Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности метаболизма фосфолипидов нейронов и нейроглии при различных функциональных состояний ЦНС

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности метаболизма фосфолипидов нейронов и нейроглии при различных функциональных состояний ЦНС"

Санкт-Петербургский ГосударствегшхЗ Университет

JЫ. правах рукописи

ФЛЁРОВ Михаил Александрович

ОСОШНОСга .ЖГАБОЛИША ФОС'ЮЛПЩОВ НЕЙРОНОВ И НЕЙРОГЛЩ 1РЙ РАЗЛИЧНЫХ ФШЦИОНАЛЬННЗС СОСТОЯНИЯХ щс

03.00.04 - биохимия.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

сАнкг-ггет 1992

работа выполнена в НИИ физиологии км. А .А .Ухтомского Санкт-Петербургокога Государственного Университета

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор М,Н,Меолова доктор медицинских наук Н.Г,Нику*ьчева доктор биологических наук Н.А.Емельянов

' 3 > д. у я а я. организация:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики, РАН, г Пудино .

. Защита диссертации оостоитея "'¿^У" и.('С<*$ 1992г. в /(¿> часов на заоедании специализированного Совета

Д 063.57 по защите диссертации на ооиокание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском Государственном Универоитете по адресу:199164,Санкт-Петербург, Университетская наб.,7/9. ауд.90.

С диссертацией могло ознакомиться в библиотеке иК. А.М .Горького Санкт-Петербургского Государственного Университета.

Автореферат разослгд " " . ¿''¿су^ Х992г.

Ученый секретарь специализированного Совета,доктор биологических наук

Н.д.Еденко

'_..,. : ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ,

Актуальность проблемы. Одной из мор^ологгчсскпс ocoú'íh-ностел нлрзнсй ткани яаляется крайне ьыри-гэккая гетерогвн-ность во клеточного состава. Пе>.рснн, осущйствлягхко спе-. цинические функции нервно.» ткани и. явдяациеея основной " структурнс-£уш<цнснадьно11 единице:* керзноИ систему, сос--' тавлятэт лжаь небольшую часть клеточного фонда последней. В то :ке время глиалькые клетки значительно преобладая? над нервными и запшаэт весь объем меяду сосудами я иекроаами, поэте-V изучая оиохпмка мозговых гоглогенатов, в болкзел степени ми изучаем метаболические процессы более характерные для ненроглиа, чал для sefij" нов; _> ряде исследований установлено, что нейрональные и непроглиальные'клетки отличаются друг от друга по ряду биохимических показателей, такюс как синтез 'белков и аминокислот-, транспорт ионов и медиаторов, активность ферментов /lí&gata,IS7I; tíedsthrod-áky et al.,1371; Roee',IS73; Hünberger, Henn,I973; Selltrt-, г Ha, ' imberger.1975; J" "at¿±har4, IS7S/. Одновременно с отт накоплен значительный - экспериментальный материал о существовании единой метаболической и Зг-тсцнональной. системы . не..;р :-нейроглия, идея о которой'была.выока. лна Хаденом /нудчп,1960,ÍS62,1964/. Более того предложено рассматри- -вать комплекс нейрон-нейроглтя, как систему боле- высокого порядка, чем единичный неЁрон /Анохин,IS68; Thubert,I974/.

Значительный прогресс в развитии 'функционально:!' неиро- . XI..ни был дс игнут благодр-я разработке методов препаративного получения клеточных $ракци~ головного ыозга обогащенных нейронами и неироглиеи До ее, 1965,1967;^ Ггеузз et al., 1967; Bloma^rand, Hamberger,K69; Jfortoa, Podualo,I970; Seliinger et al.,IS7I/. Однако, следует отметить, что до настоящего времени отсутствует универсальный.ыето^ препаративного выделения нейронов и нейроглил, который позволял бы проводить всесторонний биохимический анализ;в нейро-нальных и неироглиальных метках in vivo и in vibro, -

В отечественной литературе встречается еще очень мало работ, выполненных с применением метода препаративного вы-' деления нечроноз и : ^гроглии /Помазанская и др., 1965; Алек-

- _ 2 сидзо,{970; Апримя и др., 1978; Чирковская к др.,1978; йле-роЕ,19Г. 1972,ISGi> ; дкалиашвила, Кекелздзе,1973; Камышева, Г8£/

' / Особое место в исследовании химического состава и метаболизма нейронов и нейроглии занимают фос^олшшды. В.М. Крепе писал: "Без непременной участия елокных липидэз - фосйсли-пидов, протеолипидоз, стеролоЕ не осуществляется почта ни един биологический, процесс" /Крепе, 1981/. Важнейшими из пе-.речисленных лкпид' ■ являются фосоолшзды, составляйте около'''. $ есьх лепедое головного козга. 0к*1 язлязтея ке только постояктлли структурными компонентами клеточных мембран, но и приникают кеьбсредствеыюе участие в рефляции тонко сбалансированных биохимических реакций /Крепе, 1957/. Фосфо-. ж "*идаш£ бислой является той матрицей, на которой протекают веа'Лкзяко-хЮгШческие процессы, обуславливающие £ункцио- •■ надьнув активность биологических мембран. И поэтому сама.;'". . функгглоналънад активность мембран во многом зависит от состава .и к ' -аболизма отдельных фоссТолипидов, входящих в состав бислоя./'Уникальное химическое строение и поразительное разнообразие их кирноккслотного состава определяют иундамен тальное значение '(¿осфолипвдов^в структурно-функциональное организации клеточных мембран */лонев,1981; Осадчая и др., IS86/r а также es роль как эндогенных регуляторов биохимических процессов. i

Основу современных представлений о роли сосфолшхэдов в г. .упкцкокальков деятельности ЦНС залокилк исследования, ко. торне биш проведены сотрудниками лабораторий, руководимых акад. Е.Н.Крепсом, чл.корр.АН СССР Л.Д.Бергельсоном, проф. М.И.Прохоровой и про. Л.А.Четвериковым в начале 60-70-х годов.

Несмотря на обширную литературу, посвященную метаболизм; £ оос;ол1шидов з головном мозгу имеется сравнительно маю данных о фосцллипадах не/ронов и неНроглии /Preysz et al., 1967,1968; Пошзанская и др. ,IS69;.Hamberger, S-mnerholm, X97Ï; AbdeX-Latif et al.,197'; Mdrgraf et al.,1979/.

До настоящего времени неизвестно какие особенности присуши метаболизму различных частей молекулы кейрональних и

неИроглиальнкх фосфолипидов, неясно имеются дз пвтсношше сястеьы ск_нгз_зэ нейронах и неЗроглии или происходит

обмен фссфодипвдкши уолскулами меяду шсли. Практически не, исследован,вопрос о характере метаболизма отдельных представителе:! фосфолипидов в нейронах и нейроглии при различных ; Функционатаных состояниях, в том числе и в период созрег-а-ния нервной 1кани. Мезду тем исследова?гав содер;?.атП!Я и пн~.: тенспвности обмена фосфолипидов при различных воздействиях,' а таккэ в онтогенезе, позволит выяснить те биохимические особрчности клеток, которые связаны с их функциональными разлыияии, что может способствовать адекватному понимании нейрохимических механизмов, лё~"ицих основе деятельности головного мозга. Знание этих механизмов позволит выявить' '. причину патологических состояний, связанных с нарушение*.. : биохимического взаимодействия нейронов и нейроглии. - ,'*. ...

Дель и задачи исследования. - Дм конкретизации связи между особенностями распределения и метаболизма отдельных ' . . представителей фосфолг-тдов и их участием в структурно-функциональной организации системы нейрон-нейроглия целью■ 'данного Исследования явилось: . . ' . • V- ".

Г Установление особенностей состава и л- таболиэма фос-фолипвдов в нейронах и нейроглии коры головного мозга.

2. Выяснение различий обмена фосфолипидов яе,_оонов н нейроглии в процессе онтогенеза. • - , '

3, Определение участия фосфолипидов в модификации нейрона :ьных и нг" роглиальн'ых ы-'брак при различных функциональных состояниях.

В соответствии с этим .нами были поставлены следующие задачи: разработать универсальный метод препаративного выделения из коры головного мозга фракций, обогащенных нейронами и нейрогльей;' исследовать содержание и динамику метаболизма фосфолипидов нейронов и нейроглии с помощью радиоактивных предшественников синтеза ацетата-2-*4С и /метил-%/холина; исследовать содержание и мета^лизм фосфолипидов нейронов и нейроглии в различные сроки постнатального развития; изучить влияние гипоксии, аг.шзила,- 5-окситриптофана и пикротоксина на к. ,'таболизи фосфолипидов нейронов и нейро-

1 !4

глзс:. - ■ . ~

..'• иснорцне положения, виюспмче на зеститу: Проведенные нами исследования показали. что ^ундаментаяъной характеристике-. яецбрая нейронов и нейроглии головного мозга является слоянкй фссфолипидшй! состав. В этой характерной особенности обспг.: т:пгов мембран есть г/ного аналогичного и существенно различного, что обусловлено (функциональной спедиали-• задней нейроналыгах и не'йрэглиалькых м&мбран.

. Определенные особенности состава индивидуальных фосфоли-. ¡гиде" нейроноз и ьойроглии закладываются в онтогенезе по мере йор/.ирования многообразных функций ЦШ. На ранних стадиях постнатального развития различия в фосфолипидком составе не/, роков и нейроглин незначительны и возрастает у взрослых шотан. Формирование динамичных ассоциативных связей го" л. л; о го мозга почти не затрагивает содержание ^осфатидалхо-ляна и ?,ос^Атгда:этзнола-/ина - неотъемлемых -структурпых комяонентоз. наруккого к внутреннего слоя биляпвдного метрик са ¡детибрач, но сопровождается увеличением разнообразия ки-норннх йос^олилидов, которые определяют заЕершеннос"ь струк т},фио-функциональной организации нейроналъно-глиалышх. коп-тактов. - ' • ■ ■

Установлено, что ^осфоаяшир. нейронов и нейроглш являют ся лабильншв и интенсивно обменивающимися соединениями. Ик . дивздуальные фосфолшидк тлеют специфический характер обнов лепия е нейронах и ненроглии, это в полной мере кас'ается гидрофобных и гидрофильных компонентов молекулы, и свидетельствует о специальной роли каждого индивидуального фос-голотгада.

Изучение динамики пютачения. радиоактивности в фосфолипил допускает существование самостоятельных систем биосинтеза . фос£олипидннх молекул в нейронах и нелроглин и отражает различна метаболический вклад фосфолкпкдов в нейрохишгчес-кие реакции нейронов и нейроглии.

Независимо от природы радиоактивных предшественников фос фоллпиды нейронов обмениваются интенсивнее чем ^осфолстиды неПроглии, что подтверждает .«ранне высокии динамизм нейроналыгах мембран и функциональные различия нейронов и нейро-

глш.

Пластичность нейроналышх и нейрогдиальинх мембран обеспечивается ла'бильностко метаболизма сТлсГюлппвдов в оптоге-.. незе. Мороолопиеоким перестройкам, происходящим в системе, ' нейрон-неМрогдия предшествует ускорение биохимических процессов и, в частности, меняется метаболическая активность индивидуальны:: компонентов сос^олипидного матрикса. В процессе онтогенеза но мере усложнения клеточных йгнкцзй' происходит увеличение различий обмена индивидуальных г.осфолн-ш1дов. Закладаваются такие генетически детерминированные отношения медду сТосйолипидкым комплексом неЛроноз и неЛро-глии, которые обеспечивают полз'"ункц:.снальностд нейроналъ-. но-глиальной системы. ■ . '

Гипоксия снижает метаболизм ¿Ч>сфол:пгадов в нейронах и-нейроглии. Одегко клетки нейроглии более устойчивы к де$и-' циту кислорода, поэтому в нейронах процесс подавления метаболизма фосфатапвдоэ носит более выраженный характер, осо- ' бенно зто характерно длд йосфоинозитида и бюсфатюцтатанол-амина, обмен которых снижается почти на 50

Блокада М-холинорецепторов а\«г~том вызывает переорга-. низа- ~а Сюсполипкдного матрикса мембран ней- шов и неиро- . глии. Обнаруженные отличия в метаболической активности фос-фолипвдоз свидетельствует о том, что М-холинорец. ,тторы в , нейронах и нейроглии тлеют различное фосфолг-идноы окружение.

рецепция г оксзтридто£ан° при общей интенсификации процессов обмена ([ос^олинидов вызывает структурные перестройки в фосфолиплдном метрикее мембран нейроноЕ и нейроглии, которые отличаются от аналогичных перестроек, вызываемых действием ачизила. Это дает основание предполагать в М-хо-линэргических рецепторах в качестве апнулярннх липидов выступают £осаётидидкно з ит, $ос^атдцилсерлн и сфингомиелин, а в серотонинэргических - фосфатидилинозит и фосфатидная кислота.

Судорожные припадки, вызванные пикротоксином, обуславливает в мембранах крупномасштабные перестройки, следствием которых являются ;зменения ззаиморасполокенш и молеку-

■'.■■/•■■- '6 .>фкюс'вз£кл0дв1-1сгвий значительного- количества мембранных ксмаоченгоз. Сто находит свое отражение в резком повышении' мйтасечическо^ активности гидйвидуалышх фосфолипидов.

. Токам образа!, исследование метаболизма фска^мшпздов в нейронах и некрогдик при различных воздействиях указывает на го, что система не^рон-неароглдя является лабильной вц-сокоинтегрировакнон кооперативной системой, а такхе на универсальность клеточного ответа, осуществляемого ([осфолипи-. дат. .•.'•■■';■■.

Научная новизна.- Впервые проведено всестороннее. исследований содержания и метаболизма индивидуальных фоссшшпа-дов б нейронах и нейроглж коры головного мозга. .^•.Разработанная нами процедура выделения нейронов и наЛро-г.1' позволила повысить выход клеточного белка и получить ■ ¿ракции, обогащенные ни.рснами и нейроглие£ высокой степе--ни-чистота я мор^ологкческоЕ сохранности... . Б: результате, цроввдешщх исследовани'1 установлено, что -для налрок&а характерна более высокая степень обогащения такжи ¿ос&штвдаии как. ^осфатидиликозм* и лизофоо$иги-далхслпш но сравнении с неДроглнеЛ, в тс время как для келрогдии характерно более висспе содержание сфингомиели-на и босдатлдаой кислоты. .

При калении дкназ-шки включения адетата-2-^"С и /метпл-ЧГ/холзша показано, что во все исследованные сроки радиоактивной экспозиции нейрональные фосфолшидщ превосходят по уровню метаболизма неЛроглиальные' фосфолшшды. Наибольшей метаболической активностью обладают в нейронах и нелроглии оос^атлдшшнозит, фосфатидная кислота к лизофосфатидилхо-лш, Данные по диначклэ включения радиоактивных предшественников свидетельствуют о существовании различных систем биосинтеза фосфолипидов в. нейронах и неароглш.

Впервые получены данные о содержанки и метаболизме индивидуальных фосфолипидов в нейронах и некроглии в период созревания иерзно2 ткачи на различных стадиях о: 'огенеза. Установлено, что раздичт-щ, х~чактеряь;е для метаболической активности фосфолилидов нейронов и не^роглди формируются в процессе постнатального развития.

лачи впервые полнены данные по метаболизму ^осйолинидог нейронов и нейроглиа под влиянием $арлавологачесаих и экстремальных факторов. Показано, что при зсзбуздеияи Щ1С наблюдается повышение метаболизма, в то. время как при тэртоконаи происходит сшгаение обые.-. - ивдшзидуалышх £ос$олкшу;ив нейронов и нейроглин.

Теоретическое у. практическое значение. Результаты. '. представленные в диссертации, шеат научно-теоретическое. ; .значение, поскольку впервые дают целостную картину '¿унки;10--нальных взаимоотношений и роли индивидуальных фос(]шш1идов нейр^ов и кейроглии коры головного ыозга. Они расширяют представления о молекулярных ы^-ани.'. .ах ^оргл'^опания и дифференциации нейроналыпос и. нейроглиалышх мембран.

3 значительной степени необходимость развития этого направления определяемся социальными .факторами. Увеличение потока информсирга, повышение интеллектуальной нагрузки со-• 'временного человека,'и, как следствие, возрастающее число заболеваний ЦНС не только взрослых, но и детей, придает бсоб^л) актуальность исследованиям биохимических процессов, дотекающих на уровне не1:ронашаг' и нейроглиальных мембран. Поэ^ чу наши результаты, полученные при исс -едовании метаболизма в период миелинизацип, представляет больной практик чески2 интерес в плане более глубокого изучение .'тжчин неврологических заболеваний, связанных с наруи'-чием процессов ыиелинияации. Данные по влиянии 5-окситриптофана и амизила нг чета^олизн 'фосфолипидов могут служить указанием на различную чувствительность к (¿арлако. гпческиа препаратам биохимических систем, имеющих разную локализации и способствовать разработке адекватных методов дозирования последних. Результаты опытов с введением пикротоксина способствуют более глубокому пониманию участия мембранных компонентов' в.. возникновении судорокнои активности и разработке эффективных противосудоронных препаратов.

Среди разнообразных' дактороз воздействия на ЦНС особое : место занимает гипоксия. Это объясняется как высокой потребностью головного ;.:озга в кислороде, так и широко распространенными явлениям:: кислородно.! недостаточное^, вв:,{у по-

ofofiáuoro загрязнения окружающей среда. В связи с stiej . знание механизмов, огзегстронных за метаболические сдвиги /с.1; вкях гипоксии, необходимо для проведений мероприятий , способствуэдсс-нормализации биохимических процессов "ггр'а кислородном голодании.

:•/ .Разработанный дши метод препаративного выделения из ко-,ры головного ыозга, фракций обогащенных нейронами и нейро-глией, внедрен л применяется в научно-исследовательской .•работе на кафедре ¿иохимии и биофизики Днепропетровского гос^ливерситета. Экспериментальные результаты z основные выводы диссертации использованы при составлении и чтении курса "ЕеИрохклкя" для студентов .биолого-почвенного факулъ-" тета Ленинградского университета. Они включены в учебно-ые-.1 ическка пособия"Метода биохимически исследовании", IS82 г. ' ' /. .. ' . v ' . :

. Апробации работы. ■ Материалы диссертации доложены на ' соизтое конференциях по биохимии нервной системы /Тбилиси, I9G8; Лен. ..град,.1972;' Ростов-нагДону,1976; Минск, 1980; Ереван, 1983; .Горький, 19Б7/, 12 съезде Всесоюзного физиологического общества /Тбилиси,1975/, Всесоюзном симпозиуме "Структура, биосинтез и. превращения лпидов" /Ленинград,1972, 1975; Москва, IS78; Адыг-Ата, 1987/, Всесоюзном симпозиуме "Зизиапогиа и биохимия медиаторных процессов" Д!осква,197б/ Всесоюзном симпозиуме "функция не;':роглки" /Тбилиси ,-1076/; Всесоюзном сеыинаре "Вазвнтие o6i5ei¿ теории функциональных систем" Д*оскаа,1'97б/; Всесоюзном симпозиуме "Метаболизм белков ЩЮ" /Днепропетровск,1978/; Всесоюзном симпозиуме пс медицинской анзимологии /Астрахань,1979/; Всесоюзном симпозиуме "Развивающийся ..юзг" /Тбилиси,1984/; Всесошнсм совещании по эволюционной биохимии /Ленинград, 1986/; Всесоюзно! конференции 'Механизмы действия гормонов и медиаторов на эсхгекторные клетки" /Суздаль, 1989/. __

По материала« диссертации опубликована о,Г расота.

Структура к объем диссертации. Диссертация с-стоит из «ведения, обзора литературы, экспериментальной части, заточения,шведов и списка цитированной литературы.Экспериментальная часть содержит раздел истодов исследования и 4

раздела результатов. Диссертация изложена на 231 странице .. маяшсписЕого текста, содержит 66 таблиц, S6 рисунков. 3 указателе литературе приведена 431 работа, в тем числе 141 - отечественная и 290 - зарубежных. - ■

МЕТОДЫ ИСЯВДОВАШИ

Объект исследования. Опыты ставили на белых крысах.-самцах, различных возрастных групп: взрослых весом 120150 г; Ю-дневных крысах - весом 10-15 г; 20-даевкых - весом 25-30 г и 30-дневных - 40-50 г.

Юш. исследования метаболизма применяли ыетод радиоактивное индикации. В качестве радж KTitE.:orol предшественника использовали ацетат-2-*"С и /метил-%/холин. Лцетат-2-^0, вводили подкожно из расчета 30 мкКи на 100 г веса дивотно-го, меченый хо тан вводили интракраниально из расчета 5 мкКи на 100 г веса животного. Время радиоактивной экспозиции было I, 2 и 3 часа.

IV эксшэ вызывали г здением подкогно нитрита натрия в дозв 15 мг на 100 г веса животного. Инъекции нитрита натрия долали за 40 мин до декаплтации. Ейбор дозы и временных па. раме?|юв был обусловлен тем, что изучалось воздействие тя--жело-"г формы гемическоЗ гипоксии, когда содержание метгемо-глобина в крови животного достигает 65-80 % от ог :его содержания гемоглобина.

Амиз!"! вводили внутрибршинно в дозе 40 мг/кг сроком на 2 _аса.

5-окситриптофан вводили внутрибрллинно в дозе 100 мг/кг в течение 3 дней, ■

Пикротоксин вводили внутрибршинно в дозе 5 мг/кг. Действие пикротоксина проявлялось через 10-15 минут от момента введения. Крыс декапитировали в клиническую фазу действия пикротоксина, спустя £0 минут носла введения. Для исследования метаболизма при различных воздействиях в качеств ве радиоактивного предшественника использовали также аце-тат-2-^С с временем радиоактивно.! экспозиции - I час.

По прошествии времени радиоактивной экспозиции,крыс де-капитировату.,быстро лзвлекали и отмывали от крови мозг ох-

Л£ВДеШШ2 физиологически!.! раствором. Кору больших полушарий помещал. ла охлажденные стеклянные пластинки, тщательно из-ь«£льу&ли, суспендировали в растворе поливкнллпирролкдона и выделяли фракции, обогащенные нейронами и нейроглиен. • ■ Вселение обогащенных О'.ракр.ий нейронов и нейроглии пз коры голе лого мозга. В основу выделения обогащенных фракций , нейронов и нейроглиа нами бил полокек метод предложенный Селдпндяером и др./1973/. Этот метод был подвергнут значи-' ■тельной 1.1 одяфмнац. ^ основное направление которой сводилось к повышенна выхода 1иеточного материала, которого било бы ' достаточно для исследования содержания к метаболизма всех классов лшгадов современными биохимическими методами. ;'. Дня оценки степени чистоты и морфологической сохранности : ученные фракции нейронов и нейроглли подвергали микроско отческому контроля с помощьл г^илшзненной фаз ово-контрас т-ной микроскопии, световой микроскопии и электронной микроскопии; Проведенный микроскопический акализ показал удов-летворЕте.^ную степень сохранности полученных нами пейро-налыюй К' нейроглиальиой фракций. Степень чистсты ьейро-пальнок фракции была в среднем 90 %, незначительные прикесв шигачалн в себя глиальнне и эн' 'телиалькке клетки, капилля-' ры. Чистота ваделенкой нами нейроглиальной фракция .колеблется в пределах 80 Проведенный электрономжроскопиче-егш анализ показал, "что подз'чекние клеточные препараты ;ыедг хорошо сохранившиеся клеточные мембраны, а биохимически"! анализ активности ца.К-АТФазк /Кры-тановский и др. ,197< подтвердил это. Показателем выхода клеток служило количество белка в обогащенных маточных фракциях, которое определяли методом Лоури /^«гу ег с!., 1951/.

Методы исследования АоссТолипидоэ нейронов и нейроглпи. Индивкдуалыше фосфолипидн, выделенные из нейронов и нейро глии, полученные методом Фолча /РоХсЬ ег а1.11957/ из зкет ракта обцих липидов с помосью двумерной хроматографии в тонком слое силикагеля в системе растворителей .лороформ : метанол : 7 II аммиак /120:7' 10/ и хлорофор.: : метанол : уксусная кислота : вода /80:40:7,4:1,2/ /ршпрЬгву, 1969/.

При изучении метаболической активности тдавлдуаг-ьных

фосфолшшов использовали метод радиоактивной индикации. Радиоактивность фосфолнпидов подсчтгпзалк в тодуольпом сдгн-. тилляторэ, содержащем 4 г 2,б-ДЕфешиоксэ зола /РРО/ и 300 мг 1,4-ди/5-ф«нил-2-оксозолидбензолг/ в I л толурда.

Во всех сериях опытов результаты обработаны статистически /Лшмарин, Воробьева,1262/.

результаты исследований '■'.'.'

Содержание и метаболизм с^осгТолиписов нейронов и нойроглии. в таг" .1 представлены данные по содержания тадгаидуаяънкх фосфолипидов в нейронах и нейроглиз. Результаты выраленц в мкг фосфолипида в расчете на I ..»г клеточного белка.

Таблица I, ■

Содернанг^ фосфолипидов в нейронах и нейроглш коры ■ головного мозга крыс /ыкг ФД/мг белка/

Фосфолипвды Нейрон Нейроглия НГ/П ^

Л® 4,2 + 0,5 ' 4,1 ± 0,3 1,0 ■

с т ' 10,4 + 1,5 7Г 0 + 4,1 2,8

16,4 ± 2,6 24,9 + 2,1 1,5

И 75,4 + 6,0 150,4 ± 19,5 > 2,0

Ф'Л 14,6 £ 1.6 21,8 £ 2,3 1,5

ФЭ 41,9 £ 6,3 81,£ + 4,9 1,9 (

ФК 2,7 £ 0,3 11,0 £ 0,7 4,0

я/ НГ/Н _ содетаяние Ф.Т" в нейртлии ' ' содержание ФЛ в нейринах

IШ - лизофосфатидилхоляны; СШ - сфингомяелины; ЗС - фосфа-

твдилсерины; ФХ - фосфатидилхолины; Ж - фосфатидилинозпты;

ФЭ - фосфатидилэтаноламияы; ФХ - фосфатпдные кислоты.

Как видно из представленных данных, в нейронах преобладающими являются фосфатидилхолины и фосфатидилэтаноламотга, и их содержание составляет 75,4+6,0 и 41,„¿6,3 мкг на I мг нейроналъного белка. На доля фосфаткдилсеринов приходится 16,4+2,6 мкг/1 глг белка, а уровень фосфатидных киолот не превышает 3 мкг. Кл. гки нейроглии характеризуются более вн-

оокпи содержанием практически всех индивидуальных фосфоли-щ5дое,'.5 ключенке составляют лишь дазофосфатвдилхолшщ.со-

. которых одинаково .в неЗронах к нейрогдии. йжне как,и. в,нейронах, в-глии высоко "содержание фос^атидалхоли-еое;н'£ос£атедилэтанолшЕНов. Следует отметить, что содержание с^ннгшиелинов почти в 3, а (хопфатидноп кислоты в 4 раза выше в нейроглии по сравнении с нейронами. Расчет , процентного соотношения индивидуальных фосфолипндов свзде-; тельстзуст о спец! ических отличиях нейронов и не^роглил по ьтял показателям. Основные отличия осечены для минорных (гос{-о;штщоз. Наибольшие различи наблюдаются для лнзо-^сфатидаглхсипшов.'с^шшлиелинов, г;ос£атидилшозитоз и ^с£атидннх кислот. .

В одной нз серий .онитов мы исследовати интенсивность • обмена в различные про1..ейутки падиоактпвноа экспозиции при введении ецетатс.-2- С/.так как стремились проследить дина циву някояления радиоактивного углерода в нейронах и не&рО' г.таа. Вкл .ение ацетата-2-^C в кндавцяуальные фос^олипида HaiipoHOE и нейроглки изучали через 60, 120 и 180 м..аут после. вводения последнего. Исследование динамики включения радиоактивного углерода позволг_о установить характерные . особенности ¿летаболизма этих' липидов. в табл.2 приведены данные по включению радиоактивного углерода ^С в индивидуальные фосфоззанш нейронов.

Из представленных данных видно, что через 60 мин после введения ацетата-2-~% наибольшей, радиоактивностью обладают Носфаткдные кислоты /2313+722 ими/мин.мг "С"/, а наименьше.! - сфшгомиелины /613+34 имп/мш.иг "С/. Довольно высок;м уровнем {лета; ;.лизма характеризуются лило^осфатидаи холины и фосфатадилинозиты.Через 120 мин после введения ацетата-2-^C происходит увеличение удельной радиоактивности фэефолипидов.Б этот период резко возрастает удельная радиоактивность ¿осфатидилкнозитов и достигает 6230+III5 шп/шт.мг "С",то есть увеличивается по сразкег. з с уделЬ' no'-i радиоактивностью через с/ мин после введения ацетата-в среднем в 7 раз.Удельная радиоактивность ¿осс.ати-дилсеринов и сйингомиелинов увеличивается в среднем в 4

TÍ* tí липа 2.

Удельная радиоактивность £ос£ол11падой нейронов в различные сроки после введения ап.етата-2-х,:'С /имп/мин.мг 'С/

ФоссТ.олипида 60 120 • 180

1060 + 221 3560 + 1205 9I3S + 23G7 ,

С5Л 643 + 34 • 2308 + 611 277с 573

со 719 + 274 3034 ± 348 74С2 + 877

747 + ICS 1784 + 279 4020 + 779

чМ . S02 + 69 6230 + 1115 IC3I8 + 1318

ФЭ 682 + 69 * '13 ¿ 301 2685 + 391

ФК 2313 + 722 .4291 + 1051 10235 + 1952

раза. Удельна;, радиоактивность остальных £осфолипидов такхе •увеличивается, но не столь значительно. Через IG0 мш после зведения ацетата-2-^С хоть и происходит увеличение удельной р.диоактивности, ь^ по срачнзнию с 2-х часовой радиоа1, г""зной экспозицией оно не носит столь резкий характер как переход от 60 мин до 120 глин. Наи^льшей удельной радиоактивностью такые как и через 120 мин обладай* аосфатидилино-зиты и сос^атидныа кислоты, достигая I038I+I318 'т 10235+IS52 имп/ыин.мг "С", соответственно.Наименьшей удельн . радиоактивностью обладают сфингомиелины и кос^атид^ютанолаишш, Лредст2_ .¿енные данные по удельной радиоактивности фосфоли- . пндов свидет':.1ьствупт об к. высоко'' метаболической активности в нейронах.

Однако совериенно очевидно, что в otíinya метаболическую активность фосфоляпидов голозного мозга шосят вклад и фос-солипнды, принадлежащие нейроглиальным клеткам. Поэтому нами была исследована динамика включения- радиоактивного углерода в ^ос^оллпиды нейроглии.

В нейроглии через 60 мин после введет- ацетата-2-^С наибольшей удельной радиоактивностью обладают фосфатидные кислоты - 1208+96, а наименьшей - фосдатидилэтаноламины -157+25 иг/п/мин.мг "С".В следующие 60 мин происходит тгпели-

Таблица 4.

1 . лЖэльная радиоактивность фосфолигшдов нейроглии в различные сроки псола введения ацетата-2-^С ■; , /г.:п/м;ш.мг"Сп/ '

.Фосфрлшщды'

Время-радиоактивной экспозиции

■ 60

120

180

.ЛЕС.

■сем, .«с

СЕ

. ФЗ ФК

. 492 ± 1Г?

о?2 + 120.

. 326 + 23 640 + 153 4Г4 ±'.-98 127 ± 25 1208 -• 96

1443 ± 136 698 ± 77 1С40 + 864 + 2317 + 326 ± 1591 £

256 ■ 89 310 30 118 '

2185 743 1945 .995 2782 481 2504

+ 322 + 121 511. 130 626 99 498

чекле уровня-удельной радиоактивности всех нейроглдальных " фосдо.тгищгов. Особенно резкий подъем удельной радиоактивности наблюдается в ".¡|ос<|швдшпшозитах, фосфатидилсвггнах и лизофосфатЕдалхолинахУдельная 'радиоактивность йосйатндил-инозитов;е этот период равна 2317+360 имп/мин.ыг"С" и возрастает по сравнения 'с уделънбц радиоактивностью при часовой радиоактивной экспозиции в'4 раза. Через 180 мин после ■введения, ацэгата-2-^С удельная радиоактивность возрастает только.для фосфатвдных кислот и фосфатидидэтаноламинов, и ] среднем в 1,5 раза. ; -

Наибольшей удельной радиоактивностью такте как и при 121 мин гг-сдоэицин обладает фракция фоссгатздилинозитов - 2782+ +626, а надаеньшей фосгЕатидилэтаноламины - 481+29 имп/мин.

Полученные данпые по динамике включения радиоактивного углерода свидетельствуют о том, что во все исследованные сроки радиоактивной экспозиции н'ейрокалыше госсолкпэдк им от более высокий метаболический статус по сравнения с нейр глиальными. Как.известно, с помощью адетата-2-^С удается проследить метаболическую активность годрофобннх компонентов молекулы фосфолипадов. Наряду с этим, несомненны:! инте

рес,представляют обменные" реакции азотистых оснований. На основании данных по изучению включения печенье азотистых оснований 'логшо сделать заключение относительно активности ферментативных систем биосинтзза отдельных представителей фосфолипидов в различных неточных популяциях ЦНС. Одним яз важнейших азотистых основан иг?, входящих в состав наиболее'.-представительной группы фосфолипидов, а именно лизофссфати-далхолинов, фосфатпдилхолинов и сфингомнелинов, является холзн. В табл. 4,представлены' результаты по.включению /ме-тил-®Н/холина во фракции фосфолипидов нейронов и'нейрогдии в различные сроки .радиоактивной экспозиции. ; • ■„...':

•'■'..•.'•. • ■ • ''•: Таблица1 ' ; Удельная радиоактивность отдельных фосфолшидов нейронор и'нейроглш в разные сроки введения

. /метил-%/холина/шлп/мин.мг ФД/'■ . '

'Фосфолипиды

Вт"4«! радиоактивной з

ксЬозиции, МЕН

60 120

180

НЕЙРОНЫ/, •

•'" ш .10121 + 1240 II362 '+ IS36 757^ + 1016

cm ■ 1477 + 211 . 1669 + 291 407' + 175 .

,5556+1039 12837 + 2011 12037 + 1039

НЕЙ13 0 Г Л И Я

MX 4689 + ,944 7416 + 1090 4286 + 502

ода 405 + 112 585 ± 158 . 2710 + 550

<к 2052 + 209 4781 + 745 7859 + 780

В нейронах через 60 мин после введения /метил-%/холина наибольшей удельной радиоактивностью обладают лизофосфати-дилхоллны - 10121+1240; а наименьшей - сг ггомиелины -1477+211, фосфатидилхолины по уровню метаболизма в этот период занимают промежуточное положение. Через 120 мин наблюдается значительное Обличение удельной радло£._:тивно зти •

фосфатддилхолшов болеэ чем в 2 раза и достигает I2837+20II ег.ш/иип*. На этом фоне практически нэ изменяется удельная радиоактивность лизоассфать ,илхолинов и сфингомиелинов. В 'дальнейшей происходит снижение уровня радиоактивности лизо-фосфатидияхолинов в среднем в 1,5 раза и повышение удельной радиоактивности сфингомиелинов в 2,4 раза. ■ • В нейроглки через 60, 120 мин после введения /метил-^й/-" хо.тана наибольшей удельной радиоактивностью обладают лизофо-сфаткдилхолины, а аимекыпой - сфингомиелипы. Следует от:ле-' ткть что в период меаду 6U и 120 Mini наблюдается увеличена« .удельной радиоактивности лазофосфатидалхолкнов более чем в 1,5 раза, а через 180 ыия она достигает такого se уровня как и через 60 ыин после введения /метил-^Н/холша. Для ciWrcr.'.aexiHOB характерен относительно постоянный уровень • удельной радиоактивное.^.., в течение 2-Х часов радиоактивной экспозиции с псследуздим резки?.», в'среднем в 5 раз, возрастанием ее !з период мекду 120 и 180 мин-. Удельная радиоак- . тявноеть ф"^фатидилхолинов е первые 2 часа inize удельной радиоактивности лнз офос фатидалхолкпсв в'среднем б'2 р ja, однако через 180 мин после введения /метил-%/ходина ее уровень в среднем в 1,7 раза выше, чем уровень радиоактивности лгзофосфатвдилхолшов. ■

Такгл образом, при исследовании метаболизма отдельных фракций о применением ,8цетата-2-^,С и /метил-®Н/холина пока зано, что независимо от используемого радиоактивного пред-пествекника в нейронах фосфолипидные фракции обладают более высокой скоростьо обмена,- чем фосфолшиды нейроглни. Это положение справедливо не только для предшественников, меченых 14С и но такт и для ^Р /Freyaz et al., 1967/. Следовательно, ьсе компоненты молекулы фосфолипидов, как гидрофобные, гаде и гидрофильные, различаются в нейронах и ней-роглии по уровню своего метаболизма. Более высокий уровень метаболической активности нейрональных фос^олшидов по сравнения с лейроглпалькши подтверждает важную ~оль фосфо-ллпидов в процессах^ связаны'-'"', с транспортом конов, секрецией медиаторов, действием гормонов и а других процессах, протекаодих на клеточных мембранах.

Содержание я метаболизм (Тосаолипкдоз в нейронах и нейро-глии яри мкелинЕзации. В табл.5 приведены результаты по определению содержания индивидуальных фосфолшщдов в нейронах и кейроглии коры головного мозга животных различного возраста. 3 период созревания головного мозга процесс накопления индивидуальных фосфолипидов з нейронах и нейроглии имеет определенные специфические особенности. Как в нейронах, так и в нейроглии основную массу фосфолипкдов составляют фосфатидилхолин и фсс£атвдилэтаноламин. Однако, если содержание фосфатидилхоликов с возрастал снижается в обоих клеточных популяциях, то для фхюфатпдилэтаноламяна присущ различный характер изменения их-количественного содержания. Если в нейронах практически не наблюдается изменений содер-нания фосфатидилэтаноламина с возрастом, то в нейроглии происходит резкое увеличение этого фосфолштда к 20-му дню, оставаясь на этом уровне к, 30-му дню. Это, по-видимому, связано с тем, что в составе нейроглиальных фосфатидилэта-ноламинов присутствует большое количество"плазмалогенных форм, которые непосредственно участвуют в формировании мие-линовых оболочек. Кроме того в нейронах в этот период не ' отмечено увеличения в содержании фосфатздшх кислот. К 20-му дню в нейронах повышается содержание.лизофосфатидилхолик ков, сфкнго-иелинов, фосфатидилсеринов и фосфатидилинозптоз в.среднем в 1,5 раза. Яа этом фоне наблюдается более резкий подъем содержания'сшингомиеллнов в нейроглии. Различие в характере накопления фосфолжщдов ведет к изменению их соотнесения в нейронах и.нейроглии. Одной из особенностей, . обнаруженных нами, является установление более отчетливых различий медцу нейронами и нейроглией по мере созревания нервной ткани, которбе свидетельствует о специализации мембран двух типов клеток нервной ткани по' мере их дифференциации. В период интенсивной миелинязации резко увеличивается содержание минорных фракций фосфолипидов в неМро-глии. В этот период наиболее отчетливое увеличение в среднем в 2 раза по сравнению'с 10-дневными крысами наблюдается для таких фосфолипидов как лизофос^атпдалхолины,

. Табло...а-51'•.:"'. : Содержание фосфолшпидов в нейронах и нейроглши корн головного мозга крыс различного возраста /к. - ФД/мг -

. -; _ *■ , белка/ \ ••

' • • •

Фосфолзпщды : ■ Ю-диевные ,. 20-дневные ЗО-дпевдае

Ней р о н ы

Л® • 5,4 ± 0,2 .' 6,9+-0,4 6,1 ± 0,2

С2Л ; 10,0 ± 0,9 13,3 ± 1,4 . 13,Д ± 0,4

ас ; ■ л " ' 8,0 ± 1,1 11,6 ± 0,3 18,2 ± 2,4

99,3 ± 4,3 .101,4 ±6,1 ' 96,3 ± 3,1

щ 9,4 ± 1,0 '• 14,2 ± 0,° 17,1 ± 1,8

: ФЭ. 44,7 ± 2,4 43,2 ± 2,4 -45,4 ± 2,9

ФК 4,1 + 0,2 • 3,8 ±0,1 /3,6 ± 0,2

"" Н е.й р. о г л и я .

ЛФХ ■ . ' 4,9 + 0,9 8,2 + 0,7 . 10,9 ± 0,9

сам / . 12,4 ±1,0 • 24,1 + 1,1. 28,8 + 0,7

.. ю ' 12,7 ± 23,0 ± 0,ЕГ 25,0 + 0,8

ш .' 141, Г '±5.4- 192,4 ± 6,2 192,4 ± 6,4

.'Л / . 11,5 ±0,2 20,2 + 1,3* . 21.1 ± 2,2

.. ФЭ 84,4 ± 7,2 133,7 ± 4,9. 131,7 + 9,7

ФК 4,6 ± 1,0 8,8 ± 0,8 7,4 + 1,5

сфингомиелины,- фосфатидилс£рины, фосфатддные кислоты и Хосфатидилинозиты. В табл.6 представлены результаты ощзе-делс ния удельной радиоактивности индивидуальных фосфолжга-дов в-нейронах и нейроглши при миелшнизают. .

Ьз результатов, представленных в табл.'б ввдно, что в нейронах к 20-му дню постнатального развития по сравнению о 10-м днем в среднем,в л раза увеличивается удельная радиоактивность лизофосфатвдилхолинов, фосфатвдилсеринов, фосфа-твдилинозитов и фосфатидилэтаноламннов. Удельная радиоак- ' тивность фосфатидилхолшнов практически не меняется с возрастом, а в случае фосфатидннх кислот даке уменьшается к 30 дня постнатального развития. У 30-дневннх животных в

''К- ......

' Таблица

.Удельная радиоактквность фосфоллпидов нейронов я нейроглия при миелшнзации /шлп/иин.мг',С"/

--—(-;--:-!-*-

Фосфолипиды ■ ." ' Ю-дневкые.; 20-дневные . 30-дневные

Help о н ы

£249+727 5530+973 . 6851±1034

c&i •.•'"-"•: . 2093+388 1758+319 3804+1123

фс . \ 1678^186 ; 3600+444 ' 4057+ 811

ЕС .'-.'• 4308+235'- 4892+639 4378+ 790

фи 3366+503 ". 5897+608 ' 5302+ 784

' фэ . 1556+408 '3674+745 2312+ 597

фк ; 7685±529 ' 6322+989 5437±1360

.» Н е 3 р о г л и я .

ли 1265+168 ■' I8II+463 • 1355+351

сад ■ 1336+368 2666+633 460+ 54

фс ' - 1850+446 . . 1542+418' 2131+440.

йх 2658±209 , 2382+297 • 927±161 .

фи ■ 3825+843 . '. 3844+625'' 4530±1280

фэ 778+12! ' 1089+625. 461+133

. фк ■ 2884+662 ' 3344+1391'. .:4454+958

нейронах удельная радиоактивность лизофосфатидалхолилов- и особенно сфяягомиелинов увеличивается по сравнению с 20-. дневными крысятами, тогда как удельная радиоактивность фосфатидилсеринов и фосфатлдялзнозитов остается на том же , уровне. Следозательно.сть,- интенсивность обмена нейрональннх фосфолнпэдов в мозгу 30-даевнкх яизоуных сохраняется на еы-соком уровне, что говорит о значительной функциональной нагрузке на мембраны нервзшх клеток, что влечет за собой и • • быстрое.обновление' входящих в мембраны фосфолипидных компонентов.

В нелроглпи в период интенсивной мкеликизациз /20 дней/ увеличивается только метаболическая активность сфингомиелн-нов, причем в этом возрасте она превышает активность сфин-гомлаляноа нейронов в 2 раза.' Это молсет служить доказатель-

ством особой роли сфингомкелинов в оо^азовании мембр^. мие-' линозых оболочек. То, что обнаруженные изменения связаны с миелином, подтверждается тем фактом, что в кейро..~з: в этот период нет таких изменений, а такзе тем, что к 30-даевнсму '• возрасту, когда процесс миелинизации ослабевает, и завериа-ется, в нейроглия значительно снижается /в среднем в б раз/ интенсивность обмена сфингомкелхшов, да и накопление осталь- ' них фосфолипидов. Так, в нейроглии ЗО-дневных крыс снижается удельная радиоактивность фосфаткдилхоликсв и фюсфатпдилт . этаколаминоз, фосфолипидов, являющихся основными структур™-ми компонентами мембран. Такие различия метаболизма фюсфо-липидов в даух клеточных популяциях головного мозга нераз-• рывно связана с особенностями формирован! и созревания . нейронов и нейроглии в процессе онтогенеза. К началу рассматриваемого нами периода нейрональные клетки уке в основном сформированы /Дмитриева, 1969,1981/. Основная фунщия нейроглии в период миелинизации - формирование ииелиновых ' оболочек аксона, которое образуются из плазматических мембран, и э.тот процесс связан с теилением метаболизма фосфоли-' пидов. Поэтому ,при интенсивной ыиелиннзации нейроглпальные ■ ' фосфолипиды но удельной радиоактивности приближается, а в случае сфингомиелийов даке превосходят фосфолипиды нейронов. К 30-дна постнатального развития темпы миелинизации' , , замедляются и соответственно снижается метаболизм индивидуальных фосфолипидов'нейроглии. •

Такил образом, обнаруженные Нами отличия в содержании и метаболизме фосф-одипидов нейронов и нейроглии при миелинизации неразрывно связаны с 'функциональными особенностями этих двух типов клеток нервной ткани.

Метаболизм цдсцолтгадов нейронов и нейроглии поп гг эк-сии. Гипоксия относится к числу наиболее часто применяемых эксиершентальных воздействий для изучения нейрохимических закономерностей функциональное деятельности Щ1С. Это связано с тем, что головной, мозг характеризуется особой чувстви-, телъность» к кислородной недостаточности по сравнению с другими органами.

Несмотря на обшярнуп литературу, посвя^еннуя исследова-

• 2Г

нлп различных аспектов метаболизма при гипоксии /Четвериков, ISG6; Хватова.1977; Замуруев,1985; Slesja et el.,1275; Gibson at аХ.Д978; Bless, Gibson, 1979/ до настоящего времени данные, посвященные действию гипоксии на обмен фосфю-липидов в нейронах и нейроглии отсутствуют.

Изучение влияния гипоксии выявило различное участие фосфолипвдов в поддержании функциональной активности мембран нейронов и вейроглии. И не^рональных мембранах обмен фосфолипндов наружного монослоя /УЖ, ШХ и СОЛ/ менее подвержен влияния гипоксии, чем обмен фосфолшпгдов внутрентге-го монослоя /ФИ, £С и ФЭ/, в котором обнозленпость Ш и ФЭ снижается на 50 и 70 соответственно. '' икгосение метаболической яктязности нейроглии при гипок-сгг ••енее выражено, чем в нейронах, хотя и в этом случае привлекает внимание изменение обмена ©1 и ФЭ. Гипоксия не . вызвала существенного нарушения метаболизма фосфолшидов в обоих типах мембран, что позволяет предположить наличие механизмов, осуществляющих контроль за скоростью движения фосфолшщдных молекул в лигшдеом бислое. Благодаря этому поддерживается определенное ;адкокрясталлическое состоя- ,. ние фосфолипидяого матрякса мембраны,- которое позволяет ей сохранять необходимую функциональную активность, определя-исдул одно наиболее характерных и удивительных свойств яивых организмов - способность приспосабливаться к самым разнообразным, включая и экстремальные, условиям жизни.

Влияние амизила на метаболизм йсс^одшилов нейронов и нейроглии. ,Амизил относится к,группе центральных холико-литиков о сильно выра^еншгли М-холинолитичёскими свойствами. В литературе клеится единичные работы по влияния ами-зпла на метаболизм фосфолиплдов /Прохорова, Флёров,1975; Герасимова, Флёров,1975; Крылов и др.,1987/. Под влиянием блокада М-холинорецепторов наблюдается активация включения ■^С в фосфолштады. Наибольшее увеличение УР при введении амизила отмечено для ФИ и ФС,.в среднем в 4-5 раз. В остальных фракциях фос?олипидоз УР возрастает в среднем в 2 раза. Интересен факт обнаружения активации включения радио-акт:гь\чого углерода в нейрональнне США в 3 раза по сравнении

щ

с нормой, в то время как в нейроглна; из: СШ такой гктпва-цил не обнаружено.

Следовательно, блокада м-хслинорецепторов рез^а изменяет обмен фосаолкпидов некрональннх мембран, что полет свидетельствовать о переорганизации аосфолкгаздного матрикса в процессе рецепции. В ходе такой лереорганкзадии многократно увеличивается скорость оборота ФИ, Ш л.СЕ!. Интенсивное обновление углеродного скелета этих молекул позволяет рассматривать их как активных частников процесса взаимодействия лкганда с рецепторами. В нейроглии наблюдается отчетливое з'эе.ткченпе УР для ФИ и ЗС, в 3 и 4 раза, соответственно, а тате для и ФЭ в 2 раза по сравнению с ноткой. Не обнаружено достоверных отличий в ЛФХ, СШ и ФК. Таким образе-, иной характер изменения интенсивности об,мена тех юв фосс?одиппдов в глиаль-ных мембранах отракает, с одной стороны, анапогичное участие ФИ и ФС в осуществлении перегруппировки рецепторов, а с другой - вовлеченность б этот процесс ФХ и ФЗ, а не С <3,1, как отмечалось в нейронах. Обнаруженные различия в обновляеыости " ■фосфолипцдов в нейронах и нейроглии свидетельствуют о фоейо-липидной' гетерогенности этих, иембран, скорее всего ;л-холино- . рецепторы в нейронах и глеи имеют различное фосфолипидное окружение. ' ■

Влияние 5-окситриптос"ана на метаболизм кос^'олипидов нейронов и нейроглии.. В настоящее время усилиями фармакологов, физиологов и биохимиков накоплен значительный экспершен- . тальный материал о роли серотонща в процессах регуляции физиологических функций. В-то же время исследование влияния серетонина на метаболизм головного мозга проводить довольно затруднительно, в связи с тем, что он чрезвычайно слабо проникает через гематоэнцефалический барьер /Курский,1974/. В отличие от серотонина 5-окситриптофан достаточно хорос,. проникает в головной мозг и захватывается серотонинэргическими нейрона,!и. Введение 5-окситрпптофана в дозе 100 ыг/кг в течение трех дней вызывает двукратное увеличение серотонина внутри нейронов. /Жариков,1977/. При введении 5-окситрипто?ана наблюдается активация включения меченого ацетата в неЛрональ-Ные 1{осфолипнды в среднем в 2 раза по сравнению с кориой.исключение составляют ФИ и ФК, для которнх отмечено повыяекне

• 23f

уровня метаболизма в 8 и 6 раз, соответственно.

В нейроглии при введении 5-окситриптофана имеются отличия в метаболической активности £осфолиппдов по сравнении с нейронами. Так не обнаружено достоверных отличий в обмене нейроглиальных СФ.1 и SX по сравнению с нормой. Кроме того, уровень активации включения радиоактивного углерода

в фосфатиднне кислоты значительно ниже, чем в нейронах. Следует отметить значительное повышение метаболической активности Ш в нейроглии при введения 5-окситриптофана в среднем в 8 раз по сравнению с нормой. Подъем удельной ра-дисактиБностп Л©' и ФЭ такой .vie как и в нейронах и составляет в среднем 2 раза. • итак, рецепция амизила и 5-окситрштосана вызывает различные структурные перестройки в фосёолишщном цатриксе npi- общей-интенсификации процессов обмена фосфолшпщоз, 5-окситриптофана особенно стимулирует включение радиоактивного углерода в ® и ФК, оставляя обмениваемость остальных индивидуальных йосфоллпидов на более низком уровне по сравнению с амнзилом. Это необычайно интересные факты, которые позволяют предположить, что в м-холпнэргических рецепторах Фи е $С, ив какой-то мере иЗМумогут выступать в. качестве аЕнуляркых липидов, а в серотс^инэргических рецепторах - Ш и ФК. Скорее всего ФИ'- необходимые эффекторы обоих рецепторных комплексов, тем более что высокая обмениваемость углеродного скелета ® сочетается с интенсивным обменом их фосфатных группировок /Ananth et al.,1987/.

Метаболизм гоесфолипидов нейронов и нейроглии пои судорогах. Проблема- изучения биохимических процессов при судорогах является актуальной как в теоретическом, так и.в практическом плане, так как направлена на исследование одного из тяжелых и загадочных заболеваний - эпилепсии. Ограниченность большинства биохимических исследований эпилепсии заключается главным образом в том. что изучение этого феномена проводится е основном на ткани головного мозга в целом без учета своеобразия структуры и функций, входящих в ее состав клеточных популяций. Однако в ряде работ обосновывается гипотеза, по которой в эпилептогенезе метаболически

'принимают участие не отдельные сообщества нейронов, . комплекс кейрон-нейроглия /Погодаев, 1930,1285/. В качестве судорожного агента мы применили нзкротоксин, которой блокирует ГАМК-рецепторы ■ и вызывает резкое повышение моторной активности и судороги у аивотных. Судорашне припадки усиливают метаболическую активность всех исследованных нейро-нальных фосфолипидов. Скорость обмена Ш, ФЗ и С®, соотношение которых в мембране определяет ее стабильность с одной стороны и способность к изгибам - с другой, увеличивается в 2-2,5 раза.

Наиболее значительные изменения метаболизма отмечены для фосфатцдиликозитолов, у которых уровень удельной радиоак- . тизности при судорогах возрастает в нейрг ах по сравнения ■ с нормой более чем в 16 раз. Активация метаболизма ФИ приводит к образованию в плазматической мембране двух дополнительных вторичных мессеняеров: инозит 1,4,5-трифосгата и диацилглицерша. Первый увеличивает концентрацию внутриклеточного Са^+, а второй является доминирующим фактора! в активировании лрот.еинкиназы я /Долго-Сабуров,1986; Северин, Швец, 1987; Неутапв вt в1.Д9о7/. Одновременно с этим увеличивается интенсивность обновления ЗС, метаболизм которых ~ также тесно связан с активностью протеинкиназы С /воН -11уоип,1Э86; *о1Г оЬ 41., 1987/.

В клетках нейроглии, также как и в нейронах наибольшее влияние, судороги оказывают на ФИ и К, уровень метаболизма которых по сравнению с норкой ууеличивается в 10 раз. Сле-л/ет отметить, что если в нейронах все фосфолипиды достоверно повыаали своя метаболическую активность при судорогах, то в нейроглии не удалось установить достоверных отлитий для СШ и ФХ. .

■ Имеющиеся общие черты в обмене фюсаолипвдов в нейронах и нейроглии свидетельствует, по-видимому, с одной стороны, о единстве метаболической системы нейрон-нейроглия, а с другой, об универсальности клеточного ответа, осуществля- ' емого фосс[о.таго1да1.!и.

. заключение

Диссертационная работа'представляет собой исследование, посвященное участию фосфолигощов в структурно-функциональной организации системы нейрон-нейроглия. Самостоятельным , разделом работы явилась разработка метода препаративного ■ выделения фракций, обогащенных, нейронами и нейроглией. Разработанный' нами метод отличается хорошей воспроизводимостью,' достаточно высокой чистотой полученных клеточных фракций и монет быть использован в незначительных модификациях для выделение нейронов и нейрогляи из головного мозга различных видов лабораторных животных.

■ В полученных нами клеточных фракциях проведен анализ, как количественных, так и качественных, отличий фосфолипидоз не:" опальных и нейроглиальных мембран, установлены закономерности формирования мембранных комплексов нейронов и ней-роглии в период постпатальнсго развития дивоткого. Изучено,, влияние неспецифлческих и специфических факторов, резко вз-мешпацю: функциональный статус клеточных мембран и метаболизм индивицтальных компонентов.фосфоллпидного матрикса..

Лрздстазленные нами данные по содержанию индивидуальных фосфолипидов нейронов и нейроглш свидетельствует о том,что с одной стороны, для нейронатьнкх и глиаяьных мембран характерен одинь~;овн8 набор фосфолийидов, а с другой значительные различия в го:.количественном содержании. Нейроглиальные метки характеризуются более высоким содержанием фосфолипи-доз, за исключением лизофюсфатвдилхолипа,■количество которого практически не различается в этих клеточных популяциях, наиболее значительные различия наблюдаются для сфингоыиели-на и фосфатвдной кислоты. .

При исследовании метаболической активности фосфолипидоз установлено, что независимо от радиоактивного предаествея-ника, их обмен з нейронах значительно превышает таковой в . нейроглии. Высокий урозень метаболической активности индивидуальных фосфоллпццов обусловливает крайне вксокпй динамизм нейрональпой мембраны, что свидетельствует об основной роли £осфолипддного' матрикса в осуществлении физико-хяияч&-ских пр:цессов, происходящее на мембране. Уровень обмена

индивидуальных фосфолюшдов может яв. л>ся мерой фуги калькой активности мембраны, критерием, определяодим сте- "" пет динамизма последней.

С.труктурно-функциокальнне отличия нейрональных мембран от мембран нейроглиалькых закладывается в онтогенезе. Ка ранних стадиях постнатального онтогенеза эти отличия менее значительны. По мере увеличения функционального динамизма нейрональных мембран' происходит перераспределзкие их фосфо-липвдных компонентов. Содержание фосфолимдоЕ, имеэдкх пря- . мое отношение к структурной организации мембран в процесса . постнатального онтогенеза, снижается или остается без изменений. Это видно на примере фосфатлдилхолина и фосфатид&л-этаноламша. Одновременно с этим происходит значительное увеличение содергания фосфатидиликозита, что свидетельствует об усложнении процессов внутри- и межклеточной коммуникации. Наряду с этил наблюдается различия в характере накопления фосфолипидов, что ведет к изменения их соотношения мезду нейронами и нейроглией. Следовательно, одной из характерных особенностей, обнаруженных нами,_ является отчетливое ра'зличиа ыевду нейрона.я и нейроглией в процессе созревания нервной системы. В то же время сходство в "процент- • ном содержании фосфолипидов и характере его изменения в нейронах и нейроглии отракает универсальность строения и., дифференциации клеточных мембран в ЦНС.

Наиболее отчетливо процессы усложнения мембранной орга- . низании нейронов и нейроглии проявляются в метаболических особенностях индивидуальных фосфолипидов. Нами впервые по-~/чены экспериментальные данное о метаболической активности фосфолипидов нейронов и нейроглии на различшрс стадиях постнатального'развития. Эти данные свидетельствуют, что структурным перестройкам, происходящим в системе нейрс..-не^роглия, предпестаует ускорение биохимических процессов, отражением которых является изменение метаболической активности индивидуальных компонентов фосфолипйдкого матрикса.В постнатальном онтогенезе закладываются такие генетически детерминированные отношения меуду оосфолипиднш комплексом нейронов и нейроглии, которые определяет их полифункцио-вачьню! характер у взрослых ытоткях. По мерс развития и

усложнения клеточных функций наблюдается увеличение различий в интенсивности обмена индивидуальных фосефлипидов нейронов и нейроглии. Итак, основой функционального динамизма нейрона-льных и нейрогляальных мембран является высокая и интенсивная обмениваемость фосфолппидного матрикса. Использованные нами воздействия, отличающиеся специфичностью мембранного эффекта четко выявили, что в зависимости от природа инициирующего стимула обмен фосфолиппдов не11ронов и нейроглии характеризуется свошл особенностями. Установлено, что при различных воздействиях в нейронах и нейроглии по характеру обмена индивидуальные фосфолшщдп располагаются в строго определенной последовательности, свойственной данной клеточной популяции ЦЕС. Это создав! широкий диапазон регуляторных возможностей и придает метаболизму индивидуальных фосфолипи-дов свойства спегтиФичности и направленности на определенные функции. По-видимому, мояно предположить, что определенные функциональные свойства той или иной мембраны зависят не только от количественного и качественного разнообразия фос-фолотидов, но и от последовательности их соединения в ней.

Сравнение метаболизма (Уосфолйпидов в нейронах и нейроглии подтверждает неразрывную связь компонентов фосфолппидного матрикса обоих типов мембран и доказывает, что система ней-рон-нейрог; 'я является высокоицтёгративной кооперативной системой. Существенной -особенностью этой системы является то, что ни одна мембрана точно не дублирует 'ответ другой. Ьероятно, эти клеточные популяции обладают автономными системами биосинтеза фосфолипидов, координация которых может осуществиться на уровне ферментов' и субстратов.

Тагам образам, проведенное исследование показало, что наряду с"общими принципами дифференциации и функционирования нейрональных и нейроглиальных мембран, веются и существен-, нке отличия, которые обусловлены различиями в распределении и метаболической активности, входящих в их состав индивидуальных фссфолипидов.

ВЫВОДЫ

I. Разработан метод препаративного выделения фракция ней-

ролов•и нейроглии из коры головного ь^зга крыс со стс лныэ обогащения 90 и 80 процентов, соответственно. Доказана возможность использования препаратов нейронов и кейд ,глии на разных этапах формирования кейрон-глпальных взаимосвязей для изучения метаболизма in vivo и in vitro.

2. Разработана микромодификация метода нлракраской спектроскопии всех классов фосфолипидов головного мозга, что позволяет быстро-и надежно идентифицировать пх в микрообразцах.

3. Нейроны коры головного мозга содержит ыеньпе лзгшдов, чем нейроглия - 240+40 и 470+20 мг, соответственно в расчете на I иг клеточного белка. Фосфолипиды составляют в ней-,, ронах 61 jj, в нейроглии - 69 % от общих л чидов.

4.' Нейроны и нейроглия коры головного мозга взрослых ' крыс имеют аналогичный состав фосфолипидов, Индивидуальные фосфхшшиды нейронов с з'четом их содержания составляют следующая ряд: ШК > §3 > > > СШ Jíffi ^ Ф1С; нейроглии -ФТ > ФЭ > С2М > Ж > ФИ > ФК > MX. Фосфатцдилхолин и фос-фатидалэтаноламин в нейронах и нейроглии составляют. 60-70 % от пула фосфолипидов. В нейронах выше содержание Ш( и <Ш, ; а в нейроглии - С5М и ФК.. •

5. Нейроны и нейроглия коры мозга имеют различный характер, накопления индивидуальных .фоссолшщдов в ходе ¡¡.остна- ; тального развития.* В период активной миелинизацки в нейроглии, накапливается в 2 раза больше фосфолипидов, чем в кей-ронтх и это увеличение затрагивает все классы фосфолипидов. 7« этот период в нейронах увеличивается количество

СФЛ и уменьшается: количество

6. Нейроны коры головного мозга характеризуются более высокой метаболической активностью, чем нейроглия. Вкг-че-ни- и трития в липиды и фосфолипиды нейронов во все исследованные сроки- радиоактивной экспозиции осуществляется интенсивнее, чем в нейроглии. В нейронах наиболее интенсивно обмениваются ФК, ФИ, ЛФХ, в нейроглии - ФК, Фй, ФХ. Обмен СИ, ФЭ, ФХ в нейронах и СОЛ, ФЭ и СС в нейроглии идет с меньшей скоростью.

7. Период интенсивной миелиниззции сопровождается увели-

чениегл метаболической активности лиыццов нейронов и нейро-глии. Уровень обмена нейрональных лкпидов в этот период в 2 раза превниает обмен нейроглиальных липидов. В нейропах усиливается обмен ТШ, £0, ФИ, ФЭ в нейроглии очень резко возрастает интенсивность обмена сфингомиелина. Завершение процесса миелинизации характеризуется снижением метаболической активности фосфолипядов нейроглии, тогда как в нейронах их обмен сохраняется на высоком уровне. Зто касается ' осооенно С® и 4С. Эти факторы доказывает существование • автономных генетически обусловленных систем биосинтеза фос-фолинидов в этих клеточных популяциях ЦШ.

8. По мере формирования нейрональных и нейроглиалыгах ■ мембран проявляются различия в характере обмена фосфолнпн-дов доследованных клеточных популяций, что отратает спепи-фи. ,ские процессы дифференциации и направленности на определенные функции. '

9. Гипоксия снпаает интенсивность обмена ФЯ в нейронах, особенно ФИ и ФЭ на 50 и 70 % соответственно. Гипоксия но оказывает существенного влияния на обмен лйщдных компонентов мембран нейроглии.' *'-..■•'•.

10. Блокада м-холинорецепторов резко «-изменяет обмен фоо-фолипвдов нейрональных мембран, что свидетельствует об .-.'. участии фоо^олжпздного матрикса в'процессе рецепции.

. II. 5-окситрштофан многократно увеличивает обмен <М и ФК в нейронах и нейроглии, что свидетельствует о том, .что компоненты фосфоинозитидного цикла' являются эффекторами ;. серотошптергичеоких рецепторов. -

12. Оудоролоше припадки усиливает метаболизм фосфолипи-дов нейронов и нейроглии: многократно увеличивается интенсивность -обмена ФИ, ФС и ФК, что подтверждает тесную метаболическую связь в системе нейрон-нейроглкя. •.

13. Характер обмена индивидуальных фосфолипидов в изучаемых меточных популяциях ЦНЗ отратает специфические функции каждого класса фосфолипидов в.нейрональных и нейроглиаль-ных мембранах.

ш.

список работ, 0п7бликпвашых по материалам дж

СЕР1АЦЙИ

1. Флёров М.А. Применение ИК-спектроскопии для : -¡учения глицеридов, фосфолипидов и ганглиозидов головного мозга. - Сб.тезисов У Всес.конф.по нейрохимки. - Тбилиси, 1958. - С.213.

2. Флёров М.А., Виноградов А.Г. Пршленение бумажной хроматографии и ИК-спектроскопии для изучения фосфоикозитзд дов головного мозга. - Вопр.ыед.химии,1969. - Т.15, вып.2. - С. 196-199.

3. Ялёров.У.А. Обмен глицеридов в норле и при гипоксии.

- В кн.: Нервная система. Л. :Л1У, вып. II. - 1970. - С. , 18-22.

4. Флёров М.А., Зубер З.Л. Применение инфракрасной спектроскопии для изучения фосфолйпидов головного мозга. -Вопр.мед.хжлш. - Т. 17, вып.2. - 1971. - С. 2II-2I6..

5. Флёров М.А., Блэдзин Ю.А., Калмыков В.Л. Эфиры холестерина головного мозга. - В кн.: Нервная система. Л.: ЛГУ, 1970. - Вып. 12. - С. 30-33.

6. Флёров М.А. Интенсивность, обмена отдельных фракций глицеридов головного мозга растущих кпзотных в норле и -прц гипоксии. - В кн.: Нервная система, IS75. - Вып. 15 -С. II2-II5. •

7. Flerov М.А., Giebelakii A.Sc.n K&lmlkov УЛ.* The turnover of cortex phospholipids- In Abstr.9th Intern. Congr.Biochenu - Stockholm, 1973. - P. 30Io

o. ilerov И.Ac,, Pxokhorova JI ,IoP Gereeiaova 14. The-юе-tabolisa of lipids in different parts of brain after injection of If-cholinolytico - In Abetr«6th Intel®» Congr.Pharmacol n„ I975<> - P<> 463°

9. Flerov MoAo Specific role of different fractione of phoepholipidB ia the propagation of nervous iepole<> — In Abetro5th Intem«meeting of the Intem.Soc Леи rochet»

- Barcelona,, 1975 о * о 377

10. Флёров М.А», Герасимова И„А„ Влияние снизила на обмен фосфолипидов различию: отделов головного мезга. -

- Вопр.мед.химии. - IS76. - Т.22. - ВЛ. - С. 72-75.

11. Флёров M.А., Герасимова И.А. Интенсивность обмена фос-фолипидов в нейронах и кейроглии. - Сб.тезисов 2 Всос. симп. "Структура, биосинтез и превращение ллпидов т> эр-) гапизме человека и нивотных. - Ленинград, 1975. - C.Î04*""

12. Флёров М.А., Герасимова И.А. Интенсивность обмена фос-фолипядов в нейронах и нейроглии растущих крыс. - Сб. тезисов УП Всес.конф. по нейрохимии. - Ростов-на-Дону.

. 1976. -С. 146-147.

' ЗЗ.Фяёров 'i.A.. Герасимова И.А. Обмен ф'осфолипидов различных отделов головного мозга при введении М-холинолитика амизила. - В кн.: Физиология и биохимия медиаторных процессов. - Î!.:Наука. 1976. - С. 35-36.

14. Flerov М.А. The participation of phospholipids in the nxocesses of the storage of the infoimatiofl. - In Abstr. TOth Ditern.Congr.Bioch. - Haaburg,1976. - P. 12.

15. Флёров M.А. Метаболические взаимоотношения мембранных .-компонентов'в системе нейроп-нейроглия. - Сб.тезисов . Всес.симп. Сункции нейроглия. - Тбилиси,1972. - С.49.

16.Флэров М.А. Участие фосфолшвдов в системной организации отношений нейрон-нейроглия, - Сб.тезисов Всес.симп.

'Развитие общей теории функциональных систем. - И.,1976. ' - С. 35-41. . . '

17. Флёров ;.А., Толстухина Т.Н. Состав и обмен -фосфолипи-'' дов синаптосом. - В кн.: Нервная система. - Л.:ЛГУ,

1978. - С. 58-62.

18. Флёров М.А. Распределения и метаболизм фосфолищдов в . нейронах и нейроглии. - Вопр.мед.химии,1978. - Т.24. -Вып.2. - а. Г74-Г79.

19. Флёров М.А., Боровицкая. А. Э., Толстухина Т.И. Влияние пикротоксина на АТФазнута активность субклеточных фракций коры головного мозга. - В кн.: Нервная система. -Л. :ЛГУ, 1980. - Вып.21. - С. 96-98.

20. Флёров М.А., Толстухина Т.Н. Особенности метаболизма фосфоляпвдов синаптических мембран. - Сб.тезисов И Всес.симп. Структура, биосинтез и превращение липидов. Ленинград, 1978. - С. 81-82.

'¿I. шлёров М.А., Толстухина Т.И. Зависимость АТФазной ак-

тивности субклеточных фракций кори головного мозг., от функционального состояния. - Сб.тезисов Всес.симп.Ме-таболизм белков ДНО.; - Днепропетровск, 1978. • С. 127.

22. Флёров ГЛ.Л. Выделение нейронов и нейроглии коры голов-, ного мозга крыс различного возраста. - Вестник ЛГУ,• 1976. - Вып.9. - С. 80-8б. .

23. Флёров H.A.. Толстухина т.и., Боровицкая a.B. Действие фосфолипазы А на АТОазнке системы субклеточных фракций головного мозга. - В кн.: Нервная система. - Л.:ЛГУ,-1981. - Вып.23. - С^9Х-95 . .

24. Флёров М.А. Нейромедиаторы. - В кн.: Нейрохимия. - Д.: :ЛГУ, 1979, - С. 213-232."

25. йлёров М.А.,.Войнер й.А. Содержание ог ;елышх фракций

'.'•-- фосфодипидов в нейронах и нейроглии коры головного мозга крыс различного возраста.' - Вестник ЛГУ,1980. - В.З. - С. SI-95. ..

26. йлйров М.А. Современные методы препаративного выделения нейронов и нейроглии,. - Вестник ЛГУ, 1980. - В.15. - С.

■ ,84-91. . • • . -

27. Флёров ¡i.A., Войнер Й.А. Метаболизм отдельных фракций фосфолипидов нейронов и нейроглии в процессе миелиниза-ции. - Зопр.мед.химии,1982. - Т.28. - Вып.5. - C.SI-85.

28. Флёров H.A. Современные метода биохимических исследований. - В кн.:. Метода биотических исследований. - Л.: . ЛГУ, 1982. - С. XI-19, 25-29, 48-53.

29. Флёров М.А. Метаболическая-активность фосфолипидов в нейронах и 'нейроглии. - Нейрохимия, 1985k - Т.4, Л-4. -С. 394-402.

30. Флёров М.А., ТоЛстухина Т.Н. Изменение метаболизма фос-фолипидного матрикса нейронов и нейроглии при гипоксии.

• - Сб.тезисов Всес.конф.Фармакологическая корреляция пшоксических состояний. - Гродно,1991. - С. 32-33. ■

31. Флёров М.А. Влияние 5-окситриптофана ыа метаболизм (¡оссголипвдов нейронов и нейроглии. - Проблема нейрохими мии. - Л.:ЛГУ, 199I. - С. 102-107.