Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ транспортера серотонина с помощью сайт-специфических антител

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Анализ транспортера серотонина с помощью сайт-специфических антител"

Павлова Елена Владимировна

АНАЛИЗ ТРАНСПОРТЕРА СЕРОТОНИНА С ПОМОЩЬЮ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности биохимия (03 00 04)

Москва, 2007

003064635

Работа выполнена в Научном центре психического здоровья Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

Ведущая организация:

Московский государственный университет им МВ Ломоносова, Биологический

факультет

Защита состоится 21 сентября 2007 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д212 203 13 при ГОУ ВПО "Российский университет дружбы народов" по адресу 117198 Москва, ул Миклухо-Маклая, дом 6

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ГОУ ВПО "Российский университет дружбы народов" по адресу 117198 Москва, ул Миклухо-Маклая, дом 6

Автореферат разослан 15 августа 2007 г

кандидат биологических наук доктор биологических наук

Брусов Олег Сергеевич Дмитриев Александр Дмитриевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук доктор биологических наук

Балашов Александр Михайлович Сяткин Сергей Павлович

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

Лукашова Е В

1 ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы Активность серотониновой системы у человека и животных в значительной степени определяется встроенным в преси-наптическую мембрану белком - серотониновым транспортером (СЕРТ), который обеспечивает обратный захват нейромедиатора из пресинаптической щели СЕРТ представляет большой интерес не только для нейробиологии, но и для фармакологических разработок Этот белок служит мишенью для три-циклических антидепрессантов и селективных ингибиторов обратного захвата серотонина, а также для кокаина и наркотических амфетаминов

Молекулярно-генетические исследования позволили установить первичную структуру СЕРТ и показали, что СЕРТ принадлежит к семейству и СП'- -зависимых транспортных белков, которые осуществляют перенос ряда биогенных аминов и аминокислот, являющихся нейротрансмитгерами и ней-ромодуляторами На основании первичной структуры клонированных генов были предложены модели структурной организации СЕРТ и других белков этого семейства, предполагающие наличие 12 трансмембранных доменов (ТМД) Вместе с тем, несмотря на значительный прогресс молекулярно-генетических исследований, на белковом уровне СЕРТ изучен недостаточно, в частности недостаточно выяснены пути пост-трансляционного процессинга Один из наиболее эффективных путей изучения белковых молекул - использование антител с заранее заданной специфичностью к определенным участкам белка (сайт-специфических антител) В настоящее время опубликовано несколько работ по анализу СЕРТ методом иммуноблоттинга с помощью таких антител Однако, наблюдается большая вариабельность в величинах молекулярных масс СЕРТ-иммунореактивных полипептидов, выявляемых в разных работах Одной из причин этих несовпадений может быть несовершенство иммунохимических методов анализа СЕРТ, которыми в настоящее время могут располагать исследователи (например, недостаточная чувствительность иммуноблоттинга) Вместе с тем, несмотря на указанные сложности, СЕРТ был выявлен не только в мозге, но также во многих периферических структу-

pax, например на наружных мембранах тромбоцитов Считают, что тромбоциты могут служить удобной экстрацеребральной моделью для изучения СЕРТ Вместе с тем, систематических исследований по анализу СЕРТ в тромбоцитах методом иммуноблоттинга не проводилось, что затрудняет использование этой модели в фармакологических и нейробиологических исследованиях

Таким образом, актуальным является а) получение новых сайт-специфических антител, распознающих различные участки первичной структуры СЕРТ, б) создание на их основе более эффективных и воспроизводимых тест-систем для иммунохимического анализа СЕРТ ( в том числе усовершенствованных вариантов иммуноблоттинга СЕРТ), с) использование этих методов для более детальной характеристики продуктов экспрессии гена СЕРТ в различных тканях и клетках

Цели и задачи исследования Целью настоящего исследования было получение и характеристика панели сайт-специфических антител к трем различным фрагментам молекулы СЕРТ и использование этих антител для анализа СЕРТ человека и крысы в тромбоцитах и ткани мозга

В задачи работы входило

1) получение моноклональных антител (МкАТ) к С-концевому фрагменту 597-630 СЕРТ крысы и человека,

2) получение поликлональных антител (ПкАТ) к фрагменту 69-83 в N-концевой части молекулы СЕРТ человека,

3) получение ПкАТ к фрагменту 86-100, расположенному в начале ТМДI молекулы СЕРТ человека;

4) анализ реактивности (методом иммуноблоттинга) СЕРТ-специфических МкАТ и ПкАТ в экстрактах тромбоцитов человека,

5) анализ реактивности (методом иммуноблоттинга) СЕРТ-специфических МкАТ в экстрактах мозга крысы и экстрактах посмертного мозга человека

Научная новизна В работе получены новые гибридомные клеточные линии, продуцирующие МкАТ к С-концу СЕРТ (фрагменту 597-630), а также два новых поликлональных кроличьих антитела к участкам 69-83 и 86-100 в N-концевой части и ТМД1 молекулы транспортера, соответственно Впервые проведен систематический анализ СЕРТ в тромбоцитах человека методом иммуноблоттинга с использованием панели сайт-специфических антител к Си N- концевым участкам молекулы транспортера В результате этого анализа впервые были выявлены восемь СЕРТ-иммунореактивных белков с различной молекулярной массой (14, 22, 32, 35, 37, 56, 68 и ~ 150-200) С помощью МкАТ к С-концу СЕРТ впервые выявлены низкомолекулярные формы СЕРТ (35-37 кДа) в экстрактах ткани мозга крысы и посмертного мозга человека Полученные в работе результаты позволили высказать предположение, что молекула СЕРТ подвергается в тромбоцитах и клетках мозга эндопротеолизу с образованием нескольких полипептидов

Научно-практическая значимость работы Полученные в работе антитела могут быть широко использованы в научных исследованиях для анализа СЕРТ в различных клетках и тканях человека и млекопитающих с помощью иммуноботгинга и других иммунохимических методов Полученные свидетельства о возможном существовании укороченных форм СЕРТ может представлять большой интерес для нейробиологических исследований и фармакологических разработок В работе разработаны ряд методических приемов, которые позволяют повысить эффективность анализа СЕРТ с помощью иммуноблоттинга

Апробация работы Результаты, представленные в диссертации были доложены на межлабораторном семинаре НЦПЗ РАМН и на семинаре лаборатории нейрохимических механизмов условного рефлекса Института ВНД и НФ РАН, в июне 2005года,на конференции по биологической психиатрии в Вене,Австрия По материалам диссертации опубликовано четыре работы

Структура и объем работы Диссертация состоит из следующих разделов введения, обзора литературы, посвященного анализу данных, касающихся структуры, регуляции и функции СЕРТ, в том числе, полученных с помощью иммунохимических методов, экспериментальной части, содержащей описание материалов и методов исследования и его результатов, обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 153 источника

Общий объем работы составляет 130 страниц, включая 21 рисунок и 1 таблицу.

П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Рекомбинантные белки к С-концевому фрагменту 597-630 СЕРТ 1фысы, использованные в работе Рекомбинантный белок, обозначенный в нашей работе как Р1, был любезно предоставлен проф Р Блейкли (Я В1аке1у, Медицинская школа Вандербильдского университета, Нашвил, Теннесси, США) В белке Р1 модифицированная глутатионтрансфераза (ГТ) соединена, в рамке, с фрагментом 597-630 (1181р^1кегак8йре1р1е1рс§и<11гтпау) СЕРТ крысы (названным проф Блейкли с соавт СТ-2 эпитопом) В рекомбинантном белке, обозначенном в нашей работе как Р2, модифицированный тиоредок-син-бН« (ТГ) присоединен, в рамке, к фрагменту 597-630 СЕРТ крысы Белок Р2 был получен в лаборатории химии генов Института биоорганической химии РАН (Москва)

2. Получение моноклональных антител к С-концевому участку СЕРТ крысы 597-630. Для получения гибридом мышей линии ВАЬВ/с иммунизировали (подкожно, шесть иммунизаций с интервалом в 14-21 день) белком Р2 (15 мкг на мышь), эмульгированном в полном или неполном адъюванте Фрейнда На протяжении четырех дней перед гибридизацией мышь получала внутрибрюшинные инъекции 100 - 200 мкг белка Р1 в физиологическом растворе При получении гибридом использовали принятую в лаборатории технику слияния Культуральную среду от выросших гибридом тестировали на наличие антител к двум белкам, Р1 и Р2, с помощью твердофазного иммуно-ферментного анализа (ИФА)

3. Очистка моноююнальных антител из асцитной жидкости с помощью ионообменной хроматографии. Для получения асцитов клетки клонированной не менее трех раз гибридомы вводили в брюшную полость мышей линии Ва1Ь/С Антитела очищали из асцитной жидкости с помощью ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефарозе

4. Синтез иммуногенных конъюгатов пептидов с бычьим сывороточным альбумином и их использование для получения кроличьих антисывороток к пептидам. Пептиды, соответствующие последовательностям 69 - 83 (ЙуаеШцдеге^д) и 86 - 100 (усШку^уаусПв) в молекуле СЕРТ человека (Рис 1, б), были синтезированы в лаборатории химии синтеза пептидов Института биоорганической химии РАН Каждый из пептидов ковалентно связывали с бычьим сывороточным альбумином (БСА) с помощью глютарового диальде-гида. Иммуногенные конъюгаты немедленно после приготовления использовали для однократной иммунизации трех кроликов, как описано ниже Антисыворотки к пептидам получали путем многократной (5-6 раундов) иммунизации кроликов иммуногенными конъюгатами

5. Тестирование антител к пептидным фрагментам СЕРТ. Антитела к пептидным фрагментам СЕРТ определяли с помощью ИФА Кратко, иммунные планшеты насыщали пептидными фрагментами СЕРТ и последовательно инкубировали с тестируемой сывороткой (в разведениях 100 -3000000) и аффинноочшценными ослиными антикроличьими антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена Цветную реакцию проводили с тетраметилбензидином

6. Аффинная очистка политональных кроличьих антител к пептидным фрагментам СЕРТ. Антитела к пептидным фрагментам СЕРТ очищали из иммунных сывороток с помощью аффинной хроматографии Для приготовления аффинных носителей синтетические фрагменты СЕРТ человека (400 мг), включающие аминокислотные последовательности 69-83 и 86-100,

Внеклеточное пространство

Внутриклеточное пространство

СТ-2 эпитоп

1М-конец

С-конец

Б

Фрагмент 69-83

1 те«р1пвдк qlsacedged сяепду^ку ур1рдс1куез ддюпдувау рврдадсМг ЬараШЙ уаеМддегв Пгдкк 1 _ 2 3

86 п#ШвШШШЯЙШЬг чпдддаЯруЬтаИав! рИУтеЫв чуИтда» «/гкюрйквК

Фрагмент 86-100 4

181 а\«а1уу||$з knswntgnct nyfsedпrtw МкЬраее гэкд^сКдд lswqlalclm и

5 б

272 кдуМвдкуудайа^у! йвуИугда Ярдаотду! fylkpnwqkl 1е1д\мйаа ачЙ81дрд ГдуИаГаау пкГпппсуда

7 8

361 аМэуупст Ыдутаетг nedvsevakd адрэИ^ аеаюптраз ШаШт ПАдМвН ад1едуЛау

9 10

451 ЮеГрЬ\тгак ггегМауу Кс№дзМ Мддаууук Нееуа) ■■. !■-. ■. .-,'. : ■. Гсж1укет1д !врд\лЛл/г 11 12 СТ-2 эпитод (фрагмент 597-630)

539 I сотаГврШ! ¡¡¡свЯтвр рч!г№дупу ру\л/зи|дус 1у:ау г ПН рдМквгпк sitpвtptвl pcgdlnnav

Рис. 1 Гипотетическое распределение элементов первичной структуры транспортера серотонина человека в мембранах, цитоплазме и внеклеточном пространстве (В1аке1у е1 а1,1991)

А - структурная организация транспортера в клеточной мембране, Б - первичная структура транспортера и организация трансмембранных доменов (домены выделены серыми прямоугольниками) Курсивом обозначены последовательности аминокислотных остатков, к которым получены антитела в настоящем исследовании

ковалентно связывали с 0,2 г ВгС1Ч-сефарозы Выход антител составлял 50 -210 мкг на мл сыворотки

7. Приготовление конъюгатов антител с пероксидазой хрена Аффин-ноочищенные МкАТ и ПкАТ к СЕРТ конъюгировали с пероксидазой хрена периодатным методом

8. Приготовление экстрактов тромбоцитов для электрофореза. Способы приготовления лизатов описаны в подписи к Рис 3

9. Приготовление экстрактов тромбоцитов для аффинной хроматографии. Свежевыделенные тромбоциты человека (100-300 мг, полученных из 100 - 200 мл крови) лизировали в течение 1 часа при 5°С в 3 мл 0,025 M Na-фосфатного буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 M NaCl, 9М ультрачистой мочевины (фирма ICN), 0,5% Тритона Х-100 и 0,5% дезоксихолата Na После центрифугирования (2000g, 5°С, 15 мин) супернатант переводили в другой буфер, используя для этой цели центрифугирование (500g, 5°С, 5 мин) на колонках для ультрафильтрации (Milhpore Corporation, USA) заполненных се-фадексом G-25 Колонка была уравновешена 0,025 M фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 M NaCl и 0,5% Тритона Х-100 Затем образец разводили (1 5) в 0,025 M Na-фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 M NaCl и 0,1% Твина 20

10. Аффинная очистка экстрактов тромбоцитов Экстракт тромбоцитов, приготовленный как описано в разделе 10, пропускали 3 раза через колонку с иммуносорбентом (сефарозой, конъюгированной с МкАТ к С-концу СЕРТ) Чтобы избавиться от неспецифического связывания, через колонку предварительно пропускали 1 мл человеческой сыворотки, разведенной 15с помощью фосфатного буфера, рН 7,4, содержащего Твин 20 и Тритон Х-100

11. Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-ПААГ) и процедура иммуноблоттинга. Электрофорез в SDS-ПААГ проводили в вертикальных пластинах по методу Лэммли Образцы различных экстрактов или порции одного и того же экстракта разделяли на параллельных дорожках (40-50 мкг белка на дорожку) В некоторых экспериментах единственный анализируемый образец (1 мг белка) наносили по всей ширине геля (за исключением боковых пространств используемых для мар-

керных белков) После электрофореза белки переносили, по методу Тоубина, на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 ("Pharmacia") После соответствующих отмывок и забивки мест неспецифического связывания мембраны инкубировали с очищенными аффинно антителами к СЕРТ, конъ-югированными с пероксидазой Пероксидазная активность выявлялась хеми-люминесцентным методом с использованием наборов фирмы "Amersham" (США)

Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ

Получение гибридом - продуцентов моноклоиальных антител к С-концевому фрагменту 597-630 СЕРТ крысы. Для получения гибридом к фрагменту 597-530 СЕРТ, мы использовали, в качестве антигенов, два реком-бинатных белка, в которых указанный участок СЕРТ был соединен с различными белками-носителями (ГТ и ТГ) В результате слияния спленоцитов иммунной мыши с клетками миеломы мыши выросло около 2000 клонов Антитела культуральных супернатантов тестировались в твердофазном ИФА на способность связывать оба рекомбинантных белка (Р1 и Р2), которые включали фрагменты 596-630 СЕРТ крысы При этом, в 21 лунке была обнаружена особенно сильная одновременная анти-Р1 и анти-Р2 активность антител. Культуральные супернатанты от этих гибридом были проверены в иммуноб-лотгинге экстрактов тромбоцитов человека Антитела от 18 гибридом показали характерную картину - сплошное окрашивание в зоне белков с молекулярной массой (мол массой) >50 кДа и две ярко окрашенные полосы в зоне белков с мол массой около 35 и 37 кДа (Рис 2) Пять гибридом, антитела которых давали наиболее интенсивное окрашивание 35-37 кДа белков были отобраны для дальнейшего анализа В первую очередь, было показано, что эти антитела не связываются с ГТ и ТГ Гибридомы - продуценты этих антител были подвергнуты трехкратному клонированию.

I 3 3 4 5 6 7 8 9 Ю 11 12 13 14 15 16 17 15 19 20 21 Рис, 2, Тестирование антител к фрагменту 597-630 СЕРТ крысы в культу-

ральной среде от различных первичных гибридом с помощью имму ноблот-

тинга экстрактов тромбоцитов человека.

Для анализа в иммуноблоттинге использовали культуральные супернатанты различных первичных гибридом, показавших сильный положительный ответ в твердофазном ИФА при сеязывании с рекомбинантными белками, несущими фрагмент 597-630 СЕРТ крысы Экстракты тромбоцитов человека приготовляли по методу "А" (см. подпись к Рис. 3), в присутствии набора ингибиторов протеиназ. После Ов-Ыа-ПААГ-электрофореза и электроблоттинга нитроцеллюлозу разрезали на полоски. Каждую полоску использовали для тестирования антител купьтуралъ-ной среды (разведенной в 20 раз) от отдельно взятой гибридомы, обозначенной на рисунке соответствующим номером. Иммунные комплексы выявляли с помощью меченых пероксидазой кроличьих антител против 1д мыши (преадсорбмровакных 1дв человека), с использованием усиливающей хемилюминесцентной системы.

Каждая дорожка соответствует образцу культура л ьной среды от отдельной первичной гибридомы. Число проанализированных различных первичных гибридом составляет 21.

2. Анализ иммунореактивиости МкАТ к фрагменту СЕРТ 597-630 в иммуноблоттинге экстра сто в тромбоцитов. Оптимизация условий нмму-ноблоттинга. Реактивность МкАТ. секретируемых пятью клонированными гибридомами, предположительно специфичными к С-конну СЕРТ (МкАТ 23С5, 14Е9, 24А5, Р38 и Р39) была подвергнута детальному анализу в имму-ноблоттинге экстрактов тромбоцитов человека. При оптимизации условий выявления л оли пептидов в хем и люминесцентном иммуноблоттинге, мы отказались от принятого способа выявления комплекса антиген-антитело с помощью вторых антител (меченых пероксидазой антител против иммуноглобулинов мыши). В этом случае имело место сильное неспецифическое окраши-

вание в зоне белков с мол массами >50 кДа (см диссертацию) Вместо этого, мы обратились к одноступенчатому варианту иммуноблотгинга, с использованием аффинноочищенных анти-СЕРТ МкАТ, конъюгированных с перокси-дазой Это позволило элиминировать неспецифическое окрашивание в области белков с мол массой выше 50 кДа Кроме того, мы оптимизировали условия приготовления экстрактов тромбоцитов для ВРБ-ПААГ-электрофореза Сначала мы пользовались методом получения экстракта, который предполагает обработку тромбоцитов лизирующим буфером, включающим смесь детергентов и коктейль ингибиторов протеиназ (способ "А") Однако нам представлялось, что этот метод, обычно использующийся для анализа СЕРТ, не может полностью исключить неспецифический протеолиз белков в экстрактах Поэтому мы обратились к другим известным приемам предохранения белков от деградации. Эти методы предполагают немедленное воздействия на клеточные белки жестких факторов (прогревания, высоких концентраций мочевины), приводящих к практически мгновенной необратимой денатурации всех белков в лизатах, включая клеточные протеиназы На Рис 3 представлены результаты иммуноблоттинга экстрактов тромбоцитов человека, приготовленных упомянутыми методами, с использованием в качестве детекторных антител меченых пероксидазой МкАТ 23С5 В экстрактах, приготовленных с помощью мягкого способа (лизис клеток с помощью детергентов в присутствии ингибиторов протеаз), МкАТ 23С5 постоянно обнаруживали 4 полипептида с мол массами 68, 35,37 и ~ 150-200 кДа (Рис 3, А) Иногда также обнаруживалась дополнительная полоса с мол массой около 29 кДа (возможно, продукт неспецифической деградации СЕРТ) Можно предположить, что 68-кДа продукт представляет собой целую (полноразмерную) молекулу СЕРТ В экстрактах, приготовленных с помощью жестких процедур, МкАТ 23С5 постоянно выявляли, наряду с указанными белками, дополнительный полипептид с мол массой 56 кДа (Рис 3, варианты Б, В и Г-1) При более короткой экспозиции иммуноблоттов (варианты Б*, В* и Г*), выявлялись те же

Б* В* Г*

68-* шйШ

56-*" 4Ц1 ...... ЯК -НА>Ш'

37-»- «аш л

35-»- РИ Я

6856-

37 35

Рис 3 Иммуноблоттинг СЕРТ-иммунореактивных полипептидов в ЗОБ-лизатах тромбоцитов человека, полученных с помощью различных процедур обработки ЗББ Окрашивание с помощью моноклональных антител к С-концевому фрагменту, конъюгированных с пероксидазой хрена

Варианты А (1 и 2) свежевыделенные тромбоциты лизировали в мягких условиях используя лизирующий буфер, содержащий смесь детергентов и различных ингибиторов протеаз (детали указаны в секции 3 13 раздела "Материалы и методы") После ЗОБ-электрофореза экстрактов (50 цд белка на дорожку) и процедуры электропереноса) полоски нитроцеллюлозной мембраны, представляющие индивидуальные дорожки электрофореза, подвергались иммунноокрашиванию с помощью меченых пероксидазой МкАТ 23С5 (образец А-1), или инкубировались с теми же антителами, предварительно истощенными антигеном - рекомбинантным белком Рг (полоска А-2)

Варианты Б, В и Г свежие тромбоциты, полученные от одного и того же донора разделяли на равные порции Каждая порция тромбоцитов подвергалась экстракции в жестких условиях с использованием одной из трех процедур, описанных в разделе IV13 диссертации Белки полученных экстрактов разделяли с помощью БОЗ-ПААГ-электрофореза на параллельных дорожках (50 цд белка на ряд) в плоскости одного геля После электропереноса, нитроцеллюлозную мембрану с перенесенными белками подвергали иммуноокрашиванию с помощью меченых пероксидазой МкАТ 23С5 (ряды Б, В и Г-1) Для отрицательного контроля, идентичные вырезанные полоски мембраны, с перенесенными белками, инкубировали с теми же мечеными пероксидазой антителами, но предварительно истощенными антигеном -рекомбинантным белком Р2 (ряд Г-2) Ряды Б, В и Г (1 и 2) соответствуют экстрактам, полученным с помощью методов Б, В и Г, описанным в разделе IV 13, соответственно

Варианты Б*, В* и Г* картина, полученная при более короткой экспозиции вариантов Б, В и Г

Блотттинг окрашивали методом усиленной хемилюминесценции

белки, кроме полипептидов с мол массой 150-200 кДа (возможно, являющихся агрегатами молекул СЕРТ) Связывание МкАТ 23С5 со всеми указанными белками подавлялось после истощения антител избытком антигена (белка Р2), что указывает на иммунологическую специфичность реакций (Рис 3, вариант Г-2) Важно отметить, что при равном количестве белка лизатов, наносимого на одну дорожку электрофореза, интенсивность окраски всех иммунореакив-ных полос, включая 68 кД-белок, во всех жестких способах была значительно выше, чем в мягком способе "А" Этот факт, также как сохранение нестабильного 56 кДа-белка, может свидетельствовать, что жесткие способы более надежно предохраняют СЕРТ от неспецифической деградации, чем мягкий способ "А". В дальнейшем, при анализе СЕРТ, мы неизменно использовали жесткие условия (метод "В") для получения клеточных лизатов Другие четыре МкАТ, подробно изученные в нашей работе (МкАТ 14Е9, 24А5, Е38 и Р39), проявляли в иммуноблоттинге экстрактов тромбоцитов сходную имму-нореактивность

3. Получение и характеристика кроличьих поликлональных антител к синтетическим пептидам, включающим фрагменты СЕРТ человека 6983 и 86-100. Мы получили также две кроличьи поликлональные антисыворотки, направленные к двум соседним участкам в "М-концевой части молекулы СЕРТ В качестве антигенов использовали два синтетических пептида, включавших аминокислотные остатки 69-83 в №конце и остатки 86-100 в начале ТМД1 молекулы СЕРТ человека (Рис 1, б) Антитела очищали с помощью аффинной хроматографии и конъюгировали с пероксидазой хрена Мы проанализировали связывание этих антител с полипептидами, очищенными аффинно из экстрактов тромбоцитов человека с помощью МкАТ Е39 к С-концевому фрагменту СЕРТ 597-630 Для анализа использовали пять лизатов человеческих тромбоцитов (выделенных от разных доноров), которые индивидуально очищались на колонке с МкАТ Б39 Типичные картины иммуноб-лоттингов, получаемых в этих экспериментах, представлены на Рис 4 Как и ожидалось, 68 кДа - белок (предположительно, полноразмерная молекула

А Б В

68 56

68

37 35

-68 •56

Рис 4 Иммуноблоттин транспортера серотонина в экстрактах тромбоцитов человека, очищенных аффинно на антителах к С-концу молекулы белка Окрашивание мечеными антителами к N-концевым фрагментам молекулы полипептида

Варианты А, Б (1 и 2) и В (1 и 2)

Свежевыделенные тромбоциты человека лизировали в жестких условиях, препятствующих неспецифической деградации белка (см подпись к Рис 3) Экстракты очищали на аффинной колонке сефароза-МкАТ F39 к С-концу СЕРТ (условия хроматографической очистки описаны в разделе "Методы") Фракции связавшихся белков (элюаты) подвергали SDS-ПААГ-электрофорезу (на одну дорожку наносилось такое количество белка, которое очищалось из 60 мг тромбоцитов) После электропереноса белков на нитроцеллюлозную мембрану, эта мембрана разрезалась на вертикальные идентичные полоски, соответствующие индивидуальным электрофоретическим дорожкам Полоски инкубировали с мечеными пероксида-зой антителами к С-концу, N-концу и ТМД1 СЕРТ На рисунке представлены типичные картины, полученные после иммуноокрашивания полосок мембраны с помощью меченых пероксидазой антител А - 300 нг/мл МкАТ 24А5 к С-концу СЕРТ, Б -1500 нг/мл ПкАТ 69 83 к N-концу (варианты 1 и 2), В - 15000 нг/мл ПкАТ 86-100 к ТМД1 (варианты 1 и 2)

Ряды 1 и 2 вариантов Б и В представляют результаты, полученные с двумя различными экстрактами, которые были приготовлены из тромбоцитов взятых от двух разных доноров Электроблоттинг окрашивали методом усиленной хемилю-минесценции (время экспозиции для варианта А составляло 1-2 мин, для вариантов Б и В -10-15 мин)

СЕРТ) обнаруживался в полученных элюатах не только с помощью С-концевых МкАТ 24А5 (Рис 4, вариант А), но также с помощью №-концевых ПкАТ 69-83 (варианты Б-1 и Б-2) и ПкАТ 86-100 к ТМД1 (варианты В-1 и В-2) Кроме того, С-концевые МкАТ 24А5 выявляли во всех элюатах 56 кДа-полипептид (пример иммуноблоттинга приведен на Рис 4, А) В двух из пяти проанализированных элюатов ПкАТ 86-100 также обнаружили 56 кДа-полипептид (пример приведен на Рис 4, В-2) В то же время, ПкАТ 69-83 не детектировали 56 кДа-полипептид ни в одном из этих элюатов Возможно, в 56 кДа-полипептиде утрачена Ы-концевая часть, включающая фрагмент 69-83 Описанные совпадения в величинах молекулярных масс иммунореактивных белков, выявляемых антителами к различным участкам СЕРТ (К-концу, ТМД1 и С-концу) в экстрактах, аффинно-очищенных с помощью С-концевых антител, убедительно свидетельствуют, что использованные антитела способны распознавать в иммуноблотгинге продукты гена БЬСбА, кодирующего СЕРТ Вместе с тем, белки с мол массой 35-37 кДа обнаруживались в экстрактах, очищенных на МкАТ Р39, только с помощью С-концевых МкАТ 24А5 Антитела к 1Ч-концу молекулы СЕРТ (ПкАТ 68-83 и ПкАТ 86-100) не выявляли эти белки в тех же элюатах Указанные различия в реактивности С- и Ы-концевых антител заставляют предполагать, что 35-37 кДа белки не включают фрагмент 68-100

4. Анализ иммунореактивности поликлональных антител к 1Ч-концу и ТМД-1 СЕРТ (ПкАТ 69-83 и ПкАТ 86-100, соответственно) в иммуноблотгинге неочищенных экстрактов тромбоцитов человека. На следующих этапах нашей работы мы изучили возможность использования ПкАТ 69-83 и ПкАТ 86-100 для анализа СЕРТ методом иммуноблоттинга в лизатах тромбоцитов человека На Рис 5 представлены типичные картины иммуноблоттинга СЕРТ, наблюдавшиеся в этих экспериментах Образцы А-1, Б-1 и В-1 представляют собой результаты иммуноблоттинга (в одинаковых условиях) порций одного и того же неочищенного лизата (приготовленного из тромбоцитов

г

Рис, 5. Иммуноблотгинг транспортера серотонина человека в неочищенных экстрактах тромбоцитов с помощью антител к различным участкам молекулы СЕРТ.

Варианты А (1, 2), Б (1, 2) и В (1, 2): тромбоциты, выделенные от одного лица (донор 1) лизировали в жестких условиях {см, метод Б в разделе IV. 12). Экстракты подвергали 8 ОЭ-ПААГ-электрофорезу, при этом образец наносили по всей ширине геля, как описано б разделе IV. 17. После электропереноса белков на нитроцел-люлозную мембрану, она разрезалась на несколько одинаковых вертикальных полос, при этом на каждую полоску приходилось »60 цд перенесенного бепка. Полоски подвергались иммунному окрашиванию о помощью меченых пероксидазой антител к различным участкам молекулы СЕРТ: МкАТ 23С5 к С-концу (вариант А-1), ПкАТ 69-83 к Л-концу (вариант Б-1) и ПкАТ 86-100 к фрагменту ТМД1 (вариант В-1). В контроле {варианты А-2, Б-2 и В-2) идентичные полоски инкубировали с теми же антителами, но предварительно истощенными антигеном (рекомбинант-ным белком Р2 для МкАТ 23С5 и соответствующими синтетическим пептидами для ПкАТ).

Варианты Г (1 и 2): Иммуноблоттинг неочищенных экстраетов тромбоцитов, полученных от другого лица (донора 2), в качестве детекторного антитела использовали меченые пероксидазой ПкАТ 86-100. Экспериментальные условия были такие же как в вариантах А - В В контроле (вариант Г-2) полоски инкубировали с мечеными пероксидазой ПкАТ 86-100, предварительно истощенными антигеном (синтетическим фрагментом СЕРТ 86-100).

Блотттинг окрашивали методом усиленной хемилюминесценции.

одного донора), при использовании для выявления СЕРТ трех разных меченых пероксидазой антител: МкАТ 23С5 к С-концу СЕРТ (вариант А-1), ПкАТ 68-83 к >1-концу (Б-1) и ПкАТ 69-100 к ТМД-1 (В-1). Можно видеть, что ПкАТ 68-83 выявляли два белка с мол. .массами около 14 кДа и 32 кДа (Рис. 5, вариант Б-1). Белок с мол. массой 68 кДа этими антителами не окрашивался, хотя его присутствие в том же лизате было показано с помощью

МкАТ 23С5 (Рис 5, вариант А-1) Возможно, аффинность ПкАТ 68-83 недостаточна для выявления 68 кДа-белка в неочищенных лизатах Действительно, МкАТ 23С5 были эффективны в иммуноблотгинге в концентрациях 50-150 нг/мл, а ПкАТ 69-83 и ПкАТ 86-100 - в концентрациях 1000-1500 нг/мл ПкАТ 86-100 уверенно выявляли в том же лизате тромбоцитов четыре белка с мол. массами около 68, 56, 32 и 22 кДа (Рис 5, вариант В-1) Для ПкАТ 86-100 на рис 5 приведены данные, полученные в разных опытах с двумя различными лизатами тромбоцитов (варианты В-1 и Г-1) Белки с мол массами 67, 56, 32 и 22 кДа выявлялись в обоих лизатах, в то время как 17 и 35 кДа-белки не являлись облигатными Окрашивание резко ослабевало (или исчезало) после истощения антитела избытком антигенов

5. Анализ СЕРТ методом иммуноблоттинга в мозге человека и крысы с помощью антител к С-концу СЕРТ. Специфичные к С-концу СЕРТ МкАТ 24А5, показавшие наибольшую эффективность в иммуноблотгинге СЕРТ в тромбоцитах, были использованы в дальнейшем для анализа СЕРТ в экстрактах ткани мозга человека (постмортальный материал) и крысы На Рис 6 представлены типичные картины, получаемые нами при иммуноблот-тинге ткани мозга, в сравнении с картинами, полученными при иммуноблот-тинге СЕРТ в тромбоцитах Все анализируемые экстракты были получены в жестких условиях В образцах мозга человека, меченые пероксидазой МкАТ24А5 постоянно выявляли дуплет белков с мол массой 35-37 кДа (Рис 6, вариант Б-1). Белок с мол массой около 41 кДа является спорадической находкой В экстрактах постмортального мозга человека МкАТ 24А5 тестировали также белок с мол массой около 68 кДа, однако здесь этот сигнал был намного слабее, чем при иммуноблотгинге экстрактов тромбоцитов (Рис 6, А) Белок с мол массой около 150-200 кДа также обнаруживался в виде минорной полосы Белок с мол. массой 56 кДа вообще не обнаруживался Иммунореактивность почти полностью подавлялась истощением МкАТ

в

>аоК'

68-»- -А 68-

56-

IPt*m ¡¡ze^f ■■■ —

"в . -12 12

Рис. 6. Иммуноблоггинг транспортера серотонина в посмертном мозге че-лоиека н в мозге крысы с помощью антител к С-концу молекулы белка.

Экстракт тромбоцитов человека (вариант А), образец посмертного мозга человека {вариант Б) и ткамь мозга крысы (вариант В) подвергали SDS-ПААГ-электрофорезу на параллельных дорожках (=60 белка на дорожку). Клеточные экстракты готовили в жестких условиях, предотвращающих неспецифическую деградацию белка (см. раздел 111.18). После электропереноса, нитроцел-люлозная мембрана разрезалась на идентичные вертикальные полоски, соответствующие индивидуальным электрофоретическим дорожкам. Полоски окрашивали с помощью меченых пероксидазой МкАТ 24А5 к С-концу СЕРТ (варианты А. Б-1 и В-1). В контроле (варианты Б-2 и В-2) идентичные полоски инкубировали с теми же антителами, но предварительно истощенными антигеном (ре-комбикантным белком Р2).

Электроблоттинг окрашивали методом усиленной хемилюминисценции.

24А5 избытком антигена (белком Р2). Отсутствие 56 кДа-белка и низкий уровень 68 кДа-белка в образцах мозга человека заставляло рассматривать возможность артефактов, связанных с аутолизом белков. Поэтому, для сравнения, мы проанализировали экстракты, полученные из с веже выделен ной ткани мозга крысы (рис. 6, В-1). В этих препаратах МкАТ 24А5 постоянно определяли 37, 56, 68 и 150-200 кДа белки.

IV. ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе мы получили МкАТ и ПкАТ к трем неперекрывающимся участкам молекулы СЕРТ, включающим аминокислотные последовательности 69-83 в ТЧ-концевой части белка, последовательность 86-100 в начале ТМД-1 и С-концевой фрагмент 597-630. Мы полагаем, что эти антитела

специфичны к СЕРТ на основании следующих критериев. 1) антитела взаимодействуют в ИФА и иммуноблоттинге с рекомбинантными белками и синтетическим пептидами, использовавшимися для иммунизации в качестве антигенов, 2) все полученные нами антитела распознают в иммуноблоттинге аффинно-очищенных и неочищенных экстрактов тромбоцитов человека им-мунореактивный белок с мол. массой около 68 кДа, что очень близко к значению теоретической молекулярной массы СЕРТ человека (70,5 кДа), вычисленной на основании последовательности кДНК, 3) истощение полученных сайт-специфических антител с антигенами (рекомбинантными белками и пептидами, включающими соответствующие последовательности СЕРТ) приводит к исчезновению иммунореактивных полос в иммуноблоттинге, 4) в опытах по реципрокному связыванию, антитела, направленные к Оконцу и ТМД1 СЕРТ, распознавали иммунореактивный белок с мол массой 68 кДа, аффинно-очищенный на С-концевых антителах Реципрокное связывание подтверждает, что полученные сайт-специфические антитела действительно распознают различные эпитопы на одной и той же белковой молекуле (СЕРТ) Подобные критерии широко использовались для подтверждения специфичности антител во многих исследованиях

Впервые, поликлональные сайт-специфические антитела к СЕРТ были получены в работе Квана с соавт [<3тп е! а1, 1995] В частности, в этой работе были получены ПкАТ, направленные к участку 597-630 С-конца СЕРТ крысы ("СТ-2 эпитопу") Этот участок отличается высокой степенью межвидовой консервативности Например, у человека и крысы здесь обнаруживается всего три аминокислотных замены Вместе с тем, наблюдается значительная дивергенция между последовательностью СТ-2 эпитопа СЕРТ и аналогичными участками других членов генного семейства БЬСб Таким образом, анти-СТ-2 антитела представлялись удобным инструментом для анализа эндогенного и гетерологичного СЕРТ в клетках и тканях различного происхождения Анализ с помощью иммуноблоттинга эндогенного СЕРТ в тканях и клетках крысы (включая мозг и тромбоциты) выявил иммунореактивные

формы с мол массой 76-90 кДа, в трансфицированных клетках HeLa обнаруживались формы СЕРТ с мол массами 60 и 90 и 200 кДа Сходные результаты были получены в работах ряда других авторов [Chen et al, 1997, Ozaslan et al, 2003, Serafeim et al, 2002, Meredith et al, 2005, Inazu et al, 2001] Таким образом, в этих работах нет никаких указаний на выявление низкомолекулярных форм СЕРТ, в то время как полученные нами МкАТ постоянно выявляли дуплет из 35 и 37 кДа белков, наряду с белками большего размера (68 и 56 кДа). Однако, в работе Гулесериана с соавт, при анализе образцов посмертного мозга людей СЕРТ выявлялся в иммуноблотгинге в виде иммунореак-тивного белка с молекулярной массой около 31 кДа [Gulesserian et al, 2000] Интересно, также, что в другой, совсем недавно опубликованной работе, сообщается об обнаружении в образцах белого вещества мозга человека низкомолекулярной формы СЕРТ с мол массой около 30 кДа [Kish et al, 2005]

Сравнение результатов работ различных групп авторов по изучению СЕРТ методом иммуноблоттинга осложняется тем, что эти исследования выполнены в неодинаковых условиях, с использованием разных антител и клеточных моделей Очевидно, эти факторы могут влиять на результаты анализа В частности, условия приготовления экстрактов могут являться одной из причин вариаций в размерах выявляемых СЕРТ-иммунореактивных полипептидов В настоящей работе показано, что условия, вызывающие практически немедленную денатурацию всех белков в экстрактах (в том числе клеточных протеаз), по-видимому, позволяют избежать существенной деградации СЕРТ в процессе приготовления лизатов для электрофореза Мы также увеличили разрешающую способность метода за счет обращения к одноступенчатому варианту иммуноблоттинга с использованием меченых пероксидазой анти-СЕРТ антител. Используя указанные методические приемы, нам удалось показать, что, в совокупности, полученные нами антитела к СЕРТ воспроизводимо выявляют в лизатах тромбоцитов человека (приготовленных в жестких условиях) 8 белков с мол массами 14, 22, 32, 35, 37, 56, 68 и «150-200 кДа Белок с мол массой 68 кДа, выявляемый антителами как к С-концу, так и к N-

концу СЕРТ, по-видимому, соответствует полноразмерной молекуле транспортера

Результаты анализа СЕРТ в мозге крысы и человека с помощью С-концевых МкАТ, в целом, хорошо согласуются с результатами иммуноблот-тинга СЕРТ в тромбоцитах Более того, обнаружение 68, 56 и 37 кДа белков в свежевыделенном мозге крысы опровергает подозрение, что аналогичные белки, обнаруженные в ткани постмортального мозга человека являются продуктом аутолиза Наблюдаемые небольшие отличия между картинами имму-ноблотганга экстрактов ткани мозга крысы и человека возможно объясняются межвидовыми вариациями в метаболизме (процессинге) СЕРТ Традиционно, тромбоциты используются в фармакологических и клинических исследованиях в качестве доступной экстрацеребральной модели серотонинэргиче-ских нейронов Данные об идентичности картин иммуноблотгинга СЕРТ в тромбоцитах и ткани мозга представляются весьма важными для такого рода исследований

Как полагают цитированные выше авторы [Qian et al, 1995, Chen et al., 1997, Ozaslan et al, 2003, Serafeim et al, 2002], выявляемая в иммуноблоттин-ге гетерогенность СЕРТ объясняется различным гликозилированием Однако это предположение вряд ли может полностью объяснить полученные нами результаты, так как в нашей работе антитела к различным участкам СЕРТ выявляли разные наборы СЕРТ-иммунореактивных белков в одном и том же ли-зате тромбоцитов Учитывая также большие различия в мол массе этих полипептидов (14-68 кДа, без учета 150-200 кДа агрегатов), представляется невозможным предположить, что выявляемые нами СЕРТ-иммунореактивные белки имеют одинаковую первичную структуру и отличаются только степенью гликозилирования Данные соображения заставили нас искать другие возможные объяснения полученным результатам Одно из возможных предпо-

1 mettplnsqk qlsacedged cqengvlqkv vptpgdkves gqisngysav pspgagddtr hsipattttl vaelhqgere twgWr

1 2 3 i

86 vdfll svig'yavdlg nvwrfpyicy qngggafHpytimaifggi plfymelalg qyhmgcisi «гкюрЛкЩЩ^Ш

4

181 awalyyliss ftdqlpwtsc knswntgnct nyfsedmtw tlhstspaee fytrhvlqih rskglqdlgg is||Jslc|St^Slll

I S 6

kgvk

272 кдуМздкчутЪаЯрух ИэуЦугда tlpgawrgvl Гу1крп\л«1к1Ид\/\л/йаа «ЧЙ^бШЯбРШ nkfnnncyqd

7 "8

361 лМэтпст Мдутаетг nedvsevakd адрвН^ «итшДВШРт ВДОвИад^дуЛау

9 10

451 ldefphvwak гтегМа\го {МдвМ ^ддаутк Пееуа1дра уИуаНеау ауву^уд^ fcrdvkemlg Тврд\лгЬлгг

И _ _ 12

539 I суууа1зр1А1 АювАгДвр pqlrlfqyny pywsмlgyc № V ¡^: ■ ■. гШ рдШегик зфе1р1е/ pcgdlrlnav

Рис. 7 Гипотетические сайты специфического протеолиза (процессинга) молекулы транспортера серотонина (указаны стрелками и выделены жирным курсивом) Аминокислотные последовательности трансмембранных доменов затемнены и обозначены цифрами

ложений - протеолитический процессинг СЕРТ Можно выдвинуть гипотезу, что СЕРТ-иммунореактивные белки с мол массами 14, 22, 32, 35-37 и 56 кДа представляют собой пептидные фрагменты, образовавшиеся в результате эн-допротеолиза белка - предшественника (теоретическая мол масса 70,5 кДа), который в условиях наших экспериментов выявляется как 68 кДа-полипептид Расположение возможных точек разрыва в молекуле СЕРТ можно приблизительно вычислить на основании известной специфичности антител, электрофоретической подвижности иммунореактивных полипептидов (мол массы) и среднего значения мол массы одного аминокислотного остатка в молекуле СЕРТ (106 кДа) Эти сравнения позволяют предположить, что молекула СЕРТ разрывается в точке Lys 84 Lys 85 и на участке Lys272-Gly273-Val274-Lys275-Tre276-Ser277-Gly278-Lys279, как указано на Рис 7 В этом случае должны образоваться два N-концевых фрагмента с мол массами около 10 и 30 кДа (ориентировочно, включают аминокислотные последовательности 1-83 и 1-271) и неконцевой 20 кДа-полипептид - фрагмент 86-279, включающий ТМД 1-4 Кроме того, при отщеплении фрагментов 1-83 и 1-271

должны образоваться два С-концевых фрагмента с мол массами около 56 и 37 кДа (ориентировочно, включают аминокислотные остатки 86-630 и 273630) Можно видеть, что мол массы белков, выявляемых МкАТ 23С5 к С-концу СЕРТ (35-37, 56 и 67 кДа), ПкАТ к фрагменту 69-83 (14, 32 и 67 кДа) и ПкАТ к фрагменту 86-100 (22, 32, 56 и 67 кДа), очень близки к расчетным мол массам полипептидов, которые должны выявляться антителами данной эпитопной специфичности, если допустить, что молекула СЕРТ подвергается эндопротеолизу в сайтах, указанных на рис 1, б Небольшие расхождения между расчетными и экспериментальными значениями мол масс могут объясняться 1) высоким содержанием положительно заряженных аминокислот в составе небольших полипептидов, что в условиях БОВ-ПААТ электрофореза может приводить к получению завышенного значения определяемой мол массы, 2) дальнейшим протеолизом фрагментов, 3) иными посттрансляционными событиями, приводящими к изменению электрофоретической подвижности, 4) возможным существованием нескольких близлежащих точек разрыва Следует отметить, что гипотеза об эндопротеолизе СЕРТ не отрицает, что гликозилирование также может играть роль в возникновении гетерогенности СЕРТ

Альтернативным объяснением полученных нами результатов может быть предположение о кросс-реактивности полученных антител к СЕРТ с другими клеточными белками Однако, некоторые из выявленных нами иммунореак-тивных белков (например, 68 и 56 кДа) обнаруживались в одних и тех же экспериментах с использованием антител к разным участкам СЕРТ Белки с мол массой 35-37 кДа обнаруживались 18 антителами от различных первичных гибридом к фрагменту 597-630 (рис 2) Иммунологическая специфичность всех выявляемых белков была подтверждена исчезновением окрашивания полос в иммуноблоттинге после преинкубации анти-СЕРТ антител с антигенами В совокупности, эти факты могут служить косвенным подтверждением принадлежности выявляемых белков к СЕРТ (для получения прямых доказательств необходимо секвенирование индивидуальных белков)

Наконец, можно было бы высказать предположение, что множественные формы СЕРТ возникли в результате альтернативного сплайсинга гена СЕРТ Однако не было установлено, что данный механизм может приводить к образованию разных форм СЕРТ, хотя было показано существование множественных транскриптов гена СЕРТ с различной некодирующей областью [Bradley and Blakely, 1997]

Таким образом, мы рассмотрели несколько гипотез о возможных причинах возникновения наблюдаемой нами гетерогенности форм СЕРТ В настоящий момент нам представляется, что наиболее вероятным механизмом мог бы быть эндопротеолиз СЕРТ (в сочетании с гликозилированиием) Однако, для окончательного ответа на этот вопрос необходимы дальнейшие исследования Интересно, что совсем недавно (уже после опубликования наших результатов), появилось сообщение, в котором также высказывается предположение о возможном существовании укороченных форм СЕРТ [Shigematsu et al, 2006] Эти выводы сделаны на основании результатов иммуногистохи-мического анализа различных отделов мозга крысы с помощью антител к N- и С-концу СЕРТ

В заключение, нам представляется, что результаты нашей работы могут быть полезны в методическом плане и с точки зрения изучения структуры и функции СЕРТ, а также путей его регуляции и процессинга

V. выводы

1) Получены МкАТ к С-концевому фрагменту СЕРТ 597-630, При использовании МкАТ к фрагменту СЕРТ 597-630 разработан оптимизированный вариант иммуноблоттинга СЕРТ, позволяющий проводить анализ СЕРТ в клеточных экстрактах

2) Выяснены условия, обеспечивающие высокую эффективность анализа СЕРТ методом иммуноблоттинга Во-первых, целесообразно использовать для выявления иммунореактивных белков меченые пероксидазой аффинно-очищенные СЕРТ-специфические антитела Этот подход позволяет элиминировать неспецифическое окрашивание, наблюдаемое при использовании меченых пероксидазой вторых (антивидовых) антител Во-вторых, ввиду чувствительности СЕРТ к неспецифическому протеолизу, экстракты для анализа необходимо готовить в жестких условиях, препятствующих неспецифический деградации белков

3) Получены кроличьи ПкАТ к N- концевому участку 69-83 СЕРТ и фрагменту 86-100 в начале ТМД1, эффективные в иммуноблоттинге

4) С помощью С-концевых анти-СЕРТ МкАТ в экстрактах тромбоцитов человека, в препятствующих неспецифической деградации белков, методом иммуноблоттинга обнаружено 5 иммунореактивных белков с мол массами 35, 37, 56 и 68 кДа, а также белки с мол массой 150-200 кДа, по-видимому, являющиеся агрегатами молекул СЕРТ.

5) С помощью ПкАТ к N-концевому фрагменту 69-83 СЕРТ и ПкАТ к фрагменту 86-100 в ТМД1 СЕРТ в экстрактах тромбоцитов человека, в условиях, препятствующих неспецифической деградации белков, обнаружены полипептиды с мол массами 14, 22, 32, 56 и 68 Белки с мол массой 35 и 37 кДа этими антителами не выявлялись, что может указывать на утрату N-концевой части молекулы СЕРТ в этих полипептидах

6) В мозге крысы и человека методом иммуноблоттинга с помощью МкАТ к С-концу СЕРТ обнаружены полипептиды с мол массой 35, 37, 56 и 68 кДа

7) Белок с мол массой 68 кДа обнаруживался в экстрактах тромбоцитов, очищенных аффинно на МкАТ к С-концу СЕРТ, как с помощью С-концевых МкАТ, так и с помощью ПкАТ к К-концу СЕРТ, что позволяет заключить, что этот белок, по всей видимости, является полноразмерной молекулой СЕРТ

8) Предложена гипотеза о протеолитическом процессинге СЕРТ, согласно которой обнаруженные СЕРТ-иммунореактивные белки с мол массами 14, 22, 32, 35, 37 и 56 кДа являются пептидными фрагментами, образующимися в результате эндопротеолиза (протеолитического процессинга) белка-предшественника с мол массой 70,5 кДа (теоретическая мол масса СЕРТ), мигрирующего в условиях наших экспериментов как белок с мол массой 68 кДа

VI. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) О С Брусов, M И Фактор, Г.П Злобина, Е В. Павлова, О JI Сегал, Ю С Массино, А Д Дмитриев (2001) Содержание и молекулярная гетерогенность белка-переносчика серотонина в тромбоцитах больных различными психическими заболеваниями сравнительный анализ с использованием мо-ноклональных и поликлональных антител Вестник РАМН, т 9, №7, стр 3742

2) А Д Дмитриев, Е В Павлова, M И Фактор, О JI Сегал, Ю С Массино, И В Доброхотов, M Б Смирнова, Д Е Хван, Д А Яковлева, Г И Коляскина, О С Брусов (2004) Анализ транспортера серотонина в тромбоцитах человека методом иммуноблотганга с помощью сайт-специфических антител. Биохимия, т 69, вып 6, стр 774-789

3) A D Dmitnev, MI Factor, О L. Segal, E V Pavlova, Y S Massmo, MB Smirnova, DA Yakovleva, DA Dmitnev, EA Kizim, GI Kolyaskina, О S Brusov (2005) Western blot analysis of human and rat serotonin transporter m platelets and brain using site-specific antibodies Evidence that transporter undergoes endoproteolytic cleavage Clin Chim Acta, vol 356, №1-2, p 76-94

4) E V Pavlova, О S Brusov, MI Factor, A D Dmitnev, M A Morozova (2005) Psichosis in schizophrenia link with platelet 5-HT markers The World Journal of Biological Psychiatry, vol 6, suppl 1, p 233

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ГТ — глютатионтрансфераза;

Бв-Ка-ПААТ - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии доде-цилсульфата натрия,

ИФА - твердофазный иммуноферментный метод, МкАТ — моноклональные антитела,

ПкАт 86-100 - поликлональные антитела к фрагменту транспортера серото-нина 86-100 (Ус1Я18У1£уаус%),

ПкАт 69-83 — поликлональные антитела к фрагменту транспортера серотони-на 69 — 83 (tlvaelhqgeretwg), ПААГ - полиакриламидный гель,

Р1 — рекомбинантный белок в котором модифицированная глутатионтранс-фераза (ГТ) соединена, в рамке, с фрагментом 597-630 серотонинового транспортера,

Р2 - рекомбинантный белок, в котором модифицированный тиоредоксин-6Н18 (ТГ) присоединен, в рамке, к фрагменту 597-630 серотонинового транспортера крысы,

СЕРТ - серотониновый транспортер,

ТГ - тиоредоксин-6Н18,

ТМД - трансмембранный домен;

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Павлова, Елена Владимировна

Список использованных сокращений

I ВВЕДЕНИЕ

II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Роль механизма обратного захвата нейромедиаторов в д синаптической передаче информации

2 Обнаружение процесса обратного захвата нейромедиа- 12 торов (моноаминов и аминокислот)

3 Физико-химическая характеристика процесса обратного 13 захвата нейромедиаторов (моноаминов и аминокислот)

4 Электрофизиологические исследования транспортеров 18 нейромедиаторов с помощью "пэтч-кламп" метода

5 Солюбилизация и очистка белков - транспортеров ней- 20 ромедиаторов

6 Обнаружение семейства генов SLC6 молекулярно- 21 генетическими методами

7 Транспортер серотонина

7.1. Распределение в тканях и клетках

7.2. Структурно-функциональные исследования

7.3. Пост-трансляционный процессинг СЕРТ

7.4 Регуляция СЕРТ

7.4.1 Пострансляционная регуляция

7.4.2. Регуляция экспрессии гена СЕРТ (медленная регуляция)

7.5. Роль СЕРТ в клеточных и физиологических процессах

7.5.1. Нейромедиатор серотонин

7.5.2. Р°ль СЕРТ в клеточных и физиологических процессах, протекающих с участием серотонина

Фармакологические аспекты.

Использование сайт-специфических антител для анализа СЕРТ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Рекомбинантные белки к С-концевому фрагменту 597630 транспортера серотонина крысы, использованные в работе

Получение моноклональных антител к С-концевому участку СЕРТ крысы 597

Определение антигенсвязывающей активности монокло- 47 нальных антител

Очистка моноклональных антител с помощью ионооб- 48 менной хроматографии

Получение иммуногенных конъюгатов пептидов с бычь- 48 им сывороточным альбумином

Получение кроличьих антисывороток к пептидным 49 фрагментам транспортера серотонина

Тестирование антител к пептидным фрагментам транс- 49 портера серотонина

Приготовление аффинных носителей

Аффинная очистка поликлональных кроличьих антител 51 к пептидным фрагментам белка-транспортера серотонина

Определение белка

Приготовление конъюгатов антител с пероксидазой хре- 52 на

Выделение тромбоцитов человека

Приготовление экстрактов тромбоцитов для электрофо- 53 реза

14 Приготовление экстрактов тромбоцитов для аффинной 54 хроматографии

15 Аффинная очистка экстрактов тромбоцитов.

16 Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсуль- 55 фатом натрия (SDS-ПААГ)

17 Процедура иммуноблоттинга

18 Иммуноблоттинг СЕРТ в экстрактах посмертного мозга 58 человека

19 Иммуноблоттинг экстрактов ткани мозга крысы 59 IV РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1 Получение гибридом - продуцентов моноклональных ан- 60 тител к С-концевому фрагменту 597-630 транспортера серотонина крысы

2 Анализ специфичности антител к транспортеру серото- 61 нина

3 Очистка моноклональных антител и их характеристика

4 Оптимизация условий иммуноблоттинга СЕРТ в лизатах 68 тромбоцитов человека

4 1 Подбор эффективных концентраций меченых пероксида- 68 зой моноклональных антител для иммуноблоттинга

4 2 Оптимизация метода получения лизата тромбоцитов для иммуноблоттинга

4.3 Анализ картины иммуноблоттинга с использованием па- 74 нели моноклональных антител к С-концевому фрагменту транспортера серотонина

4.4 Иммуноблоттинг лизатов тромбоцитов, очищенных аф- 74 финно на колонках антитела-сефароза

5 Получение и характеристика кроличьих поликлональных 78 антител к синтетическим пептидам, включающим фрагменты СЕРТ человека 69-83 и 86

5.1 Получение иммуногенных конъюгатов пептидов с бычь- 78 им сывороточным альбумином

5.2 Тестирование антител к фрагментам транспортера серо- 79 тонина в иммунных сыворотках

5.3 Аффинная очистка антител к пептидным фрагментам 81 транспортера серотонина и их конъюгация с пероксидазой хрена

5.4 Доказательство специфичности поликлональных антител 83 к N-концевым фрагментам СЕРТ: иммуноблоттинг лизатов тромбоцитов, очищенных аффинно на антителах к С-концевому фрагменту

5.5 Анализ иммунореактивности поликлональных антител к 86 N-концевым фрагментам СЕРТ 69-83 и 86-100 в имму-ноблоттинге экстрактов тромбоцитов человека

6 Анализ СЕРТ методом иммуноблоттинга в мозге челове-

§9 ка и крысы с помощью антител к С-концу СЕРТ

V ОБСУЖДЕНИЕ

VI ВЫВОДЫ 112 VIII СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ГТ - глютатионтрансфераза;

ИФА - твердофазный иммуноферментный метод;

МкАТ - моноклональные антитела;

ПкАт 86-100 - поликлональные антитела к фрагменту транспортера серотонина 86-100 (vdfllsvigyavdlg);

ПкАт 69-83 - поликлональные антитела к фрагменту транспортера серотонина 69 - 83 (tlvaelhqgeretwg); ПААГ - полиакриламидный гель;

Р1 - рекомбинантный белок в котором модифицированная глутатион-трансфераза (ГТ) соединена, в рамке, с фрагментом 597-630 серотониново-го транспортера;

Р2 - рекомбинантный белок в котором модифицированный тиоредоксин-6His (ТГ) присоединен, в рамке, к фрагменту 597-630 серотонинового транспортера крысы; СЕРТ - серотониновый транспортер;

SDS-ПААГ - электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия;

ТГ - тиоредоксин-бШБ;

ТМД - трансмембранный домен;

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ транспортера серотонина с помощью сайт-специфических антител"

Актуальность проблемы. Активность серотониновой системы у человека и животных в значительной степени определяется встроенным в пресинаптическую мембрану белком - транспортером серотонина (СЕРТ), который обеспечивает обратный захват нейромедиатора из пресинаптиче-ской щели [Barker and Blakely, 1995; Rudnick and Clark, 1993]. За последнее десятилетие были клонированы гены, кодирующие СЕРТ человека, некоторых млекопитающих и Drosophila melanogaster [Blakely et al., 1991; Chang et al., 1996; Corey et al., 1994; Demchyshyn et al., 1994; Hoffman et al., 1991; Lesch et al., 1993; 1993a; Ramamoorthy et al., 1993]. Молекулярно-генетические исследования установили, что СЕРТ принадлежит к семейству Na+ и С1~- -зависимых транспортных белков, которые осуществляют перенос ряда биогенных аминов и аминокислот, являющихся нейротранс-миттерами и нейромодуляторами: серотонина (5-окситриптамина - 5-ОТ), дофамина, норадреналина, гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), глицина и др. [см. обзоры: Amara and Kuhar, 1993; Chen et al., 2004; Kanner, 1994; Rudnick and Clark, 1993]. Показана значительная гомология между генами СЕРТ и белков-переносчиков других нейротрасмиттеров, а также высокая степень гомологии между генами СЕРТ разных видов. Исходя из первичной структуры клонированных генов, были предложены теоретические модели структурной организации СЕРТ и других белков этого семейства, предполагающие наличие 12 трансмембранных доменов (ТМД)1. СЕРТ представляет большой интерес не только для нейробиологии, но и для фармакологических разработок. Этот белок служит мишенью для три-циклических антидепрессантов и селективных ингибиторов обратного захвата серотонина, а также для кокаина и наркотических амфетаминов.

1 Предполагаемая структура транспортеров этого семейства приведена на Рис.5.

Вместе с тем, несмотря на значительный прогресс молекулярно-генетических исследований, на белковом уровне СЕРТ изучен недостаточно. В частности, требуют дальнейшего выяснения пути посттрансляционного процессинга этого белка. Один из наиболее эффективных путей изучения СЕРТ - использование специфических антител. В настоящее время опубликовано несколько работ по анализу СЕРТ методом иммуноблоттин-га [Gulesserian et al., 2000; Inazu et al., 2001, Qian et al., 1995]. Однако, результаты этих исследований неоднозначны. Так, наблюдается большая вариабельность в величинах молекулярных масс СЕРТ-иммунореактивных полипептидов, выявляемых в разных работах. Одной из причин этих несовпадений может быть несовершенство иммунохимических методов анализа СЕРТ, которыми в настоящее время могут располагать исследователи (например, недостаточная специфичность и воспроизводимость иммуноб-лоттинга). Вместе с тем, несмотря на указанные сложности, СЕРТ был выявлен с помощью различных методов (включая, иммуноблоттинг) не только в мозге, но также во многих периферических структурах. В частности, СЕРТ локализуется на наружных мембранах тромбоцитов, где он участвует в процессах поддержания гемостаза [Launay et al., 1992; Lesch et al., 1993,а]. Молекулы СЕРТ в нейронах и на тромбоцитах синтезируются при экспрессии одного и того же гена, и, как считают, обладают идентичными фармакологическими свойствами [Lesch et al., 1993]. Таким образом, тромбоциты являются удобной экстрацеребральной моделью для изучения СЕРТ. Вместе с тем, систематических исследований по анализу СЕРТ в тромбоцитах методом иммуноблоттинга (с использованием панели антител к различным участкам молекулы) не проводилось, что затрудняет использование этой модели в фармакологических и нейробиологических исследованиях.

Таким образом, для дальнейшего изучения структуры и функции СЕРТ, так же как для развития фармакологических разработок, весьма актуальным является: а) получение новых сайт-специфических антител, распознающих различные участки первичной структуры СЕРТ; б) создание на их основе более эффективных и воспроизводимых тест-систем для имму-нохимического анализа СЕРТ (в том числе усовершенствованных вариантов иммуноблоттинга СЕРТ); с) использование этих методов для более детальной характеристики продуктов экспрессии гена СЕРТ в различных тканях и клетках.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования - анализ структурной организации молекулы СЕРТ в тканях крысы и человека с помощью сайт-специфических антител.

В задачи работы входило:

1) получение моноклональных антител (МкАТ) к С-концевому фрагменту 597-630 СЕРТ крысы и человека;

2) получение поликлональных антител (ПкАТ) к фрагменту 69-83 в N-концевой части молекулы СЕРТ человека;

3) получение ПкАТ к фрагменту 86-100 в ТМДI молекулы СЕРТ человека;

4) анализ реактивности (методом иммуноблоттинга) СЕРТ-специфических МкАТ и ПкАТ в экстрактах тромбоцитов человека;

5) анализ реактивности (методом иммуноблоттинга) СЕРТ-специфических МкАТ в экстрактах мозга крысы и мозга человека.

Научная новизна и научно-практическая значимость исследования. Результаты нашей работы позволили высказать предположение, что молекула СЕРТ подвергается в тромбоцитах и клетках мозга эндопротео-лизу с образованием нескольких полипептидов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Павлова, Елена Владимировна

VI. выводы

1) Получены МкАТ к С-концевому фрагменту СЕРТ 597-630, При использовании МкАТ к фрагменту СЕРТ 597-630 разработан оптимизированный вариант иммуноблоттинга СЕРТ, позволяющий проводить анализ СЕРТ в клеточных экстрактах.

2) Выяснены условия, обеспечивающие высокую эффективность анализа СЕРТ методом иммуноблоттинга. Во-первых, целесообразно использовать для выявления иммунореактивных белков меченые пероксидазой аффинноочищенные СЕРТ-специфические антитела. Этот подход позволяет элиминировать неспецифическое окрашивание, наблюдаемое при использовании меченых пероксидазой вторых (антивидовых) антител. Во-вторых, ввиду чувствительности СЕРТ к неспецифическому протеолизу, экстракты для анализа необходимо готовить в жестких условиях, препятствующих неспецифический деградации белков.

3) Получены кроличьи ПкАТ к N- концевому участку 69-83 СЕРТ и фрагменту 86-100 в начале ТМД1, эффективные в иммуноблоттинге.

4) С помощью С-концевых анти-СЕРТ МкАТ в экстрактах тромбоцитов человека, в препятствующих неспецифической деградации белков, методом иммуноблоттинга обнаружено 5 иммунореактивных белков с мол. массами 35, 37, 56 и 68 кДа, а также белки с мол. массой 150-200 кДа, по-видимому, являющиеся агрегатами молекул СЕРТ.

5) С помощью ПкАТ к N-концевому фрагменту 69-83 СЕРТ и ПкАТ к фрагменту 86-100 в ТМД1 СЕРТ в экстрактах тромбоцитов человека, в условиях, препятствующих неспецифической деградации белков, обнаружены полипептиды с мол. массами 14, 22, 32, 56 и 68. Белки с мол. массой 35 и 37 кДа этими антителами не выявлялись, что может указывать на утрату N-концевой части молекулы СЕРТ в этих полипептидах.

6) В мозге крысы и человека методом иммуноблоттинга с помощью МкАТ к С-концу СЕРТ обнаружены полипептиды с мол. массой 35, 37, 56 и 68 кДа.

7) Белок с мол. массой 68 кДа обнаруживался в экстрактах тромбоцитов, очищенных аффинно на МкАТ к С-концу СЕРТ, как с помощью С-концевых МкАТ, так и с помощью ПкАТ к N-концу СЕРТ, что позволяет заключить, что этот белок, по всей видимости, является полноразмерной молекулой СЕРТ.

8) Предложена гипотеза о протеолитическом процессинге СЕРТ, согласно которой обнаруженные СЕРТ-иммунореактивные белки с мол. массами 14, 22, 32, 35, 37 и 56 кДа являются пептидными фрагментами, образующимися в результате эндопротеолиза (протеолитического процессинга) белка-предшественника с мол. массой 70,5 кДа (теоретическая мол. масса СЕРТ), мигрирующего в условиях наших экспериментов как белок с мол. массой 68 кДа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павлова, Елена Владимировна, Москва

1. Белясова Н.А. Биохимия и молекулярная биология. (Учебное издание) Минск: Книжный дом, 2004

2. Дубынин В.А.,Каменский А.А., Сапин М.Р., Сивоглазов В.И. Регу-ляторные системы организма человека. (Учебное издание). Москва: Дрофа, 2003.

3. Льюин Б. Гены. (Пер.с. англ. Под ред. Георгиева Г.П.) Москва: Мир, 1987.

4. Мусил Я., Новакова О., Кунц К. Современная биохимия в схемах.2-ое изд. (пер. с англ.) Москва: Мир, 1984.

5. Недоспалов В.О. Физиология центральной нервной системы. (Учебник) Москва: ООО УМК "Психология", 2002.

6. Неер Э.И.,Сакман Б. Метод пэтч-кламп. В мире науки, 1992, №5, 16-24.

7. Николаев А.Я. Биологическая химия.З-ее издание (Учебник). Москва: Медицинское информационное агенство., 2004.

8. Ю.Уголев A.M. Естественные технологии биологических систем. Ленинград: Наука, 1987.

9. П.Фаллер Д.М., Шилде Д. Молекулярная биология клетки. (Руководство для врачей). Пер. с англ. под общ. редакцией акад. Збарского И.Б. Москва: Бином-Пресс, 2004.

10. Чард Т. Радиоиммунологические методы. М.: Мир, 1981.

11. Adkins Е.М., Barker, E.L., Blakely, R.D. Interactions of tryptamine derivatives with serotonin transporter species variants indicate transmembrane domain 1 in substrate recognition. Mol. Pharmacol, 2001, 59, 514-523.

12. Amara S.G. and Kuhar M.J. Neurotransmitter transporters: recent progress. Annu. Rev.Neurosci., 1993, 16, 73-93.

13. Axelrod, J., Weil-Malherbe, H., Tomchick R. The physiological disposition of 3H-epinephrin and its metabolite metanephrine. J. Pharmacol.Exp.Ther., 1959,127, 251-256.

14. Balkovetz D., Tirrupati C., Leibach F., Mahesh V., Ganapathy V. J. Biol.Chem., 1989, 264, 2195-2198.

15. Bannon M.J., Zue C.H., Shibata K., Dragovic L.I., Kapatos G. Expression of a human cocain-sensitive dopamine transporter in Xenopus laevis oocytes. J.Neurochem, 1990, 54, 706-708.

16. Barker E.L., Blakely R.D. Norepinephrine and serotonin transporters: molecular targets of antidepressant drugs. In: Bloom F.E., Kupfer D.J., editors. Psychopharmacology: the fours generation of progress. New York: Raven Press, 1995, p. 321-333.

17. Bauman A.L., Apparsundaram S., Ramamoorthy S., Wadzinski B.E., Vaughan R.A., Blakely R.D. Cocaine and antidepressant-sensitive biogenic amine transporters exit in regulated complexes with protein phosphatase 2A. J. Neurosci, 2002, 20, 7571-7578.

18. Berger P., Martenson R., Laing P., Thurcauf A., DeCosta B. Photoaffin-ity labeling of the dopamine reuptake carrier using a novel high affinity ayido-derivative of GBR-12935. Soc. Neurosci Abstr., 1990, 16, 13.

19. Bergman J., Madras B.K., Johnson S.E., Spealman R.D. Effect of cocaine and related drugs in nonhuman primates. III. Self administration by squirrel monkeys. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1989, 251,150-155.

20. Biessen E.A., Horn A.S., Robillard G.T. Partial purification of the 5-hydroxytryptophans reuptake system from human blood plateles using a citolo-pram-derived affinity resin. Biochemistry, 1990, 29, 3349-3354.

21. Blakely R.D., Berson H.E., Fremeau Jr. R. Т., Caron M.G., Peek M.M., Prince H.K., and Bradely C. Cloning and expression of a functional serotonin transporter from rat brain. Nature, 1991, 354, 66-70.

22. Blakely R.D., Ramamoorthy S., Schroeter S., Qian Y., Apparsundaram S., Galli A., Defelice L.J. Regulated phosphorylation and traffiking of antidepressant -sensitive serotonin transporter proteins. Biol. Psychiatry, 1998, 44, 169-178.

23. Braakman I., Hoover-Litty H., Wagner K. and Helenius A. J. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Cell Biol., 1991, 114, 401-411.

24. Bradley C.C., Blakely R.D. Alternative splicing of the human serotonin transporter gene. J.Neurochem. 69, 1997,1356-1367.

25. Brown G.L., Gillespie J.S. The output of sympathetic transmitter from the spleen of the cat. J. Physiol., 1957, 138, 81-102.

26. Brown M.S., Ye J., Rawson R.B., Goldstein J.L. Regulated intramem-brane proteolysis. Cell, 2000,100, 391-398.

27. Burn J.H. The action of tyramine and ephedrine. J.Pharmacol. Exp. Ther. 1932,46, 75-95.

28. Burnet P.W.J., Eastwood S.L., Lacey K., Harrison P.J. The distribution of 5HT la and 5HT2a receptor mRNAs in human brain. Brain Research, 1995, 676,157-168.

29. Caspi A., Sugden K., Moffit Т.Е., Tailor A., Craig I.W., Harrington H., McClay J., Mill J., Martin J., Braithwaite A., Poulton R. Influence of life stress on depression: Moderation by an polymorphism in the 5-HTT gene. Science, 2003,301,386-389.

30. Chang A.S., Chang S.M., Starnes D.M., Schroeter S., Bauman A.L., Blakely R.D. Molecular cloning of the mouse serotonin transporter. Mol. Brain Res., 1996,43, 185-192.

31. Chang A.S., Starnes D.M., Chang S.M. Possible existence of quaternary structure in the high-affinity serotonin transport complex. Biochem. Biophys Res. Commun, 1998, 249: 412-416.

32. Chen J.G., Chen S.L and Rudnick G. External cystein residues in the serotonin transporter. Biochemistry, 1997, 36,1479-1486.

33. Chen J.G., Rudnick G. Permeation and gating residues in serotonin transporter. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2000, 97, 1044-1049.

34. Chen N.H., Reith M.E.A., Quick M.W. Synaptic uptake and behond: the sodium-and chloride-dependent neurotransmitter transporter family SLC6. Pflu-gers Arch-Eur. J. Physiol., 2004, 447, 519-531.

35. Danbolt N.C., Piney G., and Kanner B.I. Purification and reconstitution of the sodium and potassium-coupled glutamate transport glycoprotein from rat brain. Biochemistry, N.Y., 1990, 29, 6734-6740.

36. Daniels G.M. and Amara S.G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. J. Biol.Chem., 1999, 274, 35794-35801.

37. Dette G.A. and Wesemann W. The role of sialic acid in 5-HT binding to synaptic membranes. Experientia, 1979, 35, 1152-1153.

38. Dgany O. and Wides R. The Drosophila ods/ten-m gene encodes a type I, multiply cleaved heterodimeric transmembrane protein. Biochem. J., 2002, 363, 633-43.

39. Dighiero G., Lymberi P., Mazie J.C., Rouyre S., Buttler-Browne G.S., Whalen R.G., and Avrameas S. Murine hybridomas secreting natural monoclonal antibodies reacting with self antigens. J. Immunol., 1983, 134, 765-771.

40. Eddahibi S., Raffestin В., Hamon M., and Adnot S. Is the serotonin transporter involved in the pathogenesis of pulmonary hypertension? J. Lab. Clin. Med., 2002, 130,194-201.

41. Fanburg B.L.L.S. A new role for an old molecule: serotonin as a mitogen. Am. J. Physiol., 1997,272, L795-806.

42. Fuller R.W., Wong D.T. Serotonin uptake and serotonin uptake inhibition. Ann. N.Y. Acad. Sci, 1990, 600, 68-78.

43. Gelernter J., Pakstis A.J., Kidd K.K. Linkage mapping of serotonin transporter protein gene SLC6A4 on chromosome 17. Hum. Genet., 1995, 95, 677-680.

44. Gething M.J.and Sambrook J. Protein folding in the cell. Nature, 1992, 355,33-45.

45. Gielen W., and Viefhofer B. Experientia, 1997, 30,1177-1178.

46. Gordon J. and Barnes N.M. Lymphocytes transport serotonin and dopamine: agony or ecstasy? Trends in immunology, 2003, 24,438-443.

47. Graham D., Esnaud H., Langer S.Z. Characterisation and purification of the neuronal sodium-ion-coupled 5-hydroxytryptamine transporter. Biochem. Soc. Trans., 1991,19, 99-102.

48. Grigoriadis D.E., Wilson A.A., Lew R., Sharkey J.S., Kuhar M.J.

49. Dopamine transport sites selectively labeled by a novel photoaffinity probe: ,25I-DEEP. J.Neurosci, 1989, 2664-2670.

50. Guastella J., Nelson N., Nelson H., Czyk K.L., Keynan S., Miedel M.C., Davidson N., Lester M.A., Kanner B.I. Cloning and expression of a rat brain GABA transporter. Science, 1990,249,1303-1306.

51. Guilbert В., Mahana W., Gilbert M., Mazie J. C., and Avrameas S. Presence of natural autoantibodies in hyperimmunnized mice. Immunology, 1985,56, 401-408.

52. Gulesserian Т., Engidawork E,, Cairnes W., Lubec G. Increased protein levels of serotonin transporter in frontal cortex of patients with Down syndrome. Neurosci Lett, 2000,296, 53-57.

53. Haase J., Killian A.M., Magnani F., and Williams C. Regulation of the serotonin transporter by interacting proteins. Biochemical Society Transaction, 2001,29, part 6, 722-728.

54. Harrison P.J., and Burnet P.W. The 5-HT2a (serotonin 2A) receptor gene in the aetiology pathophysiology and pharmacotherapy of schizophrenia. J. of Psychopharmacology, 1997,11,21-23.

55. Harrison P.J. and Geddes J.R. Schizophrenia and the 5-HT2a receptor gene. Lancet, 1996, 347, 1274.

56. Helenius A., Tatu Т., Marquardt T. and Braakman I. In: Cell Biology and Biotechnology. Rupp R.G. and Oka M.S., edt. Springer-Verlag, Berlin, 1992.

57. Hirst W.D., Price G.W., Rattray M., Wilkin G.P. Serotonin transporters in adult rat brain astrocytes revealed by H.-5-HT uptake into glial plasmalem-mal vesicles. Neurochem Int., 1998, 33, 11-12.

58. Hoffman B.J., Mezey E., Brownstein M.J. Cloning of a serotonin transporter affected by antidepressants. Science, 1991, 254,579-580.

59. Horschitz S., Hummerich R., and Schloss P. Structure, function and regulation of the 5-hydroxytryptamine (serotonin) transporter. Biochemical Society Transactions, 2001, v.29, 728-732.

60. Iversen L.L., Glowinski J., Axelrod J. The physiological disposition and metabolism of norepinephrine in immunosympathectomized animals. J. Pharmacol Exp Ther, 1996, 151, 273-284.

61. Jayanthi L.D., Ramamoorthy S., Manesh U.B., Leibach F.H., Ganapathy V. Calmodulin-dependent regulation of the catalytic function of the human serotonin transporter in placental choriocarcinoma cells. J.Biol.Chem, 1994, 269, 14424-14429.

62. Jess U., Far O.E.I., Kirch J., Betz H. Interaction of the C-terminal region of the rat serotonin transporter with MacMar-CKS modulates 5-HT uptake regulation by protein kinase C. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, 294, 272279.

63. Kaback, H.R. Transport studies in bacterial membrane vesicles. Science, 1974,186, 882-892.

64. Kamdar G., Penado K.M.Y., Rudnik G., Stephan M.M. Functional role of critical strip residue in transmembrane span 7 of the serotonin transporter. J.Biol.Chem., 2001,276,4038-4045.

65. Kanner B.I. Sodium-coupled neurotransmitter transport: structure, function and regulation. J.Exp.Biol., 1994,196, 237-249.

66. Kanner B.I. and Bendahan A. Transport of 5-hydroxytryptamine in membrane vesicles from rat basophilic leukemia cells. Biochim. Biophys. Acta, 1985,816,403-410.

67. Kanner B.I., Keynan S., Radian R. Structural and functional studies on the sodium and chloride-coupled y-aminobutyric acid transporter: deglycosyla-tion and limited proteolysis. Biochemistry, 1989, 28, 3722-3728.

68. Kish S.J., Furukawa Y., Chang L.J., Tong J., Ginovart N., Wilson A., ' Houle S., Meyer J.H. Regional distribution of serotonin transporter in postmortem human brain: is the cerebellum a SERT-free brain region? Nucl. Med. Biol., 2005,32,123-128.

69. Kuhar M.J. Neurotransmitter uptake: A tool for identifying neurotrans-mitter-specific pathways. Life Sci, 1973, 33,1623-1634.I

70. Langer S.Z., Briley M. High affinity H-imipramine bindings new biological tool for studies in depression. Trends Neurosci, 1981,4, 28-31.

71. Launay J., Bondoux D., Oset-Casque M., Emami S., Mutel V., Haimart M., Gespach C. Increase of human platelet serotonin uptake by atypical histamine receptors. Am. J. Physiol., 1994,266, 526-536.

72. Launay J.M., Geoffroy C., Buckle M., Cesura A., Alouf J. and Da Prado M. One-step purification of the serotonin transporter located at the human platelet plasma membrane. J.Biol.Chem., 1992, 267, 11344-11351.

73. Lesch K.R., Heils A., Reiderer P. The role of neurotransporter in excito-toxicity, neuronal cell death and other neurodegenerative process. J. Mol. Med., 1996, 74, 365-378.

74. Lesch K.P., Mossner R. Genetically driven variation in serotonin uptake: is there a link to affection spectrum, neurodevelopmental and neurodegen-eration disorder? Biol.Psychiatry, 1998,44 (3), 179-192.

75. Lesch K.P., Wolozin B.L., Estler H.C., Murphy D.L., Riederer P. Isolation of a cDNA encording the human brain serotonin transporter. J.Neuronal. Transm., 1993,91,68-73.

76. Lesch K.P., Wolozin B.L., Murphy D.O., Riederer P. Primary structure of the human platelet serotonin uptake site: identity with the brain serotonin transporter. J.Neurochm, 1993, 60,2319-2322.

77. Lew R., Grigoriadis D.E., Wilson A., Boja J.W., Simantov R., Ruhar MJ. Dopamine transporter: deglycosylation with exo- and endoglycosidases. Brain Res., 1991, 539, 239-246.

78. Littlefield J.W. Selection of hybrids from matings of fibroblasts in vitro and their presumed recombinants. Science, 1964, 145, 709-710.

79. Lopes-Corcuera В., Kanner B.I., Aragon C. Reconstitution and partial purification of the sodium and chloride-coupled glycine transporter from rat spinal cord. Biochim Biophys Acta, 1989, 983,247-252.

80. Mager S., Min C., Henry D.H., Chavkin C., Hoffman B.J., Davidson N. et al. Conducting states of a mammalian serotonin transporter. Neuron, 1994,12, 845-859.

81. Maizel J.V. The fractionation of proteins and nucleic acids using poly-acrylamide gel electrophoresis. In: Habel K. and Salzman N.P., eds. Fundamental techniques in virology. New York, Academic Press, 1969, pp. 267-293.

82. Malchow R.P., Ripps H. Effects of gamma-aminobutiric acid on skate retinal horizontal cells:evidens for an electrogenic uptake mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci USA 87,1990, 845-849.

83. Melikian H.E., Mc Donald J.K., Gu H., Rudnick G., Blakely R.D. Human norepinephrine transporter: biosynthetic studies using a site-directed polyclonal antibody. J. Biol. Chem., 1994,269,12290-12297.

84. Miller K.J. and Hoffman B.J. Adenosine A3 receptors regulate serotonin transport via nitric oxide and cGMP. J. Biol. Chem., 1994, 269, 27351-27356.

85. Miller K.J., Hoffman B.J. 5HT2 receptors increase 5HT transport via nitric oxide and cGMP. Soc. Neurosci Abstr, 1995, 21, 344.

86. Mossner R. and Lesch K.P. Role of serotonin in the immune system and in neuroimmune interactions. Brain Behav. Immun., 1998, 12, 249-271.

87. Nichols D., Atwell D. The release and uptake of excitatory amino acids. Trends Pharmacol. Sci., 1990,11, 462-468.

88. Nishio H., Nezasa K., Nakata Y. Role of calcium ion in platelet serotonin uptake regulation. Eur. J. Pharmacol. Mol. Pharmacol. Sect., 1995, 288,149-155.

89. Olivier В., Soudijn W., Wijngaaden I. Serotonin, dopamine and norepinephrin transporters in the central nervous system and their inhibitors. Prog. Drug Res, 2000, 54, 59-119.

90. O'Reilly C.A. and Reith M.E.A. J. Biol. Chem, 1998, 6115-6121.

91. Ozaslan D., Wang S., Ahmed B.A., Kocabas A.M., McCastlain J.C., Bene A., and Kilic F. Glycosyl modification facilitates homo- and hetero-oligomerization of the serotonin transporter. J. Biol. Chem., 2003, 278, 4399144000.

92. Pacholczyk Т., Blakely R.D., Amara S.G. Expression cloning of a cocaine-and antidepressant-sensitive human noradrenaline transporter. Nature, 1991,350,350-353.

93. Payelle-Brogard В., Ternynck Т., Guilbert В., and Avrameas S. Anti-tubulin antibodies in rabbits before and after immunization with pig tubulin. Mol. Immunol., 1989, 26, 121-128.

94. Peroutka S.J. Molecular biology of serotonin (5HT) receptors. Synapse, 1994,18, 241-260.

95. Qian Y., Galli A., Ramamoothy S., Risso S., DeFelice L.J., Blakely R.D. Protein kinase С activation regulates human serotonin transporters in HEK-293 cells via altered cell surface expression. J.Neurosci, 1997, 17, 45-47.

96. Radian R., Kanner B.I. Recognistitution and purification of the sodium and chloride-coupled y-aminobutyric acid transport glycoprotein from rat brain. J. Biol. Chem., 1986, 260,11859-11865.

97. Ramamoorthy S., Giovanetti E., Qian Y., Blakely R.D. In vivo phosphorilation of antidepressant-sensitive serotonin transporter. J.Biol.Chem., 1998, 273,2458-2466.

98. Ramamoorthy S.M.H., Qian Y., Blakely R.D. Biosynthesis, N-glycosylation and surface trafficking of biogenic amine transporter proteins. Methods Enzymol., 1998, 296, 347-370.

99. Ramamoorthy J.D., Ramamoorthy S., Papapetropoulos A., Catravas J.D., Leibach F.H., Ganapathy V. Cyclic AMP-independent upregulation of the human serotonin transporter by staurosporine in choriocarcinoma cells. J. Biol. Chem., 1995,270, 17189-17195.

100. Rehavi M., Skolnick P., Brownstein M.J., Paul S.M. High affinity binding of 3H. desipramine to rat brain: A presynaptic marker for noradrenergic uptake sites. J. Neurochem., 1982, 38, 889-895.

101. Ritz M.C., Lamb R.J., Goldberg S.R., Kuhar M.J. Cocaine receptors on dopamine transporters are related to self-administration of cocaine. Science, 1987, 237,1219-1223.

102. Rotman A., Pribluda V. Photoaffinity labelling of the serotonin carrier protein in platelets and brain synaptosomes. Biochim. Biophys. Acta 1982, 714,173-6.

103. Rotman A. J.Neurochem., 1976, 28, 1369-1372.

104. Rudnick G. Active transport of 5-hydroxytryptamine by plasma membrane vesicles isolated from human blood platelets. J. Biol. Chemistry, 1977,252,2170-2174.

105. Rudnick G. and Clark J. From synapse to vesicle:the reuptake and storage of biogenic amine neurotransmitters. Biochim. B-iophys. Acta, 1993, 1144, 249-263.

106. Sakai N., Sasaki K., Nakashita, Honda S., Ikegaki N., Saito N. Modulation of serotonin transporter activity by protein kinase С activation and an inhibition of type 1 and 2A serine/threonin phosphatase. J. Neurochem., 1997, 68, 2618-2624.

107. Sallee F.R., Fogel E.L., Schwartz E., Choi S.M., Curran D.P., Niznik H.B. Photoaffinity labeling of the mammalian dopamine transporter.

108. FEBS Lett, 1989, 256,219-224.

109. Sanders-Bush E., Conn J.P. Neurochemistry of serotonin neuronal systems consequences of serotonin receptor activation. In: Meltzer H.Y., ed. Psychopharmacology, 3rd generation of progress. New York, Raven Press, 1987, p.95-103.

110. Sarthy V. y-aminobutyric acid (GABA) uptake by Xenopus oocytes injected with rat brain mRNA. Mol. Biol. Res., 1986, 1, 97-100.

111. Schwartz E.,Tachibana M. Electrophysiology of glutamate and sodium cotransport in a glial cell of the salamander retina. J. Physiol., 1990, 426, 43-80.

112. Sjoqvist F., Taylor P.W.J., Titus E. The effects of immunosympathectomy on the retention and metabolism of noradrenaline. Acta Physiol Scand, 1967, 69,13-22.

113. Shigematsu, Yamamoto K., Higuchi, Fukuda T. Novel non-uniorm distribution of serotonin transporter in the mouse hippocampus and neocortex revealed by N- and C-terminal domain-specific immunohistochemistry. Brain Research, 2006,1075: 110-116.

114. Sneddon J.M. Blood platelets as model for monoamine containing neurons. In: Progress in Neurobiology, Kerkut G.A. and Phillis J.W., eds. Per-gamon Press, Oxford, 1973, pp.l51-197.

115. Spealman R.D., Madras B.K., Bergman J. Effects of cocaine and related drugs in nonhuman primates. II. Stimulant effects on schedule- controlled behavior. J. Parmacol. Exp. Ther., 1989, 261,142-149.

116. Stalh S.M. Essential psychopharmacology. Neuroscientific basis and practical application. 2nd ed. Cambridge. Cambridge University Press, 2000.

117. Suyama K. and Goldstein J. Antibody produced against isolated Rh(D) polypeptide reacts with other Rh-related antigens. Blood, 1988, 72„ 1622-1626.

118. Szabodos L., Mester L., Michal F., and Born G.V. Accelerated uptake of 5-hydroxytryptamine by human blood platelets, enriched in a sialic acid. Biochem. J., 1975,148, 335-336.

119. Szatkowski M., Barbour В., Attwell D. Non-vesicular release of glutamate from glial cells by reversed electrogenic glutamate uptake. Nature, 1990,348,443-445.

120. Tate C., Blakely R. The effect of N-linked glycosylation on activity of the Na(+) and Cl(-)-dependent serotonin transporter expressed using recombinant baculovirus in insect cells. J. Biol. Chem., 1994,269, 26303-26310.

121. Uhl G.R., Hall F.S., Sora I. Cocaine, reward, movement and monoamine transporters. Mol. Psychiatry, 2002, 7, 21-26.

122. Uhl G.R., O'Hara В., Shimada S., Zaczek R., Digiorgiani J., Nishi-mori T. Dopamine transporter: expression in Xenopus oocytes. Mol. Brain Res., 1991,9, 23-29.

123. Weihofen A. and Martoglio B. Intramembrane-cleaving proteases: controlled liberation of proteins and bioactive peptides. Trends Cell Biol., 2003, 13,71-78.

124. Wennogle L.P., Ashton R.A., Schuster D.I., Murphy R.B., Meyer-son L.R. 2-Nitroimipramine: a photoaffinity probe for the serotonin uptake / tricyclic binding site complex. EMBO J., 1985, 4, 971-977.

125. Wilson M.B., Nakane P.K. (1978) in "Imunofluorescense and related staining techniques" ed. W.Knapp, K.Holubar, L.Wich. Elsevier/North-Holland Biomedical Press, Amsterdam, p.215.

126. Zaimis E., Berk L.,Callingham B.

127. Morphological biochemical and functional changes in the sympathetic nervous system of rats treated with NGF-antiserum. Nature, 1965, 206, 1221-1222.

128. Zilkha-Falb R., Ziv I., Nardi N., Offen D., Melamed E., Barziliani A. Monoamine-induced apoptotic neuronal cell death. Cell Mol. Neurobiol., 1997, 17, 101-118.