Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ антиноцицептивного действия некоторых зоотоксинов и их препаратов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Анализ антиноцицептивного действия некоторых зоотоксинов и их препаратов"

РГ 3 ол

/ 2 * * * р 10с.?,

На правах рукописи

ТИНЯКОВА Ольга Павловна

АНАЛИЗ АНТИНОЦИЦЕПТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ НЕКОТОРЫХ ЗООТОКСИНОВ И ИХ ПРЕПАРАТОВ

03.00.13 — физиология человека и животных

А втореферат

диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород 1998

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии человека и животных Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского.

Научный руководитель: д. б. н., проф. Крылов В. Н.

Научный консультант: к. б. н., доц. Парии С. Б.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А. В. Зсвскс доктор медицинских наук Л. Н. Синицыи

Ведущая организация: Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

Защита состоится "/У " ил-я/Тя 1998 г. в /5" часов на заседании диссертационного совета К 063. 11. 13 Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского (603600, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета Автореферат разослан "¿Г " ^¿еЛ^/Ьял ? 1998 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,^ /л/

к. б. н„ доц. ^^^^Л-у 'ТЛЕКСАНДРОВА И. Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Проблема избавления человека от боли остается на сегодняшний день одной из наиболее важных задач медицины. Известен широкий спектр веществ, обладающих болеутоляющей активностью (Машковский, 1994). Однако применение большинства сильнодействующих обезболивающих лекарственных препаратов сопровождается выраженными побочными эффектами. В настоящее время актуальной является разработка лекарственных препаратов, способных оказывать выраженное обезболивающее действие, но лишенных наркотической активности.

В этом плане весьма привлекательными оказались некоторые животные яды, чьи болеутоляющие свойства известны достаточно давно (Павловский, 1955; Орлов, Корнева, 1982). Однако, изменения функциональной активности эндогенных ангиноцицептивных систем под влиянием зоотоксинов полностью не изучены, что ограничивает возможность создания новых эффективных лекарственных средств на основе животных ядов, а также повышает риск развития нежелательных побочных явлений.

Очевидно, что для успешной разработки эффективных лекарственных средств на основе зоотоксинов необходимо чёткое и детальное представление о физиологических механизмах антиноцицептивного действия конкретных животных ядов.

В настоящее время имеются лишь отрывочные сведения, касающиеся некоторых механизмов антиноцицептивного действия ядов среднеазиатской кобры и медоносной пчелы (Орлов, Парин, 1981; Парин, Гола-нов, 1983; Парин, 1985). Работы, направленные на исследование анти-ноцицептивной активности таких нейротропных зоотоксинов, как яды пятнистой саламандры и формозской кобры ранее не проводились.

В значительной степени ограниченность знаний о механизмах болеутоляющей активности зоотоксинов связана с тем, что адекватные представления о физиологических механизмах ноцицептивной чувствительности сформировались лишь в последние два десятилетия. На сегодняшний день известно, что регуляция ноцицептивной чувствительности осуществляется путём взаимодействия эндогенных ноцицептивных и антиноцицептивных систем (эндогенная опиоидная. моноаминергичес-кая, ГАМК-ергическая и др. системы) (Лиманский, 1986: Михайлович, Игнатов, 1990; Брагин, 1992).

В связи с этим в настоящей работе был проведен анализ участия эндогенных антиноцицептивных систем в аналгезии, вызываемой зооток-синами.

Диссертация выполнялась в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры физиологии и биохимии человека и животных ННГУ (№ Госрегистрации 81062913), а также в рамках программы "Университеты России" - биология, проект "Зоотоксины в патофизиологии и медицине".

Цель работы. Выявление и изучение антиноцицептивных свойств ядов животных разных таксономических групп, анализ их антиноцицеп-тивного действия и экспериментальное обоснование возможности создания на их основе лекарственных средств с болеутоляющей активностью.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать наличие антиноцицептивных свойств у ядов животных разных таксономических групп: рептилий, земноводных, членистоногих и выявить наиболее перспективные для создания лекарственных средств яды.

2. Провести анализ механизмов (ГАМК-ергических, моноаминерги-ческих, опиатных) антиноцицептивного действия ядов формозской кобры (Naja naja atra), пятнистой саламандры (Salamandra salamandra) и медоносной пчелы (Apis mellifera).

3. Исследовать антиноцицептивную и противовоспалительную активность некоторых лекарственных и фармакологических препаратов, разработанных на основе исследуемых зоотоксинов.

Новизна научных исследований. В работе впервые проведён системный анализ антиноцицептивных свойств ядов животных раз-

ных таксономических групп (членистоногих, амфибий, рептилий), а также исследована антиноцицептивная активность пчелиного яда и его препарата солапивен при хроническом применении.

На основании проведенных исследований установлено наличие специфического и неспецифического компонентов в антиноцицептивном эффекте ядов медоносной пчелы, формозской кобры и пятнистой саламандры; доказано, что общим для реализации антиноцицептивных эффектов всех исследуемых зоотоксинов является активация эндогенной опиоидной системы. Установлено, что специфический компонент анти-ноцицептивного действия яда пятнистой саламандры связан с изменением функциональной активности ГАМК-бенздиазепинового рецепторно-ионофорного комплекса, тогда как антиноцицептивное действие ядов формозской кобры и медоносной пчелы реализуется через активацию моноаминергической антиноцицептивной системы.

Проведенные эксперименты показали, что мазь, содержащая яд формозской кобры, оказывает выраженное антиноцицептивное и противовоспалительное действие.

Научно-практическая ценность работы

Выявленные антиноцицептивные и противовоспалительные свойства исследованных зоотоксинов, а также изучение механизмов их реализации позволяют утверждать, что яды медоносной пчелы, формозской кобры и пятнистой саламандры являются перспективной основой для создания целого ряда новых болеутоляющих лекарственных средств. Проведенные исследования послужили основой для разработки нового лекарственного препарата с противовоспалительной активностью - мази, содержащей яд формозской кобры. Выяснение физиологических механизмов, через которые опосредуются антиноцицептивные эффекты зоотоксинов, необходимо для успешного использования их в лечебных целях, а также для эффективного купирования явлений интоксикации животными ядами.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

Токсины животных разных систематических групп (членистоногие, земноводные, пресмыкающиеся) при болюсном и хроническом парентеральном введении животным оказывают выраженное антиноцицептивное действие. Аналгезия, инду цируемая всеми указанными токсинами связана с активацией эндогенной опиоидной системы. Специфичным

з

для механизма антиноцицептивного действия яда саламандры является изменение функциональной активности ГАМК-ергической системы, а для ядов пчелы и кобры - моноаминергической системы. Мазь, содержащая яд формозской кобры обладает мощным антиноцицептивным, противовоспалительным и противоотечным действием.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на VII Всероссийском съезде неврологов (г. Нижний Новгород, 1995), на Второй Нижегородской сессии молодых ученых (г. Нижний Новгород. 1997), на заседании кафедры физиологии и биохимии человека и животных ННГУ ( 1996).

Структура и объём работы

Материалы диссертации изложены на$£границах машинописного текста, иллюстрирована 39 таблицами, 5 рисунками: состоит из введения, обзора литературы, характеристики методов исследования, четырех глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 227 источников, из которых 155 на русском и 72 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были проведены на 578 белых беспородных крысах и 335 мышах обоего пола. Общее распределение животных по сериям экспериментов представлено в табл. 1.

Таблица I

Количество, видовой состав и распределение животных по сериям экспериментов

Этапы исследования Виды Используемый тест Кол-во

животных животных

1 7 3 4

1. Исследование анти- мыши "горячей пластины" 181

ноцицептивного дейст- крысы "горячей пластины" 64

вия пчелиного яда и крысы "отведения хвоста" 21

солапивена.

2. Исследование анти- мыши "отведения хвоста" 82

ноцицептивного дейст- мыши "горячей гиастины" 24

вия яда формозской крысы "отведения хвоста" 177

кобры.

1 2 3 4

3. Исследование анти- МЫШИ "горячей пластины" 48

нощщептивного дейст- крысы "отведения хвоста" 178

вия яда пятнистом

саламандры

4. Исследование мазе-

вых форм препаратов,

содержащих: 12

— яд пчелы крысы "отведения хвоста"

крысы "сморщивания кожи спины" 12

— яд формозской коб- крысы "отведения хвоста" 54

ры крысы "сморщивания кожи спины" 24

— яд саламандры крысы "отведешм хвоста" 12

крысы "сморщивания кожи шипы" 12

5. Исследование проти- крысы модель асептического 12

вовоспалителы 1 ых воспалеш«

свойств мази, содержащей яд формозской кобры

Итого: мыши - - 335; крысы - — 578. Всего: 913 животных

В работе использовали приготовленные ех 1етрогае растворы токсинов медоносной пчелы (в дозах от 0,1 мг/кг до 15 мг/кг), формозской кобры (в дозах от 0,01 мг/кг до 0,5 мг/кг) и пятнистой саламандры (от 0,1 мг/кг до 10,0 мг/кг). Кроме того, использовали инъекционный препарат солапивен, представляющий собой 0,06% раствор нативного пчелиного яда, а также входящий в состав пчелиного яда полипептид - ме-литтин (2,5 мг/кг). Животные контрольных групп получали физиологический раствор.

При исследовании мазевых форм препаратов на основе зоотоксинов использовали разработанную на кафедре физиологии и биохимии человека и животных ННГУ и промышленно выпускаемую мазь "Унгапивен" на основе пчелиного яда, а также опытные образцы мазей, содержащих яды кобры (0,02%, 0,06% и 0,1 %) и саламандры (0.1 %). Животным контрольной группы наносили на кожу водорастворимую мазевую основу - полиэтиленоксид (ПЭО).

При проведении фармакологического анализа механизмов антино-цицептивного действия зоотоксинов использовали следующие препараты: агонист опиатных рецепторов - морфин, антагонист опиатных реце-

5

пторов - налоксон, смешанный агонист/антагонист опиатных рецепторов - налорфин, преимущественный антагонист дофаминовых рецепторов -галопервдол, неспецифический антагонист адренергических и дофами-нергических рецепторов - аминазин, антагонист (3-адренорецепторов -пропранолол, агонист бенздиазепиновых рецепторов - реланиум, структурный аналог ГАМК - натрия оксибутират, а также неспецифический деплетор депо катехоламинов - резерпин.

Дозы и сроки введения препаратов подбирались с учетом литературных и собственных экспериментальных данных. Все растворы ядов и препаратов вводились внутрибрюшинно. Мазевые формы исследуемых зоотоксинов наносились на предварительно депилированный участок кожи спины животных (с1 = 1,5 см) стеклянным шпателем.

Мази наносились крысам ежедневно в течении 8 дней, тестирование проводилось дважды в день - до нанесения мази (предварительный замер) и спустя 90 минут после намазывания. На 9-й день намазывание прекратили, тестирование продолжали ещё 5 дней.

Исследование ноцицептивной чувствительности у животных проводились с использованием стандартных поведенческих методик: "теста отведения хвоста" и '"теста горячей пластины" (Гацура, 1974; Брагин, 1991). Для оценки местного действия мазей, содержащих зоотоксины, дополнительно оценивали латентный период реакции "сморщивания" кожи спины у крыс.

Тест "горячей пластины".

Животное помещали на металлическую пластину, предварительно нагретую до 57-58/)°С, температура поверхности пластины регулировалась термостатом. При помощи секундомера регистрировали время от момента помещения животного на пластину, до момента первого облизывания задних лап, которое и составляло латентный период реакции облизывания лап (ЛП РОЛ). Время максимально допустимой тепловой экспозиции не превышало 30 с.

В опытах с хроническим применением солапивена дополнительно использовали принцип угашения условного рефлекса активного избегания (УРАИ), для этого животное дополнительно помещали на холодную пластину на 45-60 секунд до либо после каждого тестирования.

Тест "отведения хвоста".

Тест основан на рефлекторной реакции отведения хвоста в ответ на нанесение болевого термического стимула в области верхней трети хвоста. Установка представляет собой полый футляр, внутри которого по-

мещен источник теплового излучения, позволяющий получить сфокусированный световой поток. Световое пятно (d=6 мм) совпадало с отверстием на верхней поверхности футляра. Температура в фокусе светового пятна устанавливалась на значениях, вызывающих у контрольных животных четкую аверсивную реакцию отведения хвоста с латентным периодом около 8 с. (83-85,ОС) (Гацура, 1974). Животное фиксировали на операционном поле футляра и на каретке подводили к области светового пятна, при помощи секундомера оценивали латентный период реакции отведения хвоста (ЛП РОХ).

Тест "сморщивания кожи спины".

Данный тест используется для оценки местного антиноцицептивного действия веществ и является модификацией теста отведения хвоста.

В качестве ноцицептивного раздражителя использовали сфокусированный пучок света (d = 8 мм) от лампы накаливания (150 Вт). Лампа снабжена полусферическим зеркалом-рефлектором и устройством, позволяющим точно фиксировать расстояние от лампы до поверхности кожи. Световой термический стимул наносился на предварительно де-пилированный участок кожи спины животного, на который и наносили мази, содержащие зоотоксины.

Антиноцицептнвный эффект оценивался в процентах от значений контрольной группы животных, принимаемых за 100 %. Противовоспалительные свойства мази, содержащей яд формозской кобры изучали на модели асептического воспаления. Развитие острого воспалительного отёка вызывали субплантарным введением в заднюю лапу крысы 10 % водной взвеси каолина (0,1 мл) (Гацура, 1974).

Величину воспалительного отёка определяли объёмным методом. Измерения проводили до введения провоспалительного агента и в момент максимального развития отёка у контрольных животных (через 4 часа), разница измеренных объёмов и составляла величину отёка. Про-тивоотёчный и противовоспалительный эффекты оценивали в процентах от значений контрольной группы, принимаемых за 100 % (Абрамова, 1954).

Для обработки результатов использовали стандартные методы статистического анализа, достоверность различий между группами оценивали с помощью критерия Вилкоксона-Манна-Уитни для независимых совокупностей (Гублер, Генкин. 1973: Ашмарин и др., 1975; Лакин, 1990). Обработку данных осуществляли на IBM РС/АТ-386 с помощью программы STADIA.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследование антиноцицелтивного действия яда медоносной пчелы проводилось на мышах и крысах с использованием теста "горячей пластины" и теста "отведения хвоста". Внутрибрюшинное введение мышам раствора нативного пчелиного яда в дозах 0,1; 0,5; 1,0 и 5,0 мг/кг вызывало у них дозозависимое увеличение латентного периода реакции облизывания лап, что сви детельствует о наличии у апиток-сина выраженной антиноцицептивной активности.

Наиболее стабильный антиноцицептивный эффект у мышей наблюдался при введении им пчелиного яда в дозе 1,0 мг/кг. Латентный период реакции облизывания лап у мышей достоверно увеличивался уже через 15 минут после введения апитоксина и поддерживался на уровне 163-193 % от контрольных значений в течении 2-х часов, после чего наблюдалось постепенное ослабление антиноцицептивного эффекта яда.

При введении пчелиного яда в дозе 5,0 мг/кг у мышей, наряду с выраженным антиноцицептивным эффектом, наблюдались явления интоксикации (резкое угнетение двигательной активности, тремор, судороги), так как указанная доза апитоксина близка к полулетальной (1ЛЭ50 = 6,8 мг/кг). В связи с этим, в дальнейших экспериментах пчелиный яд использовался в дозах, не превышающих 1,0 мг/кг.

Таблица 2

Изменение латентного периода реакции облизывания лап (ЛП РОЛ) у мышей при введении различных доз пчелиного яда

Время после введения яда Контроль (физ. р-р) Пчелиный яд (1,0 мг/кг) Пчелиный яд (5,0 мг/кг)

минуты ЛП, сек. ЛП, сек. % к контр. ЛП. сек. % к контр.

15 8,4 13,7* 163,1 19,5* 232,1

30 7,4 13,3* 179,7 16,1* 217,6

45 7,2 12,1* 168,1 15,4* 213,9

60 5,5 10,6* 192,7 13,1* 238,2

90 8,9 10,2 114,6 15,8* 177,5

120 8,2 13,8* 168,3 14,6 178,0

150 8,1 11,5 141,9 12,8 158,0

180 9,4 10,5 111,7 10,5 111,7

Примечание: (*) - р< 0,05 по сравнению с контрольной группой животных.

При сравнении антиноцицептивных свойств нативного пчелиного яда и препарата солапивен выяснилось, что солапивен при болюсном внутрибрюшинном введении мышам не уступает по антиноцицептивной активности раствору нативного пчелиного яда, приготовленному ех (етрогае. Выяснилось также, что динамика ноцицептивной чувствительности у животных, получавших внутрибрюшинно пчелиный яд и солапивен в дозах по 1,0 мг/кг носит фазный характер с максимумами антиноцицепции на 15 и 90-120 минутах после введения яда.

При исследовании динамики ноцицептивной чувствительности у мышей, подвергавшихся хроническому воздействию солапивеном (0,1 мг/кг/сут в течение 12 дней), выяснилось, что апитоксин вызывает увеличение латентного периода реакции облизывания лап у животных. Однако этот эффект был неустойчив во времени, длительность латентного периода аверсивной реакции у мышей в опытной группе испытывала существенные колебания (от 6,2 до 12,0 с. ) и достоверно превышала контрольные показатели лишь на 4 и 7-9 сутки эксперимента (114.3157,1 % от контроля).

Вместе с тем, в ходе эксперимента с 1 по 11 день наблюдалось заметное укорочение латентного периода реакции облизывания лап (с 10,0 до 6,3 с.) у животных контрольной группы, что мы склонны связывать с выработкой у них условного рефлекса активного избегания при многократном предъявлении аверсивного стимула. Реализация этого рефлекса у животных опытной группы, подвергавшихся хроническому воздействию солапивеном, способна маскировать проявления антиноцицептив-ного эффекта последнего, тем более, что данные И. Н. Николаева (1995) указывают на способность пчелиного яда облегчать выработку условных рефлексов у грызунов.

С целью проверки этого предположения была проведена следующая серия экспериментов, при проведении которой в стандартную методик}' тестирования ноцицептивной чувствительности был введен элемент угашения условного рефлекса.

В результате выяснилось, что антиноцицептивный эффект яда у животных, подвергавшихся угашению условного рефлекса активного избегания, проявлялся сильнее и был более стабильным во времени, что подтверждает выдвинутое предположение.

Известно, что антиноцицептивный эффект пчелиного яда связан с активацией эндогенной опиоидной системы (Парин, 1983). Однако, налоксон не отменял полностью антиноцицептивное действие апитокси-

на, что свидетельствует о более сложном механизме антиноцицепции, вызываемой ядом.

Введение крысам мелиттина (основного пептидного компонента пчелиного яда) в дозе 2,5 мг/кг вызывало у них достоверное увеличение латентного периода реакции отведения хвоста, в течение 3-х часов после введения токсина поддерживавшегося на уровне 138,4-177,9 % от контроля. Предварительное введение налоксона достоверно не ослабляло антиноцицептивного эффекта мелиттина, что указывает на реализацию этого эффекта через опиат-независимые механизмы. Возможно, в реализации антиноцицептивного действия мелиттина и цельного яда принимают участие моноаминергические антиноцицептивные механизмы.

Для проверки этого предположения хронические (в течение 12 дней) инфузии солапивена мышам проводили на фоне постепенного истощения эндогенных депо моноаминов резерпином (12 дней по 2,5 мг/кг/сут). В результате выяснилось, что резерпинизация животных на 3-6 сутки эксперимента значительно усиливает антиноцицептивное действие апи-токсина, а в дальнейшем, на 7-8 сутки, ослабляет антиноцицептивный эффект яда. Результаты тестирования, полученные на 9-12 сутки эксперимента, были неоднозначными, так как на проявление поведенческих реакций животных сильное влияние оказывало патологическое действие резерпина (угнетение двигательной активности, мышечная гипотония, тремор), связанное с полным угнетением центральных моноаминергиче-ских механизмов.

По-видимому, начальное потенциирование антиноцицептивного эффекта апитоксина резерпином связано с устранением тормозного влияния периферических моноаминергических систем, участвующих в проведении ноцицептивной информации, тогда как дальнейшее ослабление антиноцицептивного действия яда обусловлено угнетением центральных моноаминергических, в том числе и антиноцицептивных механизмов, под действием резерпина.

Вместе с тем, хроническое введение (3-адреноблокатора пропраноло-ла (1,0 мг/кг/сут) совместно с солапивеном достоверно не сказывалось на выраженности антиноцицептивного эффекта апитоксина.

Полученные данные свидетельствуют о том, что моноаминергичес-кая система вносит существенный вклад в формирование антиноцицепции под действием апитоксина.

Изучение механизмов антиноцицептнвного действия яда пятнистой саламандры проводилось на мышах и крысах с использованием тестов "отведения хвоста" и "горячей пластины".

Введение яда саламандры (0,1; 1,0: 10,0 мг/кг) крысам вызывало у них выраженный антиноцицептивный эффект, проявлявшийся уже через 45 минут после введения токсина. Максимальное увеличение латентного периода реакции отведения хвоста у крыс (201,8% от контрольных значений) наблюдалось при введении им яда саламандры в дозе 10,0 мг/кг. Причем, латентный период реакции отведения хвоста у животных этой группы оставался достоверно повышенным (135,1 % от контрольных значений) даже через 24 часа после введения зоотоксина (табл. 3).

Сходные, в целом, результаты были получены и при исследовании антиноцицептивного эффекта яда саламандры у мышей.

При проведении фармакологического анализа возможных механизмов антиноцицептивного эффекта яда саламандры выяснилось, что при совместном введении яда саламандры с морфином (3,0 мг/кг) длительность латентного периода реакции отведения хвоста у крыс достоверно увеличивалась, по сравнению с длительностью латентного периода у животных, получавших только яд саламандры и только морфин.

Вместе с тем, налоксон (1,0 мг/кг), практически, полностью отменял вызываемую ядом аналгезию в тесте "отведения хвоста" у крыс и значительно ослаблял её в тесте "горячей пластины" у мышей. Полученные данные указывают на то, что в реализации антиноцицептивного эффекта яда как на спинальном, так и на супраспинальном уровне, существенную роль играет активация эндогенной опиоидной системы.

При исследовании вклада моноаминергических механизмов в формирование антиноцицепции под действием яда саламандры выяснилось, что дофамин (0,1 мг/кг) и галоперидол (0,1 мг/кг) не влияют, а пропра-нолол (2,0 мг/кг) ослабляет выраженность антиноцицептивного действия яда саламандры.

Принимая во внимание литературные данные (Гелашвили и др., 1986, 1987) о структурном сходстве алкалоидов яда саламандры с некоторыми лигандами бенздиазепиновых рецепторов (БД-Р), мы исследовали степень участия ГАМК-ергической системы в антиноцицептивном эффекте яда саламандры.

Таблица 3

Влияние яда пятнистой саламандры на изменение латентного периода реакции отведения хвоста у крыс

Время после введения яда Кон-роль (фго. Р-Р) Яд саламандры 0,1 мг/кг Яд саламандры 1,0 мг/кг Яд саламандры 10,0 мг/кг

МИН. Jin, сек. ЛИ, сек. % к контр. ЛП, сек. %к контр. ЛП, сек. %к контр.

15 8,4 8,6 102,4 8,6 102,4 9,4 111,9

30 8,7 9,3 106,9 8,2 94,3 11,3 129,9

45 6,7 10,3* 153,7 7,8* 116,4 !Т,6* 173,1

60 7,2 9,6* 133.3 8,5 118.1 10,1* 140,3

90 5,6 7,7* 137,5 7,7* 137,5 11,3* 201,8

120 7,3 8,2 112,3 7,9 108,2 7.9 108.2

150 6,9 6,6 95,7 8.3 120,3 8,4 121,7

180 7,7 7,7 100,0 6,6 85,7 7,8 101,3

24 часа 7,4 6,5 87,8 7,3 98,6 10,0* 135,1

Примечание: (*) - р< 0,05 при сравнении ЛП в опытной и контрольной группах.

Агонист ГАМКВ-рецепторов баклофен (1,5 мг/кг) при совместном введении с ядом не вызывал достоверных изменений антиноцицептив-ного действия последнего, тогда как введение аналога ГАМК - натрия оксибутирата - в дозе 300, 0 мг/кг совместно с ядом саламандры приводило к достоверному усилению аналгетического эффекта токсина в тесте "отведения хвоста".

С другой стороны, агонист БД-рецепторов - реланиум (0,3 мг/кг) достоверно ослаблял антиноцицептивный эффект яда саламандры как в тесте "отведения хвоста" у крыс, так и в тесте "горячей пластины" у мышей.

Полученные данные позволяют заключить, что в реализации антино-цицептивного эффекта яда саламандры существенную роль играет изменение функциональной активности ГАМК-ергической системы под влиянием некоторых алкалоидов яда. Причем, алкалоиды яда саламандры могут выступать в роли обратных агонистов бенздиазепиновых рецепторов.

Изучение механизмов антиноцнцсптивного действия яда формозской кобры проводилось на крысах и мышах с использованием теста "отведения хвоста".

Выяснилось, что при внутрибрюшинном введении токсина в дозах 0,05 и 0,1 мг/кг у мышей наблюдается снижение уровня ноцицептивной чувствительности (табл. 4). Однако этот эффект токсина был непродолжительным, и достоверное повышение длительности латентного периода реакции отведения хвоста (130-140 % от контроля) у животных, получавших токсин, регистрировалось лишь с 30-й по 90-ю минуты после введения яда. Введение же яда формозской кобры в дозе 0,5 мг/кг, помимо антиноцицептивного эффекта, зачастую оказывало токсическое действие и приводило к гибели части экспериментальных животных.

Аналогичные результаты были получены в экспериментах на крысах: яд формозской кобры в интервале доз от 0,01 до 0,1 мг/кг (в/б) вызывал достоверное увеличение латентного периода реакции отведения хвоста у крыс, причем, максимальная выраженность антиноцицептивного эффекта наблюдалась у животных, получавших токсин в дозе 0,1 мг/кг.

При исследовании участия эндогенной опиоидной системы в реализации антиноцицептивного действия яда формозской кобры выяснилось, что введение налоксона совместно с ядом приводило к достоверному укорочению латентного периода аверсивной реакции, по сравнению с длительностью латентного периода реакции отведения хвоста у животных, получавших только яд, однако не отменяло аналгетического эффекта токсина полностью. Вместе с тем, совместное с ядом введение нало-рфина достоверно не влияло на увеличение длительности латентного периода реакции отведения хвоста, вызванное ядом кобры.

Это указывает на то, что в реализации антиноцицептивного эффекта яда формозской кобры, наряду с эндогенной опиоидной системой, принимают участие и другие антиноцицептивные механизмы.

Исследование моноаминергических механизмов, опосредующих ан-тиноцицептивное действие яда формозской кобры, проводилось с использованием пропранолола, галопервдола, аминазина и резерпина.

В результате выяснилось, что блокатор Р-адренорецепторов пропра-нолол отменял антиноцицептивный эффект лишь в течение первых 30 минут после введения токсина, не влияя на выраженность антиноцицеп-ции в последующие 2 часа эксперимента. Блокатор дофаминовых рецепторов галоперидол препятствовал развитию аналгезии, вызываемой

токсином, практически, на протяжении всего эксперимента, тогда как введение блокатора преимущественно а-адренорецепторов аминазина не изменяло длительности латентного периода реакции отведения хвоста, по сравнению с животными, получавшими только яд.

Таблица 4

Влияние яда формозской кобры на латентный период реакции отведения хвоста (ЛП РОХ) у мышей

Время Яд формозской кобры (0,05 мг/кг) Яд формозской кобры (0,1 мг/кг)

мин. контроль (физ. р-р) ЛП, сек. % к конт. кошроль (физ. р-р) ЛП, сек. % к конт.

5 7,8 8,0 102,6 3,2 2,8 87,5

15 6,9 8,2* 118,8 2,8 3,0 107,1

30 7,0 8,5* 121,4 2,8 3,8* 135,7

45 7,0 7,3 104,3 3,0 4,2* 140,0

60 7,0 7,0 100,0 3,2 3,9* 121,9

90 7,0 6,9 98,6 2,9 3,8* 131,0

120 7,0 7,4 105,6 3,2 4,2 131,3

Примечание: (*) - р < 0, 05 по сравнению с контрольной группой животных.

Истощение эндогенных депо катехоламинов резерпином существенно не сказывалось на выраженности ангиноцицептивного эффекта данного яда.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что в реализации антиноцицептивного эффекта яда формозской кобры принимают участие опиовдные и моноаминергические механизмы, активация которых определяется, вероятно, сложным, многокомпонентным составом яда.

Исследование антиноцицептивной и противовоспалительной активности мазевых препаратов, содержащих зоотоксины.

Хроническое нанесение на кожу мазей, содержащих яд формозской кобры в концентрации 0,02 % и 0,06 % вызывало достаточно сильный, но неустойчивый во времени антиноцицептивный эффект, проявлявшийся достоверным увеличением латентных периодов реакции отведения хвоста у крыс на 1-е, 2-е, 8-е и 11-е сутки эксперимента. Вместе с тем, при использовании мази, содержащей яд формозской кобры в кон-

центрации 0,1 %, у крыс развивался стойкий антиноцицептивный эффект, стабильно проявлявшийся увеличением латентного периода реакции отведения хвоста с 1-х по 11-е сутки эксперимента, причем, антиноцицептивный эффект мази сохранялся у животных в течение 24 часов после намазывания. Более того, этот эффект мази, содержащей яд кобры сохранялся по окончании курса процедур (9 дней) в течение ещё нескольких суток.

Выяснилось также, что содержащие яд формозской кобры мази способны оказывать угнетающее действие на местную ноцицептивную чувствительность. Это проявлялось достоверным увеличением латентного периода реакции сморщивания кожи спины при хроническом нанесении мазей на кожу спины крыс. Наиболее выраженный антиноцицептивный эффект, как и в предыдущей серии экспериментов, наблюдался в группе животных которым наносилась мазь, содержащая 0,1 % яда кобры.

При исследовании противовоспалительной и противоотечной активности мази, содержащей 0,2 % яда формозской кобры, на модели асептического каолинового воспаления у крыс, выяснилось, что мазь с ядом кобры препятствует развитию воспалительного отёка у крыс, полностью снимая этот признак воспаления.

Исследование антиноцицептивных свойств мази "Унгапивен", содержащей пчелиный яд, показало, что хроническое её нанесение (в течении 9 дней) на кожу спины вызывает достоверное увеличение латентного периода реакции отведения хвоста у крыс, оцениваемое в тесте "отведения хвоста", на 1-е, 2-е. 6-е, 8-е и 11-е сутки эксперимента.

Местное антиноцицептивное действие мази "Унгапивен", оцениваемое в тесте сморщивания кожи спины, было выражено слабее и проявлялось лишь на 1-2-е и 8-9-е сутки нанесения мази.

При исследовании антиноцицептивных свойств мази, содержащей яд пятнистой саламандры в концентрации 0, 1%, выяснилось, что этот зоотоксин при накожном нанесении не оказывает существенного анти-ноцицептивного действия.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют, что токсины животных разных систематических групп (формозской кобры, пятнистой саламандры, медоносной пчелы), а также препараты, изготовленные на основе ядов пчелы и формозской кобры, при парентеральном введении, а также накожном нанесении мышам и крысам оказывают выраженное антиноцицептивное действие, проявляющееся в тестах "отведения хвоста", "горячей пластины" и "сморщивания кожи спины".

Характерно, что в реализации антиноцицептивного действия всех исследованных зоотоксинов принимает участие эндогенная опиоидная система, активация которой, по-видимому, происходит по неспецифическому пути и обусловлена не избирательным действием каких-либо компонентов яда, а является генерализованной реакцией на введение в организм ксенобиотика. В то же время, наряду с активацией эндогенной опиовдной системы под действием зоотоксинов, наблюдается и специфическая активация других антиноцицептивных систем организма. Так, согласно нашим данным, при введении животным яда саламандры развивающаяся у них гипоалгезия обусловлена не только активацией эндогенной опиоидной системы, но и изменением уровня функциональной активности эндогенной ГАМК-ергической системы. По-видимому, некоторые алкалоиды яда саламандры, являясь обратными агонистами бенз-диазепиновых рецепторов (Гелашвили и др., 1986; 1987), ингибируют тонические тормозные влияния, оказываемые ГАМК-ергической системой на другие антиноцицептивные механизмы (в том числе эндогенную опиоиднугс и моноаминергическую системы).

В отличие от яда саламандры, специфической чертой действия ядов пчелы и кобры является активация моноаминергических антиноцицептивных механизмов. Причем, если эффект яда кобры опосредуется через активацию, в основном, р-адренергических и дофаминергических механизмов, то в формирование гипоалгезии под действием пчелиного яда р-адренергические механизмы, практически, не участвуют.

Кроме того, в отличие от яда саламандры, яды кобры и пчелы обладают выраженным антиноцицептивным действием не только при парентеральном введении, но и при накожном нанесении в виде мази. При этом мазь, содержащая яд формозской кобры, наряду с антиноцицептивным эффектом, оказывает еще и мощное противоотечное действие при развитии асептического воспалительного процесса.

В целом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что зоо-токсины животных разных таксономических групп и препараты на их основе обладают выраженным антиноцицептивным действием и являются перспективными для создания новых лекарственных средств с болеутоляющей активностью.

выводы

1. Яды животных разных таксономических групп (членистоногих -Apis mellifera, земноводных - Salamandra salamandra, пресмыкающихся - Naja naja atra) при болюсном и хроническом парентеральном введении животным оказывают выраженное антиноцицептивное действие.

2. В реализации антиноцицептивного эффекта исследованных зоото-ксннов существенная роль принадлежит эндогенной опиовдной системе, отвечающей за неспецифический компонент аналгезии.

3. Характерной чертой антиноцицептивного действия ядов медоносной пчелы и формозской кобры является активация моноаминергичес-кой антиноцицептивной системы.

4. Специфичным для действия яда саламандры является ингибиро-вание ГАМК-БД-комплекса. вследствие чего устраняется тоническое тормозное влияние, оказываемое ГАМК-ергической системой на другие антиноцицептивные механизмы.

5. Мазь, содержащая яд формозской кобры, обладает антиноцицеп-тивным и противоотечным действием.

6. Выявленные антиноцицептивные и противоотечные свойства исследованных зоотоксинов позволяют утверждать, что яды медоносной пчелы, формозской кобры и пятнистой саламандры являются перспективными для создания целого ряда новых болеутоляющих лекарственных средств.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Парин С. Б., Шилова О. П. Анализ болеутоляющего действия лекарственных препаратов с пчелиным ядом // Материалы III Научно-практической конференции по апитерапии "Апитерапия сегодня": Тезисы докладов. Рыбное, 1994. С. 36-38.

2. Шилова (Тинякова) О. П.. Парин С. Б. К анализу болеутоляющего действия лекарственных препаратов с пчелиным ядом // VII Всероссийский съезд неврологов: Тезисы докладов. Н. Новгород, 1995. С. 36-38.

3. Шилова (Тинякова) О. П.. Новосёлова Е. В., Парин С. Б. Антино-цицептивный эффект яда формозской кобры и мазевого препарата на

его основе // VII Всероссийский съезд неврологов: Тезисы докладов. Н. Новгород, 1995. С. 513.

4. Шилова (Тинякова) О. П., Парин С. Б. Анальгетическая активность яда саламандры и перспективного болеутоляющего средства на его основе // VII Всероссийский съезд неврологов: Тезисы докладов. Н. Новгород, 1995. С. 514.

5. Шилова (Тинякова) О. П., Парин С. Б. Сравнительный анализ ан-тиноцицептивного действия некоторых зоотоксинов // Вестник Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского: Сборник научных трудов аспирантов. Н. Новгород: Изд-во ННГУ, 1995. С. 912.

6. Шилова (Тинякова) О. П., Парин С. Б. Некоторые механизмы болеутоляющего действия яда пятнистой саламандры // Первая конференция герпетологов Поволжья: Тезисы докладов. Тольятти, 1995. С. 59-61.

7. Shilova О. P., Parin S. В., Kiylov V. N. Spécifié pain-appeasing activity of nevv medicinal préparations with bee renom // Apimondia: 34th Internationa! Apicultural Congress / Laussanne, Switzerland, 15-19 aug., 1995 // Bucharest, Apimondia, 1995. P. 400.

8. Тинякова О. П. Изучение механизмов антиноцицептивного действия яда пятнистой саламандры // Вторая Нижегородская сессия молодых учёных: Тезисы докладов. Н. Новгород, 1997. С. 242.

9. Красильникова M. М., Тинякова О. П., Парин С. Б. Чувствительность мышей к пчелиному яду // Апитерапия сегодня (сборник V). Материалы V научно-практической конференции по апитерапии "Пчелы и ваше здоровье" (г. Сочи, 9-12 окт. 1996 г. ): Тезисы докладов. Рыбное, 1997. С. 99-100.

10. Тинякова О. П., Красильникова M. М., Парин С. Б. Роль моноа-минергических систем в обезболивающем действии пчелиного яда // Апитерапия сегодня (сборник V). Материалы V научно-практической конференции по апитерапии "Пчелы и ваше здоровье" (г. Сочи, 9-12 окт. 1996 г. ): Тезисы докладов. Рыбное, 1997. С. 100-101.

11. Тинякова О. П., Парин С. Б. Исследование антиноцицептивного действия препаратов на основе различных зоотоксинов // Экология, здоровье и природопользование. Материалы Российской научно-практической конференции, посвященной 200-летию Саратовской губернии (г. Саратов, 10-11 сентября 1997 г. ): Тезисы докладов секции "Экология и здоровье". Саратов, 1997. С. 105-106.

12. Тинякова О. П., Новоселова Е. В., Парин С. Б. Анализ антиноци-цеитивного эффекта яда формозской кобры // Вестник Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского. Сер. биол. Вып. 1. Нижний Новгород, 1998. С. 98-103.

13. Тинякова О. П., Красильникова М. М. Исследование механизмов антиноцицептивного действия солапивена при хроническом применении // Вестник Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского. Сер. биол. Вып. 1. Нижний Новгород, 1998. С. 103-108.

14. Тинякова О. П.. Парин С. Б., Крылов В. Н. Исследование антиноцицептивного действия яда пятнистой саламандры Salamandra salamandra // Журнал эволюционной биохимии и физиологии (принята к печати).

Подписано в печать 13.01.98. Формат 60x84 1/16. Бумага писчая. Печать офсетная. Усл. печ. 1,2. Заказ 20. Тираж 100.

Типография ННГУ. Н. Новгород, ул. Б. Покровская, 37.