Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия компонентов донервной серотонинергической системы в эмбриогенезе шпорцевых лягушек и морских ежей

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия компонентов донервной серотонинергической системы в эмбриогенезе шпорцевых лягушек и морских ежей"

На правах рукописи

НИКИШИН Денис Александрович

ЭКСПРЕССИЯ КОМПОНЕНТОВ ДОНЕРВНОЙ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ ШПОРЦЕВЫХ ЛЯГУШЕК И МОРСКИХ ЕЖЕЙ

03.03.01 - физиология 03.03.05 - биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2013

1 ^ МАП ш

005059010

Работа выполнена в группе эмбриофизиологии лаборатории проблем регенерации Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития имени Н.К. Кольцова Российской академии наук

доктор биологических наук, Шмуклер Юрий Борисович

доктор биологических наук, профессор Балезина Ольга Петровна

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

доктор биологических наук, профессор Исаева Валерия Васильевна

Институт проблем экологии и эволюции имени А.Н. Северцова Российской академии наук

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук

Защита состоится 27 мая 2013 г. в 15:30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, Биологический факультет, аудитория М-1

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан 26 апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Один из классических нейромедиаторов, серотонин выполняет, помимо нейротрансмиссии, множество ненервных функций, в том числе участвует в важнейших процессах индивидуального развития. Серотонинергическая сигнальная система хорошо изучена на нервных клетках взрослых млекопитающих: для всех ее компонентов известны гены, нуклеотидные и аминокислотные последовательности, исследованы структура и механизмы их функционирования. Исследованы механизмы некоторых ненервных функций серотонина, в частности его роль в системе свертывания крови и регуляции тонуса сосудов. Особое место занимают открытые более 50 лет назад Г.А. Бузниковым функции серотонина в эмбриональном и личиночном развитии. За этот период накоплено большое количество физиологических и биохимических данных, свидетельствующих о присутствии серотонина в эмбрионах, начиная с самых ранних стадий развития, о многочисленных специфических эффектах этого вещества и его аналогов, на раннее эмбриональное развитие, а также о механизмах этих эффектов. В то же время молекулярно-биологические исследования компонентов эмбриональной серотонинергической системы до сих пор остаются немногочисленными и разрозненными.

В настоящее время исследования в области биологии развития, в том числе ранних этапов онтогенеза, ведутся чрезвычайно активно. Это связано как с общим интересом к собственно раннему развитию, так и, в частности, с большим сходством эмбриональных и опухолевых тканей. В свете современных достижений в этих областях на первый гиан выходит выяснение молекулярных основ раннего развития. Важное место в этих работах занимает изучение сигнальных путей, контролирующих ранние этапы эмбриогенеза. Учитывая широкий спектр функций серотонина и множество его эмбриональных эффектов, можно полагать, что серотонин является одним из сигнальных веществ, регулирующих раннее развитие. Исследование донервной эмбриональной серотонинергической системы на молекулярном уровне может пролить свет на механизмы регуляции процессов раннего эмбриогенеза.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключается в обзорном исследовании экспрессии компонентов донервной серотонинергической системы в раннем эмбриогенезе двух классических объектов биологии развития - шпорцевой лягушки Хепорш и морского ежа. Дня ее достижения были поставлены следующие задачи:

• исследовать экспрессию генов, гомологичных компонентам серотонинергической системы, в раннем развитии морских ежей и функциональную активность компонентов, экспрессирующихся на ранних стадиях развития;

• исследовать экспрессию генов компонентов серотонинергической системы в нормальном развитии Хепорш и выявить гены, экспрессирующиеся на ранних стадиях развития, для дальнейшего исследования;

• исследовать количественно уровень и динамику экспрессии этих генов в течение раннего развития Хепорт\

• исследовать пространственное распределение в ранних эмбрионах Xenopus мРНК генов серотонинергической системы;

• исследовать на уровне трансляции экспрессию генов серотонинергической системы, выявленных в раннем эмбриогенезе Xenopus',

• выявить возможные источники материнского (ооцитарного) серотонина путем анализа экспрессии генов ферментов синтеза серотонина.

Научная новизна. На классической экспериментальной модели - эмбрионах Xenopus впервые проведено комплексное исследование донервной эмбриональной серотонинергической системы. Впервые была исследована экспрессия всех компонентов серотонинергической системы на одном экспериментальном объекте. Показано, что на ранних стадиях развития Xenopus, в составе материнской мРНК экспрессируются основные компоненты, необходимые для осуществления сигнальной функции - везикулярный транспортер VMAT2, рецепторы HTR1E, HTR2C, HTR5 и HTR7 и транспортер обратного захвата SERT, а также ферменты синтеза серотонина ТРН2 и AAAD. Впервые получены и опубликованы частичные последовательности мРНК HTR1E, HTR5 и SERTX. laevis (NCBI Nucleotide ID: КС477213, КС477214 и JQ001861). Количественно исследованы уровень, динамика экспрессии и пространственное распределение транскриптов основных компонентов серотонинергической системы в ранних эмбрионах Xenopus, и их экспрессия на уровне трансляции. Показано, что на ранних стадиях эмбриогенеза Xenopus не экспрессируется основной фермент деградации серотонина МАОА. Выявлено, что ферменты синтеза серотонина экспрессируются как в ооцитах на ранних стадиях оогенеза, так и в фолликулярных оболочках.

Впервые проведен анализ экспрессии гомологов генов компонентов серотонинергической системы в раннем развитии морских ежей, являющихся классическим объектом исследования донервных функций нейротрансмитгеров. Показано, что на ранних стадиях развития экспрессируются гомологи рецепторов серотонина четырех типов, транспортера серотонина SERT, фермента деградации серотонина МАОА и в течение донервного развития начинают экспрессироваться гомологи везикулярного транспортера моноаминов VMAT, и ферментов синтеза серотонина. Впервые получены и опубликованы частичные последовательности мРНК SERT, VMAT P. lividus. Функциональная активность компонентов систем синтеза и обратного захвата подтверждена экспериментально. Полученные результаты являются первыми молекулярно-биологическими свидетельствами экспрессии компонентов серотонинергической системы в раннем развитии морских ежей.

Научная и практическая значимость работы. В работе получены результаты, представляющие фундаментальный научный интерес. В частности, продемонстрировано, что рецепторы серотонина, экспрессирующиеся в раннем развитии, гомологичны или идентичны дефинитивным рецепторам нервных клеток. Показана экспрессия на ранних донервных стадиях развития нейральной формы фермента синтеза серотонина Показано, что набор типов рецепторов серотонина, экспрессирующихся в раннем развитии, консервативен, по крайней мере, среди позвоночных. Выполнено исчерпывающее сравнительное обзорное исследование, в

результате которого выявлены гены серотонинергической системы, экспрессирующиеся на ранних стадиях развития и, возможно, принимающие участие в реализации донервных функций серотонина. Полученные результаты могут быть использованы как основа для дальнейших практических и теоретических исследований донервных функций серотонина и других нейротрансмитгеров. Разработанный методический подход может быть использован для исследования других нейротрансмитгерных систем в раннем развитии.

Личное участие автора. Автор непосредственно участвовал как в планировании работы, сборе материала, отработке экспериментальных методов, постановке экспериментов, получении всех результатов, так и в их дальнейшей обработке и интерпретации. Автор лично участвовал в апробации результатов исследования и подготовке основных публикаций по выполненной работе.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на VII и VIII Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2010, 2011), Первых Международных Беккеровских чтениях (Волгоград, 2010), XXI Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), VI и VII Конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2010, 2011), II Объединенном симпозиуме Французского и Британского обществ биологии развития (Ницца, Франция, 2011).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 103 страницах, содержит 21 рисунок и 4 таблицы, состоит из следующих разделов: Список сокращений, Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение результатов, Выводы и Список литературы, включающий 141 цитируемый источник.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК, статья в сборнике и глава в монографии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение и фиксация проб. В работе использовали зародышей шпорцевых лягушек Хепорш laevis (Daudin, 1802) и Xenopus (Silurana) tropicalis (Gray, 1864) и средиземноморского морского ежа Paracentrotus Imdus (Lamarck, 1816). Искусственное оплодотворение и инкубация зародышей, а также микрохирургические манипуляции (Рис. ЗГ) проводились с использованием стандартных методик (Sive et al., 2010; Бузников, Подмарев, 1975). Для последующего выделения РНК образцы фиксировали в RNAlater (Ambion, США). Для проведения гибридизации in situ зародыши фиксировали в растворе MEMFA, и хранили в этаноле при -20°С. Для иммуногистохимического исследования эмбрионы фиксировали в 4% параформальдегиде и хранили в метаноле при -20°С.

Иммупогистохшшческос окрашивание проводили поликлональными антителами против серотонина (Chemicon, США) и вторичными антителами, конъюгированными с Atto 633 (Sigma, США). Ядра докрашивали DAPI (Sigma, США).

Препараты просматривали на конфокальном микроскопе Olympus FluoView FVlOi (Центр коллективного пользования МГУ им. М.В. Ломоносова). Интенсивность иммунофлуоресценции полученных изображений измеряли в программе ImageJ (МН), статистическую обработку проводили в программе STATISTICA (StatSoft).

Выделение тотальной РНК проводили с применением TRI Reagent (Sigma, США). Полирибосомная и информосомная РНК была любезно предоставлена коллегами из лаборатории регуляции биосинтеза белка Института Биохимии им. А.Н. Баха РАН. Для удаления примеси геномной ДНК, РНК обрабатывали ДНКазой I (Fermentas, Германия). РНК переосаждали в 4 M LiCl, концентрацию обработанной РНК измеряли на спектрофотометре Nanodrop 8000 (Thermo Scientific, США). Синтез кДНК проводили с использованием обратной транскриптазы M-MLV (Евроген, Россия) и рандомных гексануклеотидов (Силекс, Россия).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР проводили с помощью набора Colored-Taq (Силекс, Россия) и специфических олигонуклеотидов (Литех, Россия) на амплификаторе MJ Mini Personal Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, США). ПЦР в реальном времени проводили на автоматическом амплификаторе 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США) с использованием смеси qPCRmix-HS SYBR+ROX (Евроген, Россия). Расчет относительной экспрессии гена проводили методом AACt с учетом эффективности ПЦР, определенной методом построения стандартных кривых (Bookout et al., 2005). Анализ продуктов ПЦР, плазмид и их фрагментов проводили с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием (0,5 мкг/мл). Гели просматривали и фотографировали с помощью системы документации Gel Doc XR (Bio-Rad Laboratories, США), далее изображения обрабатывали в программе Quantity One 1-D Analysis Software (Bio-Rad Laboratories, США). Продукты ПЦР и рестршшионные фрагменты выделяли из кусочков агарозного геля, содержащих необходимую полосу, на спин-колонках с помощью набора Cleanup Mini (Евроген, Россия). Секвенирование нуклеотидных последовательностей проводили в компании Евроген, Россия.

Конструирование векторов. Продукты ПЦР для секвенирования (SERT, HTR1E) и синтеза РНК-зонда (HTR7, VMAT2) получали с помощью Pfu-полимеразы, после чего концы аденилировали с помощью Taq-полимеразы и клонировали в вектор pAL-TA (Евроген, Россия). Лигирование проводили с по мощью Т4 лигазы (Fermentas, Германия). Для трансформации использовали компетентные клетки Е. coli штамма XL-blue (Евроген, Россия). Выделение плазмидной ДНК из ночной культуры бактерий проводили с помощью Набора для выделения плазмидной ДНК (Евроген, Россия).

Гибридизация in situ. Синтез зонда проводили на продуктах ПЦР, полученных с использованием Т7 и SP6 праймеров и плазмид pAL-HTR7 и pAL-VMAT2, с использованием дигоксигенин-11-УТФ (Roche, Германия) и РНК-полимераз Т7 и SP6 (Fermentas, Германия). Процедуру гибридизации in situ на целых зародышах (WISH), проводили по стандартному протоколу (Harland, 1991). Выявление зонда проводили с использованием конъюгированных со щелочной фосфатазой антител к дигоксигенину (Roche, Германия) и субстрата для щелочной фосфатазы ВМ Purple (Roche, Германия). Препараты обесцвечивали Н202 и хранили в 96% этаноле при 4°С.

МАОА ODC

Рис. 1. ОТ-ПЦР анализ экспрессии компонентов серотонинергической системы в развитии морских ежей и шпорцевых лягушек. (А) Экспрессия рецепторов и транспортеров серотонина в эмбриогенезе Р. lividus. 3 - зигота; Д - дробление; РБ - ранняя бластула; МБ - мезенхимная бластула; Пр - призма; Пл - плутеус. (Б) Экспрессия компонентов серотонинергической системы в эмбриогенезе X. laevis. О -ооцит; 2-2 бластомера; 8 - средняя бластула; 9 - поздняя бластула; 10 - ранняя гаструла; Н - нейрула; В - вылупление; Г - головастики; Оо - ооциты без студенистой оболочки; Об - студенистые оболочки. (В) Экспрессия компонентов серотонинергической системы в эмбриогенезе X. tropicalis. 3 -зигота; Д - дробление; 8 - средняя бластула; 9 - поздняя бластула; 10 - ранняя гаструла; Н - нейрула; В - вылупление; Г - головастики. (Г) Экспрессия ферментов синтеза серотонина в яичнике X. laevis. Я - целый яичник; О - незрелые ооциты (стадии І-Ш); Ф - фолликулярная оболочка. (Д) Исследование трансляции мРНК генов HTR2C, HTR7 и VMAT2 на стадии средней гаструлы X. laevis. ПРС - фракция полирибосом; ИС-фракция информосом.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Экспрессия и функциональная активность компонентов серотонинергической системы в раннем развитии морских ежей

ОТ-ПЦР анализ экспрессии гомологов рецепторов и транспортеров серотонина показал, что в течение эмбриогенеза P. lividus, в том числе на самых ранних его стадиях, экспрессируются гены, гомологичные HTR1A, HTR2B, HTR4 и рецептору серотонина неизвестного типа {НТК), а также транспортеру SERT, тогда как ген, гомологичный VMAT, не экспрессируется до стадии гаструлы (см. Рис. 1А). Кроме того, BLAST-анализ базы данных NCBI EST выявил клоны, выделенные из эмбрионов морских ежей на ранних стадиях развития, и гомологичные генам ферментов синтеза и деградации серотонина (фенилаланин/триптофан гидроксилазе, AAAD и MAOÄ).

Исследование функциональной активности компонентов серотонинергической системы проводили с помощью иммуногистохимического окрашивания серотонина в клетках бластул P. lividus. В контрольных эмбрионах, помимо слабого окрашивания цитоплазмы, выявляется яркое точечное иммуноокрашивание, распределенное равномерно по всей клетке. По всей вероятности, таким образом выявляется серотонин, накопленный в везикулах (см. Рис. 2А). Окрашивание эмбрионов, инкубированных в ингибиторе ТРИ парахлорфенилаланине (РСРА, ЮОмкМ), показало снижение уровня серотонина по отношению к контролю (см. Рис. 2Г и Д), что говорит об активности ТРН на ранних стадиях развития морского ежа. Иммуногистохимическое окрашивание бластул, инкубированных в предшественнике серотонина 5-гидрокситриптофане (НТР, ЮОмкМ), выявило значительное увеличение количества серотонина в клетках (см. Рис. 2Д), что говорит об активности AAAD. При этом значительно увеличивается число везикул, и часть из них локализуется вдоль латеральных поверхностей клеток (см. Рис. 2В). Для проверки активности обратного захвата серотонина мы провели инкубацию эмбрионов морского ежа в серотонине (ЮОмкМ). Последующее иммуноокрашивание показало, что концентрация серотонина в клетках увеличилась (см. Рис. 2Д). Следует отметить, что добавление экзогенного серотонина не приводит к заметному увеличению количества везикул, в отличие от эндогенно синтезированного серотонина (см. Рис. 2Б).

Таким образом, на ранних стадиях развития морских ежей экспрессируются гомологи компонентов систем синтеза серотонина, рецепции, обратного захвата и деградации. Функциональная активность системы синтеза и обратного захвата серотонина подтверждена экспериментально.

Экспрессия компонентов серотонинергической системы в нормальном развитии Xenopus

Временной характер экспрессии всех рецепторов серотонина в эмбриональном развитии X. tropicalis и X. laevis был экспериментально исследован методом ОТ-ПЦР (см. Рис. 1Б и В). На ранних стадиях развития выявлена экспрессия рецепторов HTR1E, HTR2C, HTR5 и HTR7. После включения зиготического генома на донервных стадиях развития начинают эксггрессироваться также рецепторы HTR1B, HTR3A и HTR3B. Экспрессия рецепторов HTR1A, HTR1D, HTR1F, HTR2A, HTR2B, HTR3C,

HTR4 и HTR6 выявляется только на нейральных стадиях развития. Стоит отметить, что временной характер экспрессии рецепторов, исследованных на обоих видах Xenopus, совпадает.

ОТ-ПЦР анализ экспрессии транспортеров серотонина в эмбриональном развитии Xenopus (см. Рис. 1Б и 1В) показал, что на ранних стадиях развития X. laevis экспрессируется VMAT2, тогда как в раннем эмбриогенезе X. tropicalis - VMATN. Остальные типы везикулярных транспортеров экспрессируются на нейральных стадиях развития. Анализ нукпеотидных последовательностей трех везикулярных транспортеров X. tropicalis в программе MegAlign показал, что VMATN имеет большее сходство с VMAT2, чем с VMAT1, поэтому можно предполагать, что этот тип транспортера является гомологом VMAT2. Анализ экспрессии SERT показал, что он экспрессируется на всех стадиях развития как X. tropicalis, так и X. laevis (см. Рис. 1Б и 1В).

Временной характер экспрессии генов ферментов синтеза и деградации серотонина был исследован методом ОТ-ПЦР в эмбриональном развитии X. laevis (см. Рис. 1Б). мРНК TF'H 1 не выявляется до стадии ранней гаструлы, тогда как ТРН2 и AAAD экспрессируются на всех стадиях развития. МАОА не экспрессируется на ранних стадиях развития X. laevis до стадии нейрулы (см. Рис. 1Б). Экспрессия МАОА, выявляемая в пробе ооцитов, связана со студенистыми оболочками, присутствующими в этой пробе и снятыми с более поздних стадий развития, что подтверждено анализом экспрессии МАОА в ооцитах со снятыми оболочками и в смывах оболочек (см. Рис. 1Б).

Для того чтобы выяснить возможный источник материнского серотонина, накопленного в ооцитах, были получены библиотеки кДНК из проб яичника, ооцитов на ранних стадиях оогенеза и фолликулярных оболочек, на которых был проведен ПЦР-анализ экспрессии ферментов синтеза серотонина (см. Рис. 1Г)- В яичнике экспрессируются все ферменты синтеза серотонина AAAD экспрессируется как в незрелых ооцитах, так и в фолликулярных оболочках. При этом ТРН1 экспрессируется

г

= о -

_I Контр 5 HT ШТ КРЛ

Рис. 2. Иммуногистохимическое окрашивание серотонина (красный) в клетках бластул P. lividus (А) в контроле и после инкубации в (Б) 5НТ, (В) НТР и (Г) РСРА. Ядра окрашены DAPI. Масштабный отрезок 10 мкм. (Д) Средняя интенсивность иммунофлуоресценции серотонина в клетках бластул, инкубированных в соответствующих веществах. Отмечена стандартная ошибка среднего. Достоверность по U-критерию Манна-Уитни: * р < 0,001.

у 60

40

20

S? à

і

h

ЗД8 910НХПВ ? 8 910Н В ЗД89ІОНХПВ 2 8 9І0Н В 2 8 9 10Н В З Д 8 9 ЮНХП 8

HTR1E HTR2C HTR5 HTR7 VMAT? SERT

В

140 120 100 80 60 10

ДНІ Ml BUJ ЛШ Мі RUJ АШ Mî аш ЛШ Ml RIII ДНІ Мі ВІН ЛШ МІ НІН HTR1E HTRX HTR5 MTR7 VMAT? SERT

_ЭК

сэк

Ср<пэ Cs;'

Бпаступз (стадия Э)

Рис. 3. Динамика и пространственное распределение экспрессии генов HTR1E, HTR2C, HTR5, HTR7, VMAT2 и SERT в эмбриогенезе Xenopus. (А) Профили экспрессии в течение эмбриогенеза ХП -хвостовая почка, обозначения остальных стадий — как на Рис. 1. (Б) Анимально-вегетативное распределение транскриптов. АШ - анимальная шапочка; МЗ - маргинальная зона; ВШ — вегетативная шапочка (В) Распределение экспрессии в пределах анимальной шапочки. ЭК -эпителиальные клетки; СЭК — субэпителиапьные клетки. (Г) Схема получения проб из бластулы. Количественное исследование проведено методом ПЦР в реальном времени. Относительный уровень экспрессии (RQ) нормализован по гену ODC и пробе с максимальным уровнем экспрессии. Отмечено стандартное отклонение.

в фолликулярных оболочках и не экспрессируется в незрелых ооцитах, тогда как ТРН2 наоборот, экспрессируется в незрелых ооцитах и не экспрессируется в фолликулярных оболочках.

Таким образом, проведенный ПЦР-скрининг экспрессии компонентов серотонинергической системы в эмбриогенезе шпорцевых лягушек, показал, что на ранних донервных стадиях их развития экспрессируются гены, составляющие системы синтеза (ТРН2, AAAD), везикулярного транспорта (VMAT2 или VMATN), рецепции (HTR1E, HTR2C, HTR5, HTR7) и обратного захвата (SERT) серотонина.

Уровень и динамика экспрессии компонентов серотонинергической системы в раннем развитии Xenopus

Рецепторы и транспортеры серотонина, которые экспрессируются в раннем эмбриогенезе Xenopus, исследовали количественно методом ПЦР в реальном времени. Экспрессию HTR2C, HTR7 и VMAT2 количественно исследовали в развитии X. laevis, а HTR1E, HTR5 и SERT - в развитии X. tropicalis (см. Рис. ЗА). Количество мРНК исследуемых генов на ранних стадиях развития существенно различается. Уровень экспрессии VMAT2 относительно ODC составляет 43,9%, HTR7 — 4,9%, HTR1E -0,33%, HTR5 - 0,015%. HTR2C - 0,002%, SERT - 0,0015%. Исследуемые гены также обладают разной динамикой экспрессии в течение раннего развития. Уровень экспрессии HTR1E максимален на стадии зиготы, после чего постепенно уменьшается к стадии нейрулы. Такой же динамикой в раннем развитии обладает экспрессия HTR2C. Количество мРНК IITR5 в течение раннего развития держится на довольно низком уровне, а после среднебластульного перехода постепенно повышается, достигая максимума на стадии вылупления. HTR7 экспрессируется в течение раннего развития приблизительно на одном уровне. Уровень экспрессии VMAT2 максимален на ранних стадиях развития и резко уменьшается к стадии нейрулы. Количество транскриптов SERT максимально на стадии вылупления, а в течение всего раннего развития держится на довольно низком уровне.

Пространственное распределение мРНК компонентов

серотонинергической системы в ранних эмбрионах Xenopus

Для выявления пространственного распределения мРНК исследуемых количественно генов по анимально-вегетативной оси ранних эмбрионов, была выполнена ПЦР в реальном времени на пробах анимальных шапочек, маргинальных зон и вегетативных шапочек поздних бластул X. laevis и X. tropicalis (см. Рис. ЗБ). Анимально-вегетативным градиентом обладает экспрессия HTR5 и VMAT2, причем HTR5 больше в вегетативной области, a VMA Т2 — в анимальной. Остальные гены выраженного анимально-вегетативного градиента экспрессии не имеют. Пространственное распределение мРНК генов HTR7 и VMAT2, экспрессирующихся в ранних эмбрионах X. laevis на довольно высоком уровне, было исследовано методом гибридизации in situ (см. Рис. 4). мРНК HTR7 и VMAT выявляется в ооцитах и дробящихся эмбрионах преимущественно в анимальном полушарии. На стадии бластулы экспрессия HTR7 выявляется по периферии всего зародыша, за исключением области вокруг вегетативного полюса, тогда как VMAT2 выявляется только в анимальном полушарии, почти полностью локализуясь в крыше бластоцеля.

Методом ПЦР в реальном времени также исследовано количественное соотношение относительной экспрессии генов в эпителиальных и субэпителиальных клетках крыши бластоцеля (см. Рис. ЗВ). Значимое различие в уровне экспрессии имеет только УМАТ2, который экспрессируется преимущественно в эпителиальном слое. Уровень экспрессии остальных генов в эпителиальных и субэпителиальных клетках существенно не различается.

Экспрессия компонентов серотонинергнческой системы на уровне трансляции

В заключение, для того чтобы оценить, экспрессируются ли исследуемые гены на уровне трансляции, был проведен ОТ-ПЦР анализ полирибосомальной и информосомной фракций РНК, выделенных на стадии средней гаструлы X. 1аетя (см. Рис. 1Д). В методике выделения фракций РЖ используется фиксация формальдегидом, поэтому полученные пробы могут эффективно использоваться для ПЦР с короткими ПЦР-продуктами. В информосомной фракции выявлены мРНК всех исследуемых генов, тогда как в полирибосомальной фракции выявляются мРНК НТК2С и УМАТ2, а мРНК ИТК7 — не выявляется и полностью локализована во фракции информосом. Полученный результат свидетельствует о том, что на стадии средней гаструлы транслируется мРНК НПНС и УМАТ2.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ключевым звеном в серотонинергическом сигнальном механизме являются рецепторы серотонина. Исследовав весь набор известных рецепторов серотонина у Хепорт, мы показали, что на ранних стадиях эмбриогенеза экспрессируется четыре рецептора - НТЮЕ, НТЯ2С, НТЯ5 и НТК7. Типы рецепторов серотонина, к которым принадлежат эти гены, обладают разными механизмами трансдукции сигнала: 11ТК2С активирует фосфоинозитольную систему вторичных мессенджеров, тогда как НТК7 активирует аденилатциклазу, а НТК 1Е и НТЯ5 ингибируют ее.

1000 мкм

Рис. 4. Распределение мРНК генов HTR7 и VMAT2 в ранних эмбрионах X. laevis. Гибридизация in situ для (А-В) HTR7 и (Г-Е) VMAT2 выполнена на ооцитах (А, Г)> дробящихся зародышах (Б, Д) и бластуле (В, Е) Зародыши разрезаны. Стрелками обозначен выявленный сигнал.

На ранних стадиях развития морских ежей тоже был выявлен набор генов, которые в международном проекте GNOMON охарактеризованы как гомологи рецепторов серотонина. В состав пула материнской мРНК, как и у Xenopus, входят гомологи //77?/ и HTR2, а также гомолог HTR4, который по взаимодействию с системами вторичных мессенджеров аналогичен HTR7, и транскрипт гена, являющегося гомологом рецептора серотонина неопределенного типа. При более детальном анализе аминокислотных последовательностей этих генов с помощью сервиса НММТОР (Tusn ády, Simon, 2001) было выявлено, чтоэти гены кодируют семидоменные GPCR, однако ни один из них не содержит в третьем трансмембранном домене остатка аспартата, консервативного для метаботропных рецепторов серотонина (Shi, Javitch, 2002). С учетом этого факта, пока обсуждаемые рецепторы не охарактеризованы экспериментально, вопрос об экспрессии рецепторов серотонина на в раннем развитии морских ежей остается открытым.

С целью выявить общие закономерности, полученные результаты сопоставлены с имеющимися литературными данными. Для доимплантационного развития мыши показана экспрессия HTR1D, HTR5 и HTR7 (Veselá et al., 2003; Hinckley et al., 2005; Amireault, Dubé, 20056). При этом, в отличие ai Xenopus, в раннем развитии мыши не экспрессируется ни один из подтипов HTR2 (Amireault, Dubé, 2005). Однако показано, что HTR2A экспрессируется в ооцитах хомячка и человека (Miyazaki et al., 1990; Neilson et al., 2000). В пределах класса позвоночных подобное исследование проводилось также на данио, для которого показана экспрессия HTR1A (Nikishin et al., 2009). Сопоставив вышеизложенные данные, с учетом их неполноты, и допуская некоторые исключения, можно полагать, что для раннего развития позвоночных характерна экспрессия рецепторов серотонина 1, 2, 5 и 7 типов. Что касается беспозвоночных, то в раннем эмбриогенезе С. elegans и дрозофилы выявлена экспрессия гомологов HTR2 (Hamdan et al., 1999; Colas et al., 1999). Учитывая полученные нами данные о возможной экспрессии гомолога HTR2B в раннем развитии морских ежей, можно полагать, что экспрессия тех или иных подтипов HTR2 является характерной для раннего развития всех животных.

Как мы видим, донервная серотонинергическая система включает несколько возможных механизмов функционирования, опосредованных несколькими рецепторами серотонина, экспрессирующимися в ранних эмбрионах. Стоит отметить, что на ранних стадиях донервного развития, наряду с серотонином, присутствуют и функционально активны и другие нейротрансмиттеры - ацетилхолин, адреналин, норадреналин, дофамин, гистамин (Бузников, 1967; Шмуклер и др., 1988). Таким образом, для ранних стадий донервного эмбриогенеза характерна не только множественность трансмиттерных систем, но и их комплексность и, по всей вероятности, многофункциональность.

Очевидно, что для одновременного функционирования нескольких рецепторов серотонина в одной клетке, необходима сложная регуляция их функционирования, за счет чего эти рецепторы могут экспрессироваться на разном уровне, иметь разную локализацию, по-разному компартментализоваться. Исследование пространственной локализации мРНК рецепторов серотонина в ранних эмбрионах Xenopus показало, что

анимально-вегетативным градиентом обладает экспрессия HTR5, которая максимальна в вегетативной области. С учетом того, что в этой области происходят важнейшие индукционные процессы, определяющие первичную разметку презумптивных частей зародыша, в частности, ньюкуповская мезодермальная индукция (Nieukoop, 1969 - цит. по Gilbert, 2006), не исключено, что серотонин вовлечен в эти процессы посредством HTR5.

Количественное исследование динамики экспрессии рецепторов серотонина показало, что уровень экспрессии HTR1E и HTR2C стремительно понижается в течение раннего развития, тогда как относительная экспрессия HTR7 до стадии нейрулы находится примерно на одном уровне. Существенно отличается динамика экспрессии HTR5, которая минимальна на ранних стадиях развития и начинает расти после стадии средней бластулы, т. е. после включения зиготического генома. Исследование полирибосомальной и информосомной фракций мРНК, выделенных из гаструл и сопоставление полученных результатов с динамикой экспрессии этих генов на данной стадии выявило следующую закономерность: мРНК генов, экспрессия которых уменьшается на ранних стадиях развития, присутствуют в полирибосомальной фракции, т.е. транслируются. Другими словами, на ранних стадиях развития Xenopus процесс трансляции материнской мРНК сопровождается ее деградацией. Возможно, это связано с тем, что материнские мРНК на ранних стадиях эмбрионального развития маскированы белками, что предотвращает их деградацию и несвоевременную трансляцию (Spinn, 1994). В таком случае, демаскирование материнской мРНК, необходимое для ее трансляции, может привести и к ее деградации. С другой стороны, известно, что процесс трансляции мРНК зависит от длины «полиаденильного хвоста», которая регулируется регуляторными цис-элементами в составе 3' нетранслируемой области (3' UTR) мРНК: наличие СРЕ (cytoplasmic polyadenylation element) определяет полиаденилирование и активацию трансляции при активации созревания ооцита (Paynton, Bachvarova, 1994). Анализ последовательностей с помощью сервиса RegRNA (Chang et al., 2013) показал, что мРНК генов HTR1E и HTR2C имеют СРЕ в составе 3' UTR. Учитывая результаты исследования динамики их экспрессии в раннем развитии, HTR1E и HTR2C являются наиболее вероятными кандидатами на роль функциональных посредников серотонина в раннем развитии Xenopus.

Важными компонентами серотонинергической системы являются транспортеры серотонина, осуществляющие его активный транспорт через мембрану. Транспортер серотонина ЖЯГэкспрессируется на протяжении всего эмбрионального развития обоих видов Xenopus. Гомолог SERT также экспрессируется в течение всего эмбриогенеза морского ежа P. lividus и функционально активен на ранних стадиях его развития. Учитывая, что экспрессия SERT и способность захватывать серотонин из окружающей среды показана экспериментально также для ранних эмбрионов млекопитающих (Amireault, Dubé, 2005), можно предполагать, что клетки ранних эмбрионов Xenopus тоже способны к обратному захвату серотонина. SERT является важным компонентом, вовлеченным в процесс посттрансляционной модификации

белков посредством серотонилирования (Brenner et al., 2007; Ziu et al., 2012). То, что SERT экспрессируется на ранних стадиях развития, является указанием на то, что процессы серотонилирования и внутриклеточной серотониновой сигнализации могут играть роль в раннем развитии Xenopus и морских ежей.

Результаты исследования экспрессии везикулярных транспортеров моноаминов показали, что на ранних стадиях развития X. laevis экспрессируется VMAT2, а на ранних стадиях развития X. tropicalis - VMATN. При этом, несмотря на то, что серотонин выявляется в ранних эмбрионах P. lividiis точечно, гомолог VMATначинает экспрессироваться только на стадии гаструлы. Исследование пространственной локализации мРНК VMAT2 показало, что его экспрессия обладает выраженным анимально-вегетативным градиентом, причем в эпителиальном слое клеток анимапьной шапочки его экспрессия достоверно больше, чем в субэпителиальном. На стадии бластулы серотонин преимущественно локализован в анимальной шапочке и маргинальной зоне, причем в большей степени - в поверхностном эпителиальном слое клеток (Beyer et al., 2012). Таким образом, пространственное распределение экспрессии VMAT2 совпадает с распределением серотонина. Динамика экспрессии, присутствие транскриптов во фракции полирибосом на стадии гаструлы, наличие СРЕ в составе 3 UTR мРНК, свидетельствуют о том, что VMAT2 транслируется на ранних стадиях развития X. laevis, что также подтверждается литературными данными о его функциональной активности на ранних стадиях развития Xenopus (Beyer et al., 2012). Таким образом, можно утверждать, что в клетках ранних эмбрионов Xenopus по всей вероятности осуществляется везикулярный транспорт серотонина. Этот механизм позволяет устранить серотонин из цитоплазмы, где он может осуществлять внутриклеточные функции и вовлекаться в процесс серотонилирования или же деградировать. С другой стороны, упаковка серотонина в везикулы необходима для осуществления им межклеточной сигнальной функции.

Проведенное исследование экспрессии ферментов синтеза серотонина показало, что на ранних стадиях развития Xenopus экспрессируются оба фермента, необходимые для синтеза серотонина из триптофана - ТРН2 и AAAD. Также нами показано, что оба фермента синтеза серотонина функционально активны в ранних эмбрионах морского ежа Р. lividiis. То, что серотонин может синтезироваться при инкубации в НТР, показано экспериментально также на ранних эмбрионах моллюсков и кольчатых червей (Buznikov et al, 2003; Emanuelsson, 1974). Экспрессия TPH2 продемонстрирована на доимплантационных эмбрионах мыши (Basu et al., 2008). Как мы видим, наличие системы синтеза серотонина характерно для ранних эмбрионов самых разных групп животных. Полученные результаты свидетельствует о том, что ранние эмбрионы, возможно, способны как захватывать серотонин из окружающего пространства с помощью SERT, так и синтезировать его самостоятельно, причем как из НТР, так и непосредственно из триптофана.

Так называемый материнский (ооцитарный) серотонин, накопленный в яйцеклетках, характерен для множества видов (см. Бузников, 1987). Его источником могут быть как сами ооциты, так и окружающие ооцит фолликулярные оболочки.

Нами показано, что, ферменты синтеза серотонина экспрессируются и в ооцитах на ранних стадиях оогенеза, и в фолликулярных оболочках Xenopus. Таким образом, серотонин может синтезироваться как в самих яйцеклетках в течение оогенеза, так и в окружающих их тканях яичника. В последнем случае серотонин может попадать в яйцеклетки путем обратного захвата из окружающей среды или же через щелевые контакты, связывающие во время оогенеза яйцеклетку с фолликулярными клетками (Browne, Werner, 1984). При этом на нокаутных моделях мыши показано, что именно материнский серотонин, который синтезируется в фолликулярных клетках, является важным регулятором эмбриогенеза (Côté et al., 2007).

Таким образом, мы показали, что на ранних стадиях развития шпорцевых лягушек и морских ежей экспрессируется набор компонентов серотонинергической системы, необходимых для осуществления им сигнальной функции. Серотонин и экспрессирующиеся компоненты серотонинергической системы, по всей вероятности, составляют функциональную сигнальную систему, регулирующую процессы раннего развития. Одним из таких процессов является созревание ооцитов, которое у позвоночных зависит от уровня цАМФ (Conti et al., 2002). На эмбрионах Xenopus также показано, что цАМФ через активность РКА регулирует такие ранние эмбриональные функции как клеточный цикл делений дробления (Grieco et al., 1994). Также известно, что локальная активация РКС приводит к динамическим локальным изменениям кортикального цитоскелета (см. Larsson, 2006). Возможно, что серотонинергическая регуляция созревания ооцитов (Buznikov et al., 1993), клеточного цикла и состояния цитоскелета (Григорьев, 1988), происходит с участием рецепторов серотонина, экспрессирующихся на ранних стадиях развития Xenopus и модулирующих активность PICA и РКС. Известно, что серотонин влияет на процесс установления лево-правой асимметрии (ЛПА) зародышей Xenopus, причем в этот процесс вовлечен HTR3, взаимодействующий с каноническим Wnt-сигнальным путем (Beyer et al., 2012). Кроме того, фармакологические эксперименты показали активность антагонистов VMAT и ингибиторов Н+-АТФазы в отношении ЛПА (Fukumoto et al., 2005). Опираясь на эти данные, можно полагать, что VMAT2, экспрессируемый на ранних стадиях развития Xenopus, также является одним из важных звеньев серотонинергической регуляции лево-правой асимметрии у Xenopus.

Экспрессия основных компонентов классического (синаптического) серотонинергического механизма на ранних стадиях развития морских ежей и шпорцевых лягушек, показанная в данной работе, дает основание предполагать существование на этом этапе системы, близкой по своим характеристикам к дефинитивной серотонинергической системе. При этом показана сложность донервной серотонинергической системы, имеющей несколько рецепторов, экспрессирующихся в одной клетке, что, в совокупности с множественностью трансмиттерных систем на ранних донервных стадиях эмбрионального развития, существенно отличает эмбриональную серотонинергическую систему от дефинитивной. Полученные результаты являются подтверждением той точки зрения,

что более общие эмбриональные регуляторные функции серотонина являются филогенетическими предшественниками его более специализированной нейротрансмитгерной функции. Наконец, то, что при всех различиях, серотонинергическая система представлена в донервном эмбриогенезе таких эволюционно далеких групп животных, как амфибии и морские ежи, говорит о том, что донервные регуляторные функции серотонина являются фундаментальными и универсальными.

ВЫВОДЫ

• На ранних стадиях эмбрионального развития морских ежей экспрессируются гены, гомологичные компонентам систем синтеза (фенилаланин/триптофан гидроксилаза, AAAD), рецепции (HTR1A, HTR2B, HTR4 и рецептор серотонина неизвестного типа НТК), обратного захвата (SERT) и деградации (MA О А) серотонина. Функциональная активность систем синтеза и обратного захвата серотонина подтверждена экспериментально.

• На ранних стадиях эмбрионального развития Xenopus экспрессируются гены следующих компонентов серотонинергической системы: ферменты синтеза ТРН2 и AAAD, везикулярный транспортер VMAT2, рецепторы серотонина HTR1E, HTR2C, HTR5 и HTR7, транспортер серотонина SERT.

• Уровень экспрессии мРНК компонентов донервной эмбриональной серотонинергической системы Xenopus в пуле материнской мРНК различается приблизительно на порядок в ряду VMAT2 > HTR7 > HTR1E > HTR5 > HTR2C, SERT. Экспрессия VMAT2, HTRIE и HTR2C уменьшается в процессе раннего развития, тогда как экспрессия HTR5, HTR7 и SERT на ранних стадиях развития держится на одном уровне.

• Экспрессия HTRIE, HTR2C, HTR7 и SERT не имеет выраженных различий вдоль анимально-вегетативной оси, тогда как экспрессия HTR5 и VMAT2 обладает выраженным анимально-вегетативным градиентом, причем HTR5 больше в вегетативной области, a VMAT2 - в анимальной. Экспрессия VMAT2 больше в эпителиальном слое клеток крыши бластоцеля, чем в субэпителиальном, тогда как экспрессия HTRIE, HTR2C, HTR5, HTR7 и SERT не различается между этими группами клеток.

• На стадии гаструлы мРНК HTR2C и VMA Т2 транслируются, тогда как мРНК HTR7 не транслируется и полностью локализована в информосомах. мРНК HTRIE, HTR2C и VMAT2 имеет мотив, необходимый для трансляции во время созревания ооцитов.

• Ферменты синтеза серотонина экспрессируются как в ооцитах на ранних стадиях оогенеза, так и в фолликулярных оболочках, причем в ооцитах экспрессируется ТРН2, а в фолликулярных оболочках - ТРН1.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых ясурналах из списка ВАК:

Никишин ДА., Семенова М.Н., Шмуклер Ю.Б. Экспрессия генов трансмитгерных рецепторов в раннем развитии морского ежа Paracentrotus lividus Онтогенез. 2012. Т. 43. №3. С. 212-216.

Nikishin D.A., Kremnyov S.V., Konduktorova V.V., Shmukler Y.B. Expression of serotonergic system components during early Xenopus embryogenesis. The International Journal of Developmental Biology. 2012. V. 56. № 5. P. 385-391.

Глава в монографии:

Shmukler Y.B., Nikishin D.A. Transmitters in Blastomere Interactions. In: Cell Interaction, Sivakumar Gowder (Ed.), InTech, 2012. Ch. 2, P. 31-65.

Статья в сборнике:

Никишин ДА., Кремнёв С.В., Шмуклер Ю.Б. Паттерн экспрессии рецепторов серотонина в эмбриогенезе Xenopus laevis // Международная конференция "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация" / Пущино, 2011

Тезисы конференций:

Nikishin D.A., Ivashkin E.G., Mikaelyan A.S., Shmukler Yu.B. Expression of serotonin receptors during early embryogenesis // Simpler Nervous Systems, EX East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology / St. Petersburg, 2009. C. 70.

Никишин ДА., Кремнёв C.B. Экспрессия рецепторов серотонина в эмбриогенезе шпорцевой лягушки Xenopus laevis // Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2010» / Отв. ред. И.А. Алешковский, П.Н. Костылев, А.И. Андреев, А.В. Андриянов. [Электронный ресурс] - М.: МАКС Пресс, 2010. С. 90.

Никишин ДА., Кремнёв С.В., Шмуклер Ю.Б. Экспрессия рецептора 5-НТЗА в эмбриогенезе шпорцевой лягушки Xenopus laevis II Первые Международные Беккеровские чтения. Сборник научных трудов по материалам конференции. В 2 частях. Часть 2. Под ред. д.б.н., проф. В.А. Сагалаева. / Волгоград, 2010. С. 143144.

Никишин Д.А., Кремнёв С.В., Шмуклер Ю.Б. Экспрессия компонентов адренергнческой системы в эмбриогенезе Xenopus laevis // XXI Съезд Физиологического общества им. И,П. Павлова. Тезисы докладов / Калуга: БЭСТ-принт, 2010. С. 439-440.

Никишин Д.А. Экспрессия компонентов серотонергической системы в эмбриогенезе Xenopus laevis II VI Конференция молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (16-17 декабря 2010 г., г. Москва): тезисы докладов / Онтогенез. 2011. Т. 42. № 5. С. 328-329.

Никишин ДА., Кремнёв С.В. Экспрессия транспортёров серотонина в эмбриогенезе Xenopus laevis II Ломоносов - 2011: XVIII Международная

конференция студентов, аспирантов и молодых учёных; секция «Биология»; 1115 апреля 2011 г.; Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет: Тезисы докладов / Сост.: Н.П. Карасева. М.: МАКС Пресс, 2011. С. 14-15.

Nikishin D.A., Kremnyov S.V., Shmukler Y.B. Expression analysis of serotonergic signal system in Xenopus early embryogenesis // 2nd Joint Meeting of the French and British Societies for Developmental Biology / Campus Saint Jean d'Angely, University of Nice Sophia Antipolis, France, 2011. P-92.

Никишин Д.А. Компонентный состав донервной серотонергической системы в раннем эмбриогенезе Xenopus laevis и Xenopus tropicalis II VII Конференция молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (12-13 декабря 2011 г., г. Москва): тезисы докладов / Онтогенез. 2012. Т. 43. № 4. С. 235249.

Nikishin D.A., Kremnyov S.V., Kudrin V.S., Shmukler Y.B. Transmitters in the embryogenesis of Xenopus laevis IIX East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology "Simpler Nervous Systems" September 6-10, 2012, Moscow. P. 35.

Шмуклер Ю.Б., Никишин Д.А. Серотонергическая система и асимметризация в эмбриогенезе // Конференция «Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии: симметрия и асимметрия» 14-16 ноября 2012 г., Палеонтологический институт им. А.А. Борисяка РАН, Москва. С. 55-56.

Заказ № 108-р/04/2013 Подписано в печать 24.04.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 0,8

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:гак@с/г.ги

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Никишин, Денис Александрович, Москва

Российская Академия Наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

На правах рукописи

04201356379

НИКИШИН Денис Александрович

ЭКСПРЕССИЯ КОМПОНЕНТОВ ДОНЕРВНОЙ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ ШПОРЦЕВЫХ ЛЯГУШЕК И МОРСКИХ ЕЖЕЙ

03.03.01 - физиология 03.03.05 - биология развития, эмбриология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Юрий Борисович Шмуклер

Москва 2013

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................................7

Актуальность проблемы......................................................................................................................7

Цель и задачи исследования................................................................................................................8

Научная новизна...................................................................................................................................9

Теоретическое и практическое значение..........................................................................................10

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................11

Донервные трансмиттеры..................................................................................................................11

Состав серотонинергической системы в нервных клетках...........................................................12

Система синтеза....................................................................................................................................13

Система везикулярного транспорта.................................................................................................13

Рецепторы..............................................................................................................................................13

Система обратного захвата.................................................................................................................15

Система деградации.............................................................................................................................15

Функции серотонина в раннем донервном эмбриогенезе...............................................................15

Оогенез....................................................................................................................................................16

Деления дробления...............................................................................................................................17

Межбластомерные взаимодействия..................................................................................................19

Функции серотонина в позднем донервном эмбриогенезе.............................................................24

Гаструляция..........................................................................................................................................24

Лево-правая асимметрия....................................................................................................................25

Ресничная моторика............................................................................................................................25

Механизмы донервных эффектов серотонина.................................................................................26

Серотонин в эмбриогенезе.................................................................................................................27

Динамика серотонина в раннем развитии.......................................................................................28

Локализация серотонина в клетках ранних эмбрионов................................................................28

Компоненты серотонинергической системы в эмбриогенезе........................................................29

Рецепторы серотонина.........................................................................................................................29

Транспортеры серотонина..................................................................................................................30

Ферменты синтеза и деградации серотонина..................................................................................30

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...............................................................................................32

Реактивы, использованные в работе................................................................................................32

Лабораторное оборудование..............................................................................................................33

Экспериментальные процедуры.......................................................................................................34

Получение и фиксация проб...............................................................................................................34

Обратная транскрипция и ПЦР.........................................................................................................35

Молекулярное клонирование.............................................................................................................39

Гибридизация in situ.............................................................................................................................40

Иммуногистохимическое выявление серотонина..........................................................................42

РЕЗУЛЬТАТЫ.........................................................................................................................45

Экспрессия и функциональная активность компонентов серотонинергической системы в раннем развитии морских ежей.........................................................................................................45

Экспрессия компонентов серотонинергической системы в нормальном развитии Xenopus.....50

Рецепторы..............................................................................................................................................52

Транспортеры........................................................................................................................................57

Ферменты синтеза и деградации.......................................................................................................59

Уровень и динамика экспрессии компонентов серотонинергической системы в раннем развитии Xenopus................................................................................................................................62

Пространственное распределение мРНК компонентов серотонинергической системы в ранних эмбрионах Xenopus..............................................................................................................................65

Экспрессия компонентов серотонинергической системы на уровне трансляции.......................68

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.....................................................................................70

ВЫВОДЫ..................................................................................................................................86

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................................88

Список сокращений

АТФ - аденозинтрифосфат (ATP, adenosine triphosphate) АТФаза - аденозинтрифосфатаза (ATPase, adenosine triphosphatase) АШ - анимальная шапочка ВШ - вегетативная шапочка

ГТФ - гуанозинтрифосфат (GTP, guanosine triphosphate)

ГТФаза - гуанозинтрифосфатаза (GTPase, guanosine triphosphatase)

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота (DNA, deoxyribonucleic acid)

ДНКаза - дезоксирибонуклеаза (DNase, deoxyribonuclease)

ЕА - единица активности (U, enzyme unit)

ИС - информосомы

кб - килобаз (kb, kilo base pairs)

кДНК - комплементарная ДНК (cDNA, complementary DNA) ЛПА - лево-правая асимметрия МЗ - маргинальная зона

мРНК - матричная РНК (mRNA, messenger RNA)

ОТ-ПЦР - обратно-транскрипционная ПЦР (RT-PCR, reverse transcription PCR)

пн - пара нуклеотидов (bp, base pair) ПРС - полирибосомы

ПЦР - полимеразная цепная реакция (PCR, polymerase chain reaction)

РНК - рибонуклеиновая кислота (RNA, ribonucleic acid)

РНКаза - рибонуклеаза (RNase, ribonuclease)

СЭК - субэпителиальные клетки

УТФ - уридинтрифосфат (UTP, uridine triphosphate)

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат (cAMP, cyclic adenosine

monophosphate) ЦТФ - цитидинтрифосфат (СТР, cytidine triphosphate) ЭК - эпителиальные клетки

АА - arachidonic acid (арахидоновая кислота)

AAAD - aromatic L-amino acid decarboxylase (декарбоксилаза ароматических

L-аминокислот) AC - adenylate cyclase (аденилатциклаза) BLAST - Basic Local Alignment Search Tool BSA - bovine serum albumin (бычий сывороточный альбумин) CHAPS - 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-l-propanesulfonate (3-[(3-

холамидопропил)диметиламмонио]-1 -пропансульфонат) CPE - cytoplasmic polyadenylation element (элемент цитоплазматического

полиаденилирования) DAG - diacylglycerol (диацилглицерин) DEPC - diethylpyrocarbonate (диэтилпирокарбонат) DTT - dithiothreitol (дитиотреитол)

EDTA - ethylenediaminetetraacetic acid (этилендиаминтетрауксусная кислота) EGTA - ethylene glycol tetraacetic acid (этиленгликольтетрауксусная кислота) EST - expressed sequence tag

GPCR - G protein coupled receptors (сопряженные с G-белком рецепторы)

GVBD - germinal vesicle breakdown (растворение зародышевого пузырька)

5-ШАА - 5-hydroxyindoleacetic acid (5-гидроксииндолуксусная кислота)

5-НТ - 5-hydroxytryptamine (5-гидрокситриптамин)

ID - identifier (идентификатор)

IP3 - inositol trisphosphate (инозитолтрифосфат)

IP3R - inositol trisphosphate receptor (рецептор инозитолтрифосфата)

HTP - 5-hydroxytryptophan (5-гидрокситриптофан)

HTR- 5-hydroxytryptamine receptor (рецептор 5-гидрокситриптамина)

LB - Luria-Bertani medium (среда Лурия-Бертани)

LSD - lysergic acid diethylamide (диэтиламид лизергиновой кислоты)

MAB - maleic acid buffer (малеиновокислотный буфер)

MAOA - monoamine oxidase А (моноаминоксидаза A)

MEMFA - MOPS-EGTA-magnesium-formaldehyde solution (MOPS-EGTA-

магний-формальдегидный раствор) M-MLV - Moloney murine leukemia virus (вирус лейкемии мышей Молони) MMR- Marc's modified Ringer's solution (модифицированный раствор Рингера)

MOPS - 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (3-(N-

морфолино)пропансульфоновая кислота) MZT - maternal-to-zygotic transition (материнско-зиготический переход) ODC - ornithine decarboxylase (орнитиндекарбоксилаза) PBS - phosphate buffered saline (фосфатно-солевой буфер) PIP2 - phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (фосфоинозитол-4,5-дифосфат) РКА - protein kinase А (протеинкиназа A) PKC - protein kinase С (протеинкиназа С) PLA - phospholipase А (фосфолипаза A) PLC - phospholipase С (фосфолипаза С) PTw - PBS-Tween solution (раствор PBS-Tween) RQ - relative quantity (относительное количество) SERT - serotonin transporter (транспортер серотонина) SD - standard deviation (стандартное отклонение) SSC - saline-sodium citrate buffer (натрий-цитратный буфер) ТАЕ - Tris-acetate-EDTA buffer (буфер Тпз-ацетат-ЕБТА) TEA - triethanolamine solution (раствор триэтаноламина) TPH - tryptophan hydroxylase (триптофангидроксилаза) UTR - untranslated region (нетранслируемая область)

V-ATPase - vacuolar-type H+-ATPase (вакуолярная ЕГ-аденозинтрифосфатаза) VMAT - vesicular monoamine transporter (везикулярный транспортер моноаминов)

WISH - whole mount in situ hybridization (гибридизация in situ на тотальных препаратах)

Введение

Один из классических нейромедиаторов, серотонин выполняет, помимо нейротрансмиссии, множество ненервных функций, в том числе участвует в важнейших процессах индивидуального развития. Серотонинергическая сигнальная система хорошо изучена на нервных клетках взрослых млекопитающих: для всех ее компонентов известны гены, нуклеотидные и аминокислотные последовательности, достаточно хорошо изучены структура и механизмы их функционирования. Исследованы механизмы некоторых ненервных функций серотонина, в частности его роль в системе свертывания крови и регуляции тонуса сосудов. Однако, несмотря на то, что первые работы, демонстрирующие важную роль серотонина в процессах эмбрионального развития, были опубликованы более 50 лет назад, исследования в этой области до сих пор остаются немногочисленными и разрозненными. На сегодняшний день известно, что серотонин присутствует в эмбрионах, начиная с самых ранних стадий развития, и имеется множество данных о специфических эффектах серотонина и его аналогов, свидетельствующие об участии серотонина в процессах раннего эмбрионального развития. Однако очень мало известно о том, какие компоненты составляют донервную эмбриональную серотонинергическую систему, и каковы механизмы действия серотонина на те или иные процессы раннего развития.

Актуальность проблемы

В настоящее время существует фронт работ по изучению ранних этапов онтогенеза. Это связано как с общим интересом к собственно раннему развитию, так и, в частности, с большим сходством в поведении эмбриональных и опухолевых тканей. В свете современных достижений в этих областях на первый план выходит выяснение молекулярных основ раннего развития. Важное место в этих работах занимает изучение сигнальных путей, контролирующих ранние этапы эмбрионального развития.

7

Учитывая широкий спектр функций серотонина и множество его эмбриональных эффектов, можно полагать, что серотонин является одним из сигнальных веществ, регулирующих раннее развитие. Исследование донервной эмбриональной серотонинергической системы на молекулярном уровне может пролить свет на механизмы серотонинергической регуляции раннего развития.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы заключается в обзорном исследовании экспрессии компонентов донервной серотонинергической системы в раннем эмбриогенезе двух классических объектов биологии развития - шпорцевой лягушки Хепорш и морского ежа. Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

• исследовать экспрессию генов, гомологичных компонентам серотонинергической системы, в раннем развитии морских ежей и функциональную активность компонентов, экспрессирующихся на ранних стадиях развития;

• исследовать экспрессию генов компонентов серотонинергической системы в нормальном развитии Хепорш и выявить гены, экспрессирующиеся на ранних стадиях развития, для дальнейшего исследования;

• исследовать количественно уровень и динамику экспрессии этих генов в течение раннего развития Хепорш;

• исследовать пространственное распределение в ранних эмбрионах Хепорш мРНК генов серотонинергической системы;

• исследовать на уровне трансляции экспрессию генов серотонинергической системы, выявленных в раннем эмбриогенезе Хепорш;

• выявить возможные источники материнского серотонина в ооцитах Хепорш путем анализа экспрессии генов ферментов синтеза серотонина.

Научная новизна

На классической экспериментальной модели - эмбрионах Xenopus впервые проведено комплексное исследование донервной эмбриональной серотонинергической системы. Впервые была исследована экспрессия всех компонентов серотонинергической системы на одном экспериментальном объекте. Показано, что на ранних стадиях развития Xenopus, в составе материнской мРНК экспрессируются основные компоненты, необходимые для осуществления сигнальной функции - везикулярный транспортер VMAT2, рецепторы HTR1E, HTR2C, HTR5 и HTR7 и транспортер обратного захвата SERT, а также ферменты синтеза серотонина ТРН2 и AAAD. Впервые получены и опубликованы частичные последовательности мРНК HTR1E, HTR5 и SERT X. laevis (NCBI Nucleotide ID: КС477213, КС477214 и JQ001861). Количественно исследованы уровень, динамика экспрессии и пространственное распределение транскриптов основных компонентов серотонинергической системы в ранних эмбрионах Xenopus, и их экспрессия на уровне трансляции. Показано, что на ранних стадиях эмбриогенеза Xenopus не экспрессируется основной фермент деградации серотонина МАО А. Выявлено, что ферменты синтеза серотонина экспрессируются как в ооцитах на ранних стадиях оогенеза, так и в фолликулярных оболочках.

Впервые проведен анализ экспрессии гомологов генов компонентов

серотонинергической системы в раннем развитии морских ежей, являющихся

классическим объектом исследования донервных функций

нейротрансмиттеров. Показано, что на ранних стадиях развития

экспрессируются гомологи рецепторов серотонина четырех типов,

транспортера серотонина SERT, фермента деградации серотонина МАО А и в

течение донервного развития начинают экспрессироваться гомологи

везикулярного транспортера моноаминов VMAT, и ферментов синтеза

серотонина. Впервые получены и опубликованы частичные

последовательности мРНК SERT, VMAT P. lividus. Функциональная

активность компонентов систем синтеза и обратного захвата подтверждена

9

экспериментально. Полученные результаты являются первыми молекулярно-биологическими свидетельствами экспрессии компонентов серотонинергической системы в раннем развитии морских ежей.

Теоретическое и практическое значение

В работе получены результаты, представляющие фундаментальный научный интерес. В частности, продемонстрировано, что экспрессирующиеся в раннем развитии рецепторы серотонина гомологичны или идентичны дефинитивным рецепторам нервных клеток. Показана экспрессия на ранних донервных стадиях развития нейральной формы фермента синтеза серотонина. Показано, что набор типов рецепторов серотонина, экспрессирующихся в раннем развитии, консервативен, по крайней мере, среди позвоночных. Выполнено исчерпывающее сравнительное обзорное исследование, в результате которого выявлены гены серотонинергической системы, экспрессирующиеся на ранних стадиях развития и, возможно, принимающие участие в реализации донервных функций серотонина. Полученные результаты могут быть использованы как основа для дальнейших практических и теоретических исследований донервных функций серотонина и других нейротрансмиттеров. Разработанный методический подход может быть использован для исследования других нейротрансмиттерных систем в раннем развитии.

Обзор литературы

Донервные трансмиттеры

Классические нейромедиаторы - ацетилхолин, серотонин, адреналин и дофамин, первоначально были открыты как вещества, осуществляющие синаптическую передачу нервных импульсов (Loewi, 1921 - цит. по Valenstein, 2002). В дальнейшем стало ясно, что их функции не ограничиваются нервной и нервно-мышечной передачей. Классические нейромедиаторы, помимо клеток нервной системы, были обнаружены во многих других органах и тканях, а так же в эмбрионах различных животных на ранних стадиях развития, задолго до появления нервной системы, более того, эти вещества были обнаружены у одноклеточных организмов (см. Бузников, 1967).

Серотонин (5-гидрокситриптофан, 5-НТ) является наиболее изученным нейромедиатором с точки зрения его ненервных функций (см. Бузников, 1987; Turlejski, 1999; Levin et al, 2006). Серотонин выполняет регуляторные функции уже у простейших. У инфузории Tetrahymena серотонин является внутриклеточным регулятором, влияющим на экспрессию генов и активирующим фагоцитоз (Csaba, Ubornyák, 1981), активность биения и регенерацию ресничек (Castrodad et al, 1988). У Metazoa серотонин участвует в самых разнообразных процессах на протяжении всего индивидуального развития, в том числе его ранних стадий, таких как оогенез, оплодотворение, дробление, гаструляция, морфогенез (см. Бузников, 1987; Buznikov et al,

1996), установление левой-правой асимметрии тела (Fukumoto et al, 2005а). На более поздних стадиях развития серотонин участвует в регуляции ресничной моторики (Бузников, Манухин, 1960; Doran, Goldberg, 2006), а