Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

АССОЦИАТИВНАЯ АЗОТФИКСАЦИЯ У ПШЕНИЦ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "АССОЦИАТИВНАЯ АЗОТФИКСАЦИЯ У ПШЕНИЦ"

Л-29№

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРОПРОМЫШЛЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи ЧУМАКОВ Михаил Иосифович

УДК 633.11 : 631.461.51.

АССОЦИАТИВНАЯ АЗОТФИКСАЦИЯ У ПШЕНИЦ

Специальность — 03.00.07.— микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологииекцх наук

МОСКВА 1988

Диссертация выполнена на кафедре микробиологии Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

Научный руководитель — лауреат Государственной премии СССР доктор биологических наук, профессор В. Т. Ем-цев.

Официальные оппоненты: доктор биологических .наук, профессор Умаров М. М.; кандидат биологических наук. Покровский Н. П.

Ведущее учреждение — Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии' ВАСХНИЛ.

«защита диссертации состоится « £. » л*л£&л€19 89 г. в $л?¥& часов на заседании специализированного совета К-120.35.01 в Московской сельскохозяйственной академии им. К.' А. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва И-550, ул. Тимирязевская, 49. Сектор защиты диссертаций ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан «

Г~» ,.ЛЙЛЛЛСе 198лг.

Ученый секретарь "

специализированного совета — гЛ}л£ 1+~ кандидат биологических наук ЬухСаблина С. М.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Энергоемкость производства азотных удобрений и отрицательные экологические последствия их широкого применения выдвинули на первый план проблему использования «биологического азота» для удовлетворения потребности сельскохозяйственных растений в азоте. У небобовых растений и, в частности* злаков около пятнадцати лет назад работами Й. Доберейнер (БоЪегетег, 1972, 1976) было открыто явление ассоциативной азотфиксации с диазот-рофными бактериями. Установлено, что азотфиксирующие бактерии обладают способностью к продукции биологически активнык веществ, могут подавлять рост фитопатогенных микроорганизмов. Внесение азотфиксирующих бактерий в почву зачастую оказывало благоприятное воздействие на рост и урожайность сельскохозяйственных растений, улучшало структуру почшы, содержание в ней азота. Однако более широкое .применение диазотрофных «бактерий для инокуляции небобовых растений .показало, что в ряде случаев эффект от инокуляции отсутствует. В настоящее время нет достаточно обоснованных критериев при определении микроорганизма как ассоциативного, не разработана единая .методика выделения ассоциативных бактерий. При изучении' азотфикси-рующих ассоциаций преобладающее количество работ выполнено на микроорганизмах. Роль растения-лозяина в формировании и контроле ассоциации остается практически неизученной.

Стало очевидным, что использование биологической азот-фиксации для нужд сельского хозяйства в дальнейшем в<рад ли возможно без изучения механизмов взаимоотношений и взаимодействия партнеров в диазотрофном биоценозе. Пшеница является самой распространенной сельскохозяйственной культурой в нашей стране и в мире, «поэтому решение проблемы биологической азотфиксации в приложении к пшенице может дать существенную экономическую выгоду.

Таким образом, проблема-* ассоциативной азотфиксации

у небобовых растении и, в частности, у пшеницы представляет теоретический и практический интерес.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось исследование активности ассоциативной азотфиксации у .пшениц с различным геномом, а также научение функционирования популяции диазотрофных бактерий в корневой зоне пшеницы1.

Представлялось также необходимым разработать оценки для определения эффективности взаимодействия диазотроф-ных бактерий с растениями.

Основные задачи исследований:

1. Определить активность ассоциативной азотфиксации в полиплоидном ряду пшениц, а также пшениц с различной структурой генома. Изучить видовую, сортовую вариабельность ассоциативной азотфиксации у пшениц, проявление признака ассоциативной азотфиксации у моносомных линий гексаплоидной пшеницы.

2. Разработать методы выделения ассоциативных азот-фиксирукшшх бактерий из различных зон кор.ня пшеницы.

3. Выделить из ризосферы, ризоп.таны, гистосфсры лше-ншш ассоциативные азотфнксирующие бактерии и изучить их свойства.

4. Изучить численность и состав популяции диазотрофных бактерий в корневой зоне пшеницы.

5. Разработать количественные оценки эффективности взаимодействия диазотрофных бактерий с небобовыми растениями.

6. Определить влияние инокуляции выделенными дназо-трофными бактериями на рост и развитие пшеницы.

Научная новизна. В условиях модельного опыта определена прямая зависимость величины ассоциативной азотфик-сации от плоидности генома пшеницы. Установлен значитель-/ ный видовой, сортовой полиморфизм .пшеницы по нитрогеназ-I ной активности в корневой зоне. Обнаружены индивидуаль-Л ные растения, в пределах каждого сорта пшеницы; не обладающие способностью поддерживать ассоциативную азог-';фиксацию. Способность (поддерживать азотфиксацию у бактерий, обитающих в корневой зоне, зарегистрирована у всех изученных моносомных линий гексаплоидной пшеницы. Наибольшие нарушения ассоциативной азотфиксации зарегистрированы у моносомных линий ЗА, 1А, 6Д.

Разработан и апробирован метод выделения' ассоциативных азотфиксагрующих бактерий из различных зон корня небобовых растений. С помощью нового метода из корней гех-""еаплоидной пшеницы выделены агробактерии, обладающие зависимой от растения нитрогеназной активностью. Установлены не описанные ранее ассоциативные взаимоотношения

сахаролитических азотфиксирующих клостриднй с гексапло- \ идной .пшеницей. Определена численность азотфиксирующих ) бактерий трех физиологических групп в различных зонах / корня пшеницы. л./

Впервые предложено разбить процесс образования диа-зотрофного биоценоза на ряд последовательных этапов. Впервые разработана система оценки эффективности взаимодействия диазотрофны.х бактерий с небобовыми растениями на основе количественный оценок каждого этапа образования диазотрофного биоценоза.

Практическая ценность. Разработана система количественных оценок эффективности взаимодействия диазотроф-ных бактерий с небобовыми растениями, [На основаншг которых возможен отбор и селекция бактерий, эффективно взаимодействующих с растением и повышающих урожайность растений. Для выделения ассоциативных форм бактерий предложен новый метод, с помощью которого возможен поиск эффективных микробных партнеров для небобовых растений в ассоциации. 'При ломоши разработанного метода из корней пшеницы выделены бактерии Agrobacterium ra-diobacter, обладающие зависимой от растения нитрогеназной активностью, которые представляют интерес как объекты при исследовании ассоциативного симбиоза, а также при создании генноинженерными методами штаммов, эффективно взаимодействующих с пшеницей. На базе выделенных из корневой зоны пшеницы штаммов 5 Д-1 и 56 Д возможно приготовление бактериальных (препаратов, повышающих продуктивность пшеницы. Выявлены, сорта пшеницы, обладаю- \/ щие повышенной способностью активизировать ассоциативную азотфиксацию./которые могут послужить донорами признака высокой азотфиксашш. В практику селекции пшеницы может быть рекомендован тест на nis-признак при создаиин сортов, обеспечивающих часть своих потребностей в азоте за счет биологической азогфиксации.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены-: на VII съезде Всесоюзного микробиолотического общества (Алма-Ата, 1985), на конференции молодых ученых и специалистов ТСХА (1986, 1987), на III Всесоюзной конференции «Микроорганизмы в сельском хозяйстве» (Москва, 1986), во Всесоюзной школе молодых ученых и специалистов «Современные проблемы использования биологического азота в земледелии» (Усть-Нарва, 1986), на Республиканской конференции «Симбиотрофные азотфиксаторы и их использование в сельском хозяйстве» (Чернигов, 1987), на симпозиуме по генетике азогфиксации (Венгрия, 1987), на Международном симпозиуме «Взаимоотношения между микроорганизмами « растениями в почве» (Либице, Чехословакия,

• 1987), на'Республиканской конференции! «Микроорганизмы в сельском хозяйстве» (Кишинев, 1988), на Всесоюзном совещании «Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия растений и .микроорганизмов'» (Пущино, 1988), ♦на 6-м Международном конгрессе по азотфиксации (Кельн, ФРГ, 1988), на 6-м Конгрессе FESP (Сплит, Югославия, 1988), на 8-м Баховском коллоквиуме по биологической азотфиксации (Кобулети, 1988).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, списания объектов и методов исследования, изложения результатов экспериментов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащей 257 источников. Работа изложена на 182 страницах, содержит 7 рисунков, 25 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследований служила .популяция диазотроф-ных бактерий из 306 штаммов, выделенных из ПОЧЕЫ, С поверхности корней и из корней мягкой пшеницы (сорта Саратовская 29, Саратовская 52, Альбидум 43, WS 1616). В настоящей работе использовали типовой штамм Agrobacterium radiobacter С 58, полученный от Злогникова Б. В., Agrobac-terium radiobacter. В 1218 из Всесоюзной коллекции микроорганизмов (Москва). Бактерии AzospirШum brasilense типовой штамм sp 7 (АТСС 29145) получен из музея типовых ♦культур ВНИИ прикладной молекулярной биологии и генетики ВАСХНИЛ (Москва) и штамм sp 245, выделенный из корней пшеницы и предоставленный И. Доберейнер (Рио-де-Жанейро, Бразилия).

В качестве растительного материала ненользезали зерновки пшеницы сортов Саратовская 29, Саратовская 52, Саратовская 8, Саратовская белозерная, Альбидум 43, Меляно-нус 1776, Лютесценс 230, WS 1616, предоставленные ВНИИ сельского хозяйства Юго-Востока (Саратов). Образцы пшениц с различным геномом получены из коллекции пшениц Всесоюзного института растениеводства 4Ш. ^ И. Вавилова (Ленинград). 21 моносомная лини» гексаплоидной пшеницы, созданная на основе сорта Саратовская 46, любезно предоставлена лабораторией генетики пшеницы ВНИИ сельского хозяйства Юго-Востока (Саратов).

Яровую пшеницу (Т. aestivum) сортов- Ершовская 32, Саратовская 42 в полевых опытах выращивали на полях Ер-шовской опытной станции (Саратовской области) в режиме орошения, без применения удобрений, содержащих азот. Отбор и обработку почвы из междурядий и корневой зоны пше-

ницы проводили по методу, описанному Д. Г. Звягинцевым (1980).

Определение актуальной нитрогенааной активности >в корневой зоне пшеницы проводили в возрасте 2—10 недель ацетиленовым методом (Hardy et. al., 1968) в сосудах объемом 80, 800 мл но методике М. М. Умарова (1980) в" нашей модификации. Активность ассоциативной азотфиксации у пшениц с различный! геномом определяли в возрасте двух недель методом ацетилепредукцпи на хроматографе ЛХМ-8 МД (СССР) по методикам, описанным в работах (T-Bauzon et. al., 1982, Jain, Rennic, 1986).

Для получения стерильных растений зерновки пшеницы обрабатывали 20 ..мин. в 0,02% водном растворе КМпСч, . 1 — 2 мин. в 96% этиловом спирте >и 20 мин. в 4% водном растворе Са(ОС1)г, отмывали стерильной дистиллированной водой. Проверку стерильности зерен проводили на МПА.

Учет численности азотфиксирующих бактерий в почве, ризосфере, ризоплане, гистосфере пшеницы проводили методом предельных разведений с высевом на элективные среды: 1. Среда 4А (оптимально-дифференциальная) (Мишу-стин, Емцев, 1974) —для сахаролитических клостридий. 2. Среда CR, предложенная для выделения и учета азосинрилл (Cicecers, 1982). 3. Среда, предложенная Т. А. Калининской с соавторами (1981), для учета аэробной азотфиксирующей микрофлоры. 4. Среда Эшби—для выделения и учета азотобактера.

Выделение накопительных культур из различных зон корня пшеницы проводили по разработанной нами методике, а также .по методу, предложенному в работе (T-Bauzon et. al., 1982). Для выделения азотфиксирующих бактерий из гисто-сферы пшеницы использовали поверхностную химическую обработку корней 4%-н;ьгм водным раствором гипохлорита кальция, время обработки 15—20 мин. Определение нитроге-назной активности у чистых и накопительных культур проводили .методом ацетиленредукции. Для внесения под стерильное растение культуры подращивали на твердых питательных средах в течение 72—96 часов при 28—30° С. Под одно растение вносили 0,2—1,0 мл бактериальной суспензии в концентрации 107—108 кл/мл.

Аммонийный и нитратный азот в почвенных образцах определяли с помощью .ионоселективных электродов марки ИСЭ-1 (СССР), в качестве регистрирующих приборов использовали рН-метр ЭВ-74, (СССР), И-513 (ПНР). Статистическая обработка проведена на мини-ЭВМ «Электроника Д 3-28» и микро-ЭВМ «Электроника МК-56».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. АССОЦИАТИВНАЯ АЗОТФИКСАЦИЯ У ПШЕНИЦ С РАЗЛИЧНЫМ ГЕНОМОМ

1.1. Ассоциативная азотфиксации у пшеплц с различной плоилноспъю генома

Активность азотфиксации в ассоциации с 'диазогрофными бактериями была определена у представителен всего полиплоидного ряда пшешщ в условиям модельного опыта. Если принять Ш8 — способность на диплоидном уровне организации генома пшеницы за сто процентов, то при переходе пшеницы .на тетраплоидный уровень организации генома активность азотфиксации у исследованных пшениц увеличилась на 37% (среднее значение для пшениц с геномами АВ и АО) (табл. 1). Ассоциативная азогфиксация у гексаплоид-

Таблица 1

Активность ассоциативной азотфиксации у различных видов пшеницы _;(1К нг С2Нч/г корней сутки-1)

Геном Вид пшеницы Кол-во сортов Кол-во образцов

А Т. monococcum 6 93

АВ Т. durum ,1 6

АВ Т. dicoccum 5 51

АВ Т. dicoccoides 4 65

AG Т. militinae 1 7

AG Т. tiniopliecvii о 15

АВД Т. vavilovii 5 23

АВД Т. aestivum 5 31

AAGG Т. timonovum 1 8

W

X

Q--(%)

(%)

1,74 2.47 2,28 2.13 2,79 2,44 2.56 3.10 2,29

0.89 0.18 0.60 0,63 0,52 0,72 0.50 0,92 0,23

53.1 7,1

26.3

29.4 18,7 29,7 1.9,5

29.5 10,9

51,2 2,9 3j&9 3.7 7,1 7.7 4.1 5,3

аэ

99,

99,9

99,9

99.8 НО

80,6 99,3 59,6

99.9

100 100 99,8 НО 99.6 НО 100 100

S

Р

Примечания: 1. За контроль при сравнении выборок по критерию Фишера принят Т. шопососсиш 2. НО — не определяли. Условные обозначения: X — среднее арифметическое; 8—среднее квадратичное отклонение; W — коэффициент вариации; Р — показатель точности опыта; рР — достоверность ,раз.гачий дисперсий по критерию Фишера; Р^—достоверность различий по критерию Сгьюдента.

ных пшениц (геном АВД) была на 59% выше уровня, взятого за контроль. При сравнении с гексаплоиднон пшеницей ш8-активность октоплоидной пшеницы (геном ААОО) была несколько ниже, хотя и превышала уровень контроля на 38%. Корреляция признаков плоидности генома пшеницы и активности ассоциативной азотфиксации у исследованных пшениц б

составляет +0,72, что указывает на тесную связь между этими признаками.

Исследование активности азотфиксашш у тетраплоидно-го вида пшеницы (Т. ИшорИееуп, геном АО) и у производного от него вида Т. Ишоиоуиш (геном ААОО) показало, что увеличение активности ассоциативной азотфиксашш при удвоении генома АО не наблюдается (табл. 1). Можно предположить, что оптимальное равновесие генома пшеницы для признака ассоциативной азогфиксации складывается на гек-сапдоидном уровне его организации.

Распределение признака ассоциативной азогфиксации в популяциях пшениц с различным геномом близко к теоретически нормальному. Исключение составляют пшеницы с ок-топлоидным набором хромосом, у которых распределение сходно с теоретическим распределением Максвелла.

1.2. Ассоциативная азотфиксация у пшениц с различным

геномом

Рассмотрим, как изменялся признак ассоциативной азот-фиксации у пшеницы при усложнении генома. В результате проведенных исследований было установлено, что появление геномов В ш О в качестве вторых геномов у тетраплоидных пшениц сопровождалось 'достоверным повышением способности поддерживать ассоциативную азотфиксашш у всех исследованных пшениц с геномамщ АВ и АО. Причем тетра-плоидные пшеницы; со вторым геномом О имели в среднем на 15% активность азотфшксации выше, чем тетраплоидные пшеницы с геномом В (табл. 1). Из данных, представленных на табл. 1, можно видеть, что усложнения генома у тетра-плоидных пшениц значительно уменьшает коэффициент вариации ^-признака.

Дальнейшее усложнение генома у пшеницы Т. ае8Йуиш (геном АВД) также сопровождалось усилением ^-признака.

1.3. Видовые, софтовые различия пшениц по активности

ассоциативной азотфикоации

Проведенные исследования ассоциативной азотфиксашш у сортов пшениц с различной способностью к выносу азота с зерном показало, что между этими признаками существует обратно пропорциональная связь (г=—0.9Р7) (табл. 2). Возможно, различная способность сортов реутилизировать азо1 из листьев и стебля в зерно, на которую указывают в своей работе Л. Е. Котляр и В. И. Кумаков (1983), явилась одной из причин обнаруженной нами закономерности.

Среди изученных девяти видов пшеницы максимальная активность ассоциативной азотфиксашш зарегистрирована у Т. ае8Йуиш. Сравнение ^-способности у диких >и окульту-

Таблица 2

Активность ассоциативной азотфиксации у сортов пшеницы, отличающихся по выносу азота с урожаем зерна

Сорт пшеницы Вынос азота с зерном (кг/га) Активность ассоциативной азотфиксации (Ш нг С2Н4/Г кормя сут-1)

Мелянопус 1776 51 4.1

Лютесцене 230 89 0.5

Саратовская белозерная 106 3,4

Саратовская 8 151 2,7

ренных видов теграплоядной пшеницы с геномом АВ показало, что способность к ассоциативной азотфиксации у окультуренного вида пшеницы; Т. Шсоссиш достоверно на 7% выше активности пшеницы дикого пленчатого вида Т. Шсоссоь (табл. 3).

Таблица 3

Нитрогеназная активность <в корневой зоне диких и окультуренных видов тетраплоидной пшеницы (геном АВ)

Вид пшеницы Проанализировано подвидов Проанализировано ин-дивидуаль-ных растений Активность ацетил енредукцин (1й нг ашг корня сут-1)

Т. dicoccoides (дикая) . . 4 65 2.13

Г. dicoccum (окультуренная) 4 . 51 2 28*

Т. durum (окультуренная) 1 6 2Л47

Примечание: *—различия между выборками, по критерию Фишера достоверны при 5%-ном уровне значимости.

Из полученных экспериментальных данных следует, что для пшеницы характерно явление значительного' видового, сортового, внутрисортового полиморфизма по активности ассоциативной азотфиксации. У пшеницы обнаружены диазо-трофные ассоциации, не обладающие нит.рогеназной активностью. Подобные ассоциации зарегистрированы практически у всех исследованных популяций и составляли от 10 до 90% всех растений, в зависимости от сорта.

1.4. Анализ ассоциативной азотфиксации у моносомных линий пшеницы

У моносомиой линии ЗА зарегистрировано достоверное снижение' ассоциативной азотфиксации по сравнению с исходным сортом (табл. 4). Возможно, снижение азотфиксации у лии и и ЗА связано с нарушением фотосинтеза, поскольку

Т а б л и- ц а 4

Активность ассоциативной азотфиксации у моносомных линий гексаплоидной пшеницы Саратовская 46 (lg нг CsHt/r корней сут-1)

Линия X S Линия X S Линия X

ПА 2,99 0,95 IB НО НО 1Д 3,79

2А 3,03 1,34 2В 3,75 0,72 2Д 3,09

ЗА 2,71* 0.23 ЗВ 3,86 1,31 зд 3,82

4А 3,26 1,37 4В 3,51 1,31 4Д 3,61

5А Д,8й 0,66 5В 4,08 1,07 5Д 3.65

6А 4,09 il,44 6В 3,85 0,83 6Д 2,32

7А 3,61 0,54 7В 3,51 0,53 7Д 4,06

S

0,77 1,37 0,80 0,51 0,91 0,41 0,59

Примечания: 1. НО — не определяли. 2. * — досюверное различнее контролем по критерию Стьтодента (Р<0»5). 3. Активность ассоциативной азотфкчеации: «орта Саратовская 46—4,47+1,48 (lg иг - С2Н4/Г корней су г-1). 4. Условные обозначения, см. табл. 1.

хромосома ЗА несет гены, определяющие активность фотосинтеза у пшеницы (Sears, 1963). Значительное снижение азотфиксации зарегистрировано также у линии 1А, 6Д. В целом наибольшие нарушения nis-способности зарегистрированы у моносомных линий, относящихся к геному А (среднее значение X —3,28), меньшие — в геноме Д (среднее значение Х = 3,53) и в геноме В (среднее значение Х = 3,57). Полное отсутствие способности поддерживать ассоциативную азотфиксацию .не наблюдалось ни у одной моносомной линии. Исходя из этих фактов, можно предположить, что nis-приз-нак является количественным и контролируется генами, расположенными на более чем одной хромосоме у пшениц с геномом АВД.

Таким образом, на основании экспериментов, описанных в главе 1, можно заключить, что азотфиксации в дназотроф-ном ризоценозе у пшеницы зависит от состаза генома, наиболее активная азотфиксации наблюдается у гексаплоидных пшениц. Необходимо отметить, что для пшениц характерен значительный полиморфизм nis-иризнака, который, вероятно, люжег быть отнесен к количественным.

2. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ, • УЧЕТА ЧИСЛЕННОСТИ АССОЦИАТИВНЫХ АЗОТФПКСИРУЮЩИХ БАКТЕРИИ КОРНЕВОЙ ЗОНЫ ПШЕНИЦЫ И ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ : ДИАЗОТРОФНОГО СИМБИОЗА

2.1. Разработка метода выделения ассоциативных азотфикешрующих бактерий из корневой зоны пшеницы Анализ литературы показал, что обоснованной методики выделения ассоциативных азотфпксирующих бактерий из

корневой зоны небобоЕЫХ растений в настоящее время не разработано. Для выделения диазотрофных бактерий из различных мест корневой зоны небобовых .растений предлагается методика выделения в несколько этапов (рис. 1). Благодаря предложенной методике возможно последовательное выделение бактерий, начиная с форм, удаленных от поверхности «орня на расстояние 1—2 мм, слабо связанных физически и трофически с растением до форм, развивающихся непосредственно на(в) корнях растения.

2.2. Выделение и характеристика бактерий, находящихся в дЦазотрофном ри$оцен}»зе с пшеницей

Согласно разработанному методу (рис. 1), было выделено 306 штаммов: аэробных форм — 34; микроаэрофильных— 181, анаэробных — 81. Штаммы были проверены* по активности азотфиксации в чистой культуре, в ассоциации с растением и по способности к инфекции корня. Обнаружено, что у инфицирующего штамма 5 Д-1 азотфижеация повышалась в ассоциации с пшеницей.

1. Выращивание проростков в течение 2—8 недель в нестерильной-почве

I

2. Мягкая отмывка (ручная или на шейкере) отрезанных корней в стерильном буфере (1—3 раза по-5 мин.) со сменой отмывочных растворов

Отбор образцов лочвы из ризосферы, высев на питательные среды из серийных разведений

Высев на питательные среды из отмывочных растворов (среды: среда с солевой основой среды Доберей нер + с а х а р оз а, глюкоз а, мальтоза, маннит, малат; среда Эшби; оптималыю-дифферентш-альная среда 4А (для клостри-дий); среда с * имитацией корневых выделений; МП А).

3. Отмывка корней на гомогенизаторе РТ-2 при 5 тыс. об/мин," 5 мин. (1—2 раза)

4. Обработка корней 4% (Са(ОС)г, 20—И) мин с последующей сбра-" богкой" в стерильной воде

I

5. разрушение стерилизованных— корней

Высев на питательные среды из отмыво'шых растворов (среды см. выше)

Проверка стерилизованных кор' ней на эффективность стерилизации на питательных средах без разрушения

Высев гомогената корней на питательные среды (см. выше)

Рис. :1. Схема -выделения ассоциативных азатфиксирующих бактерий из •корневой зоны иебобовых растений

Примечание:

все этапы проводятся асептически.

; Штамм 5 Д-1 был мндентифицирован согласно определителю Берге по ряду биохимических тестов, отношение АТ/ГЦи тесту но гибридизации общей ДНК. По совокупности свойств штамм 5 Д-1 может быть отнесен к Aprrobacterium radiobac-ter. Гомология общей ДНК штамма 5 Д-1 и рсперного штамма Adrobacterium tumelaciens С 58 была низкой (17—20%), в то время как процент гомологии с ДНК A. radiobacter В 1218 был значительно выше — 92±22% (среднее значение по' 10 повторностям).

♦ Таким образом, штамм 5 Д-1 может рассматриваться как ассоциативный по отношению к пшенице и представляет интерес как объект при изучении ассоциативного взаимодействия.

2.3. Распространение диазотрофных бактерий в ризосфере, ризоплане» гистосфере пшеницы

-Способ предварительной обработки корней при учете численности бактерий определяет не только численность учитываемой популяции, но и качественный состав (табл. 5). После, мягкой отмывки корней в отмывочной воде практически отсутствовали определенные виды микроорганизмов (Azoto-bacter, Clostridium), хотя обработка этих же корней на гомогенизаторе РТ-2 показала, что эти бактерия присутствуют на корнях в больших количествах (табл. 5). Имеется и обратный пример. Бактерии рода Azotobacter обнаружены после мягких отмывок и однократной обработки на РТ-2 на корнях пшеницы, но отсутствовали в отмывочной воде после повторной обработки на РТ-2 -и после химической стерилизации В' корнях.

В ризосфере и ризонлане проанализированных сортов пшеницы преобладали аэробные бактерии, представленные двумя группами бактерий, одна из которых отнесена к роду Azotobacter. Популяция микроаэрофильных бактерий была представлена бактериями рода Agrobacterium, Azospirillum и нендентифицированными штаммами. Среди анаэробных азотфиксирующих бактерий обнаружены сахаролитическне клостридии. Наиболее заселена диазотрофными бактериями ризосфера пшеницы. В ризоплане и гистосфере (Саратовская 52 и WS 1616) численность популяиии азотфиксиоую-щих бактерий составляла соответственно 3 и 5% от Численности всей популяции диазотрофов в корневой зоне пшеницы.

2.4. Образование ,азотфи[к«ирующей ассоциации между пшеницей и сахаролитическими клострициями

На основании полевых экспериментов установлено, что численность сахаролитических клостридии в ризосфере и

ризоплане пшеницы зависит от возраста растения. Максимум численности анаэробов1 наблюдался в период интенсивного вегетативного роста пшеницы, вплоть до цветения.

Клетки клостридйй обнаруживаются в значительных количествах в .ризосфере, р'изоплане всех исследованных сортов гексанлоидной пшеницы, а в некоторых случаях обладают способностью проникать в корень (табл. 5). Выделенные

Таблица 5

Численность азотфиксирующих бактерий различных физиологических групп в корневой зоне яровой пшеницы (млн. асц/г корней)

Физиологическая Способ предварительной обработки корней

Сорт пшеницы , мягкая отмывка (ручная) отмывка разрушение корней

группа бактерий на гомо-генизапо-- ре после обработки на РТ-2 после химической обработки

Саратовская 52 I II III 7S6 18 18 84 18 15 . 0,3** 2,3 1,2 0 + 0 0.1 43 0

WS 1616 I II III 726 2504 ' 0,2 136 309 0 82** 53 1

А.тьбидум-43 II III 265 6775 160 0 оо** 1,2 ол 0,1

Примечание: I — аэробные; бактерии; II — мнкроаэрофнль-ные бактерии; III—алаэробные бактерии; ** — азотобактер обнаружен.

из корневой зоны' пшеницы штаммы клостридйй обладали способностью к фиксации азота в чистой культуре и в ассоциации с пшеницей. Полученные экспериментальные данные позволяют рассматривать выделенные штаммы клостридйй как микроорганизмы, способные вступать в ассоциативные взаимоотношения с пшеницей.

2.5. Разработка критериев оценки, эффективности взаимодействия между бактериями и небобовымн растениями в азоггфикешрующей ассоциации

Анализ литературы сЕ-идетельствует о том, что в настоящее время подход к оценке эффективности взаимодействия бактерий и растений в диазотрофном симбиозе не разработан. Между тем очевидно, что такие оценки необходимы для поиска и при создании высокоэффективных бактерий. Поскольку процесс взаимодействия и функционирования азог-фиксирующей ассоциации по своей природе сложен, то пред-

ставляегся целесообразным разбить его на несколько последовательных этапов и оценить количественно.

Предлагаются следующие этапы и оценки: 1. Хемотакти-чеокое движение бактерий к корню — определяется по скорости движения бактерий :к корневым тыделениям растения-хозяина (по Mandirnba et. al., 1986). 2. Неспецифическая адсорбции бактерий на корнях — оценивается по изотермам адсорбции, рассчитываемых по формуле Лангмюра (по Shim-shik, Herbert, 1978). 3. Специфическая адсорбция бактерий на корнях. Оценкой может служить активность агглютинации бактерий лектином растения-хозяина или по специфическому ингибированию адсорбции определенными веществами. 4. Инфекция корня — оценивается методом предельных разведений при высеве из гомогената поверхностно-стерилизованных корней или счетом на срезах корня проникших бактерий. 5. Лзотфиксация — определяется по активности ацети-ленредукции бактерий в ассоциации со стерильным растением-хозяином. 6. Продукция фитогормонов — может быть оценена по активности продукции ПУК в стандартных условиях.

Таблица G

Влияние диазотрофных бактерий на пшеницу Саратовская 29 Кол-во

К иепшан- Вес стеб- Vo к кон- Вес кор- Vo к кон-

Культура ных ра- ля (мг) тролю ня (мг) тролю

стений

Контроль (б/инокуляции) 10

A., brasilense. sp 245 10

Л. radiobacter 5 D-l 10

56 Д............10

22 Д-1............10

газ ±41 197 ±24 221=40 223±31 * 1&5±26

0 57± 16 0

— 3 66± 14 + 16

+ 9 71±16* + 23

+ 12 72+17* + 26

-9 49+КЗ — 14

Примечание: * — различия средних достоверны при Р<0,05.

Активность взаимодействия партнеров в ассоциации, выраженная на каждом этапе в специальных единицах, затем оценивается для каждого этапа но шкале от —1 до +1 в условных единицах. Далее оценки каждого этапа, выраженные в условных единицах, суммируются и сумма делится на количество этапов образования ассоциации. Максимальное количество баллов, которое может набрать .микроорганизм но этой системе оценок— ( + 1), минимальное— (—1). В таком случае можно было бы принять следующую градацию степени- ассоциированности бактерий с небобовым растением: ( + 0,34) —(+1,00) —активный ассоиианг; (—0,33) —( + 0,33) — неактивный ассоциант; (—1,00) — (—034)—пеассоци-ант»

3. ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИЗАЦИИ НА СТЕРИЛЬНЫЕ ПРОРОСТКИ ПШЕНИЦЫ

Как видно из таблицы 6; дикие.штаммы (5 Д-1 и 56 Д) оказывали на стерильные проростки пшеницы больший эффект, чем штамм азоепирилл, использованный в качестве репера. Вероятно, в дальнейшем штаммы 5 Д-1 и 56 Д могут быть использованы при создании биологических препаратов, повышающих продуктивность лшеницы и как основа для создания генноннженерными методами штаммов, эффективно взаимодействующих с пшеницей.

Выводы

1. В модельных опытах впервые выявлена корреляция величины ассоциативной азотфиксации с плоидностью генома пшеницы. Максимальная нитрогеназная активность диазо-трофного ризоценсза зарегистрирована у гексаплоидных пшениц. Среди исследованных видов наиболее активны по ассоциативной азотфиксации представители вида Т. aestivum. Обнаружен значительный видовой, сортовой полиморфизм nis-признака у пшеницы. Установлено, что в пределах каждого сорта пшеницы существуют индивидуальные растения, неспособные поддерживать ассоциативную азотфиксацию. Показано, что из проверенных-21. моносомной линии пшеницы (геном АВД) наибольшие нарушения ассоциативной азотфиксации наблюдаются у линий ЗА, 1А, 6Д. Nis-признак зарегистрирован у всех моносомных линий пшеницы.

2. Разработай и апробирован метод выделения ассоциативных азотфиксирующих бактерий из корневой зоны небобовых растений. Предложен .метод химической стерилизации поверхности корней пшеницы для выделения инфицирующих форм бактерий.

3. Впервые из корней пшеницы выделены азотфиксирую-щие бактерии Agrobacterium radiobacter. Установлено, что нитрогеназная активность штаммов этого вида бактерий индуцируется растением. Обнаружена способность A. radiobac-ter инфицировать корни пшеницы.

4. Установлены ранее не описанные ассоциативные взаимоотношения сахарол'итнческих азотфиксирующих бактерий рода Clostridium с гексаплоидной пшеницей. Разработан метод доказательства ассоциативных взаимоотношений диазо-трофных бактерий с небобовыми растениями.

5. Максимальная численность диазотрофных бактерий .различных физиологических групп (аэробов, анаэробов, мик-роаэрофиллов) наблюдается -в период интенсивного роста пшеницы. Наиболее заселена бактериями-диазотрофами дона

ризосферы пшеницы, где преобладают аэробные бактерии. В составе популяции диазотрофных бактерий, функционирующей на корнях пшеницы, обнаружены представители родов: Agrobacterium, Azospirillum, Azotobacter, Clostridium.

6. Впервые предложено деление процесса образования ассоциативного рнзоценоза па ряд последовательных этапов и разработана система оценки эффективности взаимодействии диазотрофных бактерий с .небобовыми растениями на оснопе количественных оценок каждого эгама образования ассоциации.

7. В условиях гнотобиотического опыта установлено статистически достоверное (при р<0,5) увеличение веса корня и надземной части пшеницы после инокуляции чистыми культурами диазотрофных бактерий, выделенных из корней пшеницы (Agrobacterium radiobacter штамм 5 Д-1 и неиден-тифицированного штамма 56 Д).

8. Выделенные штаммы бактерий .могут быть использованы как объекты для генноинженерных работ по созданию высокоэффективных ассоциативных бактерий для пшеницы. На основе выделенных штаммов азотфиксирующих бактерий возможно создание бактериальных препаратов, повышающих продуктивность пшеницы.

. В практику селекционной работы с пшеницей можно рекомендовать использование теста на nis-признак при создании сортов пшеницы, обеспечивающих часть своих потребностей в азоте за счет биологической азогфиксации.

На основании разработанных принципов оценки эффективности взаимодействия растений и микроорганизмов возможен поиск и создание высокоактивных азотфиксирующих ассоциаций.

Список1 работ, опубликованных по теме диссертации

il. Чумаков М. И. Динамика численности анаэробных азотфик-сирующих бактерий рода Clostridium каштановых почв Заволжья в условиях орошения// Физиолото-бивхимические исследования растений и микроорганизмов,— Изд. СГУ. Саратов.— 19Й2.— С. 257.

2. Чумаков М. И. Воздействие различных факторов на нитроге-назную активность теммо-каштановой почвы Заволжья в условиях лабораторного опыта//Микроорганизмы, их роль в повышении плодородия почв и охране окружающей среди/М.: 1935.— С. 26—31.

Л. Чумаков 'М. И., Емцсв В. Т. Модификация определения нитрогеназной активмости почвы ацетиленовым методом в услозиях ана-эробиозе//Изв. ТСХЛ.—1985,— вып. 2.—С. 190—192.

4. Чумаков М. И., Иванова Л. Ю. Анаэробные азотфнкеиру-ющиа бактерии рода Clostridium в прикорневой зоне пшеншщ//Достиже-ния микробиологии—практике. Тез. докл. VII съезда Всес. микробиол. общ.—Алма-Ата, 19&5.—Т. 6 —С. 93.

5. Иванов Н. П., Чумаков М. И. Динамика, численности азот-фиксирующих бактерий каштановых почв п условиях орошения // Вопросы

.биохимии и физиологии микроорганизмов/Изд. СГУ. Саратов.— 1966.— №.10.—С. 9—14. "

6. Чумаков М; И; Иванова Л. Ю., Емцев В. Т. Ассоциативные взаимоотношения сахаролитических Clostridium с яровой пшени-цей//Микроорганизмы в сельском хозяйстве. Тез. докл. III Всесоюз. науч. конф./ Изд. МГУ, М,— 1986.— С. 93..

7. Чумаков М. И., Иванова Л. Ю., Брук М. Х„„ Котляр Л. Е„ Емцев В. Т. Ассоциативные взаимоотношения между азотфик-сирующими бактериями рода Clostridium и яровой пшеницей // Изв. ТСХЛ.—1986 —вып. 6. —С. 122—128.

•в. Чумаков М. И, Иванова Л. Ю., Е.чцев В. Т. Модифицированный метод выделения ассоциативных азотфикс1грующмх бактерий из корней злаков//Изв. ТСХА,— 1937.— вып. 3. —С. 'ИЗ—115.

9. С h u in а с о v M. I., . I v a n о v a L. Y u., Eratsev V. Т. Complex test for evaluation of associatioties of nitrogen-fixing bacteria isodated from rhizoplane of spring wheat//Proc. Int. Symp. «Interection-ships between microorganisms and plant in soil/Libce, Chechoslovakia. — ' 198. — P. 56.

ДО. Емцев В. Т., Чумаков М. И., Брук М. X. Комплексный тест для определениял ассоциативности аэогфикеирующих бактерий // Сим-биотрофные азотф.и'ксафоры и их использование в сельском хозяйстве. Тез. докл. респ. конф., Чернигов.— 1987.— С. 53.

•11. Емцев В. Т.. Чумаков М. И. Критерии для определения ассоциативности азотфиксирующих бактерий, находящихся в диазотроф-ном биоценозе с небобозыми растениями//Микробиол. ж.— 1988.— Т. 50.— N° ,3.—С. 93.—102.

;1(2. Чумаков М. И. Распространение признака ассоциативной азог-фиксации (nis) сред» представителей рода Triticum LJ/ .Микроорганизмы в сельском хозяйстве. Тез. докл. респ. конф.— Кишинев.— 198в.— С. 1.18— 130.

13. Чумаков М. И., Емцев В. Т. Формирование азогфиксд-рующей ассоциации бактерий с небобовыми растениями // С.-х. биология.— 1.938.— № 6, — С. 50—57.

ili4. Чумаков М. И. Рать генотипа пшеницы в формировании азот-фиксирующей ассоциации в прикорневой зоне//Изз. ТСХАглвыл. 4.— С. 60—65.

15. Е m ts e v V. Т., Chumacov M. I. Effect of wheat genotype on associative N2-fixation//7-th Int. Congr. N'itr. Fix.-Koln (Cologne).— 1988. — Abstr. 6-40.

16. Chumacov M., Bruok M., Enitsev V. T. Associative symbiotic N,-fixing microorganism from root zone of spring \vheat//6-th Congr. FESP. — Split, 1988.—Abstr. 11—05.

17. Emtsev'V. Т., Chumakov M. I. Influense of non-legume genohype on associative nitrogen fixation//6-th Congr. FESP—Split, 1988.— Abstr. 11-08.

Л 38817 12/XII-88 г. Объем! п. л.

Тираж 100

Заказ 2819.

Типография Московской с-х. академии им. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44

Бесплатно