Анализ структурно-функциональных механизмов взаимодействия каталаз и НАДФН2 методами компьютерного моделирования

Егоров, Дмитрий Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ структурно-функциональных механизмов взаимодействия каталаз и НАДФН2 методами компьютерного моделирования
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Анализ структурно-функциональных механизмов взаимодействия каталаз и НАДФН2 методами компьютерного моделирования"

Егоров Дмитрий Александрович

АНАЛИЗ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МЕХАНИЗМОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КАТАЛАЗ И НАДФН2 МЕТОДАМИ КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ

Специальность 03.03.01 - Физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з ' [./АР 2011

Екатеринбург — 2011

4841869

Работа выполнена на кафедре клинической лабораторной и микробиологической диагностики ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель Доктор медицинских наук, профессор

Цвиренко Сергей Васильевич

Официальные оппоненты Доктор биологических наук

Данилова Ирина Георгиевна

Доктор биологических наук, профессор Цейликман Вадим Эдуардович

Ведущая организация - ГОУ ВПО «Челябинский государственный педагогический университет» Министерства образования и науки Российской Федерации

Защита состоится «-¿X» ОЛл^г-ИЛ 2011 г. в ^ часов на заседании совета по защите кандидатских и докторских диссертаций Д 004.027.01 при учреждении РАН Институте иммунологии и физиологии УрО РАН по адресу: 620049, Российская Федерация, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, 106.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке УрО РАН (620041, г. Екатеринбург, ул. С. Ковалевской, д. 22/20), с авторефератом — на сайте учреждения РАН Института иммунологии и физиологии УрО РАН -http://www.iip.uran.ru

Автореферат разослан «I/) » Л&^ЙА/ 2011 г.

Ученый секретарь совета по защите кандидатских и докторских диссертаций Д 004.027.01 при учреждении РАН Институте иммунологии и физиологии УрО РАН, доктор медицинских наук, профессор И. А. Тузанкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Монофункциональные гем-содержащие каталазы - гетерогенная группа ферментов, проявляющих наибольшую активность в катализе реакции разложения пероксида водорода (Н202), токсичного продукта утилизации молекулярного кислорода. Исследования последних лет показали, что Н202 играет важную роль в передаче внутри- и межклеточных сигналов и задействован в регуляции фагоцитоза (Марквичева К. Н. и др., 2010), воспалительных процессов (Rahman I. et al., 2006), клеточной пролиферации (Peus D. et al., 1999) и апоптоза (Плстюшкина О. Ю. и др., 2006). Показано, что каталазы, устраняющие действие Н202, имеют важное значение в предотвращении апоптоза (Yabuki et al., 1999), регуляции воспалений (Rahman I. et al., 2006), развитии опухолей (Miyamoto et al., 1996). Каталазы участвуют в снижении токсического действия солей тяжелых металлов (Calderón I. L. et al., 2006). Получены данные об эволюционном приспособлении молекулярной структуры каталаз к участию в функционировании каскада арахидоновой кислоты (Oldham М. L. et al., 2005).

Относительно недавно обнаружено, что каталазы человека и животных, некоторых грибов и бактерий образуют устойчивые комплексы с НАДФН2 (Kirkman Н. N. et al., 1984; Chelikani P. et al., 2004). Показано, что НАДФН2 модулирует физиологическую активность этих ферментов, предохраняя их от необратимого ингибирования пероксидом водорода (Kirkman Н. N. et al., 1987, Andreoletti P. et al., 2009) или обеспечивая их участие в других реакциях (Heck D. Е. et al., 2003; Calderón I. L. et al., 2006). Однако, структура комплексов не позволяет объяснить механизм этих эффектов (Hillar A. et al., 1994; Olson L. P. et al., 1995, Heck D. E. et al., 2010). Точно неизвестны также механизмы связывания каталаз и НАДФН2. Нерешенность этих вопросов обусловлена ограничениями экспериментальных методов. Компьютерный анализ и моделирование молекулярных взаимодействий позволяют преодолевать экспериментальные ограничения и получать надежно обоснованные выводы о

структуре и свойствах молекулярных ассоциатов при сопоставлении результатов с экспериментальными данными. Поэтому применение компьютерного подхода актуально для выявления структурно-функциональных механизмов взаимодействия каталаз и НАДФН2, и, в первую очередь, механизмов связывания этих молекул друг с другом. Результаты такого исследования могут служить основой для определения механизмов участия НАДФН2 в проявлении физиологической активности этих ферментов, а также лучшему пониманию функциональной роли каталаз.

Цель исследования

Изучить структурно-функциональные механизмы связывания каталаз и НАДФН2 методами компьютерного анализа и моделирования.

Задачи исследования

1. Определить существование общих структурных особенностей каталаз, способствующих или предотвращающих связывание НАДФН2.

2. Построить модели комплексов каталаз с НАДФН2 и его фрагментами, провести их анализ.

3. Оценить влияние строения сайтов связывания НАДФНг в каталазах на геометрию комплексов.

4. Выявить функциональные механизмы, определяющие способность каталаз к образованию комплексов с НАДФН2.

Научная новизна

Впервые выполнено выравнивание аминокислотных последовательностей 14 каталаз с учетом их трехмерной структуры на основании анализа которого показано отсутствие в каталазах общих структурных компонентов взаимодействия с НАДФНг- Модельные расчеты комплексов каталаз с неорганическими монофосфатами позволили впервые предложить структуру этих комплексов и продемонстрировать близость расположения неорганических фосфатов к 2'-фосфатной группе НАДФН2. Для каталазы «А» БассИагошусез сегеч'^ае предсказаны ранее экспериментально не установленные конфигурации комплексов с 2',5'-АДФ и НАДФН2. Впервые с

применением моделирования подтверждена гипотеза о влиянии различий в строении сайтов связывания НАДФН2 на геометрические характеристики комплексов. Выявлены важные функциональные механизмы, определяющие способность каталаз к взаимодействию с НАДФН2.

Практическая значимость работы

Результаты анализа механизмов связывания каталаз с НАДФН2 создают предпосылки для более глубокого понимания физиологической роли этих ферментов, их участия в воспалительных реакциях, регуляции клеточной пролиферации и опухолевого роста. Уточнение функциональной роли каталаз будет способствовать разработке более эффективных методов лечения заболеваний, обусловленных диерегуляцией этих фундаментальных физиологических процессов. Примененная методика построения и оценки моделей комплексов каталаз с НАДФН2 и его фрагментами может быть полезна при исследовании других лиганд-рецепторных комплексов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В каталазах различие аминокислотных последовательностей сайтов связывания НАДФН2 определяет не только прочность комплексов, но и геометрию связанного лиганда.

2. Примененная методика моделирования позволяет получать важные сведения о структуре и механизмах формирования комплексов каталаз и НАДФН2.

3. Связывание 2'-фосфата НАДФН2 является важным функциональным механизмом, определяющим способность каталаз к образованию устойчивого комплекса с динуклеотидом, — в несвязываюших НАДФН2 каталазах отсутствует специализированный сайт для этого фрагмента.

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертационной работы использованы в лекциях и практических занятиях по теме «Современные подходы к компьютерному моделированию биохимических процессов» кафедры биохимии и по теме «Энзимология» кафедры клинической лабораторной и микробиологической

диагностики ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России.

Апробация работы

Результаты работы доложены на V Симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических заболеваний» (Москва, 2007), на семинаре по проблемам компьютерного моделирования лаборатории квантовой химии и спектроскопии Института квантовой химии твердого тела УрО РАН (Екатеринбург, 2008), на научной конференции «Физиология и патология нейтрофилов», посвященной 165-летию со дня рождения И. И. Мечникова и 65-летию Победы в ВОВ, отдела общей патологии ЦНИЛ Уральской Государственной Медицинской Академии (Екатеринбург, 2010) и на Российской конференции с международным участием «Фундаментальные вопросы гематологии. Достижения и перспективы» (Екатеринбург, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 4 работы. Из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, семи глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка печатных работ и приложений. Она изложена на 217 страницах, содержит 39 рисунков, 21 таблицу. Указатель литературы включает 220 работ, в том числе 211 — в зарубежных изданиях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Выравнивание каталаз

Выравнивание аминокислотных последовательностей 14 каталаз (таблица 1) с учетом их пространственной структуры проведено в программе «Chimera» (Meng Е. С. et al., 2006). Все координаты получены из Белковой Базы Данных (Protein Data Base, PDB, Bernstein F. et al., 1977; Berman H. M. et al., 2003).

Таблица 1 - Каталазы для выравнивания аминокислотных последовательностей

№ Каталаза (аббревиатура) Код PDB Комплекс НАДФН2 Ссылка

I Каталаза эритроцитов человека (ЧЭК) IDGB прочный Putnam С. D. et al., 1995

2 Бычья печеночная каталаза (БПК) 7САТ прочный Fila I. et al., 1985

3 Каталаза Proteus mirabilis (ПМК) 2САН прочный Gouet P. et al., 1995

4 Каталаза Micrococcus luteus (МЛК) 1GWH слабый Murshudov G. N. et al., 2002

5 Каталаза «A» Saccharomyces cerevisiae (КАТА) 1А4Е слабый Mate M. J. et al., 2004

6 Каталаза Enterococcus faecalsis (ЭФК) 1SI8 да Hakansson К. O. et al., 2004

7 Каталаза Vibrio salmonicida (ВСК) 21 SA да Riise E. K. et al., 2007

8 Каталаза Helicobacter pylori (ГПК) 1QWL нет Loewen P. C. et al., 2004

9 Каталаза «Ф» Pseudomonas syringae (КАТФ) 1M7S нет Carpena X. et al., 2003

10 Каталаза Exiguobacterium oxidotolerans (ЕКТА) 2J2M нет Нага I. et al., 2007

11 Гидропероксидаза II Escherichia coli (ГПН) 1GGE нет Bravo J. et al., 1999

12 Каталаза Pénicillium vitale (ПВК) 2IUF нет Murshudov G. N. et al., 2002

13 Каталаза-1 Neurospora crassa (НКК-1) 1SY7 нет Diaz A. et al., 2004

14 Каталаза-3 Neurospora crassa (НКК-3) 3EJ6 нет Diaz A. et al., 2009

Моделирование комплексов

Построение моделей комплексов проводили для трех каталаз - ЧЭК, КАТА и ГПК. Поскольку среди прочно связывающих НАДФН2 каталаз структура ЧЭК определена наиболее точно, моделирование этого комплекса позволяет детально отследить влияние вариаций структуры лиганда и рецептора на формирование комплекса. В слабом комплексе КАТА и НАДФН2 конфигурация лиганда неизвестна, однако для него получена электронная плотность. Вследствие особенностей первичной структуры в КАТА динуклеотид может располагаться иначе, чем в прочно связывающих каталазах. Поэтому определение конфигурации этого комплекса представляет несомненный интерес, а интерпретация результатов может быть обоснована экспериментальными данными. ГПК не связывает НАДФН2, однако в соответствующем сайте этого фермента нет очевидных препятствий для

размещения лиганда и анализ взаимодействий ГПК с ним может способствовать выявлению важных функциональных механизмов молекулярной ассоциации каталаз и НАДФН2.

В ЧЭК, КАТА и ГПК с помощью программы «AutoDock-3.05» (Morris G. М. et al., 1998) встраивали неорганические монофосфаты (Н2РО4', НРОД Р043" ) и 2',5'-АДФ^, наиболее важные для связывания фрагменты НАДФН2, и собственно НАДФН24\ С помощью собственной реализации набора параметров и функций «MMFF94s» (Halgren Т. А., 1996) рассчитали энергии образования комплексов в кристаллографических и модельных конфигурациях. Провели кластерный анализ лигандов (средне-квадратическое отклонение, с.к.о., между минимальной по энергии моделью и всеми остальными моделями в кластере < 0,5 А). Анализ результатов проводили также с помощью диаграмм «с.к.о. от минимальной модели - энергия», построенных в программе «OpenOffice Cale». С помощью программы «Chimera» провели визуальный анализ геометрии комплексов и подготовку иллюстраций.

Результаты и их обсуждение

Выравнивание каталаз

При анализе результатов выравнивания 14 каталаз с учетом их пространственной структуры выявлено значительное разнообразие аминокислотных последовательностей в сайтах связывания НАДФН2 или соответствующих им сайтах в несвязывающих это лиганд ферментах.

В каталазных комплексах НАДФНг наибольшее количество контактов с белком образуют аденин, 2'-фосфат, пирофосфат, никотинамидрибозид, а адениновая рибоза меньше вовлечена в межмолекулярные взаимодействия.

В образующих наиболее прочные комплексы с НАДФН2 ЧЭК и БПК важную роль в связывании адениновош гетероцикла играют (в нумерации ЧЭК) фенилаланин-198, аргинин-203, фенилаланин-446, валин-450 и лейцин-451 и серин-201, гидроксил боковой цепи которого образует водородную связь с NH26-экзоциклической группой аденина.

Фенилаланин-198 в ЧЭК и фенилаланин-197 в БПК стерически

препятствуют размещению аденина, однако смешение боковых цепей этих аминокислот при связывании лиганда устраняет препятствие для аденина (Putnam С. D. et al., 1995). Соответствующие им изолейцины в ПМК, КАТА, ВСК и ЭФК имеют менее объемные боковые цепи и не препятствуют связыванию аденина, так же как и зафиксированный водородной связью в оптимальном положении тирозин-183 в MJIK. В несвязывающих НАДФН2 каталазах в этой позиции расположены остатки с более объемными и малоподвижными боковыми цепями - триптофан или лейцин, препятствующие правильной ориентации аденина. Однако, в ЕКТА соответствующее положение занимает гистидин-179, не конфликтующий с аденином. Серии, соответствующий серину-201 в ЧЭК, найден в И каталазах. В MJ1K здесь находится глицин, в - треонин, а в ПВК - аланин. Фенилаланину-446 в ЧЭК и -445 в БПК соответствует лейцин в остальных 5 связывающих динуклеотид каталазах и в нссвязывающей его КАТФ, фенилаланин в БПК, ГПН, ПВК, НКК-1 и НКК-3, валин-427 в ЕКТА, мешающий никотинамидной рибозе, и тирозин-432 в ГПК, препятствующий связыванию аденина. Валину-450 в ЧЭК соответствует валин еще в 3 НАДФН2-связывающих каталазах (БПК, КАТА и МЛК), а в 3 других - лейцин. В 6 из 7 не связывающих НАДФН2 каталазах эту позицию занимает серин, а в седьмой - - аргинин-430. Большое разнообразие остатков обнаружено в каталазах в позиции, соответствующей лейцину-451 ЧЭК, без явной связи с образованием комплекса с НАДФН2. Лейцин здесь обнаружен в БПК, ПМК, КАТА, ЭФК, ГПК, НКК-3 и ПВК. Соответствующие метионин-474 в НКК-1, глутамин-515 в ГПН и тирозин-448 в КАТФ конфликтуют с аденином, а метионин-429 в ВСК, метионин-431 в ЕКТА и фенилаланин-438 в МЛК размещению аденина не препятствуют.

Во всех изученных НАДФН2-связывающих каталазах в позиции, соответствующей аргинину-203 в ЧЭК, также обнаружен аргинин. Гуанидиновая группа этого аргинина связывает 2'-фосфат, а вдоль его протяженной углеводородной боковой цепи расположен аденин. Вероятно, присутствие этого остатка является необходимым, но недостаточным условием

для связывания НАДФНг, поскольку этот аргинин также присутствует в 3 (ГПК, НКК-1 и ГПН) из 7 каталаз, не образующих устойчивый комплекс с динуклеотидом. В 2 других ферментах (КАТФ, ЕКТА) в соответствующей позиции расположены глутаматы, электростатически отталкивающие 2'-фосфат, а еще в 2 -гистидин (-196, ПВК) и аспарагин (-234, НКК-3), короткие боковые цепи которых не способны к оптимальному связыванию 2'-фосфата и аденина. В большинстве НАДФНг-связывающих каталаз с 2'-фосфатом взаимодействует еще одна аминокислота с катионной боковой цепью. В ЧЭК, ВПК, КАТА и ЭФК это лизин, а в ПМК - аргинин. В МЛК реализован иной структурный механизм и в соответствующей позиции в ней находится изолейцин-222, а функциональный аргинин-295 расположен там, где в других НАДФНг-связывающих каталазах лежит лейцин. В ВСК изолейцину-222 в МЛК соответствует валин-216, а роль второй катионной аминокислоты играет, возможно, лизин-433, которому в других изученных каталазах соответствуют глутамат или глутамин. В 4 несвязывающих НАДФНг каталазах в соответствующих позициях находится лизин (КАТФ, ГПН, ПВК и НКК-3). Гистидин-218 в ГПК, валин-218 в ЕКТА и треонин-258 в НКК-3 имеют слишком короткие боковые цепи и, вероятно, не могут обеспечить связывание 2'-фосфата. В КАТФ глутамат-310 занимает позицию, аналогичную аргинину-295 в МЛК, и может препятствовать размещению 2'-фосфата вследствие электростатического отталкивания.

В прочно связывающих НАДФНг каталазах пирофосфат интенсивно взаимодействует с гистидином-305, -304 и -284 (в ЧЭК, БПК и ПМК соответственно). Еще только в ВСК в этой позиции также находится гистидин. В образующих слабые комплексы с НАДФН2 МЛК, КАТА и ЭФК соответствующую позицию занимает глутамин, конфигурация которого препятствует связыванию по крайней мере, 5'-аденинового фосфата. Однако в КАТА обнаружена вставка из 2 аминокислот, отсутствующих в 13 других каталазах - лизин-455 и глутамин-456. В занимаемом положении лизин-455 может продуктивно взаимодействовать с пирофосфатом, а глутамин-456,

возможно, вовлечен в дополнительные взаимодействия с аденином. В каталазах, не связывающих динуклеотид, гистидину-305 ЧЭК соответствуют глутаматы (ЕКТА, ПВК, ГПП, НКК-1, НКК-3), треонин (ГПК), либо деления в КАТФ. Примечательно, что в следующей позиции в ЕКТА, ПВК, ГПИ, НКК-1, НКК-3 также находятся аминокислоты с отрицательно заряженной боковой группой, вызывающей электростатическое отталкивание пирофосфата. В КАТФ здесь также находится делеция, в ГПК - глутамин, а в других каталазах - не препятствующие связыванию пирофосфата остатки - лизин, глицин, аланин.

В ЧЭК гистидин-194 образует с 2'-гидроксилом никотинамидной рибозы водородную связь. В других связывающих НАДФН2 и в 4 (ГПН, ПВК, НКК-1 и НКК-3) не образующих устойчивый комплекс с динуклеотидом каталазах аналогичную позицию также занимает гистидин. Соответствующее положение в ЕКТА занимает аспарагин-175, в ГПК - тирозин-175, а в КАТФ - аргинин-196. В двух последних случаях возникает стерический конфликт с никотинамидной рибозой. В ЧЭК карбонильный кислород главной цепи глутамина-442 связан водородной связью с З'-гидроксилом рибозы. Глутамин в соответствующей позиции найден еще в 12 каталазах, а в ГПН здесь находится гистидин-507. Консервативность аминокислот в этой позиции и использование их главной цепи в межмолекулярных контактах свидетельствуют о неспецифичном связывании никотинамидной рибозы.

Связывание никотинамида НАДФНг каталазами также в большой степени неспецифично и обусловлено вовлечением консервативных остатков или взаимодействием с главными цепями аминокислот. Так, во всех 14 каталазах к каталитическому атому С4 никотинамида обращен пролин. В 13 из 14 каталаз рядом с амидным кислородом никотинамида находится атом CEI имидазольного кольца гистидина (-235 в ЧЭК), и только в ЕКТА в такой позиции находится аргинин-216, стерически препятствующий размещению никотинамида. В 5 связывающих НАДФН2 каталазах карбонильный кислород главной цепи триптофана находится на расстоянии образования водородной связи с NH2-rpynnoif никотинамида. В МЛК это положение занимает

изолейцин-288, а в ЭФК - валин-282. В несвязывающих динуклсотид ГПК, ЕКТА, КАТФ и НКК-1 в соответствующей позиции также расположен триптофан, в ГПП - изолейцин-360, в ПВК - валин-296 и в НКК-3 - лейцин-334. Важную роль в формировании окружения никотинамида играет валин-302 в ЧЭК и соответствующие ему остатки валина в БПК, ПМК, 1САТА, ВСК или треонина в МЛК и ЭФК. В несвязывающих НАДФН2 каталазах здесь расположены лейцин, изолейцин, аспартат или фенилаланин, стерически препятствующие размещению никотинамида и связанной с ним рибозы.

Полученные данные свидетельствуют о том, что каталазы используют индивидуальные механизмы взаимодействия с динуклеотидом, а общие элементы первичной структуры, определяющие их способность к такому взаимодействию, отсутствуют. В связывании адениновой половины молекулы лиганда каталазы используют специфические аминокислоты, а в ассоциации с никотинамидом задействованы также общие как для связывающих, так и для несвязывающих НАДФН2 каталаз остатки. В высокомолекулярных ферментах соединительная петля между общей для всех каталаз коровой структурой и флаводоксин-подобным доменом создает дополнительное препятствие для связывания НАДФН2. Эти результаты соответствуют полученным ранее данным по выравниванию аминокислотных последовательностей некоторых каталаз с учетом пространственной структуры (Mate М. J. et al., 1999, Chelikani P. et al., 2004) и существенно расширяют их за счет исследования большего числа ферментов и использования более совершенного инструментария.

Моделирование НАДФН2 и его фрагментов в ЧЭК

В кристаллографическом комплексе ЧЭК и НАДФН2 только две субъединицы - «А» и «С» связаны с лигандом, а две другие - «В» и «D» находятся в свободной состоянии. Предполагается, что структура свободных субъединиц в кристалле соответствует их структуре в растворе. Кроме того, положение боковых цепей аминокислот в сайтах связывания НАДФН2 в свободных субъединицах несколько отличается от их положения в комплексе с лигандом. Особенно этот эффект выражен в субъединице «D» (Putnam С. D. et al., 1995).

Проведенное моделирование неорганических монофосфатов в ЧЭК позволило надежно определить сайт связывания монофосфатной группы во всех 4 субъединицах фермента (таблица 1). Модели наиболее близких к 2'-фосфату по физико-химическим свойствам НР042' и Р043~ находятся в непосредственной близости от кристаллографического положения этого фрагмента, однако слегка отклоняются от него.

В субъединицах «А»-«С» Н2Р04" также близок к положению 2'-фосфата НАДФНг, однако смещен от него несколько больше, чем НР042" и Р043\ Большее отклонение Н2Р04" согласуется с меньшим соответствием свойств этой формы монофосфата и 2'-фосфата НЛДФН2 в условиях моделирования (pH 7,0) или выделения комплекса (pH 8,5). В субъединице «D» финальная модель Н2Р04" (с минимальной энергией) находится между гемовыми карбоксилатами, а ближайшая к 2'-фосфату модель значительно отклонена от него и характеризуется более высокой энергией (таблица 2). Измененная структура субъединицы «D» в сайте размещения НДДФН2 может препятствовать связыванию Н2Р04", но, согласно результатам моделирования, не НР042" и Р043'.

В ЧЭК может существовать специализированная область, а не отдельный сайт связывания монофосфатных групп. Так, энергии 2'-фосфата в формах НР042" и Р043_ (-283,710 и -442,422 ккал/моль соответственно) в субьединице «А» из экспериментальной структуры близки к энергиям смещенных от этого фрагмента моделей НР042" и РО43" (таблица 2). Существование такой зоны в каталазах может способствовать более продуктивному захвату лиганда, а также облегчать подгонку других фрагментов НАДФН2 к наиболее оптимальному их положению в сайте связывания. Результаты моделирования неорганических фосфатов в ЧЭК подтверждаются экспериментальными данными. Структуры комплексов каталаз и неорганических монофосфатов неизвестны. Однако смещение моделей от НР042" и Р043" от экспериментального положения 2'-фосфата в ЧЭК близко к смещению S042" от 2'-фосфата НАДФН2 в ПМК. Кроме того, в НАДФ(Н2)-связывающих ферредоксинредуктазс из шпината (ФРШ, Bruns С. М. et al., 1995) и человеческой эритроцитарной глутатион-редуктазе (ЧЭГР, Pai Е. F. et al., 1988)

экспериментальное положение неорганического монофосфата также близко, но не совпадает с положением 2'-фосфата НАДФ(Н2). В двух последних ферментах неорганический фосфат не обнаружен в области расположения пирофосфатной группы, также, как и при моделировании, хотя в ПМК одна из молекул БО/" близка к положению 5-никотинамидного фосфата. Вероятно, область у 2'-фосфата обладает наибольшей аффинностью к монофосфатной группе, а сайт связывания пирофосфата - к ди фосфату. Связывание же сульфата, вследствие различий в физико-химических свойствах с монофосфатом, может быть менее специфичным. Таблица 2 - Результаты моделирования неорганических фосфатов в ЧЭК

Фосфат (формула) Цепь Комплекс с НАДФНг с.к.о. от 2'-фосфата «МШТ94з»-энергия, ккал/моль Минимум энергии

Н2Р04" «А» + 1,095 -146,019 +

«В» - 1,142 -154,535 +

«С» + 1,185 -148,657 +

«О» - 3,642 -79,445 -

НР042" «А» + 1,149 -299,136 +

«В» - 1,193 -281,524 +

«С» + 1,063 -296,110 +

«О» - 2,191 -255,309 +

Р043' «А» + 1,094 -444,926 +

«В» - 1,343 -428,026 +

«С» + 1,089 -463,160 +

«Э» - 2,242 -415,490 +

Каталазы, образующие устойчивый комплекс с НАДФН2, связывают также и 2',5'-АДФ. Однако структура комплексов с дифосфатом неизвестна (НШаг А. й а1., 1994). Финальная модель 2',5'-АДФ в конформации, которую он имеет в НАДФН2 из кристаллографического комплекса с ЧЭК, значительно отклонена от экспериментального положения (с.к.о. 3,880 А), что главным образом связано с расположением 5'-фосфата в сайте никотинамидного амида. Финальная модель 2',5-АДФ, полученная при варьировании конформации, также существенно отклонена от кристаллографической конфигурации (с.к.о. 4,225 А). Она некорректна (2'-фосфат расположен у гуанидина аргинина-203,

5'-фосфат - вблизи 2'-фосфата в кристалле, аденин и рибоза выведены из своих сайтов) и отличается от ригидной модели (с.к.о. 4,619 Ä). Однако энергия 2',5'-АДФ из экспериментальной структуры НАДФН2 в ЧЭК (-363,653 ккап/моль) значительно ниже минимальной энергии моделей (-326,778 ккал/моль). Очевидно, ошибка связана с позиционированием 5'-фосфатного фрагмента при построении моделей в «AutoDock». Свободный 2',5'-АДФ в ФРШ и ЧЭГР связывается в очень близкой конфигурации к той, в которой он находится в этих ферментах в составе НАДФ(Н2) (Bruns С. М. et ai., 1995, Pai Е. F. et al„ 1988). При этом, вероятно, 5'-адениновый фосфат связывается в положении пирофосфатной группы, только если другие фрагменты 2',5'-АДФ расположены корректно. Применение «MMFF94s» позволяет отобрать корректную конфигурацию комплекса, если учитывать экспериментальные данные.

Модель НАДФН2, полученная при встраивании его в ЧЭК (в кристаллографической конформации), незначительно отклоняется от экспериментального положения (максимальное с.к.о. 0,341 А). Хотя различия малы, экспериментальная геометрия имеет более низкую энергию (-314,791 против -308,679...-304,233 ккал/моль у моделей). Кроме того, 2',5'-АДФ из этих моделей НАДФН2 обладает меньшими энергиями, чем из экспериментальной конфигурации НАДФН2 (-372,970...-371,947 ккал/моль). Эти результаты, при их сопоставлении с экспериментальными данными для ФРШ и ЧЭГР, свидетельствуют о том, что в ЧЭК свободный 2',5'-АДФ занимает положение, близкое, но не совпадающее с положением в составе НАДФН2. Таким образом, эта конфигурация 2',5'-АДФ может соответствовать реальному положению свободного дифосфата в ЧЭК.

При варьировании конформации НАДФН2 получены три модели с минимальными энергиями (-206,008, -202,199 и -195,302 ккал/моль). В 2 минимальных моделях отсутствуют критические ошибки размещения фрагментов и значительные препятствия для их правильной реориентации. В первой модели большая часть молекулы близка к экспериментальному положению (с.к.о. 2',5'-АДФ - 1,144 А, 5'-аденинового фосфата - 0,485 Ä, 5'-

никотинамидного — 0,561 Â), а никотинамидрибозид отклонен к амиду боковой цепи аспарагина-449 на открытом участке поверхности белка (с.к.о. 6,919 Â). Во второй модели 2'-фосфат лежит около своей позиции в кристалле (с.к.о. 1,754 А), аденин и 5-адениновый фосфат - в центре сайта без контактов с белком, адениновая рибоза смещена к аммонию боковой цепи лизина-237, 5'-никотинамидный фосфат близок к 5'-адениновому в кристалле (с.к.о. 1,546 Â), никотинамидрибозид расположен на открытом участке у пролина-304. Таким образом, эти модели могут отражать промежуточные этапы образования комплекса. Отклонение третьей модели от экспериментального положения (СКО 2,153 À) обусловлено поворотом никотинамидного кольца на 180° вокруг оси, соединяющей атомы С1-С4. Поскольку остальные фрагменты молекулы прочно связаны, а никотинамид лежит в узком сайте, реориентация ниюотинамида значительно осложнена. Хотя существование этой конфигурации маловероятно, оно возможно (при низком заселении). Так, схожее обращение положения никотинамидного кольца (с непродуктивным связыванием) предполагается в комплексе НАД+ и лактатдегидрогеназы из мышц морской собаки Scualus acanthias (Vincent S. J. F. et al., 1997).

Моделирование НАДФН2 и его фрагментов в КАТА

В КАТА обнаружена вставка лизина-455, отсутствующая в других выровненных каталазах. 5'-фосфат НАДФН2 из ЧЭК находится в КАТА ближе к аммонийной группе лизина-455 (4,534 Â), чем к амиду боковой цепи глутамина-302 (5,359 Â), соответствующего гистидину-305 ЧЭК, а положение амида глутамина-302 препятствует его продуктивному взаимодействию с 5'-фосфатом. Поскольку электронная плотность для 5-фосфата НАДФН2 из БПК (и ЧЭК) в КАТА не видна (Mate M. J. et al., 1999), можно предполагать, что 5'-фосфат в КАТА связывается лизином-455.

В КАТА модели неорганических монофосфатов найдены в двух сайтах. Н2Р04" расположен вне сайта связывания НАДФН2 между гистидином-191, лизином-298, аспартатом-442, глутамином-445 и аланином-446. Модели РО43" и НР042' находятся около 2'-фосфата НАДФН2 из ЧЭК (максимальные с.к.о. 1,546

и 1,618 А соответственно). Так как в КАТА 2'-фосфату НАДФН2 из ЧЭК соответствует четкая электронная плотность (Mate М. J. et al., 1999), модельное положение НР042' и Р043" корректно. Поскольку энергия 2'-фосфата НАДФН2 из ЧЭК в формах РО4" и НРО„г" (-488,221 и -316,805 ккал/моль соответственно) существенно выше энергии моделей Р043* и НР042" (максимальные значения -559,386 и -386,555 ккал/моль соответственно), модельный сайт НР04:" и Р043" близок или совпадает с реальным сайтом связывания 2'-фосфата в КАТА.

В КАТА модели 2',5'-АДФ отклонены от 2',5'-АДФ в НАДФН2 из ЧЭК (минимальное с.к.о. 2,163 А). При этом 5-адениновый фосфат удален от его позиции в НАДФН2 из ЧЭК (минимальное с.к.о. 2,358 А), что согласуется с отсутствием электронной плотности в этом сайте (Mate М. J. et al., 1999). В моделях 2',5'-АДФ в КАТА с минимальной энергией образования комплекса 2'-АМФ лежит около 2-АМФ НАДФН2 из ЧЭК, которому соответствует четкая электронная плотность (Mate М. J. et al., 1999), а 5'-фосфат находится у аммония боковой цепи лизина-455. В ЧЭК и КАТА сайты размещения 2-АМФ имеют сходное строение, однако энергия 2',5'-АДФ из ЧЭК в КАТА (-434,404 ккал/моль) намного выше минимальных модельных значений (-591,030... -546,265 ккал/моль), и, согласно результатам расчетов и экспериментальным данным по распределению электронной плотности, если и реализуется, то с низкой вероятностью. Таким образом, в настоящей работе впервые получена обоснованная структура комплекса 2',5'-АДФ и КАТА.

Финальная модель НАДФН2 в КАТА удалена от НАДФН2 из ЧЭК (с.к.о. 4,035 А) и имеет заметно более низкую энергию (-441,418 против -364,679 ккал/моль). В этой модели 2',5'-АДФ близок к минимальной по энергии модели свободной 2',5'-АДФ (с.к.о. 1,672 А), пирофосфат расположен у аммония боковой цепи лизина-455, никотинамидная рибоза замещает 5'-никотинамидный фосфат НАДФН2 из ЧЭК, а никотинамид - никотинамидную рибозу. Таким образом, отбор моделей НАДФН2 определяется схожим с другими каталазами размещением 2-АМФ и локализацией пирофосфата у аммония боковой цепи лизина-455. Полученные результаты согласуются с

данными рентгеноструктурного анализа и отбором моделей комплексов КАТА с неорганическими фосфатами и 2',5-АДФ. Однако никотинамидная половина молекулы лиганда в отобранной модели расположена в КАТА иначе, чем в ЧЭК, что определяется альтернативным размещением пирофосфата. Таким образом, результаты расчетов и экспериментальные данные свидетельствуют о том, что отобранная модель комплекса НАДФН2 в КАТА соответствует его реально существующей и ранее не установленной конфигурации, а отклонение пирофосфатной группы НАДФН2 в КАТА от глутамина-302 к лизину-455 подтверждает сформулированную для комплекса МЛК и НАДФН2 гипотезу о различных вариантах размещения этого лиганда в разных каталазах (МигБЬис1оу в. N. й а1., 2002).

Моделирование НАДФН2 и его фрагментов в ГПК

В ГПК финальные модели неорганических фосфатов расположены между гемовыми карбоксилатами каждой из субъединиц. В отличие от ЧЭК, в ГПК различия в положении аминокислот между субъединицами незначительны. Гем связывается кагалазными мономерами (7ашоску М. ег а1., 1999), поэтому конкуренция со стороны многочисленных фосфорилированных соединений за этот сайт связывания маловероятна или незначительна. Таким образом, действительная способность монофосфатных групп к связыванию с этим участком фермента весьма незначительна и недостаточна для образования устойчивого комплекса. Результаты моделирования в ЧЭК и КАТА свидетельствуют о том, что в НАДФН2-связывающих каггалазах наибольшей аффинностью к монофосфатным группам обладает участок вблизи 2'-фосфата НАДФН2. Поскольку корректность расчетов в ЧЭК (в свободных и связанных с НАДФН2 субъединицах) и КАТА (для комплексной формы) подтверждена экспериментальными данными, очевидное несоответствие результатов моделирования неорганических фосфатов в ГПК экспериментальным данным свидетельствует об отсутствии в этой каталазе специализированного сайта связывания 2'-фосфата НАДФН2.

В ГПК найдены две модели 2',5'-АДФ с минимальными энергиями

(-360,617 и -359,331 ккал/моль). Однако, они удалены друг от друга (с.к.о. 13,460 А). Одна модель находится между лизинами-224 и -259 и гистидином-218, а другая лежит в сайте, образованном метионином-292, лизинами-70 и -259, гистидином-218 и серином-261. Существование двух равноценных и граничащих друг с другом сайтов связывания 2',5'-АДФ в ГПК должно препятствовать корректному размещению НАДФН2. Размещение фосфатных фрагментов этого лиганда в слабо аффинных сайтах также указывает на нереалистичность этих моделей. Кроме того, энергия образования комплекса между ГПК и 2',5'-АДФ НАДФН2 из ЧЭК имеет сильно положительное значение (670,276 ккал/моль), что свидетельствует о невозможности формирования комплекса с такой геометрией.

В финальной модели комплекса НАДФН2 и ГПК лиганд удален от НАДФН2 из ЧЭК (с.к.о. 13,688 А), а 2',5'-АДФ в ней удален от финальной модели 2',5'-АДФ и от 2',5'-АДФ НАДФН2 из ЧЭК (с.к.о. 6,701 и 14,316 А соответственно). В этой модели комплекса 2'-фосфат не принимает участия во взаимодействии с ферментом, что согласуется с отсутствием в ГПК специализированного сайта связывания этого фрагмента. Комплекс с такой геометрией, вероятно, не может существовать в водном растворе, поскольку в нем потеря благоприятных контактов 2'-фосфата с ГПК способствует интенсивной гидратации 2'-фосфата, что, в свою очередь, должно вызывать еще большее ослабление взаимодействий между лигандом и рецептором. Кроме того, в этой модели значительно затруднено связывание пирофосфата. Если 5'-никотинамидный фосфат образует интенсивные взаимодействия с аммонием боковой цепи лизина-259, то 5'-адениновый фосфат взаимодействует только с гидрофобной боковой цепью метионина-220. В этой конфигурации проявляются такие же эффекты в отношении 5'-аденинового фосфата, которые описаны выше для 2'-фосфата. Расположение этой модели противоречит также экспериментальным данным по связыванию НАДФН2 каталазами, в осуществлении которого ведущую роль играет адениновая половина лиганда.

Очень высокое положительное значение энергии образования комплекса

между ГПК и НАДФН2 из ЧЭК (2471,694 ккал/моль) свидетельствует о невозможности существования этой конфигурации. Таким образом, результаты расчетов свидетельствуют о том, что основными причинами неспособности ГПК к связыванию НАДФН2 являются отсутствие специализированного сайта связывания 2'-фосфата, невозможность сбалансированного размещения пирофосфата и стерические препятствия для расположения аденина и никотинамидной половины лиганда.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты выравнивания аминокислотных последовательностей каталаз с учетом их пространственной структуры указывают на отсутствие в этих ферментах общих мотивов первичной структуры, ответственных за образование комплексов с НАДФН2. Напротив, каталазы связывают НАДФН2 с использованием специфического для каждого фермента набора аминокислот. В несвязывающих динуклеотид каталазах также нет единых структурных механизмов, препятствующих образованию устойчивого комплекса. Таким образом, в настоящей работе дан обоснованный отрицательный ответ на дискутировавшийся длительное время в литературе вопрос о существовании маркерного для связывания НАДФН2 мотиве в первичной структуре каталаз (СЬеНкаш Р. й а1., 2004).

Механизм взаимодействия НАДФН2 с активным центром каталаз неизвестен. Предложенные ранее модели по переносу пары электронов на большие расстояния через белок сталкиваются с фундаментальными трудностями и не имеют экспериментального подтверждения (Апс1гео1еШ Р. <д а1., 2001). Вместе с тем, накапливается все больше данных о том, что конформационные перестройки существенно необходимы для функционирования каталаз (СоШ Р. й а1., 1996; Ка1ко Б. в. й а1., 2001; Янве Е. К. й а1., 2007). Они могут изменять геометрию комплекса и способствовать оптимальному взаимному расположению НАДФН2 и содержащего гем активного центра. Проведенное моделирование позволило установить ряд функциональных механизмов, определяющих взаимодействие каталаз и НАДФН2, а также выявить закономерности между структурой сайта

связывания и геометрией комплекса. Учет полученных результатов при проверке конформационной гипотезы будет способствовать прояснению функциональных механизмов взаимодействия НАДФН2 и каталаз и уточнению физиологической роли этих ферментов.

ВЫВОДЫ

1. Каталазы существенно различаются по первичной структуре сайта, ассоциированного со связыванием НАДФН2, при этом в каталазах отсутствуют общие мотивы аминокислотной последовательности, определяющие связывание НАДФН2.

2. Неорганические монофосфаты связываются в каталазах вблизи 2'-фосфата НАДФН2; в комплексе с каталазами 2',5'-АДФ имеет близкое расположение к его позиции в составе НАДФН2; модели комплексов НАДФН2 с КАТА и ЧЭК могут отражать промежуточные этапы формирования комплекса или альтернативные варианты его структуры.

3. Геометрия НАДФН2 в комплексах с разными каталазами варьирует и определяется особенностями строения сайта связывания.

4. Связывание 2'-фосфата в специализированном сайте и сбалансированное размещение фосфатов НАДФН2 являются важными функциональными механизмами, определяющими способность каталаз к образованию устойчивого комплекса с НАДФН2.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные результаты могут быть использованы для изучения функциональных механизмов взаимодействия НАДФН2 и каталаз и проверки гипотезы об определяющем значении гонформационных перестроек рецептора в этих процессах.

Опробованную методику моделирования можно применять при анализе лиганд-рецепторных взаимодействий в других комплексах.

СПИСОК РАБОТ АВТОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Егоров Д.А. Компьютерное моделирование сложных лиганд-

рецепторных взаимодействий / Д.А. Егоров, Л.И. Савельев, С.В. Цвиренко // Вест. мед. акад. науки. - 2006. - №2. - С. 9-14.

2. Егоров Д.А. Применение силового поля «MMFF94s» для оценки моделей комплексов человеческой эритроцитарной каталазы с НЛДФН2 и его фрагментами, построенных «AUTODOCK» / Д.А. Егоров, J1. И. Савельев, С.В. Цвиренко // Вест. мед. акад. науки. - 2010. - №2. - С. 90-95.

3. Егоров Д.А. Моделирование комплекса каталазы «А» Saccharomyces cerevisiae и НАДФН2 для предсказания его геометрии / Д.А. Егоров, Л.И. Савельев, С. В. Цвиренко, JI. Г. Фечина // Уральский медицинский журнал. -2010.-№6(71).-С. 71-77.

Публикации в других изданиях

4. Егоров Д. А. Проблемы компьютерного моделирования лиганд-рецепторных взаимодействий в опухолевых клетках / Д.А. Егоров, Л.И. Савельев, С. В. Цвиренко, Л. Г. Фечина // Вопросы гематологии/ онкологии и иммунологии в педиатрии. - 2006. - Т. 5, № 4. - С. 10-11.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

2-АМФ - аденозин-2-монофосфат.

2',5-АДФ - аденозин-2',5'-дифосфат.

БПК - Бычья печеночная каталаза.

ВСК - каталаза из Vibrio salmonicida.

ГПК - каталаза из Helicobacter pylori.

ГПН - гидропероксидаза II (каталаза) Escherichia coli.

ЕКТА - каталаза из Exiguobacterium oxidotolerans.

КАТА - дрожжевая каталаза «А».

КАТФ - каталаза «Ф» Pseudomonas syringae.

МЛК - каталаза из Micrococcus lysodeikticus.

НАД+ — окисленный никотинамидадениндинуклеотид.

НАДН2 ■— восстановленный никотинамидадениндинуклеотид.

НАДФ+ — окисленный никотинамидадениндинуклеотид-фосфат.

НАДФН2 — восстановленный никотинамидадениндинуклеотид-фосфат.

НКК-1- каталаза-1 из Neurospora crassa.

НКК-3 - каталаза-3 из Neurospora crassa.

ПВК - каталаза из Penicillium vitale.

ПМК - каталаза из Proteus mirabilis.

с. к. о. — средне-квадратическое отклонение.

ФРШ - ферредоксин-редуктаза шпината.

ЧЭГР - человеческая эритроцитарная глутатион-редуктаза.

ЧЭК - Человеческая эритроцитарная каталаза.

ЭФК - каталаза из Enterococcus faecalis.

MMFF94s - Merck Molecular Force Field, static version, - статическая версия набора параметров и функций, разработанных в компании «Merck» для оценки молекулярных взаимодействий. PDB - Protein Data Base, Белковая База Данных

Егоров Дмитрий Александрович

Специальность 03.03.01 - Физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 09.03.2011 г. Формат 60x84/,6 Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 38 Отпечатано в типографии ГОУ ВПО УГМА Минздравсоцразвития РФ. 620028, Россия, г. Екатеринбург, ул. Репина, 3.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Егоров, Дмитрий Александрович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Классификация каталаз.

1.2. Физиологическая роль каталаз.

1.3. Общий план строения классических каталаз.

1.4. Структура комплексов каталаз и НАДФНг.

1.5. Механизм функционирования каталаз.

1.6. Роль НАДФНг в катал азах.

1.7. Гипотеза о роли конформационной подвижности в обеспечении функции каталаз и их функционального взаимодействия с НАДФНг.

1.8. Методы компьютерного моделирования для изучения комплексов каталаз и НАДФН2.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ структурно-функциональных механизмов взаимодействия каталаз и НАДФН2 методами компьютерного моделирования"

Актуальность темы

Монофункциональные гем-содержащие каталазы - гетерогенная группа ферментов, проявляющих наибольшую активность в катализе реакции разложения пероксида водорода (Н2О2), токсичного продукта утилизации молекулярного кислорода. Исследования последних лет показали, что Н2О2 играет важную роль в передаче внутри- и межклеточных сигналов и задействован в регуляции фагоцитоза (Марквичева К. Н. и др., 2010), воспалительных процессов (Rahman I. et al., 2006), клеточной пролиферации (Peus D. et al., 1999) и апоптоза (Плетюшкина О. Ю. и др., 2006). Показано, что каталазы, устраняющие действие Н2О2, имеют важное значение в предотвращении апоптоза (Yabuki et al., 1999), регуляции воспалений (Rahman I. et al., 2006), развитии опухолей (Miyamoto et al., 1996). Каталазы участвуют в снижении токсического действия солей тяжелых металлов (Calderón I. L. et al., 2006). Получены данные об эволюционном приспособлении молекулярной структуры каталаз к участию в функционировании каскада арахидоновой кислоты (Oldham М. L. et al., 2005).

Относительно недавно обнаружено, что каталазы человека и животных, некоторых грибов и бактерий образуют устойчивые комплексы с НАДФНг (Kirkman Н. N. et al., 1984; Chelikani P. et al., 2004). Показано, что НАДФН2 модулирует физиологическую активность этих ферментов, предохраняя их от необратимого ингибирования пероксидом водорода (Kirkman Н. N. et al., 1987, Andreoletti P. et al., 2009) или обеспечивая их участие в других реакциях (Heck D. Е. et al., 2003; Calderón I. L. et al., 2006). Однако, структура комплексов не позволяет объяснить механизм этих эффектов (Hillar A. et al., 1994; Olson L. P. et al., 1995, Heck D. E. et al., 2010). Точно неизвестны также механизмы связывания каталаз и НАДФНг. Нерешенность этих вопросов обусловлена ограничениями экспериментальных методов. Компьютерный анализ и моделирование молекулярных взаимодействий позволяют преодолевать экспериментальные ограничения и получать надежно обоснованные выводы о структуре и свойствах молекулярных ассоциатов при сопоставлении результатов с экспериментальными данными. Поэтому применение компьютерного подхода актуально для выявления структурно-функциональных механизмов взаимодействия каталаз и НАДФН2, и, в первую очередь, механизмов связывания этих молекул друг с другом. Результаты такого исследования могут служить основой для определения механизмов участия НАДФН2 в проявлении физиологической активности этих ферментов, а также лучшему пониманию функциональной роли каталаз.

Цель исследования

Задачи исследования

2. Построить модели комплексов каталаз с НАДФН2 и его фрагментами, провести их анализ.

3. Оценить влияние строения сайтов связывания НАДФН2 в каталазах на геометрию комплексов.

4. Выявить функциональные механизмы, определяющие способность каталаз к образованию комплексов с НАДФН2.

Научная новизна

Впервые выполнено выравнивание аминокислотных последовательностей 14 каталаз с учетом их трехмерной структуры на основании анализа которого показано отсутствие в каталазах общих структурных компонентов взаимодействия с НАДФН2. Модельные расчеты комплексов каталаз с неорганическими монофосфатами позволили впервые предложить структуру этих комплексов и продемонстрировать близость расположения неорганических фосфатов к 2-фосфатной группе НАДФНг. Для каталазы «А» 8ассЬагошусез сегеу!з1ае предсказаны ранее экспериментально не установленные конфигурации комплексов с 2',5'-АДФ и НАДФН2. Впервые с применением моделирования подтверждена гипотеза о влиянии различий в строении сайтов связывания НАДФН2 на геометрические характеристики комплексов. Выявлены важные функциональные механизмы, определяющие способность каталаз к взаимодействию с НАДФН2.

Практическая значимость работы

Результаты анализа механизмов связывания каталаз с НАДФН2 создают предпосылки для более глубокого понимания физиологической роли этих ферментов, их участия в воспалительных реакциях, регуляции клеточной пролиферации и опухолевого роста. Уточнение функциональной роли каталаз будет способствовать разработке более эффективных методов лечения заболеваний, обусловленных дисрегуляцией этих фундаментальных физиологических процессов. Примененная методика построения и оценки моделей комплексов каталаз с НАДФН2 и его фрагментами может быть полезна при исследовании других лиганд-рецепторных комплексов.

Основные положения, выносимые на защиту

3. Связывание 2'-фосфата НАДФН2 является важным функциональным механизмом, определяющим способность каталаз к образованию устойчивого комплекса с динуклеотидом, — в несвязывающих НАДФН2 каталазах отсутствует специализированный сайт для этого фрагмента.

Внедрение результатов исследования

Апробация работы

Публикации

По теме диссертации опубликованы 4 работы. Из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Егоров, Дмитрий Александрович

выводы

2. Неорганические монофосфаты связываются в каталазах вблизи 2'-фосфата НАДФН2; в комплексе с каталазами 2',5'-АДФ имеет близкое расположение к его позиции в составе НАДФН2; модели комплексов НАДФНг с КАТА и ЧЭК могут отражать промежуточные этапы формирования комплекса или альтернативные варианты его структуры.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные результаты могут быть использованы для изучения функциональных механизмов взаимодействия НАДФН2 и каталаз и проверки гипотезы об определяющем значении конформационных перестроек рецептора в этих процессах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Егоров, Дмитрий Александрович, Екатеринбург

1. Беленикин М. С. Молекулярный докинг лигандов глутаматных рецепторов / М. С. Беленикин, А. Маккиаруло, Г. Константино, В. А. Палюлин, Р. Пелличари, Н. С. Зефиров // Вестник Московского университета. Серия 2. Химия. 2002 - Т. 43, № 4. - С. 221-230.

2. Костюк В. А. Биорадикалы и биоантиоксиданты. В. А. Костюк, А. И. Потапович. Минск: БГУ, 2004. - 174 с.

3. Наградова Н. К. Белок-белковые взаимодействия в функционировании НАД+-зависимых дегидрогеназ : 44-е Баховское чтение / Н. К. Наградова. М.: Наука. - 1990.-56 с.

4. Октябрьский О. Н. Редокс-регуляция клеточных функций / О. Н. Октябрьский, Г. В. Смирнова // Биохимия. 2007. - Т. 72, № 2. -С. 132-145.

5. Ackerstrom В. Lipocalins : unity in divrsity / В. Akerstrom, D. R. Flower, J.-P. Salier // Biochimica et Biophysica Acta. 2000. - V. 1482. - P. 1-8.

6. Agar N. S. Erythrocyte catalase. A somatic oxidant defence? / N. S. Agar, S. M. H. Sadrzadeh, P. E. Hallaway, J. W. Eaton // The Journal of Clinical Investigation. 1986. - V. 77. - P. 319-321.

7. Allinger N. L. Molecular Mechanics. The MM3 force field for hydrocarbons. 1 / N. L. Allinger, Y. H. Yuh, J.-H. Lii // Journal of the American Chemical Society. 1989. - V. 111, No 23. - P. 8551-8565.

8. Altschul S. F. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs / S. F. Altschul, T. L. Madden, A. A. Schaffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller, D. J. Lipman. // Nucleic Acids Research. 1997. -V. 25, No 17.-P. 3389-3402.

9. Amara P. Ligand diffusion in the catalase from Proteus mirabilis : a molecular dynamics study / P. Amara, P. Andreoletti, H. M. Jouve, M. J. Field // Protein Science. 2001. - V. 10. - P. 1927-1935.

10. Andreoletti P. Verdoheme formation in Proteus mirabilis catalase / P. Andreoletti, J.-M. Mouesca, P. Gouet, M. Jaquinod, C. Capeillere-Blandin, H. M. Jouve // Biochimica et Biophysica Acta. 2009. - V. 1790. - P. 741-753.

11. Baxter C. A. ProLeads : flexible docking using tabu search and an empirical estimate of binding affinity / C. A. Baxter, C. W. Murray, D. E. Clark, D. R. Westhead, M. D. Eldridge // Proteins. 1998. - V . 33. - P. 367-382.

12. Bell C. T. Unusual conformation of nicotineamide adenine dinucleotide (NAD) bound to diphteria toxin : a comparizon with NAD bound to oxidoreductase enzymes / C. E. Bell, T. O. Yeates, D. Eisenberg // Protein science. 1997. - V. 6. - P. 2084-2096.

13. Berman H.M. Announcing the world-wide Protein Data Bank / H.M. Berman, K. Henrick, H. Nalcamura // Nature Structural Biology. 2003. - V. 10. -P. 980.

14. Blatchly R. A. Theoretical study of helix formation in substituted phenylene ethynylene olygomers / R. A. Blatchly, G. N. Tew // The Journal of Organic Chemistry. 2003. - V. 68. - P. 8780-8785.

15. Blumenstein M. Natural abundance carbon-13 nuclear magnetic resonance spectra of nicotinamide adenine dinucleotide and related nucleotides / M. Blumenstein, M. A. Raftery // Biochemistry. 1973. - V. 12, No 19. -P. 3585-3590.

16. Bravo J. Structure of catalase HPII from Escherichia coli at 1.9 A resolution / J. Bravo, M. J. Mate, T. Shneider, J. Switala, K. Wilson, P. C. Loewen, I. Fita // Proteins. 1999. - V. 34. - P. 155-166.

17. Bruns C. M. Refined crystal structure of spinach ferredoxin reductase at 1.7 A resolution : oxidized, reduced and 2'-phospho-5'-AMP bound states / C. M. Bruns, P. A. Karplus // Journal of Molecular Biology. 1995. - V. 247. -P. 125-145.

18. Buehner M. Three-dimensional structure of glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase / M. Buehner, G. C. Ford, D. Moras, K. W. Olsen, M. G. Rossmann // Journal of Molecular Biology 1974. - V. 90, No 1. - P. 25-30.

19. Buzko O. V. Modified AutoDock for accurate docking of protein kinase inhibitors / O. V. Buzko, A. C. Bishop, K. M. Shokat // Journal of Computer-Aided Molecular Design. 2002. - V. 16. - P. 113-127.

20. Carpena X. Structure of the clade 1 catalase, CatF of Pseudomonas syringae, at 1.8 A resolution / X. Carpena, M. Soriano, M. G. Klotz, H. W. Duckworth, L. J. Donald, W. Melik-Adamyan, I. Fita, P. C. Loewen // Proteins. 2003. -V. 50.-P. 423-436.

21. Cecchini M. Automated docking of highly flexible ligands by genetic algorithms : a critical assessment / M. Cecchini, P. Colb, N. Majeux, A. Caflisch // Journal of Computational Chemistiy. 2004. - V. 25. - P. 412-422.

22. Chance B. The primary and secondary compounds of catalase and methyl or ethyl hydrogen peroxide; kinetics and activity / B. Chance // The Journal of Biological Chemistry. 1949. - V. 179. - P. 1341-1369.

23. Chance B. The reactions of catalase in the presence of the notatin system / B. Chance //Biochemical Journal. 1950. - V. 46. - P. 387-402.

24. Chelikani P. Characterization of a large subunit catalase truncated by proteolytic cleavage / P. Chelikani, X. Carpena, R. Perez-Luque, L. J. Donald,

25. H. W. Duckworth, J. Switala, I. Fita, P. C. Loewen // Biochemistry. 2005. -V. 44. - P. 5597-5605.

26. Chelikani P. Hydroperoxidase II of Escherichia coli exhibits enhanced resistance to proteolytic cleavage compared to other catalases / P. Chelikani, L. J. Donald, H. W. Duckworth, P. C. Loewen // Biochemistry. 2003. - V. 42. -P. 5729-5735.

27. Chelikani P. Diversity of structures and properties among catalases. / P. Chelikani, I. Fita, P. C. Loewen // Cellular and Molecular Life Sciences.2004.-V. 61.-P. 192-208.

28. Chelikani P. Catalase : a repertoir of unusual features / P. Chelikani, T. Ramana, T. M. Radhakrishnan. // Indian Journal of Clinical Biochemistry.2005. V. 20, No 2. - P. 131-135.

29. Clark K. P. Flexible ligand docking without parameter adjustment across four ligand-receptor complexes / K. P. Clark // Journal of Computational Chemistry. 1995 - V. 16, No 10. - P. 1210-1226.

30. Clark M. Validation of the general purpose tripos 5.2 force field / M. Clark, R. D. Cramer III, N. Van Opdenbosch // Journal of Computational Chemistry. -1989. V. 10, No 8. - P. 982-1012.

31. Colvin M. E. Quantum chemical stadies of pyrophosphate hydrolysis / M. E. Colvin, E. Evleth, Y. Akacem // Journal of the American Chemical Society. -1995.-V. 117.-P. 4357-4362.

32. Coutinho P. M. Automated docking of monosaccharide substrates and analogues and methyl-a-acarviosinide in the glucoamylase active site / P. M. Coutinho, M. K. Dowd, P. J. Reilly // Proteins. 1997. - V. 27. - P. 235-248.

33. Diaz A. Unusual cys-tyr covalent bond in a large catalase / A. Diaz, E. Horjales, E. Rudino-Pinera, R. Arreola, W. Hansberg // Journal of Molecular Biology 2004. - Y. 342. - P. 971-985.

34. Diaz A. Structure-function relationships in fungal large-subunit catalases / A. Diaz, V.-J. Valdes, E. Rudino-Pinera, E. Horjales, W. Hansberg // Journal of Molecular Biology. 2009. - V. 386. - P. 218-232.

35. Diller D. L. High throughput docking for library design and library prioritization / D. L. Diller, K. M. Merz Jr. // Proteins. 2001. - V. 43. -P. 113-124.

36. Durner J. Salicylic acid is a modulator of tobacco and mammalian catalases / J. Durner and D. Klessig // The Journal of Biological Chemistry. 1996. -V. 271, No 45. - P. 28492-28501.

37. Edgar R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput / R. C. Edgar // Nucleic Acids Research. 2004. - V. 32, No 5.-P. 1792-1797.

38. Ercanly T. Evaluation of computational chemistry methods : crystallographic and cheminformatics analysis of aminothiazole methoximes / T. Ercanly, D. B.

39. Boyd // Journal of Chemical Information and Modeling. 2005. - V. 45. -P. 591-601.

40. Ewing T. J. A. DOCK 4.0 : search strategies for automated molecular docking of flexible molecule databases / T. J. A. Ewing, S. Makino, A. G. Skillman, I. D. Kuntz // Journal Computer-Aided Molecular Design. 2001. - V. 15. -P. 411-428.

41. Fita I. The active center of catalase / I. Fita, M. G. Rossmann // Journal of Molecular Biology. 1985. - V. 185. - P. 21-37.

42. Fita I. The NADPH binding site on beef liver catalase / I. Fita, M. G. Rossmann // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. -1985.-V. 82.-P. 1604-1608.

43. Fita I. The refined structure of beef liver catalase at 2.5 A resolution / I. Fita, A. M. Silva, M. R. N. Murthy, M. G. Rossmann // Acta Crystallographica, Section B. 1986. - V. B42. - P. 497-515.

44. Floche L. Kinetics of glutathione peroxidase / Archives of Biochemistry and Biophysics. 1969. - V. 191. - P. 541-549.

45. Flower D. R. Beyond the superfamily : the lipocalin receptors / D. R. Flower // Biochimica et Biophysica Acta. 2000. - V. 1482. - P. 327-336.

46. Flower D. R. The lipocalin protein family : structure and function / D. R. Flower // Biochemical Journal. 1996. - V. 318. - P. 1-14.

47. Friedman R. Molecular dynamics simulations of the adipocyte lipid binding protein reveal a novel entry site for the ligand / R. Friedman, E. Nachiel, M. Gutman // Biochemistry. 2005. - V. 44. - P. 4275-4283.

48. Fuhrmann J. A new Lamarkian genetic algorithm for flexible ligand-receptor docking / J. Fuhrmann, A. Rurainsky, H.-P. Lenhof, D. Neumann. // Journal of Computational Chemistry 2010. - V. 31, No 9. - P. 1911-1918.

49. Gabb H. A. Modelling protein using shape complementarity, electrostatics and biochemical information / H. A. Gabb, R. M. Jackson, M. J. Sternberg // Journal of Molecular Biology. 1997. - V. 272. - P. 106-120.

50. Gaetani G. F. A novel NADPH:(bound) NADP+ reductase and NADH:(bound) NADP+ transhydrogenase function in bovine liver catalase / G. F. Gaetani, A. M. Ferraris, P. Sanna, H. N. Kirkman // Biochemical Journal. 2005. -V. 385.-P. 763-768.

51. Gaetani G. F. Catalase and glutathione peroxidase are equally active in detoxification of hydrogen peroxide in human erythrocytes / G. F. Gaetani, S. Galiano, A. M. Ferraris, H. N. Kirkman // Blood. 1989. - V. 73, No 1. -P. 334-339.

52. Gaetani G. F. Importance of catalase in the disposal of hydrogen peroxide within human erythrocytes / G. F. Gaetani, H. N. Kirkman, R. Mangerini, A. M. Ferraris // Blood. 1994. - V. 84, No 1. - P. 325-330.

53. Goodsell D. S. Automated docking in crystallography : analysis of substrates of aconitase / D. S. Goodsell, H. Lauble, C. D. Stout, A. J. Olson // Proteins.1993.-V. 17.-P. 1-10.

54. Goth L. Hypocatalasemia in hospital patients / L. Goth, M. Vitai // Clinical Chemistry. 1996. - V. 42. - P. 341-342.

55. Gouet P. Crystal structure of Proteus mirabilis PR catalase with and without bound NADPH / P. Gouet, H.-M. Jouve, O. Dideberg. // Journal of Molecular Biology. 1995. - V. 249. - P. 933-954.

56. Green M. T. The structure and spin coupling of catalase compound I : a study of non-covalent effects / M. T. Green // Journal of the American Chemical Society. 2001. - V. 123. - P. 9218-9219.

57. Gulden M. Cytotoxic potency of H2O2 in cell cultures: Impact of cell concentration and exposure time / M. Gulden, A. Jess, J. Kammann, E. Maser, H. Seibert // Free Radical Biology and Medicine. 2010. - V. 49. -P.1298-1305.

58. Hakansson K. O. The three-dimentional structure of catalase from Enterococcus faecalis / K. O. Hakansson, M. Brugna, L. Tasse // Acta Crystallographies Section D. 2004. - V. D60. - P. 1374-1380.

59. Halgren T. A. Merck molecular force field. I. Basis, form, scope, parameterization, and perfomance of MMFF94 / T. A. Halgren // Journal of Computational Chemistry. 1996. - V. 17, Nos 5, 6. - P. 490-519.

60. Halgren T. A. Merck molecular force field. II. MMFF94 van der Waals and electrostatic parameters for intermolecular interactions / T. A. Halgren // Journal of Computational Chemistry. 1996. - V. 17, Nos 5, 6. - P. 520-552.

61. Halgren T. A. Merck molecular force field. III. Molecular geometries and vibrational frequencies for MMFF94 / T. A. Halgren // Journal of Computational Chemistry. 1996. - V. 17, Nos 5, 6. - P. 553-586.

62. Halgren T. A. Merck molecular force field. V. Extension of MMFF94 using experimental data, additional computational data and empirical rules / T. A. Halgren // Journal of Computational Chemistry. 1996. V. 17, Nos 5, 6. -P. 616-641.

63. Halgren T. A. MMFF. VI. MMFF94s option for energy minimization studies / T. A. Halgren // Journal of Computational Chemistry. 1999. - V. 20, No 7. -P. 720-729.

64. Halgren T. A. Glide : a new approach for rapid, accurate docking and scoring. 2. enrichment factors in database screening / T. A. Halgren, R. B. Murphy, R.

65. A. Friesner, H. S. Beard, L. L. Frye, W. T. Pollard, J. L. Banks. // Journal of Medicinal Chemistry. 2004. - V. 47. - P. 1750-1759.

66. Halgren T. A. Merck molecular force field. IV. Conformational energies and geometries for MMFF94 / T. A. Halgren and R. B. Nachbar // Journal of Computational Chemistry. 1996. - V. 17, Nos 5, 6. - P. 587-615.

67. Halliwell B. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease /

68. B. Halliwell, J. M. C. Gutteridge // Biochemical Journal. 1984. - V. 219. -P. 1-14.

69. Heck D. E. Mechanism of oxidant generation by catalase / D. E. Heck, M. Shakarjian, H. D. Kim, J. D. Laskin, A. M. Vetrano // Annals of the New York Academy of Sciences. 2010. - V. 1203. - P. 120-125.

70. Heck D. E. UVB light stimulates production of reactive oxygen species. Unexpected role for catalase / D. E. Heck, A. M. Vetrano, T. M. Mariano, J. D. Laskin // The Journal of Biological Chemistry. 2003. - V. 278, No 25. -P. 22432-22436.

71. Herzog C. Function of NADPH in catalase A from Saccharomyces cerevisiae / C. Herzog, C. Zamocky, L. Nykyri, F. Koller // Protein Science. 1997. -V. 6.-P. 106.

72. Hillar A. NADPH binding and control of catalase compound II formation : comparison of bovine, yeast, and Escherichia coli enzymes / A. Hillar, P. Nicholls, J. Switala, P. C. Loewen // Biochemical Journal. 1994. - V. 300. -P. 531-539.

73. Ho Y. S. Mice lacking catalase develop normally but show differential sensitivity to oxidant injury / Y. S. Ho, Y. Xiong, W. Ma, A. Spector, D. S. Ho // The Journal of Biological Chemistry. 2004. - V. 279. - P. 32804-32812.

74. Holloway M. K. A priory prediction of activity for HIV-1 protease inhibitors employing energy minimization in the active site / M. K. Holloway, J. M. Wai, T. A. Halgren, P. M. D. Fitzgerald, J. P. Vacca, B. D. Dorsey, R. B. Levin, W.

75. Holm L. Mapping the protein universe / L. Holm, C. Sander // Science. -1996. V. 283. - P. 595-602.

76. Hou T. Automated docking of peptides and proteins by using a genetic algorithm combined with a tabu search / T. Hou, J. Wang, L. Chen, X. Xu // Protein Engineering. 1999. - V. 12. - P. 639-648.

77. Ilyin V. A. Structural alignment of proteins by a novel TOPOFIT method, as a superimposition of common volumes at a topomax point / V. A. Ilyin, A. Abyzov, C. M. Leslin // Protein Science. 2004. - V. 17, No 7. - P. 1865-1874.

78. Ivancich A. EPR evidence for a tyrosyl radical intermediate in bovine livercatalase / A. Ivancich, H. M. Jouve, J. Gillard // Journal of the American Chemical Society. 1996.-V. 118.-P. 12852-12853.

79. Ivancich A. EPR investigation of Compound I in Proteus mirabilis and bovine liver catalases : formation of porphyrin and tyrosyl radical intermediates. / A. Ivancich, H. M. Jouve, B. Sartor, J. Gillard // Biochemistry. 1997. - V. 36. - P. 9356-9364.

80. Jamieson D. The relation of free rasdical production to hyperoxia / D. Jamieson, B. Chance, E. Cadenas, A. Boveris // Annual Reviews of Physiology. 1986. - V. 48. - P. 703-719.

81. Jeanteur D. The porin superfamily: diversity and common features / D. Jeanteur, J. H. Lakey, F. Pattus // New Comprehensive Biochemistry. 1994. -V. 27.-P. 363-380.

82. Jouve H. M. Tightly bound NADPH in Proteus mirabilis catalase / H. M. Jouve, F. Beaumont, I. Leger, J. Foray, J. Pelmont // Biochemistry and Cell Biology. 1989. - V. 67. - P. 271-277.

83. Jouve H. M. Characterization and spectral properties of Proteus mirabilis PR catalase / H. M. Jouve, J. Gaillard, J. Pelmont // Canadian Journal of Biochemistry and Cell Biology. 1984. - V. 62. - P. 935-944.

84. Kalko S. G. Theoetical study of the mechanisms of substrate recognition by catalase / S. G. Kalko, J. L. Gelpi, I. Fita, M. Orozco // Journal of the American Chemical Society. 2001. - V. 123. - P. 9665-9672.

85. Katoh K. MAFFT version 5 : improvement in accuracy of multiply sequence alignment / K. Katoh, K. Kuma, H. Toh, T. Miyata // Nucleic Acid Research.2005.-Y. 33.-P. 511-518.

86. Kellenberger E. Comparative evaluation of eight docking tools for docking and virtual screening accuracy / E. Kellenberger, J. Rodrigo, P. Muller, D. Rognan // Proteins. 2004. - V. 57, No 2. - P. 225-242.

87. Kirkman H. N. Catalase : a tetrameric enzyme with four tightly bound molecules of NADPH / H. N. Kirkman, G. F. Gaetani. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1984. - V. 81. - P. 4343-4347.

88. Kirkman H. N. Mammalian catalase : a venerable enzyme with new mysteries / H. N. Kirkman, G. F. Gaetani // Trends in Biochemical Sciences.2006.- V. 32, No 1.-P. 44-50.

89. Kirkman H. N. The function of catalase-bound NADPH / H. N. Kirkman, S. Galiano, G. F. Gaetani // The Journal of Biological Chemistry. 1987. -V. 262, No 2. - P. 660-666.

90. Kirkman H. N. Mechanism of protection of catalase by NADPH / H. N. Kirkman, M. Rolfo, A. M. Ferraris, G. F. Gaetani // The Journal of Biological Chemistry. 1999. - V. 274, No 20. - P. 13908-13914.

91. Kleinjung J. Contact-based sequence alignment / J. Cleinjung, J. Romein, K. Lin, J. Heringa // Nucleic Acid Research. 2004. - V. 32. - P. 2464-2473.

92. Klotz M. G. Phylogenetic relationships among procariotic and eucariotic catalases / M. G. Klotz, G. R. Klassen, P. C. Loewen // Molecular Biology and Evolution. 1997. - V. 14, No 9. - P. 951-958.

93. Kym R. Assessment of programs for ligand binding affinity prediction / R. Kym, J. Skolnick. // Journal of Computational Chemistry. 2008. - V. 29. -P. 1316-1331.

94. Lang P .T. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes / P .T. Lang, S. R. Brozell, S. Mukherjee, E. T. Pettersen, E. C. Meng, V. Thomas, R. C. Rizzo, D. A. Case, T. L. James, I. D. Kuntz // RNA. -2009.-V. 15.-P. 1219-1230.

95. Lardinois O. M. Reactions of bovine liver catalase with superoxide radicals and hydrogen peroxide / O. M. Lardinois // Free Radical Research. 1995. -V. 22, No 3. - P. 251-274.

96. Lardinois O. M. Reversible inhibition and irreversible inactivation of catalasein presence of hydrogen peroxide / O. M. Lardinois, M. M. Mestdagh, P. G.i

97. Rouxhet // Biochimica et Biophysica Acta. 1996. - V. 1295. - P. 222-238.

98. Lassmann T. Automatic assessment of alignment quality / T. Lassmann, E. L.

99. Sonnhammer // Nucleic Acids Research. 2005. - V. 33, No 22. -P. 7120-7128.

100. Lesk A. M. How different amino acid sequences determine protein structures : the structure and evolutionary dynamics of the globins / A. M. Lesk, A. Chothia // Journal of Molecular Biology. 1980. - V. 136. — P. 225-270.

101. Liu M. MCDOCK : a Monte Carlo "simulation approach to the molecular docking problem / M. Liu, S. Wang // Journal of Computer-Aided Molecular Design. 1999. - V. 13. - P. 335-351.

102. Loewen P. C. Catalase HPII of Escherichia coli catalyzes the conversion ofprotoheme to cys-heme d. / P. C. Loewen, J. Switala, I. von Ossowski, A. Christie, B. Tattrie, P. Nicholls // Biochemistry. 1993. - V. 32. -P. 10159-10164.

103. Mackey A. J. Getting more from less: algorithms for rapid protein identification with multiple short peptide sequences / A. J. Mackey, T. A. Haystead, W. R. Pearson // Molecular and Cellular Proteomics. 2002. - V. 1, No 2.-P. 139-147.

104. Majeux N. Exhaustive docking of molecular fragments with electrostatic solvation / N. Majeux, M. Scarsi, J. Apostolakis, C. Ehrhardt, A. Caflisch // Proteins. 1999. - V. 37. - P. 88-105.

105. Masaki H. Differential role of catalase and glutathione peroxidase in cultured human fibroblasts under exposure of H202 or ultraviolet B light / H. Masaki, Y. Okano, H. Sakurai // Archives of Dermatological Reseach. 1998. -V. 290.-P. 113-118.

106. Mate M. J. Structure of catalase-A from Saccharomyces cerevisiae / M. J.

107. Mate, M. Zamocky, L. M. Nykyri, C. Herzog, P. M. Alzari, C. Betzel, F. Koller, I. Fita. // Journal of Molecular Biology. 1999. - V. 268. - P. 135-149.

108. McDonald D. Q. AMBER torsional parameters for the peptide backbone / D. Q. McDonald, W. C. Still // Tetrahedron Letters. 1992. - V. 33, No 50. -P. 7743-7746.

109. McMartin C. QXP : powerful, rapid computer algorithms for structure-based drug design / C. McMartin, R. S. Bohacek // Journal of Computer-Aided Molecular Design. 1997. - V. 11. - P. 333-344.

110. Meng E. C. Tools for integrated sequence-structure analysis with UCSF Chimera / E. C. Meng, E. F. Petersen, G. S. Couch, C. C. Huang, T. E. Ferrin // BMC Bioinformatics. 2006. - V. 7. - P. 339-348.

111. Momany F. A. Validation of the general purpose QUANTA ®3.2/CHARMm® force field / F. A. Momany, R. Rone // Journal of Computational Chemistry. 1992. - V. 13, No 7. - P. 888-900.

112. Mueller S. Direct evidence for catalase as the predominant H202-removing enzyme in human erythrocytes / S. Mueller, H.-D. Riedel, W. Stremmel // Blood. 1997. - V. 90, No 15. - P. 4973-4978.

113. Murthy M. R. N. Structure of beef liver catalase / M. R. N. Murthy, T. J. Reid III, A. Sicignano, N. Tanaka, M. G. Rossmann // Journal of Molecular Biology. 1981. - V. 152. - P. 465-499.

114. Nelder J. A. A simplex-method for function minimization / J. A. Nelder and R. Mead // The Computer Journal. 1964. - V. 7. - P. 308-313.

115. Notredame C. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment / C. Notredame, D. G. Higgins, J. Heringa // Journal of Molecular Biology. 2000. - V. 302, No 1. - P. 205-217.

116. Numerical recipes in C. The art of scientific computing / W. H. Press, S. A. Teukolsky, W. T. Vetterling, B. P. Flannery. 2nd ed. - Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney : Cambridge University Press, 2002. - 994 p.

117. Ogura Y. Catalase activity at high concentration of hydrogen peroxide / Y. Ogura // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1955. - V. 57. -P. 288-300.

118. Olsen K. W. Sequence variability and structure of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenas / K. W. Olsen, D. Moras, M. G. Rossmann // The Journal of Biological Chemistry. 1975. - V. 250. - P. 9313-9321.

119. Olson L. P. Electron tunneling and ab initio calculations related to the one-electron oxidation of NAD(P)H bound to catalase / L. P. Olson, T. C. Bruice. // Biochemistry. 1995. - V. 34. - P. 7335-7347.

120. O'Sullivan O. 3DCoffee: combining protein sequences and structures within multiple sequence alignments / O. O'Sullivan, K. Suhre, C. Abergel, D. G. Higgins, C. Notredame // Journal of Molecular Biology. 2004. - V. 340. -P. 385-395.

121. Pai E. F. Crystallographic analysis of the binding of NADPH, NADPH fragments, and NADPH analogues to glutathione reductase / E. F. Pai, P. A. Carplus, G. E. Schulz // Biochemistry. 1988. - V. 27. - P. 4465-4474.

122. Parthasarathy R. Conformational variability of NAD+ in the free and bound states: a nicotinamide sandwich in NAD+ crystals / R. Parthasarathy, S. M. Fridey // Science. 1984. - V. 226. - P. 969-971.

123. Pei J. Psi-Dock : towards highly efficient and accurate flexible ligand docking / J. Pei, Q. Wang, Z. Liu, Q. Li, K. Yang, L. Lai // Proteins. 2006. -V. 62. - P. 934-946.

124. Peus D. H2O2 is required for UVB-induced EGF receptor and downstream signaling pathway activation / D. Peus, A. Meves, R. A. Vasa, A. Beyerle, T. O'Brien, M. R. Pittelkow // Free Radical Biology and Medicine. 1999. -V. 27.-P. 1197-1202.

125. Prakash K. Unique oligomeric intermediates of bovine liver catalase / K. Prakash, S. Prajapati, A. Ahmad, S.K. Jain, V. Bhakuni // Protein Science. -2002.-V. 11, No 1. P. 46-57.

126. Putnam C. D. Active and inhibited human catalase structures : ligand and NADPH binding and catalytic mechanism / C. D. Putnam, A. S. Arvai, Y. Bourne, J. A. Tainer // Journal of Molecular Biology. 2000. - V. 296. -P. 295-309.

127. Pye C. C. An ab initio investigation of dihydrogen phosphate ion hydration / C. C. Pye, M. R. Michels // Canadian Journal of Analytical Sciences and Spectroscopy. 2005. - V. 50, No 2. - P. 71-86.

128. Pye C. C. An ab initio investigation of hydrogen phosphate ion hydration / C. C. Pye, M. R. Michels // Canadian Journal of Analytical Sciences and Spectroscopy. 2004. - V. 49, No 3. - P. 175-184.

129. Pye C. C. An ab initio, infrared, and raman investigation of phosphate ion hydration / C. C. Pye, W. W. Rudolph // The Journal of Physical Chemistry A. 2003. - V. 107, No 41. - P. 8746-8755.

130. Rao S. Comparison of super-secondary structures in proteins / S. Rao, M. Rossmann // Journal of Molecular Biology. 1973. - V. 76, No 2. -P. 241-256.

131. Ren T. MSAT : a multiple sequence alignment tool based on TOPS / T. Ren, M. Veeramalai, A. C. Tan, D. Gilbert // Applied Bioinformatics. 2004. -V. 3. - P. 149-158.

132. Rovira C. Structure, protonation state and dynamics of catalase compound II / C. Rovira // A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 2005. - V. 6, No 9. - P. 1820-1826.

133. Russell R. B. A novel binding site in catalase is suggested by structural similarity to the calycin superfamily / R. B. Russell, M. J. E. Sternberg // Protein engineering. 1996. - V. 9, No 2. - P. 107-111.

134. Sancho P. Differential effects of catalase on apoptosis induction in human pronormocytic cells. Relationships with heat-shock protein expression / P. Sancho, A. Troyano, C. Fernandez, E. De Bias, P. Aller // Molecular

135. Pharmocology. 2003. - V. 63. - P. 581-589.

136. Sanner M. F. Python : a programming language for software integration and development / M. F. Sanner // Journal of Molecular Graphics and Modelling. -1999.-V. 17.-P. 57-61.

137. Schames J.R. Discovery of a novel binding trench in HIV integrase / J. R. Schames, R.H. Henchman, J.S. Siegel, C.A. Sotriffer, H. Ni, J.A. McCammon // Journal of Medicinal Chemistry. 2004. - V. 47, No 8. -P. 1879-1881.

138. Schlund S. Conformational analysis of arginine in gas phase a strategy for scanning the potential energy surface effectively / S. Schlund, R. Muller, C. Grassmann, B. Engels // Journal of Computational Chemistry. - 2008. - V. 29. -P. 407-415.

139. Sevinc M. S. Role of the lateral channel in catalase HPII of Escherichia coli / M. S. Sevinc, M. J. Mate, J. Switala, I. Fita, P. C. Loewen // Protein Science. -1999.-V. 8.-P. 490-498.

140. Sevinc M. S. Truncation and heme pocket mutations reduce production of functional catalase HPII in Escherichia coli / M. S. Sevinc, J. Switala, J. Bravo, I. Fita, P. C. Loewen // Protein Engineering. 1998. - V. 11, No 7. -P. 549-555.

141. Shatsky M. Optimization of multiple-sequence alignment based on multiple-structure alignment / M. Shatsky, R. Nussinov, H. J. Wolfson // Proteins. -2005. V. 62, No 1. - P. 209-217.

142. Shindyalov I. N. Protein structure alignment by incremental combinatorial extension (CE) of the optimal path / I. N. Shindyalov, P. E. Bourne // Protein Engineering. 1998. - V. 11, No 9. - P. 739-747.

143. Sigfridsson E. Comparison of methods for deriving atomic charges from the electrostatic potential and moments / E. Sigfridsson, U. Ride // Journal of Computational Chemistry. 1998. - V. 19, No 4. - P. 377-395.

144. Smith P. E. Molecular dynamics simulations of NAD+ in solution / P. E. Smith, J. J. Tanner // Journal of the American Chemical Society. 1999. -V. 121, No 37.-P. 8637-8644.

145. Sobolev V. CASP2 molecular docking prediction with LIGIN software / V. Sobolev, T. M. Moallem, R. C. Wade, G. Vriend, M. Edelman // Proteins. -1997. V. 1 (supplement). - P. 210-214.

146. Switala J. Diversity of properties among catalases / J. Switala, P. C. Loewen // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2002. - V. 401. -P. 145-154.

147. Switala J. Catalase HPII from Escherichia coli exhibits enhanced resistance to denaturation / J. Switala, J . O. O'Neil, P. C. Loewen // Biochemistry. -1999.-V. 38. -P. 3895-3901.

148. Takeuchi A. A human erythrocyte-derived growth-promoting factor with a wide target cell spectrum : identification as catalase / A. Takeuchi, T.

149. Miyamoto, K. Yamaji, Y. Masuho, M. Hayashi, H. Hayashi, K. Onozaki // Cancer Research. 1995. - V. 55. - P. 1586-1589.

150. Tanner J. J. Unusual folded conformation of nicotinamide adenine dinucleotide bound to flavin reductase P / J. J. Tanner, S.-C. Tu, L. J. Barbour, C. L. Barnes,K. L. Krause // Pritein Science. 1999. - V. 8. - P. 1725-1732.

151. Taylor J. S. DARWIN : a program for docking flexible molecules / J. S. Taylor, R. M. Burnett//Proteins. 2000. - V. 41. - P. 173-191.

152. Thomsen R. MolDock : a new technique for high-accuracy molecular docking / R. Thomsen, M. H. Christinsen // Journal of Medicinal Chemistry. -2006.-V. 49. P. 3315-3321.

153. Thornton J. M. Conformational energy calculations for dinucleotide molecules: A study of the nucleotide coenzyme nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) / J. M. Thornton, P. M. Bayley // Biopolymers. 1977. -V. 16, No 9.-P. 1971-1986.

154. Tosha T. On the relationship of coral allene oxide synthase to catalase / T.

155. Tosha, T. Uchida, A. R. Brash, T. Kitagawa // The Journal of Biological Chemistry. 2006. - V. 281, No 18. - P. 12610-12617.

156. Trosset J. J. Prodock : software package for protein modeling and docking / J. J. Trosset, H. A. Sheraga // Journal of Computational Chemistry. 1999. -V. 20.-P. 412-427.

157. Tummino P. J. Competitive inhibition of HIV-1 protease by biphenyl carboxylic acids / P. J. Tummino, D. Ferguson, C. M. Jacobs, B. Tait, L. Hupe, E. Lunney, D. Hupe // Archives of Biochemistry and Biophysics. -1995. V. 316, No 1. - P. 523-528.

158. Vainio M. J. Generating conformer ensembles using a multiobjective genetic algorithm / M. J. Vainio, M. S. Johnson // Journal of Chemical Information and Modeling. 2007. - V. 47. - P. 2462-2474.

159. Veal E. A. Hydrogen peroxide sensing and signaling / E. A. Veal, A. M. Day, B. A. Morgan // Molecular Cell. 2007. - V. 26, No 1. - P. 1-14.

160. Verdonk M. L. Improved protein-ligand docking using GOLD / M. L. Verdonk, J. C. Cole, M. J. Hartshorn, C. W. Murray, R. D. Taylor // Proteins. -2003.-V. 52.-P. 609-623.

161. Vincent S. J. F. The conformation of NAD+ bound to lactate dehydrogenase determined by nuclear magnetic resonance with suppression of spin diffusion /

162. S. J. F. Vincent, C. Zwahien, C. B. Post, J. W. Burgner, G. Bodenhausen // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1997. -V. 94.-P. 4383-8388.

163. Westhead D. R. A comparison of heuristic search algorithms for molecular docking / D. R. Westhead; D. E. Clark 1; C. W. Murray // Journal of Computer-Aided Molecular Design. 1997. - V. 11, No 3. - P. 209-228.

164. Word J. M. Asparagine and glutamine : using hydrogen atom contacts in the choice of side chain amide orientation / J. M. Word, S. C. Lovell, J. S. Richardson, D. C. Richardson // Journal of Molecular Biology. 1999. -V. 285. - P. 1735-1747.

165. Zamocky M. Understanding the structure and function of catalases : clues from molecular evolution and in vitro mutagenesis / M. Zamocky, F. Koller // Progress in Biophysics and Molecular Biology. 1999. - V. 72. - P. 19-66.

166. Zsoldos Z. eHiTS : a new fast, exhaustive flexible ligand docking system / Z. Zsoldos, D. Reid, A. Simon, S. B. Sadjad, P. Johnson // Journal of Molecular Graphics and Modelling. 2007. - V. 26, No 1. - P. 198-212.

167. Параметры внутренней геометрии оптимизированного в «8тр1ехтт» 2',5'-АДФ4

168. Валентные связи Валентные углы Двугранные углы Несобственные углы

169. Атомы Длина, А Атомы Угол,0 Атомы Угол, ° Атомы Угол,0

170. К6А-С6А 1,382153 ИбА-СбА-ША 118,107 Ы6А-С6А-ША-С2А 179,735 С6 А-Ыб А-Н61А-Н62А 0,609

171. Ы6А-Н61А 1,002951 ША-С6А-С5А 122,541 И6А-С6А-С5А-С4А 179,497 С6А-Ы6А-Н62А-Н61А -0,610

172. К6А-Н62А 1,008796 С6А-Ы6А-Н61А 117,390 К6А-С6А-С5А-ША -1,138 Н61А-М6 А-Н62 А-С6 А 0,666

173. С6А-ША 1,353332 С6А-М6А-Н62А 116,899 С6А-М1А-С2А-№А 2,023 К6А-С6А-ША-С5А -0,625

174. С6А-С5А 1,406699 С6А-ША-С2А 117,502 С6А-ША-С2А-Н2А -177,949 К6А-С6А-С5А-Ы1А 0,651

175. М1А-С2 А 1,357491 С6А-С5А-С4А 116,555 С6А-С5А-С4А-ЮА -0,179 ША-С6А-С5А-И6А -0,633

176. С2А-КЗА 1,339106 С6А-С5А-ША 132,020 С6А-С5А-С4А-№А 178,226 N1А-С2 А-ЫЗ А-Н2 А 0,023

177. С2А-Н2А 1,087913 ША-С6А-С5А 119,348 С6А-С5А-Ы7А-С8А -179,919 ША-С2А-Н2А-ША -0,024

178. А-С4А 1,338030 М1А-С2А-№А 127,848 N1А-С6 А-Ш А-Н61А -0,470 N3 А-С2 А-Н2 А-№1А 0,020

179. С4А-С5А 1,382772 ША-С2А-Н2А 116,898 N1А-С6 А-Ы6 А-Н62 А -179,785 NЗA-C4A-C5A-N9A 1,536

180. С4А-№А 1,369371 С2А-ЮА-С4А 112,453 ША-С6А-С5А-С4А -1,251 №А-С4А-ША-С5А -1,584

181. С5А-И7А 1,380643 ЮА-С2А-Н2А 115,253 N1A-C6A-C5A-N7A 178,113 С5А-С4А-№А-ША 1,285

182. Ы7А-С8А 1,323896 ЮА-С4А-С5А 126,222 N1А-С2 А-№ А-С4 А -3,244 С6А-С5А-С4А-ША -0,474

183. С8А-№А 1,377523 NЗA-C4A-N9A 128,374 С2А-ША-С6А-С5А 0,451 С6А-С5А-Ы7А-С4А 0,567

184. С8А-Н8А 1,083954 С4А-С5А-Ы7А 111,423 С2А-№А-С4А-С5А 2,225 С4А-С5А-ША-С6А -0,456

185. К9А-С1В 1,458319 С4А-Ы9А-С8А 106,500 С2А-№А-С4А-№А -175,814 ША-С8А-№А-Н8А 0,011

186. С1В-С2В 1,531530 С4А-Н9А-С1В 127,220 NЗA-C4A-C5A-N7A -179,672 N7A-C8A-H8A-N9A -0,016

187. С1В-04В 1,464568 С5А-С4А-Ы9А 105,382 ЮА-С4А-1*9А-С8А -179,161 №А-С8А-Н8А-ША 0,012

188. С1В-Н1В 1,091935 С5А-ША-С8А 103,775 ЫЗА-С4А-Ы9А-С1В 8,195 С4А-К9А-С8А-С1В 5,850

189. Валентные связи Валентные углы Двугранные углы Несобственные углы

190. Атомы Длина, А Атомы Угол,0 Атомы Угол,0 Атомы Угол,0

191. С2В-02В 1,420791 ША-С8А-И9А 112,837 С4А-ЮА-С2А-Н2А 176,728 С4А-М9А-С1В-С8А -7,054

192. С2В-СЗВ 1,532888 ША-С8А-Н8А 126,301 С4А-С5А-Ы7А-С8А -0,530 С8А^9А-С1В-С4А 6,924

193. С2В-Н2В 1,095754 С8А-К9А-С1В 125,834 С4А-№А-С8А-Ы7А -3,05802В-Р2В 1,628827 И9А-С8А-Н8А 120,861 С4А-И9А-С8А-Н8А 176,927

194. Р2В-01Х 1,516589 К9А-С1В-С2В 115,514 С4А-Ы9А-С1В-С2В -64,684

195. Р2В-02Х 1,517619 К9А-С1В-04В 106,730 С4А-№А-С1В-04В 54,079

196. Р2В-ОЗХ 1,518535 №А-С1В-Н1В 107,457 С4А-№А-С1В-Н1В 166,739

197. СЗВ-ОЗВ 1,441482 С1В-С2В-02В 119,988 С5А-С6А-К6А-Н61А 178,790

198. СЗВ-С4В 1,538206 С1В-С2В-СЗВ 101,654 С5А-С6А-К6А-Н62А -0,525

199. СЗВ-НЗВ 1,093789 С1В-С2В-Н2В 109,123 С5А-С4А-№А-С8А 2,480

200. ОЗВ-НОЗА 1,003787 С1В-04В-С4В 108,649 С5А-С4А-Ы9А-С1В -170,164

201. С4В-04В 1,461410 С2В-С1В-04В 106,971 С5А-ША-С8А-ША 2,197

202. С4В-С5В 1,544881 С2В-С1В-Н1В 114,055 С5А-ША-С8А-Н8А -177,788

203. С4В-Н4В 1,096261 С2В-02В-Р2В 121,348 К7А-С5А-С4А-И9А -1,266

204. С5В-05В 1,423300 С2В-СЗВ-ОЗВ 113,852 Ы7А-С8А-Ы9А-С1В 169,717

205. С5В-Н51А 1,095793 С2В-СЗВ-С4В 102,427 С8А-№А-С1В-С2В 124,026

206. С5В-Н52А 1,092774 С2В-СЗВ-НЗВ 112,480 С8А-К9А-С1В-04В -117,21105В-РА 1,646610 02В-С2В-СЗВ 113,866 С8А-1М9А-С1В-Н1В -4,551

207. РА-01А 1,524104 02В-С2В-Н2В 104,670 N9 А-С1В-С2В-02В -84,695

208. РА-02А 1,524780 02В-Р2В-01Х 104,207 К9А-С1В-С2В-СЗВ 148,722

209. РА-ОЗА 1,524679 02В-Р2В-02Х 104,686 N9 А-С 1В-С2В-Н2В 35,939

210. Валентные связи Валентные углы Двугранные углы Несобственные углы

211. Атомы Длина, А Атомы Угол, ° Атомы Угол,0 Атомы Угол,002В-Р2В-03Х 102,760 Ы9А-С1В-04В-С4В -134,458 01Х-Р2В-02Х 114,626 С1В-Ы9 А-С8 А-Н8 А -10,298 01Х-Р2В-03Х 113,725 С1В-С2В-02В-Р2В -25,118 02Х-Р2В-03Х 114,937 С1В-С2В-СЗВ-ОЗВ 79,505

212. СЗВ-С2В-Н2В 106,987 С1В-С2В-СЗВ-С4В -37,399

213. СЗВ-ОЗВ-НОЗА 108,064 С1В-С2В-СЗВ-НЗВ -159,298

214. СЗВ-С4В-04В 105,772 С1В-04В-С4В-СЗВ -14,048

215. СЗВ-С4В-С5В 114,749 С1В-04В-С4В-С5В 110,415

216. СЗВ-С4В-Н4В 110,500 С1В-04В-С4В-Н4В -131,746

217. ОЗВ-СЗВ-С4В 108,489 С2В-С1В-04В-С4В -10,265

218. ОЗВ-СЗВ-НЗВ 106,447 С2В-02В-Р2В-01Х 65,721

219. С4В-СЗВ-НЗВ 113,238 С2В-02В-Р2В-02Х -173,568

220. С4В-С5В-05В 111,922 С2В-02В-Р2В-03Х -53,153

221. С4В-С5В-Н51А 109,095 С2В-СЗВ-ОЗВ-НОЗА 5,683

222. С4В-С5В-Н52А 110,653 С2В-СЗВ-С4В-04В 32,51904В-С1В-Н1В 105,402 С2В-СЗВ-С4В-С5В -88,935 04В-С4В-С5В 110,015 С2В-СЗВ-С4В-Н4В 147,656 04В-С4В-Н4В 106,721 02В-С2В-С1В-04В 156,674

223. С5В-С4В-Н4В 108,769 02В-С2В-С1В-Н1В 40,550

224. С5В-05В-РА 116,159 02В-С2В-СЗВ-ОЗВ -50,98405В-С5В-Н51А 109,848 02В-С2В-СЗВ-С4В -167,888

225. Валентные связи Валентные углы Двугранные углы Несобственные углы

226. Н61А-Ы6 А-Н62 А 125,708 СЗВ-С4В-С5В-Н52А 39,794

227. Валентные связи Валентные углы Двугранные углы Несобственные углы

228. Параметры внутренней геометрии оптимизированного в «8тр1ехгшп» НАДФН24

229. Валентные связи Валентные углы Двугранные углы Несобственные углы

230. Атомы Длина, А Атомы Угол,0 Атомы Угол,0 Атомы Угол,0

231. N1А-С2А 1,355849 М1А-С2А-ЫЗА 128,340 ША-С2А-ЮА-С4А -0,887 ША-С2А-КЗА-Н2А -0,007

232. ША-С6А 1,352771 ША-С2А-Н2А 116,306 ША-С6А-С5А-С4А -0,385 N1А-С2 А-Н2 А-№ А 0,003

233. С2А-ША 1,341626 ША-С6А-С5А 119,199 1Ч1А-С6А-С5А-Ы7А 179,745 №А-С2А-Н2А-ША -0,007

234. С2А-Н2А 1,086810 ША-С6А-И6А 118,203 N1А-С6 А-Ы6 А-Н61 174,587 ША-С4А-С5А-Ы9А 0,433

235. ЮА-С4А 1,342112 С2А-ША-С6А 117,553 N1А-С6 А-Нб А-Н62 5,381 ША-С4А-№9А-С5А -0,449

236. С4А-С5А 1,384123 С2А-ИЗА-С4А 111,807 С2А-К1А-С6А-С5А 0,276 С5А-С4А-ША-ЮА 0,360

237. С4А-ША 1,369846 ША-С2А-Н2А 115,354 С2А-ША-С6А-Ы6А -179,307 С4А-С5А-С6А-ША -0,098

238. С5А-С6А 1,406107 ША-С4А-С5А 126,443 С2А-№А-С4А-С5А 0,735 С4А-С5А-ША-С6А 0,091

239. С5А-ША 1,380489 NЗA-C4A-N9A 128,562 С2А-№А-С4А-Ы9А -178,709 С6А-С5А-ША-С4А -0,118

240. С6А-ША 1,381705 С4А-С5А-С6А 116,652 №А-С2А-ША-С6А 0,418 ША-С6А-С5А-К6А 0,366

241. N7A-C8A 1,322886 С4А-С5А-ША 111,446 ЮА-С4А-С5А-С6А -0,160 ША-С6А-К6А-С5А -0,366

242. С8А-К9А 1,375152 С4А-ША-С8А 106,974 №А-С4А-С5А-ША 179,736 С5А-С6А-Ы6А-ША 0,379

243. С8А-Н8А 1,084710 С4А^9А-С1В 127,237 №А-С4А-Ы9А-С8А -178,058 И7А-С8А-К9А-Н8А 0,042

244. Ы9А-С1В 1,452873 С5А-С4А-Ы9А 104,993 ЮА-С4А-ША-С1В 4,254 N7A-C8A-H8A-N9A -0,052

245. К6А-Н61 1,009733 С5А-С6А-Ы6А 122,597 С4А-ША-С2А-Н2А 179,119 N9A-C8A-H8A-N7A 0,046

246. К6А-Н62 1,003547 С5А-ША-С8А 103,974 С4А-С5А-С6А-К6А 179,179 С4А-К9А-С8А-С1В 1,839

247. С1В-С2В 1,522561 С6А-С5А-ША 131,901 С4А-С5А-К7А-С8А -1,322 С4А-К9А-С1В-С8А -2,214

248. С1В-04В 1,464014 С6А-К6А-Н61 116,752 С4А-№А-С8А-ША -3,495 С8А-Ы9А-С1В-С4А 2,168

249. С1В-Н1В 1,091175 С6А-К6А-Н62 117,407 С4А-И9А-С8А-Н8А 176,454 С6 А-Ы6 А-Н61-Н62 9,569

250. Валентные связи Валентные углы Двугранные углы Несобственные углы

251. Атомы Длина, А Атомы Угол, ° Атомы Угол,0 Атомы Угол,0

252. С2В-СЗВ 1,530513 Ы7А-С8А-Ы9А 112,508 С4 А-№ А-С1В-С2В -68,847 С6 А-№6А-Н62-Н61 -9,629

253. С2В-02В 1,413189 ША-С8А-Н8А 126,273 С4А-№А-С1В-04В 48,909 Н61 -N6 А-Н62-С6 А 10,422

254. С2В-Н2В 1,096966 С8А-Ы9А-С1В 125,745 С4А-Ы9А-С1В-Н1В 162,170 СШ-МШ-С2М-С6К 5,341

255. СЗВ-С4В 1,542236 И9А-С8А-Н8А 121,220 С5А-С4А-К9А-С8А 2,405 ст-ыш-сбм-с2к -5,521

256. СЗВ-ОЗВ 1,436427 К9А-С1В-С2В 114,341 С5 А-С4 А-Ы9 А-С1В -175,283 с2к-ш1ч-сб!ч-ст 5,229

257. СЗВ-НЗВ 1,093293 К9А-С1В-04В 107,875 С5 А-С6 А-И6 А-Н61 -4,981 ЫШ-С2Ы-СЗЫ-Н2Ы -2,926

258. С4В-04В 1,461731 №А-С1В-Н1В 108,371 С5А-С6А-И6А-Н62 -174,187 2,665

259. С4В-С5В 1,540771 С1В-С2В-СЗВ 100,625 С5А-Ы7А-С8А-ША 2,932 СЗЫ-С2Н-Н2Ы^Ш -2,835

260. С4В-Н4В 1,096560 С1В-С2В-02В 119,072 С5А-ША-С8А-Н8А -177,013 С2Ы-СЗЫ-С4Н-СЖ -1,86502В-Р2В 1,622809 С1В-С2В-Н2В 108,423 С6А-1Ч1А-С2А-Н2А -179,588 С2Ы-СЗН-СЖ-С4Ы 1,807

261. Р2В-01Х 1,521327 С1В-04В-С4В 107,873 С6А-С5А-С4А-ША 179,390 С4Ы-СЗМ-С7М-С21Ч -1,878

262. Р2В-02Х 1,517337 С2В-С1В-04В 106,100 С6А-С5А-ША-С8А 178,553 С4К-С5Ы-С6Ы-Н5Н -3,470

263. Р2В-ОЗХ 1,512486 С2В-С1В-Н1В 114,460 ША-С5А-С4А-И9А -0,714 С4К-С5Ы-Н5Н-С6Ы 3,354

264. ОЗВ-НЗО 1,002871 С2В-СЗВ-С4В 101,242 К7А-С5А-С6А-Ы6А -0,691 С6М-С5Ы-Н5М-С4Ы -3,447

265. С5В-05В 1,425160 С2В-СЗВ-ОЗВ 113,921 ША-С8А-К9А-С1В 174,237 1,403

266. С5В-Н51 1,095422 С2В-СЗВ-НЗВ 113,420 С8 А-Ы9 А-С1В-С2В 113,879 N1N-C6N-H6N-C5N -1,303

267. С5В-Н52 1,094273 С2В-02В-Р2В 123,394 С8А-№А-С1В-04В -128,365 1,35305В-РА 1,640246 СЗВ-С2В-02В 118,717 С8А-Н9А-С1В-Н1В -15,105 СЗН-С7№-07Ы-ЫЖ -0,214

268. РА -01А 1,512502 СЗВ-С2В-Н2В 105,950 К9А-С1В-С2В-СЗВ 155,885 СЗИ-СЖ-ШМ-СШ 0,198

269. РА -02А 1,514979 СЗВ-С4В-04В 105,955 Ы9А-С1В-С2В-02В -72,538 ОЖ-СЖ-ШК-СЗК -0,217

270. Валентные связи Валентные углы Двугранные углы Несобственные углы

271. Атомы Длина, А Атомы Угол,0 Атомы Угол, ° Атомы Угол,0

272. РА -03 1,598312 СЗВ-С4В-С5В 114,871 №А-С1В-С2В-Н2В 44,957 СЖ-КЖ-Ш1-Н72 23,99703 -РЫ 1,599093 СЗВ-С4В-Н4В 110,642 №А-С1В-04В-С4В -140,264 С7Ы-К7Ы-Н72-Н71 -25,039

273. РЫ -ОШ 1,511309 СЗВ-ОЗВ-НЗО 106,998 С1В-Ы9А-С8А-Н8А -5,815 Н71 -ЫЖ-Н72-СЖ 21,008

274. РМ-02Ы 1,521340 С4В-СЗВ-ОЗВ 106,442 С1В-С2В-СЗВ-С4В -41,435

275. PN -05Б 1,628279 С4В-СЗВ-НЗВ 113,975 С1В-С2В-СЗВ-ОЗВ 72,385

276. С5Б 1,414790 С4В-С5В-05В 110,844 С1В-С2В-СЗВ-НЗВ -163,954

277. С5Б-С40 1,526056 С4В-С5В-Н51 109,090 С1В-С2В-02В-Р2В -48,895

278. С5Б-Н53 1,095766 С4В-С5В-Н52 111,437 С1В-04В-С4В-СЗВ -9,763

279. С5Б-Н54 1,095914 04В-С1В-Н1В 105,068 С1В-04В-С4В-С5В 114,625

280. С4Б-04Э 1,450445 04В-С4В-С5В 109,443 С1В-04В-С4В-Н4В -127,644

281. С4Б-СЗБ 1,527214 04В-С4В-Н4В 106,573 С2В-С1В-04В-С4В -17,318

282. С4Б-Н4Б 1,097664 02В-С2В-Н2В 103,254 С2В-СЗВ-С4В-04В 32,487

283. СШ 1,447078 02В-Р2В-01Х 102,107 С2В-СЗВ-С4В-С5В -88,452

284. СЗБ-С2Б 1,514095 02В-Р2В-02Х 104,546 С2В-СЗВ-С4В-Н4В 147,619

285. СЗБ-ОЗБ 1,429778 02В-Р2В-03Х 105,153 С2В-СЗВ-ОЗВ-НЗО 41,281

286. СЗБ-НЗБ 1,096357 01Х-Р2В-02Х 112,679 С2В-02В-Р2В-01Х -66,932

287. С2Б-СШ 1,533908 01Х-Р2В-03Х 115,183 С2В-02В-Р2В-02Х 175,484

288. С2Б-020 1,450985 02Х-Р2В-03Х 115,275 С2В-02В-Р2В-03Х 53,663 г"

289. С20-Н2Б 1,093612 ОЗВ-СЗВ-НЗВ 107,684 СЗВ-С2В-С1В-04В 37,120ст-иш 1,482690 С5В-С4В-Н4В 109,003 СЗВ-С2В-С1В-Н1В -78,255

290. Валентные связи Валентные углы Двугранные углы Несобственные углы

291. Атомы Длина, А Атомы Угол,0 Атомы Угол,0 Атомы Угол, °ст-ню 1,096627 С5В-05В-РА 116,090 СЗВ-С2В-02В-Р2В 74,139

292. ОЗБ-НОЗ 1,007400 05В-С5В-Н51 109,150 СЗВ-С4В-С5В-05В -85,955

293. Н02 0,985706 05В-С5В-Н52 108,757 СЗВ-С4В-С5В-Н51 153,832

294. ИШ-С2Ы 1,401820 05В-РА -01А 106,731 СЗВ-С4В-С5В-Н52 35,3211,393250 05В-РА -02А 105,495 С4В-СЗВ-С2В-02В -173,232

295. С2И-СЗ^Т 1,344575 05В-РА -03 98,000 С4В-СЗВ-С2В-Н2В 71,397

296. С2Ы-Н2Н 1,087081 РА -03 -РЫ 132,003 С4В-СЗВ-ОЗВ-НЗО 151,968

297. СЗН-С4И 1,502700 01А-РА -02 А 120,854 С4В-04В-С1В-Н1В 104,283

298. СЗЫ-СЖ 1,479588 01А-РА -03 111,208 С4В-С5В-05В-РА -168,223

299. С4Ы-С5Ы 1,510837 02А-РА -03 111,672 04В-С1В-С2В-02В 168,697

300. С4И-Н41 1,089973 03 -РИ -ОШ 113,110 04В-С1В-С2В-Н2В -73,808

301. С4Ы-Н42 1,096076 03 -РИ -02И 108,698 04В-С4В-СЗВ-ОЗВ -86,833

302. С5Ы-СШ 1,341423 03 -РИ -05Э 100,860 04В-С4В-СЗВ-НЗВ 154,621

303. C5N-H5N 1,083753 РЫ -050-С50 116,344 04В-С4В-С5В-05В 155,037

304. СбИ-НбЫ 1,085189 0Ш-РЫ-02И 117,964 04В-С4В-С5В-Н51 34,824

305. СЖ-ОЖ 1,230376 ОШ-РЫ -05Б 108,345 04В-С4В-С5В-Н52 -83,687сж-кж 1,351879 02Ы-РЫ -050 106,257 02В-С2В-С1В-Н1В 53,322

306. ЫЖ-Н71 1,019227 05Б-С5В-С40 110,674 02В-С2В-СЗВ-ОЗВ -59,412

307. НЖ-Н72 1,034888 05В-С5Б-Н53 111,155 02В-С2В-СЗВ-НЗВ 64,24905Б-С50-Н54 108,410 Р2В-02В-С2В-Н2В -169,055

308. Валентные связи Валентные углы Двугранные углы Несобственные углы

309. Атомы Длина, Á Атомы Угол, ° Атомы Угол, 0 Атомы Угол,0

310. C5D-C4D-04D 110,032 ОЗВ-СЗВ-С2В-Н2В -174,783

311. C5D-C4D-C3D 113,321 ОЗВ-СЗВ-С4В-С5В 152,228

312. C5D-C4D-H4D 108,808 ОЗВ-СЗВ-С4В-Н4В 28,299

313. C4D-C5D-H53 110,261 С5В-С4В-СЗВ-НЗВ 33,682

314. C4D-C5D-H54 109,465 С5В-05В-РА-01А 59,835

315. C4D-04D-C1D 107,989 С5В-05В-РА-02А -69,887

316. C4D-C3D-C2D 101,778 С5В-05В-РА-03 174,903

317. C4D-C3D-03D 113,311 05В-С5В-С4В-Н4В 38,839

318. C4D-C3D-H3D 112,242 05B-PA-03-PN 152,06904D-C4D-C3D 107,202 РА-05В-С5В-Н51 -48,046 04D-C4D-H4D 107,396 РА-05В-С5В-Н52 68,935 04D-C1D-C2D 106,987 PA-03-PN-01N 50,461 04D-C1D-N1N 112,182 PA-03-PN-02N -176,487 04D-C1D-H1D 106,231 PA-03-PN-05D -65,026

319. C3D-C4D-H4D 109,914 01A-PA-03-PN -96,440

320. C3D-C2D-C1D 102,217 02A-PA-03-PN 41,817

321. C3D-C2D-02D 108,951 03-PN-05D-C5D -67,818

322. C3D-C2D-H2D 112,587 PN-05D-C5D-C4D 159,061

323. C3D-03D-H03 103,537 PN-05D-C5D-H53 36,180

324. C2D-C3D-03D 108,527 PN-05D-C5D-H54 -80,875м о

325. Атомы Длина, А Атомы Угол,0 Атомы Угол,0 Атомы Угол,0

326. С2Б-СЗВ-НЗО 109,728 ОШ-РИ -05Б-С50 173,191

327. С20-Ст-ЫШ 112,209 СЯИ-РЫ -050-С5Б 45,508

328. С2Б-ст-нт 110,617 05В-С50-С4Б-04Б 166,962

329. С2Б-020-Н02 101,624 05В-С5В-С4Б-СЗВ -73,039

330. Ст-С2Б-02В 111,632 05В-С5В-С4В-Н4В 49,553