным и быстрым электрофизиологическим механизмам. Напомню здесь, что фракция тяжелых синаптосом отличалась пониженным содержанием фосфатидилсерина, почти таким же как и для нейроглии.

Имеется ли какой либо параллелизм между изменениями в АТФ -азной активности и изменениями в метаболизме фосфолипидов ?

Скорость обмена ФХ, ФЭА и СФМ, соотношение которых в мембране определяет ее стабильность с одной стороны и склонность к изгибам с другой, увеличивается в нейронах в 2-2,5 раза. Одно -временно со значительным увеличением включения метки из ацета-та-2-^4С в ФИ и ФК, наблюдается необычно высокий уровень обмена

Таблица б

Удельная радиоактивность фосфолипидов нейронов и нейроглии при введении ацетата-2-14С(имп/мин.мг С) при судорогах *

Фосфолилиды Нейроны Нейроглия

Лизофосфатидилхолин 5456 + 451 204 3 ±135

Сфингомиелин 1707 + 91 552 ± 98

фосфатидилхолин 1608 4- 9 3 651 ± 40

Фосфатидилинозитол 14628 + 1115 4378 ± 355

Фосфатидилсерин 7380 + 104 3536 ± 455

Фосфатидил^танолакин 1532 - 125 326 ± 7 -

Фосфатидная кислота 14337 - 2192 48с: 7± 996

* - данные получены совместно с М.А. Флеровым (*). ЛФХ и ФС в нейронах. Т.о. под воздействием пикротоксина происходит одновременное увеличение обмена всех фосфолипидов нейронов, но доля участия каждого из них в крупномасштабных перестройках не одинакова.В нейроглии достоверное повышение метаболической активности было отмечено не для всех ФЛ-ов.Так, если судороги оказывали, как и е случае нейронов, наибольшее влияние на ФИ и ФС нейроглии, метаболизм которых по сравнению с нормой увеличивался в 10 раз, то для СФМ и ФХ достоверных отличий не было(табл.б)

Кы предположили, что при судорогах модификация АТФаэной активности может быть опосредована не только изменениями ь метаболизме фосфолипидов, но и-гу> структурными изменениями в клеточных мембранах, связанными и с перекисным окислением липидов.

Содержание диеновых и триеновых коньюгатов - промежуточных продуктов перекисного окисления липидов, а также ¡оснований Шиффа

ь ксоиуУЦа'Х-

- конечных продуктов перекисного окисления липидов в норме приблизительно в три раза выше, чем в нейроглии. Это, как мы видели ранее, связано с тем, что нейрональные фосфолипиды имеют более высокий метаболический статус по сравнению с нейроглиальными

фосфолипидаки.

Под воздействием пикротоксина содержание диеновых и триеновых котп.югатов, а также оснований Шиффа в нейронах снижается в 1,4-1,5 раза, соответственно. В нейроглии же достоверных изменений не обнаруживается, то есть реакция нейронов и нейроглии на невротизацию пикротоксином различна. Известно, что нейроны осо-

Таблица 7

Содержание диеновых, триеновых коньюгатов и оснований Шиффа в нейронах и нейроглии коры головного мозга в норме и при судорогах.

Показатель ПОЛ Условия опыта Нейроны Нейроглия

Диеновые коныогаты Норма 1,34 + 0,08 0,44 0,03

(Е232/МГ ФЛ) Пикротоксин 0,97 + 0,09* 0,50 + 0,03

Триеновые коныогаты Норма 0,63 + 0,06 0,28 + 0,02

(Е274/МГ ФЛ) Пикротоксин 0,44 + 0,05* 0,33 + 0,02

Основания Шиффа Норма 292 + 5 173 + 21

(в усл.ед.флуор./мг ФЛ) Пикротоксин 184 + 18* 195 + 10

* - различия достоверны, р$0,05

бенно чувствительны к действию окислителей и что в первые десять минут после начала эпилептического приступа в нервной системе после мгновенного кратковременного всплеска перекисного окисления липидов, наблюдается его спад. Судя по нашим данным, это снижение накопления продуктов ПОЛ в нервной системе связано с уменьшением перекисности именно нейрональных мембран (табл.7).

Общеизвестна противоположная направленность изменения активности На,К-АТФазы и процессов накопления продуктов ПОЛ в ЦНС. В связи с этим, следовало бы ожидать увеличения активности Ка,К-АТФазы нейронов и неизменности активности глиальной АТФазы.

Оказалось же, что пикротоксиновые судороги не изменяют активности Ыа,К-АТФазы в нейронах на фоне снижения накопления продуктов ПОЛ, но в нейроглии, напротив, неизменные процессы перекисного окисления липидов сочетаются с активацией На,К-АТФазы. В данной случае, вероятно, активация глиальной Иа.К-АТФ - азы направлена не только на защиту нейронов от избытка внеклеточного калия, но и на защиту их от продуктов перекисного окисления липидов параллельно с включением антиоксидантных систем. Другими словами, активация глиальной Ка,К-АТФазы способствует поддержанию работы Ыа,К-АТФазы нейронов на постоянном уровне.

Нами было обнаружено, что в восстановительный период для

всех синаптосомальных фракций наблюдается значительный прирост АТФазных активностей (табл.8).

Таблица"8

Сравнительные данные по изучению АТФазных активностей в клеточных и субклеточных фракциях в восстановительный период через 1-1,5 часа после прекращения судорог (в мкМолях Рн/мг белка/час)

АТФазная активность Общая Мд на,К

Нейроны 6 , 1 + 0, ,1 5, , 1 г о, , 1 1,0 ± 0 , , 1

Нейроглия 27 ,2 + 1, , 1 18 , ,8 + 1, ,0 8,4 + 0, ,8

Синапт.мембраны 53 ,1 + 2, ,8 34 , ,0 + 2 , ,0 19,1 + 1, , 2

Легкие синаптосомы 49 ,5 + 2, ,1 34 , ,5 + 1, ,7 15,0 + 0, ,8

Тяжелые синаптосомы 38 ,9 + 1, ,0 27, ,8 + 0, ,6 11,0 + 0, ,6

Возможно, что в восстановительный период накопившийся во

время судорожного процесса Са++ активно выводится из синапто -плазмы, в результате чего устраняется его тормозное влияние на транспортную АТФаэу в нервных окончаниях и она резко активируется. В нейронах же и кейроглии по нашим данным наблюдается противоположно направленный процесс - АТФазная активность клеточных фракций снижается по сравнению с результатами, полученными для судорожного припадка, и следует отметить, что в нейронах и в нейроглии в восстановительный период АТФазная активность возвращается к исходному уровню, полученному для контрольных животных. Таким образом, адаптационные процессы, затрагивающие мембран-но-встроенные АТФазы, интенсифицируются именно в синаптосомальных фракциях, а за счет этого в клеточных компартментах восстанавливается равновесное состояние.

Результаты нашей работы подтверждают концепцию о том, что нейро-глиальное партнерство обеспечивается определенными конфор-мационными состояниями,соответствующими данному режиму работы.

ВЫВОДЫ :

1. Установлено, что нейрональная,нейроглиальная и синапти-ческие фракции характеризуются строго индивидуальной АТФазной активностью.

- 16 -

2. Особенности состава и метаболизма фосфолипидов нейронов, нейроглии и нервных окончаний определяют различия в активности АТФаз.

3. Фосфолипазы А и Д по-разному модифицируют АТФазную активность. Действие фосфолипаз типа А , вызывает снижение АТФаэ-ной активности , тогда как фосфолипаза Д , напротив,активирует Ыа,К-АТФазную активность.

4. При судорогах усиливается метаболизм всех фосфолипидов в нейронах, наиболее же значительные изменения отмечены для ФИ,ФС и ЛФХ. в глии достоверно повышается метаболическая активность не всех фосфолипидов: для СФМ и ФХ изменений не обнаружено.

5. Установлено, что такие продукты перекисного окисления липидов, какими являются диеновые, триеновые конъюгаты и основания Шиффа, in vivo значительно интенсивнее образуются в физиологических условиях в нейронах, что связано с их меньшешей устойчивостью к действию активных форм кислорода по сравнению с гли-ей.

При пикротоксиновых судорогах в нейронах происходит снижение диеновых, триеновых коньюгатов и оснований Шиффа, соответствующее фазному характеру изменений процессов ПОЛ в ЦНС при стрессе, а в глии изменений не обнаружено.

6. При судорогах резко увеличивается активность глиальной На,К-АТФазы на фоне неизменной активности нейрональной Na,K-AT-Фазы, что связано с защитной ролью глии.

7. В синаптических фракциях изменения АТФазной активности имеют не одинаковую направленность при судорогах.

8. В восстановительный период за счет восстановления ионного равновесия увеличивается АТФазная активность в синаптических фракциях, активность же глиальной Ка,К-АТФ-азы возвращается к контрольному уровню.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1.Флеров М.А.,Толстухина Т.И. Состав и обмен фосфолипидов синаптосом.-Сб.Нервная система. -Л.: -ЛГУ. -1978. -N19. -С.58-62

2.Флеров М.А.,Толстухина Т.И. Зависимость АТФазной активности субклеточных фракций коры головного мозга от функционального состояния. -Тезисы доклада Всес.симп.Метаболизм белков ЦНС. -Днепропетровск.-1978.- С.127;

3.Флеров М.А.,Толстухина Т.Н. АТФазные системы субклеточных фракций головного мозга при судорогах. -Всес.симп.по мед.энзимо-логии.-Астрахань. -1979. -С.154;

4.Флеров М.А.,Боровицкая А.Э.,Толстухина Т.И. Влияние пик-ротоксина на АТФазную активность субклеточных' фракций коры головного мозга. -Сб.Нервная. система.-Л.:— -ЛГУ.—1980г--К" 21Т-С79 6-9 8 ;

5.Флеро& К.А.,Боровицкая А.Э.,Толстухина Т.И. Действие фос-фолипазы А на АТФазные системы субклеточных фракции головного мозга. -Сб.Нервная система.-Л.: -ЛГУ. -1981. -Ы 23. -с.91-95;

6.Флеров М.А..Толстухина Т.И.Изменение активности АТФаз под влиянием пикротоксина в нейронах и нейроглии.Тезисы VI конф. биохимиков Приба лт. респ. , БССР, Л-да. -Рига. -1981. -С. 447-448;

7.Флеров М.А. , Толстухина Т.И. .Влияние пикротоксиня ч» АТФ -азную актиьность клеточных и субклеточных фракции головного мозга. -Тезисы докл. Всес.конф. по биохимии нервн.сист.-Горький. -1987. -С.216-217;

8.Толстухина Т.И.,Путилина Ф.Е.,Флеров М.А. Роль перекисно-го окисления липидов в проявлении функциональной активности нейронов и нейроглии. -Всес.конф. Доминантные механизмы поведенческих адаптаций. -Л.: -1990. -Вып.2. -С.54;

9.Флеров М.А..Толстухина Т.И. Изменение метаболизма фосфо-лилидного катрикса нейронов и нейроглии при гипоксии. -Сб.тезисов Всес.конф. Фармакологическая корреляция гипоксических состояний. -Гродно. -1991.-С.32-33;

Ю.Флеров М.А.,Толстухина Т.И.Метаболизм фосфолипидоь нейронов и нейроглии при судорогах. -Вопр.мед.химии. -1992. -Т.32.-N 2. -С.40-43;

И.Осадчая Л.М., Флеров К.А., Путилина Ф.Е., Толстухина Т.И. Влияние коразола на перекисное окисление липидов и активность На,К-АТФазы в нейронах и нейроглии.- Белл.эксп.биол. и медицины. -1994.-Т.177.-N2.-С.199;

12.0садчая Л.М., Толстухина Т.И.,Флеров М.А. Действие фосфо-липаз на активность уабаин-чувствительной п-НФФазы. -Тезисы докладов VI симп.по биох.липидов.С-Пб, октябрь 1994. -м.: -1995. -С.75-76.