Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм по ассоциативной азотфиксации у ячменя

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм по ассоциативной азотфиксации у ячменя"

академия наук ссср сибирское отделэж

институт цитологам и генетики

полиморфизм по ассоциативной азошксации у ячменя

03.00,15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

степаненко

Ирина Лембитовна

УДК 631.523:631.527:633.16

Новосибирск - 1990

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО АН СССР, г.Новосибирск

Научный руководитель: член-корреспондент АН СССР

В.К.Шумный

Институт цитологии и генетики СО АН СССР, г.Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

с.н.с. И.Л.Клевенская Институт почвоведения и агрохимии СО АН СССР, г.Новосибирск

кандидат биологических наук с.н.с. Е.В.Левитес Институт цитологии и генетики СО АН СССР, г.Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт генетики и цитологии

АК БССР, г.Минск

Защита состоится "" 1990г. на (/т' ба/

заседании специализированного совета по зал^^е диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.П.01) при Институте цитологии и генетики СО АН СССР в конференц-зале Института по адресу: 630090 г.Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО АН СССР

Автореферат разослан "3 " Оён'У ^-У 1990 г. Ученый секретарь

специализированного совета у Ал,-?;

доктор биологических наук Н.Б.Христолюбова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность теш. Изучение биологической фиксации азота является в настоящее время одной из актуальных проблем биотехнологии в связи с необходимостью повышения плодородия почв . Выявление повышенного уровня азотфиксации, осуществляемой свободноживущими диазотрофами, в ризосфере небобовых культур, не имеющих специального симбиотического аппарата, привлекло усиленное внимание к изучению ассоциативных азотфинсирухщих систем. Интерес к ассоциативной азотфиксации обусловлен ее ролью в азотном балансе природных экосистем и перспективностью для сельского хозяйства. Введение в культуру злаковых, получающих даже часть азота в результате микробиологической азотфиксации и за счет энергии фотосинтеза, имеет большое значение, поскольку такой способ обеспечения растений азотом сулит не только немалые экономические выгода, но и является экологически чистым.

Интенсивные исследования ассоциативных азотфиксирующих систем начались в последние 10-15 лет. Выяснены многие экологические, биохимические, физиологические факторы формирования и эффективной деятельности таких комплексов, но растению как компоненту ассоциативных азотфиксирующих систем до сих пор уделяется недостаточно внимания, причем наименее изучены генетические аспекты проблемы. Накоплен довольно обширный материал относительно высокой вариабельности нитрогеназной активности в ризосфере сортов и видов различных культур (Уове , Еизс11е1,1981). Способность растения влиять на формирование эффективного азотфиксирующего комплекса и поддерживать процесс азотфиксации определена как признак п±э (Ке1ш1е,1981).

По мнению многих авторов (Бопшэ^иез, 19?8; Но11,1933! Уове,1983 } селекция растений по способности поддерживать рост и активность азотфиксирующих бактерий является наиболее простым и доступным способом повышения продуктивности ассоциативных систем, что и подтверждает успешная селекция по этому признаку кукурузы и пшеницы. Всего за пять поколений удалось повысить активность азотфиксации в пять-десять раз ( Е1а еЪ а1,1982- Х1пЫап еЪ аХ, 1985 ), что показывает определяющую

роль генотипа растения в образовании эффективной ассоциации. Однако известно лишь несколько работ, посвященных изучению характера наследования признака nis у риса и проса ( lyama et al.,1983} Bouton et al. ,1985; Manga et al. ,1985 ). Очевидно, что для селекции растений по nia необходимо знание генетики этого сложного количественного признака, что требует создания моделей, и, в первую очередь, выбор модельного объекта для генетических исследований.

Цель н задачи исследований. Целью данной работы было изучение полиморфизма по ассоциативной азотфиксации у ячменя и генетического контроля признака nis. Б работе ставились следующие задачи:

1, Провести скрининг сортов ячменя Hordeum vulgare , а также некоторых дикорастущих видов по нитрогеназной активности в ризосфере.

2, Исследовать коллекцию индуцированных мутантов ячменя в от-И0Е6ШШ способности подцернивать рост и активность азотфикси-рущнх бактерий.

3, Выявить линии, контрастные по nis, и изучить механизм, обеспечивающий высокий уровень нитрогеназной активности в ризосфера.

4, Провести генетический анализ признака ais.

5, Изучить совместное наследование генов ais с хромосомными маркерами.

Научная новизна. В данной работе впервые:

- изучена изменчивость по признаку ais у ячменя и выявлены 40-кратные различия по активности азотфиксации в ризосфере сортов Н.vulgare;

- показано, что активность ассоциативной азотфиксации в ризосфере растений, мутантных по нитратредуктазе, выше, чем у исходного сорта;

- исследован механизм, обеспечивающий высокий уровень нитрогеназной активности в ризосфере. Показано, что линии, контрастные по нитрогеназной активности в ризосфере, отличаются по способности специфически адсорбировать азотфиксирующие бактерии;

- показано, что высокая способнось поддерживать ассоциатив-

ную азотфиксацию у ячменя наследуется как рецессивный признак и контролируется несколькими генами. Выявлены два гена ais1 и та, , определяющие различия в способности поддерживать ассоциативную азотфиксацию, показан адцитивный эффект действия nis генов:

- изучено совместное наследование nis^ и nls? с генами Ъгг or, Lk, ua, К, в, о, г, х . По предварительным данным ret: nis1 сцеплен с геном ï ,

Практическая значимость. Выделенные линии с высоким значением признака nls могут быть использованы как доноры в селекцз: на повышение ассоциативной азотфиксацик. Апробация работы. Основные результаты были доложены на Республиканской конференции "Сикбиотрофнке азотфиксаторы н ее использование в сельском хозяйство", Чернигов, 1987 г. и на 5 съезде ВОГИС им.Н.И.Вавилова, Москва, 1987 г. Объем работы. Работа состоит из введения, обзора литература, материалов и методов, двух глав, в которых приведены результаты настоящего исследования, заключения, выводов и списке* цитированной литературы. Диссертация изложена на 125 печатных страницах, содержит 9 рисунков и 23 таблицы. Список литературы состоит из 122.работ.

Материалы и методы

Для изучения изменчивости по ассоциативной азотфиксацкл использовано 39 сортов Н. vulgare , II образцов дикорастущих видов ячменя H.narinum, H.murinun, H. geniculatua, Hi jubatuc, 35 линий мутантов ячменя, полученных на сорте Bonus > и 19 линий, гомозиготных по реципрокным транслокациям, полученных на сортах Bonus и Mars .

Растения выращивали в почве, в теплице, без дополнительного внесения минеральных удобрений. Почва серая лесная с добавлением торфа и песка. Для скрининга нитрогеназной активности анализировали по 25-30 растений из каждого сорта, линии. Гибриды выращивали в одинаковых условиях одновременно с родительскими линиями .

Изучение динамики нитрогеназной активности проводили в следующие фазы: при появлении 2 и 3 листа, в-фазу выхода в

трубку, в начале цветения, в фазу молочно-восковой спелости. Основные определения сделаны в начале цветения растений, когда пыльники становились желтыми.

Способность растений поддерживать ассоциативную азотфик-сацию определялась по суммарной нитрогеназной активности в ризосфере методом редукции ацетилена в модификации Умарова (Умаров, 1976) с использованием газового хроматографа ЛХМ-8ВД. Проводился контроль за эндогенным образованием этилена. Время инкубации образцов выбрано так, чтобы скорость редукции ацетилена была линейной, что соответствовало 24 часам.

Активность азотфиксации в ризосферной почве с корней контрастных по шб линий определялась изотопным методом с

(Клевенская и др., 1982). Численность диазотрофов устанавливали методом посева разведений почвенной суспензии на безазотную среду, биомассу микроорганизмов - модифицированным физиологическим методом ( Апйогвоп, Боазп,-1978).

Меченые бактерии неидентифицированного штамма 2044, выделенные из ризосферы высокоактивных по вАз линий ячменя, и коллекционного штамма Ааозр1гИ1и[п Ирогегиш 1519 получены на среде с добавлением ортофосфата (1,8 тС1/мл). Адсорбцию бактерий на корнях 10-дневных стерильно выращенных проростков ячменя определяли по методике (Gafny et а1.,198б). Адсорбционная активность корней определялась по соотношению радиоактивной метки, связанной на корнях, и оставшейся в бактериальной суспензии.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Скрининг сортов и некоторых видов ячменя по нитрогеназной активности в ризосфере

Для оценки пределов изменчивости по способности растений поддерживать ассоциативную азотфиксацию проведен скрининг 38 сортов ячменя, созданных в разные годы и различными методами, как местной селекции, так и присланных из других стран. Нит-рогеназная активность, определяемая по скорости восстановления ацетилена, в ризосфере ячменя варьировала в значительных -пределах от 0 до 500 нмоль ^Н^/(растение -час), тогда как активность азотфиксации образцов почвы без растений составляла

лишь 0,3 + 0,1 нмоль CgH^/Cr почвы-час).

По средним показателям нитрогеназной активности сорта Mona и Новосибирский I различаются в 40 раз и не имеют трансгрессирующих классов. Распределение сортов по способности поддерживать азотфиксацию бимодальное (рис.1).

число сортов

8

cl

20

60

100

г

п

140 220

нитрогеназная активность

Рис.1. Полиморфизм сортов ячменя по способности поддерживать ассоциативную азотфиксацию.

Выявлена высокая внутрисортовая изменчивость по nis» которая обусловлена как влиянием среды на проявление признака, так и генотипической неоднородностью сортов в отношении факторов, определяющих уровень нитрогеназной активности в ризосфере. Анализ гистрограмм распределений растений по нитрогеназной активности в ризосфере показал, что ряд сортов ячменя (Сибирский 2, Черноморец, Московский 121, Менкер) представлены одним биотипом, другие (Одесский 84, Черниговский 5, Олений 80, Новосибирский I) - двумя- тремя биотипами.

Судя по форме распределения (рис.1), высокая способность к азотфиксации в агроэкосистемах с внесением высоких доз азотных удобрений не дает каких-либо преимуществ и отбор по этому признаку не ведется. При поиске доноров высокой способности к азотфиксации мы обратились к дикорастущим видам ячменя, но все исследованные образцы H.marinum, H.murinum, H.genicu-latum, H.jubatum характеризовались низкой нитрогеназной активностью в ризосфере по сравнению с н.vulgare . Аналогичные результаты получены японскими исследователями при сравнении

2

культурного и дикорастущих видов риса С Sano et al.,1981 ). Анализ некоторых разновидностей н.vulgare показал, что высокоактивные образцы выявлены у palidum (к-11544), 6-рядного пленчатого ячменя. /

Скрининг сортов ячменя по способности поддерживать рост и активность азотфиксирующих бактерий показал, что генотип растения является одним из основных факторов, определяющих уровень ассоциативной азотфиксации. Однако высокая внутрисор-товая изменчивость по исследуемому признаку усложняет изучение генетики nis , так как возникает необходимость разлинеи-вать материал.

Нитрогеназная активность в ризосфере мутантов ячменя

Значительное генотипическое разнообразие по ассоциативной азотфиксации выявлено при анализе коллекции морфологических мутантов ячменя. Средние показатели нитрогеназной активности в ризосфере различных линий находятся в пределах от 25 до 145 нмоль CgH^/(растение-час). Активность азотфиксации ниже, чем у исходного сорта Bonus , определена в ризосфере мутанта int-a2, а максимальная активность- у эректоида ert-Ъ^ .

Наличие в коллекции линий ячменя, несущих ревдпрокные транслокации, позволило увеличить разнообразие анализируемых генотипов. Пределы изменчивости нитрогеназной активности линий Bonus , несущих транслокации, не отличаются от указанных выше у мутантов. Все линии с транслокациями сорта Mars, кроме Т1-6а, характеризовались высокой нитрогеназной активностью в ризосфере. Максимальная активность около 200 нмоль С£Н^ определена в ризосфере линий TI-6d и Т3-4Ь .

Мутантные- растения с пониженным уровнем нитратредуктаз-ной активности, не способные получать азот из почвы в виде нитратов, могут служить моделью для изучения ассоциативной азотфиксации. На ранних стадиях развития растений (4 листа) нитрогеназная активность в ризосфере Хло 19 (Токарев, Шумный, 1977) ниже, чем у Винера, но уже к цветению активность азотфиксации в два раза выше в ризосфере мутанта по сравнению с исходным сортом (Р>0,39). Обеспечение повышенного .уровня нитрогеназной активности в ризосфере мутанта по нитратредуктале,,

возможно, позволяет растениям в условиях азотного голодания выживать и давать потомство. Механизм этого процесса требует дальнейшего изучения и, по-видимому, связан с уровнем корневой эксудации растений.

Характеристика линий, контрастных по способности поддерживать ассоциативную азотфиксацюо

Для дальнейшего анализа из 46 исследованных линий были отобраны по три линии с низкой и высокой нитрогеназной активностью в ризосфере. Данные линии достоверно различаются по ш-з (Р>0,999), что наиболее отчетливо выявляется при изучении динамики нитрогеназной активности в онтогенезе растений.

Таблица I

Динамика нитрогеназной. активности в ризосфере мутантов ячменя в течение вегетационного периода

Линия Нитрогеназная активность (нмоль С^^/ (раст. • час)

3 листа выход в трубку цветение

Огог 2,3 + 1,6 2,5 + 0,8 63,1 + 11,3

ЬкЬк 5,5 + 3,1 2,9 + 0,8 63,7 + 8,2

егЬ-с^У 5,5 + 3,1 4,1 ± 1,6 73,8 + 12,6

Т1-За 168,1 + 19,7 141', 9 + 22,2 106,0 + 10,7

Т3-5Ъ 131,6 + 18,0 86,5 + 14,1 154,1 + 12,8

Т1-6<1 134,4 + 14,3 174,2 + 29,2 192,4 + 24,6

Линия Т1-6с1 отличается высокой активностью в течение всего исследуемого, периода, что едва ли можно связать с уровнем корневой эксудации, которая, как известно, постепенно нарастает с возрастом растения, достигая максимума в период цветения (Уап5ига,1988).

Изотопным методом с использованием показано, что активность азотфиксации в ризосферной почве с корней мутантов Огог, ЬкЬк, етЬ-с^У в 5-6 раз ниже, чем в ризосфере линий с высокой активностью, отобранных методом редукции ацетилена.

На следующем этапе исследований двум линиям: низкоактив-

ной по шз линии Огог и высокоактивной Т1-6<а дана более подробная микробиологическая характеристика ризосферы. Определены показатели нитрогеназной активности различных зон ризосферы, численность и биомасса микроорганизмов, а также рассчитана продуктивность азотфиксации по отношению к биомассе микробов. Показано, что различия в нитрогеназной активности сравниваемых линий-распространяются и на зону ризопланы, где формируются наиболее тесно взаимодействующие ассоциации. Нитро-геназная активность в ризоплане Огог составляет лишь 12% от активности ризосферы, тогда как у Т1-6(1 ее доля возрастает до 34&. Более того, численность диазотрофов в ризосферной почве линии, характеризующейся высокой нитрогеназной активностью, в два раза выше (Р>0,95) на фоне незначительных, различий в общей биомассе микроорганизмов в ризоценозах контрастных линий (табл.2).

Таблица 2

Микробиологическая характеристика ризосферы

контрастных линий ячменя

Показатели Огог Т1-6й

Нитрогеназная активность в 0,91 + 0,24 3,70 + 0,96 ризосфере, мкмоль С^Н^/(г корня- час)

Численность диазотрофов в 11,4+0,7 20,3 + 1,6 ризосфере, млн/г почвы

Продуктивность азотфиксации, 0,53 1,37

мкгн /иг С

Эти данные позволяют предположить, что различная азот-фиксирующая активность в ризосфере сравниваемых линий ячменя может быть обусловлена не только различиями в энергетическом обеспечении процесса азотфиксации за счет большего вццеления субстратов для диазотрофов или создания благоприятных условий для протекания процесса связывания молекулярного азота, но и существованием специфических факторов, способствующих аттрактации и размножению азотфиксаторов в ризосфере Т1-6а .

Использование ^Р меченых бактерий позволило определить

адсорбционную активность корней 10-дневных проростков линий Т1-64 иОгог, выращенных в стерильных условиях. Для изучения специфичности взаимодействия с растениями использовано два штамма азотфиксирующих бактерий различного происхождения. Из таблицы 3 можно заключить, что специфичность взаимодействия существует: адсорбция бактерий штамма 2044, выделенных из ризосферы И-6<1 , в два раза выше на корнях Т1-6а по сравнению с низкоактивной линией Огог. Связывание азоспирилл, редко встречающихся в данных условиях, выше на корнях Огог.

Таблица 3

Адсорбционная активность корней контрастных по п1з линий ячменя

Линия .адсорбционная активность

Шт.2044 Шт.1519

Огог : 0,324 1,233

0,696 0,818

T1-6d + корневой экстракт 0,464 0,896

T1-6d + корневой экстракт + 0,841 0,833 ■- трипсин

Добавление корневого экстракта в суспензию меченых бактерий приводило к снижению адсорбционной активности корней Т1-ба в отношении штамма 2044, тогда как обработка трипсином корневого экстракта восстанавливала адсорбционную активность корней Т1-бй . Можно предположить, что корневой экстракт

содержал белок, специфически связывающий бактерии штамма 2044, что и приводило к ингибированию их адсорбции на корнях.

Полевые опыты показали, что сравниваемые линии достоверно различаются по ш-б, но нитрогеназная активность в ризосфере растений в поле ниже, чем в условиях теплицы.

Таким образом, выделены линии ячменя, различия между которыми состоят в способности селективно адсорбировать азотфиксирующие бактерии и обеспечивать их размножение, и предложена модель для изучения характера наследования способности растений поддерживать ассоциативную азотфиксацию.

Гибридологический анализ признака у ячменя

Для анализа наследования признака п±б у ячменя скрестили по диаллельной схеме линии с низкой активностью нитроге-назы в ризосфере (Огог, 1кЬк ) с линиями, обладающими высокой активностью, и получили гибриды первого и второго поколений (табл.4).

Таблица 4

Нитрогеназная активность в ризосфере контрастных по о^э линий и их гибридов и ?2

Родители, гибриды Нитрогеназная активность, Число

нмоль С^Н^/(растение-час) растений

средняя дисперсия

Огог 58,9 + 3,3 16,1 29

ЬкЬк 58,7 + 6,0 26,0 • 19

Т3-5Ь 146,7 + 13,2 51,1 15

Т1-ба 192,4 + 7,6 34,7 21

г1(ЬкЬ1с х Огог) 68,1 + 4,4 25,1 32

Г2(Щк х Огог) 61,3 + 2,8 27,8 207

г1(ЬкЪк х Т3-5Ъ) 60,7 + 6,6 42,0 40

Р1(ТЗ-5Ъ х ЬкЬк) 68,9 + 7,6 41,6 30

х ЬкЫс) 88,6 + 5,8 102,0 313

^(Огог х Т1-6<1) 118,7 + 7,3 43,6 36

В,1(Ш1-бй х Огог) 115,7 + 8,3 32,2 15

Р2(Т1-6й х Огог) 99,5 + 3,9 61,8 251

'г1(ТЗ-5Ъ х Т1-6с1) 59,2 + 10,8 • 43,1 16

Е2(ТЗ-5Ъ х Т1-6<1) 134,2 + 4,9 68,6 198

В ризосфере гибридных растений от скрещивания линий с

низкой способностью к азотфиксации как в первом, так и во втором поколении нитрогеназная активность низкая и совпадает по средним значениям с активностью в ризосфере родительских форм, и выщепления новых вариантов не наблюдается.

Результаты анализа потомства от скрещивания контрастных линий ЫсЦс и Т3-5Ъ оказались неожиданными. Гибриды первого

поколения характеризовались низкой, как у т,ут.|г , активностью, что не свойственно наследованию количественных признаков, контролируемых полигенной системой. Анализ реципрокных скрещиваний показал, что высокая способность к азотфиксации контролируется рецессивными ядерными генами. Распределение растений ?2 по способности поддерживать ассоциативную азотфикса-цию можно представить как сумму двух распределений со средними значениями 60 и 140 нмоль С^ (рис.2). " ' - - тз-5Ь

У 10

20 10

50

30 10

^ГП г-П-т-

ьыл

Рис.2. Распределение по Т3-5ь , ишс и их потомства Рр р£. По оси у отложено число исследованных растений, по оси х -нитрогеназная активность в ризосфере (нмоль С^Н^/рас-тение-час).

тгтн

20 80 140 х

Гибриды Рг,, относящиеся к первому распределению характе- . ризуются такой же нитрогеназной активностью, как ысЬки гибриды , а входящие в состав второго, не отличаются по активности от Т3-5ъ . Если считать растения с активностью в ризосфере свыше 120 нмоль С^Н^ гибридами с высокой способностью поддерживать азотфиксацию, то для данной комбинации расщепление по паэ 229:84 можно описать как моногибридное (^=0,56) Тогда различия в способности к азотфиксации линий Т3-5ъ и ЬкЬк контролируются двумя аллелями одного гена, который обозначим гае , а высокая способность поддерживать азотфиксацию определяется рецессивным аллелем.

Анализ потомства от скрещивания другой пары линий Т1-6<1 и Огог показал, что в первом поколении реципрокные гибриды не отличаются между собой, но характеризуются средней по отношению к родительским линиям активностью. Распределение по шз во втором поколении симметричное, а соотношение классов,

1

характеризующихся низкой, как у игог, средней, как у гибридов Рр и высокой, как у Т1-66. , активностью в ризосфере соответствует 58:136:57, что близко к 1:2:1 (^С2=1,77). Безусловно, высокая способность поддерживать ассоциативную азот-фиксацию линии Т1-6а может определяться не одним геном, а комплексом тесно сцепленных генов, либо одним главным геномг в любом случае мы будем видеть моногибридное расщепление. Кроме того, получены гибриды между линиями с высокой нитрогеназной активностью в ризосфере Т1-6& и Т3-5ъ(табл.4). Нитрогеназная активность в ризосфере гибридов Р^ от данного скрещивания низкая, что свидетельствует, по крайней мере, о паре неаллельных генов, определяющих признак у ячменя. Во втором поколении нитрогеназная активность в ризосфере в среднем высокая, но при анализе ?2 выявляются как неактивные варианты, так и растения с высоким выражением признака(рис.З), превышающим значение этого показателя у родительских линий, У

Ю "I 10

10 50

30 10

л

Т3-5Ъ

ц-ба.

о_

Цття-п

Рис.3. Распределение по п1з Т1-ба , Т3-5Ъ и их гибридов Рр оси у отложено число .исследованных растений, по х - нитрогеназная активность (нмоль Сг,Н4/рас-тение-час).

40 200 360

600

.Все гибридное потомство можно разделить на три класса: растения с низкой, высокой и очень высокой нитрогеназной активностью в ризосфере, соотношение которых 110:78:10, что можно рассмотреть как дигибридное расщепление 9:6:1 (£^=0,66). Отметим, что растений с активностью в ризосфере до 640 нмоль С^Н^ нам не удавалось выявить раньше при анализе сортов и мутантов ячменя. По-видимому, в данном случае наблюдается аддитивный эффект генов, определяющих высокий уровень нитрогеназ-

Е

А

кой активности в ризосфере родительских линий, который выражается в появлении растений с очень высоким значением гия, двойных рецессивных гомозигот по пае .генам.

На основании генетического анализа можно заключить, что способность поддерживать ассоциативную азотфиксацию у ячменя контролируется несколькими генами. Два неаллельных гена гаэ^ и п±з2 определяют высокую нитрогеназную активность в ризосфере линий Т1-ба и Т3-5ъ .

Обнаружение совместного наследования маркерных моногенных признаков с признаком п!э значительно облегчило бы дальнейшее исследовздие, поскольку тогда можно " следить за интересующим нас геном трансгрессивного действия по альтернативному фену его соседа" (Серебровский, 1970) и отбор на погашение ассоциативной азотфиксации вести по маркеру.

^аблица 5

Распределение в Р9 генов пхб и хромосомных маркеров

Пары генов | Фенотипы х Критерий ^С ^ Число

- У 1 ХУ Ху хУ ху x У растений

ш-б,, Ьг 105 36 33 II 0,13 0,09 0,34 185

ог 152 41 47 10 0,64 2,78 3-,62 250

гаэ^ иг 63 17 15 8 0,01 0,15 2,16 107

гав^ ъ 81 22 29 5 0,15 2,04 2,66 137

п±б„ хп 40 19 21 0 0,07 0,07 8,82 80

о 72 19 20 8 0,12.. 0,33 1,17 119

ш.б,, г 78 26 27 10 0,11 0,01 0,20 141

па ¡32 Ьг 103 28 34 15 0,48 0,83 2,26 180

1к 169 60 64 20 0,56 0,04 0,08 313

хаб2 иг 121 33 45 8 0,04 2,97' 3,91 207

паз2 к 58 17 20 5 0,70 0,48 1,07 120

ш-б^ Ь 30 6 12 4 0,92 0,79 2,21 51

пхз2 хп ' 20 5 7 3 0,24 0,08 1,43 35

П1в2 о 52 22 18 4 0,22 0,22 1,63 96

иаб2 г 52 21 17 5 0,22 0,77 1,18 96

Примечание, х - табличное значение^^=3,84 для£ =1 и ¿§5=7,81 для £ =3,

Линии Т1-6а и Т3-5ъ скрестили с линиями ячменя, имеющими гены-маркеры по I хромосоме- Ъг, П-ог, Lk, III- uz, П- к , ï-B, о, 211- г, и получили гибриды второго поколения,

на которых был проведен анализ совместного распределения в F? nis генов и хромосомных маркеров. При анализе гибридов Fj> выделяли 4 класса растений в зависимости от уровня нитрогеназ-ной активности в ризосфере (низкий, высокий) и фенотипа по маркеру. Соотношение этих классов соответствовало 9:3:3:IS что подтверждает значение^С^ для ху, кроме генов nis1 и xn , для которых не проходит гипотеза о независимом наследовании. Следовательно, можно предположить, что ген nis^, определяющий высокую способность поддерживать ассоциативную азотфиксацию, и ген ^наследуются как сцепленные. Частота рекомбинации между ними составляет 0,15 + 0,10', высокое значение ошибки обусловлено тем, что гены находятся в "фазе отталкивания"

Линия Т1-6а несет транслокацию по I и YI хромосомам в районе между генами о и х , что привело к изменению сцепления генов. Ген XR у растений TI-6d находится на коротком плече I хромосомы, а ген вг на длинном плече YI. Если предположить, что ген сцеплен с nis,, > и оба гена находятся в первой группе сцепления, а ген uis^ , определяющий низкую способность поддерживать азотфиксацию линии Хпхп , наследуется независимо от х » то во втором поколении должно быть 9 различных генотипов и 4 фенотипических класса, теоретически ожидаемое соотношение которых 9:3:4:0. Расщепление в Fg по данной паре признаков (табл.5) соответствует теоретически ожидаемому уС =1,66) с вероятностью Р>0,95. Следовательно ген ds^Haxo-дится в первой группе сцепления ячменя.

Для гена -nis2 определяющего высокую нитрогеназную активность в ризосфере Т3-5ъ , не обнаружено сцепление ни с одним из выбранных маркеров (табл.5). Анализ Fg показал отсутствие сцепления nisg с геном ъ .

Заключении

По-видимому, существует, по крайней мере, два механизма обеспечения высокой нитрогеназной активности в ризосфере растений. I.Выделение в ризосферу большего количества углеродсо-держащих веществ. Признак nia в данном случае будет контро-

дироваться полигенной системой," и характерной особенностью будет увеличение численности ризосферной популяции. 2.Увеличение доли диазотрофов при той же численности популяции. В данном случае высокая активность азотфиксации в ризосфере мо-?.ет определяться небольшим числом генов, ответственных за узнавание и преимущественное размножение азотфиксирующих бактерий. Отметим, что последний механизм наиболее эффективен, поскольку позволяет повысить активность азотфиксации без энергетических потерь, которые сказались бы на продуктивности растений.

*ЧВ0ДН

■, Анализ активности ассоциативной азотфиксации методом редукции ацетилена показал, что нитрогеназная активность в ризосфере ячменя (род Ногйеиш ) варьирует в пределах от 0 до

500 нмоль CgH^/(растение.час), что на два порядка превышает уровень активности свободнояивущих азотфиксаторогз в почве. '<\ Проведено изучение полиморфизма по способности растений поддерживать ассоциативную азотфиксации у дикорастущих и культурного видов рода Hordeum:

d./исследованные образцы дикорастущих видов ячменя H.maxi-аит, H.murinum, H.genioulatum, H.jubatuo характеризуются низкой нитрогеназной активностью в ризосфере и незначительным разнообразием по признаку Bis;

5) при скрининге сортов Н.vulgare обнаружен полиморфизм по ассоциативной азотфиксации, сорта Мова и Новосибирский I различаются в 40 раз по исследуемому признаку. 2. Значительный спектр изменчивости по ассоциативной азотфиксации выявлен при анализе коллекции мутантов ячменя. Максимальная активность определена у линий с реципрокными трансло-чациями, полученными на основе сорта Mars. 4. Показано, что мутанты с-пониженным уровнем нитратредуктаз-

ной активности, не способные получать азот в виде нитратов, характеризуются высокой по сравнению с исходным сортом нитрогеназной активностью в ризосфере.

.:. Исследован механизм, обеспечивающий высокий уровень ассоциативной азотфиксации в ризосфере. Показано, что высокая

нитрогеназная активность в ризосфере линии Т1-64 связана с возрастанием доли диазотрофов в составе ризосферной популяции. Линии Т1-6а и огог . контрастные по нитрогеназной активности в ризосфере, отличаются по способности специфически адсорбировать азотфиксирующие бактерии,

6. Гибридологический анализ потомства от скрещивания линий с низкой и высокой способностью поддерживать ассоциативную азот-фиксацию показал, что высокая способность наследуется как рецессивный признак и контролируется несколькими генами. Два неаллельных гена, обозначенных нами и±з1 и ш.б2 , определяют высокий уровень нитрогеназной активности в ризосфере линий Т1-ба. и Т3-5ъ , соответственно. Наблюдается аддитивный эффект действия п1з геновс

7. Изучено совместное наследование газ^ и ш.е2 с генами Ъг, ог, иг, к, ъ, о, хд, г . По предварительным данным ген гйа^ сцеплен с геном с

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Степаненко И.Л., Родынюк И.С., Шумный В.К. Азотфиксирую-щий потенциал ризоценозов мутантных форм ячменя// Изв.Сиб.Отд. АН СССР.Сер.Биол.Науки.-1989.-Вып.I.-С.6-1I.

2. Степаненко И.Л. Скрининг сортов ячменя по нитрогеназной активности в ризосфере// Частная генетика сельскохозяйственных растений.- Новосибирск, 1989.-(Сб.научн.тр.ИЦиГ).-С.50-58,

3. Степаненко И.Л. Наследование способности ячменя поддерживать ассоциативную азотфиксацию в ризосфере// Тез.Респ.конф. "Симбиотрофные азотфиксаторы и их использование в сельском хозяйстве',' Киев.-1987.-С.76-77.

4. Родынюк И.С., Степаненко И.Л., Шумный В.К. Генетический аспект азотфиксации в ризосфере представителей рода Ноп1еип: . // Тез.5 съезда ВОГиС, Москва.-1987.-Т.4, 4.2.-С.124.