Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ нового семейства регулягорных Zeste-подобных генов D. Melanogasteh

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ нового семейства регулягорных Zeste-подобных генов D. Melanogasteh"

РГЗ со

-о • -л л п- .-¡.РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАЖ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им.В.А.ЗНГЕЛЬГАРДТА

на правах рукописи УДК 577.21

Абрамова Наталия Александровна

АНАЛИЗ НОВОГО СЕКЕЯСТВА РЕГУЛЯГОРНЬЖ 2Е5ТЕ-П0£ШЫХ

Г:?Н03 ' !.СЗ.АМ01тА5ТЕК.

Генетика ( ОД.ОС.15 )

Автореферат диссертаций на соискание ученой степени кандидата. биологических каук

МОСКВА, 1950

Работа ветолнена в лаборатории биосинтеза нуклеиновых кислот Института молекулярной биологии иа.' В.А.Знгельгардта

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

дехтор биологических наук Самарина О.П.

/

кандидат биологических наук Георгиев П.Г.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: "

доктор биологических наук Аслгнян М.М. доктор биологических наук Иванов А.И.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биологии гена РАН

Зашита состоится '¿¿'¿ув 1993 г. в часов

на заседании специализированного совета Д.002.85.01при Институте биологии развития им.Н.К.Кольцова РАН по адресу: 117984, Москва, ул.Вавилова,д.23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им.Н.К.Кольцова РАН.

Автореферат разослан " ^' ¿ ^¿¿¿А??^- 1ээзг.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Е.М.Протопопова

Ллтуалььостй проОде>;и

Изучение регуляции экспрессии генов - одна из взжеймх залам «олекулярао* • генетики. • Гены зукариот и«епт сложно устроенную, рггуляторну» область, опредсляеиуэ их правилънув еременнуп и т.ишеспециф'.гчнуо экспрессии. Осксзауо роль з регуляции i рвг.кртiпц;-íи игрг.ат jaxsscsph. xoropve усиливает транскрипция и могут быть расположка» i леСоя орявитвд»и гтмссчтельио гена.

С ^.хаксепами связнваг.тся белки, которые при внпетливонки ЛИК «v.-; т яепогрелстьей.;.? :сот:?я:?тир<".в&ти с бглкзми - основными факторами транскрипции, рыспологиннами пи промоторе м тем саыым лктмвкрев&ть транскрипции. В нЕстояиее зреыя описано больное число белков - акткзатороз транскрипции, которые определяет- временные а пространственные параметры экспрессии контролируемых и ни генов. Мутации 5 тглсм;: генах приводят к. больший нарушениям в развитии и иагвт легальные последствия для организма.

С другой стороны, значительно меньше известно о роли .белков-' ре«уй?тс?ок тран^кг.'йпияк , котормь. зкспресскрувтся яа всех стадиях .".'ят-л'.тпя s регуляции трснскрышии Оолыюго числп

ivsh's. Овичкс фувкаа» тау.их гекой продублированы и »гс&точу у»тайки ¿ .^делььо« /сне на имеют Золошх последствия .ел* с сг .

>' üi'ar.üphl?c •wioaagjstcr к такглл? типу генов относится 22>г'.г. „'.ovopf.M. va:: прешо^-гается, ку^сен гля поддержания контакта >r:s;¡:y -^xev'c.-.'po--. и проь'отосом гзяа. "ак было показало, белок sesle yuacicye'i s рег>д*Ц'-:к Съяовзго .числа генов, необходимых в процессе развития. Б то ж время, инактивация геда zeste не приводит к • уеруж-ю разгчтся, т.е. функции этого гена продублированы. Очегиио. ч7о выявление и изучение генлв такого типа, представляет ч^ весьма значительный интерес а является актуальлой проблемой.

В данной работе проведено генетическое изучение кедазно годкягкаого сеиечстза регуляторных генов elyJl-З, которые, как оказалось, косеркрувт с ге)<он zeste з регуляции активности гена wriiie.

Цели m задачи исследования.

Цель Настоящей работы состояла в; характеристике нового семейства "регуляторных генов, усиливавших ыутанткый фенотип аллеля у2 и названных поэтому enchancers of yellow... .....

В задачи исследования входило:

-с помошыо генетических методов определить роль этих генов s регуляции экспрессии лохуса yellow.

-генетически охарактеризовать новый ген этой серии ,е(уJ7 ;

-изучить влияние этого семейства генов на экспрессию локуса white ;

-изучить взаимодействие мутаций этих генов с мутациями в гене zeste.

Научная новизна и практическая ценность работм.

В данной работе проведен генетический анализ новой группы регуляторных генов D. melanogaster. Помимо обнаруженных ранее генов еСуЦ-6, описана и локализована мутация в новом гене, влияющим на экспрессию локуса yellow

Показано, что гены et у il и е(у)3, принадлежащие к этой группе, контролируют экспрессии локуса yellow на уровне регуляции транскрипции, a eiy>7 -на уровне белкового продукта.

Получены . даннке, что гены этой группы, е(у)1-3 взаимодействуют с геном zeste в определении экспрессии локуса white и, вероятно, участвуют в дальнодействии регуляторных элементов (знхансера и промотора) локусов yellow и white.

Апробация работм. Материалы диссертации были представлены на X-OU . двустороннем советско-французском симпозиуме

"Физико-химические основы жизни" (Киев, 1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

- Объем-диссертации. Диссертация изложена .на 103 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора ' литературы, , экспериментальной часта и обсуждения полученных результатов, выводов и включает в себя А рисунка и 9 таблиц. Список цитируемой литературы насчитывает 146 наименования.

РЕЗУЛЬТАТЫ

ГЕНЫ, КОНТРОЛИРУЮЩИЕ ЭКСПРЕССИЮ ЛОКУСА yellow.

ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНД-ЗНХАНСЕРА yellow Т.

.Чохуе yellow кодирует мембранный белок, его транскрипция-регулируется несколькими независимо действуошими энхансерами. С помощыэ генетического . анализа большого числа ■ у-нутация было показано, что ген yellow мсжат независимо экспрессироваться по крайней мере в 40 зонах кутикулы INash and. Yarkin, 1974, Nash, 1976!.

В данной работе было сцделеио 12 зон кутикулы, по которым велся анализ уровня пигментации: тело', крылья, второй членик основания антенн, аристы, рисунок головной капсулы, рисунок "Пентагон" -на груди, грудные, брсшные, крыловые нару.тяне, крыловыг внутренние и ножные щетинки, волоски, два задних Оркпзвнх сегмента.

В системе продленной нестабильности, при использовании Р-М

гибридного дисгенеза было получено 14 мутаций, изменяших фенотип

аллёля ^ , что выражалось в нарушении пигментации шетинок на

голове и груди, но не влияшмх на проявление, других мутаций,

сказанных внедрением МДГ4, например, scl, se3®, ct6. С помошьв

recta, на. аллзлизи они были разбиты на семь групп комплементации и

обозначены как "знхансер yellow", или sty>1-7. Покямо снижения

пигьектацик i cu. табл.1), данные нутации еше ряд свойств:

способность к супрессии некоторых мутация, утолщение и укорочение

щетинок, изменение фенотипа всех частей тела, снилкние

жизнеспособности и, s некоторых случаях, стерильность. Особи, 2 ül

содеожицие мутации у , eíy)n в Х-хромосоие и дупликации гена

1 9

yellovj на аутосоые (Dp(l,2>sc~ ) или в Y-хромосоме fiQíllQ—4

!T(1;Y! М, ииеэт нормальную окраску тела.

Одна мг мутаций, ely)7u!, снижающая пигментации некоторых зон кутикулы в линии Oregon, бала локализована в 0 моргаяиде третьей хроютсокы. Более точное картирование не проводилось по причине отсутствия удобных маркерных мутаций з районе локализации.

Эту группу изучаемых генов, е(у)1-Т, по характеру взаимодействия с яокусоц yellow можно разбить на две подгруппы.

К перЕоа относятся те гены, мутактнкэ аллели которых в комбинации.в непозредденкыа аллелей yellow изменяет пигментацию кутккули. Cam принадлежат е!у)5,5,7 гена.

Мутация Генетачес- Цитологическая лака- логическая лизвцяя локализация

Таблица 1.

Влияние

Влияние 2

на у -аллаль на у -аллель

e<y>lul 1-57.9

ely>2ul 1-36,2

e(y)3ul 1-62,2

ely )4ul 1-53,1

ely)5ul 1-59,2 17 С

ely )6ul 1-37,2-

ely)7ul 3-00,5

93 В не влияет

10 С не влияет

18 CD не влияет

16 В у ; либо жэлтыв

тораксвльные ass- . тинки

Щетинки и волоски торахса и абдомена желтые, мозаичные.

10 F Тело, крылья, се-тинки светло-желтые.

60 А Тело, крылья светлеют, щетинки становятся коричневы»»!

иетинки головы и торакса, волоски желтке.

шетинки головы и торакса, волоски желтее.

шетинки головы я торакса, волоски жлтнг.

волоски и иетинки торакса желтые.

светло-аалтыг шетинки торакса

Щетинки на груди, орешке и крыльях бледно-лЕлтые. Теле и крылья желтые. Щетинки тела желтые.

. Гены другой подгруппы, такие как etyЛ,2,3, изменяют пигментацию кутикула только в присутствии мутантных yellow-аллелея.

В данной работе проводилось изучение влияния генов ely) на экспрессию генов yellow и white.

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ГЕНОВ etyJl, е(у)3 И efylT ИА ЭКСПРЕССИИ ГЕНА

yellow.

Мутация eiylf11 была получена в системе продленной нестабильности, и, возможно, связана с инсерциея мобильного" элемента Сталкер, что . может облегчить клонирование соответствующего гена.

Мутация efylT111 влияет только на пигментацию кутикулы и не имеет других фенотипическкх проявлений. Наиболее вероятны« объяснением этого факта моает быть то, что ген е(у>7 является структурным и параллельно с геном yellow определяет степень пигментации кутикулы. Нельзя, однако, исключить возможности, что продукт.'гена eiy)7 может регулировать либо транскрипцию , либо процесссинг гена yellow. Для решения этого вопроса был проведен анализ влияния мутации eiyiT115 на фенотипическое проявление супернестабильных аллелей локуса yellow, вызванных внедрением в локус мобильных элементов Р и X (Георгиев и соавт.,1992), а также анализ эффекта при введении мутации dvr" - тест для определения снижения транскрипции гена yellow в мутациях, имеющих фенотип, близкий к норме.

В аллелях и транскрипция гека находится под контролем

+ns +lbs

регуллторных элементов вставки, а в у , его прояззодных и у

транскрипция регулируется знхаксерами МДГ4, гена yellow и иксерта

X ¡Георгиев и соавт., 1992!. При введении мутации eiv>7ui з

одинаковой степени происходит уменьшение пигментации тела и

крыльев у всех проанализированных особей (табл.1). Этот результат,

является указанием ■ на взаимодействие генов е!у>7 и yellow на

белковом уровне: трудно представить, что белковый продукт гека

el у>7 s равной степени является активатором транскрипции для

разных регуляторных систем.

Мутации е(у)!и' и e<y>3ul приводят к фенотипу "желтые

детинки" только в комбинации с мутантныки аллелями. Выли созданы

комбинации мутации eiy)ul к различных супернестабилькых аллелей

2

yellow, отличающихся по взаимодействию с мутациями su(Hw) и modiEdg4 )lu}. В обшей сложности, было проанализировано 34 супернестабильных аллеля и в таблице 2 приведены только наиболее характерные случаи.

; Таблица 2.

Влияние, мутация suiHwJ2, шоим1г4>1ц1 и eiy)lul , eiy)3ul на фенотипическое проявление супернестабильных аллелей в локусе

yellow.

Индекс Изменение степени пигментации различных зон кутикулы:

______I___Е___Л___О_____ ___&.S_I_0_0_____

аллеля т к РП ГК 2А Ар К ПГ Гр Бр Кн Кв Н

8 8 8 8

i. y-s - 1" 1 - г - I - 1 - 5 - 5 — 5 - 5 - 5 -- 5 — 5 — 5 — X X X X ОХ= XXX

::. у^Р'5 -5-5-1-1-1 -5-5-- 5-3-5 —5— 5—4—

. у1-3 -0—0-0-0-0-5-5 — 5- 5- 5—5 — 3—5 —

8*= 8*= = ЩЩ §|1 ||

8$ Si ox

4. у -2-2-2-2—4—5-5 — 5- 5- 5 — 5 — 5 — 5_—

8 § 5 — 3 — 2 — x= XH x=

5.ytns -5-5-2-2-2-5-5 — 5-0-5 — 5 — 5 — 3 —

8X= 8х* 5 5 S g

s

Примечание: Цифры>определяют степень пигментации данной зоны кутикулы: 0 - отсутствие пигментации; 5 - нормальный уровень пигментации. Первая цифра определяет нижнюю границу вариабельности данного класса аллелея по степени пигментации, вторая - верхнюю. Число "о", "х", и определяют степень изменения уровня

пигментации данной зоны .кчтикулы при введении соответственно мутаций Бит*)' , вюй(м1г4) , е(у)1 (над цифрами - увеличение пигментации, под ними - уменьшение)

5. У

■lbs

8 8 ох ох -3-3-1-1-1-5-5 — 5- 0- 2 —

б

Оказалось, что все супернестабильные аллели yellow можнс разделить на два класса s зависимости от характера взаимодействия с мутациями ety)lul и e!y)3ul.

К первому классу относятся те аллели, фенотипическое . проявление которых' не изменяется при введений еt уIй1 -мутаций. Сюда принадлежат почта асе аллели с суперэкспрессией гена yellow

Ч-Ds +£

(у >, с нормальным уровнем экспрессии ly ), а также большее

число аллелей с нарушением экспрессии yellow в определенных зонах

кутикулы (y+ms ,y+ls -прогрессирующее снижение пигментации

тела и крыльев мух; y^s ,^Tts ,yvs-прогрессирующее снижение

пигментации щетинок. коготков, антенн, полового гребешка).

Таким образом, мутации e(y)lul и eiy)3ul не влияли ка

значительную группу аллелей, несмотря на разницу в интенсивности

пигментации тех или иных зон кутикулы. В этом плане eiy)lUI и

e!y)3ul отличаются от мутации e(y)7ul, снижающей интенсивность

пигментации тела и крыльев у всех взятых для анализа

у-аллелеи.. Нужно так же ответить, что на «енотшшческсе проявление

2

аллелей первой группы не оказывают влияния и улггацни suiHw) и

E0dtBdg4)lul.

.. 2тору» группу представляют аллели, взаимодействующие с

siу )ul-мутациями. В таблице 2 призедены наиболее характерные

примеры. Мутации ety"i)u*K efy)3ul имели прммэрко одинаковое по

характеру и интенсивности влияние, и поэтому длч простоты в

>il

таблице приведены данные только для «утацип е!ул . При введении sly!11'-мутаций в аллели этого класса происходило снижение пигментации kvпикули. 3 зависимости от взятого в комбинацию v-аллеля интенсивность «заимодепствия с е!у)"*-мутациями была разной.

В некоторых аллелях введение мутации е(у)1ц1 или eiy)3ul приводило тс сильному уменьшению пигментации исклэчгггельно грудных шетипок до степей;', наблюдаемо?, при / -ыутааям !табл.2.1. !. Наблюдалось, резкое снижение пигментации тела, ярчльез, второго членика антенн, арист, полового гребеика и коготков, т.е. &сех зо;; кутикулы, по которым проводился анализ (табл.2.4). Не выявлено корреляции между интенсивностью пигментации определенной зоны кутикулы супернестабильного алле.:я и силоа влияния е!у)и1-мутаиия.

Необходимо заметить, что на все аллели этого ¡-.Лаоса, гз о икни исключением 1 табл.2.2), мутации roaimdg4) и suiHwi^ оказывают

сильное влиятае. Это мохет отражать наличие определенной связи между энханеером mdg4 и действием генов eiy)ul . С другой стороны, полученные результаты (табл.2) не позволяют говорить о какой-либо корреляции нему характером действия et у и мутациями modi mcig-4 ) и sutHw). Скорее всего, они действуют независимо.

добавочным тестом на влияние е(у)-мутаций на экспрессию гена

yellow было введение .мутации dvr2. Самостоятельно мутация dvr2

вызывает небольшое уменьшение размера крыльев при увеличении

пигментации крыльев и второго членика антенн, à в комбинации с ? 2 у -мутацией приводит к фенотипу "загнутые крылья". Комбинация dvr

и у-мутаций с прогрессирующим уменьшением пигментации крыльев

сопровождалась плавным увеличением признака "загутые крылья", и,

таким образом, мутация dvr^ могла использоваться в качестве теста

на снижение транскрипции гена yellow в аллелях, имеющих фенотип,

близкий к норме.

Для опыта были выбраны yellow-аллели y+ns и y+s,

2

супрессирующие эффект мутации, dvr на крылья. Комбинация этих аллелей с мутациями eiy)lul и elyJS11 приводит к небольшому уменьшению пигментации крыльев I табл .-2. ). При введении в такую конструкцию мутации dvi^ происходит появление фенотипа "слабо загнутые крылья", что говорит о снижении экспрессии гена yellow. В отличие от мутаций е! у Uul и е( у 13й1 , введение мутации е(у 17й1 в комбинацию с мутациями dvr и у не приводило к изменению фенотипу.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что гены elyll и е(у)3 взаимодействуют с геном yellow на уровне регуляции транскрипции, в то время как ген et у>7 регулятором транскрипции не является, а взаимодействует, схорее всего, на белковом уровне.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НУТАЦИЙ ety)^, el у »3й1 И z-МУТАШМ.

Следующей задачей работы было изучение взаимодействия е<у»-генов с геном zeste. Модельной системой при этом служила регуляторная система локуса white.

Локус white кодирует мембранный белок, который, как предполагается, нужен для транспорта предшественников красного и коричневого пигмента через мембрану tSuaners et al., 1982К Степень пигментации гяаза соответствует уровня транскрипции гена, что позволяет проводить фенотипическия анализ изменений экспрессии локуса white.

&

В данной работе уровень пигментации глаз дрозофилы оценивался по 12 бальной шкале, где нормальная окраска (дикий тип) обозначается wt, а полная инактивация гена (белая окраска) - 0. И - wt, IV irpasTTCKr тлааа с" ютричяеетяжг гтятязктг i темно-коричневые; 8 - коричневые глаза; 7 - "сзегло-коричневые глаза; б - темно-оранлЕвые глаза; 5 - оранжевые глаза; 4 -светло-оранжевые глаза; 3 - желтые; 2 - светло-жЕлтые; 1 -желтоватые; 0 - белые.

Мутации s любом из знхансеров yellow не влияют на экспрессии гена white, однако зто не является достаточным доказательством того, что они не изменяют в слабой степени экспрессия гена white; небольшое нарушение транскрипции гена white, приводящее к снижение содержания пигмента менее, чем в 2 раза, фенотипически не проявляется devis et al., 1965). Однако мутации et у )l-3uï не влияли и на фенотипическое проявление взятых s анализ аллелей VIй1, wbl, wbf. Таким образом, мутации e(y)l-3ul даже в слабой степени не изменяют экспрессию локуса white.

Мутация zv77h (делеция лидерноя последовательность. белка zeste), ведущая к полной инактивации белка zeste, снижает пигментации глаз у самцов лишь до 10+ , а у самок до 3+. С этой мутацией взаимодействуют только 3 из изученных мутация: e(yilul, eiy)2ul и e(y>3ul. Это взаимодействие усиливается при 1б°С ( табл.3).

При комбинировании мутаций e(y)lul и eiy происходит сильное уменьшение пигментации глаз. У- самцов она . снижается до 5+ для е!у)1а1 и до 4+ для e(y)3ul. При этом наблюдается выралеяная мозаич'ность, что характерно для zeste мутаций. У гомозиготных самок интенсивность окраски гл'аз снижается до 3+ и мозаичность почти (для e(y>lul) или полностью (для е(у)Зи1> отсутствует. Таким образом, мутации eiy)lul и e(y>3ul \ резко усиливают эффект нулевой z-мутации на локус white.

Мутация e(y)2ul в комбинации с Zv77h осветляет глаза у самцов до S+, а у самок до 4+ со слабым мозаичным проявлением.

Для доказательства того, что именно мутации e(y)lul , ety)^1 и e(y)3ul приводят к усилению мутантного фенотипа zeste, с помощью линии у2ГВх было проведено генетическое картирование локализации усилителя zeste. (e(z)). Анализ показал, что локализация . усилителей e<z> и е<у)ul совпадают для мутаций

!

Взаимодействие мутация efy) и

локуса white.

Таблица 3. ,ul •■ в' регуляции экспрессии

z+ zv77h 25°(1б°С)

S 05

е(у)ш + wt wt 91 lOw) 5(9 J

eiy)lul wt wt 5m( 5m) 3wI3 !

ety)2ul wt wt 6(7ra) 4l3w)

e(y)3UJ wt wt 4a(4w) 3(3)

eiy >4-6ul wt wt 9(10w> 8(9)

о

Мозаичмость глаза выражается: е~сильная, пгсредняя, w-слабая иозаичность.

е(у)1и5и ely >3ul.

Экспрессия' гена white при введении z1 -мутации зависит от гомологического спаривания двух Х-хромосох: самцы имеет нормальную окраску глаз, у самок ока снижена до 3+ (табл.4).

Комбинация мутаций e(y)lul или е!у )3ul с z* у самцов приводит к небольшому снижение пигментации, до 9+, а сочетание этих же мутаций (e(y)lul или e(y)3ul > с z* у самок , либо с z0^6 в обоих случаях усиливает мутантный фенотип, но не более, чем до 3+.

В процессе работы спонтанно возник частичный ревертант мутации z^P®- z0^®^1. Эта мутация у самцов с w+ -аллелей приводит к фенотипу "светлокоричневне глаза" 1 б+! и _в гэтерозиготе с z у самок не имеет доминантного проявления. Такиы образом, по своим свойствам частичный ревертант занимает промежуточное

положение между мутациями z1 и z0i>6. У самцов мутанткый фенотип z9p6Rl усиливается в комбинации с мутацией е(у)lu! до 4+., а с мутацией eiy)3ul до 3+.

При температуре 16°С эффект zeste-ыутацип частично супрессируется.

Таким образом, было исследовано действие zeste-мутаций совместно с мутациями ety>ul . Все изученные комбинации либо не меняли мутантный фенотип, либо усиливали его, но не более, чем до степени 3+ Существование такой четкой границы, ниже которой

Таблица 4.

Влияние комбинации мутация e(y)l,3ul и различных zeste-мутаций на интенсивность окраски глаз. Мутации в Пигментация глаз при 25°С (15°Сг.

энхансерах

yellow Z°P6 2°P6R!

eiy)+ 0 9 0 S 0 9

wt(wt) 313) 31 5ш) 3(3 ) 6(10) 313 !

e(yUul 9(3) 3(31 3( 3d) 3(3) 4w(5) 3(3 >

eiy )3ul 9(9) 3i3 ; 31 3m) 313 ) 3141 3(3

пигментация глаз уже не уменьшается, позволяет предположить, что исследованные гены влияют на одну и ту же часть регуляторной системы локуса white и снижение уровня пигментации до 3+ говорит о ее полном выключении. Пигментация 3+ характерна так же для работы гена с инактивированным знхансером.

Следовало проверить, насколько обтам будет это правило. С этой целью было проведено исследование влияния мутаций г1 и z0^6 и их комбинаций с мутациями e(y)lul и e!y)3ul на гетерозиготу w+/W, где w*- один из взятых в анализ w-аллелей: W3,1, w^, к®**, wbf. Во всех проанализированных случаях независимо от температуры, комбинация мутации г1 или z0^ с w-аллеляыи приводила к снижению пигментации до 3+. Б этом случае дополнительное 'введение ei у)и1-иутаций не изменяло ее уровня. Только в комбинации w+2v77iVv!+z1 при температуре 1Ô°C глаза имели окраску 5-»-, и тогда при введении efу>ul-мутаций происходило уменьшение пигментации до ' 3+. Таким образом, эти результаты являются подтверждением того,

) что гены zeste и efy» влияют на одну и ту as часть регуляторной

' ' системы локуса white. ; V

ВЛИЯНИЕ efyJl^; fcl у >3ul-МУТАЦИИ НА ЭФФЕКТ ДОМИНИРОВАНИЯ z-МУТАЦИИ.

Мутация z1 рецессивна, но у самок, имеющих в одной хромосоме дикий аллель, а в другой - аллели wal,w^^,wbf происходит некоторое уменьшение пигментации. Таким образом, эта мутация имеет слабо выраженное доминантное проявление, которое при температуре 1б°С полностью супрессируется. В комбинации с мутациями е(у >1ul и eiy)3ul доминантное проявление мутации z1 усиливается (табл.5).

!

и

Влияние мутация е(уП ,3

ul

Таблица 5. на проявление доминантного эффекта

мутация 20р6 и z1 при температуре 25°С(1б°С).

w

wbl

+

wt(wt) 10 (wt ) 10(wt) tOfwtl 9(wt)

z'/z

?0p6,

e(y)lul ely)3ul ■+ eiyUul e(y)3ul

101 Wt) lO(wt) 5m( 10) 4w(8) 3w(8)

10(Wt) 10(wt) 4m( 9) 4w<8) 3(8)

8(wt) 6(10) 3w(8) 3(7ш) 3(6n)

8(wt) 7(10) 3(9) 3(7m) 3(6m)

7(10) 7(9) 3(8) 3(6m) 3(5m)

Мутация является доминантной при температуре 25°С,. и

пигментация соответствует выраженности ыозаичности.

уровню 5+ со средней степенью При понижении температуры до 18°С происходит супрессия доминирования и по фенотипическому проявлению мутация приближается к своему частичному ревертанту .

е(у)1

ul

и е(у )3

ul

усиливает доминантное

Введение мутаций проявление. -

Следует ответить, что ' во всех случаях рассмотренных комбинация e(y)l-3ul-zeste-whlte- мутаций степень пигментации глаз имеет два уровня, при которых,, как правило, отсутствует моэаичность: 17+-9+) и (3+1. Они, вероятно, соответствуют двум стабильным вариантам взаимодействия знхансера и проиотсра гена white, т.е. стабильным вариантам контроля экспрессии гена white.

ДОШШТНЬЙ ЭФФЕКТ НУТАЦИЯ Б ГЕНЕ е(у>3.

Мутации в л'окусах е(у)1,3 являются рецессивными, и самки, гетерозиготные по зтиа мутациям, имеют дикий фенотип.

Ми проверили, не будет ли выявляться доминантное проявление этих мутация в комбинации с мутацией гу7711.

Мутация дает у самок фенотип: темно-коричневые глаза

(пигментация 8+). У самок, гетерозиготных по аллеля пигментация глаз в присутствии двух доз мутации уменьшается

и становится мозаичной (табл.б).

Другие исследованные аллели ('*а1, У/3,2 , • V/*11, »такого

эффекта не имеют.

Таблица б.

Анализ доминантного эффекта e<y>ul мутация, комбинация Комбинация с

w-аллелея +/+ ely)lul/+ ety)3ul/+

ч- W 3 а 6ш

,JBwx, al, а4, Ы, 8 ь 5т

wM бт бт 4W

При введении в такие комбинации одной дозы аллеля eiy)3ui происходит ¿умственное уменьшение пигментации глаз во всех комбинациях мутация.' Этот зф^ехт' не изменяется "при температуре 18°С.

Таким образом, мутация e<y)3ul имеет слабый доминантный эффект в комбинации с Zv77}1 мутацией.

Для мутации e(y)lu* были получены отрицательные результаты. В гетерозиготах eiy!!ul/e(y)3uî и eiyJluî+/e(y)3ul глаза мух имеет одинаковую степень пигментации (бт).

Одна доза нутации eîy)3ul. так же усиливает в самках доминантный эффект мутации z^*5®.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Семейство новых регуляторных генов дрозофилы, епсПапсегг of ye)low, et y >1—6, было обнаруарно ранее в системе продленной нестабильности, вызванной перемещениями мобильного элемента ■ Сталкер. Гены этой группы локализованы на Х-хроносоме. Мутации б

них способны уменьшать пигментацию кутикулы взрослой мухи в i \ некоторых ее зонах t C-eorgiev et.al.. 1990, Georgiav et al,, 1989).

V

В настоящей работе дополнительно к обнаруженным ранее описан еше один ген, относящийся к той гее группе, eiyJî115, изучено влияние е!у)-генсв на транскрипцию локусов white и yellow, выявлено •взаимодействие генов е<у)1-3 и zeste в регуляции экспрессии локуса white.

Был использован коыплехс генетических подходов, позволяющих I отличать взаимодействие на уровне белковых продуктов от регуляции

экспресии на уровне транскрипции.

Во-первых, при использовании dvr'-теста, появление фенотипа "загнутые крылья" будет свидетельствовать 'о снижении экспрессии локуса у, хотя в данном случае нельзя точно выявить стадию, на которой гены efy) влияет на синтез у-белка: регуляция транскрипции, созревания мРНК, трансляции.

Во-вторых, было изучено влияние генов е(у> на различные супернестабильные аллели локуса yellow. В "этих аллелях экспрессия локуса yellow контролируется большим числом регуляторных элементов: своих знхансеров, знхансера КДГ4 и неидентифицированных регуляторных элементов вставки, содержащей мобильнее элементы Р и X. Если взаимодействие е(у) и yellow осуществляется на уровне белковых продуктов, то характер у-аллеля не будет влиять на конечный результат. Если же мутации е(у 1 влияют'ииенно на контроль транскрипции, то они будут действовать лишь на часть аллелей, ко не на все.

В-третьих, дополнительную информации' дает сравнение эффекта воздействия е(уЬмутаций на у-аллели с аналогичных при мутациях sulHw)2 и да a led g-4 )lui , так как две последние влияет именно на контроль транскрипции.

Согласно всем трем тестам, гены е(у)1 и е(у)3 контролируют экспрессию у-гена на уровне транскрипции, а ген е(у)7-на уровне белковых продуктов. Мутации генов eiyЯ и eiy)3 -генов влияют ка те же у-аллели, что и sulHw). Так как ген sutHw), s зависимости от конкретного у-аллеяя, действует то позитивно, то негативно, то, вероятнее всего, гены el у) и su(Hw) действуют независимо.

Мутации генов eiyll, е(у)2 и е(у)3 генов способны также взаимодействовать с zeste-мутащиями и. таким образом, участвуют в регуляции экспрессии локуса white.

В данной работе при совмещении различных комбинаций мутаций white и zeste было получено только два дискретных уровня снижения экспрессии локуса white, т.е. два фенотипа, имеющих неыозаичну» пигментацию глаз: коричневые 17-1—9+ ) и желтке !3+). Остальные уровни экспрессии (10+.6+-4+) всегда были следствием моэаичности в отдельных областях глада, т.е. комбинацией клеток с двумя дискретными стабильными уровнями экспрессии.

Вариант 3+, скорее всего, соответствует полной инактивации знхансера, а вариант б+ - другому стабильному, но менее эффективному (по сравнению с нормой» контакту знхансера и

промотора.

Интересно заметить, что мутации z*fy самок) и z°P®ly самцов и самок), представляющие собой точечные замены, вызывают значительное сниляние пигментации глаз мух [до 3+. что соответствует полной инактивации знхансера), в то- время-как-мутация приводящая к полной инактивации белка zeste,

вызывает только слабое снижение пигментации 1у самцов до Ю*; у самок- до 3-Н. Можно предположить, что удаление белка zeste компенсируется другими клеточными белками, выполнявшими сходные функции. В то же время изменение свойств z-белка при мутациях z0^6 и z1 , приводит к изменению специфичности его взаимодействий, в результате чего.он обеспечивает инке типы контактов, например, с гомологичной хромосомой и такое взаимодействие в результате инактивирует транскрипцию гена white.

При введении нутация в генах et у 11,2,3 в комбинации с 2v7''"n-Myтациел, у cauuoa происходит снижение экспрессии гена white в одних зонах до первого и в других - до второго дискретного уровня. У самок снижение идет до максимального уровня (3+). При этом выявляется дозовая зависимость, и мутация ' èf у )3ul даже в гетерозкготе усиливает, w-фенотип. Можно предположить, что белки -продукты генов энхансеров yellow 1-3 имеют взаимозаменяемые функции; обеспечивающие контакт знхансера с промотором гена white. Подтверждением этого является то, что они взаимодействуют с у-мутациямн сходным образом.

По фенотипическому проявлению комбинация мутаций ef у Я-3Í11 с zv77ïi сходна с мутациями V3**, т.е. у самцов пигментация меняется от желтой до коричневой, у самок- ems более светлая, w5^ - мутации регуляторной части гена, локализованы в его Э^-области и связаны в одном случае- с инсерцией мобильного элемента roo, а в трех других- с делениями различной длины, захватывавшими дистально \чргспололканай знхансер. При делеции сайта связывания zeste, расположенного в районе знхансера, в гетероэиготе v^V/vi* происходит супрессия z*-мутации. Этот факт говорит в пользу того, что белковые продукты е(у)-генов взаимодействуют с другими местами регуляторной части, чем zeste.

Ранее было найдено по крайней мере 3 генов, модифицирующих эффект г1-мутации на транскрипцию гена white (Pírrotta,i990; Phillips and Shearn,1990; Wu 'et al.,1990). Три из этих генов

1S