Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ структурно-функционального состояния некоторых транспортных белков крови в условиях различноного микроокружения

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Анализ структурно-функционального состояния некоторых транспортных белков крови в условиях различноного микроокружения"

«в 01

Воронежский государственный университет

На правах рукописи

ВАШАНОВ ГЕННАДИЙ АФАНАСЬЕВ!«

АНАЛИЗ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ НЕКОТОРЫХ ТРАНСПОРТНЫХ БЕЛКОВ КРОВИ В УСЛОВИЯХ РАЗЛИЧНОГО . МИКРООКРУХЕНИЯ

03.cu.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 19ЭЗ

Работа вшюлншш в Воронежском государственном университете.

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

Артшов В.Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессо]

Рощупгош Д. И.

доктор физико-математических наук, профессор Холмогоров В.Е.'

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии и гевдтига: АН Украшш

' Edipa.a состоится "ff* кг»д 1993 года

в -/Г- час. на заседают Специализированного Совета К 063.48.14 при Еоронзгхком государственном университете по адресу: .394693, Воронок, Университетская площ., д.1.

С диссертацией мои-ю ознакомиться в зональной научной библиотек Bopoiioscixiro1 госуниверситета.

Автореферат разослан " /<? " мая 19S3 г.

Учений секретарь' Специализированного Совета, кандидат биологических

наук, доцент /-т j? .Ковалева Т.Д.

ОБ'1'ДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Лктуплмюсть проблемы. Исследования законексгноствЯ и мохэ-

змов функционирования биосистем различных уровне^. организация ля о тс я, несомненно, конечным результатом-для всех дисциплин би-оппеского профиля. Рвшонио именно этой проблемы позволит целз-правленно влиять на протекание раз линях процессор, усиливая агопрлятние и нивелируя нежелательные'из них.

Клшепая роль в функционировании организмов отводится биопо-:г,горам в силу -разнообразия Функшй . выполняешь ими, и на уровне 1торлх реализуется любое воздействие на организм или на его от-аышэ системы. Следовательно,- для объясняли тех макропффэктов, )Торпэ. кн непосредственно наблюдаем при действии различ!шх фикто-.ш сродя па биосистеми, необходимо .рассматривать их влияло на мшеулярнкй уровень организации янвой материи, и, презде всего, i белковое структур!! в силу той огромной роли, которую они играют процессе организации и функциогагрогания гавих существ. Особое !3'ю!!лв при этом инзют белки крови, 0твэтств6ннн0 за протекание иогих функций организма, сроди которых наиболее вакним является рязнвшЬга к перенос разлиних векеств. Поэтому неудивительно, что эиболызиЛ удельный го с всех клеточных и плазменных белков 1срови оставляют именно транспортные белки - гемоглобин и сыворсочний льбугпш. Изучению 1гх структуры, а такие влияния на нее разлл.чшгх изико-химических агентов посвящено большое количество робот. Од-яко, на паи взгляд, явно недостаточно раскрыт вопрос о взаимосвязи обнаружению структурных перестроек при измононш микроокрута-¡ил. белков с проявлением ими функциональных свойств.

- С целью развития представлений по указанной наш 6ы-

01 проведет^ комплексные исследования по изучению влияния УФ сгета ! температуры на панснорт/шо сгемоглобина и енвпроточпого 1льбушша, на процоссы связывания и переноса ими лигонд">в.

Ва:пюст1. изучения воздействия этих физических факторов на >елковыв системы обусловлена рядом причин. В силу того, что „тамле-затура и УФ излучение являются естественными о: алогическими фзкто-тами, организма находятся под их постоянным влиянием. Это, веролт-га, сыграло определяющую роль и в самом появлении, и в эволюциои-юм развитии еивых существ (а.и.Опарин, 1357; М.В.Больконштейн, 1965; Р.УэПн, 1991). Необходимость адаптацш! к ним проявляется и в

условиях непосредственной жизнедеятельности индивидуальных организмов, что стало особенно актуально в связи с проблемами. разруи }шя озонового слоя Земли - естественного защитного экрана от прс нжновекия коротко- и средневолнового УФ света, и "парникового в факта", приводящего к глобальному потеллешш климата. Поэтому вл яние указанных агентов на структуру белков достаточно полно изуч но. Накопленный экспериментальный материал создает предпосылки л соотносения проявления функциональных свойств с вполне определен ними конформациогашш перестрой! сами биомакромолекул.

Гем'глобин и альбумин, внполняя одинаковую функцию транспор тировсния веществ, относятся к различным классам белков. Поэтому на их примере мохно проследить роль отдельных компонентов (белко вого и неорганического) в хода ответной реакции на 'воздействие ф эико-хиш^еских факторов и их взашовлияшш друг на друга. Одновременно указашшо белю: мозшО рассматршать й как модель фернен тов при уело Ei Di аналогии центров свпыЕзшш лигандов с активным центром. Это доковывает важность такого рода исследований с точи ярения теоретических изыскании биофизики.

В то се время рэвошга указанной проблемы hügot и вагное про гачоелве зшчошш, преяде всего для медицины. В частности, в последние годц широкое развитие 6 клинетеской практике получил нет вутога.;отрансфуз.ил УФ облученной дрови (АУШС). Однако; несмотря .на полоаителышЯ оффект, готорый даот указанный метод при лечени и прсфспяптикв целого ряда забодавший (воспалительные процесск, абсцессы, облитергрувдиа заболевания конечностей и др.), до наст яцзго времени Пало исследованным остается вопрос о механизмах, л £ac3tx в осново его благоприятного действия на организм.

D силзи с тем, что в ряде случаев 'возникает необходимость в . LviTU организмов от действия указашкгс агентов, особую актуальное приобретает пробломы разработки ее теоретических и практотосгах . основ, а такхо поиск BijCor.TUEHnx хшлических соединений, выступав сие в рол;! протоктороо. Этой проблема посвяцон таете ряд раздело настоящей диссертационной работы.

Цоль и задйчи работы. Цадьп настоящей работы явилось изучен;

езшкосвяэи ш^ду структурные изменениями, возникая^::].*: при действии УО свотз и теМператури в высии типах пространственной стр; туры молэкул сывороточного'пльбдаша. и гемоглобина с проявленном дшпие.:;1 белкам: спсцп£пчес1;ой роа1щпи транс по ртировзния опрэделв!

-5: веществ.

Задачи работы предусматривали:

1) Создание установок для регистрация кривых диссоциации ск-•омоглобина я спектров фотофлюоресценции.

2) Изучение влияния УФ излучения на физико-химические свойст-гемоглсбина и сывороточного альбумина.

3) Оценку корреляционной взаимосвязи неяду структурными изка--шяки, индуцированными воздействием УФ квантов, и проявлением злодовпншми белками функциональных свойств.

4) Определение эффективности и выявление молокулярных меха-змов действия ряда природных антиоксидантсз, таких как серотогаш (х-токоферол, при фотомодификации белков!« систем.

5) Исследование процессов, предиествувдих необратимой агрега-и гемоглобина при нагревании.

6) Возможность влияния- на процесс агрегации субъединиц при • лертермии экзогенных веществ на примере додецилсульфата натрия.

Научная новизна.

Работа являете* комплексным исследованием, посвйщчнним взаи-ювязи между структурным состоянием и функциональной активность!) (моглобила и сывороточного альбумина. Впервые изучено пяля гага УФ зета не. положение и-форму кривых диссоциации оксигекгоглобина, гепень гем-гемового взаимодействия, отрахешом которых являются зличипа константы Хилла и значение полулаевдэния молекулы гемог-эбина кислородом. Продловен молекулярный мохрчизм фотопротектор-зго действия сорятолшга по отношению к гембелку.

Показан эффект Ф.>тоактигации транспортной функции енвороточ -зго альбумина на примерз модельного соединения (конгорот), а так-Э при род {ых лигяндоп - хол9стэ }Х>Л'£1 и а-токофорола.

На примере гемоглобина установлены промежуточные "нздтэтрз-ершго" структурные состояния'белка, пгодэпредоляпцие ого необра-имуп температурную агрегации.

3 условиях различного газового состава исследованы параметры ри:Зо.тс'.';!н>,цйнции снвороточного альбумина.

Пека;-чна целесообразность сочвтанного использования трнболв-иносцунгмого и фотофлюоресцентного мотодов пр! исследовании фото-роцессон, нцзисходящог в сывороточном альбумине.

Практическая значимость.

Полученные результаты вскрывает пэрглчныо цеханизкы ответной

-G-

рзакции биосистем не» воздействие У* света и температур«, расалря представление о молекулярных процессах, легаидах и основе л-'чебне эффекта метода 4УФ0ГС. Эксгоршентн 'с исполкювашюм вф{окт:ют прцодпнх фзтопротектогов (серотонин и а-токо^ерэл) шзюхяют ра работать основы избирательней защити отделыпос компонентов систе крови.

Экспериментальные дашше могут быть полезны при сбсукдэшш Еонросов, глсаицихся прогнозирования или анализа последствий зко логических катастроф, в частности, пробкам разрушения озонового слоя Земле й "паршисового еЭДчзкта".

Апробация рэботи.

1'аториалы диссертации долокены и обсувдо!ш на: Научной сесс Воронааского госуииварсйтета (Воронея, 1989, 1993); на Всесоюзны конференциях "Транспорт кислорода и антиоксидантные системы" (Гродно, 1989), "Применение ионообменных материалов в промышленности и аналитической химии" (Ееpones, 1991), "Кояэкуллрдае и кл точные осиови кислотно-основного и температурного гомеостаза" (Сыктывкар, 1991), VII конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков,' .1991); lia IV Всесоюзном совещании "Лшишсцвнтный а на л в мэдицшш и биологии и pro аппаратурюа обеспеченно" (Косква, 1992),- па Всероссийской конференции "Проблемы кадастра, вколоти охра;ш ишотного мира России" (Sopones, 1990); на Международной конференции по экстракции органических соединений "ISEC0S-92" (В< ронег, 1992).

Публикации.

По теш диссертации опубликовано 2 статьи^ 6 тезисов.

На 'вациту выносятся следувдие положения:

1) Возрастание интенсивности-трйолшинесценции сшзороточног альбукина после его УФ облучения обусловлено усилением процессрв перекисного окисления дипидов .и нарушением кшзикристаллической структура белка.

2) Воздействие УФ света вшивает увеличение кислородсвязывая: щей способности гемоглобина. ,

3) Серотонин оказывает фотозаЕдиное действие по отношешш к тяэкулаы.гемоглебиш, что проявляется в изменении (¡ормн и полоко шит кришх длссоциацш: ое-сигвиоглобила.

4) Необратимой топловой денатурации молекул гемоглобина пред шествует образование надг. гримерных.'комплексов при 42-45°С.

-75) Схема ответной реакции белков на воздействие УФ облучения.

Структура и объем диссертации.

-.--•--- ,

Диссертационная работа ишэчавт 157 страниц машинописного ста, 7 таблиц, 50 рисунков. Состоит из введения, соки глав, зачеши и поводов. Список литератур' содержа 185 работ, из intx i отечественна, и 56 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. Строение, некоторые физико-хю.мчоскив и фушсциональ-> свойства гемоглобина"и сывороточного альбумина.

В главе представлен обзор основных работ, посвя'денних анализу зуктур гемоглобина и сшзороточного альбумина, а тмяа проивло!г.ш ! функциональных свойств.

ГЛАВА 2. Влияние некоторых физико-химических факторов на

руктур::о-фу1гкци0налыц(е свойства белков.

Приводятся основные современные воззрения, клсапдиося шпро-в ответной реакции простых белков и гскопротеидов на действие УЗ лучения, механизмов разменз поглощенней зноргни, природы возни-вдix свободных радикалов. Суммирован« пути структурно-фушздиэ-льуих изменений белков, индуцировашшх температурными воздэйст-

ЯНИ.

ГЛАВА 3. Объекты и методы исследования.

В опытах использовали растворы оксигемоглобтш, получетшо крови белых беспородных мыиой и донорской кропи человека.

Для приготовления растворов сывороточного пльбушшз чело -ка применялся кристаллически прзпарат фи^/н Hearial (В*ш'р!Я), створов сипорсточного альбумина бика - белок фирпч Koch- Li,^nt bomti-rlea (Великобритания). •

Г'!СТГ:>Г!1 ТОДИфИЦИруЕЦИХ ЕОГЦОСТВ тотоглля ИЗ к1с!СТаЛЛ!чес!д1х

©гогптов дсд"Цйлсул14ата натрия (Ser-,-а, Горланил), cnnoTomniíi еапл], рпчггкл), холесторол-э (Signa, С2Л), а тают мэслямного стрлрч t т> ч-орирола (Serva, Гермашл).

0;:спп'(мглобин выделяли по'методу D.Drabkln (1947) с кодгфи-циями Л.Л.Влгменфольда (1957).

Хго".ато1'рпфич8ско0 разделение кзрбс.-отггомоглсбшш из КЦ-цол-«озя проводили по методу, ейшешйго'гу Т.ГЩстлп et al. (1950).

Рошстрацно кривых дносошшшз! оксигомоглобина огуптеп.гчли снйктрофогоматричоским способом (О.К.Столяр и соав., 1079) с ax¿ цыо специально созданной на кафодрз биофизики Вороноиского уш:гз; ситота установи (В.Г.Артюхов, Г.Л.Еаазнов, 1990).

Транспортную способность сывороточного альбумина оценивали i методу С.И.Чогера (1975) с неболыиши кодификациями.

Трнболюмгаюсценция образцов сывороточного альбумина фиксировалась с помочью установки ТРА-2. В качество ингибитора перекиснс го окислешш липидов использовали гелий.'

Для р гистрацга: спектров фотофлпоросценции использовали уск новку, 1»зготовлеш1ую на кафедре биофизики ВоронеЕского-госушшер-ситета с использовашюн рекомендаций (Ю. А. Владимиров, 1965; i.e. Литвин, 1964).

УФ облучение исслодуошх образцов проводили в стеклянной тех мосгатирошнноЯ ют.ете (37 ± 0,Б°С) при непрерывной перекэшгдшз: с покощьа ртутно-кварцевой лампы-ДРТ-400 через светофильтр УСС-1 (240-330 1U-0. Интенсивность облучения составляла 151 ДгУм^мин.

Величину константы Хилла определяли - графически из -ангенса угла наклона касательной в точке полунэсыщешгя в координатах Хил-ла.

Статистическую обработку результатов проводили трсздлциошп^ми способаш! с помоадао интегрированного пакета "Statgrapiiico" на ЗВМ типа ШГ PC/XT.

. ГЛАВА 4. Изучение люминесцентных свойств нативного и подверг нутого УФ модификации сывороточного альбумина.

В последнее время в качестве.иобого метода исследования структуры биомолокул предложен метод триболюминесценции, т.е. г.вечения биообъектов при механическом воздействии. В механизме ■триболзя-Ьшасценщв! играют'роль трибоалектризацкя (вознкновенио электрических зарядов противоположного знака На трущихся поверхностях), а такга перекисное окисление липидов, при котором возникают парамагнитные■частицы .(В.А.Барабой, В.Э.Орел, 1935).

При обосновании проведения. експершентов мы исходили из вывода, сделанного в работе С.В.Анненковой и соавт. (Í992) о том, что в триболжшнесценцию высушенных образцов вносят вклад две составляйте:' пврекисноо окисление липидов, 'остающихся; в белка после лиофилгзацш! и нарушение упорядоченных' структур внутри макромолекулы. Однши вклад кавдот из этих компонентов в общую триболэ-

10сиенцию окончательно не выяснен. С целью решения втой задачи проводили регистрации свечения в условиях различного газового -2тавэ. При постановке экспериментов исходили из предположения О и, что перег'.исноо окисление ллпидов в атмосфере» инертного газа гибируется (Ю.А.Владимиров, Л.Н.Лрчаков, 1Э72), а при продувка экционной камер кислородом ого интенсивность максимальна.

Изменение газового состава в розкционноЯ камере (гелий на слород) привело к статистически достоверному увеличении интен-вности триболгминесценции в сухих образцах сывороточного альбу-ла человека с 634,2 ± 83,8 до !00Э,9 ± 166,4 (рис. 1). В то so кэмя не наблюдается достоверного отличия интенсивности триболши-юцонции образцов, исследовашшх в атмосфере воздуха и кислорода.

Таким образом, полученные данные позволяют подчеркнуть, что в )зш!КновониЛ триболгминесцонцш! сывороточного альбумина перекис-)о окисление лилидов является определяющим фактором и его вклад ¡ставляет около С2%. Остальные 38$ обусловлены, вероятно, нарусэ-¡ем квазикристаллической структуры белка..

Известно, что УФ радиация вызывает в биологических объектах 1д процессов, приводящих к образованию и накоплении .продуктов ра-ыяльной природа. В связи, с этим интересным представлялось изу~ ить влиянио УФ света на трибо.тамнвсценттю свойства белков. Поученные в ходе экспериментов данные приведены нл рис. 2. Эти эзультатн позволят- предположить, что поело УФ облучения растш-эв альбумина с последуюцим высушиванием образцов возмояш дал пу-и увеличения их-триболюмшюсценции: активация процессов порекис-ого окисления-лшщдов и нарушение структурной организации мякро--олекули, обусловленные, вероятно, разрывом слабых связей, поддор-¡iraar;:i трзтичнуп структуру Солка, и обрззовз'ппм раджалоп.

Следовательно, свечонио триболшинесценции связано с роалича-ией .скрытых радикальных состояний независимо от природы ¡а гоз-иююеош'я и ого регистрация позволяет определить количество рзди-длов, гопнике« в белковом образце.

С цельи проверки данного продпологония нами были проведены кспор:мзит'1 по изменил влияния УФ света-ца спектры фотофлгорос-ionmni растворов сывороточного альбумина. Постольку данный метод шляется ко)!'1йрмзционночувствитолыш«, интересны.'/ представлялось [сслздовать воздействие УФ света на структуру макромолекулы альбу-зша и 'соотнести получешшо результаты с данными, получошигмп при хэгистрзцгп! трябодтинесценции фотомодифгщировашпгх растворов у;са-

1 г с -

110

101

ес

70

сс

50

Ш'

№

V/.'/,

Л

щщ

'ЙтлШШ

тЩ щщ

пщщ

жтк

Х7//Л

</////\ Ш;

У'/.:

Щ

чштщ

-.\\i\lV////.

жж

щ

щт

Ч:1 У'У'-'/Л,, ::т;| У///У/

тЛ

(

1

Ркс. 1. Интенсивность трибошоыинесцедцви сиророточного альбумина человека в условаях различного газового состава:. '

1 - контроль Г стандартная подпокха),

2 - в атмосфере Еоздуха,

3 - р атыссйерй кислорода,

4 -'» атмосфере гелия.

и'

200

150

100

50

Ш|1|рШ

ЩЩлШШ

1ш®г=

Рис, 2. Изйенекво ийтенспшюсти три-ОолйиЕПСсцецика образцов ольбуыика неповека после У О облучения: -1 - леоблучешшй образец, г.45ЭДв7м,( 3- 755 Дк/ы1.

- и -

зпнпого ео.тгл.

Облучшпю оипоготочиого аибуппп в доз эх 433 л 755 Дя/м пэ. щчшодит к статистически достое?г"с,"У вя"">ич1«и з интепсигиостк оросценцнп белка (р::с. 3). ДалыюШдао увеличено дозп облучеичл до

п

1510 Дч/м^ индуцирует уможзокио интоисигиости •¡с.уоросцошц.и в точно максимума. Эит факт ыэтцоюяютвуот о тем, что в дамюм случав наблюдаются конформзционнт пяр>т.тройт'.и ткромолокул», затрагивающие остатки триптофана н тнрозинз и их окружение.

Рис. 3. Изменение интенсивности флюоресценции сывороточного альбумина человека после УФ облучения его растворов:

1 - необлучешшй раствор;

2 - 453 Дж/мг; • 3 - 755 Пж/м2;

4 - 1510 Дж/мг.

Набллдземзя относительная фотоустойчивость альбумина монет бить объяснена исходя из ггредставлешм о доменной структура бола и наличии многочисленных носпецифичоских мест связывания лпгандов В.то го время иолучокнкэ результаты служат косвенным подтвергдаш ем активно развивпомоЯ в последнье время гипотезы об антиоксидант ной активности сывороточного альбуьына (Б.Е.Дубинина, 1992).

ГЛАВА 5. Исследование функциональных свойств фотомодифицщхэ-

¿аиного сывороточного альбумина.

С цзлью выяснения .процессов, происходящих в образцах сывороточного альбумина при его взаимодействуй с лигандами, нами были исследованы спектральные характеристики комплексов сывороточных • альбуминов человека (САЧ) и быка (ВСД) яри связывании кет красите ля .конго красного, а таю;е природных соединений - холестерола и а токоферола. .

.Путем гарьироЕзгля природы растЕорггелей (дистиллированная 'юрдэ» бутанол, ксилол, S моль мочевина), установлено, что решаициЯ .вклад е образованно комплекса сывороточный альбумш-конгорот вно-.сят взаимодействия гидрофобной природа, что подтварадаотся увеличением величины- оптической плотности исследуемой системы с повн-сением стеле}« гидрофебностн растворителя.

■ Повш'здао концентрации холестерола' с ÍCT*1 до 1й~3 моль, инду-IjipyoT увеличение екстинкцжл изучаемых образцов, что позволяет дс пустить воукогнойть.взаимодейстЕЩ! 'литанда по неспецифичорким . центрам емкиашш. Это ведет к изменения «асроокруйения 'хромофоров бслца и их экспонировании в растворитель. Добавление холосте-рэла б раствор УФ' облученного. < S0© 'Д»лН' сййЬроточногр альбумине ■•приводит к повышению дояичшш оптической плотности систеш.. Одна! большая степень изменения огатогюгло-дзния образцов при концентра-ада! литанда 10"^ моль па сравни»® с натившм белком и отсутствие холастерола V,ü:iot бить .связана 1,веляч0ю1ем'холесторол'связ1шаххд'эй способности альбумина. . ''. " '

Наблюдаемая пропорциональность К<еаду величиной оптической ■ плотности сис*еш и • концентрацией а-.токофоро'ла при его' добавлошю ■в раствор 'белка свидетельствует об образовать; устойчивого комп-' лакса сцвороточный альбум>ш-токофзрол, Вероятно, в случае взаимо-дойстш молекулы белка с ддшшм лигандом происходят измензшт конфермащя ¡,'л1ср0:.!здзкулы, лрпзодяцие к демаскирован;® хромсфора групп. Добавление а-токофэрола к раствору УО облученного (SOS

п

/м~) сывороточного альбумина приводит к умзньсетпз рзлгипш оп-

Ч9СК0Й ПЛОТНОСТИ СИСТ0МЫ, ГТриЧОМ ИСПОЛЬЗОВЗКИе- больших КОНЦОНТ-

Lpiil токоферола индуц1!руот болоо глубокие изменения. Поскольку дом авторов (N.Khettab, 19&3; В.П.Еорболович и соавт., 1990 ) казано.что <Х-токофорол является антиодсидантом и оказывает рао- и фотозагди ное действие по отношению к бислоппосгаш систе- ' м, подобий эффект мояет быть обменен тем, что, соединяясь с ¡ьбумином, этот лиганд тормозит протекзкие реакция фотоокислешм Lira.

Тзкга образом, полученные данные позволяют заклглить, что пэ-гшной оптической плотности мокло характеризовать количество евл-швэгося с белком лиганда, а, следовательно, к оценивать' транс-эртную способность сывороточного альбумина по отнсиогогв к иссле-эваннш весествам в условиях воздействия различных фкзико-хгсш-эских факторов. . • •

ГЛАВА 6. Влияние УФ света на структурш-фушшпеналышэ свой-

тва гемоглобина. • . '•.'.-',

В результате проведонних экспериментов показано,.что уф-облу-

■7

ение растворов оксигемоглобина в дозе 151 Д^/м" гызыгаот смоценггз рктг:' диссоциации окс!1гемоглобш!а (КДО) в об/лсть' 'кэньзсс значо-ий гарцизльнсго давлешм кислорода по сравнению с контролем (но-ОлученнцЯ раствор),' что свидетельствует о потдген!?! сродства го-сг.юбина к кислороду. Дальнейшее увеличетч дозы но приводит К достоверному измеиагого пологения КДО. Однако константа ХЯлла (а), ¡еличиноЯ которой пр!Шято характеризовать степень кооперативного |фф?ктй внутри макрэмолэкулн, при'этом существенно умечи-, глоте я. )го подтгоргздаот дамшо, полученные с пемогц.п метода голь-хромато-•рафии (В,Г.Лртюхов, О. В. Путнице га, 1979), о том, что погложете жерг;ш Уф излучения сопровождается юмянотгам прогда всего четвертичной и третичной, структур гембелка (табл. 1).

С цолт изучения возможности рогулггрог.анил кислородтрансгорт-юй функции гемоглобина нами исследовалась ^ртопрэтоктортшэ свойства се;то'го-";нз при УФ облучошгн система гомопротокд-броготшя з млн. '

¡'.з полу-югшых. данных следует, что добавлению сорттотш:! к раствору несблученного геютлобина прггоадэт к зглчитальнс:.с/ сне-дг1-вю кривых диссоциации- оксигекоглобгагз з область кашлях значений парциального давления кислорода Српз. •'). Слэдоштодыю, ия уропно

Та'ЗЛНЦС! 1

1'ш,;:;па!и!а основных пара.матюв с к-згсбн-'

гемоглобина при УФ облучошгн вго растворов

Доза облучонгш, КгЛр Р50' мм рт.ст. Коне та; па Хилл: (а)

0 19,63 * 0,9Э О ОС

151 13,83 ± 0,65 1,43

802 13,64 ± 0,93 1,31

453 13,05 ± 0,72 1,78

. 604 11,40 ± 1,41 • 1,48

pQj.uupT.cT.

Рис. Л. Кривые диссоциации охсигемогло-бийа человека, модифицированного серотони-ком: ■

1 - контроль(без серотонина),

2-Ю-5 моль,

3-10*'моль,

4 - 10'3 моль серотоннн.

пшгзмл ото чогэтт проявляться в псшг-гк-.г,; иг-рыт-пного дзпмися '.юрода п крсрн. Это пглдпэлсо'зннл roivryc'i" с гппотлзоЯ Гр-'Л '

;:..'. (!'.':?.) о тем, чго n огкопо ирог/.издучогого доЯствия серо-miKi жвчгг гилохссчоспгЯ махзнизм и :кмгл'чулдлтыя с пекС*г,ьп пэ-сгря¡лчоокого -¿года ил кроготгоршк qrrnmx .":.:::■?(! (IT.IVKopx) -

(КО, 1971).

В ТО .'"Я ВрОМЛ розультатп ИЯГДХ ОПИТСЧ НО ПрЗТИНЭрт'ПТ бпЛРО 1дам данным (Vi.LoIrnm, Л.Кэзз, 1957; З.Г.Лртпхов, 1923), r.ovo-1 свидетельствуют в пользу представлен;:;! о том, что сорстотьч зимодеЯствует непосредственно с 6сл1сзми, образуя комплекс!.' с /и.

Оба этих факта позволяют прэдпологипгь, что 'создавался на; популярном уровне гипоксия молот слупт. одглм из механизмов» блл-;аря которому серотснин проявляет свои фотопротс:стор;!уа функция.

Полученные результаты.дают возможность сделать заключение о' м::-зннсЯ кащентрациопкоЯ и дозовоЯ оавйсш'зсти фтозбдаягсго Еюкта биогенного амина. Ojyiaico характер зтоЯ зависимости рззл:1-1 для сродства гемоглобина-к кислороду и степени коопорзтюх^го [iSKTq внутри болковоЯ м.лкромолбкулы. Это'подтварздает -ПОТОТРЗУ-.К.'Наградою, .1990) о том, что вызываемые сглриюгаом лигандз гформзцлонннэ изменения одной из субъодинзсц через область субъ-пичгшх контактов способны мигрировать внутри тотракорэ и • шифровать перестройки. других цепей. .

ГЛАВА 7.: Исследование структурно-фу^гаогогалышх свойств гоГ'о-

эбина, модифицированного воздействием температуры. . ;

Несмотря на накопленный обпз1р!ШЯ' материал по плнятгл томпор->-:н на болки, значительна интерес проставляло р/эяеннэ ¡»проси о ззстеро п TOifKO данотурацнонного перехода- модекул гемоглобина, п :i*o структурных и функционал: ннх гамгчгЛяш гс::^;:го7оидов при ■ зртольно оппсноЯ гипертермии.

С целью' решения зтоЯ проблемы мн исследовали плитке темпера- -

г. интервале 20г45°С ня структуру молекулы и функциональные ?Яства гемоглобина мызвЯ, что проявлялось в измэишти полотонил ;ормы кривых диссоциации оксигомоглобина.

Получечашэ экспериментальные данные спкдетзльствупт о том, ) погкт-зние температуры до 42-45вС индуцирует измлгонмо (Jopi.m Ирис. 5). Как следуот из графшеа, np:t атом наблгздшзтея ymcrtm >тря;зтелы:оЯ кооперативностьи (atl). Кл »пп взгляд, такого рода

-1G-

изыенешю кргеой инфоршгрует о начале процессов ассоциации молеку. гемоглобина (до начала ее видимого проявления) в надтотрамерные образования путем СЕязшзашш дополнительных субъединиц.

С целью проверю! данного предположения ми провел: экспэрмен-ти с использованием додецялсульфать натр1я (ДСН), поскольку известно (В.Л.Шпицберг, 1966), что в ряде случаев он вызывает ассоциацию олигомеров на субъединицы.

Пр1 добавлении к раствору гемоглобина, нагретого до 42°С, ДС1

с:

в концентрациях (1,73*3,47)-10 моль происходит изменение положения КДО (рис. 6). Детергент в концентрации (1,73*2,08) ИСТ5 моль не Изменяет форму кршой по сравнению с контролем (42°.С в отсутствие химического агента). Это свидетельствует о том, что в данно» случае ДСН на оказывает"заметного влияния на количество агрегатов высокого порядка, которэе проявилось бы в изменении формы КДО. npi увеличении концентрации детергента кривая диссоциации оксигемогло-оина через промежуточное состояние (2,43-10 моль) переходит в гиперболу ((2,60*3,47)-lO-0 моль). Форма кривой при атом свидетельствует о постепенном уменьшении числа "надтетрамерных" образований гемоглобина и диссоциацией молокул гембелка на субъединицы.

.ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Результаты проведенных -експершвнтов показывают важную роль микроокрухешш белков в'процесса функционирования организмов. Вы-зываемт УФ светом и нагреванием изменения функциональной активности исслодовашшх белков (гемоглобина и сывороточного альбумина ряда млекопитощих) детерминированы структурными перестройками белковых глобул, затрагивающими, прозде всого, третичный и четвертичный типы их структурной организации.

При создают теории кооперативного связывают гемоглобином кислорода было показано (D.Kosliland et al., 1966; J.Mono et al., 1955; K.Perutz, 1972), что процессы окскгенации-дезоксигвнации болка сопровождаются его конформационными перестройкам!. В то яе время из вкспершонтов, характеризующих связывание холестерола и а-токофорола с сывороточным альбумином, следует, что в данном случае такке наблюдается изманешш тротичной структуры. Это позволяет высказать предположение о том, что изменение третичной структуры является единым механизмом ответной реакции болтовой макромолекулы на связывание лиганда. В случае гемоглобина, являющегося олигомер-ним' белком, -вероятно, мохет происходить миграция 1сонформационнс^о состояния внутри тетрамера, осуществляемая через область субъеда!-

t 3 .43 S3 С-} КЗ СО 140 S3 р^.иартст.

, Рас. 5. Кривые дисссаизцнл схснгеиоггоби-на, иояи$"аанровввного зоэпэлстеиэу температуры: . •

1-40 С,

2-42'С,

3-45'С.- .

рС^. UM рт ст

Pix. S. Кр;!2ыа де^социзцйи оесагемо^лоба-' " на при 42"С после ызгиднкгиш аггеци.чеуль-уатом яатрал: . 1 - контроль, 2 -1,73 • Ю-'моль,

3 - 2,08 -10 -SiiOib, 4 - 2,43 - 'Онколь, • 5 - 2,50 5 - 3,47 -10 "5моль.

1ичн:и контактов и скощаищая равновесие реакции диссоциации на протомеры.

Воздействие интегрального потом УФ света (240-390 нм) на исследуемые белки такке индуцирует изменение их микроокруяения, сопровождающееся конформационными перестройками, находящими свое от-рашэше в спостральных характеристиках исследовашшх объектов.

Для. сывороточного альбумина характерны процессы частичного разворачивают макромолекулы при действии указанного фактора и накопления продуктов свободнорадикальной природы. Ранее протекание такого рода процессов было продемонстрировано для молекул гемогло-бшш мышей (В.Г.'Артюхов, 1992). Таким образом, процессы разворачивания-сворачивания глобул и накопления свободнорадикальных состояний являются, по-видимому, общими для белков в ходе ответной реакции на воздействие УФ излучения. В диапазоне терапевтических доз УФ света, использовавшихся в ходе наших экспериментов, решающее значение в фот^модификации как простых белков (альбумин), так и гемоггротоидов (гемоглобин) имеет полипептидая цепь, которая для случая с гемоглобином выступает первичным акцептором энергии УФ квантов (В.Г.Артюхов, 1992).

Полученные нами данные расширяют представление о взаимосвязи мевду структурой и фушсцией бел!сов,. рассматривая вту связь как взенойший из механизмов молекулярной адаптации организмов к воз-двйстЕ!® вктримальных факторов среда. 11 сожалению, представленные результаты, раскрывая общую направлешюсть взаимосвязи структурных изменений молекул гемоглобина и сывороточного альбумина с проявлением ими функциональных свойств, не позволяют соотнести транспортную активность исследовашшх белков с легализацией конкретных аминокислотных остатков.

Проведенные експерименты, а такие анализ имощчхся литературных данных, посвященных влияют УФ света на болковыо структуры, дает, нам основание предложить следующую схему ответной реакции гембелков на воздействие данного физического агента:

разоганио

?

ободннх — диколов

У$ слот (~ 275 им) 1 .

хро?. апобелка

I \

миграция шграцня

возбуздешшх состояния -----—»знергии

внутри апобелга на гом •

-реализация изменение

возбужденных . валентности состояний атога полоза

■ I

изменение конформавдонного состояния

1 ■

изменение функциональных „___

свойств

Внесение в раствор гемоглобина серотонша, являяцегосл природ-т антиоксидантом, вызывает образование комплекса белок-бно/онны'! /ин, что находит'свое отражение в изменении положения кривых дис-зциации оксигемоглобина. Эксперименты с использованием различных , знцрнтрзций серотонина позволяют предпологпггь, что процесс комл-эксообраоования носит двухфазный характер,.осуществляется в сблас-I суОмдиничних контактов и стабилизирует молекулу геколроте'вда. эОлюдлемоо в о том случав уго ллченио гагслоролсв,гянрлг,.",йЯ слоео бнос-;; гемоглобина могот, на наш взгляд; играть роиап?,ув роль, в прояв-знии сор тонином фото- и радиоиротекторного дейстг.'эт г з отнесении биосистемам, понизал парциальное давление кислорода в органах и

[мзнях.

Проявляемый биогенным амином резко вираге^-шгЛ фотоззгршшй' пф-зкт позволяет использовать его в клгагическсй практике 'как агент, рзпатструкций прэтекани» реакций <|отсмоди£пи1цт1 функциональных войсти гемоглобина п системе крови при ¡'спользопэнии, в частности, этодп АЯ-УЖ. Широкий интервал исследоьамгяс концентраций сорэто-

зорвировашш ободнорадикальных

'СТОЯНИЙ

1Ш1Ш дает возможность определить необходимые для введения концентрации модификатора при различных дозах УФ облучения, приметаемых при данном методе лечения больных.

Температурная модификация гемоглобина (20-45°С), сопровождающаяся разворачиванием белкоюй глобулы, позволяет выявись точку денатурациошюго перехода, соответствующего =42°С. Изменение формы кривых диссоциации оксигемоглобина в ходе указанного процесса, -вы-рзжапцееся в появлении участка с отрицательной кооператшзностью в зоне линейного нарастания концентрации оксигемоглобина, свидетельствует, на наш взгляд, об ассоциации с твтрамером гемболка дополнительных субъедшшц с образованием "надтетрамерных" образований. В пользу справедливости такого представления говорит возможность . влияния на указанный процесс додецилсульфата натрю. Кроме того, возможность образования состояний белков с большим числом ассоциированных субъедишщ была показана, например, в случае метгемо-глобинредуктази (Н.М.Козлова, Е.А.Черницкий, 19Э1). вывода.

1. Методам! спектрофотометрют, регистрации кривых диссоциации оксигемоглобина, триболюминесценщш, фотофлюоресценцш! и ионообменной хроматографа выяснена шаимосвязь между проявлением гемоглобином и снвороточнш альбумином специфической функции транспортирования лигзндов и основной.направленностью изменения их структуры в условиях модификации этих белков УФ светом и Температурой.

2. Показано, что триболюминесценция высушенных образцов сывороточного альбумна человека обусловлена двумя составляющими: пе-рогленым окислением липидов, остающихся в белке после лиофилиззции, и собственными изменениями белкоюй глсоулц. Определен ьчслад каждого из этих механизмов в общую интенсивность триболюмпносценции..

3. Установлено, что УФ облучение растворов сывороточного аль-

о

бумина человека (453 и 755 Да/м*") вызывает резкое увеличение интенсивности триболююшесценцкп, что обусловлено активацией процессов перокисного окисления липидов, а также возникновением продуктов радикальной природы в молекуле болка.

4. С помощью фото-флюоресцентного метода выявлони, что при дозе облучения 1Ы0 Дх/м^ оонарухивается снижошш интенсивности све чения сышроточного альбумина. Сравнение степени модифицирующего двЯстеил УФ излучения различных доз (4534-1510 Дж/ьО указывает на высокую фотоустойчивость данного болка.

Ь. Споктрофотометричеси«.! методом установлено, что в ббрлзо-

чие комплекса сывороточный альбумин-конгорот преимущественный лад вносят взаимодействия гидрофобной природы. После УФ облуче--

о ,

я растворов бглка (2420 Дя/м*") отмечается уменьшение количества азавяагсся с ним красителя, что свидетельствует, о снижении стоп гидрофобности белковой глобулы, вероятно, замечет окспошгро-ния гидрофильных еяшокислотных остатков в растворитель.

6. УФ облучешга сывороточного альбумина (906 Дж/м2)' индуциру-увеличение его холестеролсвязывапдей способности. а-Токофврол этих условиях препятствует протекашео реакций фотоокисленгтя аль-млша. .

• 7, Показано, что УФ свет (151-Й304 Де/м") вызывает сдвиг кри-х диссоциации океигемоглобина. в область меньших значений парци-ьного давления кислорода, что свидетельствует об увеличешм ого ■слородсвязнвакцэй способности. По-видимому, этот гфоцесс обус-влен диссоциацией тетрамера гембелка на субъединици.

8. Добавлению серотонинэ' (10_5-10-3.моль) к раствору нзтив-1Го гемоглобина человека вызывает скеэдше кривых диссоциации ,ок-[гемоглобина в область меньших значений парциального давлзшт ¡слорода по сравнению с контролем, что указывает на фгыгг образо-

1ния устойчивого комплекса гемопротеид-биогенный амин.

1 —Я ■ -- ■

9. Серотошш в конгэнтрзциях 10~ -10 таль зас^пг.а^т <го::огло-ш человека от модифицирующего действия УФ излучения (151+604 гЛГ). Фотопротекторные свойства серото!п;на обусловлены, Т^ всей !Димости, эффектом. ГИПОКС1Г!, создающейся на молекулярном уровне.

10. Повышение .температуры от 20 до 40°С вызывает смеценпо вшых диссоциации оксигемоглобшга мысеЯ в облзсть больп:1х зпзче-1й парциального давления кислорода, что свидетельствует сб уг-знь-?ши сродства гембелгл к кислороду. При дальнейшем нагрешни:: • ¡створов белга до 45°с включительно выявлен дзнатурацкошшй пере-)д, вырат^и'^йся в образовании "издтотрз'зрних" Ооря гетпготе:',п попел?!::::! нз кривой участка с отрицательной гаопоратипкзетхл.

1!. Длдснллсульфат натрия (1,73-^3,47) «Ю-5 голь) с:.*з!шас? »Н'МЮШ!-; пвгрхжругвиия молекул тормостптирэгзиного (20-42вС) я*м\яоС::га. 3 результате указанного'процесса 'происходит дкссоцкз-].т как нхгипных иолскул белка, так и агрегатов более гысокого подал, а крепыэ диссоциации оксиге«оглоб!ша приобретает пигарбол;!-юкуп форму, характерную для моно- и диэдров галопротеидч. '

список работ, опубликованных по темн диссертации

1. Артюхов Б.Г., Вашанов Г.Л. Ккслородсвязивамци-з cbcí'cii>-~i гемоглобина, кэда^ицнрованного воздэйстшэм температур;! и додещ сульфата натрия// Физиол.нуршл СССР.- 19Э0.- T.7S, к ю.~ С.13С 13G7..

2. Артюхов В.Г,, Вашанов Г.А., Панской К.П. Структурно-фут ционалышо свойства гемоглобина «шей при действии УФ-свзтз и tí перотурп// Проблемы кадастра, экологии и охрани животного мира России: Тез.докладов Всеросс.конф. - Воронеж, 1Ь-1Э октября, 199С С.110-111.

3. Артюхов В.Г., Вашанов Г.A. Изучение елияшш температуры етруктурно-функцпоналышэ свойства гемоглобина и цитохрома с// ! лекуляртю и клеточные основы кислотно-основного и температурно] гомеостаза: Тез.докладов Всесошн.конф.- Сыктышсар, 4-8 июня, 19Э1-- С.6.

.• 4. Вашанов Г.А., Коробов В.Н., Артюхов В.Г. Пршеношш мэт< нгносбмонной хроматографов: для выявлюш*.я структурных нарушений ¡ 1юторых гсмопротоидов// Применение ионообменных материалов в np¡ мыаленности и аналогической химии: Тез.докладов Всесоюзн.конф. -Воронок, 1-4 октября, 199U- С. 386-387.

5. Вашанов Г. А., Путинцева О.В., Артюхов В. Г. Спектре фотом' ричоская оцешса структурно-функциональных -нарушай гемоглобина посла терыостатироЕзния его растворов// VII конференция по cnoir роскопки биополимеров: Тез. докладов Всесоюзн. конф. - Харьков, .1-октября, 1991.- С.37-38.

6. Артюхов В.Г.,' Вашанов Г.А., Рукавишникова O.K. Триболвк носцентнче свойства растворов сывороточного альбумина в условия: различного газового состава// Люминесцентный, анализ в медицине ; биологии и его аппаратурное обеспечение:. Тез.докладов Всесоюзно: совещания.- Москва, 17-23 февраля, 1Э92.- Z ч.- С.12-13.

7. Вашанов Г.А., Артюхов В.Г. Анализ фушсционалышх свойст: гемоглобина при воздействии УФ-света й температуры// Состояние : проблемы экосистем Усманского бора.- Воронеж, 1992.-выпЛ.-

С.144-150. •

8. Artjukhov V.G., Yaahanov G-.A., KoYaleva Т.A. La?/s oí Structural and i4irictlom.l changes oí complex proteins extracted different mlcroenvlronment// Intern, organic substances solvent extraction conference: CC if. papera.- Voronezh, September, 22-21