Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ пространственной организации слухового рецепторного эпителия внутреннего уха птиц с помощью компьютерного моделирования

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Анализ пространственной организации слухового рецепторного эпителия внутреннего уха птиц с помощью компьютерного моделирования"

005015540

На правах рукописи

МАГНИЦКАЯ Екатерина Геннадьевна

АНАЛИЗ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ СЛУХОВОГО РЕЦЕПТОРНОГО ЭПИТЕЛИЯ ВНУТРЕННЕГО УХА ПТИЦ С ПОМОЩЬЮ КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

12 мдр т

Санкт-Петербург 2012

005015540

Работа выполнена в лаборатории моделирования эволюции Федерального

государственного бюджетного учреждения науки Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Научные руководители: доктор биологических наук

Левченко Владимир Федорович

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

доктор биологических наук Снигиревская Екатерина Сергеевна

Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: Лычаков Дмитрий Витальевич

доктор биологических наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, ведущий научный сотрудник

Кудрявцев Борис Николаевич

доктор биологических наук, профессор Институт цитологии РАН, заведующий лабораторией

Ведущая организация: Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Зоологический институт РАН

Защита состоится «23» марта 2012 года в 14 часов

на заседании диссертационного совета Д.002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4

Сайт института: www.cytspb.rssi.ru

Адрес электронной почты института: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru Факс института (812) 297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан « / У" » февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Е-в< Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Пространственная организация эпителиев в нормальном состоянии и изменения их строения при патологических процессах - одна из актуальных и недостаточно изученных проблем гистологии. Для ее решения необходимо определить значение количественных характеристик строения эпителиев как упорядоченных сетей, образованных клетками и их взаимосвязями в трехмерном пространстве пласта.

Однако разрешающая способность традиционной реконструкции трехмерного строения по серийным срезам, даже при использовании компьютерных технологий, недостаточна для изучения строения эпителиев как упорядоченной клеточной сети. Эта методика нацелена либо на воссоздание пласта как континуума (Braumann et al., 2005; Hansis et al., 2010), либо на исследование формы отдельных клеток и их органоидов (Means et al., 2006; Yamaguchi et al., 2010). Характер упаковки эпителиальных клеток в пространстве пласта остается неизвестным. Описанная проблема в полной мере относится к рецепторным эпителиям.

С целью создания новых подходов к изучению трехмерного строения тканей в настоящее время интенсивно разрабатываются теоретические основы пространственной организации эпителиев (Смолянинов, 1980; Маресин, 1990; Dormer, 1980). Для характеристики эпителия как регулярной сети или решетки, формируемой клетками и связями между ними, предложено использовать комплекс диагностических признаков, который включает: клеточный состав эпителия, численные соотношения разных типов клеток, количество клеток, непосредственно соприкасающихся друг с другом (клеточная смежность), порядок расположения однотипных (гомогенные контакты между клетками) и разнотипных (гетерогенные контакты между клетками) клеток или устройство внутриэпителиальной ниши каждой клетки (Савостьянов, 2005). Эти количественные характеристики позволили предложить новый трехэтапный метод реконструкции пространственной

организации эпителиев. Первый этап метода состоит в построении двумерных и трехмерных тканевых моделей и получении набора их сечений с помощью специальной компьютерной программы, второй - в исследовании срезов эпителиев с помощью различных видов микроскопии, а третий - в сравнении сечений моделей со срезами эпителиев с помощью комплекса новых признаков и выборе моделей, сечения которых соответствуют тканевым срезам. Такой подход впервые позволяет определять не только геометрические особенности клеток, но и топологию клеточной сети.

В настоящей работе в качестве объекта исследования выбран рецепторный слуховой эпителий внутреннего уха птиц (далее для краткости -слуховой эпителий птиц). Он состоит из двух типов клеток: рецепторных волосковых (А) и опорных (В). Нижние части опорных клеток полностью покрывают базальную мембрану. Фаланговидные отростки опорных клеток выходят на апикальную поверхность вместе с волосковыми клетками (Титова, 1968; Голубева, Ямалова, 1980; Tanaka, Smith, 1978). При рассмотрении апикальной поверхности привлекает внимание регулярное расположение клеток (Goodyear, Richardson, 1997; Fischer, 1992, 1994, 1998).

В отличие от слухового эпителия млекопитающих, слуховой эпителий птиц способен восстанавливаться после травмирующих воздействий, причем его регенерация происходит за счет прямой трансдифференцировки и митотических делений опорных клеток (Stone, Rubel, 2000; Stone, Cotanche, 2007; Daudet et al., 2009; McCullar et al., 2010).

Цель и задачи исследования Цель данной работы - установить пространственную организацию слухового эпителия птиц и определить значение ее количественных характеристик с помощью трехэтапного метода реконструкции. Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Провести реконструкцию пространственной организации слухового эпителия птиц, а именно:

а) построить двумерные и трехмерные компьютерные модели на основе исследования полутонких и оптических срезов эпителия. Определить наиболее информативные направления сечений; б) описать возможные варианты пространственной организации эпителия, которые обнаруживаются у одних и тех же особей птиц, смежность и микроокружение его клеток на различных уровнях пласта с помощью сечений моделей; в) изучить строение внутриэпителиальных клеточных ниш и клеточных сетей для разных вариантов пространственной организации эпителия.

2. Оценить возможность превращения разных вариантов пространственной организации друг в друга при развитии и регенерации слухового эпителия птиц.

Научная новизна

1. Для количественной характеристики пространственной организации слухового эпителия птиц использован комплекс новых диагностических признаков: клеточный состав, численные соотношения волосковых и опорных клеток, количество контактов с соседними клетками или смежность, микроокружение или количество гомогенных и гетерогенных контактов клеток, число клеточных сторон, сходящихся в точках пересечения.

2. Впервые описаны три варианта пространственной организации слухового эпителия птиц с соотношениями волосковых клеток к опорным, равными 1:2, 1:3 и 1:8. Эти варианты представляют собой клеточные сети в виде клеток, расположенных в регулярном порядке, и связей между ними.

3. Выделен новый тип пространственной организации слухового эпителия птиц. Этот вариант гистоархитектуры эпителия следует считать инвертированным двурядиым, а не двухслойным, как полагали ранее, поскольку все типы клеток выходят на его апикальную поверхность, а с базальной мембраной соприкасаются только опорные.

Научно-практическое значение

1. Полученные результаты подтверждают теоретические представления о слуховом эпителии птиц как о регулярной клеточной сети и могут

послужить базой для изучения функциональных особенностей рецепторных эпителиев.

2. Применение трехэтапного метода реконструкции на примере слухового эпителия птиц показало, что этот метод упрощает процедуру реконструкции и делает ее результаты более точными. Он может использоваться для изучения других эпителиев и их изменений в ходе развития, что будет способствовать дальнейшей разработке основ трехмерной гистологии.

3. Данные, полученные с помощью трехэтапного метода реконструкции и его экспериментальной проверки, могут быть рекомендованы для спецкурса лекций по строению рецепторных эпителиев в университетах и медицинских институтах. Часть полученных результатов вошла в монографию Г.А. Савостьянова (2005) «Основы структурной гистологии...».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Пространственная организация слухового эпителия исследованных видов птиц представляет собой регулярную клеточную сеть и характеризуется полиморфизмом. Варианты его пространственной организации имеют состав АВ2, АВз и АВ6С2, где А - волосковые, В - опорные и С - резервные клетки. Преобладающим в дисталыю-проксимальном направлении эпителия является вариант АВ2. Вариант АВ3 в виде отдельных вкраплений встречается в среднедистальной части, вкрапления АВ6С2 встречаются в разных частях. В варианте АВ6С2 из каждых восьми опорных клеток две являются резервными, способными дифференцироваться в волосковые клетки.

2. В направлении от апикального к базалыюму уровню слухового эпителия птиц профили волосковых клеток постепенно уменьшаются и исчезают, а профили опорных клеток, наоборот, увеличиваются. Поэтому на апикальном, срединном и базалыюм уровнях происходит закономерное изменение смежности и взаиморасположения клеток, а клеточная сеть характеризуется различными топологическими свойствами. На этом

основании для описания пространственной организации эпителия целесообразно ввести понятие блочного (слайсового) строения.

3. В ходе эмбрионального развития в слуховом эпителии птиц постепенно формируются недостающие слайсы, и он обретает завершенное строение. Во время регенерации часть его слайсов теряется и затем восстанавливается. Если на месте утраченных слайсов появляются слайсы иного строения, то происходит превращение одних вариантов пространственной организации эпителия в другие. Поэтому трехмерные модели с полным количеством слайсов детально описывают строение каждого из возможных вариантов гистоархитектуры слухового эпителия взрослых птиц, а также позволяют прогнозировать его изменение при развитии и восстановлении.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на XIII Международном совещании и VI Школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, Институт эволюционной физиологии и биохимии, имени И.М. Сеченова, РАН, 23-25 января 2006 г.); на научном совещании «Актуальные проблемы учения о тканях» (Санкт-Петербург, ВМА, 14 апреля 2006 г.); на семинаре Saint-Petersburg International Workshop on NanoBioTechnologies (Saint-Petersburg, 27 - 29 November 2006 г.); на симпозиуме с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Москва, Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова, РАН, 9-11 октября 2007 г.); на Всероссийской конференции «Структурные и функциональные основы эволюции функций, физиология экстремальных состояний», посвященной 125-летию со дня рождения академика Л.А. Орбели (Санкт-Петербург, Институт эволюционной физиологии и биохимии имени И.М. Сеченова, РАН, 19-20 ноября 2008 г.); на Международной конференции Leica Microsystems «Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine» (Санкт-Петербург, Центр культурного и делового сотрудничества Санкт-Петербургского государственного университета, 9-10 ноября 2009 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, из которых 4 - статьи в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК, и 9 - тезисы докладов.

Структура работы. Диссертация построена по общепринятому плану и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 181 странице, содержит 56 рисунков и 8 таблиц. Список литературы включает 226 наименований, из них 176 зарубежных публикаций.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Слуховой эпителий внутреннего уха изучали у 35 особей птиц 5 видов разного возраста. Известно, что эпителий у разных видов птиц имеет сходство по ряду морфологических характеристик (Голубева, Ямалова, 1980; Goodyear, Richardson, 1997 и др.). Сходство наблюдалось и по тем чертам, которые необходимы для данного исследования (расположение границ между клетками, смежность). Поэтому преимущественно использовался эпителий сизого голубя, но также и эпителий других видов. С помощью световой микроскопии был изучен слуховой эпителий каждого уха следующих птиц: 1 слетка серой вороны (Corvus cornix, juv.; отряд Passeriformes, семейство Corvidae), 5 взрослых особей голубей (Columba livia; отряд Columbiformes, семейство Columbidae), 2 взрослых японских перепелов (Coturnix coturnix (japonica); отряд Galliformes, семейство Phasianidae) и 2 взрослых больших синиц (Parus major; отряд Passeriformes, семейство Paridae). Для конфокальной микроскопии был использован материал от 8 взрослых японских перепелов и 2 взрослых голубей. Методом сканирующей электронной микроскопии был исследован эпителий голубей: 1 эмбриона (14 сут. инкубации), 1 птенца (4 мес.), 3 взрослых особей, а также 5 эмбрионов серебристых чаек на 20-е и 28-е сут. инкубации (Larus argentatus; отряд

Charadriformes, семейство Laridae). Трансформации пространственной организации ткани изучали с помощью сканирующей электронной микроскопии на примере эпителия взрослого голубя после ототоксического действия канамицина (ежедневные инъекции по 267 мг/кг массы тела внутримышечно в течение 10 сут.) через 6 и 25 сут. после последней инъекции. При этом использовали материал от 5 голубей.

Материал для световой микроскопии фиксировали в 2,5%-ном растворе глутарового альдегида («Ted Pella, Inc.», США) с дофиксацией в 1%-ном четырехокиси осмия на 0,1 M фосфатном буфере (PBS - «Биолот», Россия). Промытые и обезвоженные в спиртах возрастающей концентрации препараты заливали в эпон-аралдит. Перпендикулярные и параллельные апикальной и базальной поверхностям срезы толщиной в 1 мкм получали на ультратоме LK.B 111 (Швеция), окрашивали толуидиновым синим («Serva, Feinbiochemica Heidelberg», Германия) и исследовали на микроскопах МБИ-15 (Россия) и Olympus ВН-2 (Япония), оборудованных цифровыми камерами LEICA DFC300 FX (Германия) и Sony DSC-F707 (Япония).

Для того, чтобы отслеживать изменения размеров, формы и смежности клеток от апикальной поверхности вглубь пласта с помощью конфокальной микроскопии, материал фиксировали в 4%-iiom растворе параформальдегида («ТААВ Laboratories Equipment Limited», Великобритания) на 0,1 M PBS, обрабатывали 0,3%-ным Triton Х-100 («Ferak Berlin», Германия) на PBS и промывали тем же буфером. Актин клеточных границ окрашивали родамин-фаллоидином («Molecular Probes, Inc.», США) в разведении 1:50 на PBS. Пласт анализировали на различной глубине и получали серии оптических срезов с интервалом 1 мкм (микроскоп Zeiss LSM 5 Pascal (Германия)).

Расположение границ между клетками наилучшим образом выявлялось с помощью сканирующей электронной микроскопии. Материал фиксировали в 2,5%-ном растворе глутарового альдегида на 0,2 M какодилатном буфере («Serva, Feinbiochemica Heidelberg», Германия). Препараты готовили по методике "тотального препарата" (Винников, Титова, 1959), оставляя

эпителий на хрящевой раме улитки. Материал промывали, дегидратировали в ряду ацетонов возрастающей концентрации и сушили методом «высушивания в критической точке» в приборе Hitachi Critical Point Dryer (HCP-2, Япония). После наклеивания кусочков материала на держатели на них напыляли золото или платину в ионном напылителе Eiko IB-3 (Япония). Для исследований использовались сканирующие микроскопы Jeol (JSM-35, JSM-6380, Япония), либо Hitachi S 405 А (Япония).

Двумерные и трехмерные модели строили согласно трехэтапному методу реконструкции пространственной организации, предложенному Г.А. Савостьяновым (2005). Клеточные мозаики микрофотографий срезов на разных уровнях глубины пласта аппроксимировали правильными двумерными мозаиками. На их основе строили трехмерные модели и получали их сечения, используя компьютерную программу Histoarch (Воробьев, Савостьянов, 2003). Наиболее информативными оказались сечения, параллельные апикальной и базалыюй поверхностям.

Срезы ткани, также параллельные апикальной и базалыюй поверхностям (т.е., поперечные клеточным телам), сравнивали с сечениями моделей. Затем выбирали модель, топологические характеристики сечений которой были тождественны характеристикам срезов эпителия.

При подготовке изображений к печати использовали графический редактор Adobe Photoshop версий 6 и 7. Топологические характеристики клеточных мозаик на различных уровнях глубины пласта оценивали в поле зрения микроскопа и на фотографиях. У разных птиц были проанализированы дистальный конец и срединная область эпителия, при этом для определения численных соотношений разнотипных клеток и их смежности подсчитывали от 45 до 300 клеток. Для статистической обработки было отобрано 40 фотографий среднедистальной области эпителия голубя и синицы, полученных с помощью световой микроскопии. Здесь были использованы для статистической обработки фотографии срезов, полученные на разных уровнях глубины: 7 для субапикалыюго уровня, 21 для срединного и 12 для

базального. Кроме того, для статистической обработки использовали 15 фотографий субапикальпого уровня среднедистальной области эпителия перепела, полученных с помощью конфокальной микроскопии.

Соответствие реального и модельного (теоретического) соотношения разнотипных клеток определяли с помощью критерия Смежность клеток оценивали, сравнивая ее среднее значение со значениями смежности клеток модели по критерию Стыодента. Результаты обрабатывали с помощью обычных методов биометрии (Лакип, 1980; Ивантер, Коросов, 1992). Гистограммы строились в программе Microsoft Excel 2002.

РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Пространственная организация слухового эпителия птиц состава АВ2

Слуховой эпителий птиц в верхней (субапикальной) части состоит из волосковых клеток А и опорных клеток В, а в нижней (околобазалыюй) -только из опорных клеток В. Произведенный подсчет обоих типов клеток на апикальной поверхности и на поперечных срезах разных уровней глубины пласта эпителия показал, что на большей части эпителия волосковые и опорные клетки находятся в соотношении, равном 1:2, что подтверждается статистической оценкой по критерию у\ Таким образом, пласт имеет клеточный состав АВ2.

Форму поперечных профилей и взаиморасположение клеток на апикальной поверхности и на разной глубине можно описывать двумерными моделями клеточных мозаик. На основе исследования полутонких поперечных срезов со срединной глубины пласта эпителия голубя была построена исходная модельная мозаика из гексагональных профилей волосковых и опорных клеток в соотношении 1:2 (рис. 1 .II, уровень d). По мере удаления от исходной мозаики к апикальной поверхности пласта размеры профилей волосковых клеток возрастают, а при движении вниз, к базалыюму уровню - уменьшаются до полного исчезновения; профили опорных клеток, напротив, увеличиваются. На основе данного

преобразования строится 3-мерная модель (рис. 1.1). Она дает представление о форме клеток и числе их граней, а сечения этой модели (рис. 1.11) показывают смежность клеток на различных уровнях. Уровни, обозначенные одинаковыми буквами с разным количеством звездочек, соответствуют геометрическим изменениям мозаик. Если появляется другая буква, это значит, что один вариант топологической мозаики сменяется на другой. Подобные обозначения будут использованы далее.

Уровни глубины d*-d топологически идентичны друг другу. Смежность всех клеток равна шести, число клеточных сторон, сходящихся в точках их пересечения, равно трем (рис. 1.11, уровни d*-d). Микроокружение каждой опорной клетки составляют три такие же опорные клетки (гомогенные контакты) и три волосковые (гетерогенные контакты), и такие контакты чередуются через один. Микроокружение волосковых клеток представлено только гетерогенными контактами с опорными клетками. Такой порядок расположения клеток - диагностический признак клеточной сети состава АВ2. Другой наглядный признак такого эпителия - наличие поперечных границ между выростами опорных клеток там, где они отделяют волосковые клетки друг от друга (рис. 1 .II, уровни d*-d**).

На уровне е волосковые клетки исчезают, и мозаики претерпевают топологическую трансформацию: смежность поперечных профилей оставшихся опорных клеток становится равной трем, а число клеточных сторон, сходящихся в точках их пересечения, равно шести. Но на уровне / вновь возникает мозаика из гексагонов, в каждой точке пересечения которой сходятся по три клеточные стороны.

В данной модели выделяются два структурных блока - слайса: d*-e и е-f. Эту модель нельзя назвать двухслойной, так как в ней нет сплошного верхнего слоя, и на апикальную поверхность выходят оба типа клеток. Поскольку в перевернутом на 180" виде она была бы моделью двурядного эпителия, то в настоящем виде она отражает такой вариант гистоархитектуры, который можно назвать инвертированной двурядностыо.

I » II III IV

Рис. I. Пространственная организация слухового эпителия птиц клеточного состава

АВ2.

1. Трехмерная модель слухового эпителия. Волосковые клетки (А - темные) изолированы друг от друга отростками опорных клеток (В - светлые). И. Мозаики поперечных сечений на разных уровнях глубины модели. III. Срезы слухового эпителия на соответствующих уровнях. Мозаики d*-d*** и е - конфокальная микроскопия (японский перепел). Мозаики d vif - световая микроскопия (голубь). Длина масштабного отрезка 10 мкм. IV. Мозаики апикальной поверхности слухового эпителия. Между выростами опорных клеток видны поперечные границы (некоторые указаны белыми стрелками). Верхний образец (эмбрион голубя, 14 сут.) соответствует уровню d* модели на рис. 1.1 и II. На нижнем образце (эмбрион чайки, 28 сут.) опорные клетки по форме напоминают треугольники, но являются неравносторонними гексагонами. Между ними также видны поперечные границы. Образец соответствует уровню d***. Сканирующая электронная микроскопия. Длина масштабного отрезка 15 мкм.

При сравнении сечений модели с фотографиями срезов эпителия заметно уменьшение волосковых и увеличение опорных клеток, видно, как сохраняется правильность формы клеточных профилей на разной глубине (см. рис. 1.111, уровни d*-d). Глубже лежат мозаики из треугольных профилей опорных клеток (рис. 1.111, уровень е), которые затем трансформируются в гексагональные (рис. Т .111, уровень/).

Другой признак эпителия клеточного состава АВ2 - поперечные границы между выростами опорных клеток. Результаты сканирующей электронной микроскопии апикальной поверхности доказали их наличие (рис.

1 -IV, верхний рисунок). Подтвердилось и наличие в эпителии мозаики, которой соответствует уровень с!*** модели (рис. 1.1 V, нижний рисунок).

Статистический анализ смежности клеток показывает соответствие слухового эпителия птиц и модели клеточного состава АВ2. Точность такого соответствия немного меньше на срединном и базальном уровнях. Таким образом, построенная модель отражает с точностью до топологических свойств трехмерную организацию слухового эпителия птиц состава АВ2, который можно считать инвертированным двурядным.

Пространственная организация слухового эпителия птиц состава АВз

В среднедисталыюй части слухового эпителия голубя встречались небольшие вкрапления в вышеописанной ткани состава АВг, для которых численные соотношения волосковых и опорных клеток приближались к значению 1:3. Подсчет и статистическая проверка клеточных соотношений по критерию х2 на указанных вкраплениях подтвердили, что па одну волосковую клетку, действительно, приходятся три опорные. Обнаруженная клеточная мозаика аппроксимирована двумерной моделью состава АВ3 из гексагонов, т.е. клеточных профилей со смежностью, равной шести (рис. 2.11, уровень Ь*). На базе двумерной мозаики построена трехмерная модель такого же состава, показывающая форму и взаиморасположение волосковых и опорных клеток (рис. 2.1).

Смежность всех клеток модели на уровнях Ь-Ь** равна шести, по три клеточных стороны сходятся в точках их пересечения. Волосковые клетки имеют только гетерогенные контакты с опорными клетками, тогда как опорные двумя противоположными гранями контактируют с волосковыми, а четырьмя боковыми - с такими же опорными клетками. Каждая волосковая клетка отделена от другой телом целой опорной клетки, и это -диагностический признак эпителия состава АВ3.

На уровне с волосковые клетки исчезают, и при такой топологической трансформации профили опорных клеток приобретают форму ромбов со смежностью, равной четырем, тогда как число пересекающихся клеточных

сторон становится чередующимся: в одних точках оно равно трем, в других -шести. Ниже уровня с ромбовидные профили превращаются в гексагоиы. Как и в варианте АВ2, при этом меняется не только смежность, но и геометрическая форма клеток, так как количество их сторон зависит от числа соседей, с которыми соприкасается клетка. В данной модели выделяются три слайса: а-Ь, Ь-с и с-й/.

При светооптическом исследовании слухового эпителия птиц обнаружилось, что предсказываемая моделью структура подтверждается, но не полностью, т.к. верхний слайс модели, заключенный между уровнями а-Ь, в реальной ткани отсутствует, и на ее апикальной поверхности волосковые клетки не смыкаются. Поэтому здесь обнаруживается та мозаика, которой соответствует уровень Ь модели (рис. 2.11, уровень Ь).

Рис. 2. Слуховой эпителий птиц клеточного состава АВз. I. Модель, показывающая форму клеток; волосковые клетки А - темные, опорные клетки В - светлые. II. Поперечные сечения модели на различных уровнях. III. Срезы слухового эпителия на соответствующих уровнях пласта. Полутонкие поперечные срезы, световая микроскопия (голубь). Длина масштабного отрезка 10 мкм.

Это удалось подтвердить при изучении скошенного среза пласта с мозаикой из гексагональных профилей крупных волосковых и тонких опорных клеток (рис. 2.III, уровень Ь). При этом, в соответствии с моделью,

I

II

III

каждую волосковую клетку отделяет от другой одна опорная клетка. На большой глубине профили волоековых клеток постепенно вытесняются опорными клетками, и на уровне ¿1 мозаика состоит только из гексагональных профилей последних (рис. 2.Ш, уровень с/). Подтверждается модель и результатами сканирующей электронной микроскопии. Можно заключить, что вариант трехмерного строения, описываемый неполной моделью клеточного состава АВ3, реализуется в слуховом эпителии птиц и также является инвертированным двурядным. Однако почему он встречается лишь в виде небольших участков в эпителии состава АВ2, пока неясно.

Для эпителия состава АВ3 была построена модель, демонстрируЕощая микроокружение клеток или строение их внутриэпителиальных ниш. На рис. 3.1 показаны плотно сомкнутые в нижней части опорные клетки, формирующие ниши для волоековых клеток. Приведенная иллюстрация (рис. 3.11) подтверждает изоляцию волоековых клеток друг от друга целыми телами опорных клеток без отростков.

Рис. 3. Форма виутриэпителиальных ниш для волоековых клеток в эпителии состава

АВ3.

I. Форма ниш для волоековых клеток, образуемых опорными клетками. Две ниши заполнены волосковыми клетками. Волосковые клетки - темные, опорные клетки -светлые. II. Клеточные ниши на апикальной поверхности слухового эпителия (голубь, 4 мес.). Белая стрелка указывает на вытянутую опорную клетку, отделяющую две волосковые друг от друга. Сканирующая электронная микроскопия. Длина масштабного отрезка 10 мкм.

Трансформация слухового эпителия птиц во время его регенерации

Известно, что волосковые клетки А осуществляют контактное ингибирование ближайших опорных клеток В (Goodyear, Richardson, 1997; Daudet et al., 2009). Поэтому к прямой трансдифференцировке способны только те из опорных клеток, которые не имеют непосредственных соприкосновений с волосковыми клетками. Такие клетки появляются при численном соотношении волосковых и опорных клеток, равном 1:8. Из восьми опорных клеток шесть имеют контакты с волосковыми клетками, а две (резервные клетки С) — не имеют. Данный вариант клеточного состава обозначается, как АВ6Сг. Если такие клетки отсутствуют (как в вариантах клеточного состава АВ2 и АВ3), то лишь вследствие гибели волосковых клеток или делений опорных клеток может быть достигнуто необходимое численное соотношение. Подобная ситуация может произойти в случае акустической или химической травмы эпителия.

На базе мозаики клеточного состава АВ6С2 (рис. 4.11, уровень е) построена трехмерная модель, показывающая форму и взаиморасположение волосковых (А), опорных (В) и резервных (С) клеток (рис. 4.1). Эта модель состоит из 4 слайсов, заключенных между ближайшими топологически различными мозаиками уровней b-f. Главным диагностическим признаком этой модели является то, что волосковые клетки отделяются двумя опорными клетками, расположенными параллельно одна к другой (рис. 4.11, уровни Ь-е).

Проверка модели показала следующее. При исследовании с помощью сканирующей электронной микроскопии эпителия эмбрионов чайки за сутки до вылупления было обнаружено, что волосковые клетки отделены друг от друга двумя опорными (рис. 4.III, верхний рисунок). В некоторых участках апикальной поверхности обнаруживаются также маленькие профили волосковых клеток, возникших в ходе дифференцировки резервных. Эта микрофотография описывается уровнями бис модели. На другой микрофотографии также обнаруживаются растущие волосковые клетки, которые появляются почти по всем углам прежних волосковых клеток (рис.

4.111, нижний рисунок). Данной мозаике слухового эпителия птиц соответствуют уровни с и модели АВ6С2 (рис. 4.11).

Рис. 4. Слуховой эпителий птиц клеточного состава ABf,C2-I. Трехмерная модель. Волосковые клетки (А) - серые, опорные клетки (В) - светло-серые, резервные клетки (С) - черные. II. Поперечные сечения модели. III. Верхний рисунок (эмбрион чайки, 28 сут.). Стрелками показаны границы между опорными клетками, отделяющими волосковые друг от друга, стрелками со звездочками - новое поколение волосковых клеток. Сканирующая электронная микроскопия. Длина масштабного отрезка 6 мкм. Нижний рисунок (голубь, через 25 суток после введения канамицина в течение 10 дней). Стрелками показаны волосковые клетки нового поколения. Сканирующая электронная микроскопия. Длина масштабного отрезка 15 мкм.

Когда эпителий подвергается воздействию антибиотика, часть волосковых клеток погибает. При этом пласт становится однослойным, все его клетки соприкасаются с базальной мембраной и выходят на апикальную поверхность. В этом случае от модели, приведенной на рис. 4, останется лишь один слайс d-e.

При моделировании регенерации конструкция состава АВ6С2 с сокращенным количеством слайсов может восстановить свою исходную

структуру или измениться, наращивая сверху и снизу новые слайсы, отличающиеся от прежних. В этом случае резервные клетки теряют связь с базальной мембраной и перемещаются в верхнюю часть пласта,

дифференцируясь в волосковые. В итоге возникает вариант, который описывает трехмерная модель на рис. 5.1.

В соответствии с числом резервных клеток С, новых волосковых клеток становится примерно вдвое больше, чем исходных. На апикальной поверхности профили новых и исходных клеток имеют одинаковые размеры (рис. 5.11, уровень а). Однако в глубине пласта эти клетки различаются. Новые волосковые клетки обозначаются А*. Опорные клетки в верхней части пласта отделяют новые и прежние волосковые клетки друг от друга выростами, а в нижней части (на рисунке не показанной) треугольные профили опорных клеток превращаются в гексагональные.

С"', * /V ,:'

I II III

Рис. 5. Слуховой эпителий птиц клеточного состава АА*2В{, после дифференцировки резервных клеток в волосковые.

I. Трехмерная модель. II. Поперечные сечения модели. Исходные волосковые клетки А -серые, опорные клетки В - светло-серые, новые волосковые клетки А* - черные. III. Микрофотографии эпителия, а* Апикальная поверхность слухового эпителия (голубь, неповрежденная дистальная часть эпителия). Поперечные границы между отростками опорных клеток указаны стрелками. Сканирующая электронная микроскопия. Длина масштабного отрезка 10 мкм. с. Субапикальная поверхность слухового эпителия (слеток вороны). Вокруг зрелых (темных и крупных) волосковых клеток находятся юные (светлосерые и мелкие (белые стрелки)). Черные стрелки - границы между опорными клетками, которые отделяют волосковые друг от друга. Полутонкий поперечный срез, световая микроскопия. Длина масштабного отрезка 10 мкм.

Клеточный состав новой модели описывается, как АА*2В6, и на разных ее уровнях различаются три слайса: a-b, b-c, c-d (рис. 5.1 и II). На полутонких срезах обнаружены зрелые и растущие волосковые клетки, причем между собой зрелые отделены сдвоенными опорными клетками (рис. 5.III, образец с). Расположение волосковых и опорных клеток сравнимо с моделью АА*2В6 (уровень с на рис. 5.II). Кроме того, этот уровень хорошо описывается и моделью АВ6С2 (рис. 4.II, уровень е).

В ходе восстановления эпителия после воздействия канамицина гексагональные профили исходных и новых волосковых клеток, расположенные на его апикальной поверхности, выравниваются и изолируются тонкими выростами опорных клеток, между которыми появляются поперечные границы (рис. 5.Ill, образец а*). Подобная картина может соотноситься как с уровнем d* модели АВ2 на рис. 1 .II, так и с уровнем <7* модели АА*2В6 на рис. 5.II.

Если потеря верхних слайсов модели АВ6С2 на рис. 4 дойдет до уровня е, то возникнет однослайсовая модель с гексагонами равного размера на апикальной поверхности. Получившаяся конструкция может затем надстраиваться слайсами, характерными для модели рис. 1. В итоге новые и исходные волосковые клетки не будут различаться, и модель приобретет состав АВ2. Таким образом, для модели состава АВ6С2 при дифференцировке ее резервных клеток С в волосковые возможны два пути трансформации.

В вариантах строения ткани клеточного состава АВ2 и АВ3 прямая трансдифференцировка опорных клеток в волосковые невозможна. Для того, чтобы появились опорные клетки, которые не подвергались бы контактному ингибированию и служили резервными клетками, пласт должен приобрести состав АВ6С2. Условия превращения модели состава АВ2 в АВ6С2 таковы: должно либо погибнуть 75% волосковых клеток, либо все опорные клетки должны поделиться дважды, а в модели состава АВ3 должно погибнуть 62,5% волосковых клеток или должны поделиться вначале все опорные клетки, а затем - каждые две из шести. Схематически описанные варианты

превращения моделей можно представить следующим образом (рис. 6). Здесь же для сравнения приводится иллюстрация прямой трансдифференцировки опорных клеток в волосковые из статьи других авторов.

Рис. 6. Слева - современное плоскостное представление прямого превращения опорных клеток в волосковые. Справа - трехмерное представление путей взаимопревращений описанных вариантов гистоархитектуры. На схемах можно видеть, что все клетки проходят через промежуточную стадию, на которой соприкасаются с базальной мембраной и выходят на апикальную поверхность.

Таким образом, модель АВ6С2 с резервными клетками, показанная на рис. 4.1, II, и различные варианты ее трансформации отражают реорганизацию трехмерного строения эпителия при возникновении новой популяции волосковых клеток из опорных.

Как и все описанные ранее варианты пространственной организации слухового эпителия птиц, варианты АВ6С2 и АА*2В6 следует считать не двухслойными, а инвертированными двурядными, поскольку волосковые клетки не смыкаются друг с другом и все клетки достигают апикальной поверхности.

Выводы

1. Пространственная организация слухового эпителия внутреннего уха исследованных видов птиц (голубя сизого Columba livia, перепела японского Coturnix coturnix (japónica), чайки серебристой Lams argentatus, синицы большой Parus major, вороны серой Corvus comix) характеризуется комплексом признаков, включающим строгие численные соотношения

волосковых и опорных клеток, определенные значения их смежности и состав микроокружения каждой клетки.

2. Одним из основных свойств пространственной организации слухового эпителия птиц является полиморфизм его клеточной сети, в составе которой численные соотношения волосковых (А), опорных (В) и резервных клеток (С) принимают значения АВ2, АВ3 и АВ6С2. Наиболее распространенным в дистально-проксимальном направлении эпителия является вариант состава АВ2. Другие варианты встречаются значительно реже и в виде небольших участков.

3. На разных уровнях глубины слуховой эпителий птиц характеризуется различной смежностью и взаиморасположением клеток, благодаря чему эпителиальный пласт имеет блочное (слайсовое) строение. В пределах каждого слайса топология клеточной сети остается неизменной. Построенные модели позволили выявить в зрелом, неповрежденном эпителии от 2 до 4 слайсов.

4. Число слайсов в эпителии может изменяться: в ходе дифференцировки оно увеличивается до значения, равного таковому в зрелом эпителии, уменьшается во время регенерации после повреждения и возвращается к исходному уровню при ее завершении. При этом одни варианты пространственной организации эпителия могут превращаться в другие, отличаясь от исходных составом, формой и смежностью клеток. Полнослайсовые модели детально описывают пространственную организацию слухового эпителия взрослых птиц, а также позволяют прогнозировать ее развитие в ходе онтогенеза и восстановление при регенерации.

5. Когда в клеточном составе слухового эпителия птиц на одну волосковую клетку приходится не менее восьми опорных, тогда две из них оказываются резервными, которые могут дифференцироваться в волосковые. Это достигается в клеточном составе АВ6С2, который характерен для эпителия в онтогенезе или при регенерации.

6. В полностью сформированном слуховом эпителии птиц волосковые и опорные клетки достигают апикальной поверхности, а на базалыюй мембране находятся только опорные клетки. Вследствие этого слуховой эпителий птиц является инвертированным двурядным.

Список публикаций по теме диссертации

1. Савостьянов Г.А., Грефнер Н.М., Голубева Т.Е., Савостьянова (Магницкая) Е.Г.

Трехмерная организация сенсорного эпителия улитки птиц // Морфология. - 2000. Т. 117. № 2. - С. 62-68.

2. Савостьянов Г.А., Грефнер Н.М. Голубева Т.Е., Савостьянова (Магницкая) Е.Г.

Трехмерная организация эпителиев состава АВ2 на примере сенсорного эпителия улитки птиц // Журн. эвол. биохим. физиол. - 2005. Т. 41, вып. 5. - С. 457-464.

3. Савостьянова (Магницкая) Е.Г., Воробьев A.B., Грефнер Н.М., Левченко В.Ф. и Савостьянов Г.А. На пути к трехмерной гистологии. Применение компьютерных моделей к реконструкции трехмерной структуры биологических тканей на примере анализа строения слухового эпителия птиц // Морфология. - 2007. Т. 131, вып. 1. - С. 8-17.

4. Магницкая Е. Г., Грефнер H. М., Голубева Т. Б., Воробьев А. В., Левченко В.Ф. и Савостьянов Г.А. Трансформация трехмерного строения эпителия в развитии на примере рецепторного эпителия слухового сосочка птиц // Сенсорные системы. - 2009. Том 23. № 4. -С. 351-362.

5. Савостьянова (Магннцкая) Е.Г., Воробьев A.B., Грефнер Н.М., Левченко В.Ф. Применение компьютерных моделей для реконструкции трехмерной структуры биологических тканей // XIII Международн. совещание и VI школа по эволюционной физиологии. Тезисы докладов и лекций. - СПб. 23-28 января 2006 г. —2006. - С. 190-191.

6. Воробьев A.B., Грефнер Н.М., Савостьянова (Магницкая) Е.Г. Ткань как объект структурной компьютерной гистологии // Актуальные проблемы учения о тканях. Материалы научного совещания. - СПб. 14 апреля 2006 г. - 2006. - С. 87-88.

7. Грефнер Н.М., Воробьев A.B., Магннцкая Е.Г. Компьютерное моделирование гистоархитектуры в эволюционной гистологии // Проблемы эволюционной морфологии животных. Тезисы международной конференции, посвященной 100 - летию со дня рождения акад. A.B. Иванова. - СПб. - 2006. - С. 29-30.

8. Vorobyov A.V., Grefner N.M., Magnitskaja Y.G. Theoretical and experimental basis of tissue engineering // Saint-Petersburg International Workshop on NanoBioTechnologies. Book of abstracts. - Saint-Petersburg, Russia. November 27-29, 2006. - 2006. - p. 16.

9. Savostyanov G. A., Grefner N.M., Lutskaja O.F., Savostyanova (Magni(skaya) K. Morphogenesis of 3-D structure of epithelia and principles of their reconstruction // Focus on Microscopy. 19th International Conference on 3D Image Processing in Microscopy. - Perth, Australia. April 9-12,2006. - 2006.

10. Воробьев A.B., Грефнер H.M., Магницкая Е.Г. Принципы пространственной организации клеточных пластов и методы компьютерного моделирования их морфогенеза // Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза. Симпозиум с международным участием. - Москва. 9-11 октября 2007 г. - 2007. - С. 139-141.

11. Магннцкая Е.Г., Левченко В.Ф., Грефнер Н.М., Савостьянов Г.А. Структурное разнообразие клеточных сетей // «Структурные и функциональные основы эволюции функций, физиология экстремальных состояний», посвящено 125-летию со дня рождения академика Л.А. Орбели. Тезисы докладов и лекций. - СПб. 19-20 ноября 2008 г. - 2008. - С. 95-96.

12. Magnitskaya E.G., Golubeva T.B., Grefner N.M., Vorobyov A.V., Savostyanov G.A. Computer simulation and confocal microscopy for 3d reconstruction of the epithelial tissues // International conference «Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine» by Leica Microsystems. - Saint-Petersburg, Russia. November 9-10,2009.-2009. - p. 19.

13. Савостьянов Г.А., Магницкая Е.Г., Грефнер H.M., Голубева Т.Б. Межклеточные взаимодействия: от микроокружения к гистионам и клеточным сетям // VIII Всероссийская конференция по патологии клетки. Сборник научных трудов. Тезисы докладов. - НИИ МЧ РАМН. - Москва. 11-12 ноября 2010 г. - М.: МДВ, 2010. - С. 206-208.

Список цитируемой литературы

1. Воробьев А.В., Савостьянов ГА. Компьютерное моделирование трехмерной структуры биологических тканей // Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных проблем и прикладных научных задач. Тез. докл. науч. совещ. ИВТН-2003. 24 дек. 2003 г. / М.: Открытые Системы. - 2003. - С. 16.

2. Голубева Т.Б., Ямалова Г.В. Структурно-функциональные особенности периферического отдела слуховой системы птиц // Сенсорные системы и головной мозг птиц / Под ред. В.Д. Ильичева и Л.С. Богословской. М.: Наука, - 1980.-С. 84-113.

3. Ивантер Э.В., Коросов А.В. Основы биометрии / Петрозаводск: Изд-во Петрозаводского гос. ун-та. - 1992. -168 с.

4. Лакин Г.Ф. Биометрия / М.: Высш. шк. - 1980. -293 с.

5. Маресин В.М. Пространственная организация эмбриогенеза / М.: Наука. - 1990. - 168 с.

6. Савостьянов Г.А. Основы структурной гистологии. Пространственная организация эпителиев / СПб.: Наука.-2005.-375 с.

7. Смолянинов B.B. Математические модели биологических тканей / М.: Наука. - 1980. ■ 366 с.

8. Титова Л.К. Развитие рецепторных структур внутреннего уха позвоночных / Л.: Наука. - 1968. - 192 с.

9. Braumann U.D., Kuska J.P., Einenkel J., Horn L.C., Loeffler M., Hoeckel M. Three-Dimensional Reconstruction and Quantification of Cervical Carcinoma Invasion Fronts From Histological Serial Sections // IEEE Transactions on Medical Imaging.-2005. V. 24. № 10.-P. 1286- 1307.

10. Daudet N., Gibson R., Shang J., Bernard A., Lewis J., Stone J. Notch regulation of progenitor cell behavior in quiescent and regenerating auditory epithelium of mature birds // Dev. Biol. - 2009. V. 326. - P. 86 - 100.

11. Dormer K.J. Fundamental tissue geometry for biologists / Cambridge. L.: Cambridge Univ. Press. - 1980. - 146 P-

12. Fischer F.P. Quantitative analysis of the innervation of the chicken basilar papilla // Hear. Res. - 1992. V. 61. № l.-P. 167 - 178.

13. Fischer F.P. Quantitative ТЕМ analysis of the bam owl basilar papilla // Hear. Res. - 1994. V. 73. № I. - P. 1 -15.

14. Fischer F.P. Hair cell morphology and innervation in the basilar papilla of the Emu (Dromaitis novaehollandiae) // Hear. Res. - 1998. V. 121.№ l.-P. 112-124.

15. Goodyear R„ Richardson G. Pattern Formation in the Basilar Papilla: Evidence for Cell Rearrangement // J. Neurosci. - 1997. V. 17. № 16. - P. 6289 - 6301.

16. Hansis E., Carroll J.D., Schaefer D„ Doessel O., Grass M. High-quality 3-D coronary artery imaging on an interventional C-arm x-ray system // Med. Phys. - 2010. V. 37. № 4. - P. 1601 - 1609.

17. McCuIlar J.S., Ту S., Campbell S., Oesterle E.C. Activin Potentiates Proliferation in Mature Avian Auditory Sensory Epithelium // J. Neurosci. - 2010. V. 30. № 2. - P. 478 - 490.

18. Means S., Smith A.J., Shepherd J., Shadid J., Fowler J., Wojcikiewicz R.J.H., Mazel Т., Smith G.D., Wilson B.S. Reaction Diffusion Modeling of Calcium Dynamics with Realistic ER Geometry // Biophysical Journal. - 2006. V. 91.-P. 537-557.

19. Stone J.S., Cotanche D.A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium // Int. J. Dev. Biol. - 2007. V. 51.-P. 633 -647.

20. Stone J.S., Rubel E.W. Temporal, Spatial, and Morphologic Features of Hair Cell Regeneration in the Avian Basilar Papilla // J. Сотр. Neurol. - 2000. V. 417. - P. 1 - 16.

21. Tanaka K., Smith C.A. Structure of chicken's inner ear: SEM and ТЕМ study // Amer. J. Anat. - 1978. V. 153. №2. -P. 251 -272.

22. Yamaguchi Т., Fujii Т., Abe Y., Hirai T„ Kang D., Namba K., Hamasaki N., Mitsuoka K. Helical image reconstruction of the outward-open human erythrocyte band 3 membrane domain in tubular crystals // J. Struct. Biol. -2010. V. 169. №3.-P. 406-412.

Подписано в печать 14.02.2012. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 8806Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.:(812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Магницкая, Екатерина Геннадьевна, Санкт-Петербург

61 12-3/769

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ ИМЕНИ И.М. СЕЧЕНОВА РАН

на правах рукописи

МАГНИЦКАЯ ..................

ЕКАТЕРИНА ГЕННАДЬЕВНА

АНАЛИЗ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ СЛУХОВОГО РЕЦЕПТОРНОГО ЭПИТЕЛИЯ ВНУТРЕННЕГО УХА ПТИЦ С ПОМОЩЬЮ КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

ДИССЕРТАЦИЯ

иа соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук Левченко Владимир Федорович; доктор биологических наук Снигиревская Екатерина Сергеевна

Санкт-Петербург-2012

СОДЕРЖАНИЕ

1. Введение 5

2. Обзор литературы 13

2.1. Проблемы изучения пространственной организации эпителиев 13 2.1.1. Основы трехмерной реконструкции тканей по серийным срезам 15

2.2. Современные методы и подходы к реконструкции

трехмерной структуры тканей 17

2.2.1. Неинвазивные методы исследования тканей и получения их срезов 17

2.2.2. Компьютерная обработка и коррекция изображений 19

2.3. Моделирование пространственной организации тканей 22

2.3.1. Индивидуально ориентированные модели

пространственной организации тканей 23

2.3.1.1. Модели, основанные на непосредственном взаимодействии клеток 23

2.3.1.2. Модели, основанные на дальнодействии клеток 24

2.3.2. Универсальные подходы к построению топологических и геометрических моделей пространственной организации тканей 26

2.4. Основы теории модульного строения тканей 30

2.4.1. Понятие о тканевых модулях 3 0

2.4.2. Понятие о тканях как полимеризованных гистионах 31

2.4.3. Модели клеточных сетей для однослойных клеточных пластов 31

2.4.4. Трехмерные модели многорядных и многослойных эпителиев 33

2.4.5. Новый подход к реконструкции трехмерного строения

многорядных и многослойных эпителиев 34

2.4.6. Проверка нового подхода к реконструкции

трехмерного строения эпителиев 35

2.5. Слуховой орган птиц и его рецепторный эпителий 35

2.5.1. Строение слухового эпителия внутреннего уха птиц 38

2.5.1.1. Слуховые клетки 38

2.5.1.2. Форма и иннервация разных подтипов волосковых клеток 39

2.5.1.3. Опорные клетки. Восприятие звукового сигнала 42

2.5.2. Гистоархитектура слухового эпителия 43 2.5.2.1. Взаиморасположение волосковых и опорных клеток 44

2.5.3. Развитие слухового эпителия в онтогенезе 46

2.5.4. Способность слухового эпителия птиц к регенерации 48

2.5.5. Миграция и морфологические изменения новых волосковых клеток 51

2.6. Заключение по обзору литературы и постановка задачи исследования 52

3. Материалы и методы исследования 54

3.1. Материалы для исследования: слуховой рецепторный эпителий внутреннего уха птиц 54

3.2. Методики: приготовление слухового эпителия

внутреннего уха птиц для световой микроскопии 58

3.3. Подготовка материала для конфокальной микроскопии 59

3.4. Приготовление слухового эпителия внутреннего уха птиц

для сканирующей электронной микроскопии 59

3.5. Построение топологических и геометрических моделей

пространственной организации эпителиев 61

3.6. Построение топологических и геометрических моделей пространственной организации эпителиев с помощью компьютерной программы НЬШагсИ 62

3.7. Трехэтапный метод реконструкции пространственной организации эпителиев

с использованием компьютерных моделей 63

3.8. Статистическая обработка результатов и работа с изображениями 64

4. Результаты изучения пространственной организации

слухового рецепторного эпителия внутреннего уха птиц 66

4.1. Пространственная организация

рецепторного слухового эпителия птиц состава АВг 70

4.1.1. Построение трехмерной модели

рецепторного слухового эпителия птиц состава АВ2 70

4.1.2. Варианты модификации базовой модели 79

4.1.3. Определение пространственной организации реальной тканевой структуры путем сопоставления сечений моделей и срезов реальной ткани 84

4.1.4. Количественная характеристика соответствия модели состава АВ2

и реального слухового эпителия птиц 93

4.1.5. Заключение по разделу 4.1 98

4.2. Трехмерная организация рецепторного слухового эпителия состава АВз 100

4.2.1. Построение трехмерной модели

рецепторного слухового эпителия состава АВз 100

4.2.2. Сопоставление модели состава АВз со структурой реальной ткани 106

4.2.3. Количественная характеристика соответствия модели состава АВз и реального слухового эпителия птиц 112

4.2.4. Заключение по разделу 4.2 117

4.3. Модели трансформации состава и структуры

рецепторного слухового эпителия птиц 118

4.3.1. Построение и описание трехмерных моделей ткани состава АВ6С2 119

4.3.2. Модификации базовой модели клеточного состава АВбСг 121

4.3.3. Проверка трехмерных моделей состава АВбСг и АА*2Вб 126

4.4. Общее заключение по главе 4 137

5. Обсуждение результатов 140

5.1. Суть полученных результатов 140

5.2. Достоверность полученных результатов 154

5.3. Новизна полученных результатов 157

5.4. Значение полученных результатов 160

6. Выводы 162

7. Список литературы 164

8. Список публикаций по теме диссертации 183

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Многообразие строения эпителиев всегда привлекало внимание исследователей. Благодаря многочисленным исследованиям срезов эпителиев в базально-апикальном направлении среди них были выделены однослойные, многослойные и многорядные. Роль эпителиев, связанная с взаимодействием с внешней средой, секрецией и всасыванием, а также с рецепторными функциями, определяет непосредственное соприкосновение клеток в пласте. Для эпителиев характерны злокачественные патологии, приводящие к изменениям гистоархитектуры. Однако пространственная организация эпителиев в нормальном состоянии и ее изменения при патологических процессах до сих пор остаются неизвестными.

Изучение взаимодействия клеток в ткани, которое определяет их взаиморасположение, должно в результате раскрывать закономерности структуры сети, порождаемой клетками и связями между ними (Савостьянов, 2005). Именно эта сеть и обеспечивает функциональные свойства ткани. Важность сетевого аспекта для биологических систем начинает отчетливо осознаваться (Капра, 2002; Schutt, 2000; Barabasi, Oltvai, 2004; You, 2004; Albert, 2005 и др.). В полной мере это относится к

эпителиальным пластам.

Однако разрешающая способность общепринятых методов исследования строения тканей недостаточна для описания упорядоченной клеточной сети. Господствующая гистологическая методика основана на исследовании тонких, практически двумерных тканевых срезов, дающих представление о строении клеток, но не раскрывающих их взаиморасположения в трехмерном пространстве. А многочисленные способы реконструкции трехмерного строения тканевого пласта по серийным срезам позволяют проводить либо реконструкцию эпителиев как континуума, в котором не различаются отдельные клетки (Braumann et al., 2005; Stachs et al., 2007; Chi et al, 2009; Hansis et al., 2010 и др.), либо исследовать форму отдельных клеток и их органоидов (Means et al., 2006; Furness et al., 2008; Mazel et al., 2009; Yamaguchi et al., 2010 и др.). Но для изучения взаиморасположения клеток, их смежности и микроокружения, а также клеточной сети, образованной клетками и межклеточными связями, разрешающая способность этой методики оказывается недостаточной. Сейчас на помощь реконструкции приходят конфокальная микроскопия и компьютерные

технологии (Буданцев, Айвазян, 2005; Abramoff et al., 2004; Johnson, Pipe, 2009; Jiang et al., 2010 и др.), но они пока не изменили сути и качества этого метода.

Таковы причины того, что сетевое строение эпителиев остается практически неизвестным. Не проведено разделения его топологического и геометрического аспектов, нет и набора признаков для характеристики клеточных сетей.

Обозначенная выше проблема касается различных эпителиев, в том числе рецепторных, среди которых интерес для настоящей работы представляет рецепторный

слуховой эпителий внутреннего уха птиц.

Слуховой эпителий внутреннего уха птиц (далее для краткости - слуховой эпителий птиц) состоит из двух типов клеток: волосковых (А) и опорных (В). Нижние части опорных клеток полностью покрывают базальную мембрану. При этом верхняя часть опорных клеток в виде фаланговидных отростков выходит на апикальную поверхность. Волосковые клетки располагаются между отростками опорных клеток и тоже выходят на апикальную поверхность (Титова, 1968; Голубева, Ямалова, 1980; Tanaka, Smith, 1978; Fischer, 1992,1994,1998; Golubeva, 1997 и др.).

При рассмотрении клеточных мозаик апикальной поверхности этого эпителия привлекает внимание регулярное расположение клеток (Goodyear, Richardson, 1997; Pickles, van Heumen, 2000 и др.). К настоящему времени получены качественные данные об их форме (Голубева, Ямалова, 1980; Tilney et al., 1986; Fischer, 1992, 1994, 1998) и о развитии эпителия (Goodyear et al., 1995; Golubeva, 1997; Fekete et al., 1998).

Слуховой эпителий птиц способен восстанавливаться после травмирующих воздействий, в отличие от слухового эпителия млекопитающих, и регенерация происходит за счет опорных клеток. Поскольку в случае повреждений первыми погибают волосковые клетки, например, при воздействии ототоксических антибиотиков, а опорные оказываются намного устойчивее, то именно они способны прямо превращаться в волосковые клетки. Опорные клетки могут также делиться, а появившиеся дочерние клетки дифференцируются в новые опорные и волосковые (Adler, Raphael, 1996; Stone, Rubel, 2000; Cafaro et al., 2007; Stone, Cotanche, 2007; Daudet et al., 2009; McCullar et al., 2010). Те из опорных клеток, которые способны дифференцироваться в волосковые, мы называем резервными клетками С.

Сейчас проводится множество исследований на предмет того, как управляется регенерация слухового эпителия через генные каскады; осуществляется поиск сигнальных молекул, отвечающих за то, останутся ли опорные клетки неактивными или вступят в процесс обновления эпителия (Stone, Cotanche, 2007; McCullar et al., 2010 и др.). Но какая доля волосковых клеток должна погибнуть для того, чтобы началась

прямая трансдифференциация опорных клеток в волосковые, а какая - для того, чтобы опорные клетки приступили к митозу, до сих пор не выяснялось. Неизвестно и то, как в ходе повреждения и регенерации меняется взаиморасположение и смежность клеток.

Для того, чтобы изучать строение клеточной сети рецепторных эпителиев, следует для начала обратиться к теоретическим основам развития и строения тканей. Они были заложены работами Беклемишева В.Н. (1925, 1964) о принципах тканевого строения, Хлопина Н.Г. (1946) о дивергентном развитии, Заварзина A.A. (1950,1986) о гистологических параллелизмах. Далее началось развитие основ пространственной организации тканевых пластов с использованием их топологических и геометрических характеристик (Смолянинов, 1980; Dormer, 1980; Маресин, 1990 и др.).

В рамках этого направления была разработана концепция структурной гистологии (Савостьянов, 2005). Смысл этой концепции заключается в развитии системных представлений о тканевом строении. Ткани рассматриваются как сети или решетки, формируемые клетками и взаимосвязями между ними. Клеточные сети имеют модульное строение, что проявляется в регулярно повторяющемся расположении их клеток. Состав и структура таких сетей поддаются вычислению и могут описываться семействами одно-, двух- и трехмерных топологических и геометрических моделей в виде периодических клеточных решеток и мозаик. Для описания моделей был сформулирован комплекс диагностических количественных признаков. Среди них такие, как клеточный состав эпителия, численные соотношения разных типов клеток, смежность клеток, то есть количество клеток, непосредственно соприкасающихся с каждой из них, микроокружение каждой клетки или внутриэпителиальная клеточная ниша, то есть, в каком порядке однотипные и разнотипные клетки окружают друг друга. И из повторяющихся в пространстве клеточных микроокружений формируется строение клеточной сети эпителия в целом.

Эти модели позволили разработать новый эффективный трехэтапный метод реконструкции пространственной организации эпителиальных тканей. Его первый этап состоит в построении двумерных и трехмерных тканевых моделей и получении набора их сечений с помощью специальной компьютерной программы, второй этап - в морфологическом исследовании эпителиев, а третий - в сравнении сечений моделей со срезами тканей с помощью указанного выше комплекса признаков, и выборе той из моделей, сечения которой соответствуют тканевым срезам. Эта модель и будет отражать строение исследуемой ткани. Такой подход радикально повышает разрешающую способность реконструкции и дает возможность определять не только геометрические особенности клеток в пласте, но и характер их взаиморасположения, т.е. топологию его

клеточной сети. Кроме того, существенно упрощается процедура реконструкции, поскольку использование компьютерных трехмерных моделей позволяет резко сократить количество тканевых срезов и делает ненужным их точное совмещение.

Таким образом, представилась возможность исследовать строение пласта слухового эпителия птиц в трехмерном пространстве, топологические характеристики его клеточной сети и возможности ее адаптивных перестроек с помощью нового трехэтапного метода реконструкции. Следует заранее отметить, что настоящее исследование не охватывает такие стороны строения и жизнедеятельности слухового эпителия птиц, как его иннервация, рецепторная функция и биохимические характеристики. Будущие исследования, несомненно, дадут возможность изучить зависимость пространственной организации изучаемого эпителия от упомянутых характеристик.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы - установить пространственную организацию слухового эпителия птиц и определить значение ее количественных характеристик с помощью трехэтапного метода реконструкции. Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Провести реконструкцию пространственной организации слухового эпителия птиц, а именно:

а) построить двумерные и трехмерные компьютерные модели на основе исследования полутонких и оптических срезов эпителия. Определить наиболее информативные направления сечений; б) описать возможные варианты пространственной организации эпителия, которые обнаруживаются у одних и тех же особей птиц, смежность и микроокружение его клеток на различных уровнях пласта с помощью сечений моделей; в) изучить строение внутриэпителиальных клеточных ниш и клеточных сетей для разных вариантов пространственной организации эпителия.

2. Оценить возможность превращения разных вариантов пространственной организации друг в друга при развитии и регенерации слухового эпителия птиц.

Научная новизна

1. Для количественной характеристики пространственной организации слухового эпителия птиц использован комплекс новых диагностических признаков: клеточный

состав, численные соотношения волосковых и опорных клеток, количество контактов с соседними клетками или смежность, микроокружение или количество гомогенных и гетерогенных контактов клеток, число клеточных сторон, сходящихся в точках пересечения.

2. Впервые описаны три варианта пространственной организации слухового эпителия птиц с соотношениями волосковых клеток к опорным, равными 1:2, 1:3 и 1:8. Эти варианты представляют собой клеточные сети в виде клеток, расположенных в регулярном порядке, и связей между ними.

3. Выделен новый тип пространственной организации слухового эпителия птиц. Этот вариант гистоархитектуры эпителия следует считать инвертированным двурядным, а не двухслойным, как полагали ранее, поскольку все типы клеток выходят на его апикальную поверхность, а с базальной мембраной соприкасаются только опорные.

Научно-практическое значение

1. Полученные результаты подтверждают теоретические представления о слуховом эпителии птиц как о регулярной клеточной сети и могут послужить базой для изучения функциональных особенностей рецепторных эпителиев.

2. Применение трехэтапного метода реконструкции на примере слухового эпителия птиц показало, что этот метод упрощает процедуру реконструкции и делает ее результаты более точными. Он может использоваться для изучения других эпителиев и их изменений в ходе развития, что будет способствовать дальнейшей разработке основ трехмерной гистологии.

3. Данные, полученные с помощью трехэтапного метода реконструкции и его экспериментальной проверки, могут быть рекомендованы для спецкурса лекций по строению рецепторных эпителиев в университетах и медицинских институтах. Часть полученных результатов вошла в монографию Г. А. Савостьянова (2005) «Основы структурной гистологии...».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Пространственная организация слухового эпителия исследованных видов птиц представляет собой регулярную клеточную сеть и характеризуется полиморфизмом. Варианты его пространственной организации имеют состав АВг, АВз и АВ6С2, где А -волосковые, В - опорные и С - резервные клетки. Преобладающим в дистально-

проксимальном направлении эпителия является вариан