Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аспекты взаимодействия клеток высшего растения и синезеленых водорослей при совместном культивировании

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Аспекты взаимодействия клеток высшего растения и синезеленых водорослей при совместном культивировании"

?Г6 ОД

. - АКАДЕШЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ БОТАНИКИ им. Н.Г.ХОЯОДНОГО

На правах рукописи

КАМАЛОВА Светлана Васильевна

АСПЕКТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КЛЕТОК ВЫСШЕГО РАСТЕНИЯ И СйНЕЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ ПРИ СОВМЕСТНОЙ КУЛЬТИВИРОВАНИИ

03.00.05 - Ботаника .

Авгорефера* дассвр®ацйн на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Киев - 1993

Работа выполнена в отделе клеточной биологии и анатомии Института ботаники им. Н. Г. Холодного АН Украины

Научный руководитель : доктор биологических наук,'

профессор Е. Л. Кордом

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Л, А. Сиренко

доктор биологических наук, Н. В, Коццратьева Ведущая организация: Ботанический институт имени

В. Л. Комарова РАН .

Защита состоится "<££2 " _ 1993г.

в /2 часов на заседании специализированного совета Д. 0.16.52.01 в Институте ботаники им. Н. Г. Холодного АН Украины по адресу: 252601 - ГСП - I, ул. Терещенковская, 2;

С диссертацией и опубликозаными работами можно ознакомиться в библиотеке Института ботаники им.Н.Г. Холодного АН Украины /г. Клев, ул. Большая Житомирская, 28/.

Автореферат разослан " " а 1993г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических: наук

. 11 7 ^ И. Л. Нав ро цкая

и'

ВСТУПЛЕНИЕ

В настоящее время в самостоятельную область исследований выделена экспериментальная симбкология, в задачи которой входит: изучение роли симбиоза в эволюции клетки и организма; факторов, обеспечивающих объединение особей в симбиоз; возможности возникновения симбиотических отношений в природе de novo и создание искуственных ассоциаций, обладающих полезными свойствами, в частности способностью к аэотфиксации /Бутенко , 190? /.

В качестве партнеров азотфиксаторов весьма перспективны синезеленые водоросли, которые одновременно являются азот-фиксаторами и фитосинтетиками, вццеляют в окружаодуто среду биологически актианые вещества /Сиренко, 1986/, образуют ассоциативные и симбиотические связи с высшими растениями различных таксонов, где обеспечивают партнера связанным азотом / Rai, 1990/.

Интенсификация работ по экспериментальному симбиогенезу мезду высшими растениями и синезеленкш водорослями в условиях in vitro требует выявления факторов, яэляющйхся опре- . делягщими при установлении взаимодействия мевду партнерами. Дня расширения видового спектра внешх растений к азотфик-сирущик синезеленнх водорослей необходимо прогнозирование их совместимости как партнеров, 'в перспективе создания искуственных ассоциаций.

3 связи с этим, необходимо изучение морфологических-особенностей синезеленых водорослей, перспективных для создания искуственных ассоциаций, выявление изменений, происходящих при совместном культивировании с клетками высшего растения, определение общих морфологических особенностей, характеризующих эффективность взаимодействия партнеров в искуственной азотфиксирующей ассоциации.

Цель и задачи исследований. Основной целью данной работы является изучение морфологических особенностей и интенсивности роста аоотфинсирующего вица Cyanophyta в монокультуре и при выращивании его совместно с каллусами и проростками покрытосеменных растений при различных условиях выращивания с применением методов светой и электронной микроскопии. • При •

атом были поставлены следующие задачи:

I/ изучить особенности совместного роста Lycopersicon peru -'vianun Mill, и 12 сортов L.esculentum Mill, с двумя видами синезеленых водорослей /Anabaena thermalis vouk И Nostoc calcicola Вгёь. /, отобрать партнеров для экспериментальной системы "клетки несимбиологического высшего растения-азот-фиксируюшая синеэеленая водоросль" с учетом видовых и сортовых отличий партнеров, с применением методов культуры клеток и Тканей; 2/ изучить морфологические особенности и рост партнеров, отобранных для модельной системы в монокультуре в условиях интенсивного выращивания;3/ сравнить интенсивность роста и морфологическую изменчивость синеэеленой водоросли, отобранной в качестве партнера для модельной системы "высшее растение - Cyanophyta " в монокультуре, модельной системе и при вырдшчвании с проростками различных видов прокрытосеменных растений; 4/ оптимизировать условия совместного выращивания партнеров в модельной системе; 5/ изучить рост и морфологическую изменчивость клеток покрытосеменных растений и сине-зеленых водорослей в модельной системе при совместном их выращивании в оптимизированном режиме.

Впервые для изучения возможностей создания искуственной ассоциации "высшее растение- азот-фяхснрующая синеэеленая водоросль" в качестве партнеров исследованы виды рода Lycopersicon Mill./2 вида и 12 сортов/ и аэотфиксирующая синеэеленая водоросль Anabaena thermalis выделенная из зон обрастания растений риса Юкного Вьетнама. Для a. theraaiisвпервые составлено описание аксенически чистой культуры, которые наряду- с данными-о морфологических особенностях вцца, полученных с помощью световой микроскопии содержат также сведения установленные с помощью электронной микроскопии.

Впервые для L.esculentum / вида в природе не образующего симбиоз с синезелеными водорослями/ при совместном культивировании с A.thermalisвыявлена зависимость роста каллуса от сортовой принадлежности вида, а также от вида водоросли.

Установлена возможность получения ряда симбиоз-специфических признаков, характерных для аэотфиксирующего синциано-

за, в модельной системе каллус несимбиотического высшего рао-

теНИЯ - Anabaena theriaalia.

Разработан оптимизированный режим подготовки и совместного культивирования каллуса Lycopersicon esculentum Anabaena therraalis . Впервые получены данные о влиянии различных концентраций соединений Мп и ¿л , а также /-облучения на характер взаимодействия мезду клетками высшего растения и синеэеленымк водорослями.

Ü2522£ÜÜSa_^ морфологические особенности Anabaena thernalia vouk , выделенной из зон обрастания растений риса и исследованной нами в аксенической культуре при выращивании в монокультуре, модельной системе и с проростками L.eseulentura, Medicogo sativa L. и Oryza sativa L. принципиально не отличаются от описанных для этого вида, однако не совпадают с установленными для какой-либо из ее форм. Уровень вариабельности значений исследованных признаков синеэеленых водорослей возрастает при совместном выращивании с проростками и каллусом высших растений; 2/ степень изменчивости скорости роста и ультраструктуры синеэеленых водорослей и клеток высшего растения при совместном выращивании определяется видовой и сортовой принадлежностью парт- -неров, способами их культивирования и возрастает при использовании каллусных клеток высших растений; 3/ к числу факторов, селективно регулирующих рост партнеров в искуственной ассоциации можно отнести содержание питательных веществ в среде /"критическими" являются концентрации соединений азота марганца и цинка/ /оба партнера/, угнетение партнера у-облу-чением /5 Гр/,/макросимбионт/; отсутствие света и адаптация к содержанию сахарозы в среде/микросимбионт/; 4/ изученная модельная система каллус Lycopersicon esculentum - Anabaena thermalis Vouk при выращивании в оптимизированном режиме выявляет сходство с природными синцианозами, которое выражается в усилении интенсивности образования гормогониев, накоплении слизи в местах скопления водоросли, адгезии их к клеткам высшего растения, усиления полиморфизма клеток сине-зеленых водорослей, эффотаа угнетения роста партнеров высокими концентрациями связанного азота в среде.

Л?нные> полученные при изучении взаимодействия каллуса и проростков трех видов высших растений/Lyooperaioon ccculentui,:, I-iedicaro cativa, Oryza sativa / С двумя видами Cyanophyta / ЛпаЪаепа Uhurmalio и Nostoc calcicola могут служить основой для дальнейшего изучения детерминант формирования искуственного азотфиксирующего симбиоза покрытосеменных растений и синезеленых водорослей.

/дикие о морфологической изменчивости A.thcrmalis при взаимодействии с клетками высших растений, полученные на светооптическом и электронномикроскопическоы уровнях могут быть использованы в качестве тестовых параметров при анализе характера взаимодействия партнеров при совместном выращивании. Предложенная схема подбора партнеров позволит ускорять эффективный отбор организмов для искуствепкых азотфиксирувщих систем.

Ji/шные о закономерности роста клеток высшего растения могут быть использованы в методических рекомендациях для подготовки и совместного культивирования партнеров при выяснении вопросов формирования ассоциативных связей и использования метаболитов азота синезелеьых водорослей клетками высших растений.

А2Е2£ация_]Эпботы._ Основные результаты выполненных исследований докладывались на семинарах отдела клеточной биологии и анатомии Института ботаники им. Н. Г.Холодного АН Украины /Г989-1992г.г./, Республиканской конференции молодых ученых "Актуальные вопросы ботаники и экологии" /Глменец-ГГодольский, 1989г./, республиканской научной конференции молодых ботаников "Актуальные вопросы ботаники" /Киев, 1991г./, ежегодных научных конференциях Мелитопольского государственного пединститута /1991-1992г. г./, IX сьеэде УБО /Днепропетровск, 1992г./ теме диссертации опубликовано 5 работ.

Диссертационная работа выполнена на 14? страницах машинописного текста, состоит из вступления,обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 72 рисунками и электронномикроскопическими фотографиями и 25 таблицами.

I. ОБЬЕТГШ И МЕТОДИКА И2СЛВДОВА!Ш

Обьектами_ исследования были алогологически и аксени-чесга чистые культуры азотфиксирующих синезеленых водорослей Anibnonri thern-ilie Vouk И Hostoc cnlcicol"t ВгбЪ.

выделенные из зон обрастания растений одичавшего риса с Южного Вьетнама, которые поддерживаются в лаборатории отдела клеточной биологии и анатомии Института ботаники АН Украины. Из высших растений изучались проростки и каллус : томата культурного/ lycopcrsícon eoculcntum Hill., сорта Киевский 139, Украинец, Свитанок, Искорка, Заказной, Ревермун, Донецкие, Новинка Приднестровья, Волгоградские, Салатные,Драгоценность/^ томата перувианского / ь. poruvinnum Kill. /, риса посевного/ Oryzn cativa L. /, люцерны посевной/ Keclicaco за-tivn L. /.

Культуры л. thornniia______Jj._¿^ci^coln,__выращивали

в 100 мл колбах на жидкой беэазотистой среде И 0/ Нгуен X.,1990 при 12-ти час. фотопвркоде, освещенности - 2000 лк, t=26-27°C, пересаживали раз в месяц.

Стерильные семена высаживали на среду МС I, содержащую 1/2 солей МС/ Murwjhinc-.»¡;oo~, 1962/, 7 г/л агара, рН 5,7. Сегменты 7-суточных проростков выращивали на средах каллусообразования в темноте 3 недели. Для этого применяли модифицированные питательные среды: сравнитель но богатую по содержанию минеральных и органических компонентов/ 1/2 макро- и Г/5 микросолей МС, 1,5 мг/л НУК/ среду С /Сидоров и др., 1985г./ и более бедную модифицированную среду lC-C/I/4 макро- и Г/10 микросолей МС 3 мг/л ИУК,3 мг/л кинети-на/ / П а п з an pour-Кзt ал Ь ппн ti ct ni. , 1986/.

Дня. совместного культивирования первичный каллус весом ТОО-120 мг переносили на среды для совместного выращивания С/-/ и LC-C/-/, содержащие уменьшенное количество соединений азота - 40% и сахарозы - 507$. Для нанесения на каллус использовали суспензию водорослей с оптической плотностью 0.7 /I капля на каллус/. Смешанную культуру выращивали 14 суток при соете интенсивностью 2000 лк, Т2-часовом фотопериоде, t = 27°С. Дяя совместного культивирования проростков томата и риса, люцерны с л. «ierra-¡lis суспензии водорослей наносили на стерильныс семота на твердой среде ПО/7 г/л агара/.

И£и_иссл£2овании морфометрических признаков клеток водоросли и каллуса высших растений были использованы статистические методы: определение параметров выборок, графичес-• кие методы, критерии достоверности Стьюдента. Прирост сырой биомассы каллуса вычисляли по формуле:

К = ------х IOO0S,

Рь-?а

где Ра - вес сахарного стаканчика + среда;

Рь - вес сахарного стаканчика + среда + первичный каллус;

Pt - вес каллуса после опита /14 суток/. Биомассу водорослей определяли стереометрическим методом/Вас-сер и др., 1989г./. Для оценки взаимодействия партнеров в раздай парах и условиях выращивания применяли индекс взаимодействия /Ив/: отношение показателя роста каллуса в моно- и смешанной культуре/Корженевская, 1990/. Статистическую обработку ' данных проводили по Зайцеву /1990/. Для электронномикросколи-ческого анализа идентификацию участков корней, стеблей, листьев к каллуса, содержащих водоросли, проводили под бинокулярной лупой. Материал готовили по общепринятой методике. Полутонкие срезы /2 мкм/ иэготовливали на ультратомеШВ-8800 и исследовали под световым микроскопом "Amplivul Отобранные полутонкие срезы заключали в смесь эпоксидных смол и делали ультратонкие срезы для анализа в трансмиссионных электронных : микроскопах JEM 100 В и JEM - 1200 EX.

; ' 2. ПОДБОР ПАРТНЕРОВ ДЛЯ МОДЕЛЬНОЙ СИСТЕМ ПО ИЗУЧЕН® ВЗАИМОДЕПСТВЩ КЖГОК ШШЕГО РАСТЕНШ И АЗОГЗИК-CliPyiliE'! СИНЕЗЕЛЕНОЗ ВОДОРОСЛИ

При совместном культивировании на питательных средах С/-/ И LC-C/-/ Ahnbaena thermalis и Kostoo calcicola негативно влияли на рост каллуса Lycopersicon pôruviânum и 12 сортов I». esculentum /Rie. I/.

В зависимости от комбинации партнеров и питательной среды отмечено варьирование степени угнетения роста каллуса от %/Vu Приднестровская - a. thermalis - LC - С /-/ / до 81$,/Искорка - п. calcicola - С/-//. Рост каллуса всех исследованых сортов на относительно богатой среде С/-/ превышал показатели для среды iC-C/-/, но индекс взаимодействия при этом уменьшался.

•)г<г '¿'гмг

УШ IX X

>ги шг

XI XII

/г/г /г/г

XIII Х1У

Рис. I каллусы

Гистограммы роста каллуса томатов при совместном выращивании с азотфиксирующими синезеленнми водорослями АгиЛаепа «»еипаИз и 'ПовЪос са1с1со1п на средах С/-/ и 1С-С/-/ на" 14-е сутки: каллус Ьусорогз1соп езси1еп1иг!1 сорта : I -Киевский - 139, II -Украинец, III - Свитянок, 1У - Искорка, У - Заказной, У1 -Карлсон, УП-Ре-вермун, УШ - Донецкие, IX -Н.Приднестровские, X -Волгоградские, XI -г Салатные, XII - Драгоценность, Х1П-Ь.регшг1апит и Хвалительно пассируемый каллус/;

А - монокультура, В - совместное культивирование с ч-Л-.Шег-та1сп1с1 оо!ч; 1=5 -среда С/-/, га-среда 1.С-С/-/.

А. ^егтлПа И И- сп1с1со1а при СОВмеСТНОМ КуЛЬ-

тивировании с каллусом томатов на среде^С-С/-/ росли интенсивнее чем на среде л О, разрастаясь по поверхности каллуса и питательной среды. На среде С/-/ водоросли росли медленно, образуя лишь небольшие коллонии на поверхности каллуса.

На основе сравнения особенностей роста каллуса в монокультуре и при совместном культивировании с А. ^егтяИв и и. са1с1со1а исслздовяннив сорта можно разделить на три группы: I/ сорта которые слабо реагируют На изменение состава питетельной среды, независимо от присутствия водоросли/Киевский - 139,Карлсон, Салатные , Драгоценность/;

2/ сорта, более чувствительные к питательной среде независимо от присутствия водоросли/Украинец, ь. peruvianum /; 3/ сор-

та, чувствительность которых к составу пительной среды изменялась в зависимости от присутствия водорослей.

■ По данным анализа показателей роста каллусов с различными видами синезеленых водорослей при смене условий питания также ввделены три группы томатов: I/ сорта которые имеют высокий индекс взаимодействия/Ив/ с одним видом водоросли независимо от состава среды/Карлсон, Ревенмун, Салатные, драгоценность и

Ь. peruvianum С Л. thermalies , Иакорка - С Ii. cal-cicola / ; 2/ сорта, величина IIb которых с конкретным видом водоросли изменялась только на обедненной среде/Украинец, Донецкие/; сорта величина Ив которых е тем или иным видом водоросли изменилась в зависимости от состава среды.

Таким образом, величина Ив клеток каллуса и синезеленой водоросли определяется в первую очередь видовой и сортовой принадлежностью партнеров и зависит также от условий выращивания.

¡Изменяя состав питательной среды при культивировании каллусов томатов с тем или иным видом синезеленых водорослей мы отобрали перспективные для совместного культивирования сорта:Карлсон, Салатный, Драгоценность. Среди них сорт Карлсон отличается наибольшим приростом биомассы каллуса в монокультуре на средах С/-/ и ЬС-С/-/, и наибольшим Ив с водорослями на обоих средах. Также большинство сортов имели наибольший Из в условиях недостатка пи. тательных веществ с л. thernalic . Поэтому длА модельной системы были избраны как обьекты каллус L. esculentum сорт Карлсон И Л. thermalis

3. РОСТ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ьусогщн-dlGO.i i^OVl^iüW'i KILL, /СОРГ КАРЛСОН/ И А1\ Ai3Aj!*i л j.'Jii'jWb/iLIo VOUK

3.I. Морфологические особенности азотфиксирующей синезеленой водоросли АпчЬиепа thcrmnlia при росте в аксенической культуре на среде и 0.

АпаЬтепа thernalis Vouk______I Анабепа тепловодная

в аксенической культуре на твердой среде и 0 образует пленчатые колонии от зеленого до темнозеленого цвета. Bit и пряше или

^Здесь и далее изучалась 14-суточная культура водоросли;

слегка согнуты. Нолониальнял слизь развита слабо. Вегетативные клетки цилиндрические^ с округлыми концами, лишены газовых вакуоле;';. Г'црина клетки" 2,3-4,7 мкм при х и Мо около 3, 39-3,42мкм V-9. О*; длина, измеренная без учета возраста 2,0-4,9 мкм при х и Г.'о 3,3-3,44 мкм, 7-23,4?-. Индекс форг.-ы равен 1025. Гетеро-цисты от округлых до рлипсоидных: ширина 3-5,5 мкм при х и Мо

3, 4-3, 49 мкм, 7 -9, 4.«; длина в пределах 4, и-о, 3 мкм при х и Мо

4, 8-0, 3 мкм и У-Т2,5/', 1' -13?%. Частота встречаемости гстероцист составляет а контроле о!, / п= 1000/. Акинеты а исследуемой культуре не обнаружены.

Ультпчструктура л. чаюш-Па____._ Вегетативные клетки

окрудены чстырехслойной оболочкой. Протопласт имеет гомогенную электронную плотность с тилакоидами, близко сгруппированными и расположенными пароледьно др.уг другу по периферии клетки. Тила-коиды, которые находятся вблизи клеточной оболочки, могут контактировать с плазмалсммой. Многочисленные фикобилисомы локализированы на тилркаидах. В зрелых вегетативных клетках наблюдается менее упорядоченное расположение тллакоидов, набухание и расширение внутритилакоидного пространства, вакуолизация периферической цитоплазмы. Нуклеоид в центральной части клетки представлен на срезах фибриллами ДНИ. Встречаются структурированные цианофициноиые гранулы со средними размерами 0, 15-0,25мкм. В межтилакоидном пространстве присутствуют карбоксисомы/7-2 на срезе клетки/. Цитоплазма богата рибосомами. Липидные капли различи ных размеров расположены по всему обьему протопласта. Иногда наблюдаются электроннопрозрачные зоны.

Зрелые гетероцисты.отличаются от вегетативных клеток утолщенной оболочкой и сетчатой структурой фотосинтетического аппарата. Тилаконцы расположены по всему обьему клетки. Также увеличивается количество липидных калель. Вокруг поровогоканала наблюдаются характерные утолщения клеточной оболочки. Хорошо выявляется пробка порового канала к область напротив нее внутри гетероцисты, выполненная электронноплотным материалом. Снизь вокруг клеток водоросли не наблюдается.

3.2. А. «югп.аия при выращивании на каллусе Ь.евсц-1епг-ип /среда С/-//.

При совместном культивировании л. ьъагтаНз на по-

верхности каллуса томата сорта Иарлсон образует небольшие скоп-р

Обьем выборки п=Т00, х - среднее арифметическое значение поиз-нака, Мо - модальное значение признака, V-коэффициент варьи-

■ рования, £Гг - индекс формы по формуле: у _ х_£лины____х ^^

у сирины

ления нитей. FbcT водоросли угнетен, прирост биомассы составил 37% от контроля. Нити в колониях расположены рыхло, гормогонии отсутствуют. Линейные размеры вегетативных клеток и гетероцист примерно одинаковы с контрольным вариантом. Количество гетероцист снижено до Ж.

Ультраструктурная организация клеток существенно отличается от таковой в контроле. Клеточная оболочка становится неровной , часто наблюдаются локальные расширения периплазматического пространства. Несмотря на оптимальную освещенность, гилакоиды располагаются по всему объему клетки; отмечена веэикуляция тпла-коидов, фиксбилисомы немногочисленны, карбоксисомн одиночные.

Таким образом, при выращивании к. themolis с каллусом На среде С/-/-наряду с эффектом икгибирования водорослью роста каллус а/Рис. I/ наблюдается негативное влияние данных условий еы-ращявания на сииезеленую водоросль, которое проявляется в деструктивы« изменениях ее клеток, замедлении роста и снижении количества гетероцист.

3.3, !,Ърфологические особенности ЛпаЬчепа thermalia при совместном выращивании с проростками высших растений /среда и О/.

iiS—ilSZSi^_______сорта Карлсон

скорость роста A. thermal is не отличалась от таковой в монокультуре. Водоросль обрастала семенную кожуру и гилокотиль и распространялась по поверхности среды. На стеблях, листьях и корнях проростков водоросль не обнаружена. Размеры вегетативных клеток и гетероцист меньше, чем в контроле. Для вегетативных клеток ширина Z, 1-4,3 мкм при х и !.'о 2.90-3,00 мкм, V -17,23. Для гетеро цист х ширины 4,36 мкм, длины - 3,36 мкм, -130$. Частота встречаемости гетероцист состгвляет Ы. Ультраструкт-ура клеток A. the-

rn-.ylis подобна такой в монокультуре. Дцгезия клеток водоросли к клеткам гипокотиля томата не наблюдалась.

При выращивании A. thermalis с проростками Огуяа ая-_ tiya выявлено их стимулиругацее действие на рост водоросли, прирост биомассы которой превышал показатели в монокультуре на 260$. Скопления нитей найдены на стеблях, листьях, корнях проростков в толче агаризованной среды на значительной глубине. При изучении образцов с применением сканирующей электронной микроскопии нити водоросли выявлены по всей поверхности листьев, наблюдаются в углублениях поверхности и в щелях устьиц. Водоросль образует

многочисленные гормогонии. Линейные размеры клеток и частота ге-тероцист а этом варианте и контроле достоверно не отличаются.

Расположение тилакондов менее упорядочено по сравнению с монокультурой. Отмечено уменьшение количества карбоксисом, что может свидетельствовать о снижении интенсивности фотосинтеза. Учитывая усиление роста водоросли, можно допустить, ото она полуодет от проростков риса питательные или биологически актив-гае вещества. Существенно увеличивается количество/4-5 на срезе клетки/ и размеры цианофициновых гранул /0.2-0.4 мкм/, что указывает на усиление азотонакопления в клетке. Водорослевые клетки окружены слизью /0.5-1,0 мкм/, имевшей вид мелкозернистой субстанции низкой электронной плотности и расположенной концентрическими слоями. Часто встречаются клетки в состоянии деления.

П2220СТКИ_______негативно влияют на рост

л. -ШегпаНз . После 14 дней совместного выращивания водо-

росль образовывала еле заметные скопления на семенной кожуре и поверхности среды возле них. Образование гормогониев не происходило. Линейные размеры клеток превышали контрольные значения. Для вегетативных клеток ширина колебалась в пределах 3,0-4,8 мкм, при х и Мо 3,4-3,65 мкм, V- 13, I??. Дяя гетероцист х ширины -3,65 мкм, длины -4,8 мкм при х и Мо 3,4-3, Г5 мкм, Р--12??. Частота встречаемости гетероцист равна 5% . В ультроструктуре опытных клеток отмечены некоторые отличия: тилакоиды расположены по всему обьему протополаста, количество карбоксисом уменьшилось. Однако деструктивные изменения в клетках водоросли не наблюдались.

Полученные данные, 'таким образом, позволяют сделать вывод о существенном влиянии высших растений на СуапорЬуЬз . Рост водорослей уже на первых этапах совместного выращивания с различными видами имеет неодинаковый характер; негативный с люцерной/природный симбионт 1гь1гоЬд.ип /, нейтральный/томаты/и стимулирующий с рисом /вступает в ассоциативное взаимодействие с а. ььогтаНз в природе/. В последнем случае изменения в ультраструктуре клеток водоросли совпадают с рядом симбиоэ-спе-цифичесних признаков азотфиксирующих синцяанозов/усиление образования гормогониев и накопления слизи, адгезия между клетками партнеров, неупорядоченное расположение тилакоидов, увеличение количества и размеров цианофициновых гранул, уменьшение количества карбоксисом.

3.4. Рост и ультраструктура каллуса L. escuientura при совместном культивировании с Л. thcrmalis на среде С/-/.

Прирост биомассы каллуса в монокультуре составил 127% /Рис.I/. Результаты электронномикроскопического анализа клеток каллуса свидетельствуют о высокой вариабельности их структурной организации. Периферическая зона каллуса состоит из клеток ме~ ристемоподобного и паренхимоподобного типов. ^ Линейные размеры меристемоподобних клеток существенно меньше/ х ширины- 27,21, длины - 35,09 мкм/, чем паренхимоподобных /х шрины-41,52, длины - 58.61 мкм/.

Последние в втой зоне составляют приблизительно 60%. Ультраструктура исследованных клеток была типичной для дедиффереишро-ванных клеток в культуре in vitro /КЬрдюм и др., 1980; Климцук, 1991/.

Прирост биомасси каллуса при совместном росте с л. tharna-lis на среде С/-/ на. 51% меньше чем в монокультуре, соответственно Ив равен 0.б. Клетки периферической зоны каллуса, контактирующие с водорослью, резко отличались от клеток в монокультуре, йс линейные размеры увеличены: для меристомоподобнък клеток х ширины - 36,35, длины - 45,57 мкм, для паренхимоподобных клеток х ширины - 43,30, длины - 70. 10 мкм; последние преобладают и составляют 91%. Клетки двух периферических слоев каллуса находятся на разных стадиях деградации, вплоть до некроза. Такие клетки вакуолизированы, часто почти лишены содержимого, их оболочки значительно утолщены и отстают от протопласта, чго напоминает клеточную организацию при патогенезе и несовместимых прививках/Бе- -режная, 1988/. Полученные данные свидетельствуют о негативном влиянии A. therrmlis на рост каллуса и жизнедеятельность клеток, что на структурном уровне проявляется в их деструктивных изменениях.

3.5. Проростки lycopersicon cooulenfcura /сорт Карлсон/, Medicado sativa И Oryzo. se.tiva при совместном выращивании с Д. thcrmalis на среде КО.

При совместном культивировании с A. thormalio отмечено ускоренное и более дружное прорастание семян и зерновок, а также некоторая стимуляция роста проростков риса и люцерны на 17 и 8$ соответственно, по сравнению с. контролем. На рост проростков ■

^Учитывая специфику эксперимента, здесь и далее т исследовали клетки периферической зоны кяллуса 14 суточной культуры.

томата водоросль не оказывает никакого влияния. При электронно-микроскопическом исследовании клеток проростков трех видов растений' в зонах локализации водоросли /участков стебля, гипокотиля, кор!Я, которые обросли или контактируют с А. ^еггааИя /

отличия от монокультуры проростков не найдены.

Таким образом, в отличие от каллуса I. езспПепЬит на среде С/-/, проростки томатов не выявляют признаков деструкции при совместном выращивании с д.. -ШегтаИв . Следовательно негативное влияние водоросли на рост и ультраструктуру каллуса при совместном росте на среде С/-/ вызван условиями культивирования, а не непосредственно биологическими свойствами водоросли. Такое положение,,возможно, объясняется тем, что несбалансированность среды С/-/ для каллуса стимулирует синтез фенольных соединений в клетках томата, выполняющих защитную функцию, которые могут негативно влиять на водоросль. Последняя в ответ на неблагоприятные условия, в свою очередь, усиливает выделение веществ, токсичных для каллуса. Это обуславливает необходимость оптимизации условий совместного культивирования каллуса высших растений и синезеленых водорослей.

4. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИИ ШРАЩВАНШ МОДЕЛЬНОЙ СИСТЕШ КАЛЛУС ь/оорх,;{оюс;1 ъ^сишиим /СОРТ КАРЛСОН/ - АНАиАЫА '^¿ЬЖоХи На основе серии экспериментов по изучению влияния ряда факторов /концентрации питательных веществ и рН среды, возраст партнеров, условия освещенности, ^ -облучение/ на рост каллуса

Ь. езси1епСига И А. ^егтаЦз при совместном ВЫраЩИвании разработан эффективный режим подготовки партнеров и их культивирования /Рис.2/.

Пропись среды К/-/ для совместного культивирования составлена на основе анализа литературных данных /Бутенко, 1967, Корже-невская, 1590/, эксперимента по совместному выращиванию каллуса 12 сортов Ь. езои1опЬит и Ь. региузлгпцга ' С СИНезвЛб-шми водорослями на отличающихся по содержанию питательных веществ средах ьС-С/-/, С/-/, а также серии полных факторных экспериментов /Ш*3 И /, в которых исследовали оптимальность концентраций ККО^, Ипбо^ , 2п304 , фитогормонов, сахарозы, рН.

Среда К для индукции каллусогенеза содержит дополнительно соединения азота / 1900 мг/л кко^ , 1650 мг/л /

и фитогормоны, для образования каллуса у ь. е:зси1еги;шп / 1,5 мг/л ЬАП и' 0,5 мг/л НУК/.

Оптимизация режима культивирования модельной системы кал-

эксплант

маточная культура водоросли, среда к О

каллусообразоеа-ние,среда К, темнота,день

облучение каллуса /5 Гр/пе-ред инокуляцией водоросли

инкубация водоросли в

г/л сахарозы, 22 дня

инокуляция водоросли через 3 дня после пассирования каллуса на среду К/-/

совместное культивирование, среда К/-/, темнота

Рис.2. Схема режима К - подготовки и совместного культивирования партнеров в модельной системе каллус

11усорегаз.соп евси1еп<;ит - азотфиксирующая синезеленая водоросль. АпаЬаепа ^егтаНз лус высшего растения -синезеленая водоросль содержит следующие моменты^/использование чреды.наиболее пригодной для роста каллуса,но модифицированной в направлении устранения иона аммония, снижении концентраций кко^ , Кпзс^ 4 и с близкими к

Пропись среды К/-/:

ККО, ~ ~ V --------- в6 ' 1,00 "

НН4Н03 - . 0,4-0

СдС1а*2И20 г20 рр . 1,00

370 глицин 1,00

КИ2РО^ 170 гидролиэат казеина 200

11,19 мезоинозит 100

Ма2-ЭДГА" 8,34 ИУК 3,00

5 ; 5,10 Н.4-Д 0,10

HnSO^' 7П20 5,90 кинетин . 0,90-

ZnSO^VH^O 0,90 сахароза 19,0 г

KJ 0,33 агар - 6,5

На ИоО„ *аа-,о CL с. 0,30 6,0

0,025

CoCl /6;i ,0 0,025

нейтральному рН 6.0; 2/ необходимо учитывать возраст каллуса и водоросли для которой оптимальна стационарная фаза роста; 3/ предварительное выращивание синезеленой водоросли на среде с дабавлением сахарозы с целью их адаптации к соответствующим концентрациям; 4/ облучение каллуса у-лучами/ 5 Гр/ для ослабления иммунитета клеток каллуса и угнетения роста водоросли на его поверхности; 5/ совместное выращивание в темноте для установления более тесной метаболической зависимости водоросли от каллуса.

Выявлены общие для изученной модельной системы и азотфик-сирующих синцианозов при искуственном реинфицировании/ Petera, 1986/ закономерности ростовой реакции на действие ряда факторов: угнетение роста парт-неров высокими концентрациями связанных форм дзота в средо / оптимальные концентрации ио2~ для модельной системы в 8 - .10 раз меньше, чем в среде КС для клеток высших растений/; участие в регуляции взаимодействия партнеров фитогормонов /ИУК, 2, 4 Д, кинетика/. В системен vitro на взаимодействие партнеров могут также влиять: концентрация питательных веществ и рН среды /."критическим" является соединение ионов Мп2й Zn2+, оптимальные концентрации которых занимают промежуточное значений между таковыми для сред N0 и МС/, отсутствие света, возраст партнеров.

5. РОСТ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КАЛЛУСОВ • ВЫСШИХ РАСТЕНИЯ И А» омккнлыз ПРИ СОВШУГНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В ОПТИМИЗИРОВАННЫХ УСЛОВИЯХ, РЕЖИМ к

5.I. Рост и особенности ультраструктуры каллуса высших растений.

Сравнение данных по приросту биомассы каллуса томатов при совместном выращивании с л. thermaiia в различных условиях показало, что э оптимизированном режиме К произошло существенное усиление каллуса. Прирост биомассы сорта Карлсон превышал таковой в монокультуре на средах 1С -С/-/ и С/-/ на 105 и 605S, каллуса ь, peruvimum - на 50 и 22%. соответственно. При совместном культивировании для L. escuientum прирост биомассы увеличился на 139 и 114 %, а для L. paruvianum - на 101 и 81%, со ответственно, по сравнению со средами I» ОгС/-/ и С/-/. Дяя обоих видов интенсивность роста в моно- и смешанной культуре в режима К по приросту сырой и сухой биомассы не отличаются, Ив равен 1,0, что существенно превышает показатели для предъщутцих сред /Рис. I /:

Данные по приросту биомассы при совместном культивировании каллуса Medicngo cativa и Л. thermalis подтвердили положительный эффект режима К, где ífe равен 0.92, что существенно превышает значения Ив для томатов на средах ьС-С/-/ и С/-/.

Применение разработанного нами режима К для совместного культивирования каллусов различных видов высших растений показало, что удалось снять эффект угнетения, роста каллуса синезеленой водорослью, причем не .только у l. esculentum , но и для других вцдов / L. peruvianum, Kcdicajjo sativa /. Это дает основания предполагать, что в оптимизированном режиме учтены основные условия установления взаимодействия каллусных клеток высшего растения и cyanophyta.

Структурная организация клеток каллуса L. esculentum на среде 1С/-/ / в монокультуре не отличается от такой на среде С/-4 Морфологические данные указывают на то, что в реяиме К/-/ происходит интенсификация пролиферативной активности каллуса - количество меристимоподобных клеток увеличивается на 26%, что связано с изменениями условий трофики.

При совместном культивировании с a. thermalis линейные размеры клеток и соотношения их типов, ультраструктура каллусных клеток, как и ростовые показатели, в условиях оптимизированного режима сходны с таковыми монокультуры. %сто наблюдаются тесные контакты клеток партнеров. Отмечены случаи локализации коротких нитей - a. theraaiia в большое старых периферических клетка* каллуса с сильно утолщенными оболочками, как правило, лишенных содержимого, и в пространстве мевду первичными оболочками клеток каллуса после лизиса срединной пластинки.

Следовательно, при совместном культивировании в режима К о синезелеными водорослями контактируют нормально развитые клетки каллуса. При совместном росте с А. thermalis каллусные клюки находятся в более выраженной зависимости от условий выращивания, чем в монокультуре.

5.2. Iber и морфологические особенности ¿пчЬаепа thernali3 VouJc На каллусе Lycopcrsicon * esculentun в режиме К.

Интенсивность роста А. thermalis с каллусом томатов в оптимизированном режиме / рост в темноте / не отличалась от контрольной; следовательно нам удалось снять и аффект угнетения

роста водоросли каллусом, л. ъъогтпИа на поверхности каллуса образует колонии с плотно расположенными в центре нитями и многочисленными гормогониями, ориентированными в различных направлениях, адо напоминает рост водоросли с проростками риса. Нити водоросли расположенные на поверхности каллуса проникают в межклетники периферической зоньг каллуса. При этом водоросли могут приобретать форму узкого пространства которое занимают, ширина вегетативных клеток колеблется в пределах 2,3-3,6 мкм, при х и Мо 3,19-3,4 мкм, V-13, Щ. Для гетероцист х ширины - 3,81мкм, длины - 5,21 мкм. Значения линейных размеров вегетативных клеток и гетероцист больше, чем полученных для проростков томатов. Такая закономерность вдавлена для каллуса люцерны - увеличение размеров клеток водоросли при росте с каллусными клетками, в сравнении с проростками. Ка каллусе ь. езсга-эгЛип ширина вегетативных клеток составляет 2,8-4,7 мкм при х и Мо 3,7-3,76 мкм, для гетероцист х ширины - 4,55 мкм, длины - 5:54 мкм. Частота встречаемости гетероцист не иэмонилась, как у большинства опытов равна 5$. В ультраструктуре л. ььеггааНз также наблюдаются изменения. Тилакоиды расположены хаотично, фикобилисомы и карбоксисомы немногочисленные, что связано с ростом в темноте. Везикуляция ти-лакоидов наблюдается редко. Цитоплазма содержит многочисленные рибосомы. Часто встречаются цианофициновые гранулы/4-0/ на срезе клетки, размером 0,2-0,41,«см. Увеличение количества и размеров циа-нофициновых гранул обнаружено также для проростков риса наряду с другими изменениями в составе включений / уменьшение количества фикабшисои и хярбоксисом/, 'неупорядоченным расположением гила-коидов и увеличение размеров клеток, которые характерны для Суа-порЪуЪа при вступлении в симбиотические взаимоотношения. Такой полиморфизм синезеленой водоросли является симбиоз-специфическим признаком азотфиксируюцих синцианозов / оЬеиагъ оъ «1.,, 1983/.

Клетки водоросли окружены слоем слизи толщиной 0.1-0.2 мкм. По мере роста модельной системы происходит дальнейшее наполнение слизи и увеличение размеров цланофицнкоамх гранул /до 0.5 мкм в диаметре / и слоя слизи до I мкм у б-недельной культуры. Слизь покрывает поверхность наллусных клеток и ассоциированные с ними нити водоросли. Наличие слизи также является симбиоз-специфическим признаком синцианозов. Наш данные подтверждают предположения, что слизь участвует в адгезии водорослей с поверхностью растительной клетки. Наличие адгезии в нашем эксперименте также, с

одной стороны, связана с видовой принадлежностью растений /у проростков/ и, с другой - с условиями культивирования /проростки и каллус томатов/.

Таким образом, при совместном выращивании с каллусом L.es-culentum на оптимизированной среде К/-/ A.thernalis проявляет признаки, характерные для синезеленых водорослей в азотфик-сирущем синцианозе: усиление образования гормогониев, накопление слизи, адгезия с клетками высшего растения, возрастание полиморфизма клеток.

Следовательно, полученные данные подтверждают регуляторную роль режима совместного культивирования на взаимодействие партнеров При выращивании с проростками ъ. esculontum , изменения морфологических признаков л.tлетний не выявляются. Усиление измен-_чивости изученных признаков A. thernalis при выращивании с не-симбиотическим высшим растением происходит при использовании де-дифференцированных клеток. При определенных условиях совместного культивирования с клетками высшего растения, которое в природе не вступает в симбиотическое взаимодействие с Cyanophyta , /ла -Ъаепа thermalia. в условиях in vitro может проявлять ,. признаки, характерные для синезеленых водорослей в азотфиксирующпх синцианозах.

ВЫВОДЫ

1. Создана экспериментальная ассоциативная азотфиксирукяцая система : каллус Lycopersicon esculentum Hill. / сорт Кэрлсон/-азот-фиксирующая синезеленая водоросль АплЬлопд thermalis Vouk

2. Морфологические признаки АпаЪ-чепа themmlis , выделенной из зон обрастания риса Южного Вьетнама и исследованной наш в аксени-ческой культуре при выращивании в монокультуре, модельной системе И С проростками Lycopersicon «aculenfcufi, Ií'edic-чко sativa L.

и Orysa sativa L. принципиально не отличаются от описанных для данного вида в литературе. Фактические лимиты размеров вегетативных клеток и гетероцист изученной водоросли охватывают амплитуду колебаний значений соответствующих признаков всех известных форм этого вида, но не совпадают ни с одной из этих амплитуд. Данные, подтверждающие целесообразность объединения л. thernilis с a. variabilis не получены.

3. Степень изменчивости ростовых,морфологических и ультраструктурных показателей a. ther;n--<lis и клеток высших растений в

I 1<Э.

экспериментальной системе определяется видовой и сортовой /для покрытосеменных/ принадлежностью партнеров, а там*е способом подковки их к совместному росту и режимом культивирования/условия освещенности, состав сред, возраст партнеров/.

4. На основе серии мнофакторных экспериментов составлена опти- ' мизированная среда W-/ для совместного культивирования экспериментальной системы с учетом потребностей обоих партнерэв, которая содержит: уменьшенные концентрации соединений азота

/в формо KNOj /, Мп и Zn , а также сахарозу в количестве, достаточном для каллусных клеток и фитогормоны для совместного культивирования / ИУК, 2,4 - Д, кинетин/.

5. Выявлено сходство ростовой реакции партнеров в экспериментальной системе каллус L. esculentum - A. thermali3

и при реинфицироаании естественных с'инцианозов: угнетение роста .смешанной культуры высокими концентрациями NOg в среде и регуля-торная роль фитогормонов.

6. Еыявлено сходство некоторых особенностей жизнедеятельности и структуры прокариотического азотфиксирующего партнера в экспериментальной модельной системе в оптимизированном режиме культивирования, при выращивании с проростками риса и природными синциа-. нозами: усиление образования гормогониев, накопления слизи, адгезия к клеткам высшего растения, возростание полиморфизма клеток /увеличение размеров клеток, изменения в расположении тилакоидов и содержании включений/.

7. Дня создания искуственных азотфиксирующих ассоциаций целесообразно использование дедиффиренцированных клеток высшего растения, при взаимодействии с которыми происходит усиление изменчивости признаков Cyanophyta . фи этом необходима раэра-г ботка оптимального для избранных обьектов режима совместного культивирования /выращивание в темноте на оптимизированной среде и подготовки партнеров /адаптация синезеленых водорослей к содержанию сахарозы в среде и снижение иммунитета макропартнера/.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах: I. Камалова C.B. Совместное культивирование каллуса томатов с синезелеными водорослями // В кн.Тез.докл.научной конференции молодых ученых "Актуальные вопросы ботаники и экологии",Каменец-Подольский, -1989,-Киев:Наукова думка.-1990, с.50-51.

2. Камалова C.B. Симбхотичн1 системи азотф1 ксуючих синьо-зелених водоростей з вищими рослинами // Укр.ботан.курн.-1991-Т. 48, № 5, с. 66-74.

4. Камалова C.B. Взал модin калусу томат1в з азотфгксуючою синьозеленою водоростю лп^Ьпепа fchermalis Vouk //IX 3"ï3fl УБГ. ,Тез.доп.-Кигв: Наукова думка, 1992,-с. 187-188.

5. Камалова C.B. 0лгим1зацгя умов сумхсного культивування кулусу Lycopersicon esculentum Mill, та Anabaena thermalis

Vouk // IX з"1'зд УБГ. Тез.доп., Днхпропетровськ,-1992. Кихв; Наукова думка.-1992, с. 188-189.

6.Камалова C.B. Аспекти взаямодгг асоцгагивних азотфгксую- . чих синьозелених водоростей i клгтин несимбхотичних вищих рос-лин в умовах in vitro // Укр.ботан.журнал-1993. -Т. 50,1»"3г£.