Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антигенные и иммуногенные свойства синтетических пептидов вируса ящура А22

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Антигенные и иммуногенные свойства синтетических пептидов вируса ящура А22"

Ив

1 МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА. И

ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных

На правах рукописи УДК 578.835:616.988.4

МУДРАК Наталья Станиславовна

АНТИГЕННЫЕ И ИШНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА СИНТЕ1ИЧЕСКИХ ПШГОЩОВ ВИРУСА ЯП^РА А,

. 03.00.06 "Вирусология"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир - 1993

Работа выпо.Гг'эка so Всероссийское каучяо-п^зледовзтелъ-■ с ком институте защити животных. -

ЯНУЧНЬЙГ РШЗЗОДИТЕЛЬ:' - ДРЯГАЛИН йнсэлай Яясолзэеяч, кандидат ветеринарных наук, сгаракй кауяЕаН сотрудник.

ОИ-ЩИАЛЫШЕ ОППОНЕНТtí: ;

- МАКАРОВ Владимир Владимирович,' доктор биологических наук. профессор ( ВНйКЕЕи"-, г.Покров); -

- ®НЮ Антонович, . кандидат ветеринарньс: наук, старшгй наганый сотрудник ( EffiSGS, г. Владгслф). •

БЕДНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Всероссийский научно-последова-, гельскпй к технологический .институт биологической проьаля-лгнкостн г. Щелково Московской области.

Защита состоится ф" 0*/ ■ 1993 г. в ю цасоБ ка . заседании специализированного совета К 120.60. 01. по гаците диссертация на соискание ученой степени кандидата наук при Всероссийском научно-исследовательском институте гаситы - жвотньк по-адресу: Б00900, г. Владимир, п. Юр^ёвед, ВНИ-"

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты ли- ..

еотных. . ji . -

Автореферат разослан 1993 г.

Ученый секретарь спецкалкагфованного.совета - Узшов B.JL

-г- -

СЕДАЯ ХАРДЕ! ЕРПСТТША РАБОТЫ •Актуальной:& темы. Ящур-распространенное заболевание гарнокопьггкых.какосяз^е больной экономический ущерб животноводству. В настоящее время наиболэе еф|з<сг1Евкым средством специфической профилактики ящура является Еакилнация препаратами, приготовленными ка основе иначтивироваккого вируса. Однако, зирзкая практика производства и ксполезовз- . клл показала и определенны? недостатки таких вакцин. Е частности, суцестнузт проблемы изготовления шчгктпвпрсван-еых вакцинных- препаратов кг штаммоз вируса, плохо раз'.йс-. жнеднися з культурах клеток. Некоторые штакайг вируса япура кестабилы-гн, разругается до субъединиц при проведении различных манппулнцп! и хранении. Длительное культивирование в различных клеточных л:п~ие:-: мэкзт привести к возкикнозе-223 лтамшв, отлгчагщдзсса по антптекности от исходного вируса. Црмаслэнноэ производство зачцкн связано с нзработ-кей большого количества вирулентного вируса, при которой не исключается риск неполной инактивации вируса, в результате чего могут вспыхнуть очаги зппзоотий ящура при вакцинации такими препаратами. _ И, наконец, в традиционные:, про- . тизоясурных.вакцинах содержится значительное количество балластных примесей, перегружавших кммункую систему вакцинируемых животных.

• В связи с вышеизложенны}..?, з последа?? годы больше внимание привлекает ■ идеи создания искусственных - вакцин, когда з качестве антигенного материала используют синтетические пептиды, имитцрувз^э Ьнтигеккне детерминанты ка-тивного белка л »дэделирупщие ■ каким-дий'о образом их ; пространственную структуру.

К преимуществам пептидны:-: синтетических вакцин можно отнести: стабильность, отсутствие в препарате посторонних белков и нуклеиновых кислот,известный химический состав, возможность получения пептидоз, кинтирупцнх антигенные , 'детерминанты тех вирусов,чье производство в больших количествах, затруднено по разным причинам;возможность создания

- з -

поливалентной вакцины в виде единого полимэра,содержащего деге ркинантнкэ группы антигенов разных тшоз вирус а, практически неограниченный срок хранения антигенов.

В начале 80-х годов появились первые.сообщения о возможности получения путем химического синтеза антигенов вируса япура. Б ряде лабораторий мира были получены синтетические пептиды - аналоги аминокислотных последовательностей различных участков УР| вируса ящура типов А и 0,обла-дакпЗ:-: актигекностьк и ю.аф'ногенностью для лабораторных и встгсствекно-воопрпимчизых животных. Однако, полученные -препараты по ряду причин ке соответствовали требованиям, предъявляв} ги к вакцинам и поэтому в этом направлении лро-дслыгсхся интенсивные исследование.

Данные исследования явились фрагментом больной поисковой работы двух научно-исследовательских институтов 'по создания вакцинных препаратсз против ящура на основе синтетических антигенов. Поскольку отбор полученных образцов синтетических пептидов требовал большого количества экспериментов по их испытанию,возникла настоятельная необходи- ■ мость в определении принтов и методических подходов при отборе и изучении иммунологических свойстз препаратов и образцов вакцин с использованием,различных .серологических гестов. • • . .'.

Цаяв « задачи исследозаюй. Целью кашей работы явилось изучение антигенных и иммуногенных свойств синтетических пептидов вируса ящура А ¿2. с применением серологических ре-, акций. . '

Для достижения этой цели - были' поставлены следующие задачи: •' ' :

- отбор в ходе первичного скрининга в имыунофэрмент-ком анализе /ИФА/ по связывании со специфическими противо-яцтрны-шГ антителами пептидов для испытания их на .животных,

- оценка с использованием серологических тестов гуморального ¡шмункого.ответа на синтетические препараты у лабораторных и восприимчивых животных;в зависимости от ус-

■•ловий иммунизации -/дозы, . краткости введения, адмзваятов, продолжительность'иммунологических реакций/,

- изучение с пецийичнос ти иммунного ответа на синтети-чаокиз антигены, ;

- изучение влияния синтетически;-: антигенов на синтез основных- классов пшгунсглобулиноз.

Научкгя корнана. Впервые по результатам скрининга из 40 образцов синтетических пептидов отобран ряд пептидов -аналогов амнкокислотньо: последовательностей из основного патогенного участка УР^- вируса'япура для опытов на лабораторных л Еоезршаотзкл животных.

Показана связь нежду кмкуногенкостью испытуем: препаратоз для у-'ботнкх и :пс активностью в И2А.

Установлено, что испытуемые пептиды были типосг.енп-' фпчны' в ПСА, а антитела, индуцируемые ими, не реагировали с. вирусом других серотнпсз. '

Показана связь ме;^ду уровнем взфусспецкфкчески:-: . /И2А/; з;грус:-:ейтрал1гзугзт:1:: антител ,п протективным эффектом в опытах"на зоспраюкигшс .животных. -

Опраделеко, что длительность иммунитета на отдель- . ;ные пептиды составляет не-менее езсти кэскцез, ' а содержание сскозкьз-: классов клг/ноглобулинов в различные . сроки после иммунизации синтетическими'препаратами соответствует .таковому на полньй вирусный антиген. .

На. основании получение: результатов разработана и .предлзкзна схема отбора и оценки иммунобиологических сзойсгз синтетических антигенов "длй изготовления противоя-шуркых пептидных вакцин. .

Ярггтгкческсэ гкгченйэ раСзш. Разработаны методические подходы.в.оценке антигенности и иммуногеннссти син-. тетичеекпх препаратов-аналогов аминокислотных последова-— тельностей УР^ вируса-ящура

Дня изготовления опытных образцов вакцины были рекомендованы пептиды с-последовательностью аминокислот УР^135 -159 (ИЕЗО и (142-145) п (ЕШИЗЖ). ; /

Еа основании исследований была подготовлена "1!ето-дика оденет антигенной к иммузогеяной активности .синтетических прсткзояаурных преларатоз на лабораторных животных. ", которая рассмотрена на Ученом Совете и утверждена директором института. •

Результаты исследований включены в "Инструкцию по изготовлению и контролю экспериментальных образцов'синтетической противоянурной вакцины А р£ и " Инструкция по изготовления к контроля пептидной вакцины против ящура ¿¿2 • для снец" {утверждены директором ЕЗСВН).

АпроЗалик работа. Материалы йиссертацпи долохекы, . оссундекк и одобрены на конференции "Актуальные проблемы ветеринарной вирусологии /Владимир,1388/, Всесоюзном' сим-поеща® по химии пептидов /Рига, 1390/, конференции молодых ученых ВЕЖ /Владимир, 1590/, Международной конференции "К ногой стратегии борьбы с яшуром"/Суздаль,1991/, кскферен-ццк по вопросам ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии /ВАСХН - Покров, 1932/, на заседаниях методической комиссии и Ученого созета ВЕИЯй в 1385- 1991г. з виде отчетов.

Цу&&иации каучнък лсслэдогажхй. По материалам диссертации.опубликовано 3 научных работ. .. . • Структура, .и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, список литературы и приложение.

Работа иллюстрирована 17- таблицами и 12 рисунками.

Список литературы включает 93 источника, из них 10 отечественных и 83 зарубежных азтороз.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Яйптиды. Для изучения были отобраны пептиды с последовательностью амкнокислрт: 10-24, 33-61, 5£Ь69, .90-98, 155-153, 123-159,. 140-159, 135-159,- 175-1&&,.. 13^213;/СИК-. тегированы з лаборатории химии пептидов, института биоорва-

нической химии АН СССР/ и 10-25, 141-150, /142-151/п, 142155,. 145-155, /142-155/, /145-155/п. 197-213, 2.00-214 /синтезирована в лаборатории генетики БНИЛЗН/. Пептиды ис-пытнвались-либо в свободно;.; Епде.лпСо в виде'кокъагатов с белновьми носителями.

Резггциа кейтралкзздак ставили в 'этльтуве клетск

■ свиной печки /СП/ а пенициллинсвых флаконах, используя

• двукратное r-аззедеякя :;2ь-х:уе:,.ой сыворотки и йостолКку& дозу вируса 100 ТПД 50/0,1. мл.

'¡Тротивазггсгэдкьг /ВИД/ и •акгЕвируекмз /ДВА/ антитела, а такяе типоспецифпчность пептидов и сывороток определяли в непрямом ♦ варианте твердофазного гмаукофер-ментного-метода /Crovthsr е. а , 1979; Voller е. а. . 197S/.-

Счисхяу к выдэлзкпг 146S компонента вируса ящура осуществляли по "Методике получения высокосчпщенных препаратов лапинизированного вируса ящура типа А". Утверждена. детектором ВНйЯй.

■Очпстгсу к щцчлзшхз газ^укоглсбулиноз из сывороток

■ крови.йязотяыю проводили по "Ьйтодике выделения гаша-гло-• буашноз из сывороток крови". Утверждена директором: БНКЯй.

Гпгэр;гзгуккъз саварокн на различные варианты вируса ящура типа А, типа 0 л Азия-i получали путем двукратной иммунизации кроликов 1455 кешоиентом вируса в дозе SO-ICO .мкг.- .■■--•.'• .

Счззгпгу к гТтГ'"'"Р"21"сгро2плз:-э противопептидкых . еызо-ротол проводили катодом аффинкоЛ хроматографии, используя з качестве асфги-кого .сорбента бе'док А-сейзрозу CL-4E.

Кйлтяеетнещта спраделзшш игглупоглобуяйноз классов 8-ii-ÍI осуществляли по методу йанжни /1965',используя •монсспецифическне ахтиенвороткк против Ig'3 и IgM крупного рогатого скота, полученные"в лаборатории -ю:мукологии ЁНИШ.

Оп?-,ггы ка аквоххых. Шауногенкые свойства синтетических препаратов оценивали на лабораторных и восприимчивых 's .

жвотных. Юрским свинкам и кролика.^ введение вакцины осуществляли внутримышечно, в объеме О,'5 мл. Вакцинированных морских свинок на 28 день после иммунизации заражали ялантзрно адаптированным к ним вирусом в дозе 500-1ССО ЯДС з 0,1 мл. ' '

Естесственно-восприимчивых к ящуру животных имму-нкзирозали эмульсионным препаратом одно- или дзукратно в объеме 2,0 мл, подкожно. Иммунитет.к ящуру у вакцинировгн-ного крупного рогатого скота и овец проверяли на 21-60 дни после иммунизации путем заражения животных контрольным вирусом а дозе 10СС0 ИД^-з 0,2 мл кнтрадврмолккгвально.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. ОгЕор пептидов з ША.

На начальном этапе перед испытаниям на лабораторных животных был проведен- скрининг пептидов в непрямом варианте иммунофэркентного метода по связыванию с антителами кролика, иммунизкрозанного 1483 компонентом вируса ягдтоа А . Было исследовано свьше 40 пептидов-аналогов первичных последовательностей из. раз личных участков \'В. , причем проверились пептиды как в -свободном виде, так и в виде конь-югатов с. белковыми носителями. Пептиды с последовательностью аминокислот, соответствующих К- и -С-концевым областям УР> - Еяруса;ящура А^ } проявили относительно низкую активность при -связывании с противрящурными антителами /таблица 1/-..

При испытании антигенных свойств синтетических пептидов с , последовательностью аминокислот из оснозного иммунодоминантного участка 130-160_ титры -противояшурных антител были значительно выше. Следует отметить, что-пептиды в полимеризованкой форме, по сравнению с мономерами, были намного, 'активнее. '.Так, титры сыворотки в реакции с пептидами 14Й-151 и 142-155 не превышали фоновый , уровень, в тс-время как при связывании с этими же пептидами в форме -полимера они достигали значений 3,0-3,2

_ г>

Первоначальный скрининг з иммунофэрментяом анализе выявил дза.пептида с последовательностью аминокислот .из главного ика/гукодаминанткого района. Помимо упомянутого выше пептида /142-155/п-/синтезирован во БНИЯИ/,. хорошие результаты 'показал пептид 135' - 159 /синтезирован в Институте биосрга-нпческой химии ■ им. 'Шемякина /.

Таблица 1.

Активность пептидов з JÍS2A при связывании с противо-яшурными антителами.

Пептиды

i i х- и C*tíí т

r-ip.. -Г f ^ А»^

Пептиды-

¿ИТр

re л (lg)

61 25 70 со

39 10 50 -90

175 - 18Q 187 -213

141 - 150.

142 - 151

(142-151)п

•1,7 i D, 1 . < 2,0 ' 1,5 ± 0,3 • .1,7 ± 0,1 2,2 ± 0,1 . 2,So¿ 0,20. 2¿S ± 0,2 . 1,7 i 0,1 3,0 i 0,0". ,

142 -155 . 1,7 ¿C,1 (142 - 155) П 3,2 ±0,1. (145 - 155)KLK 3,0+0,0 (145 ■ - 155)n 3,0 + 0,0

.136 - 159 - 145S A KLH '

3,3 ¿ 0,5 4,5 ± 0,2' < 1,5

Титр противояшурных иммуноглобулинов з реакции с ним дос- ' ; тигал 3,3. ± 0,5.Проявили активность -и другие пептиды,' воспроизводящее фрагменты'аминокислотной послэдозателькос-•ти из главного иммуногенкого участка \'?х вируса ящура А22>.

141-160, 135-151,/ 7142-151/п, /145-155/И.Н,- /145-155/П. •С-------

.остальными из проверенны-: пептидов противсяцурная сыворотка* была,примерно'в 10-15'раз менее активна.

Таким образом, . в результате скрининга з И5А был выявлен ряд-пептидов, проявивших специфическую активность

при связызании с противоящурныма антителами. Эти пептиды были отобраны для изучения .их иымуногенной■активности на лабораторных и восприимчивых животных.

2. Изучекмэ антигенных и иглцуногенгшх сзойств синтетических пептодоп па лабораторных гзшотаых. Для- изпения иммуногенности синтетических препаратов в качестве экспериментальных животных использовали кроликов и морских свинок. Активность пептидов оценивали по уровню вируснейтрализупцих (ВНА), антивирусных (АБА) и прстпволептидных (ППА) антител в сыворотках крови подопытных животных, а также ло протектизному действию испытуемых пептидов в экспериментах по контрольному заражению вирулентным вирусом морских свинок, вакцинированных' синтетическими препаратами. •

Пептиды с последовательностью- аминокислот 10-25, 50-59, 90-98 в свободном виде нэ индуцировали у кроликов образование антител и не защищали морских свинок от заболевания при контрольном заражении. Конъюгаты этих пептидов с гемоцианкноы стимулировали синтез противопептидных антител, но они не индуцировали вирусспецифическую активность, не ингибировали размножение вируса ящура в культуре клеток и не проявляли протективной активности в тесте защиты на морских СЕИнках.. • • _

Бептид 135-151 в свободном виде' не' индуцировал образование у кроликов противопептидных и антивирусных антител, ко в то же зреыя проявлял протекгивную активность'на морских свинках /процент защиты - 57/, т.е. иммунный .ответ ка него зависел от вида животного..

Когда же с помощью конъюгации с KLH удалось сгиму-ляровать у кроликов иммунный-ответ на этот пептид /ППА -4,5 ig- / то, оказалось, - что эти антитела проявляли вирусс-пецнфнческую /3,8 1е-/ и вируснэйтрадизующув /7,Q-7,71og2/ актхшностзД а его протектизные свойства возросли до 82%.

Свободные пептиды с последовательностью аминокислот С-концевого участка шшшеятида VP 175-189 и 197-213

- 10 - •

вызывали образование- противопелтидных антител г кроликов, однако эти антитела- не проявляли В1фускейгрализузлу£ активность« Более того, иммунизация этими пептидами без носителя не зашивала морских свинок от заболевания при контрольном заражении. В то ке время кснъггат пептида 197-213 с гемоцианином зашагал 60% морских сгкнск от -заболевание.

Эксперименты показали, что наибольшую активность в опытах на лабораторных животных проявили пептиды с, последовательностью аминокислот • из основного акмунагенного участка Ур£: 141-160, 136-159, (142-155)п,-135-151. В свободном виде они стимулировали образование ША, АВА и ВНА в высоких титрах и проявляли 30-100% лротектизный аффект . в опытах на морских свинках.

В последующих опытах по изучение различных характеристик синтетически:-: антигенов использовались эти пептиды.

Елилннэ условий кз^уккзацкн на. е&рологичг-енпэ пс;егц;з.тз-тм т-г-мутгкпга отвага, у морских свиксж.

3 ряде экспериментов изучали влияние условий икмуни-•зацки на индукции противрпептидньк, антивирусных и вирус-нейтрализуюпцп":.-антител у морских свинок.

Для определения - доза и' кратности вакцинации полимерный пептид (142-155)Я а форме эмульсионного, препарата вводили морским 'езинкам однократно в дсзе->5С мкг или двукратно-по 25 МКГ'С ревакцинацией через 3,7,14,23 й 42 дня. Протектизную актизность пептида определял путем заражения интраплантарно контрольным вирусом в дозе 200-5С0 ИД 50. /0,1 мл.

В этом опыте., вирусспецифические антитела в сыворотках подопытных гкявоткья определяли в ЙФА, начиная с 3 дня после первой иммунизации. В ходе зкееприкекта их уровень возрастал, достигая значений 4,0-4,4 1® (на 23 день после первой.-иммунизации), что соответствовало наиболее высоким значениям титров вируснейтрализукщих антител (3,3

Для оценки иммуногенной активности пептида (142-155)п было достаточно однократной иммунизации, поскольку на 28 день при контрольном заражении 4 из 5, животных были защищгны,. з тигры ЕНА и АБА достигали при зтом значений 2,4 log¿ и 4,4 lg, соответстззнко. Уров0яь антител у морских свинок, . иммунизированных двукратно, зависел от интервала между вакцинациями. Ревакцинация через 7-14 дней стимулировала активную выработку вируснейтрализухних и антивирусных антител. На 21 день после■ второй ■ иммунизации самый высокий гитр-ВНА (3,3 log¿ наблюдался в группе морских 02ИН0К. вакцинированных двукратно с интервалом в 7. дней. Б этой же группе определяли достаточно высокие значение титров вирусспецибических антител (4,Dig).

Следует отметить, .что в груше животных, которым повторное введение пептида проводили через 42 дня после первой иммунизации, титр БНА. через 10 дней составил ,• в среднем,. 3, llcg2. Однако, для быстрой, оценки ищунсгеккой активности на лабораторных животных синтетических препаратов, такой пнтерзал между вакцинациями не является удобным, тем более, что в данном опыте таких же серологических показателей удалось достичь в группе с 7-дневным кнтерва- . лом на 21 день после 2-ой иммунизации.

. Таким образом,' уровень накопления зпруссг.эцифичес-ких антител ' в крови подопытных яивотных в разные сроки после первого введения синтетического антигена был сопоставим с титрами вируснейтрализушщ антител. Протективный эффект при зсех схемах иммунизации сказался примерно' оди- ; каков. Поэтому, в дальнейших экспериментах по испытании иммунологических свойств синтетических пептидов ' кспользо- '' вали однократную иммунизацию с контрольным заражением на 26-е сутки.

Исходя из данных .литературы о важной роли адтжван-тсв в формировании иммунного ответа ка синтетические пептиды, ь отдельно« . опыте на юрских свин:-эх изучали адъ-квангную активность ряда препаратов, используемых для

■ - 12 - '

. традиционных протизоящуркьн вакцин. Были испытаны следув-щэ. адъюзанты: полный адъювант ррейнда (ПАФ), масляные .адъизангы 1 и 2 ( полученные из лаборатории инактивирован-ньк вакцин) в форме водно-масляной эмульсии, масляный гдъ-взант 2212 (синтетическое масло ПЗС-З), масляный алькзвакт (минеральное масло) с 25% ланолина, суспензия 47* дгускисн кремния с сапонином. Е качестве ионогена использовали полимерный пептид (142-155)п в дозе 50 мкг на >пвотное. Через 28 дней провели контрольное заражение морских свинок, часть животных была тотально обескровлена.. Результаты проверю: зкруснейтралигузэдэй, антивирусной и прстекткзкой активности пептида показали. - что, наряду с сироко применяемым при испытан:::: пй.гуногенной актизнссти синтетических антигенов полным адъгзантом Фрейяда, хорошее стимулирундее действие на иммунную систему оказали адьюзанты 2 и ГЕЗС-З. У животных, когорыл вакцинировали пептидом в сочетании с зтши зещбстгзк:, 'отмечались высские уровни ВНА и АЕА и полная защита от язура. Наименее слабым адъззантом была двуокись кремния с сапонином и масляный адтагант на основе' минерального масла с сапонином. В группа:-:* где применяли зти адазакты, • каблидалгя самый низкий уровень защиты и, соответственно, невысокие титры ДВА (2,0-2,7 1£) и ВНА (< 1,0-1,1 юеа).

Таким образом; количественные показатели как ДВА, так.и ЕНА, в данном-опыте были сопоставимы и коррелировали с уровнем запреты хизотных от инфекции.

. Продолгсктоланасть }&сг;'1:олог;-шс;к!й рзшщпк у ла-• ' бораторккх йквотньк посла вакизаящии сшпгатжгс-

'П-ЗЗ! ПЗХГГНДЗМК.

Одной из важнейших характеристик вакцины является" напряженность и продолжительность вызываемого ш поствакцинального иммунитета. ' Объективной оценкой длительности • . иммунологической реакции является урозень вируснейтрализу-щих .антител, циркулирующих в крови вакцинированного жи-

ватного.

В опыте на кроликах изучали продолжительность циркуляции антивирусных и вир ус не йт р ализ угхцих антител в сыворотка;-: крови кроликов, вакцинированных пептидами (136-151)KLH и 136-159.

Было установлено, что конъюгат пептида 135-151 с KLH после двукратной вакцинации стимулировал у кроликов длительный иммунный ответ. Вируснейтрализухщке и антивирусные антитела у х-л&гунизирозгнных пептидом животных определяли в течение года (срок наблюдения), причем в течение 9 месяцев и:-: уровни достигали высоких значений (ВНА-дс 6,5 Icg2, ABA-до 4,3 lg). К концу года их титры снизились до 3,5 1o's2(EHA) к до 3,0 lg (ABA). Проведенная через 12 месяцев ревакцинация пептидом (136-151)KLH вызвала незначительное повыление уровня антител.

Свободный от белкового носителя пептид 136-159 по сравнению с кокькгатом пептида (135-151)KLH индуцировал у кроликов после 2-х иммунизаций относительно невысокий уровень ЕНА (до 5,5 log2) при высоких титра:--: противопептидных ( 5.0 lg) и антивирусных (до 4,0 lg) антител. К концу года отмечалось, снижение титров: ППА-4,41^; АВА-3,2 lg и -ЕНА-2,0 log2. Ревакцинация.этим пептидом через 12 месяцев вызвала 'подаем антител-, как вируснейгралкзузкг.их,. так и антивирусных. •

Таким образом, синтетические пептиды с .последовательностью аминокислот из основного иммуногенного участка У?! индуцировали у кроликов выработку зирусспецифкческих и вируснейтрализуюЕИХ- антител, которые•сохранялись у .тавотных в течение 9-12 месяцев (срок наблюдения). .

На основании -проведенных'на лабораторных животных опытов по испытанию иммуногенной активности различных синтетических препаратов был отобран ряд- пептидов, ■ наиболее активных ni иммукогенноети,' для проверки на естесствен-но-воспрнжчивых животных. • Среди них оказались пептиды: 135-159, (142-155)л, 141-150, (142-351)л, наиболее актив-

- 14 - , s . кыз яри скрининге в ИФА. • _

2. изучив» актнгенньи и иммуксгелньк свойств синтетических ллткгеша тз. крупном рогатом скоте и овцах.

На естесстзенно-зсспркпмчпзы:-: животных издали влияние дозы антигена, кратности иммунизации, адъкзантоз на синтез зирусспзш-фзческих и Еируснейтрализующих антител и продолжительность кх циркуляции з организме :-с;зстны:с. Напряженность иммунитета оценивали по устойчивости хлвот-.....ных к заболеванию после заражения вирулентным вирусом.

Основные результаты опытов на крупном рогатом скоте суммированы в таблице 2. Данные этих исследований показали, что пептиды (142-155)я и 135-153 в составе эмульсионной вакцины с учетом испытанны:-: доз антигена были близки- по иммунсгеякосгя, обеспечивая защиту около 50л подопытных дизотных. Уровень нейтрализующих антител у животных, выдержазЕих контрольное заражение был выше 5,7-5,01сё; а вирусспецифкческих - > 3,0 lg-. Как и в опытах на морских свинках пептидные вакцины с ГОА и сапонином показали худите результаты по сравнению с масляными.

Подтверждены данные DiMarchi е. а. (1985) о'положительном влиянии пептида - аналога С-концевой детерминан-- ты 200-213 на ишуногенность пептида из йммунодоминактного участка -VP1. при их ксвалентном связывании-. Высказано - предположение, что зтог комплекс имитирует конфирмационную детерминанту. - ' -

. В.'рщте на ХРС была проверена длительность иммунного ответа на-синтетические пептиды 136.-159 и (142-155) п • - в течение 6 месяцев. 5 голоз крупного рогатого скота имму-'. визировали двукратно полимерным пептидом (142-155) п з дозе 1,0-3,-0 мг с интервалом 42 дня. Б качестве адткванта ис-, - пользовали препарат на основе синтетического масла £315. Пробы сывороток отбирали до вакцинации, через S0,41,60,S0, 120 и ISO дней после первой иммунизации. Данные серологических тестов сравнивали с результатами контрольного'зарз-

laöj&nra 2

Иммунагенная активность синтетических пептидов после двукратной иммушзаши для крупного рогатого скота

ЙТпДоза "Тдьттт Jjlipn антотоо^д^ажешен^ Ззщище-W) П11Л ДВА ВНА(log «)

- : (cg) (£а) ® с бсого

в опыте

(I42-I55)n i 3,0 •• с.м.3315 4,0 3,7(3,4-4,0) 6,4(5,0-7,0) 2/2

(142-155)п 3,0+1,0'ПЛФШЛФ 3,5 2,0(2,0-3,0) 5,7(4,5-8,0) 1/2

(142-155)п 3,0 ГОА+сап. 2,0 2,0 1,2(1,0-2,5) 0/2

(142-155)пзг ' 3,0 с.и.3315 3,0 2,5 4,5(4,0-5,0) 0/2

136-159 1,0+0,1 ПАФ-ШФ и.о. 3,64(3,57-3,7) 9,4(9,3-9,5) 2/2

136-159^ 5,0 ПЛФ и.о. 3,05(3,0-3,1) 4,9(4,2-5,7) 1/2

136-159 ' 1,0 с.м.3215 и.о. 2,8(2,6-3,1) 5,0(4,6-5,4) 0/2

■I36-I59 1,0 ПАФ+НЛФ и.о. 3,2(2,5-4,0) 6,2(5,0-8,3) 3/4

141—1.60 б/н 1,0 ПАФ+НАФ и.о. 3,0-3,4 6,2-6,3 0/2

Ü4I-I6Q)+( 200-213) 1,0 с.м.3315 и.о. 3,0-3,5 4,0-6,1 2/2

контроль' - ' - - <¿1,6 -¿1,0 0/6

Ol

н - однократная иммунизация; - полный адаювант Фрейида; НЛш - неполный адъюваит Фрейнда; с.м. ~ синтетичоскоо масло. ,

да кия черео 1SS дней после начала опыта.

Ч годе зкссесиквкта у светлых наблюдалось bcsk лзние в кров5" уровней ISA. .АЗА я ВНА вплоть до 4 месяца. Причем у трех жвотн'пгх. не заболевших яглуром после з£р£;-:е-нкя, татры антител через 4 месяца после первичной вакцинации высохли s среднем: ППА - от 2,2 до > 4,6 lg; ABA - от , 2,0 до 4,2 и ВНА - о? С.4 до 0,0 Ig (10,1 lo%¿ , а через С месяцев значения ABA составили 3.3 а ВНА-1,3 1с-( 5,4 1 .

У двух животных, не выдержавших контрольное гага-женпе титры антител были суп»ctsshko и достигали: ППА - 4,0 ig; ABA - 3,12 la; и ВНА - 1,4 ig (4,55 log2), 3 через 5 месяцев к окончаний эксперимента и:-: уровень не превышал : ABA - 2,3 1? и ВНА - 0,3 (2,55 lcg2). На основании этих результатов можно сделать вывод, что уровень ABA и ВНА в данном опыте являлся объективным показателем иммунитета у животных, привитых синтетические полимерны:.! антигеном.

Параллельно с опыта:,и на крупном рогатом скоте. пь&1у~:ог5У,г.ь:а свойства- отобранных синтетических препаратов пспытывались на овцах ( таблица 3). Однократная иммунизация полимером (142-155^п в дозах 5,0; 3,0 и 1,0 мг. в сочетании с ПАО пли отечественным иммуности^лятором на осноге синтетического .масла 3315 обеспечивала защиту овец. Как правило, в сызорс^ках животных при дзукраткой вакцинации пли при однократно: - больной дозой (5,0 мг) отмечались высокие■уровни ABA (4,3-4,5 lg) И ВНА (8,9-3,8 log2). Ври конструировании вакцинного комплекса, где в качестве антигена испытызался. пептид-135-159, адъьзант гидроксал с сапонином оказался не активны:.;. Этот пептид в сочетании с другими ад'ьюзак-таьптпндуцпровал относительно' чевкзок::* уровни ППА (ДО 4,0 lg), ABA (до 2,8 и ВНА (до 3,71c----¿'. Тем не менее все подопытные животные были устойчива контрольному зара-кечиы.

На овцах, иммунизированных полимерным пч пм; •:.

Таблица Я

Иммуногенная активность синтетических пептидов для овеп

п • Кратность 'Дттрн антител перед заражением •

Пептид {Щ ишуниза- Лдьювант ^ ВНЛ(^)

(142-155)п "1,0 3,0 - 5,0 ■3,0

• 1,0 136-1.59 1,0 1,0 • 1,0 контроль '-

2 2

Запущено

'Своего в опыте

,ПМ+НМ и.о. 3,9(4,2-3,6) 9,4(9,0-9,8) 2/2

4,1? 8,0 1/1

4,3(4,0-4,6) 8,9(8,7-9,2) 2/2-

с.м.3315 3,35(3,5-3,2) 2,1 • 2/2 •

2,7(2,2-3,2) 1,7 . 2/2

ПАЗ 3,25(3,0-3,5) 2,69 3,6(3,5-3,7) 2/2

с.м.3315 3,0(2,0-4,0) 2,4(2,0-2,8) 2,0(1,0-3,3) 2/3

ГОЛ+сап. 2,0 -¿2,0 ¿1,0 ■ 0/3

- 2,0 ¿2,0 <1,0 0/4

. ПМ>, НЛФ -адаговсшты Фрейнда.

(142-155)" была исследована зависимость медду дозой г-"гида, введенного двукратно, с интервалом в 42 дня, и иммунологической реакцией жзвотных з течение 6 месяцев.

Отмечено, что трехкратное снижение дозы (до 1,0 -1,0 мг) синтетического полимера не оказало существенного влияния на уровни антивирусных и знруснейтрализукпщ антител на протяжении всего эксперимента.

В отдельном опыте изучали продолжительность и;л,(у-нитета у овец, вакцинированных одно- и двукратно в дозе 1, О мг пептидом 136-159. Показано, что однократная иммунизация индуцировала очень низкий уровень ЕЕА. После ревакцинации через 42 дня уровни БНА и АЗА резко возрастали, достигая пика к 3 месяцу (5,0 log^ " 2.25 соответственно), з последующие дни они продолжали циркулировать. б крови, достигая к концу опыта значений: SHA -4,15 log2 и АБА - 2,7 lg\

Эксперименты нз естессгзеяно-зосприпмчивых яивот-ных показали, что синтетические пептиды, отобранные на предыдущих этапах работы, оказались иммуногенкыми для крупного рогатого скота и озец. Они индуцирозали выработку антивирусных и зируснейтрашзующкх антител, уровень которых зависел-от условий иммунизации. Продолжительность циркуляции антител составила 6 месяцев (срок наблюдения).

3. Сгтгцифкчкссть еяктетаческих пептидов и ккду-¡ЗФуеьзгх антител Одной из • ■ .'„яжных характеристик антигена является специфичность, индуцируемого им иммунного ответа.

Типоспецкфичносгь синтетических антигенов 136-159 и (142-155)п определяли в непрямом варианте ИФА "по связы-■ванив.с прстивоялурньаз: антителами кролика, иммунизированного 145S компонентом вируса зшура типов 0, Азйя-1 и различных подтипов А.

Результаты показали, что оба пептида обладали выраженной специфичностью к ■ Титры прстлзоядурных анти-

тел А22 связывании с к;*;,с: достигали сами:*: высоких значений: с пептидом (142-155) л - 2,21%; а с -пептидом .135159 -3.0" в то ■врем.ч как активность' сывороток на другие типы и подтипы 'А' не превышала 'уровень фока (< 1,5).

.В реакции перекрестной нейтрализации с вирусом типов А. О*к.С исследовал:! сыворотки кроликов, крупного рогатого скота и овец ка.полимер (142-155)п, пептиды без носителя - 138-151 и 135-153, а также на .пэпищ 138-151 с ' геыоцианпнсм. Полученные результаты свидетельствуют о вы' ралекной тшмспецифичности все:-: проверенна сывороток.

В непрямом варианте ИФА-изучались типо- и зариан-тоспецпшичность сыворотки кролика, . получэнной.на пептид (142-155) п. Для сравнения пспользозали пшерг-азгунну» 'сыворотку на 1453 антиген А2г и сыворотку кенкмункого кролика. . Е данном эксперименте определял: значение г для дзух сывороток по формуле: ■■.-■•;.

титр сыв-ки с гетерологичяьм вирусом

титр сыв-ки.е гомологичным вирусом -. - ' Результаты опыта свидетельствуют о вариантной сие-' цифичности сызороткк на. полимер (142-145)'п. Значения .г.- для . . пептидной сыворотки по отщпэнкэ'.ко всем'.подтипам А -..оказа- -лись на -порядок-.нике.по- сравнения-'с таковыми гшерим- . мукной протизоящфкой сыворотки. ,■. Таким образом, - аятийеп-ткдная.сыворотка./: . узнавала";' только '.тот:' вирус> . чья- . последовательность'.аминокислот была использована "для^ син-:- .' теза пептида^, ■ ' ■ ' / '. - "'-".'.-

4. Еш-шииэ скктеткчесинх ад-хигекоз. ка. .аигхаз-основных классов з^зукагл&улйкоз у круп-' . .. нога, рогатого с-юта. , . ■ • .Известно, что.изотипы антител, синтезрфг<сшихся' з организме в .ответ-на введение, антигена, играют' важйую роль в механизме защиты от. инфекции. .. .■ .'",

В опытах на. крупном рогатом скоте было исследовано .' количественное .содержание основных классов -иммуноглобули-'

коз я . зкруснбйтрашгаузиэя активность сывороток крс>.зи в различные сроки после. иммунизации пептидом (142-155) п.

Три головы КРС были двукратно с интервалом в 42 дня вакцинпрозаны синтетическим полимерным пептидом в дозе 3,0 мг в сочетании с масляные адъхвактом на основе синтетического масла 3315. До вакцинвции и через 14,28,42 и 63 дней у животных отбирали кровь и сыворотки исследовали в ?РПД по методу Манчини с соавт.. (1355).

Содержание 1£М в сыворотках до вакцинации в среднем составляло 1,9±0,2 мг/мл, а в последующие сроки - соответственно: 3,01¿0,20; 2,37±0.40; 2,2610,30 и 2,5+0,3 мг /мл. Таким образом, концентрация иммуноглобулинов класса М самой высокой была на 14 сутки после первой иммунизации. 3 последующие сроки уровень снижался, а ревакцинация через 42 дня практически не оказала существенного влияния на выработку антител зтаго класса.

Средний*уровень до взкцинацли составил 13,2±. 0,5 мг/мл, затем, соответственно: 15,7+0,5; 17,2+0,3; 16,0+ +0,9 к 18,5±0,7 мг/ыл. Количественные изменения иммуноглобулинов класса Б в динамике характеризовались нарастанием их концентрации на 14-23 сутки, затем ело некоторое с имение их уровня, а'ревакцинация ывззала увеличение количества 1^3 на 21 сутки после второй иммунизации.

. БирускейтрализуЕщая активность сывороток на протяжении эксперимента равномерно возрастала й- титры БНА к концу шита в ере;,чём составляли 10,4+0,2 ¿Щ^/т.

Опыта ка'КП по -изучению влияния синтетических антигенов на синтез - антител различных классов показали,- что количественные, изменения уровней 1еМ и 1дЗ происходят, в целом, типично дет зтого вида животных.при развитии япур-'ной инфекции.- 3 ранние'сроки после ишункгацяп'идзт синтез антител класса Н, затем их содерлание з крови уменьшается и происходит преимущественный синтез антител.

выводы

1. Разработаны критерии отбора.синтетических анти. генов-аналогов аминокислотных. последовательностей различ- '

ных .фрагментов VFj вируса яшура AZ2 и предложена схема • оценка-: их иммукогенных свойств.

2." Изучены антигенные свойства более 40 -синтетических пептидов-и на основании проведенных исследований для . "разработки противоящурной вакцины- рекомендованы пептиды

(142-155)п и 135-158.

3. Изучено накопление противопептидных, зирусспе-цизических'(И1А) и в::рускейгралнзувщих антител .у лабораторных животных. Установлена корреляция между уровнями ABA и БНА на различных зтапах вакцинального процесса и устойчивостью морских свикок к ящурной инфекции.

4. Установлена зависимость изменения уровня накопления АБА и ЕНА в крови крупного рогатого скота и овец, . иммунизированных вакцинами на основе синтетических антигенов (142-155)п и 135-159 в различные сроки после вакцинации с устойчивостью к заболеванию ящуром. " Животные, у которых были титры ЕЕА вьппе 5,7 log2 и ABA - выше 3,0 lg, выдерживали контрольное заражение.

5. Длительность циркулями АЕА и ЕНА в крови „животных, иммунизированных вакцинами ка основе синтетических •пептидов составляла:' для кроликов - 9-12 месяцев,, для KFC и овец - 6 месяцев( срок •Вабаоддения)-- '

6. Синтетические пептиды (142-155)п и-136-;159 и. ■ индущруеше. raai антитела обладали выраженной типовой-' .-и

подтишдой специфичностью. •

7. Количественные изменения концентрации иммуногт' лобулинов классов..В и LÍ в сыворотках' крови крупного рога-.-того скота, иммунизированного пептидом (142-155) п,' соответствуют таковому процессу ка-полный вирусный антиген, т. е. .в первые 14 дней после введения пептида идет преимущественный синтез антител класса М, ■ в последующе , сроки ' происходит переключение на выработку иммуноглобулинов G. 1

список спубжксзанкьк работ.

1. Ыудрак Е С. Антигенные свойства синтетических пептидов вируса ящура. - Акт. пробл. вэт. вирусология. Тезисы докл. научн. конференции.. Владимир, 1988, с. 22-23.

2. Чепуркпн А. В. , Дрягалин Е а , Изанщэнкоз В. Е , Лядский V*. М. , Мудрая Н.С., .Суровой А.'О/, Зольника 0. !1 Продолжительность ::м>луккого ответа у кроликов на введение . синтетических пептидоз. - Акт. пробл. зет. внру&ологпи. Тезисы докл. научн. конференции. Владимир, 1958, с. 25-25.

3. Мудрак Е С. , Давыдова Е Д. , Дрягалин Е Е , Че-пуркин А. В., Глобэнко Л. к,, Молчанова А. ¡1 Использование 5-элок-А сефарозы для выделения ишунсглсбудпнсв из сывороток животных, ш-иуяпзкровэнных синтетическим пептидом. -Акт. пробл. нет. вирусологии. Тезисы докл. научн. конференции. Владимир, 199С. с. 64.

4. Кудрак Е С. , Чепурккк А. В., Павлоз А. В. , Дряга-лин Е К., Рыбакоз С. С. Сценка протпвоялурного шагунитета у крупного рогатого скота на мулатимэрнай пептид, с помолью серологических реакции. - Акт. пробл. зет. вирусологии.' Тезисы докл. научн. конференц;:::. Владимир,1990, с. 75.

5. Чепурккн А. Е ,. Павлов а. В. < Петров В. Е , Ыудрак Е С., Лядский И. Ш , Рыбакоз- С. С. , Кзанзщэккоз В. Е , Дряга-лин ЕЕ, Бурдов А..Е Антигенная к'иммукогенкая активность синтетических мулгглмеркых пептидоз вируса япура А^- Всесоюзный симпозиум пз'хкмгяг пептидов. Тезисы докладов, Рига, '1990,' С, 87.. . .

5. Чепурккк А. В., Кванкщенков В. Ё , Дрягалин 'Е Е , Лядский М. 31, Мудрак.ЕС. , Павлов А. В., Рыбаков'С. С. , Бурдов А. Е , Еолыкна 0. II Ечзлуногенные свойства" противоящур-ных вакщгяных препаратов, полученных на основе синтетических пептидов. -'В сб.: "К новой стратегии борьбы с януром. " Тезисы докл. международной конференции. Владимир, 1991.

7. Мудрак Е С., Чепуркин А. В:, Дрягалин Е Е ,

* - 22 - • :

Павлов А. В.Молчанова А. К.; Рыбаков С. С. Специфичность—.. антител. индуцируемых синтетическим!' пептидами вируса ееу-ра' А . - Тезисы докл. наг-- конференции по вопроса;.; вет. вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. РАСХК - Покров, 1532, с. 130-181. :

S. 1фдрак rl.C., йпсайлпка Е К., Чэпуркин А. В.,' _Павлов А. Б., Дрягалин. Е Е , ПЬрюзев ЕЕ Динамика скктеза^--осковны:-: классов иммуноглобулинов 'у крупного рогатого скота при пммунизапли синтетическим полимерным пептидом вируса язура А. - Тезисы докл. научн. конференции по вопроса.« нет. вирусологии, микробиологии и эпизоотологии.'РАСХЕ -Покров, 1992, c.1S3.

i0.oz.3i