Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

АНАЛИЗ РОЛИ ЛОКАЛЬНЫХ БИОЭЛЕКТРИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ В РЕЦЕПЦИИ ОХЛАЖДЕНИЯ У ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ CVCVRBITA РЕРО L.)

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "АНАЛИЗ РОЛИ ЛОКАЛЬНЫХ БИОЭЛЕКТРИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ В РЕЦЕПЦИИ ОХЛАЖДЕНИЯ У ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ CVCVRBITA РЕРО L.)"

с

На правах рукописи

МЫСЯГИН Сергее Алнмммч

АНАЛИЗ РОЛИ ЛОКАЛЬНЫХ БИОЭЛЕКТРИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ В РЕЦЕПЦИИ ОХЛАЖДЕНИЯ У ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ СиСиЯВПЯ ГЕЮ Ь.)

03,00.12 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород

2003

Работа выполнена на кафедре биофизики Нижегородского государственного

университета им. Н И. Лобачевского

Научный руководитель; заслуженный деятель науки РФ

доктор биологических наук, профессор Опрктов В. А.

Научный консультант: доктор биологических наук,

с.и.с. Пятыгия С .С.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Лобов В.П.

кандидат биологических наук, доцент Дятлова К. Д.

Ведущая организация: Казанский институт биохимии и био-

физики КазНЦ РАН

Защита состоится "_" декабря 2003 г. в_часов на заседании диссертационного совета К.212,166.02. Нижегородского государственного университета им.

Н И, Лобачевского (603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского

Автореферат разослан **_" ноября 2003 года

И.Ф. Александрова

Ученый секретарь диссертационного совету, кандидат биологических наук

------7? /

уМН-

Основные со крашения и обозначения Л1Ц - амплитуда потенциала действия, Л ЦП - аналоговом тфрокой преобразователь, БЭР — биоэлектрическая реакция, НД - потенциал действия, РП - рс-цепторный потенциал, Т„т - пороговая температура 1снерании потенциала действия, ЛТ,.т - пороговый перепад температур, необходимый для генерации потенциала действия, Е„, - мембранный потенциал, Ли - внеклеточно (поверхностно) измеряемая разность потенциалов. Ли» - внеклеточно намеряемая разность потенциалов в -зоне охлаждения, ¿Ш; - внеклеточно измеряемая разность потенциалов вне зоны охлаждения.

Общая характеристика работы Актуальность проблемы. В настоящее время у высших растении установлены и достаточно хорошо изучены разные виды электрической активности. Однако, вопрос о том, какую роль играют биоэлектрические потенциалы в растительном организме, остается во многом дискуссионным.

Очень важным представляется возможное участие биоэлектрических реакций (БЭР) в рецепции раздражения клетками высших растений. Этот вопрос исследован крайне слабо, хотя у так называемых двигательных растений злек-трофиэиологическим способом точно установлен этап реиепиии механического стимула и возникновение рецелторного потенциала (РП), при водящего затем к генерации потенциала действия (ИД) ^аскоЬзоп, 1965; ШШкиш. Рккпп!, 1972). У высших нелокомоторных растений отсутствуют такие высокоснепна-лнзированные ренепторные образования, какие имеются у животных (например, механореценторы, световые рецепторы). Восприятие внешнего раздражения у них осуществляется, по-видимому, при участии клеточных мембран, в первую очередь, плазматических мембран эпилермальных клеток. Молекулярные механизмы такого восприятия пока неясны, но можно полагать, что они связаны с изменением состояния как лишшюго матрикса мембраны, так и включенных в нее белковых систем (Оргйоу, Руа1у{?т, В электрофизиологии растений термин "рецептор» I

ияк>т, как правило, при изучении механореиепшш у высших растений и хзро-вых волороелен. В этом случае РП - небольшая, временная деполяризация, вол tu каюта я в ответ на механически» стимул. РП косит градуальный характер, то есть его амплитуда зависит от силы стимула. Когда РП достигает порогового гначення, возникает ПД (Sliimineii, 2001). Рецепция других стимулов (химических и температурных) практически не изучена. В ряде работ отмечается гот факт, что достижение порога возбуждения при охлаждении клеток высшего растения связано с инактивацией протонного насоса (Онритов и др., 198*1; Pyaiygin et al., 1992). Это приводит к входу ионов Саг* в клетку, затем к активации Са"*-завнсимых СГ-ка налов, при участии которых формируется фаза деполяризации ПЛ. Таким образом, у высших растений механизмы подпо-рогоаых изменений Е„, отличаются от механизмов генерации ПД. Для животных объектов показано, что механизмы генерации РП и ПД различны.

У животных объектов установлено, что РП обладают следующими свойствами:

1) Г радуальный характер РП; его амплитуда зависит от величины стимула;

2) При достижении порогового значения РП генерируется ПД. Если РП вызывает генерацию ПД непосредственно в рецепторной клетке, его иногда называют генераторным.

Реиспторные клетки также обладают рядом свойств: Í) Высокая чувствительность к определенному раздражителю;

Способность к значительному усилению сигнала. Энергия электрическо-141 сигнала, возникающего в результате транедукции, намного больше >ncpi ии внешнего стимула; .

3) Высокая избирательность по отношению к стимулам определенной модальности, то есть рецелторные клетки определенного типа реагируют только на адекватные стимулы; , í

■1) Возбудимые структуры рецепторных клеток обладают способностью к аккомодации, то есть достижение порога возбуждения зависит от скорости нарастания стимула;

5) Способность к сенсорной адаптации, то есть изменение реакции и результате повторной стимуляции.

Могут ли клетки (в первую очередь эпнлермальные) высших растений, не обладающих локомоторными функциями, иметь свойства реценторных клеток и генерировать в ответ на внешний стимул местные БЭР с признаками РП, остается неясным. Рассмотрение этого вопроса представляется важным для раскрыта механизмов взаимодействия растения со средой и доказательства универсальности процессов рецепции на клеточном уровне у высших растений и животных.

Цель и основные Ц9<л1?>1"ван><я- Целью настоящей работы было

комплексное электрофизиологическое исследование роли биоэлектрических потенциалов в рецепции охлаждения клеггками проростков тыквы.

Были поставлены следующие задачи: 1) изучение способности генерировать ПД в ответ на охлаждение различных органов растения, 2) изучение аккомодационных свойств порога возбуждения при охлаждении с различными градиентами, 3) изучение сенсорной адаптации при действии периодического охлаждения, 4) влияние расиросфаняющнхсч ПД на параметры БЭР возбудимых клеток в связи с процессом рецепции.

Научная новизна. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что эпидермальные клетки стебля генерируют ПД в ответ на охлаждение и могут передавать возбуждение электрошнически, в радиальном направлении эдек-тровозбудимым пучковым клеткам в глубине стебля. Холодочувсгвитедьность клеток стсбля может быть очень высокой. ПД возникает при перепаде температур всего 1,3 "С.

Показано, что пороговый перепад температур, необходимый для генерации ПД корнями, намного больше, чем для клеток стебля и равен 15 1>С. Возникающий ПД распространяется акропетально в стебель и регистрируется на расстоянии 5 см от корневой шейки.

Порог возбуждения поверхностных клеток стебля в зоне постепенного охлаждения обладает способностью к аккомодации. При увеличении скорости ох-

ÍP

лаждення пороговый перепад температур, необходимый для-генерации ПД (AT,hV) уменьшается, что связано со снижением порога возбуждения.

Возбудимые структу ры клеток стебля проявляют способность к сенсорной адаптации, как по типу привыкания, так и сенситизаиии'уже при 15-минутноч интервале между стимулами. Увеличение интенсивности воздействия (глубины охлаждении) приводит к преобладанию эффекта сенситизации.

Наv ч н о-11 ра tfriугеское чначе н ие. Подученные данные важны для выяснения рши 1>'Л' в рецепнии охлаждения у высших растений. Было показано, что возбудимые клетки высших растений обладают рядом свойств, присущих ре цеп-торным клеткам животных объектов: высокая чувствительность к определенному раздражителю (охлаждению), способность к значительному усилению сигнала, способность к а к комода пи и порога возбуждения и сенсорной адаптации. ">ui i оворит о сходстве процессов рецепции внешних факторов у животных и растительных объектов, что способствует развитию представлений об жолкжии процессов рецепции у различных типов возбудимых систем. ()ршви"С положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Клетки корня проростков тыквы {Cucurbtta pepo L.) могут генерировать ИД в ответ на охлаждение. Этот ПД способен распространяться акролетально вдоль стебля.

2. ')ин,термальные клетки стебля генерируют ПД при действии локального постепенного охлаждения и передают возбуждение олектротонически шектровозбулимым пучковым (слеткам вглубь стебля.

.1. Позоулимыс структуры клеток стебля способны к аккомодации при рецепции в юне охлаждения, то есть достижение порога возбуждения зависит «i скорости нарастания стимула.

•(. Характер сенсорной адаптации Оабитуация и сенситизаиия) клеток стебля зависит не только от интервала между стимулами, но от физиологического состояния растительного организма и интенсивности воздействия. При увеличении силы воздействия (глубины охлаждения) проявляется сенсорная адшшшия по типу сенситизации, то есть происходит первона-

чаль нос увеличение максимальной скорости реполяризаини и уменьшение длительности местной БЭР, что можно связать с активацией Н*-ЛТФазы, так как данные параметры косвенно характеризуют активность протонного насоса.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на V Путинской конференции молодых ученых, (Пувдино, 2001), International symposium "Signalîng Systems of Plants Cells" (Moscow, 2001), Годичном собрании Всероссийского общества физиологов растений *Окспериментальная биология растений" (Уфа, 2001); Международной конференции "Актуальные вопросы экологической физиологии растений в 21 веке" (Сыктывкар. 2001); IV н V Международных симпозиумах "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования" (Москва, 2001, 2003); Международной конференции "Регуляция роста, развития и продуктивности растений" (Минск, 2001 ); Всероссийской научно-практической конференции "Физиология растений и экология на рубеже веков" (Ярославль, 2003); V съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано и направлено » печать 13 работ.

Структура н объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав .(включая обзор литературы), заключения, выводов и списка литературы. Изложена на страницах, содержит рисунка и таблицы. Список цитируемой литературы включает работ, из них на иностранных языках.

Объект и методы исследования

Объектом исследования служили двухнедельные проростки тыквы < 'tiatr-biia реро L., сорта Мозолеевская. Растения выращивали гидропонным способом при освещении люминесцентными лампами (6-8 клк), световом периоде 12 часов н комнатной температуре (20-23 °С). В качестве субстрата использовали керамзит, питательным раствором служила 50%-ная среда Хоглэнда-Арнона.

Регистрацию изменений разности потенциалов (AU) проводили между уча-

стком стебля и корнями. Участок стебля располагали в кювете, укрепленной на поверхности тер моочлаждаю!цего столика. Кювету заполняли стандартным раствором содержащим, I мМ КС1,0,5 мМ CaCIj, 0,1 мМ NaCt,

Внеклеточную регистрацию изменений AU осуществляли неполяризую-шимися хлорссрсбряными макрозясктродами ЭВЛ-1МЗ. В качестве электродов Сравнения применяли также электроды ЭШ1-1МЗ, погруженные в стандартный раствор, омывающий корни. Электроды подключали к усилителю и регистратору. В качестве усилителя использовали ионом ер универсальный ЭВ-74 с входным сопротивлением Ю11 Ом. Применяли компьютерную цифровую регистрацию с номошью платы аналог ово-цнфрового преобразователя (АЦП). Дальнейшую обработку результатов осуществляли на персональном компьютере с использованием программы Excel 7.0.

Регистрацию изменений Е» проводили на эпкдермальных клетках стебля проростков тыквы с помощью олно канальных микроэлектродов.итготоапенных и> с1скла "Иирекс" на микрокузнице МЭ-4. M и кро электроды заполняли раствором ЗМ KCI по стандартной методике (Кожечкин, 1975).

H качестве физиологически умеренного раздражителя, вызывающего генерацию ПЛ. применяли постепенное охлаждение участка стебля помешенного в кювету, от 27-30 до 8-10 "С со скоростью 1,5-3,5 "С/мин. Охлаждение производили при помощи термоохлаждзюшего столика. Скорость охлаждения задавали, изменяя напряжение, подаваемое через трансформатор на термостали к. Иосскшовлснме исходной температуры осуществляли путем смены полярности шка через термостолик. Изменение температуры s микрообъеме кюветы регистрировали миниатюрным термистороч из комплекта медицинского термометра 'ППМ-60М, который подключали через уравновешенный мост Витстона к иономеру универсальному ЭВ-74 и плагге АЦП.'

При изучении местных БЭР в ответ на периодическое охлаждение клеток ею1ля раздражитель наносили с интервалами IS, 30 мин. В зоне охлаждения раиориропали местные БЭР, для характеристики которых использовали следующие параметры: температурный порог местного биоэлектрического ответа.

который определялся как разница между исходной температурой и пороговой температурой (Тпт>), при которой начиналась генерация ПД; длительность местной БЭР, выраженная в секундах н максимальная скорость реиоляризаиии, измеренная в мВ/с. Для исследования зависимости характера сенсорно¡1 адаптации от интенсивности раздражителя, клетки стебля проростков тыквы охлаждали с глубиной 6 и 12 "С, изменяя таким образом силу воздействия. Интервалы между стимулами были 30 мин.

При изучении способности корней генерировать ИД в ответ на охлаждение их помешали в кювету, расположенную на поверхности термостолика, где находился первый измерительный электрод. Второй измерительный электрод помешали на стебель на расстоянии 5 см от корневой шейки. Электроды сравнения контактировали с листом на значительном удалении от корневой системы. Корневая шейка находилась вне зоны охлаждения. Применяли глубокое охлаждение клеток корня от 15-18 "С до 0-2 °С.

Опыты проводили не менее чем в 5-кратных повторностях. Результаты экспериментов обрабатывали при помощи методов вариационной статистики (Лакин, 1973; Тейлор, 1985).

Характер электр офизиологическою ответа клеток стебли и корпя проростка тыквы па постепенное охлаждение

БЭР клеток стебля в ответ на охлаждение имеет достаточно сложную кинетику. Несмотря на значительную вариабельность в динамике изменения мембранного потенциала всегда можно выделить ряд типичных фаз обязательного или факультативного характера (рис. I).

1) Латентная фаза.

2) Фаза подпороговой деполяризации. Дио медленно возрастает, достигая уровня порога возбуждения.

3) Возбуждение или фаза надпороговой импульсной деполяризации, При весьма незначительных перепадах температур мембранный потенциал резко смешался, формируя передний фронт ПД в зоне охлаждения. Через не-

сколько секунд после возникновения фротв ПД в охлаждаемых клетках регистрируется распространяющийся по стеблю ПД.

4) Фаза дальнейшей ле поляризации. Л и» продолжает постепенно возрастать п ходе снижения температуры. При этом в пределах одного охлаждения может возникнуть несколько ПД

5) Фаза реполяризашш, ЛЦ> восстанавливается до промежуточного квазистационарного уровня в лоле восстановления температуры.

6) Следовая фаза.

Время от качала охлаждения, с

Рис. I. Типичные БОР в ответ на охлаждение гипокотнля проростка тыквы. Ди,, разность потенциалов в зоне охлаждения, AU/-разность потенциалов tía расстоянии 5 см от тоны охлаждения, Т°С - изменение температуры, Tllop« пороговая температура возникновения импульсной деполяризации, 1 - 6 - фазы развития БЭР (объяснение в тексте).

Возникает вопрос о том, с какими клетками стебля связаны регистрируемые ЮР. На рис. 2 представлен фрагмент одновременной записи внеклеточно регистрируемой биоэлсетр и ческой активности (AUo) и мембранного потенциала (1£щ) (микрогпекгродное отведение) одной эпидермальной клетки в зоне очлаждения. Из нее видно, что изменения Ет и AUo очень близко совпадают л руг с другом по времени н амплитуде на этапе подпороговой деполяризации. По>ючу мы полагаем, что ведущим в эту фазу яаляетсЛ элеюрогенез эпидер-мальных клеток и их можно рассматривать как клетки реиеоторные ло ото-

шенню к охлаждению.

На следующем этапе импульсной деполяризации изменения ди<, также почти точно совпадают по времени со сдвигами Ега, но заметно меньше по амплитуде (Е„, =122 мВ, Ли«=105 мВ). Различие в амплитудах деполяризации трудно трактовать однозначно, но, вероятно, это не результат внеклеточного шунтирования Д11о (что отразилось бы и на предыдущем этапе). Возможно, это связано с возникновением на фазе деполяризации местной БЭР противоположного тока реполяризацин в быстро генерирующих ПД электровозбуднмых клетках проводящих пучков. Это подтверждается относительно меньшей продолжительностью пика распространяющегося ПД (¿и/) по сравнению с импульсными сдвигами ¿11» в зоне охлаждения (рис. 1).

РП.мВ 30 |-ГС

I мин

Т. "С -Г 24

-120

-30

-60

-90

0

20

16

12

-150

Рис. 2. БЭР клеток стебля в зоне локального охлаждения при поверхностном макроэлектродном (Ли«) и внутриклеточном микроэлектродном (Ет) отведениях. Т°С - изменение температуры.

Одновременность начала импульсной деполяризации, регистрируемой внутриклеточным и внеклеточным электродами, указывает на то, >гго эпидер-мальные клетки генерируют ПД сами и перелают возбуждение электроток иче-ски в -улектровозбудимые пучковые клетки вглубь стебля. В свою очередь, последние проводят ПД активно вдоль стебля. Обращает внимание, что холодо-чувствительность клеток стебля может быть исключительно высокой. Г1Д иногда возникает при перепаде температур 1,3 "С.

Для сравнительной оценки реценторных свойств клеток стебля важно определить температурный порог возникновения ПД в ответ на охлаждение в корнях. Охлаждение клеток корня проводили с градиентом 12 лС/мин и до значительно более низких температур, чем на стебле (0-2 ''С). Удалось зарегистрировать [>ЭР клеток корня в зоне охлаждения (рис. 3), а также импульсную реакцию по типу ПД в корне и распространяющийся ПД в стебле на расстоянии 5 см от корневой шейки (рис. 4). Однако перепад температур, необходимый для генерации ПД корнями, намного больше, чем для клеток стебля (15 ПС).

30 130 230 330 430 530 Время от начала охлаждения, с

Рис. 3, ЮР клеток корня, не включающая генерацию ПД, в ответ на охлаждение. I-измененне Лиц корня в зоне охлаждения, 2-изменение стебля на расстоянии 5 см от корневой шейки, 3 - изменение температуры,

')то можно объяснить тем, что покровные клетки корня неспособны генерировать ПД, а проводяшие пучки расположены в толще коровой паренхимы, (ктому их возбудимые клетки, как считают Мамулашвили и др. (1972), адал-

тируются к медленно меняющимся условиям. Можно предположить, что постепенное охлаждение является неадекватным раздражителем для клеток корня. Корневая система располагается в почве в условиях относительно постоянной температуры, и для нее большее значение имеют, химические факторы.

130 230 330 430 Время охлаждения, с

Рис. 4. БЭР клеток корня, включающая генерацию ПД, в ответ на охлаждение. 1-нзменение Ди<1 корня в зоне охлаждения, 2- изменение ЛЧ( стебля на расстоянии 5 см егт корневой шейки, 3 - изменение температуры.

Сенсорная адаптация клеток стебля проростка тыквы при периодическом охлаждении

Одним из свойств рецепторных клеток животных объектов является их способность к сенсорной адаптации. Исследовали биоэлектрические реакции клеток стебля на периодическое охлаждение с интервалами между воздействиями 15 минут. На рнс. 5 представлена зависимость средних значений Т|ит импульсной деполяризации от порядкового номера стимула. Исходную температуру поддерживали на постоянном уровне (19,2 °С>. Видно, что Т1М, монотонно убывает, то есть пороговый перепад температур, необходимый для возникновения импульсной деполяризации увеличивается с каждым последующим воздействием. Следовательно, клетки стебля адаптивно уменьшают свою чувствительность к повторным охлаждениям.

В ряде статей показано наличие у высших растений эффекта привыкания к периодическому охлаждению (Стадиик, Боберский, 1976; Мтогеку, 1989;

Мтогзку, §ра£\у1ск, 1989). Однако, я этих работах применяли либо кратковременный стимул большой силы, либо интервалы между воздействиями были 2,5-5 мин, что меньше рефрактерного периода для генерации импульсной деполяризации. Мы использовали в качестве стимула природный фактор — постепенное охлаждение от 19,2 до 8-15 "С со скоростью 2,5-3 °С/мин, интервалами между стимулами больше периода относительной рефрактерности для генерации ПД у клеток стебля тыквы (5-12 мин) (Ретивин и др., 1988). Таким образом, есть основания считать, что клетки стебля тыквы адаптировались к повторным охлаждениям.

исходная температура

4-*-» « » »

5

О • ■ • -. ■ ..... ...............,.....-.....,

О .12 3 4 5 6 номер стимула

Рис. 5. Зависимость пороговой температуры импульсной деполяризации от номера стимула при периодическом охлаждении клеток стебля с интервалами AtH 5 мин.

При рассмотрении не средних значений, а БЭР каждого конкретного растения на периодическое 15-минутное воздействие, обнаружили два типа изменения их параметров. Первый тип характеризуется монотонным увеличением температурного порога при повторных раздражениях. Возрастают также величины длительности биоэлектрического ответа, а максимальная скорость peno-ляризании уменьшается, что свидетельствует об увеличении времени восста-

■ . " ' ..г " I

новления систем бнозілектрогенеза после тест-охлаждения. Такой характер адаптации сенсорных систем принято называть габктуацкей - привыканием tpwc.ft.l).

«200

I 150 100

35 0 25 &

20 & 15 § 10

ш200 ^150 & 100

І 50 <

0

35 =0

25 І :ю &

15 І

10 і-

600

Время от начала охлаждения, с

200

400

600

Время от начала охлаждения, с

Время от начала охлаждения, с

100 200 300

■ я пт начала отел;

Время от начала охлаждения, с

Рис. 6. Местные БЭР клеток стебля в ответ на периодическое охлаждение при ¿1=15 мин, I - изменение ДЦ(1,2 - изменение температуры, а, б. в, г -порядковые номера стимула.

Температури ьіґі порог

Длительность мест ой БЭР

номер стимула

номер стимула

Максимальная скорость

номер стимула

Рис. 7 Параметры местных БЭР клеток стебля & ответ на периодическое охлаждение при Д1=15 мин.

їй

Второй тип характеризуется тем, что после первого тест-воздействия Т0ор возрастает и в дальнейшем практически не меняется. С каждым повторным охлаждением максимальная.скорость реполяризацни увеличивается, а длительность местной БЭР уменьшается. Такой тип адаптации можно назвать сенсиш-зацней (рис 8,9).

— ...,----,-----J 0

10 110 210 310 410 310 Время от начала охлаждении, с

15 <н 12 *

О*

9 г? 6 &

3 I

о н

10 110 210 310 410 510 Время от начала охлажден из, о

15 и

С

12 <*

9 I

6 I

Е?

3 I

о н

„ 0,2 -) вэ

І 0,1 |0,05 О

г.-

15

• 12 і

9 £

6 І-

І І

0 £

10 110 210 310 410 510 Время от начала охлаждения, с

10 110 210 310 410 510 Время от начала охлаждения, с

Рис. 8.Местные БЭР клеток стебля в ответ на периодическое охлаждение ' при Л1=15 мин. 1 - изменение ДЦо.2-изменениетемпературы,а,б,в,г-порядковые номера стимула.

Из литературы известно, что Н*- АТФаза участвует в формировании фазы

реполяризацни ПД (Опритов и др., 2002), поэтому можно предположить, что:

длительность биоэлектрического ответа и максимальная скорость реполяриза-

,

иии косвенно характеризуют активность протонного насоса.

Для исследования зависимости характера сенсорной адаптации от интенсивности воздействия охлаждали клетки стебля на б и 12 °С, Интервалы между стимулами были 30 минут. При охлаждении на 12 зарегистрировали монотонный рост температурного порога. Длительность местной БЭР уменьшается, но в пределах первых четырех стимулов. Затем мы фиксировали увеличение этого параметра. Максимальная скорость реполяризацни увеличивается также в

зтих пределах и уменьшается при дальнейшей стимуляции. Амплитуда местной БЭР практически не меняется и максимальна при первом воздействии (рис. 10). При глубине охлаждения 6 "С зарегистрировали постепенное увеличение температурного порога. Остальные параметры меняются незначительно от стимула к стимулу, без какой либо закономерности (рис. 11),

, Температурный порог

Длительность местной БЭР 150

номер стимула

2 3

помер стимула

Максимальная скорость 4 реполяризашін

'0 —

2 3

номер стимула

Рис. 9 Параметры местных БЭР клеток стебля в ответ на периодическое охлаждение при Д1=15 мин.

Таким образом, можно предположить, что при увеличении силы раздражения клетки растения адаптируются к повторяющимся стимулам по типу сенситизации. Для животных объектов показано, что привыкание является результатом взаимодействия двух независимых процессов — собственно привыкания и сенситизации, которые обеспечиваются разными механизмами. При повторяющейся стимуляции выраженность сенситизации вначале увеличивается, а затем снижается. Величина и продолжительность сенситизации непосредственно зависят от интенсивности раздражителя, и при большой интенсивности она возрастает (Котляр, 1986).

IS

Температурный порог

в 120

3 100 С

Щ so

Е 2

« ъо

2 3 4 5 номер стимула

Амплитуда местной БЭР

Длительность местной БЭР 300 «250 ¡200 я 150 100-1

1 2 3 4 5 номер стимула

Макс, скорость реполярнзации

2 3 4 5 номер стимула

2 3 4 5 номер стимула

Рис. 10, Параметры местных БЭР клеток стебля а ответ на периодическое охлаждение при ¿1=30 мин. Глубина охлаждения 12 "С.

Температурный порог

Длительность местной БЭР

2 3 4 5 номер стимула

2 3 4 5 помер стимула

Амплитуда местной БЭР

ч

с

Макс, скорость реп оляри заики

3 4 5 номер стимула

2 3 4 5 и ом ер стимула

Рис. [ 1. Параметры местных БЭР клеток стебля в ответ на периодическое охлаждение при Д1=30 мин. Глубина охлаждения б сС.

Изучение аккомодационных cboüctb поверхностных клеток стебля проростков тыквы Одним из свойств реиепторных систем является их способность к аккомодации. Если удастся доказать, что возбудимые структуры поверхностных клеток стебля в зоне раздражения способны к аккомодации, то тем самым будет получено еше одно доказательство выполнения этими клетками рецегггорной функции при действии холодового стимула.

На рис. 12 представлены записи БЭР в зоне раздражения, включающих градуальные изменения потенциала и надпороговую деполяризацию, возникающую при достижении порога возбуждения в ответ на постепенное охлаждение клеток стебля проростков тыквы с различными скоростями. Охлаждение прекращали после формирования переднего фронта ПД. Как видно из рис. 12, при генерации местного ПД при меньших скоростях охлаждения подпороговые изменения развиваются медленнее.

1,9

О 50 100 ISO ZOO 250 300 350 400

время, с

Рис. 12, Генерация местных БЭР, возникающих в ответ на охлаждение клеток стебля с различными скоростями. Скорости охлаждения в °С/мии указаны над соответствующими кривыми.

На рис. 13 показана зависимость ДТ^ от скорости охлаждения. Кривая отражает типичные аккомодационные изменения. При увеличении скорости охлаждения ДТрор уменьшается, что связано со снижением порога возбуждения.

2Й

1,8 2,1 2,4 .2,7 3 3,3 скорость охлаждения, "С/мин

Рис. 13. Зависимость перепада температур (ЛТ,»,,). необходимого для гене-раини импульсной деполяризации, от скорости охлаждения клеток стебля.

Ранее рядом авторов уже была установлена способность к аккомодации возбудимых структур высших растений при действии некоторых раздражителей, включая охлаждение (Пятытин, Опритов, 1982). При этом о величине температурных порогов возбуждения судили по возникновению распространяющихся ПД, регистрируемых за пределами зоны охлаждения стебля. Нашей задачей было изучить аккомодационные свойства возбудимых структур клеток стебля непосредственно в зоне охлаждения.

Таким образом, получены убедительные доказательства способности к аккомодации возбудимых структур поверхностных клеток стебля в зоне постепенного охлаждения. Мы исследовали явление аккомодации как свойство порога возбуждения клеток, непосредственно контактирующих с Холодовым раздражением. Вероятно, способность возбудимых структур поверхностных клеток стебля к аккомодации показывает, что эти клетки могут выполнять рецептор нуга функцию, а местная БЭР обладает свойствами РП.

Поскольку реиелпия раздражения , заканчивается генерацией ПД, важно было выяснить, каким образом распространяющийся ПД влияет на аккомодационные свойства возбудимых структур клеток стебля. Для этого мы исследовали электрофизиологический ответ на охлаждение с различными градиентами после распространения по гипокогилю ПД. Эксперимент вели одновременно на двух растениях с помощью двухканальной электрофизиологической установки.

У одного из растений вызывали акропетапъно распространяющийся по стеблю ПД путем воздействия струей холодной воды (5-9 РС) к течении 5-10 с на участок стебля возле корневой шейки. Сразу после прохождения ПД производили глубокое охлаждение участка стебля возле семядольных листьев опытного (после распространения ПД) и контрольного растений от 19 "С до 0 ПС с разным» скоростями.

Как внлно из таблицы 1 уменьшение в контроле и варианте с распространением ПД при уменьшении скорости охлаждения оказалось одинаковым. Следовательно, аккомодационные свойства возбудимых структур клеток стебля под влиянием распространяющегося ПД не изменились. Однако, в клетках тех растений, по которым прошел ПД, надпороговая деполяризация оказалась достоверно больше чем в контроле. Ранее было показано, что амплитуда фазы деполяризации ПД на охлаждение в клетках стебля проростка тыквы связана коррелятивной зависимостью с величиной метаболической компоненты мембранного потенциала (ОргНоу, Руа1у81п, 1989). Следовательно, распространение ПД индуцирует повышение активности протонного насоса, сохраняющееся в )на* чительном интервале времени после импульсного возбуждения.

Таблица 1

Величины пороговой температуры генерации ЛД (Тц^ °С> н амплитуды ПД (Агщ, мВ) клеток стебля при их постепенном охлаждении с различными градиентами в вариант« с распространяющимся ПД (опыт) и без него (контроль)

Градиент охлаждения, град/мин Время охлаждения ао 0 РС, мин т °с ' пор» ^ Ацд. мВ

контроль опыт контроль ■ Опыт

1,5 12 12,8±0,9 12,1 ±0.8 75,6±2,9 90,8±3,5

0,7 26 10,3±0,7 10,6±0,6 77,1 ±3,0 90,2±2,б

0.5 36 8,2±0,4 7,4±0,5 77,8±3,5 92^9±3,6

<и 60 5,6±0,7 5,4±0,8 74,5±3,7 85,0±2,8

Можно предположить, что при периодическом охлаждении происходит либо активация, либо угнетение прогонной помпы. В зависимости от того, какой процесс преобладает на той или мной фазе развития БЭР, отмечается усиление или угнетение параметров повторных ответов, то есть сенсигизация или габнтузция.

Заключение

,, Проведенные нами эксперименты позволяют предположить, что местная БЭР клеток стебля проростков тыквы в ответ иа локальное охлаждение обладает свойствами PII клеток животных объектов.

На основе анализа одновременной записи БЭР клеток стебля тыквы в зоне локального охлаждения при поверхностном ■ макроэлектродном и внутриклеточном микрозлектродном отведениях было показано, что эпидермальные клетки генерируют местный; ГОД при охлаждении и передают возбуждение электротоиически в радиальном направлении в электровозбудимые пучковые клетки вглубь стебля, В свою очередь, последние проводят ПД активно в продольном направлении вдоль стебля.

Наши результаты подтверждаются экспериментами, проведенными ранее" па локомоторном растении венериной мухоловке (Оюпаеа sp.). Benolken, Jackobsen <1970) показали, что градуальный рецепторный ответ и ПД генерируются в одной и той же сенсорной клетке.

Получены записи ЮР клеток корня в ответ на глубокое охлаждение. Перепад температур, необходимый для генерации импульсной реакции по типу ПД, был на порядок больше, чем для клеток стебля (15 и 13 °С, соответственно). Эти результаты свидетельствуют о том, что температурное воздействие не является адекватным, раздражителем для корня высшего растения (Cucurbita pvpo L.), что связано,-в первую очередь, с его анатомическим строением. Проводящие пучки расположены в толще коровой паренхимы, которая охлаждается постепенно, и для проводящих-пучков корня,-заключенных в глубину центрального цилиндра, охлаждение не является внезапным, они успевают адалти- -

роваться к изменившимся условиям (Мамулашвили и др., 1972).

Показана способность к аккомодации возбудимых структур клеток стебля в зоне постепенного охлаждения. Мы исследовали явление аккомодации как свойство порога возбуждения клеток, непосредственно контактирующих с холодовым раздражением,

Одним из свойств рецепторных систем является сенсорная адаптация, которая проявляется в изменении чувствительности при влиянии постоянно действующего или периодически повторяющегося фактора. Ранее было обнаружено, что при периодическом охлаждении возбудимые системы клеток стебля тыквы изменяют чувствительность по двум типам: габитуации или привыканию (при 15-минутном интервале между стимулами) и сенситизаиии (при интервале между стимулам 30 мин и I час) (Лобов др., 1999; Лобов, 2003). Нами показано, что при интервале между стимулами 15 мин возможна не только габитуаиия (происходит увеличение длительности местной БЭР, а максимальная скорость реполяризации уменьшается от стимула к стимулу), но и сснснтнзания (per ист* рируется уменьшение длительности местной БЭР и увеличение скорости реио-ляризации с каждым повторным стимулом). Мы полагаем, что ответная реакция иа такое.воздействие зависит, в определенной степени, от интенсивности раздражителя. Нами было показано, что при глубине периодического охлаждения 12 °С (при 30-минутном интервале между стимулами) происходит первоначальное уменьшение длительности местной БЭР и увеличение скорости реполяризации, тогда как при глубине охлаждения б °С такие эффекты не наблюдаются. В данном случае сенситизация по ряду параметров проявляется в результате увеличения силы воздействия.

Можно предположить, что ответная реакция клеток стебля на периодическое охлаждение зависит, в определенной мере, от физиологического состояния растительного организма.

Таким образом, наши результаты позволяют предположить, что эпилер-мальные клетки стебля высшего нелокомоторного растения могут выполнять роль рецепторных в отношении постепенного охлаждения. Они обладают ря-

дом свойств характерных для рецепторных клеток животных: высокая чувствительность к определенному раздражителю, способность к значительному усилению сигнала, способность к аккомодации порога возбуждения и сенсорной адаптации. Местная БЭР, которую зги клетки генерируют в ответ на охлаждение, может выполнять роль РП.

Выводы

Е. Эпидермхзьные клетки стебля генерируют ПД при охлаждении и передают возбуждение глектротонически, в радиальном направлении в электровозбудимые пучковые клетки вглубь стебля.

2.. Клетки корня способны генерировать импульсную БЭР по типу ПД в ответ на глубокое охлаждение и передавать возбуждение в стебель. Перепад температур, необходимый для генерации ПД корнями (15 °С), намного больше, чем для клеток стебля (1,3 °С). Таким образом, клетки корня обладают гораздо меньшей чувствительностью к охлаждению; чем клетки стебля.

3. Возбудимые структуры клеток стебля в зоне постепенного охлаждения обладают способностью к аккомодации, то есть достижение порога возбуждения чао иск г от скорости нарастания стимула: При увеличении скорости охлаждения нороювын перепад температур, необходимый для генерации ПД, уменьшается, что связано со снижением порога возбуждения.

4. Характер сенсорной адаптации клеток стебля к периодическому охлаждению зависит не только от времени между стимулами, но также от физиологическою состояния растительного организма и интенсивности воздействия (глубины охлаждения). В зависимости от этих факторов уже при 15-минутном интервале между воздействиями ■ может проявляться сенсорная адаптация по типу сенситизации (улучшение параметров-местных БЭР) или габитуации (ухудшение параметров местных БЭР). Увеличение глубины охлаждения (при: 30-минутном интервале между стимулами) приводит к возникновению сенситиза-иии по ряду параметров (регистрируется первоначальное уменьшение длительности местных БЭР и увеличение максимальной скорости реполяризации).

5. Распространяющийся вдоль стебля ПД не оказывает влияния на такое свойство рецепторных клеток, как аккомодация порога возбуждения, но увеличивает амплитуду последующей биоэлектрической тест-реакции.

6. Полученные данные показывают, что эпидермалъные клетки стебля тыквы обладают рядом свойств, характерных для рецепторных клеток животных. Эти данные подтверждают и развивают идею о том, что местные БЭР у растений могут выполнять функцию РП.

Список публикаций по теме дисмртаиии

1. Мысягин C A , JIoGoa С Л. Характер электрофтиологического ответа клеток стебля и корня пророста ты*вы на охлаждение Н Биология * наука 21-го века: Тез. Í-Я Путинской конф. мол. ученых. Пуши но, 2001. С. 156-157.

2. Мысягин С.А, Регивин ВТ., Опритов В А., Лобов С,А; Биоэлектрические реакшш клеток гнпокотзя проростков тыквы (Cucurbita pepo L.) на периодическое охлаждение // Вест. Баш к ирс к. ун-та. Спец. вып. 2001. Jfei 4.2. С. 101-105.

3. Oprilov V.A, Pyatygin S S, Vodeneev V.A.. Mysyagin S.A. The role of bioelectric potentials in reception of cooling in higher plants // Signaling systems of plant cells; Abstr. Int. symp. Push-chino ONTI, 2001, C. 95-96.

4. Мысягин С. А, Регивин В Г., Опритов В А , Крауз В О. Анализ параметров БЭР высшего растения (Cucurbita pepo L) при охлаждении клеток стебля н корня И Физиология, электрофизиология, 6oi аника и интродукция сельскохозяйственных растений. И. Новгород: НГСХА, 200I.C 173-178

5. Мысягнн C A., Регивин В Г., Опритов В А. Изучение электрофизиологического ответа пророст ю в тыквы на охлаждение с различными градиентами после распространения по гн-покотилю потенциала действия // Актуальные вопросы Экологической физиологии растений в 21 веке: Тез Межд. конф. Сыктывкар: Коми НЦ УрО РАН. 2001. С. 89-90,

6. Опритов В А , Пятыпш С, С., Регивин В Г., Мысягнн С.А. Cucutbita pepo L. как модель для изучения роли потенциалов действия в формировании синдрома адаптации у высших растений Н Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования: Тр. IV Межд. сими М.: РУДО, 2001, Т. 1, С, 377-379.

7 Onpntoe В А, Пятыгин С. С., Регивин В Г., Водеиеев В. А, Мысягнн С.А. Избирательная (енерзпня потенциалов действия клетками высшего растения в ответ на различные стресс-факторы // Регуляция роста, развития и продуктивности растений: Мат. 2-й Межд. науч. конф Минск, 2001, С. 154.

X. Регивин В Г., Опритов В,А., Мысягнн С.А., Лобов С.А. Сенсорная адаптация клеток ги-покотнля проростков тыквы к периодическому охлаждению, Н Вест. Нижегородец ун-та. Сер Ьиол 2002. Вып 1 (5) С. 172-178.

V Опритоп В А, Пятыгтш С С, Лобов С.А , Мысягин С.А, Крауз В О Cucurbita pepo L. как модель для щучены я роли биоэлектрических потенциалов в рецепции растениями внешних шндействий // Новые и нетрадиционные растения и перспективы нх использования: Маг. V Межа сичн М : РУДП, 2003, Т, 1, С. 283-285.

10. Мысягин С А, Опритов O.A. Сенсорная адаптация клеток высшего растения к периодическому охлаждению // Физиология растений и экология на рубеже веков: Мат. Всероссийской научно-практической конф. Ярославль: Я росл, гос. ун-т, 2003. С, t11-И2.

11. Оприюв В А., Пятыгмн С С., Мысягнн С.А , Крауз В О., Водеиеев В А. Роль биоэлектро-гепеза в адаптации клеток высшего растения к низкотемпературным воздействиям // Физиология растений и экология на рубеже веков: Мат, Всероссийской научно-практической конф. Ярославль: Яросл. гос. ун-т, 2003. С. 114.

12. Опритов ВА, Пятыгин СС., Лобов С.А., Водеиеев В.А., Мысягин С.А, Шнбзрова А Н. Электрофизпоаогическое звено в рецепции охлаждения клетками высшего растения И V-ый съезд Обш-ea физиологов растений России: Тез. докл. Пенза, 2003. С 313.

13. Мысягин С.А., Опритов В А. Анализ аккомодационных свойств возбудимых структур стебля проростков тыквы на основе местных биоэлектрических реакций, вызванных охлаждением // Вест, Нижегородец, ун-та. Сер. Б но л. 2003 (в печати).

Подписано в печать 17.11.2003. Формат 60x84 1/16, Гарнитура Тайме. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1. Захаз 1597. Тираж 100.

Типография Нижегородского госуниверситета им. Н.И. Лобачевского Лицензия № 18-0099 603000, Н. Новгород, ул. Б. Покровская, 37.

H

m- -609