Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ морфологии и наследования опушения листа у яровых сортов и гибридов мягкой пшеницы Triticum aestivum L.

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ морфологии и наследования опушения листа у яровых сортов и гибридов мягкой пшеницы Triticum aestivum L."

На правах рукописи

ДОРОШКОВ АЛЕКСЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

АНАЛИЗ МОРФОЛОГИИ И НАСЛЕДОВАНИЯ ОПУШЕНИЯ ЛИСТА У ЯРОВЫХ СОРТОВ И ГИБРИДОВ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ ТгШсит Ь.

03.02.07 Генетика 03.01.09 Математическая биология, биоинформатика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 НОЯ 2012

Новосибирск 2012

005054985

005054985

Работа выполнена в лаборатории эволюционной биоинформатики и теоретичеа генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Инсп цитологии и генетики сибирского отделения российской академии наук и секто генетики качества зерна Федерального государственного бюджетного учрежден науки Институт цитологии и генетики сибирского отделения российской акадел наук (ИЦиГ СО РАН), г. Новосибирск, Россия.

Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент Афонников Дмитрий Аркадьевич

кандидат биологических наук, доцент Пшеничникова Татьяна Алексеевна

Официальные оппоненты: Хлесткина Елена Константиновна,

доктор биологических наук, доцент,

старший научный сотрудник лаборатории молекулярш

генетики и цитогенетики растений

Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт цитологии и генетики СО РАН, г.

Новосибирск

Макеев Всеволод Юрьевич,

доктор физико-математических наук, доцент, зав. отделом вычислительной системной биологии Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РА г.Москва

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск

Защита диссертации состоится «2^» К&Л Ър^ 2012 г. на утреннем заседай!

диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание учеи

степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО

РАН в конференц-зале Института по адресу:

630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, 10,

т./ф. (383)363-49-06, факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.

Автореферат разослан « [Ь » ОU.JS- ¿Гр £ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Мягкая пшеница (Triticum aestivum L., i = 6х = 42, аллогексаплоидный геном BBAADD) одновременно является гратегической сельскохозяйственной культурой и ценным объектом :нетических исследований. Знание генетических особенностей этого вида иеет как хозяйственное, так и фундаментальное значение (Bryan et ai, ?97). Важным направлением исследований является изучение генетических еханизмов приспособления этой культуры к условиям среды. Один из таких еханизмов связан с контролем формирования опушения листа растений, звестно, что опушение листа пшеницы вносит значительный вклад в .щиту от вредителей (Scillinger et ai, 1968, Roberts et al., 1979) и адаптацию абиотическим факторам среды (Крупнов и др. 1990; Лихенко и др., 2007; ameed et ai, 2002). Детальное изучение генетического полиморфизма и ¿явление генов, ответственных за формирование опушения листа, является ггуальной задачей, как в свете практического применения, так и со стороны ундаментальных основ биологии развития растений.

В настоящее время в Каталоге генных символов (Mcintosh et al., 2008, clntosh et al., 2011) отмечено только два локуса, связанных с этим шзнаком. Это ген НИ, локализованный в хромосоме 4В (Майстренко, 1976, obrovolskaya et ai, 2007) и ген Н12, локализованный в хромосоме 7В (Taketa ai, 2002; Dobrovolskaya et al., 2007). Однако, исходя из фснотипического □нообразия мягкой пшеницы по этому признаку (Вавилов и др., 1925, тилов, 1990), а также данных о генетическом контроле опушения листа |угих видов растений (Marks, 1997; Hulskamp et al., 1999; Larkin et al., 2003) )жно предположить наличие большего количества генов, )дифицирующих этот признак.

В настоящее время одной из проблем при детальном изучении нетического механизма контроля опушения листа у пшеницы является сутствие технологий фенотипирования, позволяющих в массовом порядке лучать количественное описание характеристик опушения. Существующие дходы основаны на экспертной оценке или подсчёте трихом под [кроскопом (Майстренко, 1976; Lacape et al., 2005; Dobrovolskaya et al., 07). Развитие высокопроизводительных технологий поможет на основе' ализа большего количества данных выявлять детали проявления признака. )полнительным источником информации при выявлении генов, ветственных за формирование опушения листа, могут служить обширные иные о генетическом контроле опушения у двудольных растений, наиболее следованным из которых является A. thaliana. Эти данные могут быть пользованы в совокупности с современными методами биоинформатики,

сравнительной геномики для поиска у пшеницы гомологов гено] формирующих генную сеть контроля опушения у А. ГИаИапа. Результат такой работы позволят предсказать локализацию компонентов генной сет контроля опушения листа растений на гомеологичных хромосомах пшениц] и их возможное фенотипическое проявление, что облегчит дальнейшу! работу по картированию консервативных генов опушения листа пшеницы изучения их молекулярных функций.

В настоящей работе для, изучения генетического контрол формирования трихом на поверхности листа мягкой пшеницы, был применена комбинация методов классической генетикр высокопроизводительного фенотипирования и подходов биоинформатики системной биологии.

Цель и задачи исследования. Выявить особенности морфологи* наследования, а также проявления в онтогенезе опушения листа пшениц! ТгШсит аезНуит Ь., используя высокопроизводительный мето, фенотипирования, и предсказать локализацию компонентов генной сет! контроля опушения листа растений на гомеологичных хромосомах пшснищ с помощью методов сравнительной геномики.

Для достижения заявленной цели были поставлены следующие задачи:

1) Разработать протокол получения микроизображения листа дл. фенотипирования растения по признаку опушения, позволяющий получать микроизображения, пригодные для компьютерной обработки

2) Проанализировать изменчивость количественных характеристик опушения листа мягкой пшеницы в зависимости от яруса листа.

3) Исследовать возможность использования предложенной технологии для детального описания структуры гибридных популяций по количественным характеристикам опушения листа на примере популяции гибридов второго поколения между сортом Hong-mang-mai и линией 102/00'.

4) На основе анализа количественных характеристик опушения листа выделить морфотипы опушения листа для мягкой пшеницы.

5) Проанализировать влияние генетического фона на проявление опушения листа, контролируемого геном Н12""4'.

6) Провести реконструкцию генной сети контроля опушения листа у АгаЫ^р.Ч!.? ЛаНапа на основе литературных данных и методов компьютерного распознавания текстов.

7) Методами сравнительной геномики предсказать локализацию компонентов генной сети контроля опушения листа А. /ЬаНапа на гомеологичных хромосомах пшеницы.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые применён метод высокопроизводительного фенотипирования, основанный на использовании изображения сгиба листа для анализа количественных характеристик опушения. Впервые на основе количественных характеристик опушения листа были выделены фенотипические классы в популяции F2 Hong-mang-mai х линия 102/00', на основе чего была описана модель наследования этого признака. Впервые на основе количественных данных были выделены морфотипы опушения листа среди сортов мягкой пшеницы. Впервые показано, что фенотипическое проявление гена ШТ"Р, интрогрессированного в геном мягкой пшеницы от Aegilops speltoides, зависит от генетического фона сорта-реципиента. Впервые была проанализирована консервативность генной сети формирования трихом и предсказано местоположение компонент генной сети формирования трихом на хромосомах ячменя и пшеницы.

Практическая ценность работы. Использование предложенного в данной работе подхода описания опушения листа, основанного на использовании микроизображений сгиба листа, позволит осуществлять более детальное и быстрое извлечение данных о количественных характеристиках опушения листа в генетической и селекционной работе. Селекция мягкой пшеницы с учётом количественных характеристик опушения листа позволит задействовать ресурсы устойчивости к биотическим и абиотическим факторам внешней среды, связанные с этим признаком.

Основные положения, выносимые па защиту. У мягкой пшеницы существуют генетически детерминированные морфотипы, различающиеся по количественным характеристикам опушения листа.

Фенотипическое проявление гена Н12а"р, интрогрессированного от Ae.speltoides, обусловлено аддитивным взаимодействием с генетическим фоном сортов-реципиентов.

Распределение трихом, их размеры и конечная форма контролируются генной сетью, которая имеет консервативные фрагменты, широко представленные среди цветковых растений. Гены, входящие в эти фрагменты, у пшеницы располагаются преимущественно на хромосомах 4 и 6 гомеологических групп.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21 работа, из них 6 статей в рецензируемых научных журналах, входящих в список ВАК.

Апробация работы. Работа представлена в виде устных и стендовых докладов на международных конференциях, среди которых: 5-ый съезд ВОГиС (2009, Москва), «The 7th International Conference on Bioinformatics of

Genome regulation and Structure» (Новосибирск, 2010), «8-th Europea Conference on Mathematical and Theoretical Biology, and Annual Meeting с The Society for Mathematical Biology», (Краков, 2011), The 2nd Internation! Conference «Plant Genetics, Genomics and Biotechnology» (Иркутск, 2012 «Генетика, геномика и биотехнология растений» (2010, Новосибирск «Генетические ресурсы и геномика пшеницы» (2011, Новосибирск).

Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзор литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключили выводов, библиографического списка, списка публикаций по тем диссертации. Работа изложена на 158 листах машинописного текст! содержит 59 рисунков и 14 таблиц. Список литературы включает 18 источника (21 отечественных и 152 зарубежных).

Личный вклад автора. Основная часть работы выполнена авторо] самостоятельно, в частности, приготовление препаратов, получени изображений и извлечение количественных характеристик опушения лист! генетический анализ, реконструкция генной сети ; и предсказани локализации её компонентов на хромосомах риса, ячменя и пшеницы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы сорта Новосибирская 67, Саратовская 2< Hong-mang-mai, Голубка, Диамант 2, Чайниз Спринг, Янецкис Пробат Родина, интрогрессивная линия мягкой пшеницы Родина-Ае. speltoide 102/00' (Lapochkina et al., 2001), изогенные линии сортов Саратовская 2 i:C29 Hirsp (i:C29 HlTesp) и Диамант 2 (¡:Дм2 Н1?ец\ несущие ген Hl?esp различающиеся по происхождению и степени выраженности опушени листа. Растения выращивались в условиях гидропонной теплицы ЦК! «Искусственного выращивания растений» ИЦиГ СО РАН во время весенни и осенних вегетаций 2008-2011 годов. Для описания морфологии опушени листа каждого сорта использовалось 25-30 растений.

В работе использовались следующие статистические методы: критери у2 Пирсона (Pearson, 1900), коэффициент корреляции Пирсона (РокицкиГ 1974), t-критерий Стьюдента (Student (Gösset), 1908), кластерный анали: метод главных компонент Пирсона, реализованный в пакете PAST (Hamm< et al., 2001), а также метод главных компонент (Principal component analysi РСА) (Pearson, 1901).

Для поиска последовательностей ДНК и белков в генома растительных организмов были использованы базы данных KEGG (Kanehis et al., 2004), PLAZA 2.5 (Proost et al., 2009) и NCBI:Gene (Pruitt et al, 2000) алгоритм BLAST (Altschul et al., 1990). Для выявления функционально! сходства последовательностей использовались базы данных KEGG SSDB

PLAZA 2.5. Для сравнительного картирования использовался геномный браузер О. sativa NCBI, сравнительная карта хромосом О. sativa и Н. vulgare (Stein et al., 2007), данные о синтении хромосом О. sativa и T. aestivum (Salse et al., 2008, Quraishi et.al., 2009).

Реконструкция модели генной сети контроля опушения листа производилась на основе поиска ассоциативных связей при помощи программы компьютерного анализа текстов Pathway studio (Nikitin et al, 2003).

Разработка технологии высокопроизводительного

фенотипирования для анализа опушения листа пшеницы. Технология высокопроизводительного фенотипирования опушения листа основана на получении контрастного микроизображения трихом на его сгибе. Она включает в себя 3 этапа (рис. 1 ): ( 1 ) отбор листьев с растения, (2) выбор точек и приготовление препаратов для микроскопии, (3) получение изображений, их компьютерная обработка и анализ.

Рис. 2.1 — Последовательность операций для получения микроизображения опушения листа. 1 - отбор листьев с растения, 2- приготовление препаратов, 3 - получение микроизображений.

Для компьютерного анализа изображений использовались программы ЬШМес! (Дорошков и др. 2009) и ЫЮйеаг (вепаеу еГ а/., 2012), выдающие данные о распределении трихом по длинам в виде вектора, каждым элементом которого является число трихом определённого интервала длины, а также число трихом на изображении N и среднюю длину Ь.

Число трихом на поперечном сгибе листа как характеристика плотности опушения. Для оценки соответствия количественных характеристик опушения на сгибе и поверхности листа проведён анализ 200

пар изображений сгиба листа и его поверхности на расстоянии 1-2 см от сгиба (рис. 2А) среди растений с различным типом опушения. Зависимость между количеством трихом п5 на единичной площади поверхности от числа трихом на 1 мм сгиба пг представлена на рисунке 2Б. Эта зависимость на интервале пг>3 соответствует линейной регрессии (корреляция значима, р<0,001).

Рис. 2. А - Модель получения изображений сгиба листа и единичного (5=1) элемента площади. Поверхность сгиба площадью S{ с высотой сгиба h. Стрелки указывают на схематические изображения сгиба и поверхности. Отмечены значения числа трихом на единице длины сгиба (nf) и на единице площади (ns).

Б - Диаграмма рассеяния оценок количества трихом на единицу площади при подсчете на поверхности листа (ns) и количества трихом на единицу длины сгиба листа nf

Наклон линии регрессии отражает соотношение площадей торца сгиба и единичной площади поверхности листа: ns/nf =1/S{ и позволяет оценить толщину сгиба h порядка /?=1/3.120»0.320 мм, что близко к удвоенной толщине листа пшеницы. При nf< 3 часто возникает ситуация, когда близким значениям nf соответствуют сильно различающиеся значения ns, что характеризует данную область как зону неопределённости (рис 2В). Такая неточность в оценках может быть устранена за счёт усреднения данных по нескольким сгибам, полученным для одного листа. Таким образом, сгиб листа может использоваться для оценки структуры опушения поверхности листа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Зависимость характеристик опушения листа пшеницы от его яруса.

Для сорта Саратовская 29 и линии 102/00' были показаны различия по плотности и длине трихом листьев разных ярусов. Различия между листьями

1-3 ярусов превосходят значения стандартной ошибки среднего (Р= 0,95), однако они значительно меньше, чем различия между средними значениями этих характеристик для указанных генотипов. Для двух исследованных генотипов не было выявлено достоверных различий в плотности и длине опушения между листьями 4-6 ярусов, поэтому они могут быть использованы для описания опушения листа взрослого растения. Результаты показывают, что в проявлении признака опушения листа этих растений преобладающий вклад вносит генетическая компонента, а факторы онтогенеза вносят небольшой модифицирующий вклад.

Анализ фенотипического проявления и наследования опушения в гибридной популяции. В популяции ¥2 ОТ скрещивания между сортом Пог^-тап§-пш и линией 102/00'.была проанализирована структура опушения листа. Показано, что некоторые растения в гибридной популяции Р2 между сортом Hong-mang-mai и линией 102/00' образуют значительно более плотное опушение, чем родительские формы и более длинные трихомы (рис. 3). Это может свидетельствовать об аддитивном действии генов контроля опушения листа сорта Hong-mang-ma¡ и линии 102/00'. N и С не выявляют прямой или обратной зависимости (г=0,01 ;Р=0,93).

Рис. 3 - Распределение средней длины I и плотности трихом N в популяции гибридов Р2 между сортом Hong-mang-mai и линией 102/00'. Пунктирной линией выделены области значений Ь и N, характерные для родительских форм. Звёздочками отмечены средние значения этих характеристик для родительских форм и потомков.

Было выделено 4 фенотипических класса, различающихся по числу трихом и их средней длине. Независимые распределения растений в этих классах как по числу трихом, так и по их длине соответствует расщеплению 1:3, что свидетельствует о моногенном характере их наследования. Более детальное описание расщепления в популяции Р2 по опушению листа было получено на основе иерархического кластерного анализа векторов распределения трихом по длине. Были выявлены две большие группы потомков, которые различались количеством трихом в интервале длин от 20 до 170 мкм. Их соотношение составляло 9:7. По плотности трихом 1 группа

была однородна, а группа 2 содерджала растения с малым и большим числом трихом в соотношении 3:4. Разделение на группы по средней длине трихом происходит независимо. Полученные результаты свидетельствуют о том, что плотность опушения контролируется двумя комплементарно взаимодействующими генами.

Фенотипическое разнообразие опушения листа у пшеницы.

Разнообразие опушения листа пшеницы было оценено на выборке растений 8 сортов, 3 линий и дикого злака Ае. яре1Ыс1е$. В качестве характеристик рассматривались среднее число трихом и средняя длина трихом. Результаты представлены на рисунке 4 и в таблице 1. Среди генотипов мягкой пшеницы были выделены две группы, чётко различающиеся по длине и плотности трихом (рис. 4, табл. 1): группе 1 "слабо опушённые" Родина, Диамант 2, Янецкис Пробат и Чайниз Спринг, которые локализуются на графике в области 0-16; I = 0-55 мкм и группе 2 "сильно опушённые" - сорта Новосибирская 67, Голубка, Саратовская 29 и Ноп§-тап§-ша1, которые локализуются на графике в области N = 16-44 Ь = 55 - 200 мкм. Дикий диплоидный злак Ае. хрекоикх по числу трихом соответствует группе 1, а по средней длине трихом - группе 2. Количественные характеристики опушения исследованных генотипов и их групп приведены в таблице 1.

Нопд-тапд-гпа1 Саратовская 29

Голубка

Новосибирская 67

\8 12\ 18 2Г\ 30

I \ \ \>

Родина ЧайнизСпринг Янецкис Пробат Диамант 2

Рис. 4 - Распределение значений числа трихом N и средней длины трихом Ь для исследованных растений восьми сортов и Ле^Иорх .\peltoides. Области, занимаемые соответствующими сортами, отмечены эллипсами.

Данные таблицы 1 подтверждают наличие двух групп, чётко различающихся по длине и числу трихом. Вариации параметров числа трихом и средней длины в целом выше в группе 2, чем в группе 1, однако и в

группе 1 существуют генотипы, у которых вариация по числу трихом (Диамант 2) и длине трихом (Чайниз Спринг) сравнимы с растениями из группы 2. Из таблицы также видно, что в выборке существуют генотипы, для которых наблюдается высокая значимая корреляция между числом трихом и их средней длиной (Р<0,001). По-видимому, это отражает различия в генетических механизмах контроля опушения листа.

Количественные характеристики опушения листа, полученные в данной работе можно сопоставить с классификацией признака, предложенной Н.И.Вавиловым (1923). Группа 1 соответствует IV типу опушения («редкое»). Группа 2 соответствует двум типам опушения листа: сорт Hong-mang-mai соответствует типу I («мохнатое»), а сорта Голубка, Саратовская 29 и Новосибирская 67 соответствуют типу II («бархатистое»). Тип опушения III - «реснитчатое» характеризуется наличием небольшого количества длинных трихом. Этому типу соответствует опушение листа исследованного Ае^Иорх хре1М(1ех.

Табл. 1 - Сравнение количественных характеристик опушения исследованных сортов Родина, Диамант 2, Чайниз Спринг, Янецкис Пробат, Голубка, Саратовская 29, Hong-mang-mai, Новосибирская 67, а также Ае. speltoides. Втаблице приведены оценки среднего числа трихом ~N, средней длины L, их дисперсии Var( N) и Var{ L), а также среднее значение

Фенотип ipyuna Генотип число растений N L (мкм) Lmax (мкм) VAR (N) VAR ( L) VAR R ( 1!N) Р ( L/N)

1 Диамант 2 39 7,5 32,2 66,2 14,9 51,5 499,9 0,50 * <0 001

Чайниз Спринг 29 1.0 26, 6 43,5 0,6 122,3 1 509,8 0,58 « <0 001

Янецкис Пробат 30 3,0 29,3 74,2 1,8 70,1 10940,9 0,23 <0 5

['одина 30 0,6 17,4 30,8 0,3 262,3 448,1 0,63 • <0 0001

2 Hon^-mang-mai 20 28,9 148,6 863,1 24,2 447,6 21998,9 0,01 <0,97

Саратовская 29 20 35,8 138,8 488,3 13,0 310,0 7026,6 0,22 <0,5

Голубка 28 29,1 122,0 489,0 10,9 278,4 9109,3 0,49 • <0 01

11овосибирская 67 33 23,6 95,4 283,2 14,3 79,0 3862,1 0,41 <0 02

3 Aegtlops speltoides 22 6,2 97,6 332,2 9,1 1670,1 31022,7 0,64 <0,005

Таким образом, использованный в работе метод позволил выявить морфотипы опушения листа у мягкой пшеницы и соотнести их с классификацией опушения, предложенной Н.И.Вавиловым (1923). При этом, эта технология предоставляет большие возможности для детального описания характеристик опушения листа пшеницы.

4.0

3.6 3.0

S 25 I 2.0

g 1.5

b

5 1.0 0.5 0.0 -0.5

— Диамант 2

Рис. 5 - Усреднённые профили распределения трихом по длине для сорта Диамант 2 и изогенной линии ¡:Дм2 Н12. Вертикальными

линиями обозначен разброс значений в пределах 95% доверительного интервала для каждого значения длины трихом.

15,75 120.75 225.75

длина трмяэм

Анализ фенотипического

проявления опушения

листа,

находящегося под контролем гена Hl2aesp на различном генетическом фоне. Сорт Родина (реципиент) формирует единичные трихомы средней длиной около 15 мкм. Ае. speltoides (донор) формирует слабое опушение, а линия 102/00' формирует опушение листа, схожее по распределению длин трихом с Ае. speltoides. Однако эта линия формирует дополнительно к трихомам, характерным для Ае. speltoides трихомы большей длины, что, вероятно, связано с влиянием генетического фона сорта Родина. Одновременно, это свидетельствует о возможной независимости генетического контроля количества и длины трихом, либо плотностей трихом разной длины.

Введение гена Hl2aesp в генотип слабо опушенного сорта Диамант 2 (линия i: Дм2 HIT"''), формирующего малое количество и длину трихом, вызывает формирование более плотного и более длинного опушения с профилем распределения трихом по длинам сильно опушённого типа (см. рис. 5С). Введение гена Hl2aesp в сорт Саратовская 29 также приводит к увеличению плотности опушения и формированию более длинных трихом. Следует отметить, что значения длины и плотности трихом линии i:C29 HIT"4' превосходят соответствующие значения для всех исследованных нами сортов.

Реконструкция генной сети развития опушения листа A. thaliana.

На основе анализа литературных данных был создан список генов, участвующих в процессах формирования опушения листа у A. thaliana. Затем, с использованием этих данных и программы автоматического анализа текстов Pathway studio была реконструирована модель сети регуляторных и белок-белковых взаимодействий между ними (Рис 6). На рисунке выделены 2 основные компоненты генной сети, контролирующие формирование паттерна (TTG1, TRY, GL3, EGL3, TRY, СРС и т.п.), ветвления и приобретения трихомами окончательной формы (ZWI, STI, FASS и т.п.) и дифференцировки (ТТ8, SPY), оставшиеся не отмеченными на рисунке (рис. 6).

_ . Белок

^ Простая молекула Функциональный

©класс Комплекс

—а—, регуляция экспрессии и ,. регуляция (неизв механизм) .... модификация белка , белок-белковое связывание , а связывание с промогором в д. синтез

а прямая рефляция киназа

Транскрипционный фактор

& &

Контроль формирования паттерна распределения трихом

Рис. 6 - Модель генной сети формирования трихом у A.thaliana, полученная при помощи программы Pathway studio. Обозначение элементов приведено в правой части рисунка.

Анализ геномов 25 растительных организмов, содержащихся в базе данных PLAZA 2.5, показал, что белки участвующие в регулировании паттерна распределения трихом (TTG1, GL2, GL3, EGL3, ATMYB23), дифференцировки клеток трихом (SPY, КАК, RHL2, ТТ8), а также ветвления трихом (STI, FASS/TONNAEU2, MYB5) A. thaliana широко представлены в геномах цветковых растений, что может свидетельствовать об их функциональной важности, и консервативности соответствующих им путей регуляции развития трихом цветковых растений.

Предсказание генов, регулирующих развитие трихом у пшеницы методами сравнительной геномики. На основе анализа данных из баз KEGG, PLAZA, NCBI в геноме риса были определены последовательности и локусы, ортологичные генам контроля опушения листа A.thaiana. Затем при помощи сравнительных хромосомных карт (Stein et al., 2007; Dubcovsky et al., 1996; Devos, et al., 1997; Cho et al., 2005) было выявлено расположение соответствующих генов на хромосомах О. sativa, Н. vulgare и Т. aestivum. Всего было предсказано 15 локусов у трёх видов (табл. 2). Наибольшее количество локусов отмечено в четвёртой и шестой гомеологических группах, а во второй группе не отмечено ни одного. Три из четырёх известных маркеров, связанных с опушением листа у Н. vulgare

соответствуют предсказанным нами локусам генов опушения листа и предполагаемому фенотипическому эффекту.

Функциональная аннотация генов A. thaiana позволяет оценить фенотипический эффект их аллельных вариантов у Н. vulgare и Т. aestivum и спопоставить эту информацию и имеющимися экспериментальными данными. В частности, О.И. Майстренко (1976) указывала на наличие генов контроля опушения ряда сортов мягкой пшеницы в хромосомах 1, 3, 4, 5 и 6 гомеологических групп, что хорошо соотносится с полученными нами данными. Кроме того, известная информация о фенотипическом проявлении генов НИ и Н12 (Arbuzova et al., 1996, Taketa et al., 2002, Pshenichnikova et al., 2007; Dobrovolskaya et al., 2007) и их локализация на хромосомах пшеницы позволяет предположить их гомологию с генами Gil, G12, GL1A и RHL1. Таким образом, проведённый анализ позволяет оптимизировать дальнейшую работу по картированию генов опушения листа на хромосомах мягкой пшеницы.

Табл. 2 - Предсказанная хромосомная локализация генов контроля опушения листа у пшеницы Т. aestivum, а также предположительные

фенотипы мутантов.

Гомеологическая группа хромосом Т. aestivum Плечо Гомолог у A. thaliana Предположительный фенотип мутантов

1 S FASS/TO NNAEU2 изменение размеров и формы трихом

1 L GL 2 сниженная плотность опушения /нет трихом

3 S STI изменение размеров и формы трихом

3 L GL1 сниженная плотность опушения

4 S GL1 сниженная плотность опушения

4 S GL 2 сниженная плотность опушения /нет трихом

4 L TRY / CPC увеличенная плотность опушения, расположена трихом группами, увеличение ядра и содержания ДНК клеток трихом

4 L GL1A сниженная плотность опушения /нет трихом

5 L STI изменение размеров и формы трихом

5 L ETC1 увеличенная плотность опушения

6 S RHL1 Уменьшение размеров трихом, уменьшение содержания ДНК в ядрах клеток трихом

6 L TTG1 сниженная плотность опушения

6 L КАК уменьшение размеров трихом, увеличение плоидности

6 L GL3 увеличение количества трихом, уменьшение содержания ДНК в ядрах клеток трихом

7 S RHL1 сниженная плотность опушения, влияние на длину трихом

Разработка Экспериментального образца информационного портала «Биотехнология растений». В настоящей работе была проведена работа по созданию Экспериментального образца информационного портала «Биотехнология растений» (ЭОИП БР). Этот портал предоставляет информационную поддержку биотехнологическим экспериментам в области трансгенеза растений и селекционно-генетических экспериментов на пшенице (Кочетов и соавт., 2012). Информационный портал состоит из двух блоков: (1) системы поддержки эксперимента по созданию генетических конструкций у растений, включая Базу данных промоторов (БДП), Базу данных трансляционных энхансеров (БДТЭ), Базу данных внешних информационных ресурсов (БВИР) и интерфейсы к ним; (2) Базу данных Б\\ФОЕ для информационной поддержки эксперимента в области селекции и генетики растений. Каждый из этих блоков ориентирован на решение специальных задач и позволяет увеличить эффективность разработок в соответствующих областях.

ВЫВОДЫ

Разработан протокол подготовки препаратов и микроизображений, входящий в состав метода высокопроизводительного фенотипирования растений по признаку опушения листа, позволяющий получать детальное цифровое описание структуры опушения. Предложенный метод позволяет устанавливать соотношение коротких и длинных трихом на поверхности листа, а так же использовать методы многомерного статистического анализа при сравнении количественных характеристик опушения. Установлено, что между числом трихом, идентифицированных на изображении сгиба листа, и числом трихом на единицу площади на поверхности соседней области листа существует линейная зависимость. Таким образом, трихомы, различаемые на сгибе листа, могут служить адекватной оценкой структуры опушения поверхности листа. На примере анализа растений сорта Саратовская 29 и интрогрессивной линии 102/001 мягкой пшеницы с различным и формами опушения листа были выявлены различия в количественных характеристиках опушения листа для листьев разных ярусов и показано, что наиболее интенсивно этот признак проявляется на листьях второго яруса.

Показана возможность использования предложенной технологии для описания детальной фенотипической структуры гибридных популяций по признаку опушения листа.

При исследовании популяции Р2 Hong-mang-ma¡ х линия 102/00' впервые была обнаружена неравномерность распределения параметров плотности и

длины трихом. На основе этого была описана модель наследования количественных характеристик этого признака.

6) При исследовании выборки сортов с разным проявлением признака опушения листа была выявлена и описана вариабельность количественных характеристик опушения листа и выделены два морфотипа по степени выраженности этого признака.

7) Впервые показано, что фенотипическое проявление гена Hl2aesp, интрогрессированного в геном мягкой пшеницы от Aegilops speltoides, зависит от генетического фона сорта-реципиента: чем более выражено опушение у сорта-реципиента, тем больший эффект на этот признак оказывает ген Н12а"р, что свидетельствует об аддитивном взаимодействии гена Hl2aesp с соответствующими генами сортов - реципиентов.

8) На основе анализа литературных данных и использования программ автоматического анализа текстов реконструирована модель генной сети контроля опушения листа A. thaliana, выделены основные структурные элементы, - компоненты, ответственные за распределение трихом, рост и дифференцировку, а также за ветвление и форму трихом.

9) На основе поиска гомологов генов, контролирующих формирование опушения листа в геноме риса и использования сравнительных хромосомных карт риса, пшеницы и ячменя было предсказано местоположение компонент генной сети формирования трихом на хромосомах ячменя и пшеницы. Часть предсказанных локусов совпала с локусами известных генов, контролирующих опушение у злаков.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Genaev М.А., Doroshkov A.V., Pshenichnikova Т.A., Afonnikov D.A. Kolchanov, N.A. Extracting quantitative characteristics of wheat leaf hairiness using image processing technique. / Planta. -2012. - DOI: 10.1007/s00425-012-1751-6

2. Генаев M.A., Дорошков A.B., Пшеничникова Т.А., Морозова Е.В., Симонов A.B., Афонников Д.А. Информационная поддержка селекционно-генетического эксперимента у пшеницы в системе WheatPGE. // Математическая биология и биоинформатика. 2012. Т. 7. № 2. С. 410-424.

3. Кочетов A.B., Смирнова О.Г., Ибрагимова С.М., Рассказов Д.А., Афонников Д.А., Генаев М.А., Дорошков A.B., Пшеничникова Т.А., Симонов A.B., Морозова Е.В. Информационный портал "Биотехнология растений" -Интернет ресурс для поддержки экспериментов в области генной инженерии растений, генетики и селекции пшеницы // Вавиловский журнал генетики и селекции 2012 (принята в печать).

4. Генаев, М.А., Дорошков А.В., Морозова Е.В. и др. Компьютерная система WheatPGE для анализа взаимосвязи фенотип-генотип-окружающая среда у пшеницы // Вавилов, журн. генет. и селекции. 2011. Т. 15. С. 784-793. . Дорошков А.В., Пшеничникова Т. А., Афонников Д. А. Анализ особенностей морфологии и наследования опушения листа пшеницы Triticum aestivum L. с помощью компьютерных методов фенотипирования // Генетика. - 2012. - Т. 47, № 6. - С. 739-743. . Дорошков А.В., Арсенина С.И., Пшеничникова Т.А., Афонников Д.А. Применение компьютерного анализа микроизображений листа для оценки характеристик опушения пшеницы Triticum aestivum L.// Инф. вестник ВОГиС — 2009. - Т. 11. № 1 - С. 218-226. . Генаев М.Л., Дорошков А.В., Афонников Д.А. (2012) Программа автоматического определения количественных характеристик опушения листа (ОЛДетект2). // Свидетельство о регистрации программы для ЭВМ N 2012612357 от 5.03.2012, дата приоритета 17.11.2011. Генаев М.А., Дорошков А.В., Афонников Д.А. (2010) База данных для анализа взаимосвязей генотип-фенотип-окружающая среда у пшеницы (ВитПГЕ). Свидетельство о регистрации базы данных N 2010620602 от 23.10.2010, дата приоритета 30.06.2010

Doroshkov А.V., Pshenichnikova Т.А., Afonnikov D.A. Prediction of the structure and localization of genes controlling leaf pubescence in wheat Triticum aestivum L. and barley Hordeum vulgare L. based on Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. genes data // Proc. of the 2nd International Conference "Plant Genetics, Genomics and Biotechnology", Иркутск, 2012. ».Doroshkov A.V., Genaev M.A., Pshenichnikova T.A., Afonnikov D.A. Quantitative characteristics of leaf pubescence in bread wheat cultivars // Proc. of the 2nd International Conference "Plant Genetics, Genomics and Biotechnology", Иркутск, 2012.

.Genaev M.A., Doroshkov A.V., Pshenichnikova T.A., Afonnikov D.A. Extraction of quantitative characteristics describing wheat leaf pubescence with a novel image processing technique // Proc. of the 2nd International Conference "Plant Genetics, Genomics and Biotechnology", Иркутск, 2012.

.Doroshkov A.V., Genaev M.A., Pshenichnikova T.A., Afonnikov D.A.. Analysis of leaf hairiness morphology wheat: computational approaches using image processing technique. // Proc. of the International Conference "Wheat Genetics Resources and Genomics" Новосибирск, 2011.

.Afonnikov D.A., Doroshkov A.V., Genaev M.A., Pshenichnikova T.A. High througput phenotyping approach to analysis of the leaf hairiness in wheat // Proc.

of the International Conference "Wheat Genetics Resources and Genomics" Новосибирск, 2011.

14.Dproshkov A., Genaev M., Pshenichnikova Т., Afonnikov D. Analysis of leaf hairiness in wheat Triticum aestivum L. using image processing technique // Proc. o^,European Conference on Mathematical and Theoretical Biology, Krakow, Poland, 2011

15.Dproshkov A.V.,. Genaev M.A, Pshenichnikova T.A., Afonnikov D.A. Analysis of leafhairiness in wheat Triticum aestivum L. using the high throughput phenotyping approach // Proc. of the International Conference "Plant Genetics, Genomics, and Biotechnology, Новосибирск, 2010.

16.Doroshkov A.V., Genaev M.A., Pshenichnikova T.A., Afonnikov D.A. Using a computer-base image processing technique in genetic analysis of leaf hairiness in wheat Trticum aestivum L. // Proc. of the 7th International Conference on Bioinformatics of Genome regulation and Structure, Новосибирск, 2010.

17.Дорошков A.B. Using the computer-based image processing technique in genetic analysis of leaf hairiness in wheat Triticum aestivum L // Proc. of the Young Scientists School "Bioinformatics and system biology", Новосибирск, 2010

18.Афонников Д.А. Дорошков Л.В., Генаев M.A. Анализ морфологии опушения листа у пшеницы: компьютерный подход с использованием анализа изображений // Тезисы. Российско-Французского семинар "Геномика, биоинформатика и моделирование в науках о жизни", Новосибирск, 2010.

19.Дорошков А.В., Генаев М.А., Пшеничникова Т.А., Афонников Д.А. Методы компьютерного анализа в исследовании опушения листа пшеницы Triticum aestivum L. Тезисы. VIII Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Молодеж и современные информационные технологии" Томск, 2010.

20.Дорошков А.В., Пшеничникова Т.А., Афонников Д.А. Using the computer-based image processing technique in genetic analysis of leaf hairiness in wheat Triticum aestivum L. // Proc. of. 1st Workshop on plant molecular biotechnology -XV Biotechnology summer school. Gdansk, Poland, 2009.

21.Afonnikov D.A., Arsenina S.I., Doroshkov A.V., T.A.Pshenichnikova Development of the computer approach for defining leafhairiness in wheat based on its microscope image processing. // Proc. of. the Russian-French Conference "Problems and Prospects in Plant Biotechnology" Новосибирск, 2008.

Благодарности. Автор выражает благодарность A.B. Симонову за помощь в работе с растительным материалом, С.А. Арсеньевой и М.А. Генаеву за реализацию алгоритмов LHDetect и LHDetect 2, В.М. Ефимову за советы по статистической обработке данных, Д.Н. Штокало за возможность использовать Pathway Studio, сотрудникам сектора генетики качества зерна к отдела системной биологии за всестороннее содействие. ЭОИП БГ разрабатывался при поддержке Министерства образования и науки РФ а рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 гг.» (07.514.11.4052).

Подписано к печати 10.10.2012 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16 Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 экз. Заказ № 74

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дорошков, Алексей Владимирович

Общая характеристика работы

Цели и задачи исследования

1. Обзор литературы

1.1. Мягкая пшеница Triticum aestivum L.: структура генома и основные подходы к его исследованию

1.2. Опушение листа высших растений

1.3. Генетический контроль опушения листа 17 1.3.1 Генетический контроль опушения листа у Arahidopsis thaliana 17 1.3.2. Опушение листа злаковых растений

2. Материалы и методы

2.1. Растительный материал

2.2. Условия выращивания

2.3. Анализ изображений

2.4. Статистические методы ! 31!

2.5. Методы биоинформатики и системной биологии

2.6. Разработка технологии высокопроизводительного фенотипирования для опушения листа пшеницы

2.6.1. Технология высокопроизводительного фенотипирования для опушения листа пшеницы

2.6.2. Число трихом на поперечном сгибе листа как характеристика плотности опушения

3. Результаты

3.1. Зависимость характеристик опушения листа пшеницы от его яруса

3.2. Анализ фенотипического проявления и наследования опушения в гибридной популяции F

3.3. Фенотипическое разнообразие опушения листа у пшеницы

3.4. Анализ фенотипического проявления опушения листа, находящегося под контролем гена W\2aesp на различном генетическом фоне 71 3.4.1 Структура опушения интрогрессивной линии 102/00'из коллекции

Арсенал» и донора этого признака - Ае. speltoides Tausch 71 3.4.2. Структура опушения листа изогенных линий сортов Саратовская и Диамант 2 с геном контроля опушения W\2aesp от линии 102/00'

3.5. Предсказание генов, регулирующих развитие трихом у пшеницы методами сравнительной геномики

3.5.1. Реконструкция генной сети развития опушения листа А. 1каИапа

3.5.2. Исследование представленности генов контроля опушения листа среди растительных организмов

3.5.3. Предсказание локализации генов контроля опушения листа пшеницы Т. ае$Иуит и ячменя Н.\ulgare

3.6. Исследование молекулярной эволюции белка, вЬ2 А. (ИаПапа 104 3.7 Разработка Экспериментального образца информационного портала

Биотехнология растений»

3.7.1 Экспериментальный образец информационного портала

Биотехнология растений»

3.7.2 Структура и содержание Экспериментального образца информационного портала «Биотехнология растений^)

3.7.3 Технико-экономические показатели ЭИОП БР, обеспечивающие положительный эффект от внедрения системы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ морфологии и наследования опушения листа у яровых сортов и гибридов мягкой пшеницы Triticum aestivum L."

Актуальность проблемы. Мягкая пшеница (Triticum aestivum L., 2п — 6х — 42, аллогексаплоидный геном BBAADD) одновременно является стратегической сельскохозяйственной культурой и интересным объектом генетических исследований. Знание генетических особенностей этого вида имеет как хозяйственное, так и фундаментальное значение (Bryan et al., 1997). Важным направлением исследований является изучение генетических механизмов приспособления этой культуры к условиям среды. Один из таких механизмов связан с контролем формирования опушения листа растений. Известно, что опушение листа пшеницы вносит значительный вклад в защиту от вредителей (Scillinger et al., 1968, Roberts et al., 1979) и адаптацию к абиотическим факторам среды (Крупное и др. 1990; Лихенко и др., 2007; Hameed et al., 2002). Детальное изучение генетического и выявление генов, ответственных за формирование опушения ли 1ктуальной задачей, как в свете практического применения, так и со стороны фундаментальных основ биологии развития растений.

В настоящее время в Каталоге генных символов (Mcintosh et al., 2008, Mcintosh et al., 2011) отмечено только два локуса, связанных с этим признаком. Это ген Н11, локализованный в хромосоме 4В (Майстренко, 1976, Dobrovolskaya et al, 2007) и ген Н12, локализованный в хромосоме 7В (Taketa et al., 2002; Dobrovolskaya et al., 2007). Однако, исходя из фенотипического разнообразия мягкой пшеницы по этому признаку (Вавилов и др., 1925, Вавилов, 1990), а также данных о генетическом контроле опушения листа других видов растений (Marks, 1997; Hulskamp et al., 1999; Larkin et al., 2003) можно предположить наличие большего количества генов, модифицирующих этот признак.

В настоящее время одной из проблем при детальном изучении генетического механизма контроля опушения листа у пшеницы является отсутствие технологий фенотипирования, позволяющих в массовом порядке получать количественное описание характеристик опушения. Существующие подходы основаны на экспертной оценке или подсчёте трихом под микроскопом (Майстренко, 1976; Lacape et al., 2005; Dobrovolskaya et al., 2007). Развитие высокопроизводительных технологий поможет на основе анализа большего количества данных выявлять детали проявления признака. Дополнительным источником информации при выявлении генов, ответственных за формирование опушения листа, могут служить обширные данные о генетическом контроле опушения у двудольных растений, наиболее исследованным из которых является A. thaliana. Эти данные могут быть использованы в совокупности с современными методами биоинформатики, сравнительной геномики для поиска у пшеницы гомологов генов, формирующих генную сеть контроля опушения у A. thaliana. Результаты такой работы позволят предсказать локализацию компонентов генной сети контроля опушения листа растений на гомеологичных хромосомах пшеницы и их возможное фенотипическое проявление, что облегчит дальнейшую работу по картированию консервативных генов опушения листа пшеницы и изучения их молекулярных функций.

В настоящей работе для изучения генетических механизмов контроля формирования трихом на поверхности листа мягкой пшеницы, была применена комбинация методов классической генетики, высокопроизводительного фенотипирования и подходов биоинформатики и системной биологии.

Цель работы. Выявить особенности морфологии, наследования, а также проявления в онтогенезе опушения листа пшеницы ТгШсит аеяНуит Ь, используя высокопроизводительный метод фенотипирования, и предсказать локализацию компонентов генной сети контроля хромосомах пшеницы с помощью метод Для достижения заявленной цели опушения листа растении на гомеологичных (зв сравнительной геномики. были поставлены следующие задачи:

1) Разработать протокол получения микроизображения листа для фенотипирования растения по признаку опушения, позволяющий получать микроизображения, пригодные для компьютерной обработки.

2) Проанализировать изменчивость количественных характеристик опушения листа мягкой пшеницы в зависимости от яруса листа.

3) Исследовать возможность использования предложенной технологии для детального описания структуры гибридных популяций по количественным характеристикам опушения листа на примере популяции гибридов второго поколения между сортом Hong-тап%-та\ и линией 102/00'.

4) На основе анализа количественных характеристик опушения листа выделить морфотипы опушения листа для мягкой пшеницы.

5) Проанализировать влияние генетического фона на проявление опушения листа, контролируемого геном Н12а"р.

6) Провести реконструкцию генной сети контроля опушения листа у АгаЫс1орз1$ ¡каИапа на основе литературных данных и методов компьютерного распознавания текстов.

7) Методами сравнительной геномики предсказать локализацию компонентов генной сети контроля опушения листав. ЛаИапа на гомеологичных хромосомах пшеницы.

Научная новизна работы. В настоящей работе для анализа количественных характеристик опушения впервые применён метод высокопроизводительного фенотипирования, основанный на использовании изображения сгиба листа. Впервые были выделены фенотипические классы в популяции Бг Нопд-тап£-та1 х линия 102/00', на основе чего была описана модель наследования этого признака. Впервые на основе количественных характеристик были выделены морфотипы опушения листа среди сортов мягкой пшеницы. Впервые показано, что фенотипическое проявление гена Hl2aesp, интрогрессированного в геном мягкой пшеницы от Ае. speltoides, зависит от генетического фона сорта-реципиента. Впервые при помощи методов сравнительной геномики были проанализированы гены, формирующие консервативное ядро генной сети формирования трихом и предсказано местоположение компонент генной сети формирования трихом на хромосомах ячменя и пшеницы.

Практическая ценность работы. Использование микроизображений для описания опушения листа позволит осуществлять более детальное и быстрое извлечение данных о количественных характеристиках опушения листа в генетической и селекционной работе. Селекция мягкой пшеницы с учётом количественных характеристик опушения листа позволит задействовав ресурсы устойчивости к биотическим и абиотическим факторам внешней среды, связанные с этим признаком.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21 работа, из них 6 статей в рецензируемых научных журналах, входящих в список ВАК.

Благодарности.

Автор выражает благодарность Александру Симонову за знакомство с мягкой пшеницей, Светлане Арсеньевой и Михаилу Генаеву за реализацию алгоритмов LHDetect и LHDetect 2, Вадиму Михайловичу Ефимову за советы по статистической обработке данных, Дмитрию Штокало за возможность использовать Pathway Studio, а также коллективам сектора генетики качества зерна и отдела системной биологии за всестороннее содействие.

ЭОИП БР разрабатывался при поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 гг.» (07.514.11.4052).

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Дорошков, Алексей Владимирович

5. Выводы

1) Разработан протокол подготовки препаратов и микроизображений, входящий в состав метода высокопроизводительного фенотипирования растений по признаку опушения листа, позволяющий получать детальное цифровое описание структуры опушения. Предложенный метод позволяет устанавливать соотношение коротких и длинных трихом на поверхности листа, а так же использовать методы многомерного статистического анализа при сравнении количественных характеристик опушения.

2) Установлено, что между числом трихом, идентифицированных на изображении сгиба листа, и числом трихом на единицу площади на поверхности соседней бразом, трихомы, области л!иста существует линейная зависимость. Таким ос различаемые на сгибе листа, могут служить адекватной оценкой структуры опушения поверхности листа.

3) На примере анализа растений сорта Саратовская 29 и интрогрессивной линии 102/001 мягкой пшеницы с различным и формами опушения листа были выявлены различия в количественных характеристиках опушения листа для листьев разных ярусов и показано, что наиболее интенсивно этот признак проявляется на листьях второго яруса.

4) Показана возможность использования предложенной технологии для описания детальной фенотипической структуры гибридных популяций по признаку опушения листа.

5) При исследовании популяции F2 Hong-mang-mai х линия 102/00' впервые была обнаружена неравномерность распределения параметров плотности и длины трихом. На основе этого была описана модель наследования количественных характеристик этого признака.

6) При исследовании выборки сортов с разным проявлением признака опушения листа была выявлена и описана вариабельность количественных характеристик опушения листа и выделены два морфотипа по степени выраженности этого признака.

7) Впервые показано, что фенотипическое проявление гена Hl2"esp, интрогрессированного в геном мягкой пшеницы от Ае. speltoides зависит от генетического фона сорта-реципиента: чем более выражено опушение у сорта-реципиента, тем больший эффект на этот признак оказывает ген Hl2aesp, что свидетельствует об аддитивном взаимодействии гена Н12°е1р с соответствующими генами сортов - реципиентов.

8) На основе анализа литературных данных и использования программ автоматического анализа текстов реконструирована модель генной сети контроля опушения листа А. МаИста, выделены основные структурные элементы, -компоненты, ответственные за паттернинг, рост и дифференцировку, а также за ветвление и форму трихом.

9) На основе поиска гомологов генов формирования опушения листа в геноме риса и использования сравнительных хромосомных карт риса, пшеницы и ячменя было предсказано местоположение компонент генной сети формирования трихом на хромосомах ячменя и пшеницы. Часть предсказанных локусов совпала с локусами известных генов, контролирующих опушение у злаков.

4. Заключение

Понимание механизмов приспособления организмов к изменяющимся условиям внешней среды является актуальной задачей. Любой живой организм, с одной стороны, поддерживает постоянный избирательный обмен веществ с внешней средой, с другой -имеет необходимость быть изолированным от ряда воздействий. Для надземных частей растений важно поддерживать необходимый уровень газообмена и транспирации. Однако повышенная потеря влаги, излишнее ультрафиолетовое облучение могут оказывать губительное действие на развитие растений. Известны растения, способные произрастать в различных климатических зонах, в том числе и засушливых. Для эффективного выполнения функции частичной изоляции от внешней среды эпидермис высших растений формирует сложную структуру - он состоит из плотно прилегающих друг к другу клеток, покрытых кутикулой, которые обеспечиваю! изоляцию; имеет устьица, регулирующие газообмен и транспирацию; а также поверхностные образования - трихомы. Трихомы высших растений разнообразны в зависимости от выполняемых функций. Они могут быть разных размеров, состоять из одной или нескольких клеток, выделять секрет и т.п. Они также нередко используются в качестве систематического признака. Например, расположение перегородок между клетками головки железистых трихом позволяет разделять Scrophulariceae и Solanaceae (Solereder, 1908).

Трихомы давно привлекают ученых как интересный объект исследования в генетике развития. На известном модельном объекте, A. thaliana, ведутся исследования молекулярных механизмов формирования одноклеточных ветвистых трихом (Marks, 1997 ; Hulskamp et al., 1999; Hulskamp et al., 1996; Larkin et al., 2003). На данный момент развитие трихом этого растения является наиболее исследованным. Известен ряд генов, определяющих развитие трихом, а также характерные взаимодействия между ними.

Результаты проведённого в настоящей работе анализа последовательностей генов и их белков доступных цветковых растений на предмет наличия ортологов генов опушения листа A. thaliana говорят о том, что генная сеть формирования опушения листа имеет консервативную часть, присущую большому количеству цветковых растений. Здесь следует отметить такие гены как Glabra 1 - Glabra 3, Transparent testa glabra 1. Одновременно с этим, значительная часть белков регуляции формирования трихом специфична для A. thaliana или двудольных растений.

В то же время, развитие трихом однодольных растений, а также их генетический контроль, исследованы в значительно меньшей степени. Есть данные о том, что для более засухоустойчивых сортов пшеницы характерна большая плотность опушения (Крупное и др. 1990). Кроме того, есть данные об участии опушения в защите от вредителей (Schillinger et al., 1968; Roberts et al, 1979).

Важная сельскохозяйственная культура - мягкая пшеница, относящаяся к однодольным растениям, очевидно, имеет свою специфику генетического контроля признаков, которая, в том числе связана и с полиплоидностью её генома. У мягкой пшеницы различают три хромосомных набора — элементарных генома - А, В и D, унаследованных от разных видов. При этом известно наличие у диплоидных видов пшеницы генов контроля опушения листа (Крупнов, 1990; Sharma et al., 1994). Вероятно, каждый из элементарных геномов мягкой пшеницы имеет свою генетическую систему контроля опушения листа. Это приводит к наличию в общем геноме так называемых гомеологичных генов, то есть генов, сходных по структуре, местоположению и выполняемой функции, но находящихся в разных наборах хромосом. Таким образом, кроме полигенного контроля опушения листа, у пшеницы могут существовать гомеоаллельные гены, функционально вырожденные или функционально дополняющие друг друга, которые также увеличивают общее количество генов, вовлечённых в контроль этого адаптивного признака.

Для поиска генов, ответственных за контроль опушения листа необходимы генотипы с контрастным проявлением признака. Непрерывная изменчивость признака также требует разработки методов детального цифрового описание этого признака. Ранее, основываясь на экспертной оценке и визуальном подсчёте, у мягкой пшеницы было выделено два гена опушения листа. Однако данные о количестве генов, контролирующих формирование трихом для других растений, свидетельствуют в пользу существования, помимо генов основного эффекта, некоторого количества генов, модифицирующих проявление этого признака у мягкой пшеницы. Для поиска этих генов впервые в данной работе был разработан протокол, основанный на использовании для описания структуры опушения листа изображения сгиба листа. Нами было показано, что сгиб листа предоставляет достоверную информацию о структуре опушения его поверхности. Этот метод анализа опушения листа показал высокую эффективность и может быть использован для выделения описания и сравнения морфотипов опушения, в частности для выделения фенотипических классов при анализе расщепляющихся популяций.

При помощи нового метода анализа структуры опушения листа впервые были выделены группы сортов, чётко различающиеся по длине и плотности трихом. Сорт Родина, считавшийся ранее неопушённым, обнаружил единичные короткие трихомы на поверхности листа. Растения сортов Диамант 2, Янецкис Пробат и Чайниз Спринг по значениям длины и плотности трихом были отнесены к группе слабо опушённых. Сорта

Новосибирская 67, Голубка, Саратовская 29 и Hong-mang-mai были отнесены к группе сильно опушённых. Для некоторых генотипов в исследованной выборке растений наблюдалась зависимость средней длины трихом от плотности опушения.

Чёткость разделения сортов на две группы, а также зависимость длины и плотности опушения, говорит о наличииу пшеницы как минимум двух генов, определяющих одновременно длину и плотность расположения трихом. Различия между сортами внутри групп говорят о наличии генов-модификаторов этого признака. По нашим данным наибольшее количество функционирующих генов опушения листа наблюдается у сортов Саратовская 29 и Hong-mang-mai. Ранее для сорта Hong-mang-mai было показано наличие гена, влияющего на опушение листа в хромосоме 7В (Taketa etal., 2002).

При помощи нового метода анализа структуры опушения листа было проанализировано проявление этого признака в онтогенезе мягкой пшеницы. Для двух неродственных генотипов, сорта Саратовская 29 и линии 102/00' из коллекции «Арсенал», было показано, что на поверхности листьев разных ярусов опушение листа разнится по плотности и длине трихом. Различия между листьями 1-3 ярусов превосходят стандартное 95% отклонение, однако значительно уступают различиям между выбранными линиями. Таким образом, в данном случае опушение листьев определяется генетическими факторами, и одновременно несколько модифицируется во время онтогенеза растения. Следует отметить, что максимальные значения плотности и длины опушения были отмечены у исследованных растений двух генотипов для второго листа. Это может быть связано с особенностями онтогенеза растений мягкой пшеницы. Проросток, формируя первый лист, ещё имеет запас питательных веществ в семени, во время формирования второго листа растение переходит к полностью автономному питанию. Вероятно, в этот момент формирование микроклимата вблизи поверхности листа с помощью трихом особенно актуально.

По многочисленным данным, опушение листа встречается как у мягкой пшеницы, так и у тетраплоидных, а также диплоидных диких форм пшениц (Вавилов, 1990; Крупное, 1990). Для расширения генетического разнообразия мягкой пшеницы И.Ф.Лапочкиной с сотрудниками в ИЦиГ СО РАН была создана коллекция интрогрессивных линий мягкой пшеницы «Арсенал», линии которой несут фрагменты генетического материала от Ае. speltoides Tausch. (Lapochkina et al., 2001). Среди них особый интерес в свете исследования опушения листа представляет линия 102/001 сорта Родина, несущая ген опушения листа Hl2fesp от Ае. speltoides Tausch, (образец к-389 из коллекции ВИР). В настоящей работе проведён детальный анализ и сравнение структуры опушения сорта-реципиента Родина, линии 102/00' и донора этого признака Ае. speltoides ч а

Tausch. Сорт Родина формирует единичные трихомы средней длиной около 15 мкм. Ае. speltoides формирует слабое опушение, а линия 102/00' формирует опушение листа, схожее по распределению длин трихом с Ае. speltoides. Однако эта линия формирует дополнительно к трихомам, характерным для Ае. speltoides трихомы большей длины, что, вероятно, связано с влиянием генетического фона сорта Родина. Одновременно, это свидетельствует о возможной независимости генетического контроля количества и длины трихом, либо плотностей трихом разной длины.

Для более детального исследования проявления опушения листа, контролируемого геном Hl2aesp, были использованы линии сортов Диамант 2, Саратовская 29, в которые был введён этот ген. Было показано, что ведение гена Hl2aesp в генотип слабо опушнного сорта Диамант 2 (линия i: Дм2 HIT0"1*), формирующего малое количество и длину трихом, вызывает формирование более плотного и более длинного опушения с профилем распределения трихом по длинам как у сильно опушённого типа. Введение гена Н12а"р в сорт Саратовская 29 также приводит к увеличению плотности опушения и формированию бфлее длинных трихом. Следует отметить, что значения длины и плотности трихом линии i:C29 Hl2aesp превосходят соответствующие значения для всех исследованных нами сортов. Можно предположить, что гены, ответственные за формирование опушения листа у сорта Саратовская 29, неаллельны гену Hl2aesp. Возможно также что Ае. speltoides несёт более сильный аллель в локусе Hl2aesp, чем Саратовская 29, однако не имеет генов-модификаторов, свойственных сорту Саратовская 29 и позволяющих этому сорту формировать большее количество и размер трихом.

Также была проанализирована структура опушения листа растений гибридной популяции между сортом Hong-mang-mai и линией 102/00'. Ранее, опушение листа в этой гибридной популяции были проанализированы визуально. Тогда было установлено, что среди гибридов между этими формами не выявляется неопушённых растений. Было показано, что эти генотипы содержат аллель Н12 гена, который управляет развитием длинных трихом (Добровольская и др., 2007).

Мы показали, что некоторые растения в гибридной популяции F2 образуют значительно более плотное опушение, чем родительские формы, а также более длинные трихомы. Этот факт может свидетельствовать об аддитивном действии генов контроля опушения листа сорта Hong-mang-mai и линии 102/00'. Это наблюдение заслуживает дальнейшего изучения для понимания механизмов формирования опушения листа в онтогенезе злаковых растений.

В настоящей работе нам удалось идентифицировать различия в структуре опушения листа растений в популяции F2 Hong-mang-mai х линия 102/00' по числу трихом и выделить в них группу с небольшим числом трихом (<22). Полученное нами соотношение растений с малым и с большим числом трихом относятся как 1:3, что свидетельствует о моногенном характере наследования. Интересно также, что такое же отношение (1:3) мы наблюдали и для наследования средней длины трихом (хотя в этом случае разделение на две группы было менее четким). По-видимому, каждый из этих признаков контролируется двумя аллелями, таким образом, что большее количество трихом доминирует над меньшим, и большая длина над меньшей. Таким образом, мы наблюдаем в обоих случаях положительный регулятор инициации трихом и его более слабый аллель, положительный регулятор роста трихом и его более слабый аллель. Однако могут существовать другие генетические факторы, которые осложняют картину распределения растений в по фенотипам разных классов, в частности по длине трихом. При использовании кластерного аналйза было выявлено разделение потомков на группы ¡по степени сходства высоты и формы профиля распределения трихом по длинам. Эти группы относятся как 9:7, что соответствует комплементарному действию генов. При этом, разделение на группы по средней длине трихом происходит независимо от групп, полученых при помощи кластерного анализа. Разделение по плотности опушения соотносится с данными кластерного анализа. При объединении результатов разделения по плотности трихом и данных кластерного анализа выявляются группы, численно соответствующие 9:3:4, что соответстыует дигенной комплементации.

Таким образом, мы можем предположить наличие в данной популяции расщепления с участием по трёх локусов, влияющих на структуру опушения листа, два из которых выявляют комплементарное взаимодействие.

Генотипы родительских форм:

Р:

Нопд тапд та\

NN вБ II

102/00' пп ее высокая плотность трихом повышенная плотность коротких трихом малая средняя длина трихом Г

N8 пг

ПБ

N5 пв не

NN NN N11 N11 J гг Бе

NN NN N11 Nn 4

ЭБ ее Бе

NN N11 пп пп

Бе ЭЭ

N11 N>1 пп ппв А ее * Т низкая плотность трихом низкая плотность коротких трихом высокая средняя длина трихом

N-3- высокая Л

Рисунок 59 102/00'. повышенная плотность коротких трихом N■5$ высокая плотность трихом, низкая плотность коротких трихом пп- низкая плотность трихом, низкая плотность коротких трихом

Генетическая гипотеза, описывающая наследование структуры опушения листа в популяции гибридов между сортом Ноп£-тап§-та1 и линией

1 1.1 и II " высокая средняя длина трихом

II - низкая средняя длина трихом то

На рисунке 59 представлена модель, описывающая наследования количественных характеристик опушения листа в популяции гибридов ¥2 между сортом Hong-mang-mai и линией 102/001. Можно предположить наличие трёх аллельных генов. Условно они обозначены буквами:

N - положительный регулятор инициации трихом; п - рецессивный аллель (сниженная плотность трихом);

8 — ген определяющий формирование высокой плотности коротких трихом (не проявляется на фоне низкой общей плотности (пп)); в - рецессивный аллель (низкая плотность коротких трихом) Ь - положительный регулятор роста трихом; 1 - его более слабый аллель (малая средняя длина трихом).

TeHN инициации по своему проявлению близок к описанному ранее боЛее простыми методами гену Н12. Следует также отметить, что для Алктапа найдены ген ы - регуляторы и роста трихом, по фенотипическому эффекту соответствующие предполагаемым в нашей модели (Marks, 1997 ; Hulskamp et al., 1999; Hulskamp et al., 1996; Larkin et al., 2003).

Нами было предсказано положение генов, ортологичных генам контроля опушения листа A. thaiana, консевативным для цветковых растений. Используя базы данных KEGG genes, KEGG SSDB, PLAZA plant comparative genomics, а также NCBI и программу blast+ были найдены гены, функционально соответствующие генам контроля опушения листа A.thaiana. Затем при помощи сравнительных хромосомных карт (Stein et al., 2007; Dubkovsky et al., 1996; Devos, et al., 1997; Cho et al., 2005) было выявлено расположение соответствующих генов на хромосомах О. sativa, Н. vulgare и Т. aestivum. Местоположения генов, предположительно участвующих в формировании опушения листа, распределены относительно равномерно по хромосомам Н. vulgare и Т. aestivum. Наибольшее их количество отмечено в четвёртой и шестой гомеаллельных группах, а на второй группе не отмечено ни одного. При этом для Н. vulgare известен ряд морфологических маркёров, связанных с опушением органов. Они найдены на третьей, четвёртой, пятой хромосомах. Мутации в соответствующих генах приводят к изменению опушения органов либо к изменению размеров трихом. Для A. thaliana известны гены со сходным фенотипическим эффектом. При этом, три из четырёх известных маркёров, связанных с опушением листа у H.vulgare соответствуют предсказанным нами локусам генов опушения листа и предполагаемому фенотипическому эффекту.

Кроме того, была проанализирована молекулярная эволюция среди цветковых растений одного из ключевых генов контроля опушения листа - Glabra 2, представителя семейства НГ)-21Р IV генов. Были выявлены дупликации исходного предкового гена на ранних этапах эволюции цветковых растений с последующим функциональным расхождением дочерних генов. Описанные на филогенетическом дереве клады выявили соответствие с известной классификацией последовательностей 1ГО-21Р IV - генов на основе нуклеотидных последовательностей гомеодоменов (Неппкзвоп et а1., 2005; Ни а1, 2012). Одновременно с этим были выявлены детали эволюции НО-21Р IV генов, ранее не описанные. Внутри клад I у, II 6 соответвтующих группам НО-21Р IV у и IV 8

Неппкззоп & а!., 2005) были отмечены древние дупликации предкового гена, предшествующие обособлению однодольных и двудольных. При этом, внутри клады II г был отмечен обособленный кластер последовательностей, которые отличались от всех рассмотренных модификацией участка связывания ДНК, вставкой в петлю гомеобокса между спиралями (в мотиве спираль-петля-спираль (НЬН)), леициновои делециеи в районе застёжки» а также добавочным С-концевой доменом. Добавочный С-концевой домен выявил высокое соответствие консервативному домену МЕКНЬА (МикЬецее е( Ы., 2006). Этот домен ранее был обнаружен у некотороых представителей семейства \iD-ZlP III генов, а также ряда генов водорослей и бактерий (МикЬецее & а!., 2006). Для НЭ-21Р IV генов этот домен описан в настоящей работе впервые.

Результаты настоящей работы предоставляют благодатную почву для дальнейшего молекулярного картирования консервативных генов опушения листа пшеницы на основе сопоставления предсказанных нами локусах и данных о фенотипическом проявлении соответствующих генов у А.Лшапа и рода ТгШсит. Поиск в генетических коллекциях контрастных фенотипов, картирование генов, специфичных для пшениц, также значительно облегчается с применением новых подходов высокопроизводительного фенотипирования.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дорошков, Алексей Владимирович, Новосибирск

1. Бараев А.И. Яровая пшеница. М.: Колос, 1978. - 428 с.

2. Боранбаев С. Создание сортов пшеницы, устойчивых к пьявице // Вестник с.-х. науки Казахстана 1981. - Т. 6. - С. 92-93.

3. Вавилов Н.И. Теоретические основы селекции. М.: Наука, 1990. - 512 с.

4. Вавилов Н.И. К познанию мягких пшениц // Тр. по прикл. бот. и сел. Петроград: Гос. ин-т опытной агрономии, 1922-1923.-Т. 13.-С. 149-215.

5. Генаев, М.А., Дорошков A.B., Морозова Е.В. и др. Компьютерная система WheatPGE для анализа взаимосвязи фенотип-генотип-окружающая среда у пшеницы // Вавилов, журн. генет. и селекции. 2011. Т. 15. С. 784-793.

6. Генаев М.А., Дорошков A.B., Пшеничникова Т.А., Морозова Е.В., Си1. Афонников Д.А

7. Информационная поддержка селекционно-гемонов A.B., нетического биология иэксперимента у пшеницы в системе WheatPGE. // Математическая1.Iбиоинформатика. 2012. Т. 7. № 2. С. 410-424. !

8. Дорошков A.B., Арсенина С.И., Пшеничникова Т.А., Афонников Д.А. Применение компьютерного анализа микроизображений листа для оценки характеристик опушения пшеницы Triticum aestivum L.II Инф. вестник ВОГиС 2009. - Т. 11. № 1 -С. 218-226.

9. Журавлёва H.A. Механизм устьичных движений, продукционный процесс и эволюция. Новосибирск: Наука, 1992. - 140 с.

10. Ивченко Г.И., Медведев Ю.И. Математическая статистика. М.: Высш. школа, 1984. -248 с.

11. Крупное В.А., Цапайкин А.П. Опушение листьев пшеницы: генетические и экологические аспекты // С.-х. биология. 1990. — № 1. - С. 51-57.

12. Лихенко И.Е. О взаимосвязи опушения органов растений яровой мягкой пшеницы с хозяйственно и биологически ценными признаками в условиях западной Сибири // Растениеводство и селекция. 2007. - № 6. - С. 25-31.13.