Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антиокислительные свойства лекарственных веществ и плазмы крови

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Антиокислительные свойства лекарственных веществ и плазмы крови"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

ВТОРОЙ МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ имени Н. И. ПИРОГОВА

На правах рукописи УДК 577.3 + 615.1

ЕПАНЧИНЦЕВА Ольга Михайловна

АНТИОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ И ПЛАЗМЫ КРОВИ

C3.00.d2— Биофизика

Автореферат

Диссертации на соискании ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1991 г.

Работа выполнена во 2-ом Московском ордена Лейиш государственном медицинском институте им. Н. И. Ппрогова.

Научный руководитель: академик АМН СССР,

доктор биологических наук, профессор Ю. А. Владимиров.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

проф. О. А. Азизова

доктор биологических наук, проф. А. И. Журавлев

Ведущая организация: Всесоюзный онкологический научный центр

Защита состоится „ . . . "........1991 г.

в . . . часов на заседании специализированного ученого совета К0841404 2 МОЛГМИ им. Н. И. Ппрогова по адресу: 117513, г. Москва, ул. Островитянова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке 2 МОЛГМИ им. Н. И. Ппрогова.

Автореферат разослан „ . . . ".......1991 г.

Ученый секретарь

специализированного ученого совета,

кандидат мед. наук, доцент Буромский И. В.

Г »СУД«

"*"*" ~~ ' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность настоящей гзеоты ойуелогл-.-! :а ксоивялмость» поиска Фармакологических срС-дстс, поз^олггощи:: пс21:сит1г» устсичи-еости организма ч воздойстпию неблагоприятных СактороБ гнойней среды. Б.Н. Тарусопь"! лгиоедены убедительнее раннее, ссидетегьс-тсуюигие» что о реализации попрехдаюшего де£стпил на организм различных неблагоприятных оскторсп пахная голь принадлежит сгойоднс-радикапьным процессам. СТарусоз Б.Н. , 1С'Е4 3. На оснозе изучения этих процессор в организме?, как первичного универсального мехд^из-ма реализации позрехдамщего дойстсил 1 ?£лагсг.р'иятни;; оакторез внешней среды, сформировался нозый подход к лсчени;э и профилактике такого рода патологий, осносанний на разрасотко спососсо —

ния сиогоднорадикальными реакциями о организме. СЖураплел А.И. , Жураолеоа А.И., 1977 3 В ецпзи с зтим сольшоэ гзииманла о последние десятилетия уделяется поиску и исследованию соединений, способных тормозить разоитие спаеодно—радикальных реакций о организме, так назыоаемых антиокислителей. Следует иметь в овиду, что некоторые синтетические антиоксидамти (АО) проявляют ссейстса ксеноенотмксо СКаЫ Я., 19В43, о соязи с чем логично искать Фармакологически активные агенты среди минорных составляющих пиии, -обладающих свойствами АО, т.е. среди еиоантиоксидантоз [ Жураэлео А.И., 19023 и такой поиск успешно ведется САтез В., 1933, Нои11с11ап С., 1905']. Наиеолее перспективной ми считали ойширную группу природных анти-оксидантоо, представляемую кумаринами. группа природных антискси-дантоо представлена кумаринами СМиггау Я. 0.1.. еЪ.е!., 19В23. Доступности, простое строение, легкость химической модификации позволяет считать кумарины удобными синтонами для перехода к АО др'угкг типоо. На основе созданных кумариновых лигандов синтезп.руютсп новые кар£оксилатные комплексные соединения меди, обладающие каталитической активностью супороксиддисмутасц. СЛарйеноа Э.А., и .^р. 1908 3•

Гнткокис литель* /-о активность <АОЛ> озцвсто можно изучать .•^эдом железозависимой кемилмминссцснции весьма простой системы» очны,: липопротеидои СШагоо E.G. и ар-, 193i3. Этот метод и сыл применен d м г» сто я щей работе для изучения A OA кумгхринов. Определс— АСА локагстзенньг,? препаратов -пто одна из задач, стоящих, погод иссг.егсзатсл ями этих соединений. Вторая заключается в выяснении ¿ислсгичсского зФоект--» действия зтих е^ц^стс. Одним из криториоз мояет iSLiTb улучшение? состояния аитиоксидантной защитной системы сгглриома. Z'X^рав лes А-И. , 196Q3. Решение отой проблемы, примони-~сг,ьна к кул^гиногзым соединениям, представляет собой большую самостоятельную задачу, ииходг.щук» за рамки данной р а соты. Однако мы использовали метод >:омил>змин(?сценции <с применением той же стандартной комилюминесцентной системы) для изучения антиокислительной гктизности плазмы крови у вольных с ожогом глаз. Для этого заболевания, характеризующегося высокой степенью липидной пероксидации СФедоров С.и. и др., 19803 весьма информативна оценка общей ADA плазмы крови, поскольку она. позволяет пгсдстаиить состояние системы антиокис лито л ей d цс.?лом. Определение АОА плазмы крови может служит» тестом на состояние механизмов защиты против активации процесса ПОЛ при клиническом применении препаратов, обладающих антиокислительными ссойстпами»

Цель и члдачи исследовднип. Целью настоящего исследования б«1ло сраонительное изучение методом хомилюминесценции антиокисли-тсльной активности тро;; классов новых синтетических антиоксидантоа < кумариноиых редуктонов, комплексных соединений меди на основе кумар ^нооых лигандое и 3 — замещенный кумаринов >, а также определение антиокислитольной активности плазмы кгоси сольных с химическими ожогами глаз на разных стадиях васолеоания. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи«

1. В областной клинической офтальмологическое3! больнице г. ¡Ч'ш.роьа внедрить метод опгед^лчнил а;»тиокислительной активности

лекарственных аоусстз vs пла&ми к г* о с и с nrvo^bio спяцмгльчз г.-о. ной хомилюминеецсмтной устиноог:';.

2• Изучить антиокис л итег.ььук» активность 6 кумачное;;х * ^~ ТОНОВ И СОПОСТа1)ИТЬ MOXani/OM ИМ ЛНТИО'СЛС литолинсго дейстгл-.": действием изоестн^: антисксичантоо » ионо/п » асчср^ино-гэй км с: лог

Z. Научить антнекиелмтолънум активность 4 кат комплексных соединений меди (II) н.. с:мг.и.? кумаг-w «се;-.!;: лиг1«?.*';:•••: caлицI/,.лaтнopo комплексного соединения м^ди и салицилатног ко-: лексного соединения марганца и сог.с. гаггить их ант»* он v.

тельного действия с действием супсгиксиддисмутагы.

Изучить амтиокислитольную гктисиость четыре:: 3 - с а м-:. .-.;•-mux кумаринпо и сопоставить механизм и>: алтиокислительнор' лг.-С с.-*- • иия с дойстпием пзпестного антиоксиланта - ионе л г..

3. Исслгздооати аНТИОКПСЛИТОЛЬМУЮ аКТИЗМОСТЬ ЛЛаСКкЛ К"СГ • (методом с с л ал лени и гелезозависимей хемил::ми1 <есцо дии> у сольн^.ч с; химическим otorott глаз III степени, с зависимости от стадии сспс.--ни.

Научнал попизна. Прозедена количественная оценка антпочис л»'* тельной актиомости кумзрипипых гедуктонзо.• Обнаружено, что г механизму антиокислительного дсйстсил к-умариног^-ю редуктоны тг.го тоют к с поем у структурному аналогу -аскогеиносой кислоте и г.лг;е?тн^ отличаются от фснольного АО-ионола.

Прооедена количестпе. «ai оценка аптиокислптелиной активное т-.-; 4 кареоксилатних комплексных соединений меди (II) на осмоао кум г иное] ь.х лигандоз, салицилатного комплексного соединения мгди салицилатного комплексного соединения марганца. Обнаружено, механизм антиоксидантного сейстпия пс*дь-содержащих кумагп»юв эок к дейстои»® Cu-Mn-COD с некоторым дополнительным вкладом > риноп как лооушки гадикалоо.

Проведена г п л имеете ci тая оценка ант ^окислительной акч v > 3-наметенных кумагимоп. Unnopyxrn Факт актипации хоми лиг t."

.,-окси, З-амино кумагинами.

Проведена оценка антиок^гг.ительной активности плазмы крови у но изучавиюйся ранге категории Сольных с химическим ожогом глаз о codhc!/,мости от стадии болезни. Оенаружсно, что АОА плазмы крови возрастает на 3 сутки поело схсга с последующим снижением • ее в 1,5-2 раза к 20 суткам.

Практическая зн илхость. Предложенный метод определения АОА препаратов по ослайлени!э ХЛ липопротеидов давал хорошую корреляцию с химическим анализом продуктов перекисного окисления для двух классов соединений: кумагиновых редуктонов и комплексных соединений меди на осносе купариносых лигандов. Это позволяет рекомендо-• вать метод х/1 для определения АОА подобного типа веществ.

Количественно оценена антиокислительнап активность для третьего класса всаеств - З-гамеиениых кумаринов. Это позволяет рекомендовать 'данные соединения в качестве потенциальных препаратов антиокемдантного действия.

Обнаружен Факт, что 3*- окси и 3 - амино кумарины могут Быть использованы для повышения ксантоиого выхода хемилюминесценции по механи-му Физической актизации.

Метод определения AQft плазмы крови с целью выяснения тяжести состояния и эффективности лечения еыл использован в практической работе о частном клинической Больнице г. Кемерова.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на ааседании каоедры биофизики II М0/1ГМИ в мае 1990г, на заседании общества офтальмологов г. Кемероиа в сентябре 1990г, совместном ааседании каФо«ры биофизики II М0/1ГМИ и НИИФХМ в мае 1991г.

Публикации. По' теме диссертации находятся в печати и опубликовано 4 печатные работы.

ОБъ-ем работы. Диссертация состоит из введения, оезора литературы, описании материалов и методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списк

литературы. Раеота изложена на 132 страницах машинописного текста включая 50 рисунков, 3 таблицы и список литературы из 204 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Оеускт и методы исследооания. Основным овьектом исг педования еыли! 1. известные препараты

Н,С

ОН

но он

он

аскорсиновая кислот©

2. новые синтетические препараты! 2а> 3 —замещенные кумйрины

3 - аминокумарим

(I)

осс

/Ч*

чИ

- оксикумарин

(II)

3 - ацетиламинокумарин (III)

ч»

3 - кумаринокарвоноаая кислота (IV)

2в) 3»4 — диготорозамощеннио кумарины.

■ ОН

СА

/JH3

Ч>.

3 - амино - 4 - оксикумарин

(V)

NH3

I

С*

/МНа

ч»

3,4 - диаминокумарин (VI)

cor

3 7 амино - 4 - иетиламино-кумарин (VII)

<У

N ^СНаС,На

N

! /«я .

SS

3 - аминэ — 4 - йенвил—

ам1Лнокумарин <VI II)

N^ ^СНяСНаСНа N

1 /«»

XV

(У7Г

S СНЯС8Н,

/«а

амино - 4 -пропия-

аминокумарин (1У>

3 — aMv.ito -4-S-üBMovm»

кумарин (X)

2в> Карбоксилатные комплексные соединения меди <11) на

основ кумариновых лигандов» PQ 93(146) РО 33-3 РО 136-3 PQ 101

(XI)

(XII) »XIII) (XIV)

Ca лицилатные_комплексные соединения меди и марганца

салицилатотрис/акво/марганец(11)семигидрат (XV)

бис/салицилато/ди/акво/медь(11)дигидрат (XVI>

Новые препараты еыли предоставлены к.х.н. Э.Я. Парфеновым иэ лай. биорегуляторов (зав. про®. Смирнов /1-Я.) Всесоюзного научного центра по безопасности биологически активных соединений.

2.2. Обследованные больные. Обьектом исследооания была также плазма крови больных с химическими ожогами глаз III степени тяжести. Исследооания проводились на базе Кемеровской областной клини-

•оской офтальмологической больницы сооместио с д.м.н. Хатминским Ю.Ф. и к.м.н. Белобородовой E.C¿ Плазму получали из гепаринизиро-ванной кропи, которую забирали натощак на 1, 3, 7, 14, 20 сутки и определяли ев АОЛ.

Измерения кинетики хемилюминесценции <ХЛ) проводили на собранном нам» хемилмнинометре, устройство которого выло описано в литературе [Владимиров Ю.Д., Лрчакоо ñ.tt. , 1972.3. Принцип метода опрс .оп&тлп антиокислительной активности (АОА) лекарственны« веществ и плазмы- крови оснопан на изменении интенсивности свечения стандартной хемилюминесцентной системы CCXCJ» а шснно суспензии липопротеидов яичного холтка (ЖЛП>» о которой свосоднорадкальноо . окисление липидов инициировалось добавлением соли двухвалентного железа. Суспензию хелточных липснпротеияов готовили путем гомогенизации хелтка куриного пйца в фосфатном буфере (40 мМ КН2Р0„> 100 мМ XCI » pH 7,47 > и хранили при -4°С в течение недели, ХЛ суспензии ЖЛП инициировали добавлением ионоэ двухвалентного хелеза в конечной концентрации 2,5 мГС. . Измерения производили при постоянном перемешивании и при температуре 37° С и фосфатном буфере. Уровень ПОЛ в данной системе оценивали по накоплению ТБК активных продук-

I

тов (цветной реакции с 2—гиобарбитуровай кислотой). CMcknight R.C., Hunter F.Е., 19663. Оосфолипиды дли приготовления липосом выделяли из желтков куриных яиц по методу CBlight E.G., Dyer К.I.,1959.3. ХЛ липосом инициировали добавлением ионов двухвалентного хелеза в конечной концентрации 100 мкМ. Растворы исследуемых антиоксидантов готовили разбавлением в небольшом количестве CaHs0H и аа 'ем разводили дистиллированой водой непосредственно перед применением. Измерения ХЛ липосом производили при постоянном перемешивании в. трис HCl бу»ере (pH- 7,4) при температуре 37°С.

Интенсивность перекисного окисления характеризовалось содержанием ТБК-актиьных продуктов и амплитудой ХЛ. Антиокислительныв свойства исследуемых соединений и плазмы крови характеризовал''

величиной концентрации антиоксиданта, ингивиг» утерей с«рл*ование ТБК-активных продуктов на" SO'/. <C„.q ) и ингиеирующей интенсивность медленной вспышки Х/1 на 50 X <1_,.>.

Спектральные исследования выполняли на приборе С®-?6.

Полученные в работе результаты статистически скролотаны . по критериям Стьмдента- Фишера, коэффициент линэйной корреляции ов-считан методом рангов . Все значения средних величгч представлена как средняя - ошибка средней. Все кривые и графики, приаедс. |ныэ в дальнейшем, обработаны и построены к IBM PC/AT с использованием пакета программ Grafer.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Антирадикапьная активность кумариновых редуктонов. д л р

изучения антиоксидантных сиойетэ кунаринозыч редук.оноа определили действие этих веществ на интенсивность Х/1 СХС, На pnc.lt« гриведвуц кинетические кривыо Xfl в присутствии различных концантрвций кумарина VIII. И» рис. 1а видно,, что с увеличением концентрации кумкри-на VIII наблюдается снижение максимального уровня интансиаиегти иемилиминисценции СХС. Это re имело место и в случая другим иселе-дуомых кумаринозых Редуктонов. Снижение уровня ХЛ к СХС о присутствии антиокеидантев сопРопождавтся такх® и уменьшением накопления ИДА в ходе процесса. Срзе .ительная амтиокислитальнва ахтиэноеть для ясен препаратов, определенная по концентрации,, снижающей час-сим4пьнуч интенсивность и накопление ИДА в 2 раав приведена а таблиц» I.

Тазлмца I. Сравнительная антиокислительнап вктминостк кумариновых редуктонов, ионола и аскорбиновой кислоты.

1.доди-

ение

VI VIT

VIII

IX

X

аскор -биновая кислот..

Концентрация антиоксидантов (моль/л) снижающая □ 2 раза <

интенсвность XЛ в масимуме

30

<3,4 Z 0,1)*10~6

-7

<4,0 . 0,3)»10

<3,В _ 0,4)tíO

<1,0 * 0,1>*10"7

<7,3 _ 0,6)*10

<2-, 2 0,1) »10

(6,0 _ 0,4)*10

(1,В _ О,tltlO

количество ТБК активных продуктов

30

<7,0 Z 0,2) *10-6

-6

<3,3 _ 0,2)*10

(8,0 _ 0,3)*10

(1,В * О,1)*10_6

(9,2 Z 0,4)*10"6

(1,5 _ 0,1)*10

-4

<7,4 _ 0,2)*10

-7

Коэфф.коррел. г для зависимостей

-f (С)

о, вв

О, 33 0,В2 0,86 0,3? 0,74 0,90 0,91

I/I0-f

C-lg(C)3

0,91 о,вз

0,84 0,99 0,94 0,96 .0,72 О, 96

Примечание' и I- интенсивность Х/1 в максимуме в отсутствии и о присутствии антиоксидантов в концентрации С, моль/л. Ив данных Табл.Х. видно, что по критерию I5Q АОА изученных кумариновых соединений возрастает в ряду! X < IX < V < ионол < VI < VII < VIII

При отом все вещества обладают антиокислительной активность« намного большей, чем аскорбиновая кислота. По критерии С^ ряд получается в целом довольно близким, но не идентичным. X < IX < V .< VI < VII < VIII < ионол

Различия между данными по ISQ и C5Q означают, что данные произвоя-

V

6

мые кумарина тушат ХЛ с большей мере, чем угнетают перекисное окисление липидоо. Это хорошо видно на примере

З-амино-4-З-еензилкумарина !См.рис.1б).

Мохно предположить, что кумариновые редуктоны .обладают как антиокислительным эофектом, так и способность» снижать квантовый выход хемилюминесценции.

Изучаемые соединения оказались высокоактивными антиоксиданта— ми. Как можно видеть из табл.1, по своей АО активности соединения У-Х намного превосходят аскорбиновую кислоту и находятся на одном уровне с ионолом. Возникает вопрос, каков механизм АО активности изученных нами кумариновых редуктонов. Механизм действия ингибитора радикалов можно разделить на 3 типа: 1) ингибиторы ..илидных радикалов (ионол), 2) вещества, влияющие на состояние Ре (XI), .3) вещества, влияющие на радикалы в водной оазе.[Владимиров Ю.А.,Ар-чаков А.И.,19723. К антиоксидантам последнего типа относится аскорбиновая кислота. В настоящей работа мы не ставили своей задачей подробное изучение механизма действия кумариновых редуктонов. Тем не менее мы постарались ответить на вопрос, к какому типу антирадикальных соединений, скорее всего,относятся изучавшиеся нам* вещества. Для этого сравнивали характер концентрационных зависимостей интенсивности XЛ для исследуемых соединений и известных анти— оксидантов. Это оказалось возможным потому, что зависимость (С) била существенно различна «ля ионола и аскорбиновой кислоты. Ранее было показано, что для ловушек радикалов, таких как, ионо.' ,

наблюдается линейная зависимость величины (1^—1)/у I от концентрации антиоксиданта, где ^-интенсивность 1 медленной вспышки без добавления антиоксиданта, I -интенсивность мэделенной вспышки с антиоксидантом СТеселкин И.О. и др.,19373. Нами выла изучена аналогичная вависимость для кумариновых редуктонов, но она окз»а-лась во всех случаях далеко не линейной. Это видно из рис. 2а. данных таблицы 1, где приведены коэффициенты коргвляции г п»ро

Интенсивность, усл.ед.

§ g

»tiltil 1111.11 ». 111.i... i. f

ooppaop abobaba

Ko8N£88

o-ju-j^-oia CEKtKRE

£££££££

2. 5э

2. а

1.0:

0. 5

3. Ö3

К©нцежгграция, мзм

Эаэетзисгта хгягвнещгасФтн TSi с? sc-Egsa-■»çi-Я^м 3 — с:з:та?>— i - бегакгижгзп^коргпаи

«

SI i« о .0. л H í>

«о.

РЗ о So

lio. Q.

i

/

y3 p-rPTTTT'rVT-t'f I I V I I I к-ГТ ! I ? I

«'7 0 9 SQ П

сйратазй у,тп"т"тру1гсу>:,

SaanoEîisoTS sesîskieesîîcîsî 3SI if! ©Зрмяой Емщетирмщи

íl-saan«*—4—бвпгплвкозкен^доряггга.

тр« 4^-1)/-/10* I и концентрации С. Для ионола - » 0,90 варьируют от 0,35 до 0,94 для разных кумариновых веществ. Это мохет сыть одним из свидетельств того, что механизм действия редуктонов отличается от механизма действия ионола. В дальнейшем мы попытались подобрать несколько омпирических уравнений, которые удовлетворительно описывали бы экспериментальную зависимость интенсивности ХЛ от концентрации для исследуемых веществ. И» соотношений 1-*(1/С>, 1/1=МС>, 1/1 ■ т/С), близкой к линейной для всех редуктонов оказалась зависимость I " * С1д<1/С)3. Рис.2б. Б таблице I приведены коэффициенты • линейной корреляции между параметрами Пд-и/'/10* I и С и можду 1/10и ПдИ/ОЭ. Линейную зависимость с высоким коэффициентом корреляции для функции С1д(1/С)3

давала аскорбиновая кислота (г * 0,96) но >:е ионол (г " 0,72). Таким образом по данному признаку исследванныо соединения ближе к аскорбиновой кислоте, чем к ионолу, но они имеют гораздо более высокую АОА, чем аскорбиновая кислота. Наибольшей антиокислительной активность» обладали соединения у которых в 4 положении содержались атомы азота, меньшая активность была у соединений, содержа-, цих в 4 положении атомы кислорода или серы. Такие изменения 'АОА можно объяснить изменением протонирования 1МН группы в 3 положении в молекукле кумаринов.

2.Антирадикальная активность комплексных соединений меди <II) на основе кумариновых лигандов. В настоящей работе было обнаружено, что карбоксилатные комплексные соединения меди (II) на основе

—в' —3

кумариновых лигандов ■ концентрациях 10 - 10 М проявляют свойства ингибиторов ПОЛ, приводящих к ослаблению хемилюминесценции,

2+

индуцированной ионами Ре в СХС. При втом Форма кривых хемилюми-несцвнции на менялась, но снижалась амплитуда свечения по мере увеличения концентрации добавляемого препарата. Концентрации антиоксиданта, снижающие интенсивность ХЛ в <ша раза а также концентрации, снижающие вдвое количества ТЁК активных продуктов

приведены в таблице II.

Таелица II. Сравнительная антиокислительная активность карвоксила-тны* комплексных соединений меди < X 1-ХIV), еалицилатных комплексных соединений меди (XV), марганца (XVI), а такте ионола.

Соединенна

Концентрация амтиоксидантов (моль/л) снижающая о 2 раса!

интенсионость ХЛ о максимуме

Чо .

количество Т&К актиэных продуктов

с=о

Коз«®.корреляции для зависимостей

-ТП^Г С-1о<С> з

«У1»

/»о* 1

° (С)

XI

XII

XIII

XIV

XV

XVI

(1,5 - О,1) * 10

-7

(7,0 - 0,3) * 10

-В

<9,0 - 0,5) * Ю

(7,0 - 0,4) * 10

-7

(3,5 - 0,2) * 10

-3

(3,5 - 0,2) % 10

-6

(9,0 - 0,5) * 10

О,О - 0,4) * 10

-а

(В,О - 0,4) * 10

(1,6-0,2) * 10

-7

(6,0 - 0,4) * 10

(2,2 - 0,3) * 10

-7

СОД

(6,0 - 0,4) » 10

(125 - 20) ад/мл

-7

-7

(7,4 - 0,2) * 10

(130 - 15) ед/мл

0,70

О. 42

0,81

0,32

О, 60

0,92

0,90

0,96

0,70

0,97

0,91

0,93

0,70

0,72

Можно видеть, что эти концентрации примерно равны мехду совой для ионола и соединений XII, XV и XVI, тогда Как соединения XI, "III, и XIV несомненно эффективнее тушат ХЛ, чем угнетают овр«»оаанив ИДА. Па=ледее, как и о случав рассмотренных выше кумаримов, может , сыть сзягано с тем, что эти полные комплексы оказмваятсп тушителя-

ми вовбуждимны* состояний молекул наряду с истинным антиоксидант-ным действием.

Какое же механизм антиоксидантного действия медь-содегхаимх прои»водных кумарина ? Наиболее естественно думать, что он сходен с механизмом действия медь-содержащего антиоксидантнсго Фермента супероксиддисмутазы (СОЛ). Чтобы в какой-то мери подтвердить правильность такого предположения, мы провели изучении действия СОЯ и соединения XIII на кинетику хенилюминесцвнции липосом в трис-бу*ере,где пролявляется более четко, чем в Фосватном буфере различный стадии кинетики ХЛ. Полученные данные приведены на рис. За, для СОД и рис. Зб, для препарата XIII.. И* сопоставления этих кривых видно, что действие обеих веществ сходно, а иненнэ!

1). Происходит снижение амплитуды медленной вспышки кемилюминес-цвнции (рис.За и 3«»).

2) Снижается амплитуда стационарного свечения.

3).При добаелвним атих соединений на стадии стационарного свечении (стрелка на рис.За и Зг> происходит вспышка хамипиммнвсценции, обусловленная, вероятно, образованием перекиси подирсд*, на супвро-

. ксидных радикалов (Рис.Зя и Зг).

-О атом отношении ССД и препарат XIII отличаются от ВФФектоо других кумариновых антиоксидантов, которые при повторном введение нв девали вспышки ХЛ. Следует, впрочем, отметить, что при добавлении препарата XIII в концентрации 3 * ю-*' м происходит удлинение латентного перисда, тогда как СОД сокращало его ( данны® н® искавшим) , Зто геаорит о том, что антиоксидантный вбФвкт препарата ' XIII-частично обусловлен также кумариновой частью комплекса. Кума-риновый редуктон 3,4 -диаммнокумармн увеличивает время до максимума медленной вспышки ХЛ липосом в трис-суфври, так же как ионал и а-токп»ерол.

Этот в®»ект может быть объяснен тем, что данные вещества яалпютсп лоаучиами свободных радикалов СЛи Хо-Ик., 19903

интенсивность, усл.ед.

S 8 S 8

' " ■ ........."i.......il........и

Интенсивность, усл.ед. ........S.......if!.......^...м-ЙпУшУ

-21В цепом, полученные данные говорит о том, что определяющий механизм антиокислительного действии медь содерхащих кумаринов аналогичен действию Си-Мп-СОД, с некоторым вкладом оофекта кумарина как ловушки радикалов.

Из таелицы XI. видно, что полученные вещества имеют рааную антиокислительнук активность. При этом активность веществ XII, XIII, выше о отношении ингибирования как ХЛ, так и накопления продуктов ПОЛ, чем у такого известного антиоксиданта как ионол.

3. йнтирадикальная активность 3-зд>неценных кумариноа и их вли внио на «елоэозависимую хемилюнинесценцим. В таблице III приоедсни данные по антиокислитсльной активности ионола и кумаринов (I-IV), определенной по накоплению продуктов ПОЛ.

Таблица III. Антиокислительные свойства кумаринов I-IV, определяемы» по накоплению ТБК-активных продуктов.

Исследуемые соединения.

С_л моль/л ««о.

<7,4 + 0,2J*10~7

(4,0 + 0,2) «Ю-5

( = ,0 + 0,4)*10~5

(1,2 0, 1)*10"3

(0,0 + 0,1)*10~3

Ионол Кумарин I Кумарин II Кумарин III Кумарин IV

Cjj0y - концентрация антиоксидантов (моль/л), снихакщая количество ТБК - активных продуктоо в 2 раза.

Все и»ученные кумарины окаамвали в разной пере имгиеируюций эффект, т.е. проявляли свойства антиоксидантов. Мерой АО активности можвт служить концентрация соединений, вызывающих уменьшение количества накопленного МДА вдвое! оти концентрации такхе приведены в таалиць. III. Окааалось, что flaie наиболее активные кумарины I и II овладеют существенно меньшим (приблизительно на два порпдка сели-

чины) антиокислительным эффектом, чем ионол , тогда как соединения III и IV еще □ 20-25 раз менее активны.

На рис.4 приведены кинетические кривые хемилюминесценции длй

кумаринов I—IV. В присутствии кумарина IV (рис.4а.) наблюдается

тушение хемилюминесценции, как и в случае ионола. Однако другие

кумарины давали активаию ХЛ на ранних стадиях развития процесса (с

максимумом около 2 мин). Например, при добавлении соединения II в

2+

концентрации 150 мкМ в СХС и инициировании ионами Fe интенсивность хемилюминесценции через 2 мин. увеличивалась о 15 раз (рис.-4о).Для соединения I также характерно заметное увеличение ХЛ на ранних стадиях процесса (1-8 мин), но одновременно происходит уменьшение интенсивности на более поздних стадиях (Рис 2г). Ранее было высказано предположение СШароа B.C., и Щерстнеэ М.П., 19903, что за развитие хемилюминесценции в присутствии ионоэ железа ответственны дое различны« ХЛ реакции. Первая связана с ПОЛ (стадии быстрой и медленной ослышки ХЛ) и является еильно кислород-зависимой, а вторая обусловлена реакциями, но'соязанными с ПОЛ (стадия стационарного свечения) и слабо зависящими от концентрации кислорода о среде САтанэев Т.Б. и др. S9903

Очевидно, что кумарины I и II будучи АО (см. табл.III), тем не мен€?е усиливают ХЛ на стадии медленной вспышки свечения, связанного с реакциями ПОЛ. Можно предположить, что они являются Физическими активаторами ("сенсибилизаторами") ХЛ, обусловленной реакциями цепного окисления липидов. Соединение III обладало такими re свойствами, но в значительно меньшей степени. Структурная формула кумзринов I — III содержит опеФиновый фрагмент с олектронодонорным и с 1ектроноакцепторнып заместителем, расположенным при одном центре <Cj), а такие олееины, обладающие так называемым каптодативным аффектом CViehe Н.О., 19033, стабилизируют центр локализации нпс-п.*р*ннсго электрона при захвате . ими радикальной частицы, т.о. прорзлр.ют соойстоя типичных антиокислителей. Другой возможный

Интепсгзяосг», уеп.ед.

à S 8 i.......................... i-.

Интенсивность, усл.ед. S 8 8

механнзм ЛО действия кумаринов I-I3J - их взаимодействие с индуктором ПОЛ - ионами хвлеза. Для прооорки этого предположения мы испытали влияние на Х/1 кумаринокарбонопой кислоты (IV), оленина, нэ осладаинцэго каптодатионым звФсктом, но способного, подоено кумйринам, I-III слабо срязывать иони хелеза. Оказалось, что соединенно IV туиит X/1-заоисимым от концентрации способом (рис. 4а) и по своей ЙО активности слизок к кумзрину III. (Табл.III).

IV. Антиокислительная активность плазмы крори больных с химическим охогом глаз III степени тяхгести на разных стадиях болезни. Обследоиали 5 сольных с химическими охогами глаз III степени тихости. Плазму получали из гепаринизцрованной крови, которую забирали натощак на 1, 3, 7, 14, и 29 сутки после ожога.

Оказалось, что антиокислительная активность плазмы крови вольных с химическими охогами глаз III степени тяжести изменилась в. зависимости от стадии охогопой йолезни. Днтиокислительная активность

<Н -Н> ß- —-/С

плазмы крови определялась параметром < ■ — гяе

V*0* Н

Н0~амплитуда медленной вспышки СХС sea добавления плазмы, н - амплитуда медленной вспышки СХС при добавлении плазмы, С — объем добавляемой плазмы.

Было обнаружено, что аоа плазмы крови больных с химическими ожога-пи глаз III стзпьни тяжести изменялась в зависимости от стадии ожоговой болезни. Максимальное возрастание озФФициента ß по сравнении с 1 сутками наблядалось на 3 сутки <16,0 *1,3> мл ' с после-

(уюиим его снижениям в 1,5 - 2 раза к 28 суткам после ожог (9,2,

., — 1 .0,4) мл

Чмеютс я данные о том, что при химических ожогах гл-'з в от ом отгон» •ажБИвамтсп сиободнорадикальные процессы. [Федоров С.И.и Я*. , 19ВОЗ Накопление продуктов свободнорадикальмого окисления вызывает при этом дальнейшее повреждение клеточных структур. По видимому, »то :огг*овож дается уменьшением a anacos антиоксилантов о Клетках и

н.лрумением их притока так же как и для другим чидоб патологий СТарусоо Б.Н. и д>». 19&63, что отражается на уровне антиокислительной активности плазмы кроои,

е ы в с д ы

1. Методом хемилюпиносцонции и по снижению накопления МДЛ в стандартной системе еыла определена антиокыслительная активность пасти кумаринових рсдуктоноо. Било показана, что все изученные кумарины обладают антиокислительной активность», причем наиболее активными были соединения 3,4-диаминокумарин, 3-амино -4-метиламимокумарин и 3-амино-4,-бснЕилйминскумарин. Наибольшей антиокислительной актианостью обладали соединения у которых в 4 положении содержались атопы азота, меньшая активность была у соединений, содержащих в 4 положении атомы киегтода или серы. Такие изменения АОА можно объяснить изменением протснигования NN группы в 3 положении в молвкукло кумаринов.

2. Изучение характера зависимости интенсивности хемилгими.чес — цвнции от концентрации антиоксидантоо показало, что куиагимоаис редуктоны по мохг (изму своего действия ближе к водорастворимому окислители - аскорбиновой кислоте, чем к липидному антиоксиданту-бутилгидроокситолуолу (ионолу).

3. В результате измерения антиокислительной активности четырех карбоксилатных комплексных соединений меди (II) на осноое кумариновых лигандов было показано, что наиболее активными яаляют-с« соединении РО-ВЗ-З и РО-136-3 (антиокислитольная активности выше, чем у известного антиоксиданта ионолэ), тогда как соединение РО-93 обладало умеренной активностью, сравнимой с ионолом, а РО-101 был еще менее активен. Все изученные карбоксилатныа комплексные соединения меди на основе кумариновых лигандов оказались намного активнее ранив известного салицилатного комплекса моди (бис/-салицилато/ди/вкво/медь<II)дигидрат), а РО-ОЗ-З и РО-136-3 - агти-вмг?>, чин салил«латнк(й комплекс марганца (салицилвтотгис/акоо/

марганец (II) семигидрат).

4. Изучение влияния мед;»-содоржаии« кумаримов нд кинетик хемилгсминесценции о суспензии липосом показало, что механизм аьп-окислительного де-йстоип этих вецеств аналогичен действие Си-М-.-ССО, с некоторым складом ооескта кумарина кгк леэущки радикалов.

3. Изучение зависимости накопления ТБК активных продуктов в стандартной системе показало, что З-замещенние кумзрины (3-окси, 3-амино, 3-ацетиламино кумарини и з-кумаринокарсоновая •кислота) обладают умеренной антиокислптельной активность» , причем наибольшей АОА среди ланных соединений обладали 3-окси и 3 амино кумари-ны.

6. Было обнаружено, что хотя 3-окси, 3-амино и 3 -ацетиламино замещенные кумарини проявляли антиокислительнуя активность^ эти соединения усиливали интенсивности XЛ о стандартной системе, главным образом, на ранних стадиях развития свечения. Полученные данные показывают, что кумарины могут быть сенсибилизаторами, свечения, сопровождающего ПОЛ.

7. Изучена антиокислительная активность плазмы крови (методом тушения желеэоэависимой хемилюминесценции) у больных с химическим ожогом глаз XI! степени, о зависимости от стадии болезни. Обнаружено, что АОЛ плазмы крови возрастает на третьи сутки после ояога С последующим снижением ее в 1,5-2 Раза к 29 суткам.

Практические рекомендации.

1. Предложенный метод определения АОА препаратов по ослаблении ХЛ липопротсидов давал хорошую корреляции с химическим анапи-; )М продуктов пергкисного окисления для двух классов сочдимемиДг кумариновых гидуктоноо и комплексных соединений меди на основ к кумагимовых лигандоа. Это позволяет рекомендовать метод ХЛ для определения АОА подобного типа ввиеста.

2. Количественная оценка амтиокислительной екнлносм

кумариновых производных показала, что карбоксилатные комплексные соединения меди обладают весьма иисокой антиокислительной активностью, что позволяет рекомендовать данные соединении в качестве потенциальных препаратов антиоксидантного дейстоип.

3. Поскольку обнаружено, что 3-окси и 3-аминокумарины повышают квантовый выход хемилюминесценции, мохно рекомендовать исполь-•орать кумарины для усиления хемилюминесценции при хемилюминесцен-тном анализе процессов пврокисного окисления липидов в теоретических и прикладных научных исследованиях.

Определение АОА плазмы кроаи может служить тестом на состояние механизмов защиты протио активации процессов ПОЛ при клиническом применении препаратов, обладающих антиокислительными свойствами.

Метод определения АОА плавны кроои с целью выяснения тяхести состояния и эффективности лечения внедрен в практическую работу областной клинической больнице г. Кемерова.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Антирадикальная активность 3—замещенных кумаринсв и их влияние на жвлезозаьисимую мемилюминесцвнцим. // Бюлл. эксп. еиол. и мед., 1991. 10В, В, 296-299. / Соавт.» Владимиров Ю.А., Парфенов

Э.А., Смирнов Л.Д./

2. Результаты исследования антиокислительной активности плазмы крови больных с химическими ожогами глаз и некоторых лекарственных препаратов, используемым в лечении отой патологии. // Тезисы докладов 2-й научно-практической конференции. Новосибирск, 1990.

С. 17 - 19. / Соавт.I Владимиров Ю.А., Клебанов Г.И., Хатминский Ю.®., Болобородоаа Е.С./.

; ЛЛУл/З mt. QUI Т/00