Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ механизмов внутриклеточно индуцированной протенциации в нейронах виноградной улитки

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Анализ механизмов внутриклеточно индуцированной протенциации в нейронах виноградной улитки"

С О

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ II А У К ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ

на правах рукописи УДК 615.78+612.821.6

МАЛЫШЕВ Алексей Юрьевич

АНАЛИЗ МЕХАНИЗМОВ ВНУТРИКЛЕТОЧНО ИНДУЦИРОВАННОЙ ПОТЕНЦИАЦИИ В НЕЙРОНАХ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ

03.00.13- физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических нзук

Москва - 1998

Работа выполнена в Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (директор П.В. Симонов).

- академик

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор ILM. Балабан.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук B.JI. Эзрохи; кандидат медицинских наук A.B. Шевелкин.

Ведущее учреждение: кафедра физиологии высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ.

Защита состоится 23 декабря 1998 г. часов на заседании специализированного ученого совета (Д-003.10.01) при Р1нституте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (г. Москва, ул. Бутлерова, 5а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИВНД и

НФ РАН.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

О.Х. Коштоянц

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время практически общепризнанным является тот факт, что изменение эффективности синаптической передачи лежит в основе механизмов обучения и памяти (см., например, Kandel et al., 1995; Bliss and Collingridge, 1993). Одной из наиболее разработанных моделей для изучения синаптической пластичности на позвоночных является долговременная потенциация (ДП) длительное увеличение амплитуды ответов нейронов на тестирующий стимул, возникающее после высокочастотной стимуляции афферентных входов (Воронин, 1982). Однако, несмотря на долгую историю изучения ДП, до настоящего времени отсутствуют прямые доказательства того, что механизмы ДП имеют какое-либо отношение к механизмам обучения и формированию следов памяти (Johnston, 1997; Voronin et al., 1994). В этой связи особенно привлекательными кажутся исследования на более простых организмах, например, таких как моллюски. В самом деле, с одной стороны было показано, что у моллюсков можно выработать оборонительные и пищевые условные рефлексы, что является проявлением процедурной (недекларативной) памяти (Максимова, Балабан, 1976, 1985; Walters et al., 1979; Alkon, 1974). С другой стороны, благодаря относительно простому строению нервной системы и крупным нейронам, на моллюсках можно детально описать нервные сети, контролирующие те или иные поведенческие акты. Затем, анализируя нервную сеть, контролирующую ту форму поведения, которая подверглась изменению в процессе обучения, можно определить локализацию и механизмы пластических перестроек. Подобная задача была блестяще выполнена школой Кендела на модели рефлекса отдергивания жабры у морского моллюска аплизии (Kandel et al., 1995). Однако оказалось, что клеточные

механизмы, определяющие обучение у аплизии по некоторым важным характеристикам отличаются от механизмов синаптической пластичности, обнаруженным на позвоночных. Главное отличие состоит в том, что в отличие от ДП нейронов позвоночных, сенситизация нейронов аплизии, определяющих отдергивание жабры, запускается не высокочастотным разрядом в нейронах, а воздействием химического стимула - серотонина (Brunelli et al., 197В связи с этим особенно интересными кажутся те модели обучения на моллюсках, в которых используются механизмы индукции синаптической пластичности, применяемые при исследованиях на нейронах позвоночных -высокочастотная стимуляция ripe- или постсинаптического нейрона.

Одной из посылок настоящей работы явился тот факт, что при выработке сенситизации на наземной улитке Helix болевой стимул вызывает в командных нейронах оборонительного поведения высокочастотный спайковый разряд. Известно, также, что значительную роль при выработке сенситизации играет активация серотонинергических нейронов, обеспечивающая мощный выброс серотонина, который сам по себе оказывает потенциирующее влияние на командные нейроны. Однако неясно, вносит ли высокочастотный спайковый разряд в командном нейроне какой-либо вклад в развитие данной сенситизации.

Вопрос о том, участвует ли постсинаптический нейрон в развитии синаптической пластичности у моллюсков дискутировался в литературе довольно долго. К моменту начала настоящей работы наиболее распространенной точкой зрения было отрицание значения постсинаптической клетки в пластических перестройках у беспозвоночных животных. Высказывались даже идеи, что филогенетически первой

появилась пресинаптическая пластичность, а затем уже, у позвоночных животных, дополнительно возникли

постсинаптические механизмы. Причиной подобного рода воззрений, по-видимому, послужила работа из лаборатории Кендела (Carew, 1984), в которой экспериментально доказывалось, что активация постсинаптической клетки не является ни необходимым, ни достаточным условием для индукции синаптического облегчения, лежащего в основе ассоциативного обучения у аплизии. Тем не менее, в 1994 году из лаборатории Глянцмана вышла работа, в которой сообщалось, что долговременная потенциация в культуре нейронов аплизии может быть индуцирована сочетанием высокочастотной стимуляции пресинаптичсекой клетки с деполяризацией постсинаптического нейрона (Lin and Glanzman, 1994), то есть впервые прямо указывалось на возможную роль постсинапса в индукции синаптического облегчения у моллюсков. В том же году была опубликована статья (Kuhnt et al., 1994), в которой была продемонстрирована возможность индукции долговременной потенциации в нейронах гиппокампа посредством высокочастотной тетанизации постсинаптического нейрона, что подчеркивает важную роль постсинапса в развитии пластических перестроек у позвоночных. В связи с этим возник вопрос, возможно ли индуцировать синаптическое облегчение путем высокочастотной стимуляции постсинаптического нейрона у моллюсков без афферентной активации.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель настоящей работы состояла в изучении механизмов потенциации, возникающей после внутриклеточной тетанизации командного нейрона (имитирующей вышеописанный спайковый разряд). Для

достижения данной дели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследовать возможность индукции синаптической потенциации путем внутриклеточной тетанизации постсинаптического нейрона в изолированной ЦНС моллюска.

2. Определить роль ионов кальция в выработке внутриклеточно индуцированной потенциации (ВКИП) синаптических ответов командных нейронов.

3. Выяснить роль серотонина в индукции ВКИП.

4. Определить, какие вторичные посредники вовлечены в поддержание ВКИП.

5. Исследовать, вовлекаются ли какие-либо ретроградные мессенджеры в развитие ВКИП.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые показана возможность выработки синаптической потенциации на нейронах моллюска путем внутриклеточной тетанизации постсинаптического нейрона. Обнаружено, что, как и в аналогичных моделях синаптической пластичности на позвоночных животных, запускающим механизмом ВКИП у моллюсков является увеличение кальция в постсинаптическом нейроне. Выявлена сезонная зависимость выраженности ВКИП - долговременная потенциация вырабатывается только в весенне-летний период. Показано, что серотонин не является запускающим механизмом ВКИП в отличие от широко известных моделей гетеросинаптического облегчения у беспозвоночных; однако присутствие серотонина необходимо для реализации долговременной фазы потенциации. Впервые показана возможность участия окиси азота в пластических перестройках у беспозвоночных животных.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Анализ механизмов ВКИП расширяет представления теоретической

физиологии о механизмах обучения и памяти на клеточном уровне в ЦНС животных. Кроме того, совокупность представленных данных о пластических свойствах постинаптического нейрона может найти применение при конструировании нейрокомпьютерных кибернетических систем.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные материалы диссертации докладывались на 33-м международном конгрессе IUPS (International Union of Physiological Sciences), (С.-Петербург, 1997), на 5-ой конференции ISIN (International Society for Invertebrate Neurobiology) "Простые нервные системы" (Москва, 1997), на молодежных научных конференциях ИВНД и НФ (1997, 1998), на конференции Европейского общества нейронаук (Берлин, 1998), на конференции молодых ученых в МГУ им. Ломоносова посвященной 90-летию Л.Г. Воронину (Москва, 1998).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и тезисы 4 докладов.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением методов исследования, главы результатов и их предварительного обсуждения, общего обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками. Список литературы

содержит/KS источников.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на взрослых особях Helix lucorum L., собранных в Крыму и содержащихся в лаборатории. Перед препаровкой животные обездвиживались и наркотизировались, для чего их помещали на 10-30 мин. в снег и/или вводили изотонический

раствор MgCl2. После чего улитка закреплялась в восковой ванночке, вскрывалась гемоцель и извлекалось окологлоточное нервное кольцо. Закрепленная в ванночке ЦНС омывалась раствором Рингера для холоднокровных. Оболочки ганглиев снимали пинцетами. Активность нейронов регистрировали внутриклеточно по стандартной методике стеклянными микроэлектродами с диаметром кончиков около 0,5 мкм, заполненными 2,5 М раствором цитрата калия или смесью 2 М растворов цитрата калия и КС1 в соотношении 1:1. Электроды имели сопротивление от 10 до 50 Мом.

Регистрировали внутриклеточные ВПСП гигантских командных нейронов париетальных ганглиев, участвующих в оборонительном поведении (Balaban, 1979, 1983), причем в основной серии опытов регистрирующие электроды вводили одновременно в два симметричных нейрона (главным образом ЛПаЗ и ПГГаЗ). Для тестирования синаптических ответов стимулировали интестинальный нерв одиночными стимулами. Раздражение нерва осуществляли прямоугольными толчками тока длительностью 3-5 мс через пластиковый присасывающий электрод. С целью уменьшения низкочастотной депрессии, типичной для этих суммарных ВПСП {Балабан, Захаров, 1992), применяли большие межстимульные интервалы. Второй внутриклеточный микроэлектрод использовали для кондиционирующей тетанизации. Экспериментальный протокол включал в себя тестирование до тетанизации (5 стимулов), внутриклеточную тетанизацию, и посттетаническое тестирование. Внутриклеточная тетанизация обычно подавалась через 0,5-1 мин. после пятого тестирующего раздражения нерва и состояла из 8-10 пачек импульсов длительностью 25-33 мс каждый. Длительность пачки и интервал между пачками составляли 8-10 с. Сила

импульсов (5-15 нА) была сверхпороговой для потенциалов действия. Однако при использованной частоте тетанизации (15-20 Гц) обычно только часть импульсов вызывала разряды. В каждом опыте один из регистрируемых нейронов тетанизировали, а другой служил контролем, так как более 90% синаптических входов этих нейронов имеет общий источник (Balaban, 1997).

В отдельной серии опытов за 1 мин. до каждого тестирования мембранный потенциал тетанизируемого нейрона фиксировался на уровне -70 мВ при помощи методики двух-электродной фиксации потенциала. При этом регистрировали возбуждающие постсинаптические токи (ВПСТ), вызванные стимуляцией интестинального нерва; в контрольном нейроне параллельно регистрировали ВПСП. Всего были зарегистрированы ответы 250 пар нейронов до и после тетанизации.

Регистрация производилась на IBM PC-совместимый компьютер (частота дискретизации 1 кГц, АЦП - DIGIDATA 1200, Axon Instruments) В каждой точке тестирования измеряли пиковые амплитуды ВПСП (ВПСТ). Все величины выражали в процентах от амплитуды начального ответа в данном эксперименте. Вычисляли средние значения ± стандартные ошибки средних. Достоверность результатов оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни (U-критерий) и критерию знаков. Статистически значимыми считались различия при р<0,05, если иное не оговорено в тексте.

Для подавления функции серотонинергических нейронов в полость тела животных вводился нейротоксин 5,7-диокситриптамин (5,7-ДОТ) ("Sigma", США) растворенный в стандартном физиологическом растворе Рингера для холоднокровных с 0,1% аскорбиновой кислотой в качестве

антиоксиданта в дозе 20 мг/кг массы тела животного. Эксперименты проводили на 2й - 7й день после инъекции.

В специальной серии опытов на 5,7-ДОТ-инъецированных животных (в дальнейшем - 5,7-ДОТ-группа) за 15 мин. до тетанизации в экспериментальную ванночку добавляли серотонин креатинина сульфат ("Calbiochem", США) в концентрации 5*10" 7М.

Растворы калиевой соли ЭГТА ("Serva") в концентрации 0,5 М и кальция хлорида в той же концентрации инъецировали под давлением через низкоомные (4-6 МоМ) стеклянные микроэлектроды. Параметры инъекции подбиралась таким образом, чтобы инъецируемый объем был в 1000 раз меньше, чем объем клетки.

Для активации протеинкиназы С (ПКС) в систему протока добавляли SC-10 (RBI, USA) в финальной концентрации 10~5 М. Другой активатор ПКС - форболовый эфир ("Serva") .добавляли в экспериментальную ванночку с расчетом, чтобы финальная концентрация была 10~6 М. Ингибитор протеинкиназы С хлорид хелеретрина ("RBI", USA) вводили в проток в конечной концентрации 5*10~е М.

Специфический ингибитор протеинкиназы А I и II типов гр-cAMP ("RBI", USA) добавляли в систему протока за 30 мин. до тетанизации в концентрациях 10~7, 10~6, 10"5 и 10~4 М. Активаторы ПКА изобутил-метил-ксантин ("Serva") и sp-cAMP ("RBI") апплицировали в экспериментальную ванночку из пипетки с расчетом, чтобы финальная концентрация была 10~6, Ю-5 и 10~4 М.

Для подавления функции NO-синтазы использовали Nco-нитро-L- аргинин ("Sigma"), который вводили в систему протока за 30 мин. до тетанизации в концентрации 10~4М.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Эффект внутриклеточной тетанизации командпого нейрона.

Внутриклеточная тетанизация одного из двух регистрируемых нейронов приводила практически в каждом эксперименте к избирательному возрастанию амплитуды ВПСП в тетанизированном нейроне, в то время как ВПСП в контрольном (нететанизированном) нейроне оставался неизменным. Увеличение амплитуды ВПСП в тетанизированном нейроне по степени выраженности и длительности можно условно разделить на две фазы, которые в дальнейшем мы будем называть кратковременная (первая), длящаяся 5-20 мин., и долговременная (вторая), длящаяся 20-60 мин., фазы потенциации. Длительность второй фазы определялась продолжительностью эксперимента; в случае продолжения тестирования потенциация наблюдалась до 2 часов и более. Превышение амплитуды ВПСП тетанизированных нейронов над амплитудами ВПСП контрольных нейронов было статистически значимым и в среднем составляло 37,9 ± 5,2% (р<0,001) для первой точки кратковременной и 7,1 ± 3,7% для последней точки долговременной фазы потенциации.

В большинстве зарегистрированных нейронов можно было измерить уровень мембранного потенциала после тетанизации. Во всех этих случаях наблюдалась посттетаническая гиперполяризация. Величина гиперполяризации, измеренной вскоре (1-2 мин.) после окончания тетанизации, проявляла тенденцию к корреляции (коэффициент корреляции составлял 0,56, р < 0,06, N = 17) с относительным возрастанием амплитуд ВПСП, измеренных в течение 30-50 мин. после тетанизации относительно средних амплитуд до тетанизации в тех же нейронах.

2. Роль иосттстаничсской гиперполяризации в развитии первой фазы потенциации.

Одной из возможных причин увеличения амплитуды ВПСП после тетанизации могла бы быть посттетаническая гиперполяризация, поскольку известно что амплитуда ВПСП практически линейно зависит от значения мембранного потенциала клетки: гиперполяризация нейрона приводит к отклонению равновесного потенциала для ионных каналов, определяющих развитие ВПСП и возрастанию амплитуды последнего (Экклз, 1964).

С целью оценить вклад, вносимый посттетанической гиперполяризацией в развитие ВКИП, была поставлена серия экспериментов с внутриклеточной тетанизацией командного нейрона в режиме фиксации потенциала. В этой серии перед каждым тестирующим стимулом по нерву мембранный потенциал тетанизируемого нейрона фиксировался на -60 мВ при помощи методики двух-электродной фиксации потенциала; при этом измеряли возбуждающие постсинаптические токи (ВПСТ), возникающие в командном нейроне при стимуляции интестинального нерва. Оказалось, что фиксация потенциала на мембране тетанизируемого нейрона приводит к полному исчезновению первой, кратковременной фазы ВКИП, больше того, через 5-10 мин. после тетанизации амплитуда входящих токов в тетанизируемом нейроне была даже ниже чем амплитуда ВПСП в контрольном, нететанизируемом, нейроне. Однако, уже через 25 мин. после тетанизации амплитуда ВПСТ в тетанизируемом нейроне становилась больше контрольного ВПСП.

Таким образом, проведенные эксперименты с фиксацией потенциала тетанизируемого нейрона позволяют утверждать, что первая кратковременная фаза ВКИП полностью определяется

посттетанической гиперполяризацией, в силу механизмов, описанных в начале главы.

3. Эксперименты с тестирующей стимуляцией мопоеипаптических нейронов.

Другой возможной причиной увеличения амплитуды ВПСП после тетанизации могло бы быть изменение числа возбуждаемых волокон в интестинальном нерве. Для проверки этого предположения мы поставили серию экспериментов, в которых вместо стимуляции нерва для тестирования использовалась стимуляция нейронов, пресинаптических к командным. Пресинаптические нейроны довольно малы (15-20 мкм в диаметре) и могут быть идентифицированы только по их синаптическим входам на командные нейроны и по наличию антидромных спайков, возникающим при стимуляции интестинального нерва, в который они посылают свои отростки (Агаке1оу е1 а!., 1991). В этой серии экспериментов мы использовали экстраклеточную стимуляцию пресинаптических нейронов короткими (0,5 мс) толчками тока через подломанный микроэлектрод (диаметр кончика 5-7 мкм) заполненный физиологическим раствором. Электрод помещался в область правого париетального ганглия, где расположены пресинаптические нейроны (Палихова и др., 1992; Агаке1оу е1 а1., 1991). В каждом эксперименте интенсивность стимуляции подбиралась таким образом, чтобы ВПСП в командном нейроне возникал только в том случае если стимулирующий электрод расположен точно над сомой пресинаптической клетки. Динамика ВКИП в этих экспериментах существенно не отличалась от таковой при стимуляции интестинального нерва. Такие результаты подтверждают точку зрения, что ВКИП связана, скорее всего, с изменением

эффективности синаптической передачи, а не с увеличением числа стимулируемых волокон в нерве.

4. Внутриклеточная тетанизация может вызывать долговременную депрессию.

В части экспериментов (в 10-15% случаев) внутриклеточная тетанизация командного нейрона либо вообще не приводила к каким-либо изменениям амплитуды ВПСП, либо вызывала выраженную депрессию синаптических потенциалов. Согласно литературным данным схожий эффект наблюдается и при выработке различных форм синаптической фасилитации в нейронах позвоночных (Bear and Malenka, 1994). Сравнительно недавно в мировой литературе появился новый термин -метапластичность. Суть этого понятая состоит в том, что предыдущая история активности данного конкретного синапса предопределяет, что будет выработано в результате последующих индуцирующих воздействий - потенциация или депрессия (Abraham and Bear, 1996; Abraham and Tate, 1997). В свете вышесказанного мы считаем, что, возможно, в нашем. случае также предыстория синаптических входов на командный нейрон предопределяет потенцирующий или депрессирующий эффект внутриклеточной тетанизации.

В наших экспериментах было найдено, что если внутриклеточная тетанизация командного нейрона вызывает облегчение синаптических входов на данном препарате, то повторная тетанизация того же нейрона, произведенная через 1-2 часа после первой, практически в 100% случаев также приводит к потенциации. Важность этого факта станет ясна в дальнейшем при описании результатов экспериментов с химическими блокаторами ВКИП.

5. Сезонная зависимость выраженности посттетанической потенциации.

При детальном анализе экспериментальных данных выяснилось, что существует различие между опытами, проведенными весной - летом (с марта по август) и осенью (сентябрь-декабрь). Оказалось, что долговременная фаза потенциации отсутствовала в осенних экспериментах и статистически значимо была выражена в опытах, проведенных в весенне-летний период (р < 0,01). Через 50 мин. после тетанизации превышение амплитуды ВПСП опытного нейрона над амплитудой ВПСП контрольного составляло 19,0 ± 6,5%. Первая фаза ВКИП присутствовала во всех опытах, независимо от времени проведения.

Исходя из вышеописанных данных а также из результатов экспериментов с фиксацией потенциала, свидетельствующих о том, что первая фаза ВКИП связана, скорее всего, только с посттетанической гиперполяризацией, можно утверждать, что осенью и зимой пластические изменения в командных нейронах, индуцируемые внутриклеточной тетанизацией значительно ослаблены. Наблюдаемое возрастание амплитуды ВПСП после тетанизации в этот период отражает изменение пассивной составляющей мембранной проводимости и не является, таким образом, тем, что входит в понятие "синаптическая пластичность".

6. Зависимость долговременной фазы посттетанической потенциации от уровня серотонина.

Известно, что одним из мощных модуляторных факторов в нервной системе беспозвоночных, играющих важную роль, в том числе и в сезонных изменениях, является серотонин (Салимова, Милошевич, 1978; Hiripi and Salanki, 1973). С целью выявления

возможной связи выраженности посттетанической потенциации со степенью активации серотонинергической системы была проведена серия опытов с фармакологически поврежденными серотонинсодержащими нейронами. Для подавления функции серотонинергических нейронов использовали нейротоксин 5,7-диокситриптамин. 5,7-ДОТ отличается от серотонина (5-ОТ) наличием одной дополнительной гидроксильной группы. Будучи введенным в полость тела улитки, 5,7-ДОТ из-за большого сродства к серотонину избирательно захватывается серотонинсодержащими клетками по механизму обратного захвата. Токсические свойства 5,7-ДОТ проявляются в подавлении синтеза серотонина, обратимом разрушении терминалей серотонинергических нейронов, ведущему к подавлению их функции и, как следствие этого, снижению уровня серотонина в нервной системе (Baumgarten et al., 1987). Долговременная фаза посттетанической потенциации при подавлении функции серотонинергических нейронов отсутствовала, как и в осенних экспериментах основной группы. Таким образом, нарушение функции серотонинсодержащих нейронов блокирует возникновение долговременной фазы посттетанической потенциации. Однако, при введении животным 5,7-ДОТ, помимо повреждения терминалей нейронов снижается общая концентрация серотонина в ЦНС за счет подавления его синтеза (Vehovszky et al., 1988). Для выяснения влияния уровня серотонина на долговременную фазу потенциации была проведена серия экспериментов на 5,7-ДОТ-группе, в которой за 15 мин. до тетанизации в экспериментальную ванночку добавляли серотонин в концентрации 5*10~7М. Выяснилось, что увеличение концентрации экстраклеточного серотонина приводит к достоверному превышению амплитуды ВПСП тетанизируемого

нейрона относительно контрольного в течение второй фазы потенциации. Существенно, что контрольный нейрон также находится в условиях повышенной концентрации серотонина. В последней точке эксперимента (через 45 мин. после тетанизации) эта разница составляла 11,3 ± 2,6%. Таким образом, необходимым условием возникновения долговременной фазы посттетанической потенциации является, по-видимому, не столько активация модуляторных серотониновых нейронов, сколько присутствие 5-ОТ в межклеточной жидкости в определенной концентрации. По видимому, оптимальный для индукции ВКИП уровень серотонина в ЦНС реализуется в весенне-летний период и моделируется у "безсеротониновых" животных при повышении концентрации экстраклеточного серотонина.

7. Роль попов кальция в индукции посттетанической потенциации.

В работах на аплизии было показано, что одним из условий развития синаптической потенциации является увеличение концентрации ионов кальция в постсинаптической клетке (Bao et al., 1998; Murphy and Glanzman, 1996; Lin and Glanzman, 1996). Поэтому, мы решили проверить какова роль постсинаптического кальция в исследуемой ВКИП.

Как уже говорилось ранее, если через 1-2 часа после первой внутриклеточной тетанизации в командном нейроне произвести вторую, то она даст тот же или даже больший по амплитуде эффект.

В первой серии опытов по изучению роли постсинаптического кальция во ВКИП, через 1,5 часа после первой тетанизации (в случае получения выраженной потенциации) мы производили инъекцию ЭГТА (кальций-

хелатирующего агента) в тетанизируемый нейрон и затем, через 30 мин., производили повторную тетанизацию этого же нейрона. Оказалось, что связывание внутриклеточного кальция с помощью ЭГТА способно полностью блокировать индукцию ВКИП. Разница между амплитудами ВПСП в контрольном и тетанизированном нейронах через 50 мин. после тетанизации составляла 20.1 ± 12.1% до инъекции, и -12.5 £ 16.9% в той же точке после инъекции (р < 0,01). Необходимо отметить, что инъекция 0,1 М КС1 в командный нейрон в тех же условиях не приводила к блокаде потенциации.

Интересно отметить, что инъекция ЭГТА также препятствовала появлению посттетанической гиперполяризации. После первой тетанизации в этой серии наблюдалась гиперполяризация, равная -13.8 ± 3.3 мВ, тогда как после инъекции изменения мембранного потенциала после тетанизации составляли -1.4 ± 3.8 мВ (разница достоверна).

Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что возрастание концентрации кальция в постсинаптическом нейроне есть необходимое условие для индукции ВКИП. Для проверки того, является ли это также достаточным условием для индукции потенциации, мы провели серию опытов с прямой инъекцией кальция в командный нейрон. В этих экспериментах мы с помощью давления, инъецировали хлорид кальция в расчетной конечной концентрации 1-5*10~4 М в командный нейрон. Было найдено, что такая инъекция приводит к долговременному возрастанию амплитуды ВПСП в инъецированном нейроне, по амплитудной и временной динамике сходному с изменениями, вызванными внутриклеточной тетанизацией. Инъекция хлорида кальция также приводила к гиперполяризации командного нейрона; через 5 мин. после

инъекции мембранный потенциал изменялся, в среднем, на -11.6 ± 3.2 мВ. Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что увеличение концентрации ионов кальция в постсинаптическом нейроне во время индукции ВКИП является необходимым и достаточным условием выработки последней.

8. Задействование каскадов вторичных посредников в развитии посттетанической потенциации.

Поскольку, согласно литературным данным, одним из основных механизмов, задействованных в развитии пластических перестроек у беспозвоночных является активация цАМФ-зависимого пути (Bailey et al. 1996), мы проверили влияние специфического ингибитора протеинкиназы А I и II типов гр-сАМР. Выяснилось, что аппликация rp-сАМР за 30 мин. до тетанизации в концентрациях от 10"7 М до 10"4 М не приводит к каким-либо изменениям в развитии посттетанической потенциации.

С другой стороны, аппликация ингибитора фосфодиэстеразы IBMX (вещества, приводящего к повышению содержания цАМФ внутри клетки) и мембранно-проницаемого аналога цАМФ sp-сАМР в концентрациях от 10~6 М до 10"4 М не приводила к увеличению амплитуды ВПСП, что, хотя и косвенно, также свидетельствует в пользу того, что аденилатциклазный путь не принимает участия в пластических изменениях в исследуемых нейронах.

Другим широко известным вторичным посредником, участвующим в пластических процессах в нервной системе как позвоночных, так и беспозвоночных животных является протеин киназа С (ПКС) (Alkon, 1995; Alkon and Nelson, 1990; Braha et al., 1990). В этой связи мы поставили ряд экспериментов,

направленных на выяснение возможной роли ПКС в изучаемой ВКИП. Было найдено, что добавление в систему протока специфического ингибитора ПКС хлорида хелеретрина в концентрации 5*10"6 М приводит к блокаде ВКИП, ранее выработанной на том же самом препарате. С другой стороны, аппликация специфического активатора ПКС - SC-10 вызывала долговременное увеличение амплитуды ВПСП в командном нейроне, по временной и амплитудной динамике сходной с ВКИП. Так, амплитуда ВПСП через 50 мин. после аппликации SC-10 составляла, в среднем, 106,3+1,3 %, тогда как в контрольной группе (только тестирующие стимулы по нерву) в той же временной точке средняя амплитуда ВПСП была 76,6+3,3 (различия достоверны). Однако, аппликация другого широко известного активатора протеин киназы С - форболового эфира -не приводила к изменениям амплитуды ВПСП в командном нейроне в ответ на стимуляцию интестинального нерва.

Таким образом, наши данные позволяют предположить участие протеинкиназы С в поддержании ВКИП. Единственным противоречащим фактом остается то, что форболовый эфир, один из мощных активаторов ПКС, не вызывал увеличения амплитуды ВПСП в командном нейроне. Однако, как известно из литературных данных, существуют изоформы протеинкиназы С, не зависящие от форболовых эфиров (Marriott and Mason, 1996). Возможно, что именно такие изоформы ПКС и опосредуют, по крайней мере частично, увеличение амплитуды ВПСП в командном нейроне, вызываемое внутриклеточной тетанизацией.

9. Влияние ингибитора NO-синтазы на развитие посттетанической потенциации.

Хотя, как было показано, синаптическая фасилитация у моллюсков может проходить при участии постсинаптической клетки (Bao et al. 1998; Murphy and Glanzman, 1996), экспрессия потенциации, как считается, развивается, в основном, благодаря пресинаптическим механизмам (Bao et al., 1998). Таким образом, предполагается существование некоего способа передачи информации между пре- и постсинаптическими нейронами, например, с помощью обратных посредников. Исходя из этого предположения мы проверили участие одного из широко известных ретроградных мессенджеров - окиси азота - в изучаемой ВКИП. Было найдено, что добавление в проток ингибитора NO-синтазы L-NNA в концентрации 10*4М за 30 мин. до тетанизации блокирует ВКИП, которая ранее вырабатывалась в том же самом препарате. Разница между амплитудами ВПСП в контрольном и тетанизированном нейронах через 70 мин. после тетанизации составляла 35.5 ± 28.3% в контрольной группе и -13.2 ± 9.0% на фоне L-NNA (различия статистически значимы, р < 0.01). При этом L-NNA никак не влияла на посттетаническую гиперполяризацию. Последняя составляла -13.2 ± 3.1 мВ перед добавлением L-NNA и -10.7 ± 3.1 мВ на фоне аппликации ингибитора (различия не достоверны).

Таким образом, полученные результаты указывают на возможное участие окиси азота в генезе ВКИП. Если предположить, что NO выступает здесь в качестве обратного посредника, то это означает, что хотя индукция ВКИП осуществляется пресинаптически, ее долговременное поддержание происходит, по крайней мере частично, благодаря пресинаптическим механизмам.

Однако, возможно и другое объяснение выявленной зависимости ВКИП от NO. Было найдено, что ингибиторы NO-синтазы способны подавлять пластичность соматических ходинэргических рецепторов командных нейронов Helix (Пивоваров и Эхидо-Виллореаль, 1996). Исходя из этого, возможно предположить, что увеличение амплитуды ВПСП в командных нейронах после тетанизации связано с изменением чувствительности рецепторов к медиатору и имеет, таким образом, постсинаптическую природу. Это хорошо согласуется с результатами экспериментов с "искусственным синапсом" -аппликацией АХ на сому нейрона. В этой работе (Малышев и др., 1997) протокол выработки ВКИП был схожим с нашим, однако тестирование производилось путем ионофоретической аппликации ацетилхолина на сому командного нейрона. Выяснилось, что после внутриклеточной тетанизации амплитуда входящих токов, вызванных аппликацией Ах возрастала. Это свидетельствует о том, что внутриклеточная тетанизация может запускать пластические перестройки в изучаемой синаптической связи, имеющие постсинаптическую природу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, на основе полученных результатов и имеющихся данных литературы можно попытаться построить гипотетическую схему механизмов ВКИП. Внутриклеточная тетанизация командного нейрона приводит к деполяризации мембраны (здесь и далее см. рис. 1). Деполяризация мембраны вызывает открытие потенциалзависимых кальциевых каналов и вход кальция внутрь клетки. Применение коротких импульсов тока, по-видимому, более эффективно для удержания кальциевых каналов в открытом

Са - зависимый К1санал

^ I Рецептор к -------^N0}------серотонину Серотонин

Рис.1. Гипотетическая схема механизмов ВКИП. Объяснение в

тексте.

состоянии, т.к. не приводит к их инактивации. Увеличение концентрации внутриклеточного кальция приводит к открытию кальций-зависимых калиевых каналов, выходу калия из клетки и гиперполяризации мембраны. Последнее, видимо, и обуславливает наблюдаемую первую фазу ВКИП. Помимо активации калиевого тока, кальций приводит к активации протеинкиназы С и ее транслокации из цитозольной в мембранносвязаную форму. Можно предположить, что последнее приводит к

фосфорилированию АХ-рецепторов и увеличению их чувствительности. Это объясняет возрастание ответа командного нейрона на аппликацию ацетилхолина после внутриклеточной тетанизации (Малышев и др., 1997). Другим результатом активации протеинкиназы С является запуск механизмов, активирующих ЫО-синтазу, что приводит к формированию свободной окиси азота и ее диффузии до терминален пресинаптического нейрона. Последнее обеспечивает пресинаптические механизмы поддержания ВКИП, в первую очередь такие, как увеличение выброса медиатора. Не совсем ясной остается роль серотонина в формировании ВКИП. Можно предположить, что серотонин оказывает в данном случае некоторые метаболические эффекты, например, такие, как поддержание уровня свободной протеинкиназы С. Тогда становится понятной необходимость наличия серотонина в определенной концентрации в межклеточной жидкости, ведь при низком уровне свободной (но неактивной) ПКС вызванное тетанизацией увеличение концентрации кальция не приведет к вышеописанным изменениям.

Хотя данная схема является в значительной степени гипотетической, она построена на основании полученных экспериментальных данных и может служить для выработки стратегии дальнейших исследований в будущем.

выводы

1. Внутриклеточная высокочастотная тетанизация командных нейронов виноградной улитки вызывает двухфазное (кратковременная и долговременная фазы) увеличение амплитуды ВПСП, вызванных тестирующей стимуляцией интестинального нерва.

2. Кратковременная фаза посттетанической потенциации, по крайней мере частично, обусловлена развивающейся посттетанической гиперполяризацией.

3. Выраженность долговременной фазы потенциации зависит от уровня серотонина в гемолимфе. Этот факт может лежать в основе обнаруженной сезонной зависимости выраженности долговременной фазы ВКИП: вторая фаза потенциации вырабатывается весной и летом но практически не вырабатывается в осенне-зимний период.

4. Увеличение концентрации ионов кальция в командном (т.е. постсинаптическом) нейроне является необходимым и достаточным условием для индукции ВКИП.

5. ВКИП не блокируется ингибиторами цАМФ-зависимой протеинкиназы.

6. Увеличение амплитуды ВПСП в командном нейроне после внутриклеточной тетанизации, по крайней мере частично, происходит вследствие активации протеинкиназы С-зависимого фосфорили-рования.

7. Показано, что окись азота участвует в развитии исследованной ВКИП, предположительно в качестве ретроградного мессенджера.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Тезисы конференций:

1. A. Malyshev, N. Bravarenko. "Dependence of synaptic facilitation postsynaptically induced in snail neurons on season and serotonin level." Abstracts of XXXIII International Congress of Phisiological Sciences, St. Petersburg, 1997, June 30 - July 5, P075.54

2. A. Malyshev. "Role of postsynaptic calcium increase in the long-term facilitation in neurons of Helix lucorum." Abstracts of The 5th East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology "Simpler Nervous Systems", 1997, September 9-12, Moscow, p.46.

3. A. Malyshev "Role of postsynaptic calcium increase in the long-term facilitation in neurons of Helix lucorum". Abstracts of 1998 Forum of European Neuroscience, 27 June - 1 July, Berlin, p.347.

4. А.Ю. Малышев. "Потенциация ответов нейронов Helix зависит от уровня постсинаптического кальция и окиси азота", тезисы конференции молодых ученых по проблемам высшей нервной деятельности, посвященной 90-летию со дня рождения чл.-корр АН и АПН СССР Л.Г. Воронина, Москва, 1998, с. 19.

Статьи:

1. А.Ю. Малышев, Н.И Браваренко, А.С. Пивоваров, П.М. Балабан. "Влияние уровня серотонина на постсинаптически индуцированную потенциацю ответов нейронов улитки", Журн. высш. нервн. деят., 1997, Т. 47, N3, с 553-562.

2. Malyshev A., Bravarenko N., Balaban P. "Dependence of synaptic facilitation postsynaptically induced in snail neurons on season and serotonin level", 1997, Neuroreport, V. 8, pp. 1179-1182.