Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антиконстрикторное действие механочувствительности эндотелия

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Антиконстрикторное действие механочувствительности эндотелия"

РГ5 ОД

0 ^МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА,

° ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ

р г 5 н ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ 1 з Г Л Д М : имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

КАРТАМЫШЕВ Сергей Петрович

АНТИКОНСТРИКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ МЕХАНОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЭНДОТЕЛИЯ

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена на кафедре физики живых систем Московского физико-технического института (заведующий кафедрой - академик В.И. Шумаков) и в лаборатории биомеханики и регуляции кровообращения Кардиологического научного центра РАМН (заведующий лабораторией -профессор В.М.Хаютин).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент A.M. МЕЛЬКУМЯНЦ

Официальные оппоненты:

1. Доктор медицинских наук, профессор В.И. КАПЕЛЬКО

2. Доктор биологических наук, H.A. МЕДВЕДЕВА

Ведущее учреждение - НИИ трансплантологии/,искусственных органов

ББА на заседании Специализированного Совета Д.053.05.35 Биологического факультета МГУ им. Ломоносова (119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

РАМН

Защита диссертации состоится

аудитории

Автореферат разослан

1996 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В 1979 году Смиешко, Хаютин и соавторы установили, что артерии расширяются при увеличении в них скорости кровотока и суживаются при ее уменьшении. Очевидно, что для осуществления такой регуляции просвета артерий необходимо, чтобы стенка этих сосудов обладала способностью каким-то образом "измерять" скорость кровотока и регулировать соответственно этой скорости тонус гладких мышц. Предположение о том, каким образом могла бы осуществляться такая регуляция было высказано С.Родбардом (Иос}Ьагс1, 1966) еще до того, как сама эта регуляция была экспериментально выявлена. Родбард предположил, что клетки эндотелия способны воспринимать действующую на них со стороны движущейся крови гидродинамическую силу (напряжение сдвига) и снижать тонус гладких мышц тем в большей степени, чем больше эта сила. Действительно, напряжение сдвига (т) при ламинарном стационарном течении жидкости в цилиндрической трубке определяется следующим соотношением:

т = 32 Т| с!3 (1),

где г) - вязкость жидкости, ф - ее объемная скорость, с1 - внутренний диаметр трубки. Видно, что напряжение сдвига пропорционально расходу, и, значит, вполне может служить мерой скорости тока жидкости. Однако в то время, когда эта гипотеза была сформулирована, не было практически никаких оснований считать, что тонус сосудов регулируется соответственно напряжению сдвига на стенке. Тем менее можно было подозревать участие п такой регуляции эндотелия, который считали лишь атромбогенной пленкой, выстилающей поверхности, контактирующие с кровью.

Однако вслед за обнаружением чувствительности артерий к скорости кровотока было установлено, что эти сосуды расширяются также в ответ на повышение вязкости текущей по ним жидкости (Мелькумянц, 1982; Балашов, 1987). Поскольку, как видно из формулы (1), напряжение сдвига пропорционально, не только расходу, но и вязкости, этот факт свидетельствовал в пользу предположения о том, что напряжение сдвига на стенке действительно влияет на тонус сосудистых гладких мышц.

Примерно в то же время произошли кардинальные изменения но взглядах на функцию эндотелия. Фурчгот и Завадский (1980) показали, что эндотелий действительно участвует в регуляции тонуса гладких мышц. Они установили, что ацетилхолин расслабляет гладкие мышцы сосудов не непосредственно, а лини, потому, чп> эндотелиоциты выделяют при действии на них ацетплхолина вещество, снижающее тонус гладких мышц и названное зндогелиальным фактором расслабления (ЭФР) Вслед за этой работой Смиешко (1983) и его коллеги выяснили, что ди-лататориый ответ бедренной артерии на повышение в ней расхода крови осуществляется лишь и сосуде с интактным эндотелием. Этот факт, до-

называющий, что чувствительность артерий к скорости течения крови опосредуется эндотелиальными клетками, был подтвержден другими авторами (Holtz et al, 1983; Pohl et al, 1986; Балашов, 1987). Наконец, было показано, что реакции артерий на изменения вязкости крови также реализуются лишь в сосудах с интактным эндотелием (Melkumyants et al, 1989). Все эти результаты, взятые вместе, доказывали, во-первых, существование ранее неизвестного вида регуляции артериальных сосудов - их способности приспосабливать свой просвет к величинам скорости течения и вязкости крови, и, во-вторых, что эта регуляция определяется способностью эндотелиоцитов изменять тонус гладких мышц соответственно напряжению сдвига.

Как показали дальнейшие исследования, механочувствительность эндотелия обеспечивает весьма значительные изменения сосудистого сопротивления. Выяснилось, что диаметр артерий увеличивается при увеличении в них скорости течения крови настолько, что падение давления на этих сосудах практически не меняется даже при многократнсм увеличении кровотока (Никольский, 1987; Khayutin et al, 1993). Эти данные с несомненнностыо доказывают, что чувствительность эндотелия к напряжению сдвига является важным фактором регуляции сосудистого сопротивления, способным значимо участвовать в регуляции кровообращения.

В рамках исследования роли эндотелия в регуляции сосудистого тонуса было выяснено, что эндотелиоциты способны значительно ослаблять констрикторные реакции артериальных сосудов. Оказалось, что артерии с удаленным или поврежденным эндотелием суживаются под действием констрикторных стимулов значительно сильнее, чем эти же сосуды с интактным эндотелием (Verrecchia et al, 1984; Lamping et al, 1985; Young a Vatner, 1986; Никольский, 1987). Этот феномен, как правило, объясняют тем, что агонисты, вызывающие сокращение гладких мышц, действуя одновременно на специфические рецепторы эндотелиоцитов, вызывают выделение ЭФР, который и ослабляет это сокращение. Однако возможна и иная интерпретация этих результатов. Действительно, эксперименты указывают на то, что в ответ на повышение напряжения сдвига эндотелиоциты также выделяют ЭФР (Pohl et al, 1986; Rubanyi et al, 1986; Tesfamariam a Cohen, 1988). Поскольку напряжение сдвип обратно пропорционально третьей степени внутреннего диаметра, то любое уменьшение диаметра при неизменном кровотоке значительно увеличивает напряжение сдвига на стенке, что должно приводить к выделении: дополнительного количества ЭФР, ослабляющего вазоконстрикцик (Khayutin, 1990). Как показывают расчеты, ослабление констрикцин обусловленное механоцептивной функцией эндотелия должно быть весь ма значительным. Таким образом, механочувствительность эндотелш может являться не только фактором, обусловливающем расширение ар терпи при увеличении и них кровотока, но и фактором, ослабляющи>

юэнстрикторные реакции сосудов и, таким образом, препятствующим развитию сосудистого спазма

Отметим, что, хотя твердо установлено наличие химического посредника между эндотелием и гладкими мышцами, обеспечивающего расслабление последних при повышении напряжения сдвига, фактор, выделяемый при этом эндотелиоцитами, не идентифицирован. Принято счисть, что ЭФР, выделяющийся в ответ на повышение напряжения сдвига, идентичен фактору, выделяющемуся при действии на эндотелиоциты фармакологических агентов, таких как ацетилхолин, АТФ, брадикинин и т.д., и представляющему собой оксид азота (N0). Хотя некоторые экспериментальные данные позволяют считать, что в ответ как на механический, так и на химический стимулы эндотелиоциты выделяют одно и то же вещество, расслабляющее гладкие мышцы, ряд фактов наводит на мысль о том, что ЭФР, выделяющийся в ответ на повышение напряжения сдвига отличен от оксида азота.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в том, чтобы, во-первых, выявить и количественно оценить антиконстрикторный эффект механочувствителъности эндотелия и, во-вторых, выяснить является ли N0 медиатором реакции артерий при увеличении напряжения сдвига на их стенке. Конкретно, мы намеревались:

1. доказать, что механочувствительность эндотелия является фактором, ослабляющим констрикцню сосудов;

2. оценить, сколь значим вклад механочувствительности эндотелия в ослабление вазоконстрикции по сравнению с другими опосредуемыми эндотелием механизмами;

3. определить, является ли оксид азота медиатором опосредуемой эндотелием дилатации артерий на повышение скорости кровотока. Научная новизна. Экспериментально доказано, что чувствительность эндотелия к напряжению сдвига обусловливает ослабление констрикции сосудов, независимо от природы констрикторпого стимула. Показано, что этот антиконстрикторный эффект механочувствительности эндотелия весьма значителен: он ослабляет констрикторныс реакции сосудов в большей мере, чем остальные обусловленные функцией эндотелия механизмы вместе взятые. Эти результаты позволяют связать склонность со-судон с поврежденным эндотелием к развитию спазма именно с нарушением механоцептипной функции эндотелия.

Установлено, что ннгибирование синтеза N0 в эндотелиоцитах магистральных артерий котки ослабляет ответы на действующие через эндотелий фармакологические агенты, но, тем не менее, не вызывает ослабление реакций этих сосудов на повышение скорости кровотока. Эти данные позволяют заключить, что в ответ на повышение напряжения сдвига эндотелиоциты способны выделять ЭФР, отличный от N0. Научно-практическая значимость. Исследование антиконстрикгорного действия механочувствительности эндотелия существенно для понимания

общих принципов функционирования и регуляции системы кровообращения, развития сосудистого спазма, а также для изучения патогенеза атеросклероза, гипертонической болезни и других заболеваний сердечнососудистой системы.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: научных конференциях молодых ученых МФТИ, Москва, 1992, 1994; Европейском физиологическом конгрессе, Прага, 1991; ХУН Европейской конференции по микроциркуляции, Лондон, 1992; Международной биофизической школе-семинаре, Пущино, 1993; Всероссийском семинаре по биомеханике, Санкт-Петербург, 1995. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ. Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (Глава I), изложения методики опытов (Глава II), результатов опытов (Глава III), их обсуждения (Глава IV) и выводов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на наркотизированных кошках обоего пола массой 1.8-4.4 кг.

1. Опыты по исследованию ослабления констрикпии артерий, вызываемой снижением трансмурального давления и нораяреналином. Для изучения роли механочувствительности эндотелия в ослаблении вазоконстрикцни мы сравнивали консгрикторные ответы бедренной артерии в двух случаях: когда механизм чувствительности эндотелия к напряжению сдвига активен и когда его действие не проявляется (при расходах крови в артерии близких к нулю).

У фиксированных на столе кошек рассекали кожу над левой бедренной артерией от пупартовой связки до гюнтерова канала и выделяли участок артерии длиной около 1 см для измерения ее диаметра контактным емкостным датчиком перемещений (Рогоза, 1981). Скорость кровотока в артерии измеряли электромагнитным расходомером РКЭ-1 с датчиком расхода Д2М. Артерии перфузировали собственной кровью животного из сонной артерии при помощи перфузионного насоса ПН-4 (Хаютин и соавт., 19.58) в условиях стабилизации трансмурального давления, используя автоматическую следящую систему (Гришанов и соавт., 1982). После окончания операции бедренную артерию соединяли с пер-фузионнон системой и установлнвали на нее датчик диаметра. Затем артерию в течение 30 минут перфузировали при расходе 3-5 мл/мин и трансмуральпом давлении, стабилизированном на уровне 120 мм рт.ст., не осуществляя в течение этого времени никаких воздействий. Далее, регистрировали изменения диаметра артерии в ответ на повышение кровотока ступеньками с шагом 4-5 мл/мни до 40-50 мл/мин. По результатам этих измерений строили зависимость с1(ф) (рис.1), которая у всех животных характеризовалась четко выраженной З-образностыо.

1.7

X 1.4

et

^ 1.6 -

x

x

a

i-u

O. 1.5

1.3

1.2 ->-1-■-■-•

O 10 20 30 (O SO

Скорость кровотока (ил/мин)

Рис. 1. Типичная зависимость d(Q). (Е+ - артерия с иптактным эндотелием, Е- - деэндотелизованная артерия).

Сужение бедренной артерии, вызывали двумя способами: снижением трансмурального давления и стимуляцией адренорецеиторов гладких мышц норадреналином. Для того, чтобы выявить аптикоиетрпкторпый эффект чувствительности эндотелия к напряжению сдвига, сужение сосуда вызывали при "низком" (2-3 мл/мин) и "высоком" (8-15 мл/мин) кровотоке. Как видно из формулы (1), напряжение сдвига на стенке пропорционально расходу жидкости Q. Следовательно, при одинаковом уменьшении диаметра увеличение напряжения сдвига будет тем больше, чем выше кровоток, при котором это уменьшение диаметра произошло. Можно показать, что при выбранном нами "низком" кровотоке вряд ли следует ожидать противодействия констрикции, обусловленного реакцией артерий на повышение напряжения сдвига. Действительно, если при кровотоке 3 мл/мин" вызнать уменьшение диаметра артерии па 20-25% (именно такие величины мы обычно использовали н опытах), то напряжение сдвига при такой констрнкции возрастет в 2-2,5 раза. Это эквивалентно росту кровотока с 3 до 6-7,5 мл/мин. Но из зависимости d(Q) (рис.1) следует, что увеличение кровотока п этом диапазоне расходов практически не приводит к расслаблению гладких мышц, то есть копстрикння в этом случае не должна ослабляться механизмом |кту-ляции тонуса гладких мышц соответственно напряжению сдвига.

Напротив, при "высоком" кровотоке (скажем, 10 Мл/мин) повыше ние напряжения сдвига и те же 2-2.5 раза эквивалентно повышению расхода с 10 до 25 мл/мин. Как видно из рнсЛ, такое повышение расхода приводит к значительному увеличению диаметра артерии, и, следовательно, можно ожидать, что при таком кроЕогоке сдвиговый механизм способен существенным образом противодействовать констрикции.

В каждом опыте, после определения зависимости (1(0), подачу пер-фузионного насоса устанавливали на уровне 3 мл/мин ("низкий" кровоток) и снижали трансмуральное давление со 129 до 90 или 70 мм рт.ст., регистрируя сужение артерии в ответ на тако^. воздействие. После достижения диаметром нового стационарного значения, трансмуральное давление восстанавливали к исходному уровню (120 мм рт.ст.). Затем кровоток в артерии повышали до величины, соответствующей началу крутого участка зависимости с1(<2) и равной, обычно, 8-15 мл/мин, и при этом ("высоком") кровотоке регистрировали ответ артерии на то же воздействие. У пяти животных сразу после этой пары воздействий производили деэндотелизацию бедренной артерии и вновь регистрировали ответы артерии на снижение трансмурального давления при "низком" и "высоком" кровотоке.

У девяти животных после регистрации ответов артерии с интактным эндотелием на снижение растягивающего давления регистрировали также изменения диаметра артерии, вызывавшиеся при "низком" и "высоком" кровотоке нанесением со стороны адвентлции норадреналина в концентрации 310"7 М или 10"6 М. В шести опытах после этого, также удаляли эндотелий с бедренной артерии и повторяли все пробы (как со снижением давления, так и с норадреналином) па деэндотелизованном сосуде. Деэндотелизацию производили, высушивая интиму сосуда в течение трех минут воздухом ШвЬтап еЬ а1, 1975). У трех животных вместо деэндо-телизации механочувствительность эндотелия подавляли, вводя в просвет на 30 секунд 0.02% раствор димера глутарового альдегида. Такая процедура приводит, благодаря повышению жесткости эндотелиоцитов, к избирательному устранению или подавлению ответов сосудов на повышение напряжения сдвига (Мелькумянц и соавт.* 1986). 2. Опыты по исследованию роли механочувствитсльности эндотелия в констрикторных реакциях сосудистого русла органа. Для выявления роли механочувствительности эндотелия в ослаблении констрикторных реакций сосудистого русла, мы сопоставляли вазоконстрикцию, вызываемую одним и тем же стимулом, при перфузии конечности кошки в режимах постоянного давления и постоянного'кровотока. Напомним, что необходимым условием того, чтобы механочувствительность эндотелия могла ослаблять констрикторные реакции, является рост напряжения сдвига на стенке сосудов при их сужении. Если вновь обратиться к формуле (1), то становится ясно, что это условие выполняется в том случае, если при уменьшении диаметра сосудов кровоток в них либо не уменьшается

вовсе, либо уменьшается так, что величина Q/d3 все-таки увеличивается. Вазоконстрикция при перфузии сосудистого русла постоянным расходом крови должна вызвать повышение напряжения сдвига на эндотелии всех сосудов, диаметр которых уменьшается, что, в свою очередь, должно ослаблять констрикцию. При перфузии же русла в режиме ста--билизируемого перфузионного давления, обусловленный сужением сосудов рост их гидравлического сопротивления должен привести, к столь сильному уменьшению органного кровотока, что напряжение сдвига на эндотелии не только не будет увеличивается, но, более того, может уменьшаться. Таким образом, сопоставление вызванных одним и тем же стимулом констрикторных ответов сосудистого русла органа в режимах перфузии с постоянным давлением и постоянным кровотоком должно позволить оценить эффект механочувствительности эндотелия в ослаблении органных констрикторных реакций.

Ясно, что при перфузии сосудистой сети невозможно (в отличие от опытов с перфузией одной артерии) одновременно стабилизировать и кровоток, и перфузионное давление во время констрикторной реакции. При стабилизации перфузионного давления органный кровоток, вследствие повышение сосудистого сопротивления, будет неизбежно уменьшаться. В силу этого можно ожидать некоторого расслабления гладких мышц микрососудов, обусловленного действием метаболических факторов, поскольку недостаточное кровоснабжение должно привести к накоплению в тканях недоокисленных продуктов обмена, обладающих дилата-торным действием. С другой стороны, вазоконстрикция при перфузии органа постоянным расходом крови должна вызвать повышение перфузионного давления, а, следовательно, и трансмурального давления во всех сосудах, включая мелкие и средние артериолы. Так как в этих сосудах сильно выражена миогенная реакция Бейлисса, повышение растягивающего давления должно приводить к усилению их констрикции. Эти обстоятельства делают невозможной однозначную интерпретацию изменений сопротивления микрососудов во время констрикторных. реакций.

Для того, чтобы избежать этой неоднозначности, мы оценивали по отдельности изменения сопротивления относительно крупных и мелких артериальных сосудов, для чего измеряли давление в периферическом отрезке перевязанной артерии голени. Согласно данным Лундвалла и Мелландера (Lundvall, 1971; Mel lander ct al. 1987), так измеряемая величина (дистальное давление, Рджт) соответствует давлению на границе между средними и мелкими артериолами. Это позволяет отдельно оценивать изменения сопротивления проксимальных артериальных сосудов (расположенных выше по течению крови от места измерения дисталь-ного давления), которые не подвержены прямому действию метаболических факторов и для которых не характерна миогенная реакция Бейлисса.

Опыты производили на сосудистом русле задней конечности кошек. В бедренную артерию в дисталыюм направлении вводили канюлю-тройник,

одно из колен которого соединяли с электроманометром, а другое - через датчик расходомера с выходом перфузионного насоса. Вход перфузион-ного насоса соединяли с сонной артерией. Такая схема позволяет перфу-зировать сосуды конечности с постоянным расходом, измеряя при этом перфузионное давление Ро- Чтобы сделать возможной перфузию под постоянным давлением, в центральный конец перевязанной яремной вены вводили канюлю, которую соединяли с выходом перфузионного насоса через через электрогидравлический дроссель, являющийся исполнительным элементом системы стабилизации давления. При превышении пер-фузионным давлением задаваемого уровня Ро (например, вследствие сужения сосудов конечности), дроссель открывается и часть крови, нагнетаемой насосом, сбрасывается в вену, минуя сосудистую систему органа, что обеспечивает стабилизацию давления в бедреной артерии.

Далее, тонкую пластиковую канюлю вводили в периферический конец перевязанной артерии голени и соединяли с электроманометром для измерения дистального давления. Благодаря этому, мы могли определять как общее сосудистое сопротивление Ро/(0). так и сопротивление проксимальных артериальных сосудов (Ро - РДИСт)/0-

После окончания операции и подключения перфузионной системы левую заднюю конечность перфузировали в течение 30 минут при стабилизированном на уровне 100-120 м рт.ст. перфузионном давлении. Далее, переходили в режим перфузии постоянным расходом, для чего пережимали трубку, соединяющую выход насоса с дросселем, и устанавливали такую подачу насоса, которая обеспечивала давление в бедреной артерии равное 120 мм рт.ст. Спустя 5 минут такой перфузии, через тройник, расположенный на выходе насоса вводили с помощью инфузатора раствор норадреналина (10м М). Скорость инфузин подбирали таким образом, чтобы перфузионное давление повышалось примерно на 3050%. Обычно такой эффект наблюдался при концентрации норадреналина в крови равной 1-3 10"7 М.

После того, как перфузионное давление достигало нового стационарного значения (обычно этот процесс занимал 3-5 минут), введение норадреналина прекращали ц давали возможность перфузионпому давлению вернуться к исходному уровню. Далее, снимали зажим с трубки, соединяющей насос с дросселем, возврящаясь к режиму перфузии при постоянном давлении, и вновь вводили (с той же скоростью, что и в первой пробе) норадреналии. В конце этой серии измерений, внутриартери-альпо при пос тоянном расходе вводили ацетилхолин (10"е М) и адснозин (Ю"'1 М), что позволяло оценить способность сосудов расширяться в ответ на фармакологические стимулы, действие которых либо опосредуется эндотелием (ацетилхолин), либо не зависит от него (адснозин).

У 8 животных сосуды конечности, далее, деэпдотелизонывали методом пиюосмотического шока. Для этого сосудистое русло в течение 1 минуты нерфузмровали раствором Рннгера, вымывая из сосудов .кровь,

после чего в течение 30 секунд перфузировали русло дистиллированной водой (Robertson et al, 1979). У 7 животных осуществляли избирательное повреждение механочувствительности эндотелия, вводя для этого в сосуды на 30 секунд раствор димера глутарового альдегида в концентрации 0.02% (Мелькумянц и соавт., 1986). После повреждения (тем или иным способом) эндотелия, вновь регистрировали ответы на ту же концентрацию норадреналина при двух режимах перфузии и ответы на вводимые внутриартериально ацетилхолин и аденозин. 3. Исследование действия ингибиторов синтеза NO на эндотелий-зависимые сосудистые реакции. В серии из 17 опытов, мы выясняли, подавляют ли некоторые производные L-аргинина, являющиеся ингибиторами NO-синтетазы, дилаггаторный ответ артерий при увеличении напряжения сдвига на эндотелии. Для этого мы сопоставляли ответы бедренной артерии на повышение скорости кровотока, ацетилхолин и АТФ до и после ингибирования синтеза NO в эндотелиоцитах. В контрольном периоде опыта регистрировали расширение бедренной артерии на повышение кровотока с 10 мл/мин двумя ступеньками с шагом 15-20 мл/мин, а также на ацетилхолин, наносимый со стороны адвентиции (ЗЮ"7 и 10"6 М, 9 животных) и вводимый внутриартериально (Ю-8 и 3 10 8 М, 8 животных). Концентрации ацетилхолина выбирали таким образом, чтобы расширение артерии, вызываемое каждой из них, было примерно равно величине дилататорного ответа, вызываемого каждой ступенькой кровотока. У 4 животных также регистрировали ответ на вводимую внутриартериально АТФ (10"6 М).

После этой серии контрольных измерений, синтез оксида азота подавляли либо внутривенным, либо внутриартериальным введением мо-нометил-Ь-аргинина (ММА, 8 животных) или метилового эфира нитро-аргинина (9 животных). При внутривенном применении оба ингибитора вводили в дозах 10, 30 или 200 мг/кг, при внутриартериалыюм введении в кропи, текущей в артерии, создавали концентрации ингибиторов 10 и 30 мкМ. В этом состоянии вновь регистрировали ответы на повышение скорости кровотока, ацетилхолин и АТФ.

Наконец, в последнем периоде опыта, мы пытались установить обратимость действия ингибиторов синтеза NO, для чего вводили внутривенно 100-500 мг/кг L-аргинина и вновь регистрировали ответы на те же воздействия.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.1. Влияние механочувствительности эндотелия на сужение артерии, вызываемое уменьшением трансмурального давления. Типичный ответ бедренной артерии на снижение трансмурального давления со 120 до 90 мм рт. ст. показан на рисунке 2. При "низком" (3 мл/мин) кровотоке диаметр сосуда пассивно отслеживает изменения растягивающего давле-

ния. В ответ на скачкообразное уменьшение давления диаметр сначала быстро уменьшается на 140 мкм, а затем медленно "дотягивается" до нового стационарного значения, уменьшаясь еще на 80 мкм, так что суммарное уменьшение наружного диаметра артерии составило 220 мкм (с 1,37 до 1,15 мм) или 16%. Восстановление давления вызывает монотонное восстановление диаметра до исходной величины. Такое пассивное (без особенностей) изменение диаметра артерии соответствует нашему предположению, что при низком кровотоке антиконстрикторнсе действие механочувствительности эндотелия не должно проявляться.

ДИАМЕТР мм

ДАВЛЕНИЕ мм рт.ст.

КРОВОТОК мл/мин

1.5

1.3

1.1

120

90

+Е

А Б

V _

I/

11ги

1

П *

-Е

А Б

3 мин I_I

Рис. 2. Ответы бедренной артерии на снижение трансмуралъпогс давления с 120 до 90 мм рт. ст. при "низком" (А - 4 мл/мин) и "высоком" (Б - 12 мл/мин) кровотоках. (Левая запись сделана дл* артерии с интактным эндотелием, правая - после деэндотелизации.)

При "высоком" кровотоке (12 мл/мин) ответ артерии на прежнее изменение трансмурального давления принципиально отличается от ответа наблюдавшегося при "низком" кровотоке. В перЕЫЙ момент, снижение давления и в этом случае вызывает быстрое уменьшение диаметра на т( же самые 140 мкм, после чего, как и при "низком" кровотоке, начинает ся медленное дальнейшее сужение сосуда. Однако, спустя 25 секунд (з; это время диаметр уменьшился еще на 50 мкм) это сужение сменяете; расширением, которое длится 75 секунд. В результате этого расширена суммарное уменьшение диаметра артерии оказывается вдвое меньше, при "низком" кровотоке. Пришедшее на смену сужен.по расширение со

суда, естественно, отражает расслабление его гладких мышц. Это расслабление мышц еще более отчетливо проявляется при восстановлении исходного трансмурального давлеьия, когда тргнсмуральне давление 120 мм рт.ст. "растягивает" артерию, гладкие мышцы которой расслаблены, настолько, что ее диаметр более чем на 100 мкм (на 7,3%) превышает исходный уровень. Затем, в течение 2 минут происходит восстановление первоначального диаметра артерии.

Такие изменения диаметра при "высоком" кровотоке реализуются только в артерии с интактным эндотелием. После, удалеция эндотелия, ответь: артерий на снижение трансмурального давления при "низком" и "высоком" кровотоке оказывались одинаковыми. Следовательно, расслабление гладких мышц при снижении трансмурального давления, наблюдающееся при "высоком" кровотоке, определяется способностью эндотелия регулировать тонус гладких мышц соответственно напряжению сдвига.

Результаты этой серии опытов показывают, что если при "низком" кровотоке снижение трансмурального давления вызывало уменьшение внутреннего диаметра артерий с интактным эндотелием на 21,6 ± 2,1%, то при "высоком" кровотоке диаметр уменьшался лишь на 12.4% ± 1,5% (пг-14, р<0.01). У разных животных уменьшение ответа при "высоком" крозотоке было в 1,3 - 6 раз меньше, чем при "низком" кровотоке. Артерии с поврежденным или удаленным эндотелием отвечали на уменьшение трансмурального давления при "низком" и "высоком" кровотоке одинаково (р>0,1). Во всех опытах восстановление первоначального давления в артерии при "низком" кровотоке вызывало монотонное возвращение диаметра к исходной величине; при "высоком" же кровотоке всегда наблюдалось превышение диаметром Исходного уровня, свидетельствовавшее о расслаблении гладких мышц.

Итак, если говорить о качественных результатах этой серии опытов, то они полностью соответствуют сделанным, нами предположениям: ответы артерий (их форма и величина) зависят от величины кровотока. При "высоком" кровотоке они действительно оказываются значительно меньше, чем при "низком" кровотоке. При близком к нулю расходе крови артерии отвечают на изменения трансмурального давления лишь пассивными изменениями своего диаметра, тогда как при "высоком" кровотоке снижение давления вызывает четко определяемое расслабление гладких мышц, а повышение давления, напротив, сопровождается последующим повышением их тонуса. Это различие ответов проявляется только в том случае, если сохранена механочувствительность эндотелиальных клеток.

Очевидно, что механочувствительность эндотелия должна ослаблять констрикцию независимо от природы фактора, вызывающего сужение артерии, поскольку для проявления этого механизма существенно лишь само по себе уменьшение диаметра и повышение напряжения сдвига. В ошханных выше экспериментах сужение вызывали, снижая трансму-

ральное давление. Однако все соображения могут быть использованы и при анализе констрикторных реакций, вызванных любым иным стимулом. Ведь значимыми здесь являются лишь два обстоятельства: во-первых, сам по себе факт уменьшения диаметра и, во-вторых, поддержание при этом неизменного (но достаточно высокого, надпорогового) кровотока. Этих двух условий достаточно для функционирования исследуемого механизма независимо от природы констрикторного стимула. Этот тезис подтверждается следующей серией опытов, в которых сужение артерии вызывали норадреналином..

ХЛ*_Влияние механочувствительности эндотелия_на констрикиию

артерии, вызываемую норадреналином. Результаты этой серии сходны с наблюдавшимися в опытах-со снижением трансмурального давления. Ответы всех артерий с интактным эндотелием при "низком" кровотоке были существенно слабее, чем при "высоком". Вызываемое норадреналином (10"6 М) уменьшение внутреннего диаметра при "высоком" кровотоке составляло в среднем 11.8 ± 1.2% против 19.5 ± 1.7% при "низком" кровотоке. Поскольку в обоих случаях эндотелий был интактен и концентрации норадреналина одинаковы, то, естественно, наблюдавшееся ослабление констрикции при "высоком" кровотоке нельзя приписать выделению ЭФР вследствие активации адренорецепторов эндотелия. Тем не менее, это ослабление констрикции несомненно связано с функцией эндотелия, так как деэндотелизованные артерии отвечали на норадрена-лнн одинаковым сужением независимо от скорости кровотока.

Следует отметить, что лишь у 5 из 9 животных деэндотелизация усиливала вызываемый норадреналином ответ бедренной артерии при "низком" кровотоке, причем это усиление ответа было весьма незначительным. Поскольку есть основания считать, что деэндотелизация, осуществляемая высушиванием интимы воздухом, практически не повреждает гладкие мышцы, то можно сделать вывод, что количество .ЭФР, выделяющееся при активации адренорецепторов эндотелия, мало по сравнению с количеством ЭФР, выделяющегося при повышении напряжения сдвига. Это наблюдение позволяет заключить, что обусловливаемое функцией эндотелия ослабление констрикции практически полностью определяется его механочувствительносгью.

Подводя итог, можно сказать, что в опытах на изолированной бедренной артерии кошек показано, что регуляция просвета сосудов в соответствии с величиной напряжения сдвига на эндотелии обусловливает значительное ослабление констрикторных ответов. Этот антиконстрик-торный эффект реализуется независимо от природы стимула, вызывающего сужение сосуда, и определяется (при постоянном кровотоке) самим по себе фактом уменьшения диаметра, которое приводит к повышению напряжения сдвига и, соответственно, к некоторому раслаблепию гладких мышц, противодействующему констрикции. Также выяснено, что ан-тиконстрикторный эффект, определяемый чувствительностью эндагемня

к напряжению сдвига, обеспечивает более сильное ослабление констрик-ции, чем все остальные эндотелий-зависимые механизмы в.месте взятые.

Продолжая исследование роли механочувствительности эндотелия в ослаблении констрикции, мы поставили задачу выяснить, в какой мере это свойство эндотелия может влиять на органные констрикторные реакции. 2. Роль механочувствительности эндотелия в констрикторных реакииях сосудистого русла органа. В сосудах с интактным эндотелием вызываемое норадреналином (1-3-10"7 М) повышение общего сопротивления сосудистого русла конечности при перфузии с постоянным расходом оказывается почти вдвое меньше, чем при перфузии с постоянным давлением (36.8 ± 3.7% против 69.6 ± 7.3%). Этот эффект почти полностью определяется различной констрикцией проксимальных сосудов, сопротивление которых при постоянном кровотоке возрастает лишь на 14.7 + 2.8%, в то время, как при постоянном давлении его рост составляет 72.3 + 7.1%. При обоих режимах перфузии сопротивления дисталъпых сосудов увеличивается практически одинаково: на 62.1 + 4.2% при постоянном расходе и на 65.9 + 4.8% при постоянном давлении. Деэндотелизация значимо увеличивает вызываемое норадреналином повышение общего сопротивления при обоих режимах перфузии (54.2 + 4.0% против 36.8% при постоянном кровотоке и 84.5 + 9.3% против 69.6% при постоянном давлении). Однако наиболее значительно усиливается констрикторный ответ проксимальных артерий в режиме перфузии постоянным расходом крови. Под действием норадреналина сопротивление деэндотелизованных проксимальных сосудов возрастает при постоянном кровотоке на 65.8 + 9.3% (вместо 14.7% в сосудах с интактным эндотелием), а при постоянном давлении оно увеличивается на 86.0 + 9.4% (против'72.3% в интактных сосудах). Видно, что и после деэндотелизации констрикторный ответ проксимальных сосудов при перфузии постоянным расходом эказывается несколько слабее, чем при перфузии с постоянным давлением (65.8% против 86%). Мы полагаем, что это неболвшое различие определяется эффектом растяжения сосудов возросшим трансмуральным давлением. Однако очевидно, что это различие мало по сравнению с различием тех же ответов в сосудах с интактным эндотелием (14.7% против 72.3%). У отдельных животных различие констрикторных ответов при двух режимах перфузии в сосудах с интактным эндотелием составляло 15-6 раз, тогда как в деэндотелизованном русле оно было выражено незначительно - 1.1-1.5 раз. Ясно, что значительно более слабый ответ проксимальных сосудов при постоянном расходе определяется здесь какими-го свойствами эндотелия, а именно, согласно нашему предположению, ;го чувствительностью к напряжению сдвига.

Это предположение мы проверили в опытах, в которых эндотелий |е удаляли, а лишь повреждали его механочувствительность. Устранение чувствительности артерий к напряжению сдвига приводило гак же, как и юэндотелизация, к выраженному усилению констрикторных ответов

проксимальных сосудов в режиме перфузии с постоянным расходом, но не усиливало статистически значимо ответы на норадреналин при перфузии русла с постоянным давлением (р>0.1,п=7, парный тест Стьюдента).

То обстоятельство, что деэндотелизация приводила хоть к небольшому (на 12%), но статистически значимому усилению констрикторных ответов при перфузии в режиме стабилизированного давления, а подавление механочувствительности эндотелия не усиливало этих ответов, позволяет заключить, что эндотелий способен ослаблять констрикцию, вызываемую норадреналином, благодаря не только чувствительности к напряжению сдвига. Так, принято считать, что норадреналин, активируя адренорецепторы эндотелиоцитов, вызывает выделение ЭФР, что должно приводить к некоторому ослаблению вазоконстрикции. По нашему мнению, именно этому эффекту и можно приписать различие ответов на норадреналин в перфузируемых под постоянным давлением сосудах с интактным эндотелием и после деэндотелизации. Видно, однако, что этот эффект мал по сравнению с ослаблением констрикции, обусловленным механочувствителыюстью эндотелия.

Все эти факты доказывают, что при относительно постоянном кровотоке в сосудах органа главным обусловливаемым эндотелием антиконст-рикторным фактором является способность эндотелиоцитов изменять тонус гладких мышц соответственно изменениям напряжения сдвига на стенке.

На наш взгляд, опыты с перфузией сосудистого бассейна при постоянном кровотоке свидетельствуют в пользу предположения В.М. Хаютина (1993, 1995) о том, что именно механочувствительность эндотелия выступает в качестве контура отрицательной обратной связи при развитии гипертонии. Действительно, при прессорных реакциях увеличивается не только сосудистое сопротивление, но также сила и частота сердечных сокращений. В силу этого, минутный объем кровообращения не только не уменьшается, но, более того, может даже увеличиться. Это обстоятельство представляет собой условие для проявления антиконстрикторного эффекта механочувствительности эндотелия: сосуды суживаются, а кровоток в них неизменен или даже растет, и, следовательно, значительно возрастает напряжение сдвига па эндотелии. Таким образом, обусловленную механочувствителыюстью способность эндотелия противодействовать констрикции можно рассматривать как фактор, замедляющий развитие первичной гипертонии.

Итак, мы показали, что механочувствительность эндотелия представляет собой значительно более мощный аитиконстрикторный фактор, чем выделение ЭФР в ответ на фармакологические констриктормые стимулы. Мы полагаем, что именно ослабление ответов на повышение напряжения сдвига обусловливает значительное усиление констрикции и возникновение спазма в сосудах, пораженных атеросклерозом.

Заключительная часть работы была посвященна исследованию действия ингибиторов синтеза NO из L-аргинина на эндотелий-зависимые сосудистые реакции.

3. Является ли оксид азота медиатором опосредуемой эндотелием дила-тании артерий на повышение скорости кровотока?

В контрольном периоде, расширение артерий, достигавшееся двумя ступеньками повышения расхода крови составляло 7.2 + 0.9% и 16.7 + 2.1% от исходного диаметра. Величины ответов на две концентрации ацетилхолина (независимо от способа его применения) составляли, соответственно, 7.4 ± 1.4% н 16.9 ± 2.4%, а на АТФ - 17.4 ± 1.4% (данные представляют собой среднее + средняя ошибка среднего). Ингибирование NO-синтетазы метиловым эфиром нитро-аргинина (10 и 30 мг/кг, в/в) уменьшало величину ответа на более высокую концентрацию ацетилхолина (10"6 М), соответственно, до 41.5 ± 8.8% и 27.9 ± 6.9% от ее контрольной величины, а величина ответа на АТФ уменьшалась до 71.0 + 3.4% и 25.6 + 8.3%. Нитро-аргинин в концентрации 30 мг/кг подавлял ответы на относительно низкую концентрацию ацетилхолина (3 10"7 М) практически полностью (<15% от величины ответа, наблюдавшегося в контрольном периоде). Это подавление дилататорных ответов на действующие через эндотелий фармакологические агенты частично обращалось L-аргинином.

У всех животных внутривенное введение нитро-аргинина вызывало повышение артериального давления и сужение бедренной артерии. Все эти эффекты нитро-аргинина (ослабление или даже устранение ответов на ацетилхолин и АТФ, повышение системного давления и сужение сосудов) были описаны ранее (Mulsch а Busse, 1990; Ishii et al, 1990) и свидетельствовали о способности этого соединения подавлять выделение эндотелиоцитами ЭФР. Однако в наших опытах ингибирование NO-синтетазы нитро-аргинином совершенно не ослабляло ответы артерии на повышение скорости кровотока (р>0.05).

Еще более демонстративно различное действие ингибирования NO-синтетазы на опосредуемую эндотелием дилатацию артерии, вызываемую механическим и фармакологическими стимулами, выявляелось при использовании ММА. Как и нитро-аргинин, ММА вызывал сужение сосудов, повышение артериального давления и подавлял ответы артерии на ацетилхолин. Однако ответы на повышение скорости кровотока после ингибирования NO-синтетазы ММА не только не уменьшались, но значимо возрастали (р<0.01).

Неспособность ингибиторов NO-синтетазы подавить или ослабить ответы бедренной артерии кошек на повышение скорости кровотока свидетельствует о том, что расширение артерий в ответ на повышение скорости кровотока не зависит от образования оксида азота из L-аргинина. В то же время, выраженное сужение артерий и повышение системного артериального давления, вызываемые аналогами L-аргипина, указывают на

то, что какой-то дилатагорный механизм этими веществами все-таки повреждается. Разумно предположить, что ингибирование NO-синтетазы подавляет базовое (в отсутствие стимуляции) выделение эндотелием некоего фактора расслабления, никак не действуя на продукцию фактора, выделяющегося в ответ на повышение напряжения сдвига. В этом случае, наблюдающееся после внутривенного введения ММА или нитро-аргинина увеличение регионарного гидравлического сопротивления можно объяснять тем, что эндотелиоциты постоянно, вне зависимости от действующего на них напряжения сдвига, выделяют в медию NO, то есть само по себе наличие интактного эндотелия (а не его чувствительность к напряжению сдвига) обеспечивает некоторую степень расслабления гладких мышц и, соответственно, поддержание сосудов в несколько расширенном состоянии. Естественно, что подавление образования оксида азота из L-аргипина должно, при этом, вызывать сужение сосудов и повышение их сопротивления.

Результаты этой серии опытов позволяют сделать один из двух выводов. Во-первых, можно полагать, что эндотелиоциты магистральных артерий кошки производят два ЭФР, один из которых выделяется ими постоянно (basal release), а также при действии на них фармакологических агентов, таких как ацетилхолин и АТФ. Этот фактор и представляет собой оксид азота, образующийся из L-аргинина под действием NO-синтетазы. Второй, отличный фактор, выделяется клетками при увеличении напряжения сдвига. То есть, оксид азота, являясь ЭФР, не является медиатором опосредуемой эндотелием дилатацни на повышение напряжения сдвига. Альтернативный вывод состоит в том, что вполне возможно, что увеличенное напряжение сдвига на эндотелии также стимулирует высвобождение клетками NO, однако либо из источника, отличного от L-аргинина, либо из того же источника, но по другому пути.

ВЫВОДЫ

1. В опытах на изолированной бедренной артерии кошек показано, что регуляция просвета сосудов в соответствии с величиной напряжения сдвига на эндотелии обусловливает значительное (в 1.3-6 раз) ослабление констрикторпых ответов. Это антиконстрикторнос действие реализуется независимо от природы стимула, вызывающего сужение сосуда, и определяется самим но себе фактом уменьшения диаметра, которое приводит к повышению напряжения сдвига и, соответственно, к некоторому раслабленшо гладких мышц, противодействующему констрнкцпн.

2. Вызываемая порадреиалином констрикпня артериальных сосудов задней uoiic'iiioci и кошки значительно слабее при перфузии постоянным расходом крови (когда напряжение сдвига при назоконстрикции растет), ■км при перфузии с постоянным давлением (когда напряжение сдвига не у i-.' - i м ■ i м ii;if-i »->( >. .'ho различие (цветов при разных режимах перфузии

сильно выражено в сосудах с интактным эндотелием и весьма незначительно в деэндотелизованном русле, равно как и в сосудах, механочувст-вительность эндотелия которых повреждена.

Деэндотелизация и повреждение механочувствительности эндотелия значительно усиливают констрикторные ответы проксимальных сосудов задней конечности при перфузии постоянным расходом и незначительно - при перфузии с постоянным давлением. Эти данные свидетельствуют том, что чувствительность эндотелия к напряжению сдвига значительно ослабляет органные констрикторные реакции.

3. Способность эндотелия регулировать тонус гладких мышц при изменениях напряжения сдвига является главным обусловливаемым эндотелием антиконстрикторным фактором. Механочувствительность эндотелия обеспечивает значительно более сильное ослабление вызываемой норад-реналином вазоконстрикции, чем все остальные определяемые функцией эндотелия механизмы вместе взятые.

4. Ингибирование NO-синтетазы, вызывая сужение сосудов, повышение системного артериального давления и ослабление ответов на АТФ и аце-тилхолин, не уменьшает ответы артерий на повышение напряжения сдвига. Следовательно, оксид азота, синтезируемый из L-аргинина, являясь одним из эндотелиальных факторов расслабления, не является медиатором опосредуемой эндотелием дилатации артерий кошки на повышение напряжения сдвига.

Сиисок работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Melkumyants AM, Balashov SA, Klimachev AN, Kartamyshev SP, Khayutin VM. Nitric oxide does not mediate flow-induced endothelium-dependent arterial dilatation in the cat. Cardiovasc. Res. 26: 256-60, 1992.

2. Melkumyants AM, Balashov SA, Kartamyshev SP. Endothelium sensitivity to shear stress as an anticonstrictor factor. Int. J. of Microcirculation 11, suppl.l, sl44, 1992.

3. Мелькумянц A.M., Балашов С.А., Климачев А.П., Картамышев С.П., Хаютин В.М. Оксид азота не является медиатором опосредуемой эндотелием дилатации артерий на повышение скорости кровотока. Физиол. ж. им. И.М.Сеченова 78 №4: 61-7, 1992.

1. Melkumyants AM, Balashov SA, Kartamyshev SP. Anticonstrictor effect of the endothelium sensitivity to shear stress. Pflugers Arch. 427: 264-9,

5. Мелькумянц A.M., Балашов С.А., Картамышев С.II. Антиконстрик-торный эффект чувствительности эндотелия к напряжению сдвига. Физиол. ж. им. И.М. Сеченова 82 №4: 93-101, 1996.

1991.