Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антиген для иммуноферментного анализа при диагностике токсоплазмоза животных

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Антиген для иммуноферментного анализа при диагностике токсоплазмоза животных"

У<ЦК636.09П.353

На правах рукописи

ЕФРЕМОВ НИКОЛАЙ АЛЕКСЕЕВИЧ

АНТИГЕН ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ТОКСОПЛАЗМОЗА ЖИВОТНЫХ

03.00.19. - паразитология, гельминтология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Республика Казахстан Алматы 1998

Работа выполнена в проблемной лаборатории паразитоценологии при кафедре паразитологии Казахского государственного аграрного университет; в хозяйствах и мясокомбинатах Жамбылской и Кызылординской областей.

Научный руководитель - заслуженный деятель науки РК, доктор биологических наук, профессор академик АЕН

М.В. Хван

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Б.Ш. Шайкенов.

доктор ветеринарных наук, профессор С.С. Вечеркин.

Ведущая организация - г. Семипалатинск,Государственный университет "СЕМЕЙ".

Защита состоится " ^ " 1998 г. в /р- ч

сов на заседании диссертационного совета Д 55.40.01 при Казахском научи исследовательском ветеринарном институте по адресу: 480016, г. Алматы, пр спект Райымбека, 223.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан " 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор ветеринарных наук,

профессор // //' -- . Б.Ф. Керимжанова

у а и***^ -

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Для неуклонного роста поголовья сельскохозяйственных животных и дальнейшего повышения его продуктивности важное значение имеет современная диагностика и эффективная профилактика паразитарных болезней, опасных для жизни людей и наносящих ущерб животноводству. Это касается и болезней с природной очаговостью, к числу которых относится токсоплазмоз.

Токсоплазмоз - тяжолое, паразитарное заболевание человека и животных, вызываемое простейшими вида Toxoplasma gondii. В большинстве случаев токсоплазмоз как у людей, так и у животных протекает в латентной форме. У детей, особенно в раннем возрасте, заболевание зачастую заканчивается летально или инвалидностью. У животных токсоплазмоз является бдной из причин различной патологии: мертворождений, рождения нежизнеспособного молодняка, бесплодия, абортов и т.д. Острое и хроническое течение болезни, приводит к истощению, отставанию в росте, а также к гибели значительного поголовья молодняка.

На сегодняшний день наиболее актуальной и трудоемкой является проблема иммунодиагностихн токсоплазмоза у человека и сельскохозяйственных животных. Современная диагностика, является важным звеном в комплексе мероприятий по борьбе с токсоплазмозом.

По мнению ряда исследователей ( Sabin A.B., Feldman H.A., 1948, Sleen Е., Kass Е., 1951, Бакушша H.A., 1965, Боровиков A.A., 1976, Болдырева Р.Г., 1978) при выявлении возбудителей протозойных болезней наиболее точными и быстрыми являются серологические тесты.

Из иммунологических методов диагностики токсоплазмоза наиболее широко применяются реакции связывания комплемента (РСК), достоверность которой зависит от качества антигенов. На протяжении ряда лет ученые различных стран мира проводили работу по приготовлению диагностикумов для РСК. Предложен ряд методов по приготовлению ди-агностикумов из перитоиеального экссудата белых мышей, содержащего

токсошшмы. Все методы включают приемы, способствующие извлечению специфического токсоплазменного компонента.

Цель исследований. Целью работы явилось получение свободного от балластных веществ специфического экзогенного токсоплазменного антигена и изучение его иммунологических свойств, а также использование его для ранней прижизненной диагностики токсоплазмоза животных в иммуноферментном анализе (ИФА).

Задачи исследований:

- приготовить активный и специфический в иммунологических тест-системах экзогенный токсоплазменный антиген;

- получить гипериммунные сыворотки крови к экзогенному ток-соплазмснному антигену;

- адаптировать антигенвыявляющий вариант иммуноферментно-го анализа для диагностики токсонлазмоза животных;

- изучить возможность получения шгшидиотипических антител х экзогенному токсошшменному антнгену и испытать их в качестве сенситина в иммуноферментном анализе.

Научная новизна работы- Разработан способ получения экзогенного токсоплаэменного антигена и предложена методика использорания его в иммуноферментном анализе для выявлнения токсоплазмениых шпител. Для диагностики токсоплазмоза животных адаптирован антигенвыяв-лякмций вариант иммуноферментного анализа, а также изучена возможность использования антииднотипических антител в качестве сенснтина в и ммунодиагностике токсоплазмоза.

Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований получен и предложен экзогенный токсошшменный антиген для ранней прижизненной иммунодиагностики токсоплазмоза у животных. Результаты проверки этого препарата подтвердили его высокую эффективность, что дает основание рекомендовать его с целью применения в научных и диагностических лабораториях иммуноферментного анализа.

(ИФЛ).

Реализация результатов исслгдований. На основания полученных результатов подготовлена нормативно-техническая документация;

- экзогенный тсксоплазменный антиген лиофилнзированный рекомендованный научно-методическим сонетом зооветеринарного института для рассмотрения на НТС МСХ РК в Кометете ветеринарии;

- оформлен патент на предполагаемое изобретение.

Основные положения исследовании выносимые на защиту:

- Получение специфической и антнгенактивной фракции из соматического (эндогенного) и секреторно-экскреторного ( экзогенного) токсо-плазменных антигенов.

- Получение гипериммуиных сывороток крови к антигенным фракциям экзогенных токсоплазменных антигенов.

- Адаптация антнгенвыявлякицего иммуноферментного анализа для диагностики токсоплазмозз.

- Использование феномена антиидиотштии в днапгостике токсо-плазигоза.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: У-Всесоюзном съезде протозоологов (Витебск, сентябрь 1992г)г научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспнраитоа (Алматы, март 1991 г), Республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (Алматы, 1991, 1992), научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов АЗВИ (1990, 1992, Г 993), Республиканской конференции молодых ученых и сггециалистов-живодноводству (Семипалатинск, 1991), заседании общества паразитологов Казахстана (Алматы, 1992), научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 150-летнк> Абая ( Алматы, 1995 г), на семинаре — совещаний врачей серологов Казахстана (Алматы, 1990 г.).

Публикации. По, материалам диссертации опубликован э 9 научных работ, разработаны и находятся на утверждении НТС МСХ PK в Комитете ветеринарии, ТУ, временная инструкция, временное наставление.

Объем н структура диссертации. Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста и состоит т титульного листа, содержания, перечня сокращений, условных обозначений, символов, единиц и терминов,{ведения, основной части, заключения, списка использованных источников и приложения. Работа иллюстрирована 8 таблицами 4 рисунками. Список использованных источников включает 166 наименований, в том числе иностранных авторов 94.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2. Материал и методы исследования Работа выполнялась с 1989 по 1998 годы в проблемной лаборатории паразигоценологии при кафедре паразитологии Казахского государственного аграрного университета, в хозяйствах и мясокомбинатах Жам-былской и Кызылордйнской областей.

Наиболее близкий по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения токсоплазменного антигена, предложенный авторами (Ж.К. Омаров, A.A. Боровиков и В.М. Красов, 1976). Однако этот способ используется для получения эндогенного антигена из токсоплазм, а для получения экзогенного антигена мы удаляли токсо-плазмы из перитонеального экссудата зараженных белых мышей.

Экзогенный токсоплазменный антиген получали из перитонеального экссудата зараженных токсоплазмозом белых мышей, путем обработки низкочастотным ультразвуком (УЗДН -2 М), который в последствии использовали для иммунизации кроликов с цель» получения токсоплаз-мёмных антител (идиотипов).

В процессе приготовления экзогенного токсоплазменного антигена определяли количество белка на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 280 нм, а затем антиген собирали, диализировали против дистил-

о 7

лированной подм 24 часа при 4 С (при пятикратной смене диализирую-

щего раствора). Диализат концентрировали 30% раствором полиэтилен-гликоля - 600 (ПЭГ), после чего его хранили при 20°С, или лнофилнзи-ровалн, а в дальнейшем использовали для иммунологических исследований.

Иммунизацию кроликов антигеном проводили по методу Г.Фрнмеля (1987), для чего использовали полный адьювант ФреГгнда (ПАФ), 1,5 мг антигена в смеси с полным адыовантом Фрейнда (ПАФ) в соотношении 1:1 вводили в подушечки четырех лапок по 0,25 мл в каждую. На 21 день кроликов реиммуннзировали той же дозой антигена с ПАФ в бедренные мышцы обеих лапок по 0,5 мл смеси в каждую. Начи-" пая с 7-го дня после второй иммунизация вели ежедневный контроль за титром прецнлнтируюгцих антител реакцией количественной преципитации (РКП) ( М. lleidellberger, 1938) и иммуноферментным анализом (ИФА) ( А. Voller ci all, 1976). При достижении титра прсцитггирующнх антител не ниже 1,0 мг/мл в РКП или 1: 25000 в ИФА от кроликов брали кровь нз ушной краевой вены спирт-кенлолопым методом по 40 мл трехкратно с интервалом в 72 часа. При низких титрах (менее 1 мг/мл в РПК и ниже 1: 25000 в ИФА) антител проводили дополнительную иммунизацию. Через 15 дней после ренммунизацни проводили цикл внутривенных инъекций. Антиген в дозе 1,5 мг на кролика вводили двукратно с интервалом в 24 часа в центральную ушную вену. Для избежания аллергической реакции, за 2 часа до внутривенного введения, кроликов сенсибилизировали малыми дозами антигена ( 25 мкг на животного). Всего использовали 67 кроликов. Контроль за титром антител осуществляли вышеупомянутыми методами. Гамма-глобулиновую фракцию из пуля питнсы-вороток выделяли насыщенным раствором сульфата аммония.

Иммуноферментный анализ проводили п двух направлениях.

1. В сыворотке крови кроликов определяли антитела к экзогенным антигенам токсоплазм.

2. В сыворотке крови кроликов определяли экскреты-секреты токсоплазм.

Для определения циркулирующих антител в сыворотке крови кроликов иммуноферментный анализ (ИФА) проводили по методу А. Voller et all, (1976), где в качестве первого компонента сорбируемого на полистироловых иммунологических планшетах использовали экзогенный антиген токсоплазм, разведенный в 0,1 М карбонагао-солевом буферном растворе (pH 9,6). В качестве коньюгата использовали антитела против иммуноглобулинов кролика (Анти JgG), меченые пероксидазой из хрена, приготовленные в институте эпидемиологии и микробиологии (ИЭМ) им. Гамалея. В качестве субстратно-индикаторной смеси применяли субстрат, предложенный D. Ellens et ail, (1980) и субстрат, предложенный A.Abraham (1984).

Учет результатов реакции проводили визуально по разнице окраски контроля и опыта или спектрофотометрически на спектрофотометре СФ-26.

Для иммуноферментного определения в сыворотке крови экзогенных антигенов токсоплазм готовили иммуноферментный коньюгат. Приготовление иммуноферментного коньюгата начали с получения антисывороток к экзогенным антигенам токсоплазм вышеупомянутым методом.

Из полученной антисыворотки выделяли гаммаглобулиновую фракцию путем высаливания насыщенным раствором сульфата аммония, выделенную гаммаглобулиновую фракцию диализировали против 0,01М фосфатио-солевого буферного раствора (pH 7,2-7,4) в течение 48 часов при 4°С при пятикратной смене буферного раствора. После чего путем ионообменной хроматографии на диэтиламиноэтан (ДЭАЭ) целлюлозе выделяли иммуноглобулин G(JgG). Конъюгацию кроличьего JgG с пероксидазой Олайнского производства, с показателем чистоты - 2,7-3,2 производили по метеду P.K. Nacane et all, (1974). 4 мг пероксидазы растворяли в 1 мл дистиллированной воды, добавляли 0,2 мл раствора

0,1 М периода« натрия ex Tempera и слегка перемешивали выдерживали 20 шаг, после чего диалгинровали 12 часов при 4°С против 0,001 М ацетатного буфера (рИ 4,4). К этому раствору добавляли 0,02 мл 0,2 М буферный раствор (pH 9,5) н сразу же добавляли 10 мг/мл иммуноглобулина на 0,01 М карбонатном буферном растворе (pH 9,5), после чего смесь оставляли при комнатной температуре на 2 часа. Затем добавляли 0,1 мл боргндрата натрия, приготовленный ex Tempera, в концентрации 4 иг на 1 мл дистиллированной воды и выдерживали в течение 2 часов при 4°С, затем диализировапи против фосфатно-солевого буферного раствора (pH 7,2-7,4) в течение 12 часов при 4°С, после чего диализат наносили на колонку с ссфадексом G- 200, уравновешивали 0,01 М фосфатпо-солевым раствором (pH 7,2-7,4) и с помощью спектрофотометра определяли связавшиеся с псроксидазой иммуноглобулины от нссвязавшихся при длине волны 280 им и 430 им.

Полученный коныогат концентрировали с помощью полиэтилен-гликоля -600 до концентращга белков не ниже 1 мг/мл, после чего к нему добавляли обычный сывороточный альбумин до концентрации 10 мг/мл. Иммунологическую активность полученного коньюгата проверяли в реакции количественной преципитации и ИФА. Во всех варнатах ИФА учет результатов проводили визуально, по разнице окраски контроля и опыта. Контролем служили нормальные сыворотки крови овцы, кролика, свободные от токсоллазм.

Для получения шгтиидиотипоп, т.е. антител против токсоплазмен-ных антител, кроликов иммунизировали иммуноглобулином JgG - airm-сывороток к тксоплазменному экзогенному аитигеиу по методу Г- Фри-меля ( 1987). Кровь от иммунизированных кроликов получали через каждые три дня спирт-ксилоловым методом из ушной вены. Динамику анти-идиотипических антител изучали в РПК по Heidelberger (1938).

Сорбцию антнидиотипических антител проводили по методу S. Avramcas et all, (1969) с применением иммуносорбентов приготовленных

по методу А.Н. Маянского с соавг. (1976). Для элюции антител использовали 0,1М и фосфатно-лимонно-кнслый буферный раствор рН-2,6. Полученные элюенты концентрировали 30%-ным раствором полиэтнленгликоля -600, обессаливали на сефадексе G-50 и исследовали иммуноферментным анализом.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Получение экзогенного токсоплазменного шггигена.

Наиболее подходящим исходным материалом для получеши токсоплазменного антигена является перитоиеальный экссудат зараженных белых мышей (J.K. Frenkel, 1948) т.к. токсошшмы в нем составляют приблизительно 1/4 всего клеточного содержимого.

Применение антигенов изготовленных из культур тканей (Jacobs, 1956; Turell, 1956; Shuhova, 1961; Shimisu, 1963; Акиншина, Грачева, 1963) ограничено тем, что тохсоплазмы в культуре тканей не дают такого обильного накопления паразитов, как в леритонеаяьном экссудате мышей.

Получение экзогенного токсоплазменного антигена достигается удалением токсоплазм из перитонеального экссудата зараженных белых мышей, дезинтеграцией клеточных элементов перитонеального экссудата, путем обработки низкочастотным ультразвуком (УЗДН-2М), извлечением антигенактивных экскретов-секретов токсоплазм изононным фракционированием и истощением антигенной фракции от неспецифиечских балластных веществ иммуиосорбционнммн методами от мышинного белка И общих антигенных детерминант к саркоспоридиям и безноитиям.

Для приготовления экзогениого токсоплазменного антигена использовали пернлокеальный экссудат белых мышей, зараженных эталонным штаммом токсоплазм (RZ) или одним из вирулентных штаммов выделенных от сельскохозяйственных животных. Собранный перитоиеальный экссудат содержащий токсоплазмы центрифугировали в

сгерилънь'х пробирках в течение 30-45 мин при 3000-4000 об/мин. Полученный ссадок удаляли, а пернтонеальный экссудат, содержащий экскрегы-сикрсгы токсоплазм, лейкоциты и гистиоциты белых мышей" подвергали дальнейшей очистке.

Для этого провели нзоноинос фракционирование ультразвукового лнзата ггернтонеалыюго экссудата белых мышей, предварительно ослобожденных от токсоплазм, которые начали с фокусирования балластных фракций содержащихся в лизате при недостаточно полной предварительной очистке от лейкоцитов и гистиоцитов белых мышей. Затем при вторичной обработке надосадочной жидкости прогретой ультразвуком до оптимальной температуры 35-40°С, медленной' нейтрализацией 0,5-1,0 Н раствором соляной кислоты доводили рН до 6,5-7,5 н фокусировали следующую антигенную фракцию и при рН 3,54,5 выделяли третью антигенную фракцию. После центрифугирования экзогенную антигенную фракцию растворяли в 20-30 мл дистиллированной воды при рН 8,0-8,2 и проводили последующую ее очистку.

Иммунохнмнческую очистку экзогенной антигенной фракции проводили с помощью антнсывороток на иатнвный пернтонеальный экссудат белых мышей, птериммунной сывороткой на токсоплазменный антиген, а также гипериммунной сывороткой на сяркоцистоз, безноитиоз. Натнвный пернтонеальный экссудат здоровых белых мышей получали следующим образом: мышам интраперотонеалыго вводили по 0,2 мл насыщенного раствора хлористого натрия. Через 30 мин насыщенный расвор вводили повторно ,в дозе 0,4-0,5 мл. По истечению одного часа от момента первого введения насыщенного раствора мыш<;й наркотизировали, вскрывали, а затем из брюшной полости изплекалн шприцем экссудат. Собранный (экссудат) материал центрифугировали при 3000 об/мин в. течение 30 мин, диашповалн против дистиллированной воды в течение 12-24 часов при 4°С.

Гилеримчунные сьшорогки крови получали иммунизацией кроликов белками нэт явного пертоиеальиого зксс; дача здоровых белых мышей, саркоцистозным и безнонтиозным ьнтигснами. Из атиеывораток, путем высаливанш насыщенным ра-чво^ом сульфата аммония, выделяли гамма-глобулиновую фракцию, которую раствордли в минимальном количестве дистиллированной воды и обессоливали на колонке с сефедексом 0-50 или диализом против проточной воды (12ч), дистиллированной воды (24ч) и физиологического раствора (25 ч).

Из приготовленных нами гамма-глобулинов готовили соответствующие иммуносорбенты.

Иммуносорбцнонлую хроматографию антигенного препарата проводили по обычной схеме, принятой для колоночной иммуносорбции. В результате использования хроматографии получали одну фракцию, рН в которой доводили дч 7,5, затем диалнзировали ее против дистиллированной воды, упаривали под вакуумом до концентрации 2-4 мг/мл белка и анализировали в реакции иммуноферментного анализа. Дальнейшую очистку фракции осуществляли аналогичным способом пропуская последовательно через иммуносорбеит содержащий против безиоитий и соркоспоридий.

* Стандартизацию экзогенного токсоплазменного антигена проводили по серологической активности путем титрации с гипериммунными сыворотками к экзогенному антигену токсоплазм.

Рабочий титр устанавливали для каждой серии антигена.

Для длительного хранения антиген лиофилизировали. Срок годности лиофилизированного антигена составлял 2-3 года.

3. f. CPABHIГТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЗЛИЧНЫХ

МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ ТОКСОПЛАЗМЕННЫХ АНТИТЕЛ

Многие иммунологические тесты п качестве необходимого компонента требуют использования антисывороток к паразитарным антигенам. Однако у естественно ннвазированных животных титр антител, как правило, невысок и они малопригодны в качестве стандартных реагентов.

С учетом этого нами испытаны и сопоставлены различные методы иммунизации кроликов токсоплазменным антигеном.

С целью получения высокоактивной, токсоплазменной сыворотки нами была проведена иммунизация кроликов экзогенным токсоплазменным антигеном из штамма Rz трехи методами: по методу Г. Фримсля (1987), Fey et all (1976) и по методу A.M. Сафронова (1976). Иммунизацию кроликов по методу Fey et all (1976) проводили сочетанием внутримышечных и внутривенных инъекций токсоплазменного антигена. При иммунизации по методу Г. Фрнмеля (1987) использовали адьюваит Фрейида, приготовленный нами. Иммунизацию кроликов по методу A.M. Сафронова (1976), проводили внутривенным введением токсоплазменного антигена с предварительной сенсибилизацией организма кроликов путем введения малых доз белка антигена (0,002 мг).

Забор кровн от иммунизированных по различным схемам кроликов производили начиная с 3-го дня после последней нммушташш с интервалом в Здпя. Динимику титра токсплазмешшх антител кзучалп путем постановки реакции количественной перешшнтации (РКП) по методу М. Heidelberger, (1938), через каждые з дня. Количество белка в каждой порции сыворотки кровн от иммунизированных кроликов определяли на спектрофотометре СФ-26 при 280 им.

Наиболший титр токсоплазыенных антотел (864 мкг/мл) получен в результате иммунизации кроликов токсоглаэмениым антигеном по методу Г. Фримеля (1987) на 9-й день после последней инъекцни. Затем на втором месте стоит метод иммунизации кроликов по H.Fey et all, (1976), где на 9-й день после последней инъекции было получено токсоплазменных антител в количестве (774 мкг/мл). Наименьшее количество антител (408 мкг/мл) получено в результате иммунизации кроликов методом A.M. Сафронова (1976).

Считаем, что из изученных ламп схем иммунизации лучшим является метод иммунизации по Г. Фримелю (1987), который проводится сочетанием внутримышечных и внутривенных введений антигена. Взятие крови должно проводиться, начиная с 7-9 - го дня после последней иммунизации.

3.2. ОЧИСТКА ЭКЗОГЕННОГО ТОКСОПЛАЗМЕНИОГО

АНТИГЕНА И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО АКТИВНОСТИ И

СПЕЦИФИЧНОСТИ В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ

В настоящее время ультразвук широко используется в различных областях медицины и ветеринарии. Для направленного экстрагирования и фракционирования антигена использовали отечественный низкочастотный диспергатор УЗДН-2М.

Изоионное фракционирование ултразвукового лизата пернтонеального экссудата белых мышей предварительно освобожденных от токсоплазм, начинали с фокусирования балластных фракций, которые могут содержать лейкоциты и гистиоциты белых мышей.

Иозионным фракционированием экзогенного токсоплазменного антигена, нами было выделено три белковые фракции; при этом пнтигенактнвной была вторая фракция с изоэлектрической точкой 7,0.

Дальнейшую очистку второй фракции экзогенного токсоплазменного антигена осуществляли гель-фильтрацией ее на сефадсксе С-200. При этом нами установлено, что экзогенный тексонлазменный антиген элюируется Змя фракциями с незначительными колебаниями в пределах каждой из них, причем антнгенактивной была вторая фракция, которую подвергли дальнейшей очистке, для повышения специфичности с помощью иммуносорбентов.

Очистку экзогенного токсоплазменного антигена провод.шй с помощью антисывороток на нативный перитонеальный экссудат здоровых белых мышей, а также гнпериммунной сывороткой на саркоцистоз и безнонтиоз. Для достижения высокой специфичности экзогенного токсоплазменного антигена провели иммунизацию кроликов антигенами близкородственных паразитов - саркоцнст и безноитий.

Истощение экзогенного токсоплазменного антигена иммуносорбентами провели против нативиого перитонеалыюго экссудативного белка здоровых белых мышей и анти JgG безноитий и саркоцнст.

Активность экзогенного токсоплазменного антигена определяли иммуноферментным анализом. Экзогенный токсоплазменный антиген в иммуноферментном анализе обладал высокой чувствительностью и специфичностью и способен выявлять в сыворотке крови больных человека и животных токсоплазменные антитела в титре 1:800 и разделении антигена 1:640.

3.3. ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСОПЛАЗМЕННЫХ АНТИГЕНОВ В

СЫВОРОТКЕ КРОВИ В качестве иммунологического теста определения в сыворотке крови ^ циркулирующих антигенов при токсоплазмозе сельскохозяйственных животных нами апробирован иммуноферментнмй

анализ (ИФА), постановку которого начали с приготовления иммуноферментных токсоплазменных конъюгатов.

Иммуннофермснтный токсоплазмсниый конъюгат готовили периодатным методом по Р.К. Nakane el all, (1974).

Выбор оптимальной активности конъюгатов проводили для каждой серии, поскольку его активность зависит как от активности перокендази» так и от специфической активности иммуноглобулинов. Максимально регистрируемые титры а ИФА получали при разведении гамма-глобулиновой фракции к экзогенному токсоппазменному шпигену 1: 2500 ( 4 мкг белка на лунку - рабочее разведение), и токсоплазменных иммуноферментиых конъюгатов 1:800.

Степень слияния различных факторов на чувствительность анализа зависит от уровня оптимизации физико-химических параметров, таких как значение рН сорбционного и комплексирующего буферных растворов, сроков и температуры.

Для изучения чувствительности ИФА в зависимости от длительности сорбции первого компонента на поверхности полистирола нами проведено инкубирование в течение 1-2-3 часов при температуре 37°С, 16-18 часов при Т4°С.

Наивысшее,значение регистрируемых антигенов 1:200 получили г при фиксации первых компонентов в течете 16-18 часов при 4°С и 3-х часов при 37°С, поэтому в дальнейших исследованиях мы использовали это время фиксации.

Максимальные титры экзогенного токсоплазменного антигена в исследуемых сыворотках крови регистрировались при значении рН сорбционного буферного раствора в пределах от 3,5 до 11,5 поэтому в качестве сорбционного . буферного раствора в последующем использовали наиболее часто применяемый 0,1 М карбонатно-солевой буферный раствор с рН 9,5-9,6.

Из результатов исследований вытекает, что значение рН сорбцнониого буферного раствора мало влияет на чувствительность ре.'кцнн, а оптимальное значение рН комплексирующего буферного раствора варьировало в пределах от 9,0 до 10,0, поэтому в дальнейших исследованиях нами использовались часто применяемые 0,1 М карбона тно-солевой буферный раствор с рН 9,6 м фосфатно - солевой с рН 9,0.

Постановку антигенвыявляющего иммуноферментного анализа, направленного на выявление в исследуемых сыворотках крови животных антигенактивных специфических фракций экзогенных антигенов проводили в четырех вариантах. При постановке четырех вариантов ИФА использовали одни и теже токсоплазменные сыворотки крови кроликов, а в качестве контроля использовали сыворотки крови крольчат, свободных от токсоплазм.

Сравнительная чувствительность четырех вариантов антигенвыявляющего »иммуноферментного анализа показала, что наивысший титр 1:320 экзогенного антигена в сыворотке крови спонтанно больных токсоолазмозом кроликов регистрировали во втором варианте, тогда как в первом, третьем и четвертом вариантах максимальный титр антигена составил 1:160.

Отмечая достоверность всех вариантов реакции, что указывает на объективность теста.

Из испытанных антигенвыявлякнцих вариантов ИФА наивысшую чувствительность показал второй вариант, поэтому для дальнейших наших исследований мы использовал к этот вариант антигенвыявляющего ИФА.

Следует отметить, что остальные три испытанных нами антигенвыявлякнцих вариантов ИФА тоже пригодны для ранней прижизненной диагностики токсоплазмоза. Особенно следует отметить четвертый вариант ИФА, который можно назвать "экспресс-методом" и

отличается от остальных вариантов быстротой постановки, относительно высокой чувствительностью, так необходимой для практических специалистов.

Нашей промышлеиостью не выпускается антитоксоплазмешшй иммуноферментный конъюгат, поэтому в настоящее время предпочтителен второй вариант антигеивыявляющего ИФА, где в качестве конъюгата используется антивидовой конъюгат.

Таким образом, из проведенных исследований видно, что отработанные параметры реакций позволяют добиться высокой чувствительности всех четырех вариантов антигеивыявляющего ИФА н эти тест-системы являются пригодными для ранней прижизненной диагностики токсоилазмоза человека и животных, & также изучения защитного ответа организма на токсоплазменную инвазию и выяснения паразют-хозяинных отношений при данном заболевании.

В связл с вышеуказанным после определения оптимальных параметров и иммунодиалюстической активности антигенвыявляющнх вариантов ИФА при токсоплазмозе нами определена специфичность и корреляция с антнгенвыявляющим вариантом ИФА.

Постановку ИФА проводили с заведомо положительными на токсоплазмоз (и, животных), безноитиоз и сархоцистоз сыворотками,; крови.

Антнгенвыявляющий вариант ИФА обладал высокой специфичностью и полностью коррелировал с антительным выявляющим вариантом ИФА. Максимальный титр при этом в шггителыюм варианте достигал 1:640, а при антигенном 1:80 при исследовании сыворотки крови человека,. 1:160; 1: 5120 и 1:40, 1:640 соответственно при исследовании сывороток -кропи кроликов больных токсоплазмозом. Таким образом, экзогенный токсоплазмеиный антиген вполне пригоден для иммунодиагностики тохсоплазмоза человека и животных и при этом обладает высокой чувствительностью, что позволит повысить

достоверность иммунодиагностики при выявлении больных токсоплазмозом неловка и животных.

3.4. ФЕНОМЕН АНГИИДИОТИПИИ В ДИАГНОСТИКЕ ТОКСОПЛАЗМОЗА

В настоящее время методы антнидиотипни применяются редко, а в отношении токсоплазмоза вообще не применялись. В связи с этиы переД нами была поставлена задача получить антиидиотигшческие антитела (АТг) к антителам (ATi) против экзогенного токсоплазменного антигена и проверить антигенные свойства в иммунологических тестах для ранней прижизненной серодиагностики токсоплазмоза человека и животных.

Для получения антнидиотипических антител кроликов иммунизировали экзогенным токсоплазменным антигеном.

Через 21 день кроликов реиммуннзировали той же дозой антигена с ПАФ в бедренные мышцы задних конечностей по 0,5 мл смеси в каждую. При достижении титра прецишггирующих антител 1,5 мг/мл в РКП or кроликов брали кровь. Из полученных токсоплазменных идиотипов путем высаливания 50% сульфатом аммония выделяли гамма-глобулиновую фракцию. Из обессоленных гамма-глобулииовых фракций , методом ионообменной хромотографии на ДЭАЭ - целлюлозе выделяли JgG. Хромотографию проводили 0.01М фосфатным раствором с рН 8,0.

Выделенный JgG концентрировали 30% раствором ПЭГ-600 ко концентрации 3,0 мг/мл белка. Измерения проводили на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 280 нм. Полученными растворами иммунизировали кроликов по вышеуказанному методу и в тех же дозах в смеси с ПАФ. Начиная с 3-го дня после реиммунизации через каждые 3 дня проводили взятие крови от кроликов с последующим определением в сыабротхе крови титра антнидиотипических антител методом постановки реакции количественной преципитации (РКП) ш»

Heidelberger (1938).

В дальнейшем проводили иммуносорбцию антннднотипических антител из антисывороток по методу S. Avrameas tt all, (1969) с применением иммуносорбента, приготовленного по методу ЛЛ1. Маянского (1976), который готовили путем включения нднотипа в матрицу полиакриламидного геля. Гамма-глобулиновуто фракцию выделяли из акгосывороток путем высаливания 50% раствором ИЭГ-600 в 5 раз по сравнению с исходным объемом сыворотки. Затем в 10 мл глобулиновой фракции растворяли 0,6 г акрнламида, ОД г метилен бис акрнламида, с добавлением 0,02 мл ТЭМЭД и 0,5 мл свежеприготовленного 40% -ного раствора персульфата аммония.

Полученный гель инкубировали при Комнатной температуре в течение одного часа Для контроля качества сорбции антител из антиндиотипов приготовили иммуносорбенг по той же методике с включением дистиллированной воды в матрицу полиакриламидного геля. Сорбцию анпшдиотипических антител проводили в 2 этапа.

Вначале извлекали балластные антитела, а затем содержимое концентрировали. Для элюции антиидиотипичсских антител применяли лимонно-фосфорно-кислый буфер (pH 2,6). Элюцию проводили двукратно. При этом получали из каждых 10 мл токсоплазменных антисывороток по 8 мл анпшдиотипических антител. Полученные х антииднотипические шгпггела нейтрализовали Трис- HCl- буфером до pH 7,0-7,2, Для контроля качества проведенной сорбции антител второго порядка (АТ2) проводили повторные ко!гтрольные сорбции с применением иммуносорбента из дистиллированной воды. Качественно проведенной сорбцией считали, если после часового перемешивания на магнитной мешалке оптическая плотность надосадка была не более "фоновой", т.е. 0,05 при измерении на спектрофотометре СФ-26 при длинне волны 280 им.

Диагностическую ценность полученных, таким образом, токсоплазменных ашнидиотнпнческих антител изучали в иммуноферментом анализе (ИФА). Для постановки ИФА использовали сборные сыворотки крови кроликов больных токсоплазмозом и сыворотки крови кроликов текущего года рождения свободных от токсоплазм.

Полуденные антицдиотипические антитела разводили 0,1 М карбонатно-солевым буферным раствором (рИ 9,5) и сорбировали на полистироле в течение 18 часов при температуре 4°С. Затем последовательно после соответствующего инкубирования вносили иссдедуемые сывортки крови кроликов, антивидовой конъюгат против кроликов, субстратно-индикаторную смесь. В качестве комплексирующего буфера использовали 0,01 М фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий 0,5 г/л тритон Х-100 (ТФБ).

Учет реакции проводили визуально (по шггенсивности окрашивания субстрата в опыте и контроле).

В результате наших исследований самое высокое значение регистрируемого титра антител (1:5120) получено при концентрации антииднотнпических токсоплазменных антител 60 мкг/мл. Это свидетельствует о возможности применения их в качестве сенситнна в ИФА.

Кроме этого нами определена специфичность АТ2 в ИФА. Для этого постановку ИФА осуществляли с положительными на токсоплазмоз, безноитиоз и саркоцистоз сыворотки крови, а в качестве антигена использовали токсоплазменные АТУ При этом установлено, Что токсоплазменные антиидиотипические антитела обладают строгой специфичностью и могут с успехом применяться в качестве антигенов в иммунодиагностике токсоплазмоза человека и животных.

ВЫВОДЫ

1. Перитонеальный эксудат, зараженных внутрнбрюшннно токсоплазмами, белых мышей содержит экскреты-секреты трофозоитов и может служить источником приготовления иммунологически активного экзогенного антигена.

2. Экзогенный токсоплазменный антиген после предварительной очистки изоионным фракционированием, гельфильтрацией и иммуносорбцней пригоден в качестве сенситина в антител- и антигенвыявляющих вариантах иммунофермеитного анализа.

3. Для получения гипериммунных токсоплазмснных сывороток крови и приготовления вдиотипов наиболее предпочтителен метод иммунизации животных, предложенный Г. Фримелем (1987), который позволяет получить до 864 мкг/мл специфических антнтсл.

4. Доказана высокая эффективность и специфичность антител- и антигеивыяшшощих вариантов иммунофермеитного анализа при постановке его с экзогенным антигеном для ранней прнжизнешшй диагностики токсоплазмоза животных.

5. Доказана пригодность полученных нами аитиидиотипических антител к экзогенному токсоплазменному антигену для ранней прижизненной диагностики токсоплазмоза в качестве ссИситнна в иммунофермеитном анализе.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для повышения эффективности прижизненной диагностики токсоплазмоза человека и животных рекомендуем очищенный экзогенный токсоплазменный антиген для иммунофермеитного анализа.

. 2. Для массового исследования животных на токсоплазмоз рекомендуем применять диагностикумы, приготовленные с использованием антииднотипов к экзогенному токсоплазменному антигену в качестве сенситина в иммунофермеитном анализе.

Список работ, опубликованных по теме писсертации

1. М.З.Хзан, З.З.Зуев, А.А.Боропиков, H.A.Ефремов. Днагно^-гика токсоплазмоза -■'ивотдах // Вцте^кат ака^емт наук. №<то-пог'.п "1 4. Т9°?, том 34.

2. Н.А.ЕЬреша, Li.b. Зуеп. Кап сарысуын;;ягы тонсопла.калы »¡тигенлер! иммуноферментт! тэс1л адалы // 'Ъастау" гылыш 5аспа орталыгы. Жаршы. Алматы. I9S7. 0.97.

3. Н.Л.Ефремов. Токсопла.-малы антиденелер алудын ар турлх гэсхлдерпин салыстырмалы сипатта.шсы // 'Ъасту " гылыт баспа )рталыгы. Алматы, I9S7. № Ц.

4. H.A.Ефремов, В.В.Зуев, О.П.Ананьев. Способ поженит ме-габолитного токсоплаэменного антигена лиофилизированного. Приоритет от 21.07.97. ?5 970687. I Алматн, 1997 г.

5. Н. Д. EJpet/Oü. Адам мен жануарлар юкеоплагмосы .пиагности-гасындагы аитиидлотиптер // 'Ъастау" гылыми баспа орталыгы. ïapuw. Алматы, 1 cJl~b. V1 I.

6. И.А.Ефремов , Li.d.Зуев. heTaOojiniii токссплаомалы атигеи 1лу Мс1л1 //"Ъастау" гылыш баспа орталыгы. Алмазы,

# 2.

7. В.В.Зуев, Н.А.Е^ремоч, 0.П.Ананьев. Временное наставление гто «етя^опгтного токсоплаэменного антигена лно|:1лиэи-рованного. 19.03.199Ii. Рассмотрены и на НТС.

8. H.A.Ефремов. Зременнал инструкция по изготовлению и кон-•ролю метаболитного токсоплаэменного антигена лиофилизиронанного. Î9.05.97. Алматы. Рассмотрены и рекоменпованы на НТС КАЗГОСАГНУ

Î стр.

9. В.З.Зуев, H.A.Ефремов, 0.П.Ананье». Технические уелочи-

m антиген мято<ТолитнчР токсоплазменннй лиофилизировянный'. 14 стр.