Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ структуры и получение в прокариотической системе рекомбинантного белка G2 хантавируса серотипа пуумала, изолированного из зоонозного очага на территории Республики Башкортостан

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ структуры и получение в прокариотической системе рекомбинантного белка G2 хантавируса серотипа пуумала, изолированного из зоонозного очага на территории Республики Башкортостан"

На правах рукописи

Мухаметханов Наиль Ханафиевич

АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ И ПОЛУЧЕНИЕ В ПРОКАРИОТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА С2 ХАНТАВИРУСА СЕРОТИПА ПУУМАЛА, ИЗОЛИРОВАННОГО ИЗ ЗООНОЗНОГО ОЧАГА НА ТЕРРИТОРИИ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН

03,01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2010

003493232

Работа выполнена в лаборатории вирусных препаратов «НПО «Микроген»» МЗ РФ филиал «Иммунопрепарат»

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент

Баймиев Алексей Ханифович Учреждение Российской Академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Официальные доктор биологических наук, профессор

Чемерис Алексей Викторович оппоненты: „ г> - - л

Учреждение Российской Академии наук

Институт биохимии и генетики

Уфимского научного центра РАН

доктор биологических наук Шевелев Алексей Борисович Учреждение Российской Академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М. П. Чумакова РАМН

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии медицинских

наук НИИ вакцин и сывороток им.И.И. Мечникова РАМН

Защита диссертации состоится «_»_2010 г. в «_» часов

на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01

при Учреждении Российской Академии наук Институт биохимии и генетики

Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, пр. Октября, 71

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, пр. Октября, 71) и на сайте ИБГ УНЦ РАН ibg.anrb.ru/dissov.html

e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан «___»_' 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета i Бикбулатова С.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - широко распространенное в странах Евроазиатского континента природно-очаговое заболевание, вызываемое хантавирусной инфекцией. В Европейской части Российской Федерации на территории Республики Башкортостан (РБ) находится самый крупный и активный природно-зоонозный очаг этого заболевания. Основным возбудителем ГЛПС в Башкортостане является хантавирус се-ротипа Пуумала (PUU). В Восточной Сибири и на Дальнем Востоке, ГЛПС с более тяжелой формой вызывается серотипом Сеул (SEU) и Хантаан (HTN). Актуальность изучения проблемы обусловлена отсутствием тенденции к снижению заболеваемости, тяжестью течения с развитием различных тяжелых осложнений (ток-сико-инфекционный шок, почечная недостаточность, разрыв почек, тромбогемор-рагический синдром, кровоизлияние) и значительным экономическим ущербом. К сожалению, на сегодняшний день еще не получены эффективные специфические средства для профилактики и этиотропной терапии ГЛПС. Динамика заболеваемости ГЛПС в республике характеризуется эпидемическими вспышками каждые 3-4 года. Подобные вспышки связаны с массовым размножением рыжих полевок и высоким уровнем инфицированное™ грызунов - природного резервуара для вируса. Кроме того, подъем заболеваемости ГЛПС в годы с низкой численностью полевок, а также отличия в тяжести инфекционного процесса могут быть вызваны, в том числе, антигенной вариабельностью и разной степенью патогенности циркулирующих на территории РБ штаммов хантавирусов, возбудителей ГЛПС. Передача вируса от грызуна к человеку происходит в основном воздушно-капельным путем и через экскременты животных (Schmaliohn et al., 1985; Chu et al., 1994; Avsic-Zupanc et al., 1995). Ежегодно по всему миру фиксируется более 150-200 тысяч случаев заболевания ГЛПС.

Эффективность лечения любого заболевания определяется его точной диагностикой на раннем этапе заболевания. Для диагностики ГЛПС наиболее широко используются методы, основанные на детекции специфических антител. В них используется фиксированный ацетоном антиген, полученный из культуры клеток

Vero E6, инфицированных патогенным хантавирусом (Lee et al., 1985). Получение подобного препарата является весьма трудоемкой и опасной процедурой. Альтернативой традиционному получению антигена может стать рекомбинантный вирусный белок, синтезированный в про- или эукариотической системе экспрессии. При наличии эффективных штаммов-продуцентов получение рекомбинантного белка потребует значительно меньше времени, кроме того, отсутствует необходимость работы непосредственно с вирусом.

Разработанные и лицензированные на сегодняшний день вакцинные препараты для профилактики ГЛПС представляют собой «живые» аттенюированные вакцины, созданные на основе вирусов серотипов HTN и SEU, циркулирующих, преимущественно, в странах Азии - Китае и Южной Корее (Song et al., 1998; Lee et al., 2001). К тому же, по ряду сообщений, указанные вакцинные препараты индуцируют низкий уровень синтеза нейтрализующих антител у иммунизированных людей. На территории России основным возбудителем ГЛПС является вирус серо-типа PUU. и поэтому нет оснований утверждать, что данные вакцины окажут эффективное профилактическое действие. В качестве альтернативы обычным вакцинам уже разработаны и разрабатываются новые рекомбинантные вакцины, например, от гепатита В и С (Спасокукоцкий, 2000). Стратегия создания таких вакцин сводится к клонированию гена, чей продукт при экспрессии в подходящей системе приведет к продукции белка, способного вызвать при введении в организм человека синтез вируснейтрализующих антител. Еще одним направлением в области ре-комбинантных технологий является разработка ДНК-вакцин. Принцип ДНК-вакцинации основан на введении в организм векторной ДНК, несущей гены белков, продукция которых приведет к полноценному иммунному ответу. Данный подход позволил получить антитела к множеству антигенов инфекционных патогенов вирусной и бактериальной природы (Dertzbaugh et al., 1997). В настоящее время, в ряде стран Западной Европы, а также в Китае и Южной Корее активно ведутся исследования, направленные на создание ДНК-вакцин для лечения и профилактики ГЛПС. Однако до введения ДНК-вакцин в медицинскую практику необходимо провести эксперименты, подтверждающие их эффективность и безопасность.

Цель работы заключалась в исследовании структуры гена поверхностного гликогтротеина G2 хантавируса, выделенного из зоонозного очага на территории Республики Башкортостан и создании системы получения рекомбинантного белка G2 в клетках Е. coll.

Задачи исследования'.

1. Амплификация, клонирование и секвенирование гена гликопротеина G2 хантавируса, выделенного из органов грызунов и крови больных ГЛГ1С на территории Республики Башкортостан;

2. Анализ нуклеотидной и выведенной из нес аминокислотной последовательности клонированного гена гликопротеина G2 и сравнение с аналогичными последовательностями исследованных ранее вирусов;

3. Получение генетической конструкции, содержащей ген поверхностного гликопротеина G2 исследуемого хантавируса, способного экспрессироваться в прокариотической системе;

4. Получение рекомбинантного белка G2 в клетках Е. coli.

Научная новизна. Установлено, что на территории Республики Башкортостан циркулирует хантавирус Ufa-2005 серотип PUU. Определена полная последовательность кодирующей области гена G2. Получена генно-инженерная конструкция на основе векторов pBluescript и pPinPoint, включающих в себя ген гликопротеина G2 хантавируса серотипа PUU, экспрессия которого регулируется бактериальным lac промотором. Показана возможность экспрессии полноразмерного белка G2 хантавируса серотипа Пуумала в Е. coli (штамм JM 109).

Практическая значимость Полученные результаты расширяют и дополняют представления о структуре нуклеотидной и белковой последовательностей хантавируса, который циркулировал на территории Республики Башкортостан и явился причиной вспышки ГЛПС в 2001-2005гг. Ген G2 из плазмидных конструкций можно использовать для получения штамма-продуцента гликопротеина, для диагностических целей, ДНК-вакцины и рекомбинантной вакцины.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов (Уфа, 2000); на Всероссийской научно-

практической конференции «Медицина будущего» (Сочи, 2002); на Всероссийской конференции с международным участием «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение», посвященной 100-летию основания филиала «Иммунопрепарат» (Уфа, 2005); «История изучения и современное состояние эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики» (Уфа, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 1 статья в журнале из Перечня ВАК.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объект исследования - хантавирус (род Hantavirus), который был основным этиологическим агентом ГЛПС на Южном Урале за период 2001 - 2005 гг.

Выделение и очистка тотальной РНК из крови больных и образцов легочной ткани рыжых полевок (Myodes, Clethrionomys glareolus), отловленных на территории Республики Башкортостан, проводилась экстракцией смесью гуанидинтио-ционат-фенол-хлороформ (Chomczynski et al. 1987) и «Trizol Reagent» фирмы «In-vitrogen». Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили методом мягкого лизиса с использованием Brij-58 (Pernecky, Coon 1996). Электрофоретичёское фракционирование препаратов ДНК осуществляли в зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК и требуемого разрешения, используя 0,6 - 1,8% агарозные гели. Синтез кДНК. ДНК, комплементарную вирусной геномной РНК, получали, используя фермент AMV-ревертазу (обратной транскриптазы вируса миелобласто-за птиц) или MulV-ревертазу (Frohman 1988). Амплификацию вирусной кДНК проводили методом «гнездовой» полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Feldman 1993). Компетентные клетки готовили по Kushner (Kushner 1978), с некоторыми изменениями. Молекулярную массу полипептидов определяли методом коэлек-трофореза белков с известными значениями молекулярных масс (Laemmli 1970). Твердофазный иммуноферментный анализ проводили, используя тест-систему для определения антигенов хантавирусов «Хантагност». Определяли величину поглощения света при длине волны 492 нм на приборе «Унискан И» (Flow laboratories Финляндия) (Гловер 1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение геномной РНК хантавируса

Из 0,5 г ткани легких зараженных мышей гуанидинтиоционат-фенол-хлороформным методом была выделена тотальная РНК. Для выделения М-сегмента генома из вирусного материала использовали метод обратной транскрипции с полимеразной цепной реакцией (ОТ-П1ДР). В пяти препаратах было отмечено накопление продуктов кДНК с размерами, которые соответствовали теоретически ожидаемым - около 2000 п.н. (рис. 1).

=2000п.н.

12 3 4 5 6 7 8

Рис. 1. Электрофоретический анализ продуктов кДНК гена G2.

Дорожки: 1,8- маркер весов (ДНК фага X : BssTI);

2 - 6 - кДНК-копии гена G2; 7 - отсутствие продукта.

Для увеличения наработки целевого продукта использовали метод гнездовой ПЦР (nested PCR) (рис. 2) с использованием внешней (Ml и М2) и внутренней пары (МЗ и М4) праймеров в два раунда. В амплификации использовали праймеры, представленные в таблице 1. Продукт амплификации фрагмента М-сегмента был очищен методом фенольно-хлороформной экстракции и клонирован в вектор pGEM-TEasy («Promega», США).

Далее была определена нуклеотидная последовательность данного фрагмента и зарег истрирована (Ufa-2005) в базе данных GenBank.

Т)

1 2 3 456789 Рис. 2. Электрофоретическин анализ продуктов ПЦР.

1 4 - продукты ПЦР реакции при использовании внешних М1и М2 праймсров (1876 н.п.); 5 - 8 - продукты гнездовой ПЦР реакции с использованием внутренних пар МЗ и М4 праймеров (1543 н.п.); 9 - ДНК фага А.: ВввТ!)

Таблица 1

Праймеры для амплификации кДНК фрагмента М-сегмента, соответствующего гену а хантавируса.

Наименование прай-мера Нуклеогид-ная позиция Последовательность праймера Ориентация праймера Размер ПЦР продукта (п.н.)

М1 1796, 1817 5'ССАТСТСАООСААСААСАТСТС-3' «+» 1876

М2 3668, 3647 5 'ОСААОААСААА АОТССАООСАТ-З'

МЗ 1945,1975 5'-ТСООТТСТТТОТСАТОСТАОТСТОС-ТСССТО-З' 1543

М4 3487, 3455 5'-ТТАСОССТТАТСТТСТТТССТСТАЛ-СТАСОТСТ-5'

Анализ нуклеотидной последовательности фрагмента вирусного генома, соответствующей гену в2 хантавируса УГа-2005

При сравнительном анализе нуклеотидной последовательности клонированного нами фрагмента с первичной структурой соответствующего участка М-сегмента штамма хантавируса СС-1820 было обнаружено, что на всем протяжении | исследуемого фрагмента, соответствующего кодирующей последовательности

8 Р

ь-

гликопротеина G2 имеются отдельные несовпадения в нуклеотидной последовательности. Уровень гомологии сравниваемых участков составляет 94,7%. Были выявлены следующие отличия: в положении 1990 была обнаружена замена С—>G, в положении 1997 G—*А, 2063 A—G, 2109 А^С, 2143 A—>G, 2215 G—»А, 2443 A—»G, 2602 С—Т, 2724 C—G, 2763 С^Т, 2781 А—Т, 2829 А-Ю, 2837 Т—С, 2863 С-^Т, 2866 Т-*С, 2893 Т-+С, 2896 A-*G, 3269-3270 СС—GG. Замена в положении 2063 привела к замене аминокислоты R—»G, в положении 2109 Q—>Р, 2724 Р—>R, 2763 А—V, 2781 Q-»L, 2829 К—»R, 2837 F—L, 3269 Р—G.

Большая часть нуклеотидных замен в открытых рамках считывания исследованного М сегмента, соответствующего гену G2, сосредоточена в 3-й позиции кодонов, вследствие чего они не оказывают влияния на аминокислотные последовательности вирусного белка. Обнаруженные изменения в аминокислотных последовательностях белков хантавируса сводятся к взаимным заменам гидрофобной аминокислоты с короткой боковой цепью - аланина на валин, основной аминокислоты лизина на аргинин, что оказывает минимальное воздействие на вторичную структуру белка. Однако, наблюдаются и значимые для сохранения конформации и общего заряда белка замены гидрофобных аминокислот на полярные и наоборот, в следующих положениях: 2063 (аргинин на глицин), 2109 и 2781 (глютамат на пролин и лейцин, соответственно), 2837 (пролин на аргинин) и 2724 (фенилаланин на лейцин).

В настоящее время эволюционная взаимосвязь хантавирусов устанавливается на основе сравнительного анализа соответствующих нуклеотидных последовательностей М, S и L сегментов генома вируса (Antic et al., 1992; Spiropoulou et al., 1994; Vapalahti, 1996;). Antic и соавт. (1992) выделяют два различных эволюционных направления хантавирусов: один включает вирусы, переносимые Apodemus и Rattus (семейство Мышиные, Muridae), такие как HTN (Хантаан) и SEU (Сеул) се-ротипы, а другой включает серотипы, переносимые Clethrionomys и Microtus (семейство Хомякообразные, Cricetidae), такие как серотипы PUU (Пуумала) и РН (Проспект Хилл). В последние годы были выделены вирусы, впоследствии классифицированные как хантавирусы, переносимые землеройками (семейство Земле-ройковые Soricidae), которые отделились и эволюционировали самостоятельно в

гораздо более ранний период по сравнению с другими хантавирусами. Открытия новых хантовирусов (Kang Н., 2009; Song J.-W., 2009) несколько изменило точку зрения на эволюцию хантавирусов, предложенную Antic и соавт. (1992).

Филогенетический анализ, проведенный на основе компьютерного выравнивания нуклеотидных последовательностей М-сегментов (рис. 3), зарегистрированных в электронном банке нуклеотидных последовательностей GenBank (NCBI, США) показал, что изолированный нами вирус на дендрограммах находится в общем кластере хантавирусных штаммов, выделенных ранее на территории Республики Башкортостан. Исследователи по-разному оценивают роль географического фактора в эволюции хантавирусов. Например, Plyusnin с соавт. (1994) считают, что штаммовые различия хантавирусов связаны с их географической удаленностью друг от друга.

Взаимосвязь между генетической и географической отдаленностью штаммов была также показана для PUU штаммов из Центральной Европы, для HTN штаммов из Китая и из Кореи, для SNV и других хантавирусов из США (Schmaliohn et al., 1988; Xiao et al., 1993; Liang et a!., 1994; Bowen et ai., 1995; Rowe et al., 1995; Hielle et al., 1995; Song et al., 1996).

Определенный нами уровень нуклеотидных различий для М-сегментов штаммов, выделенных из популяций грызунов в разных странах, составил 25 -40%; для штаммов, изолированных в одной стране - 12 - 18%, и для штаммов, изолированных в одной популяции 4 - 8%. Штаммы формируют отдельные группы в соответствии с местом их изоляции: в Сербии, Греции, Словении - серотип DOBV, в Германии, Норвегии, Финляндии - PUU, в России в Приволжском ФО -PUU, на Дальнем Востоке России, в Китае и Южной Корее - Amur, HTN, SEU. А в США, Панаме, Мексике, Боливии выделены вирус SNV и другие хангавирусы, вызывающие геморрагическую лихорадку с легочным синдромом (ГЛЛС). В группе российских штаммов для серотипа Пуумала были выделены несколько подгрупп: вирусные изоляты из Казани, Ижевска, Уфы, Омска и Тюмени.

А

- Уфа

Казань

Омск

¡I 02 PUU UFA 97 (AJI33582) 1 02 PUUV 18211m ÍM29979) ■ 02 PUU ИГ» 2(105 (KUÍ9261) J 02PUUV K27 (1.08754) 02 PUUV 0017 (ЛГ442614) (12 PUUV KAZAN (ZS4205) 02 PUUV SOTKAMO (X61034) G2 PUIJV CRFIM (AF3S70SI) 02 PUUV CG 222 (ЛК44261« G2 PUUV CRF 308 (AF4426I7) J 02 PUUV Erli (AJ23877) 02 PUUV VINOBLN (7.49214) 02 rUUV VKANIt'A(U14IJ6) G2rllUVUMEA(AY52i2l8| G1 Khabanmk vira (МОИМ*)

G2 Topogiav virus (Al 011647)

02 Fusung-Cr-247 (EU072488)

02 PROSPECT IllLLviras (X55129)

02 TULA vims MORAVIA (N( №15228)

0'2 ANDES virus(AF.124901)

02 CHOCLO (DQ2S5047)

02 SIN-NOMBRB virus NM H10 (NC0052I5)

02 Cano Deljadito virus VHV-574 (DQ28445I)

02 IITNVCJAp« (N'C 005219)

02 HTNVZT I0(NCIXX>437)

02 AMUR virus (EF371454)

02 DOB RAVA virus (СШШ50|

02 UOBRAVA (NC'005234)

G2 SF.UV 80-39 (S47716)

02 SF.UVZ17I (EF1I7248)

02 PUUV Sapporo (M34882)

G2 HTNV 1.99 (AF2S8298)

02 Tluiltapalayanr \irus (NO 010708)

25 20 15 10 5 Замена пуклеогндов (xlOO)

В

tí

I]

PUUV CO >S20 l'UCJV Ufa-2005

PUUV Bashkiria 2001 PUUV K27 I'UUV Ufa 97 PUUV Ka»tn PUUV Sotkamo PUUV CRF308 PUUV CRF \61 PUUV CRF 308 PUUV CG 222 I'UUV Vindeln I'UUV Vtanica PUUV Umea PUU Krfi Khabarovsk vim» Topogiav vims Fusong-M 1-68 Prospcci Hill vims TULA virus Andes virus C'lloclc virus

Sin-Nombrc virus NM H10 Cuno Dclyiulito virus Dobrava virus, Omsk Anuir vims HTN CJAp93 SliUV SO-J') SEUV ZT71 HTNV L99 HTNV S.ipporo T!ioU;«pa!ay:un virus

25 20 15 10 5

Замена аминокислот (хЮО)

Рис. 3. Филогенетический анализ нуклеотидных (С) и аминокислотных (О) последовательностей гена (Ос) некоторых изолированных хаитавирусов. В скобках указаны названия штаммов и номера, под которыми нуклеотидные последовательности зарегистрированы в базе данных СепВапк.

Необходимо отметить, что в Тюменской области циркулируют, помимо се-ротипа PUUV, серотипы DOBV, TopografovV, TULV (Якименко и др., 2008); на территории Омской области циркулируют серотипы хантавируса - PUUV, DOBV, TULV (Дзагурова и др., 1999; Якименко и др., 2001). В Германии и Словакии выделены серотипы PUU и TULV. Имеются данные, что на территории Республики Башкортостан также циркулируют два серотипа вируса - PUUV, DOBV (Ткаченко Е.А., 2006), что согласуется с исследованиями Antic с соавт. (1992), которые полагают, что географический фактор не играет большой роли в эволюции этих вирусов, и в качестве примера приводят изоляцию как PUU-, так и HTN-подобных вирусов из одних и тех же географических регионов Восточной Европы, а также SHU- и HTN-подобных вирусов из одного и того же региона Кореи.

Сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей подтвердил вывод о географической кластеризации вирусных штаммов серотипа PUU. Наличие целого ряда отличий в первичной структуре исследованных участков генома изолированного вируса Ufa-2005 при сравнении с ранее выделенными в этом регионе штаммами требует проведения дополнительных исследований, направленных на установление стабильности и возможности циркуляции этого штамма в последующие годы. ,

Исследование первичной аминокислотной последовательности гликопротеина G2 изолированного вируса Ufa-2005

Функции гликопротеинов вируса до настоящего времени полностью не выяснены. Предполагается, что данные белки участвуют в механизме проникновения вируса в клетку хозяина. Слияние вируса с клеткой происходит через клатрин-зависимый эндоцитоз (Jin et al., 2002). Есть основания полагать, что один из белков распознает и присоединяется к рецептору клетки мишени ВЗ интегрину, используя в качестве кофактора белки DAF/CD55 (Krautkramer and Zeier, 2008), или предположительно к поверхностному белку массой 30 кДа (Kim et al., 2002), а другой осуществляет процесс слияния вируса с эндосомальной мембраной клетки.

Описаны два класса поверхностных гликопротеинов вирусов, опосредующих слияние вируса с мембраной клетки, различающейся по структуре и расположе-

нию активного центра. Предполагается, что в активном центре белка находится пептид слияния (peptide fusion), непосредственно встраивающийся в мембрану клетки. Callaher с сотруд. (2001) описали первый класс белков слияния, который охватывает различные семейства не родственных вирусов: гемагглютинин вируса гриппа (семейство Ортомиксовирусы), гликопротеин gp41 вируса иммунодефицита человека (семейство Лентиовирусы), F белок (семейство Парамиксовирусы), гликопротеин GP2 вируса Эбола (семейство Филовирусы) (Epand, 2003). Им свойственна трехмерная кольцевая закрученная, преимущественно а-спиральная структура с пептидом слияния, расположенным ближе к N-терминальному концу. Длина пептида слияния различается в зависимости от вируса, но обычно содержит два или более цистеиновых остатка, стабилизирующих его третичную структуру. У зторого класса пептид слияния находится во вну7ренней области в пределах 60150 аминокислот N-терминалыюй части белка и образует петлю, фланкированная Р-складчатой структурой (Allison et al., 2001). Такая структура организации белка слияния характерна для Е1 белка вируса Синдбис, Е белка вируса леса Семлики, (семейство Тогавирусы) и для гликопротеина Gc(G2) - семейство Буньявирусы.

Исследования выделенного на территории Республики Башкортостан гена гликопротеина G2 (Gc) вируса Ufa-2005 серотипа PUU с использованием пакета программ DNA star и ТМНММ (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM), позволили выявить определенное структурное сходство предполагаемого пептида слияния белка G2 (Gc) вируса Ufa-2005 с пептидом слияния других представителей родов семейства Буньявирусы, а также с представителями семейства Тогавирусы.

Анализ выведенной аминокислотной последовательности выявил некоторые функциональные участки, исходя из чего, нами предложена схема предполагаемого белка слияния вируса, (рис. 4). Также обнаружено соответствие области пептида слияния гликопротеина G2 вируса пептиду слияния у представителей родов семейства Буньявирусы и Тогавирусы.

Трансмембранный участок

i

Предпалагаемый пептид слияния (745-788а.о.)

потенциальные сайты гликолизирования ( аспарагин 261 и 303)

й пептид

Эктодомен

Эндодомен _ *

Сайт расщепления (WAASA654-658a.o.)

Трансмембранный участок

/

Рис. 4. Распределение консервативных аминокислот в гликопротеине G2 Пуумала вируса семейства Буньявирусы.

Показано, что область гликопротеина G2(Gc) (рис. 4), которая соответствует пептиду слияния у представителей родов Тосповирусы, Хантавирусы, Ортобунья-вирусы, Найровирусы, а также для представителей семейства Тогавирусы: SIN, SFV, WEEV и включает 20 - 40 а.о. Консервативные аминокислотные остатки (рис. 5), отмеченные вертикальными стрелками, формируют пептид слияния у представителей вирусов семейства Буньявирусы и Тогавирусы. Идентичность аминокислот, формирующих пептид слияния, в отдельно взятом роду исследованных нами вирусов в пределах одного семейства превышает 70%. Из анализа выведенных аминокислотных последовательностей у вируса Анды пептид слияния занимает участок с 738 по 781 а.о., у вируса Ufa-2005 - с 745 по 788 а.о. и находится в аминоконцевой части гликопротеина G2(Gc).

Выявленные нами аминокислотные последовательности пептида слияния обогащены гидрофобными аминокислотами, в том числе, с высоким углом поворота - глицином и пролином, ароматическими - фенилаланином и триптофаном. Положение цистеиновых остатков, а также триптофана - высококонсервативно, что является важным фактором при формировании третичной структуры гликопротеина

W V ;

ei., J..V..-S.....

■ cj:iciit-!r«omífr£iDTir£ríucirfc:fíU!tc.....

62 ТЯЛ1ШГС 749 - с Y ¿"AV. S к * ö"Y г * а т *снг i i D Y е Í V s «"А ; S' г A D С ( G V '. Т

сг JBOTTAPAUÍW! VIRLIS ÍOtO 39 - с TOA.: S к г т МИ t С S к 1 И 6 т t ч Т А V A : К Р в С Р с I И Г

02 KY-2 • с I С I с К X Y А Г Г ¡> 8 Т к с г г 1 К D Y с ч ! $ » в : $ ? Í о : F Í V 5

сг PiTV - Y б А С в к Y А У Р о т 1С п г t Р Y С F I G G h KD С FC V -, X

сг рои K27 - с Y G S 1 к Y A Y Р * Q Т 3 С Г I I К 0 Y К Г Т С '* С . k ? Р D С r> V

02 PW ÜPA 41 - с т с $ I к Y í * « в ? G С F I í К 0 Y В * т g * с ; N Р Р С f 3 V • Г

G2 ТОТ SOTKAMO • с Y С S Г 1 к Y А 1 Р * в i 3 С F V ?. I 0 > п т с V с : Р ► D С F 3 V -

02 РОТ VRAKICA - с rete: с г Y Л Г р к С т а с г г Е I D У1 Г s с у с ' ч ? Р С f S г

42 WUV m-97 - с Y С $ С 1 I Y A Y ? И в Í а : г i г к с Y i i I 5 * С Г s ? р о с t и V .

сг РОТ КЕИ - с Y С i С к к Y A Y » К Q Т с с Г 1 г К i Y К Y i з V с : S ? ? С { G V ;

С2 PUITV ОИСХ - с i а а с т г Y Y Р И я т к с Н Р I R 0 Г I Y К II W с . S р А С Р G i ■■.

сг DOBY - с Y G А С I к Y 1 Y р * в г 1С1Г t R 0 T S Y (KVC Ь Р A D С t J i :

с? AKLT» VIRUS Y С А Г т к Y I Y Р И R Т Ifltí ? Я fi Y Q 4 т s. с . S г А С 1 V г- г

С2 RTU S7H • с Y С А С Г I Y Y HIT Е С Н Y l В 0 1 4 Y т s и : * р s с е j V

сг ВТИ tío - с Y С А С Т I Y Y р <* а т К С В Y í 11 D Y Q Y т s * з ~ S Р А С t G V т

62 BTKV fi32 • с Y С А С I к Y I Y р и а т R С Я Y 2 R Б Y 5 Y ! $ V G С S ? S С í с V : т

сг SOXRCtíO SC--4 - с Y С А с Т 1 Y Г р и а т К С Н Y £ R D Y Q í i s . с : к г а с р g V ; г

сг SEO «0-3» • с Y С АС Т I y o y p a a r (с с я г I К 0 Y E Y к s * а ; (. ? Р С Р 0 V

сг KAPORAL V1RL'3 - с Г С А С 0 1 x r р а о т 1С Т f l Ж С У С г х с » с Я в D С Р С

сг AÍÜV *H-1 - с Y g А 3 т. Y Y Р * Q ? К С Г Р • R D Г 5 1 той: Р G D С S V т

G2 BUJE RIV2R VIPXS • с y G i i: « к Y I Р ¡» Q Т негр 1 К 0 У Q I Т 5 V С 1 •> ? Р С 5 V •

сг CASO CELGADITO VIRCS VHV--S74 - с Y G I С к * Y A Y Р * Q Т к с г г 2 К 0 Y § У s к V с : !С Í с С Г G V т

сг choclo virus - с Y G А С н к Y Y Р '* Q t К С f F г К D Y Q Y t G « А ; S Р С С I V

Сс IWk MAGUA« Vlfys - с ist: У Í l I им • - и т r i a i» s я с : Е Е Г С L А I Й

Сс BOffiA MOAU VIRUS - с T С с 9 Т D I Р в к к - - * ; Т Г А о 1 Я 5 R V с : Е 1 Г С : 1 А ? я V

Сс bwya víaos - с Т 5 с с Р S N X С В t А • ■ н Т Г S с I " S R * С к е г с l а V и V

Сс NALBO CCSFV Ro» HÜVIV-:OO - с I С 5 С р с X С С С 1 S Т С - L к к i и р а К С »' R . > ? т » С S 0 т

Сс NA1RO CCSFV IbAr 10200 - с Т С 0 с р е * с G С Т S Г С - L К Í £ И Р В R К tf R ' Ч Г т С К G V ;.

Сс kaiso cchfv tuwiy - с Т С 0 с Р с » с G С 1 S ! С - 1 Н( 1 > м н t i : К Р Т К С 1 G т

Сс KAIKO БА2Ш VIíL'S X ПЧ т с Т G D '- р Ä-СССИ $ С - L í í Í с м ММ.' >.' Í Г V с X с V ;

Ge tOSPO СШ-1 т с Т С N С 3 ■ С • X R ir Q А Т С F 0 0 Г С I Т Р S Y '« G : t I А I) С Г А I 1 А т

Сс TOSPO CBNV - с ТС КС к С - I К Q Г. 1 V 5 V 1 о р с V ? р s к * с ; [ Е 1 G С 1 А I 1

Сс tospo msv - с Т G S С н с - гнои V С К 1 D Г С V Т Р s и V з HLSCIA 1 в Е S

Ge TOSPO TCSV . с т с х с A D с К Q К Р V S V L D Г С V Т f S И V G ' Е Е 1 С 1 А 1 в Е S

СС TOSPO T5W - с г с * о D с * К М Q А Í 6 Р р D t С V т Р s y с : Е Е А С Г А 1 я I.A

El SFV A7 - с С G 3 $ i с S т к С К 9 D 0 С - X V Y Т С V Y г к » с с A Y С С С S 1 1» 0

ti sikdbis vucs - с С G S 1 1 С 0 Р А А Я A D 1С • 1 V Г С С V Y ÍKiCCASCFCBS t В S

El WbEV BU - с ces l в с К A S S К A D 1С-* V Г С С V Y г и V в t » j с г г с s 1 Ш Q

Рис. 5. Сравнительный анализ пептидов слияния у представителей семейств Буньявирусы и Альфавирусы.

Для сравнительного анализа и поиска области пептида слияния, из базы данных NCBI были взяты следующие последовательности: семейство Буньявирусы, род Тосповирусы (АВ274026, NC003620, NC008307, AY871097, AY574054), род Ортобуньявирусы (AY286445, AY593725, NC001926); род Найровирусы (DQ206448, DQ211636, DQ81354); род Хантавирусы патогенные (АВ297666, U14136, NC005223, AJ410616, L37903, EF117248, L08754, AF030552, AY363179, AF288656, DQ285047, DQ284451) и Ufa-2005; хантавирусы не патогенные: (U36803, DQ825771, AY363179, L08756, Х55129) и представители семейства Тога-вирусы: Х77425, J02363, DQ422027.

Предполагается, что цистеиновые остатки в пептиде слияния образуют петлю с экспонированным триптофаном, который внедряется в плазматическую мембрану клетки мишени. Дисульфидные связи в пептиде слияния у вируса Анды образуются между 738 и 773 а. о., 754 и 780 а. о. (Tischler et al., 2005), у вируса Ufa-2005 - между 745 и 780 а. о., 761 и 787 а. о. Аминокислотные последовательности в белке слияния у представителей семейств Буньявирусы и Тогавирусы различа-

ются; тем не менее, обнаруживается определенное структурное сходство в положениях аминокислот (глицин, пролин, фенилапанин, триптофан), играющих важную роль в структурной организации пептида слияния. Анализ гидрофобно-гидрофильных профилей El белка у вируса Синдбис и G2 вируса Ufa-2005 также ■ выявил выраженную закономерность между этими белками (за исключением некоторых районов (рис. 6).

Гидрофобно-гидрофильные профили гликопротеинов вирусов практически совпадают, несмотря на то, что вирусы относятся к разным семействам. Вероятно, механизм проникновения вирусов SIN и изолированного нами вируса один и тот же. опосредованный соответственно гликопротеинами El и G2, и, следовательно, определяется общей закономерностью в структурной организации этих белков.

4.5

' 50 100 150 200 250 300 350 400 450 50?

4.5-1

G2 PUU пептид слияния (110-149 а о.) ^

Е1 SIN трансмембранный район (480 499а о.)

Рис. 6. Гидрофобно-гидрофильные профили El белка вируса Синдбис и G2 вируса Ufa-2005 Вертикальными линиями выделены области, соответствующие пептиду слияния и также трансмембранному району у двух вирусов

Сравнительный анализ фрагмента аминокислотной последовательности, соответствующей пептиду слияния гликопротеина G2 вируса Ufa-2005 и аналогичных описанных раннее последовательностей пептидов слияния рода Хантавирусы - HTN, SEU, AND, представителей рода Флебовирусы - SAN, а также представителей семейства Тогавирусы - SIN, SRF позволили выявить значительную гомологию между этими участками. Основываясь на данных сравнительного анализа аминокислотных последовательностей гликопротеинов G2 буньявирусов и El то-гавирусов, мы можем предположить, что гликопротеин G2 изолированного вируса Ufa-2005 относится к белкам слияния.

Клонирование и изучение экспрессии гена С2 вируса Ша-2005

Для подбора праймеров была использована нуклеотидная последовательность штамма СО-1820 (М29979) серотипа Рии. Полученный ПЦР-продукт, представляющий собой фрагмент кДНК копии М-сегмента, длиной 1543 п,н„ соответствующий полной кодирующей последовательности гена 02, был клонирован в вектор рОЕМ-Тсазу. Клонированный ген 02 не имел инициирующего кодона, так как триплет АТС находится в гене белка 01. В связи с этим нами были подобраны праймеры: 5'-ctagtctgaattctggtaatggttcatcacttaattg-3, и

5'- ggttcatgaattcattgtaatggctgccag-3', включающие инициирующий АТО кодон. Для создания экспрессирующей конструкции с геном 02 из вектора р0ЕМ-02 методом ПЦР был наработан полноразмерный ген 02. Амплифицированный фрагмент с АТО кодоном, был встроен в ген 1ас-2 бактериального вектора рВ1иезспр1 II ЯК- после последовательности, кодирующей первые 40 ак. (3-галактозидазы под контролем 1ас-промотора. В результате были получены рекомбинантные клоны рВ1ие5спр1-02 (рис. 7), среди которых после электрофоретического фракционирования в агарозном геле были отобраны плазмиды со вставкой для дальнейшего рестрикционного анализа (рис. 8).

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Рис. 7. Электрофоретический анализ ДНК рекомбинантных клонов. 1,8- плазмида рВЫеэспр!; 2, 6, 7, 9 - плазмида без вставки; 3, 4, 5, 10, 11, 12, 13 - рекомбинантные плазмиды

Для рестрикционного анализа рекомбинантных клонов с целью определения ориентации вставки гена 02, использовали эндонуклеазу РзИ. Уникальный сайт

1М1 имеется в полилинкерной области вектора и в последовательности вставки (сайт для рестриктазы Рей - 243 нуклеотид от 5' концевой части гена).

4287 п.н.

256 п.н.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Рис. 8. Электрофореграмма продуктов рестрикции ДНК рекомбинантных клонов pBluescript-G2, несущих ген G2 белка.

1, 12 - ДНК бактериофага X / BssTI; 2, 4, 6, 7, 8, 9- рекомбинантные клоны pBluescript-G2 : Pstl, не содержащие нужную вставку; 3, 7 - рекомбинантные клоны pBluescript-G2 в прямой ориентации; 5, 11 - рекомбинантные клоны pBluescript-G2 в обратной ориентации.

Гидролиз плазмид серии pBluescript-G2 рестриктазой Pstl, содержащей вставку в прямой ориентации, давал фрагменты длиной 1313 и 3230 п.н., в обратной ориентации - 4287 и 256 п.н.

Предполагалось, что в полученных клонах pBluescript-G2 ген гликопротеина G2 хантавируса Ufa-2005 будет экспрессироваться в Е. coli с образованием гибридного белка в результате снятия репрессии с промоторного участка гена lac Z лактозного оперона индуктором ИПТГ. Секвенирование с использованием прай-мера к Т7 промотору (5 - taatacgactcactataggggaattg - 3') подтвердило, что клонированный ген G2 находится в одной рамке считывания с lac-Z фрагментом. В то же время, после проведения электрофоретического фракционирования в ПААГ-ДСН геле клонов с рекомбинантным вектором pBluescript-G2, которые прокультивировали в условиях индукции, не было обнаружено полосы, соответствующей по массе(57-60 кДа) рекомбинантному белку G2. Причины отсутствия экспрессии белка не удалось выяснить. Поэтому на следующем этапе работы, ген G2 с вектора pBluescript-G2 был вырезан и клонирован в экспрессирующий вектор pPinPoint по сайтам рестрикции HindIII и BamHI (Promega. США). Векторная система pPin-

Point состоит из трех плазмид. Каждая плазмида имеет сдвиг на один нуклеотид в области полилинкера (MCS), что позволяет синхронизировать промотор lac-Z-стрептавидин с клонированным геном.

Определение-пуклеотидных последовательностей рекомбинантных клонов pPinPoint-G2 подтвердило, что ген G2 был клонирован в нужной рамке считывания. При инициации трансляции с AUG кодона должен синтезироваться гибридный белок, включающий 128 а.о. белка стрептавидина и полноразмерный белок G2. Для исследования экспрессии гена G2 вируса Ufa-2005 бактериальные клетки Е. coli (штамм JM109), трансформированные векторами серии pPinPoint-G2, культивировали в условиях индукции. В качестве контроля использовали клетки тех же самых клонов, отобранные до индукции. В большинстве случаев результат был отрицательным, т. е. в опытных образцах белковый продукт с ожидаемой молекулярной массой не был зарегистрирован. Однако в некоторых клонах методом элек-трофоретического фракционирования в ПААГ-ДСН геле было отмечено появление белка, отсутствовавшего в контрольных образцах. Молекулярный вес данного белкового продукта соответствовал молекулярной массе комбинированного стреп-тавидин-02 белка и составил 70-76 кДа. Уровень синтеза рекомбинантного белка в клетках Е. coli значительно варьировал от мало заметной до хорошо видимой полосы на электрофореграмме (рис. 9).

1 2 3 4 5 6

► !. ~—----- • • —ИбкДа

.1 ¿4 i'. * ^кЛ £> ¿t ti'- ^

f • „ 4 £ * J ' Г * - » { - '

в ' •' Г " ; —67 кДа

í s, ,,i t f - с ' V

1 «í^t Ь~ J S—J ■ —45 кДа "_f U ~ —35кДа

. - ¿v' — 25кДа

7 ^.. .i -

—18,2кДа

Рис. 9. ПААГ-ДСН гель-электрофорез белков. 1, 2 - клоны до индукции; 4, 5, 6 - клоны после индукции; 3 - маркерные белки ("Serva", Германия): химотрипсиноген А - 25 кОа, ß-галактозидаза E.coli - 116 кДа, бычий альбумин- 67 кОа, яичный альбумин - 45 кОа, лактат дегидрогеназа - 35 кДа, эндонуклеаза рестрикции Bsp98I - 25кДа, ß-лактоглобин - 18,4 кДа. Стрелкой отмечена полоса, соответствующая белку стрептавидин-02

Определение антигенных свойств рекомбннантного белка С2 вируса Ша-2005 методом ИФА

Антигенные свойства рекомбинантного белка 02 выявили иммунофермент-ным анализом, используя тест-систему для определения антигенов хантавирусов «Хантагност», разработанную Институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН имени М. П. Чумакова, согласно рекомендациям производителя (рис. 10). Оптическую плотность измеряли на спектрофотометрическом оборудовании «Унискан» при длине волны 492нм. Для данной тест-системы положительными считаются пробы, оптическая плотность которых в лунках с антихантавирусным ^0 превосходит оптическую плотность лунок с нормальным 1§0 более чем в 2 раза.

1, 2 3 4,

А В С О Е f в Н

Рис. 10. Иммуноферментный анализ рекомбинантного белка 02

вируса иГа-2005 К+ - контроль с вирусным антигеном К- - нормальный ^О человека

По результатам измерения оптической плотности положительными являются клоны А1 и Н1, разница оптической плотности в которых соответственно равна

о ад & '5 >3 3 I £ ? 2 о ад га Ё 3 3 * з К 5 р

«3 X 3 т га х 5 и

е- с*. в-о х ¿Р = ^ ь о. о, о в

я а га ¡о

А 1,923 0,308 0,273 0,277

В 0.445 0,422 0,362 0,370

С 0,300 0,291 0,289 0,294

0 0.587 0,643 0,416 0,310

Е 0,523 0,608 0,347 0,326

Р 0.374 0,368 0,355 0,313

С 0,402 0,382 0,212 0,267

н 2,303 0,498 1,316 к+ 0,511 К-

6,24 и 4,62. В контроле разница оптической плотности превышала более чем в 2 раза. Остальные образцы показали отрицательный результат, т.е. в них экспрессия рекомбинантного белка происходила с низкой эффективностью. Из результатов иммуноферментного анализа можно сделать вывод, что полученные клоны AI и Н1 штамма Е coli JM 109, трансформированные плазмидой pPinPoint-G2, синтезировали рекомбинантный белок G2.

Заключение

Выделен и получен полноразмерный ген вирусного гликопротеина G2 хан-тавируса Ufa-2005. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей изолированного вируса Ufa-2005 показал, что данный вирус имеет генетически общее происхождение со штаммами, выделенными ранее в Республике Башкортостан из рыжей полевки (Clethrionomys glareolus). Были выявлены замены в нуклео-тидной последовательности выделенного гена G2 от соответствующих участков первичной структуры М-сегмента штаммов: CG-1820, CGI 7, К27. Наличие целого ряда отличий в первичной структуре исследованного участка М сегмента вируса Ufa-2005 требует проведения дополнительных исследований, направленных на установление стабильности и возможности циркуляции вируса в последующие годы.

Сконструированы векторные системы pGEM-G2, pBluescript-G2 и pPinPoint-G2, кодирующие ген гликопротеина G2. Плазмидные конструкции могут использоваться в качестве донора гена G2 при получении рекомбинантной вакцины в дрожжевой векторной системt(Pichiapastoris) и ДНК-вакцины. Следует отметить, что плазмида была получена на основе серотипа PUU - основного возбудителя ГЛПС в Республике Башкортостан.

Выводы

1. Амплифицирован, клонирован и секвенирован ген гликопротеина G2 хан-тавируса, выделенного из-органов грызунов и крови больных во-время вспышки ГЛПС 2001-2005 гг. на территории Республики Башкортостан.

2. Показано, что исследуемый хантавирус Ufa-2005 относится к серотипу Пуумала и имеет общее генетическое происхождение со штаммами, выделенными ранее на данной территории.

3. Из анализа нуклеотидной и выведенной из нее аминокислотной последовательности клонированного гена гликопротеина G2 и сравнение с аналогичными последовательностями исследованных ранее вирусов предполагается, что глико-протеин G2 Ufa-2005 относится к белку слияния.

4. Получена генетическая конструкция на основе вектора pPinPoint, способная экспрессироваться в клетках Е. coli, содержащая полную последовательность кодирующей области гена поверхностного гликопротеина G2 исследуемого ханта-вируса под контролем индуцируемого бактериального промотора lac Z.

5. Показано, что синтезируемый в клетках Е. coli белок G2 содержит антигенные детерминанты, определяемые иммуноферментным анализом тест-системой «Хантагност», и может быть использован для диагностических целей.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хасанова С.С., Хайбуллина С.Ф., Ли Л.Е., Мухаметханов Н.Х., Веселов С.Ю., Кулагин В.Ф. Поиск условий экономичного синтеза рекомбинантного нуклеокап-сидного белка вируса ГЛПС для создания тест-систем // БашГУ. - Итоги биологических исследований за 2000 г. - Уфа. - 2001. вып. 6. - С. 67 - 68.

2. Мухаметханов H. X., Хасанова С.С. Получение и клонирование гена G2 ханта-вируса в вектор pGEM-T // Сборник материалов и тезисов научно-практической конференции «Медицина будущего». - Сочи. -2002. - С. 70.

3. Хайбуллина С.Ф., Хасанова С.С., Магазов Р.Ш., Морзунов С.П, Кулагин В.Ф., Алсынбаев М.М., Ли. Л.Е, Мухаметханов Н.Х. Разработка штаммов - продуцентов

рекомбинантных белков вируса ГЛПСИ БащГУ. - Итоги биологических исследований за 2002 г. -Уфа. - 2003. вып. 8. - С.37 - 42.

4. Мухаметханов Н.Х., Баймиев А.Х., Кулагин В.Ф., Туйгунов М.М. Получение рекомбинантного гликопротеина 02 вируса Пуумала. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции: история изучения и современное состояние эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики. - Уфа.- 2006. -С. 151-156.

5. Мухаметханов Н.Х., Баймиев А.Х. Получение рекомбинантного белка 02 ханта-вируса серотипа Р1Ш // Тихоокеанский медицинский журнал (перечень ВАК). 2008,-№2. С. 86-89.

Отпечатано с готовых диапозитивов в ООО «Пршп+», заказ № 231, тираж 100. 450054, пр. Октября, 71.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мухаметханов, Наиль Ханафиевич

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Общие сведения о геморрагической лихорадке с почечным синдромом.

1.2 Молекулярная биология, филогения и зоогеография хантавирусов.

1.2.1 Зоогеография хантавирусов.

1.2.2 Особенности организации генома хантавирусов

1.2.3 Синтез вирусной РНК и созревание вирионов.

1.2.4 Функции вирусных белков

1.3 Вакцины.

1.3.1. Генно-инженерные вакцины.

1.3.2 ДНК-вакцины. Особенности генетической иммунизации

1.3.3 Преимущества ДНК-вакцин и возможные ограничения в их применении.^

1.3.4 Вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом.

Глава 2 Объект и методы исследований.

2.1 Краткая характеристика объектов исследований.

2.2 Выделение и очистка тотальной РНК из образцов легочной ткани 54 рыжей uoRQBKii.(Clethrionomys glareolus)

2.3 Выделение и очистка суммарной РНК из образцов крови 55 больных, заболевших ГЛПС.

2.4 Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.5 Выделение плазмидной ДНК методом мягкого лизиса

2.6 Удаление РНК из препаратов плазмидной ДНК.

2.7 Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами.^

2.8 Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих 60 условиях

2.9 Препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих 62 условиях

2.10 Синтез кДЬЖ.

2.11 Полимеразная цепная реакция.

2.12 Элюция ДНК из агарозных гелей.

2.13 Концентрирование ДНК бутанолом

2.14 Приготовление компетентных клеток

2.15 Приготовление вектора для клонирования

2.16 Секвенирование ДНК

2.17 Цитирование вектора и фрагмента ДНК

2.18 Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК

2.19 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

2.20 Индукция lac промотора.

2.21 Электрофорез полипептидов Е. coli.

2.22 Твердофазный иммуноферментный анализ.

2.23 Реактивы и материалы.

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ структуры и получение в прокариотической системе рекомбинантного белка G2 хантавируса серотипа пуумала, изолированного из зоонозного очага на территории Республики Башкортостан"

Актуальность проблемы. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - широко распространенное в странах Евроазиатского континента вирусное природно-очаговое заболевание. В Европейской части Российской Федерации на территории Республики Башкортостан (РБ) находится самый крупный и активный природно-зоонозный очаг этого заболевания. Природные очаги в РБ характеризуются высокой эпидемической активностью и являются самыми напряженными в мире. В РБ уровень заболеваемости в 5 - 10 и более раз превышает общефедеративный и составляет 40-60% заболеваемости по России. С 1957 г. по 2003 г. в республике переболело более 70 тыс. человек. Наивысшие показатели достигнуты в 1997 г.: по РБ - 224,5 на 100000 населения, из них 34 случая (0,4%) смертельного исхода (Нургалеева и др., 1999); по г. Уфе - 512, а по Благовещенскому р-ну - 1059. Серологическими методами была установлена принадлежность возбудителя данной вспышки к серотипу PUU. В Восточной Сибири и на Дальнем Востоке ГЛПС с более тяжелой формой и смертностью от 1% до 12%, вызывается серотипом Сеул (SEU) и Хантаан (HTN). Актуальность изучения проблемы обусловлена отсутствием тенденции к снижению заболеваемости, тяжестью течения с развитием различных тяжелых осложнений (токсико-инфекционный шок, почечная недостаточность, разрыв почек, тромбогеморрагический синдром, кровоизлияние) и значительным экономическим ущербом. К сожалению, на сегодняшний день еще не получены эффективные специфические средства для профилактики и этиотропной терапии ГЛПС. Динамика заболеваемости ГЛПС в республике характеризуется эпидемическими вспышками каждые 3— 4 года. Подобные вспышки связаны с массовым размножением рыжих полевок и высоким уровнем инфицированности грызунов - природного резервуара для вируса. Кроме того, подъем заболеваемости ГЛПС в годы с низкой численностью полевок, а также отличия в тяжести инфекционного процесса могут быть вызваны, в том числе и антигенной вариабельностью и разной степенью патогенности циркулирующих на территории республики Башкортостан штаммов хантавирусов, возбудителей ГЛПС. Передача вируса от грызуна к человеку происходит в основном воздушно-капельным путем и через экскременты животных (Avsic-Zupanc et al., 1995; Chu et al., 1994; Schmaliohn et al., 1985). Ежегодно по всему миру фиксируется более 150-200 тысяч случаев заболевания ГЛПС. Эффективность лечения любого заболевания определяется его точной диагностикой на раннем этапе заболевания.

Для диагностики ГЛПС наиболее широко используются методы, основанные на детекции специфических антител. В этих методиках используется фиксированный ацетоном антиген, полученный из культуры клеток Vero Е6, инфицированных патогенным хантавирусом (Lee et al., 1985). Получение подобного препарата является весьма трудоемкой и небезопасной процедурой. Альтернативой традиционному получению антигена может стать рекомбинантный вирусный белок, синтезированный в про- или эукариотической системе экспрессии. При наличии эффективных штаммов-продуцентов получение рекомбинантного белка потребует значительно меньше времени, кроме того, отсутствует необходимость работы с вирусом.

Разработанные и лицензированные на сегодняшний день вакцинные препараты для профилактики ГЛПС представляют собой «живые» аттенюированные вакцины, созданные на основе вирусов серотипов HTN и SEU, циркулирующих, преимущественно, в странах Азии - Китае и Южной Корее (Song et al., 1998; Lee et al., 2001). К тому же, по ряду сообщений, указанные вакцинные препараты индуцируют низкий уровень синтеза нейтрализующих антител у иммунизированных людей. На территории России основным возбудителем ГЛПС является вирус серотипа PUU, и поэтому нет оснований утверждать, что данные вакцины окажут эффективное профилактическое действие. Альтернативой обычным вакцинам разрабатываются и уже разработаны рекомбинантные вакцины, например, от гепатита В и С (Спасокукоцкий, 2000). Стратегия создания таких вакцин сводится к клонированию гена, чей продукт при экспрессии в подходящей системе приведет к продукции белка, способного вызвать при введении в организм человека синтез вируснейтрализующих антител, против данного вируса. Еще одним направлением в области рекомбинантных технологий является разработка ДНК-вакцин. Принцип ДНК-вакцинации основан на введении в организм векторной ДНК, несущей гены белков, продукция которых приведет к полноценному иммунному ответу. Данный подход позволил получить антитела к множеству антигенов инфекционных патогенов вирусной и бактериальной природы (Dertzbaugh et al., 1997). В настоящее время в ряде стран Западной Европы, а также в Китае, Южной Корее активно ведутся исследования, направленные на создание ДНК-вакцин для лечения и профилактики ГЛПС. Однако до введения ДНК-вакцин в медицинскую практику необходимо провести длительные эксперименты для того, чтобы подтвердить их эффективность и безопасность.

Цель работы заключалась в исследовании структуры гена поверхностного гликопротеина G2 хантавируса, выделенного из зоонозного очага на территории Республики Башкортостан и создании системы получения рекомбинантного белка G2 в клетках Е. coli.

Задачи исследования:

1. Амплификация, клонирование и секвенирование гена гликопротеина G2 хантавируса, выделенного из органов грызунов и крови больных ГЛПС на территории Республики Башкортостан;

2. Анализ нуклеотидной и выведенной из нее аминокислотной последовательности клонированного гена гликопротеина G2 и сравнение с аналогичными последовательностями исследованных ранее вирусов;

3. Получение генетической конструкции, содержащей ген поверхностного гликопротеина G2 исследуемого хантавируса, способного экспрессироваться в прокариотической системе;

4. Получение рекомбинантного белка G2 в клетках Е. coli.

Научная новизна. Из результатов проведенных нами исследований установлено, что на территории Республики Башкортостан циркулирует хантавирус Ufa-2005 серотип PUU. Определена полная последовательность кодирующей области гена G2. Получены генно-инженерные конструкции на основе векторов pGEM Teasy, pBluescript и pPinPoint, включающие в себя кодирующую область гена гликопротеина G2 хантавируса серотипа PUU, экспрессия которого регулируется бактериальным lac промотором. Показана возможность экспрессии полноразмерного белка G2 хантавируса серотипа Пуумала в Е. coli (штамм JM 109).

Практическая значимость Полученные результаты расширяют и дополняют представления о структуре нуклеотидной и белковой последовательностей хантавируса, который циркулировал на территории Республики Башкортостан и являлся причиной вспышки заболевания ГЛПС в 2001-2005гг. Ген G2 из плазмидных конструкций можно использовать для получения штамма-продуцента гликопротеина, для диагностических целей, ДНК-вакцины и рекомбинантной вакцины.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов (Уфа, 2000); на Всероссийской научно-практической конференции «Медицина будущего» (Сочи, 2002); на Всероссийской конференции с международным участием «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение», посвященной 100-летию основания филиала «Иммунопрепарат» (Уфа, 2005); «История изучения и современное состояние эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики» (Уфа, 2006). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей и тезисы научных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 157 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 125 страницах и содержит 18 рисунков и 3 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Мухаметханов, Наиль Ханафиевич

ВЫВОДЫ:

1. Амплифицирован, клонирован и секвенирован ген гликопротеина G2 хантавируса, выделенного из органов грызунов и крови больных во время вспышки ГЛПС 2001-2005 г.г. на территории Республики Башкортостан.

2. Показано, что исследуемый хантавирус Ufa-2005 относится к серотипу Пуумала и имеет общее генетическое происхождение со штаммами, выделенными ранее на данной территории.

3. Из анализа нуклеотидной и выведенной из нее аминокислотной последовательности клонированного гена гликопротеина G2 в сравнении с аналогичными последовательностями исследованных ранее вирусов следует, что гликопротеин G2 Ufa-2005 относится к белку слияния.

4. Получена генетическая конструкция на основе вектора pPinPoint, способная экспрессироваться в клетках Е. coli, содержащая полную последовательность кодирующей области гена поверхностного гликопротеина G2 исследуемого хантавируса под контролем индуцируемого бактериального lac промотора.

5. Показано, что синтезируемый в клетках Е. coli белок G2 содержит антигенные детерминанты, определяемые иммуноферментным анализом тест-системой «Хантагност», и может быть использован для диагностических целей.

Заключение

В результате проведенных исследований, нами был выделен и получен полноразмерный ген вирусного гликопротеина G2 хантавируса Ufa-2005. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей изолированного вируса Ufa-2005 показал, что вирус имеет генетически общее происхождение со штаммами, выделенными ранее в Республике Башкортостан из рыжей полевки {Clethrionomys glareolus). Были выявлены замены в нуклеотидной последовательности выделенного гена G2 от соответствующего участка первичной структуры М-сегмента штаммов: CG-1820, CG17, К27. Наличие целого ряда отличий в первичной структуре исследованного участка М-сегмента вируса Ufa-2005 требует проведения дополнительных исследований, направленных на установление стабильности и возможности появления другого варианта вируса в последующие годы.

Сконструированы векторные системы pGEM-G2, pBluescript-G2 и pPinPoint-G2, кодирующие ген гликопротеина G2. Плазмидные конструкции могут использоваться в качестве донора гена G2 при получении рекомбинантной вакцины в дрожжевой векторной системе(Р/с/?ш pastoris) и ДНК-вакцины. Следует отметить, что плазмида была получена на основе серотипа PUU - основного возбудителя ГЛПС в Республике Башкортостан.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мухаметханов, Наиль Ханафиевич, Уфа

1. Alexeyev О., Elgh F., Zhestkov A., Wadell G., Juto P. Hantaan and Puumala vitus antibodies in blood donors in Samara, an HFRS-endemic region in European Russia // Lancet. 1996. - V. 347. - P. 1483-1494.

2. Alff P., Sen N., Gorbunova E., Gavrilovskaya I.N., Mackow E.R. The NY-1 Hantavirus Gn cytoplasmic tail coprecipitates TRAF3 and inhibits cellular interferon responses by disrupting TBK1-TRAF3 complex formation //J Virol. 2008. - V. 82.-P. 9115-9122

3. Andersson H., Barth B.-U., Ekstrom M. Garoff H. Oligomerization-dependent folding of the membrane fusion protein of Semliki Forest virus. J. Virology. 1997. - V. 71. - P. 9654-9663.

4. Antic D., Lim B.-U., Kang C.Y. Molecular characterization of the M genomic segment of the Seoul 80-39 virus;nucleotide and amino acid sequence comparisons with other hantaviruses reveal the evolutionary pathway // Virus Res. 1991. - V. 19. - P. 47-58.

5. Antic D., Lim B.-U., Kang C.Y. Nucleotide seqvuence and coding capacity of the large (L) genomic RNA segment of Seoul 80-39 virus a mamber of the hantavirus genus // Virus Res. 1991. - V. 19. - P. 59-66.

6. Antic D., Wright K.E., Kang C.Y. Maturation of Hantaan virus glicoprotein G1 and G2 // Virology. 1992. - V. 189. - P. 324-328.

7. Antic D., Wright K.E., Kang C.Y. Maturation of Hantaan virus glycoproteins G1 and G2 // Virology.- 1992. V. 189. - P. 324-328.

8. Antic D., Yong Kang C., Kristin S., Schamaljohn C., Vapalahti O., Vaheri A. Comparison of the deduced gene of the L, M, S genom segments of hantaviruses // Virus Res. 1992. - V. 24. - P. 35-46.

9. Arikawa, J., Takashima, I., Hashimoto, N. Cell fusion by haemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) viruses and its application for titration of virus infectivity and neutralizing antibody // Arch Virology 1985. - V. 86. -P. 303-313.

10. Avsic-Zupanc Т., Toney A., Anderson K., Chu Y.K., Schmaliohn C.S. (1995). Genetic and antigenetic properties of Dobrava virus: a unique member of the Hantavirus genus, family Bynyaviridae // J. Gen. Virol. -1995.-V. 76.-P. 2801-2808.

11. Babiuk L.A., Lewis J., Suradhat S., Baca-Estrada M., Foldvari M., Babiuk S. Polynucleotide vaccines: potential for inducing immunity in animals // J. Biotechnol. 1999. - V. 73. - P. 131-140.

12. Barry M., Johnston S. Biological features of genetic immunization // Vaccine. 1997. -V. 15. - P. 788-791.

13. Beaty B. J., Miller B.R., Shope R.E., Rozhon E.J., Bishop D.H. Molecular basis of bunyavirus per os infection of mosquitoes: role of the middle-sized RNA segment // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V. 79. - P. 12951297.

14. Beaty B.J., Rozhon B.R., Gensemer P., Bishop D.H. Formation of reassortant buniaviruses in dually infected mosquitoes // Virology. 1981. -V.lll.-P. 662-665.

15. Boshart M., Weber F., Jahn G., Dorsh-Hasler K., Fleckenstein В., Schaffner W. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. // Cell. 1985. - V. 44. - P.521-530.

16. Bowen M.D., Kariwa H., Rollin P.E., Peters C.J., Nichol S.T. Genetic charaterization of a human isolate of Puumala hantavirus from France // Virus Res. 1995. - V. 38. - P. 279-89.

17. Chapman B.S., Thayer R.M., Vincent K.A., Haigwood N.L. Effect of intron A from human cytomegalovirus immediate-early gene on heterologous expression in mammalian cells // Nuc. Acids Res. 1991. - V. 19. - P. 3979-3986.

18. Chen S.-Y., Compans R.W. Oligomerization, transport, and Golgi retention of Punta Того virus glycoproteins // Virology. 1991. - V. 65. - P. 59025909.

19. Chomczynski P., Sacchi N.// Anal. Biochem. 1987. -V. 162. -P.156-59.

20. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium-thiocyanate-phenol-chlorofonn extraction // Anal. Biochem. — 1987.-V. 162.-P. 156-159.

21. Chu Y.K., Jenning G., Leduc J.W., Lee H.W., Schmaliohn C.S., Dalrymple J.M. Serologgical relathionships among viruses in the Hantavirus genus, family Bunyaviridae // Virology. 1994. - V. 198. - P. 196-204.

22. Clare J.J., Rayment F.B., Ballantine S.P., Sreekrismna K., Romanos M.A. High-level expression of tetanus toxin fragment С in Pichia pastoris strainscontaining multiple tandem integrations of the gene // BioTechnology. -1991.-V. 9.-P. 455-460.

23. Collett M.S. Messenger RNA of the M segmeent RNA of Rift Vallay fever vurus//Virology.- 1986.-V. 151.-P. 151-156.

24. Combet C., Blanchet C., Geourjon C., Deleage G. NPS network protein sequence analysis // Trends Biochem. Sci. 2000 - V. 25. - P. 147-150.

25. Corver J., Ortiz A., Allison S.L., Schalich J., Heinz F.X., Wilschut, Membrane fusion activity of tick-borne encephalitis virus and recombinant subviral particles in a liposomal model system // Virology. 2000. - V. 269, 37-46.

26. Davis H.L., Michel M.L., Whalen R.G. DNA-based immunization induces continuous secretion of hepatitis-B surface-antigen and high-levels of circulating antibody // Human Mol. Genet. 1993. - V. 2 - P. 1847-1851.

27. Donelly J., Ulmer J., Shiver J., Margaret A. DNA vaccines // Annu. Rev. Immunol. 1997. - V. 15. - P. 617-648.

28. Easterbrook J.D., Klein S.L. Immunological mechanisms mediating hantavirus persistence in rodent reservoirs // PLoS Pathog. -2008 V. 4. -P.42-49.

29. Eisenberg D., Liithy R., Bowie J.U. VERIFY3D: assessment of protein models with three-dimensional profiles. Methods // Enzymol. 1997. - V. 277. - P. 396-404.

30. Elliot R.M. Molecular biology of the Buniaviridae // J. Gen. Virol. 1990. -V. 71-P. 501-522.

31. Epand R.M. Fusion peptides and the mechanism of viral fusion // Biochim. Biophys. Act.-2003.- V. 1614.-P. 116-121.

32. Ferreira G., Monteiro G., Prazeres D., Cabral J. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications // Trends. Biotechnol. 2000. - V. 18. - P.380-388.

33. Gallaher W.R., DiSimone M.J., Buchmeier M.J The viral transmemrane superfamily possible divergence of Arenavirus and Filovirus glycoproteins from a common RNA virus ancestor // Microbiol. -2001. — V. 1. — P.24—34

34. Garcin D., Lezzi M., Dobbs M., Elliot R.M., Schmaljiohn C., Kang C.Y., Kolakofsky D. The 5'-ends of Hantaan virus (Buniaviridae) RNAs suggest a prime-and-realign mechanism for the initiation of RNA synthesis // J. Virol. 1995. - V. 69. - P. 5754-5762.

35. Gibbons D.L., Vaney M.-C., Roussel A., Vigouroux A., Reilly В., Lepault, J., Kielian M., Rey F.A. Conformational change and protein-protein interactions of the fusion protein of Semliki Forest virus // Nature. 2004. -V. 427.-P. 320-325.

36. Giulian G.G. Resolution of low molecular weight polypeptides in a non-urea sodium dodecyl sulfate slab polyacrylamid gel system // Fed. Proc. 1985. -V. 44.-P. 686-693.

37. Gonzalez-Scarano F., Janssen R., Najar J.A., Pobjecky N., Nathanson N. An avirulent G1 glycoprotein variant of La Crosse bunyavirus with defective fusion function // J. Virol. 1985. - V. 54. - P. 757-763.

38. Guirakhoo F., Heinz F.X., Mandl C.W., Holzmann H., Kunz C. Fusion activity of flaviviruses: comparison of mature and immature (prMcontaining) tick-borne encephalitis virions // J. Gen. Virol. 1991. - V. 72. -P. 1323-1329.

39. Hacker J.K., Hardy J.L Adsorptive endocytosis of California encephalitis virus into mosquito and mammalian cells: a role for G1 // Virology. 1991. -V. 235.-P. 40-47.

40. Hardestam J., Karlsson M., Falk K.I., Olsson G., Klingstrom J., Lundkvist A. Puumala hantavirus excretion kinetics in bank voles (Myodes glareolus) II Emerg. Infect. Dis. 2008 -V.14. - P. 1209-1215

41. Henikoff S., Henikoff J.G. Protein family classification based on searching a database of blocks // Genomics. 1994. - V. 19. - P. 97-107.

42. Hernandez L.D., Hoffman L.R., Wolfsberg T.G., White J.M. Virus-cell and cellcell fusion // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1996. - V.12.- P. 627-661.

43. Hjelle В., Chavez G., Torrez N., Yates S., Sarisky J., Webb J., Ascher M. Genetic identification of a novel hantavirus of the harvest mouse Reithrodontomys megalotis // J. Virol. 1994. - V. 68. - P. 6751-6754

44. Holand J.J., Spindler K.Horodyski F. Rapid evolution of RNA genomes // Science. 1982 -V.215. - P.1577-1585.

45. Hooper J., Kamrud K., Eigh F., Custer D., Schmaliohn C. DNA vaccination with Hantavirus M segment elicit neutralizing antibodies and protects against Seoul virus infection // Virology. 1999. - V. 255. - P.269-278.

46. Huang H., Li X., Zehua Z. Genetic immunization with Hantavirus vaccine combining expression of G2 glycoprotein and fused interleukin-2 // Genetic Vaccines and Therapy. 2008. - v. 6. - P. 15-21.

47. Ikegami Т., Won S., Peters C.J., Makino S. Characterization of Rift Valley Fever Virus Transcriptional Terminations // J. Virol. 2007 — V. 16 - P. 8421-8438.

48. Janssen R ., Nathanson N., Endres M.J., Gonzalez-Scarano F. Virulence of La Crosse virus is under polygenic control // J. Virol. 1986. - V. 59. - P. 1-7.

49. Jardetzky T.S., Lamb R.A. Structure of the parainfluenza virus 5 F protein in its metastable prefusion conformation // Nature 2004. - Vol. 438. - P. 38^44.

50. Jin M., Park J., Lee S. Hantaan virus enters cells by clathrindependent receptor-mediated endocytosis // J.Virol 2002. - V. 294. - P. 60-69.

51. Kallio-Kokko, Leveelahti R. Human immune response to Puumala virus glycoproteins and nucleocapsid protein expressed in mammalian cells // Hannimari Journal of Medical Virology-2001. V. 65. - P. 605-613.

52. Kamrud K., Hooper J., Eigh F., Schmaljohn C. Comparison of the protective of naked DNA, DNA-based Sindbis replicon, and packaged Sindbis replicon vectors expressing hantavirus structural genes in hamsters // Virology. -1999.-V. 263.-P. 209-219.

53. Kim T.-Y., Choi Y., Cheong H.-S., Choe J. Identification of a cell surface 30 kDa protein as a candidate receptor for Hantaan virus // J. Gen. Virol. -2002.- V. 83.-P. 767-773.

54. Krautkramer E., Zeier M. Hantavirus Causing Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome Enters from the Apical Surface and Requires Decay-Accelerating Factor (DAF/CD55) // J. Virol. 2008 - V.82. - P. 4257-4264.

55. Kyte J., Doolittle, R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein // J. Mol. Biol. 1982. - V. 157. - P. 105-132.

56. Lai W.C., Bennett M., Johnston S.A., Barry M.A., Pakes S.P. Protection against Mycoplasma -pulmonis infection by genetic vaccination // DNA Cell Biol. 1995.-V. 14.-P. 643-651.

57. Lee H.W., Baek L.J., Johnson K.M. Isolation of Hantaan virus, the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever with renal syndrom in humans // Arch. Virol. Suppl. 1982. - V. 1. - P. 35-47.

58. Lee H.W., Lee P.W. Korean hemorrhagic fever. I. Demonstration of causative antigen and antibodies // Korean J. of Internal Medicine. 1976. -V. 19.-P. 371-383.

59. Lee P.W., Amyx H.L., Gajdusek D.C., Yanagihara R.T., Goldgaber D., Gibbs C.J. New hemorrhagic fever with renal syndrome-related virus in rodents in the United States // Lancet. 1982. - V. 2. - P. 1405-1411.

60. Lee P.W., Gibbs С .J., Gajdusek D.C., Yanagihara R. Serotypic classification of hantaviruses by indirect immunofluorescent antibody and plaque reduction neutralization tests // J. Clin. Microbiol. 1985. - V. 22. -P. 940944.

61. Lescar J., Roussel A., Wien M.W., Navaza J., Fuller S.D., Wengler G., Wengler G., Rey F.A. The fusion glycoprotein shell of Semliki Forest virus: an icosahedral assembly primed for fusogenic activation at endosomal Ph // Cell -2001. V. 105.-P. 137-148.

62. Lewis P.J., Cox G.J.M., Hurk S., Babiuk L. Polynucleotide vaccines in animals: enhancing and modulating responses // Vaccine. 1997. - V. 15. -P.861-864.

63. Liang M., Li D., Xiao S.Y., Hang C., Rossi C.A., Schmaliohn C.S. Antigenic and molecular characterization of hantavirus isolates from China // Virus. Res. 1994. - V. 31. - P. 219-233.

64. Lober C., Anheier В., Lindow S., Klenk H.-D., Feldmann H. The Hantaan virus glycoprotein precursor is cleaved at the conserved pentapeptide WAASA // Virology. 2001. - V. 289. - P. 224-229.

65. Lorenz I.C., Allison S.L., Heinz F.X., Helenius A. Folding and dimerization of tickborne encephalitis virus envelope proteins prM and E in the endoplasmic reticulum // J. Virol. 2002. - V. 76. - P. 5480-5491.

66. Lundkvist A., Bjorsten S., Niklasson B. Immunoglobulin G subclass responses against the structural components of Puumala virus // J. Clin. Microbiol. 1993. -V. 31. - P. 368-372.

67. Marquardt Т., Helenius A. Misfolding and agregation of newly synthesized proteins in the endoplasmic reticulum // J. Cell Biol. 1992. - V. 117. - P. 505-513.

68. McAleer W.J., Buynak E.B., Maigetter R.Z., Wampler D.E., Miller W.J., Hilleman M.R. Human hepatitis В vaccine from recombinant yeast // Nature. -1984. V.307. - P. 178-180.

69. McCaughey C., Shi X., Elliot R.M., Wyatt D.E., O'Neill H.J., Coyle P.V. Low pH-induced cytopathic effect a survey of seven hantavirus strains // J. Virol. Methods. - 1999.-V. 81.-P. 193-197.

70. Mir A.M., Panganiban A.T. A protein that replaces the entire celluler elF4F complex //J.EMBO 2008. - P. 1 - 11

71. Moreau P., Hen R., Wasylyr В., Everett R., Gaub M. P., Chambon P. The SV40 72 base pair repeat has a striking affect on gene expression both in SV40 and other chimeric recombinants // Nucl. Acids Res. 1981. - V. 9. -P. 6047-6068.

72. Ogino M. Cell Fusion Activities of Hantaan Virus Envelope Glycoproteins // J. Virol. 2004. - Vol. 78. - P. 10776-10782.

73. Parrington M.A., Lee P.-W., Kang C.Y. Molecular characterization of the Prospect Hill virus M RNA segment: a camparison with the M RNAsegment of other hantaviruses // J. of Gen. Virol. 1991. - V. 72. - P. 1845— 1854.

74. Patterson J.L., Cabradilla C., Holloway B.P., Obueski J.F., Kolakofsky D. La Crosse virions contain a primer-stimulated RNA polymerase and a methylaited cap-dependent endonuclease // J. Virol. 1984. - V. 52. - P. 215-222.

75. Pfarr D.S., Rieser L.A., Woychik R.P., Rottman F.M., Rosenberg M., Reff M.E. Differential effects of polyadenylation regions on gene expression in mammalian cells // DNA. 1986. - V.5. - P. 115-122.

76. Philpott M., Hioe C., Sheerar M., Hinshaw V.S. Hemagglutinin mutations related to attenuation and altered cell tropism of a virulent avain influenza A virus // J. Virol. 1990. - V. 64. - P. 2941-2947.

77. Pisetsky D.S. Immunostimulatory DNA: a clear and present danger // Nat. Med. 1997. - V. 3. - P. 829-831.

78. Poch O., Sauvaget I., Delarue M., Tordo N. Identification of four conserved motif among the RNA-dependent polymerare encoding elements // J.Embo. 1989. - V. 8. - P. 3867-3879.

79. Polo J.M., Belli B.A., Driver D.A., Frolov I., Sherrill S., Hariharan M.J. Stable alphaavirus packaging cell lines for Sindbis virus and Semliki Forest virus derived vectors // Prot. Natl. Acad. Sci.USA. - 1999. - V. 96. -P.4598-4603.

80. Porter D.C., Wang J., Moldoveanu Z., McPherson S., Morrow C.D. Immunization of mice with poliovirus replicons expressing the C-fragment of tetatus toxin protects agains lethal challenge with tetanus toxin // Vaccine. 1997. - V. 15.-P. 257-264.

81. Puthavathana P., Lee H.-W., Kang C.Y. Typing of Hantaviruses from five continents by polymerase chain reaction // Virus Res. -1992. -V.26. -P. 614.

82. Raz E., Carson D.A., Parker S.E. Intradermal gene immunization: the possible role of DNA uptake in the induction of cellular immunity to viruses //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. -V. 91. - P. 9519-9523.

83. Robinson H. Nucleic acid vaccines: an overiew // Vaccine. 1997. - V. 15. -P. 785-787.

84. Rodriguez F., Whitton J. Enhancing DNA immunization // Virology. -2000. V. 268. - P. 233-238.

85. Rouse B.T. Induction of mucosal immunity against herpes simplex virus by plasmid DNA immunization // J. Virol. 1997. - V.71. - P. 3138-3145.

86. Rowe J.E., Jeor S.C., Riolo J., Otteson E.W., Monroe M.C., Henderson W.W., Ksiazek T.G., Rollin P.E., Nichol S.T. Coexistence of several novel hantaviruses in rodents indigenousto North America // Virology. 1995. -V. 213.-P. 122- 130.

87. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. // Molecular cloning: a laboratory manual./ 1989. p 134.

88. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - V.74. -P.5463-5467

89. Sarzottii M., Dean T.A., Remington M.P., Ly C.D., Furth P.A., Robbins D.S. Induction of cytotoxic T cell responses in newborn mice by DNA immunization // Vaccine. 1997. - V. 15. - P. 795-797.

90. Schmaliohn A.L., Li D.L., Negley D.L., Bressler D.S., Turell M.J., Korch G.W., Ascher M.S., Schmaliohn C.S. Isolation and initial characterization ofa newfound Hantavirus from California // Virology. 1995. - V. 206. - P. 963-972.

91. Schmaliohn C., Chu Y., Schamaljohn A., Dalrymple J. Antigenic subunits of Hantaan virus expressed by baculovirus and vaccinia virus recombinants //J. Virol. 1990. -V. 64. -P. 3162-3170.

92. Schmaliohn C.S., Jennings G.B., Hay J., Dalrymple J.M. Coding strategy of the S genome segment of Hantaan virus // Virology. 1986. - V. 155. -P. 633-643.

93. Schmaliohn C.S., Schmaliohn A.L., Dalrymple J.M. Hantaan virus M RNA coding strategy nucleotide sequence and gene order // Virology. — 1987.-V. 157.-P. 31-39.

94. Sealey P.G., Southern E.M. Gel electrophoresis of DNA // In: Gel Electrophoresis of Nucleic Acids. A practical approach. IRL Press, Oxford. -1982.-P. 39-76.

95. Seder R. DNA-vaccines-designer vaccines for the 21st century // The New England J. of Medicine. 1999. - V. 341. - P. 277-278.

96. Shope R.E., Rozhon E.J., Bishop D.H.L. Role of the middle-sized bunyavirus RNA segment in mouse virulence // Virology. 1981. - V. 174. -P. 79-86.

97. Song G. Successful development of inactivated cell culture vaccine against HFRS in China // Proc. the fotht international conference on HFRS and Hantaviruses, USA. 1998. - P. 102-113

98. Song J.W., Baek L.J., Nagle J.W., Schlitter D., Yanagihara R. Genetic and pathogenetic hantavirus from white-footed mouse (Peromyscus leucopus) latter //Lancet. 1996.- V. 344.-P. 1637-1648.

99. Song J.-W., Kang H.J., Gu S.H., Moon S.S., Bennet S.N., Song K.-J., Baek L.J., Kim H.-C., Guinn M.L., Chong S.-T., Klein T.A., Yanagihara R. Characterization of Imjin Virus, a newly isolated hantavirus from the Ussuri

100. White-Toothed Shrew (Crocidura lasiura) //j.Virol. 2009. - V.83. - P.6184-6191

101. Spiropoulou C.F., Albarino C.G., Ksiazek T.G., Rollin P.E. Andes and Prospect Hill hantaviruses differ in early induction of interferon although both can down regulate interferon signaling // J. Virol. 2007 - V.81. - P. 2769-2776.

102. Spiropoulou C.F., Morzunov S., Feldmann H., Sanchez A., Peters C.J., Nichol S.T. Genome structure and variability of a virus causing Hantavirus pulmonary syndrome // Virology. 1994. - V. 200. - P. 715-723.

103. Stafford D.W., Bieber D. Concentration of DNA solutions by extraction with 2-butanol // Biochim. Biophys. Acta. 1975. - V.378. - P.18-21.

104. Steege D.A. 5'- Terminal nucleotide sequence of Escherichia coli lactose repressor mRNA. Features of translational initiation and reinitiation sites // PNAS. 1977. -V. 74. - P. 4163-4167.

105. Stohwasser R., Raab K., Darai G., Bautz E.K. Primary structure of the large (L) RNA segment of nephropathia epidemica virus strain Hallnas B1 coding for the viral RNA polymerase // Virology. 1991. - V. 183. - P. 386-391.

106. Sundin D.R., Beaty B.J., Nathanson N., Gonzalez-Scarano F.A G1 glycoprotein epitope of La Crosse virus: a determinant of infection of Aedes triseriatus // Science. 1987. - V. 235. - P. 591-593.

107. Tang D.C., Devit M., Jonston S.A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response // Nature. 1992. - V. 356. - P. 152-154.

108. Taylor S., Frias-Staheli N., Garcia-Sastre A., Schmaljohn C. Hantaan virus nucleocapsid protein binds to importin a proteins and inhibits tumor necrosis factor alpha-induced activation of nuclear factor kappa В / J. Virol. 2009.- V. 83.-P. 1271-1279.

109. Valenzuela P., Medina A., Rutter W., Ammerer G., Hall B. D.Synthesis and assembly of hepatitis В virus surface antigen particles in yeast // Nature.- 1982. V.298. - P. 347-350.

110. Vapalahti O., Lundkvist A., Kallio-Kokko H., Paukku K., Julkunen I., Lankinen H., Vaneri A. Antigenic properties and diagnostic of Puumalavirus nucleocapsid protein expressed in insect cells // J. Clin. Microbiol. -1996.-V. 34.-P.l 19-125.

111. Wells J.M., Wilson P.W., Norton P.M., Gasson M.J., Le Page R.W. Lactococcus lactis: High-level expression of tetanus toxin fragment С and protection against lethal challenge // Mol. Microbiol. 1993. - V.8. - P. 1155-1162.

112. Wolff J.A., Malone R.W., Williams P. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo // Sience. 1990. - V.247. - P. 1465-1468.

113. Xiang Z.Q., Spitalnik S., Tran M., Wunner W.H., Cheng J., Ertl H. Vaccination with a plasmid vector carrieng the rabies virus glycoprotein gene induces protective immunity against rabies virus // Virology. 1994. — V. 139. - P.132-140.

114. Xiao S.Y., Liang M., Schmaliohn C.S. Molecular and antigenic characterization of HV114, a hantavirus isolated from a patient with renal syndrom in China // J. Gen. Virol. 1993. - V. 74. - P. 1675-1679.

115. Xiao S-Y., Ledus J.W., Chu Y.K., Schmaliohn C.S. Phylogenetic analyses of virus isolates in the genus Hantavirus, family Bunyaviridae // Virology. -1994.-V. 198.-P. 205-217.

116. Yamasaki K., Weihl C., Roos R. Alternative translation initiation of Theiler's murine encephalomyelitis virus // J. of Virol. -1999. V.73. -P.8519-8526.

117. Yanigahara R., Svedmyr A.L., Lee P., Goldgaber D., Gajdusek D.-C., Gibbs Jr., Nystrom K. Isolation and propagation of nephropathia epidemica virus in bank voles // Scand. J.Infect. Dis. 1984. - V. 16. - P. 225-228.

118. Yokoyama N., Maeda K., Mikami T. Recombinant viral vector vaccines for the veterinaiy use // J. Vet. Med. Sci. 1997. - V.59. - P.311-322.

119. Yong-K.C., Gerald В., Jennings, Connie S., Schmaljohn A., Vaccinia Virus-Vectored Hantaan Virus Vaccine Protects Hamsters from Challenge with Hantaan and Seoul Viruses but Not Puumala Virus // Ft. Detrick, Frederick 21702-50.

120. Yoshimatsu K., Yoo Y., Yoshida R., Ishihara C., Azuma I., Arikawa J. Protective immunity of Hantaan virus nucleocapsid and envelope protein studies baculovirus expressed proteins // Arch. Virol. -1993. Vol. 130. — P.365-376.

121. Гловер. Д. Новое в клонировании ДНК. Методы./ М. Мир, 1989. 346 с.

122. Дебабов В.Г. ДНК-вакцинация и генотерапия на основе транзиентной экспрессии нуклеиновых кислот в соматических клетках человека и животных // Мол. Биол. 1997. - Т. 31. - С. 209-215.

123. Дзагурова Т.К. и др., // Акт. пробл. вир. 1999. - Т.2. С.60

124. Льюин. Гены. / М. Мир 1987. 544 с.

125. Магазов Р.Ш., Кулагин В.Ф., Хайбуллина С.Ф. ГЛПС некоторые современные аспекты лечения и профилактики // Сборник статей «Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом - пути решения проблемы». - Уфа. - 1995. - С. 5-9.

126. Спасокукоцкий А. Генные вакцины. Актуальность разработки новых вакцин // Еженедельник Аптека. 2000. - №229. - С. 1-7.

127. Фазлыева P.M., Хунафина Д.Х., Камилов Ф.Х. Сборник статей

128. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом в республике» Башкортостан. // Уфа. 1995. С. 243-250.

129. Филдс Б. Н., Найп Д.М., Мэрфи Ф.А., Харрисон С., Уайли Д., Ройзман Б., Холланд Д. Дж., Рэмиг Р. Ф., Шоуп Р., Кауфман Р., Пенмен Ш., Грин М., Лоуи Д. Вирусология. М. / Мир. 1989.492 с.

130. Якименко и др., Природно-очаговое заболевания человека // Сб. научных работ. 2001. - С.32-39.