Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Амилоид бета как апобелок липопротеинов высокой плотности 3 и очень высокой плотности

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Амилоид бета как апобелок липопротеинов высокой плотности 3 и очень высокой плотности"

/Г

кххдмхии унивррситг/г дружбы народом

н| Б од : :

. I . % На гюанах рукописи

УДК 61282+616.00131+577.112115

КУДИНОВ Алексей Рудольфокич

АМИЛОИД БЕТА КАК А1КШЮК ЛИПОИЮ'ШН ЮН ПЫШКОЙ НЛОТНОСГИ 3 и ОЧЕНЬ ВЫШКОЙ

шкупюсли

( Оюциалыюсгь 03.0001- - Биохимия )

лтчжш'лт •

диссертации на гойскание учёной степени , Кандидата Ьиолотческих наук

МОСКВА 19Й

Работа выполнена в лаборатории нсйрохимии Научного Нсп^и Психического Здоровья РАМН.

Научный руководитель: доктор биод. наук I'. III. Пузаста

Официальный оппоненты: чл-кода РАМП, локтор медицинских наук, щюфсогдр Ианчснко Л.Ф.

доктор биологических наук, п|Юфеосор Шишкин С(1

Иодушая оргатдаиия: Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАИ • *

Зашита литацлании состоится "___1995 года в _часов на

заседании диа^ртацношюто совета Д 05.12202 при Российском Университете Дружбы народов по адресу: 117198 Москва, ул Миклухо-Маклая, д. 8, Медицинский Факультет.

С днссерташкй мож1Ю' ознакомиться в научной библиотеке Роалйского Унипе|>снтета Дружбы 1иродов по адресу: 117198 Москва, уд. Миклухо-Маклая, д. 6. • .

Автореферат разослан "В" Юг года

Учёный сек|*ггарь сданиалтщюванного совета локгор медицинских наук

нрифестр ИЗ. Торбек

ОЫЦЛ11 ХАРАКТЕРИСТИКА 1'ЛЮТЫ Лк 1\И11,1ИХ-.11. Проблемы. I) |ЮГ„№:1НСС и(*!мя И С011|Х!чешЮЙ биохимии Иа|ИСГаеГ нпи'|)1ч: к П|**>.II-м<■ амидоидо.Ю|1, пол которыми понимают большую группу клинически и биохимически |шн<х)б|шных патологических шлоипий, \ац1кп'|>и1.\к)|Ш|Х(.11 отложением и тканях. и оршнах пс|ШЛ1юри\1ЫХ Тибриллн|>и14х белкоп. Особое место и этой группе патологий ахтаплшог бегп-ами.юидши мозга, н|х:д<:таш1нюпше мо|>фо биохимическую основу КЛИНИЧШчОИ КАЛИНЫ (¡еНИЛЫЮИ, П|ХХ'.НШ1ДЫЮН (1к).|еЛ1Ь ЛлЫ|т1Ме|)и. Г>.\) де.мешши и г.и11.||*)ма Дауна (Щ), имеющие «лонной субьедишшей амилоидных отложении белок Амилоид бета (Л/Л .Образование фибрилл С<ма амилоида и

|«злнчпых (лр>кту|ях мозга больных Т|*;х вышеуказанных патологий (дален:— больных) было доказано :шжг|х>н110мик|хг.к0пическнми, гистохимическими, ичм.мюмц^южличижими и биохимическими методами исследования, а и 1992 тду А(3 бил найден п "расткршой" конфцпиции ( р.\(3 ) н плазме и

снишюмол-ошй жидкости (СМЖ) болыплх и здоровых людей, а также в кулыу|)алы|01| цх:де ряда клеточных линий, что «вилось основанием заключить: (г\(3— нормальный и обязательный бел(ж циашима. Однако, пощом о механизмах пато.'кнпческок) изменении "|)астно|)ИМоН" конфо| лишни рА/3 и емх) фиб|хыло№1сзо. о причинах I юзн и ш )нени я ' /} а м илоидоза мозга ири но| шальном

стцчши и Солезнн, о и.йцшелшехли поражении мозга и о тхжнтшях /Замилеигкш для ¡¡тип организма, далеки от глиего |ш|х;шения. Оеюбешю

актуальным в наследовании бета амижниозов п|хисга|иш<м(.я пощхх: о поддержании р\/3 н |К1Створимон конерормации. Иыяшгснне механизмов этого щюнесса позволило См выявить факто|)Ы, он|х:деляющие фибриллогеиез А/3 при

патологии. Эго позволило бы подойти к |>а:1|иботке патогенетически обоснованной диагностике, и|)0ф^1иктике и тцшии /Замилоидозоя и имело бы

. фунламешалыкх! значение в понимании механизмов поддержания , 1чхк:г|и|кл1*:н1кж структур белковых молекул. С этих позиций важно обнаружит«. тй мак)хшхг£кули плазмы и СМЖ, которые взаимодействуют с рА/3. Цель и ,>а шчн ислчемонанцн: Целью настоящей [йботы являете® 1. вышлет«: механизмов поддержания *|встйорим<»й" кои формации рА/3 в плазме кропи

здоровых донорон И ныяшкшис факторов, ощхгделяюших этот процесс;. 2 выяндаеие возможных сайтов системного синтеза рЛ/З^в организме человека.

И тответсгвии с этим были посташгены следующие задачи: I Выявить белки плазмы кропи и СДТЖ здоровых людей, взаимодействующих с рА(3; 2. Изучить возможность аешииации рА/3 с липшцютсинами плазмы крови здоровых людей; 3.

Г •

Пи.НМОГСНЬ НШМОЖШХЛТ, Г.ННГС.Ю рАД ИЧКГГМ'ИЧ.КИМП КЛИКаМИ II мокмс кулылрм к.нчок ггпатоб. шломы человека HepG2 и ii|xiaiia.Tiuii|xiiiaii. ;к .mill will но iiiioni, i.iHii<:.iit|xiiiainiom p\ß r. лр.мими шк^шшгкл.пма liai чи;1Л__и<1Ш!,«1ы; It рабок: впервые пока.ино шаичолешлиие р\(3 i.

aiio.iiinoii|x)ieiiiia\iif J п Л-| и илалме к|х>ви и (Л1Ж .uo|x>iiu\ ложцхш и ни.попав» |х).п. липощхггеиноп ii.ia.iMii к|хиш как шг.темы rjiíuu.iiojua р\/3 и ниркушшш. Аилишния р.\0 г. .11111113 n JlilOlill. лока.мнная прямым ()ii|»Mi'.i('iiiii'M M - KD1 и « ми)11 аминокпг. ки ной П'н-.гловачелмкхггп. m vitro жеиеримешачи г. 6iioriiiiii.'iii|x>isaiiiiUM пииетчи.кич аналотм \ß и

\.Т1Л|ШЛр\К1\рПО MCIO IOM IIMMMIO- >ЛеМ|Х>||||ОЙ ЧИК|ХХ:КОПИН. ЯВИ.КХ.1, (XIIOIUlllllI'M

(.'iiiraiii р\/3 минорным аполипощюгешюм >ш\ клаит .411. К]»>че гот в

неримешах in vitro была нока.ипа важность лшпимой фа.н.1 .'Il II ill Л и JlilOlill. и и часпкхти (]хх фолишиов. и ишиГнржпшн фибриллоткоа \Aß.

Па.челование ii|x),i\Kiuiii р\/3 к\льт\|х>и п-папгичкич клеток впервые обнаружило em (i'K|x;niiK) п iri hi клегочнон ик.тече n ai ичите. iuiom .K(iiinciii|>aiiiiii и ихлаве не.1|х:лы,\ лиио|х>тошоп il ашщпаини r. aiio.Hiiioii|xii(4iiiaMii J и A I.

ll|KiKiii4i4.Kan ;nia4iiMi>:ri. работы: 11|Х)пелёниыс ипледопапия ikui».im.iii впервые покпдгпг I. Au/milamm) рА/3 г. аполинощхггашами J и /VI и ii.rn.iMo криш и (ЛГ/К* а.10|Х)ш.|\ ,|К).|гц; 2 Лгяжиацик) р\/3 Сета г. JII 11)11.') и JlilOlill и в.шче К|хши ;цо|х)ш,|\ .кинцюн, Я Ишиюлействио рЛ/3 с. аиолинощхжшнами J и Л-1 в

ихлаве J II ПИ 13 и JlilOlill H.KUMM кропи: -t. Ипшбн^танип фнб^п.кнене.и ишкчп'нч.ких аналогии р.\0 дещхпеитмированними |х"к01клр\и|х>ваиш.1чи JII ШИЛ и .11 If)1 ill и фог-фолипилачи: Я Секрншю р\0 п значнтстлыюи коннеп пинии miaiiiMci кичи клетками d ftrrrane вновь синтезируемых ЛИ и в ашжнанин i: AnoJ и AiioVl, что можег быть ur.no.monillo для пшагпия .iijx4iai4\nmm,i\ ко.шчилп р\0.

1. I! плазме K|xiHii и СМЖ * ;iiojXiiii,i\ люден р\/3 ашжшцюгсш 11|х?||м.мц(ч:пхчшо с aiio.imioiifxjiсипами J н Л-1.

2. Ilpiiixua иешмолптшя p\f¡ с выше>казапиымси аиолиповротешгачи цилтнаи: ионная ллп Дно J и гилрофобпая лля АпоЛ-1.

Par i порти,in амилопл бега яатяетгд аиоболкоч лшюлротеинов вышкой IIлопкх'.ги .'i ( .11 llil 13 ) ii Л111|0|Х)Т(Ч1П0Н O'ICIHi вышкой плппнхли ( JIIIOIÎII ) п.та.ши к|хшп .1ло|хты\ лонцхт.

2

I. Наимо |ейстние |>\/3 с Aiioj и AnoAl н 11.1a.1ue k|x>dii |x'a.im\eien н ихтане iti,nne.\Ka.iaiiHUX .iiiiii)ii|»iii'iiiiiiit.

Г). . Inini шаи фа.и . II!l!lKt и JlllOlill. п п частности «Jkm:<Jk>.:iiiiiiiii.i. iinmimp.Moi фибрнл.hhvikm \(j и iKciiepiiMcinax in vitro.

(). P\/J |||Ю О lllipv'l' ll И .ШУЧИ И.'ЛЫЮЙ K<IlllU'irri ЫНИИ K.V. II,T.V|X)II ГОНаТИЧесКИХ клеток iiepG2 как апобелок hc.i|xmi.ix Jill, н ассоциации с AnoJ u АпоА I . Aii|»fiaiiiiii ixiuoii.i: Материалы .ннщгташш докладмналиеь на:

1. 2-Чеп Меж.i\ налипни ежегодной кофс|х;шши, И|ЮНО.шмой Американской Ашишациен I1еп|х>паук. Наншштон, 1993.

2. Меж. ia6o| ш орпоп научной ко||фе|хчтин научного цен ijvi психического a.lo|x>iiLii l'AM|l, «¡ентнбрь, 1991

Межлабцы торном наушом (¡емипа|Х! института молекулярной биолоши РАН. октябре |99|

Стр>К1У|>а и обм'Ч! тиг|папин: Диш'ртапия ахггоиг го ннедення, o6.so|ia лик'|)атуры. жснериментальноп части, |хаулыатон и их обсуждения, включении и huhohhi Она наложена на единицах машинописного текста и

иллнхгфщхмшна 1 таблицами, одной схемой и 17 рисунками. Ьпблио^ифия содержит отечестнениых и Дфубежных источника.

ШДКГЖАИИК I'AIIOTW ЭШ II'MMKI I TAJ 1ЫI АН ЧАСТЬ Плащу к'|х)|;и получали путем нижоскцххткит) иентрифугщхшния цельной

ifa (¿¡щтпо-фадюй колонке Нидак 04 и гельфилыранионной колонке Супе|хш 12/60 н|хях);шли н ИЖХ-системе фи|>мы Waters. Афиниую тцотматоцифто плазмы К|*)Ш1 и (Л1Ж осункхлтшяли на колонках с привитыми к бром-циан актшнфошшнбй Сефа|хис 1U ('Цфмания, QUA) атипичм-кими А0ИО и A012R.

Х|х)маия1афИ'кхкук) ал юаню |х:ли |) кислых и ти:чх)фобных } слонин х. Аффинную «(Хйюго^ыфик) культурлыюй qxMbi клеток HepG2 лроиолили на аффинной колонке с принятыми к С:фарше 111 мон(жлопалыш\1и аитиДiKl Gil)

антителами. J til luta.iMi.i к|хм» выделили методом п|хтю|штшпого удьтрцентри-фупцхшния в 1хгк)(х: фирмы Beckman Ti 50.2 нри 16°С и ско|хх.ти 45 тысяч об/чин и хацжп'ри.юнали •иек1]*жно\шк|)оекопич«кп и иммуноблшоч • с: |хиличными антителамиСГаблина 1). Аликшты синпмцчоскпш А/31-10, биотини-лцюшнного C.jn/|(oNHSi)iioTniioM (11л|<с, QUA), инкуби|Х)пали с плазмой К|Х1Ш1, ныделяли J If I и полученные ф|икнии анали.1|||хжали на наличие меченного пептида.' Для ').н'кт|х)нпой мик-ципсгаши П\1) .'III наносили на ЗМ|х.чпетки,

I

ф|1К(.и|*ш.1и полным |wctix>)x>m фос<|>ог.\шт.тата. и iin.ija.iii.iii|*)iia.iil н :>.'гкт|х>ш|ом ммк| коконе Иейгл при 80kV. I) случае тищшлекцмшщ мик|хг.копии (H-.')M). ОМ |хчпеткн. ног.'н: нанесения на них материала. ;kiCTiiici.in желатином. ннкуби|хта.|и с мопоклональиыми ан ш А/3 amiiie.iaMit(4g8). и iiix.ii'

2 о1мыпок пнкубиртчши с 11]клгипом А, копия цхданшыч г частицами .киота лнам('||*т I и "¡им. ||мм\11011|х)и11ннгапик> pAff и биотип А/31-10 iu .'II!. (1МЖ и |и.1.пппых фраКЦИЙ ку.'11>т.у|»лм10п q*mh клеток HepG2 |1|х)1ЮДИЛН в ,кч итерирующих и натмвнмх условиях г. антителами ii|xmnc Aß. AikiJ. Au»VI. Дно]'« АиоЛ-t. SAA и al аншчичотрписипа.. Аликвоты Jill. фикций культу ралыюй (|х:лы тюгмчеекмх клегок. ллюентов афинной х|Х)матоп>афин и иммупоп1хчш1Ш1Н|х)наш1ме белки анализировали на общий белок и |шделн.ш на Трис./Т|>1шнпо1юм/Ю°о и но.1иак|)иламил11ом пмь лдск^хм^цх'-зсШЛАП с

ногиедуюшнч .)лект|х)пе|хч1(хим белков на НИТроиеллкышные или нолмиипилплен-дифлуоридные ( Йммобнлон I' ) мемб]хшы. Специфическое евлзмгснше выявляли вторичными антителами. конмопцювапимми с не|х>ксида.кн"1

\|хчы. BH.iya.iii.ui нии биотин-А/31-10, мемПцшы йикубтцхшали го

•

(Т|хч1гавили11ом. конькищхминным с не|хжсидазой хрена. Флуо^иммм готовили с ппюлшонанием хемилкминнешчгпюго [хмпмпа фирмы ДюИонт. ОНА. Оп|»'и'.кчше аминокислотной пехле юпа телиюсти инте|Х*:уемыч белковых полос (ху шествии метолом автоматичешвд Эдмажшской девиации на -177А белковом ана.'нмптцх'. Результирующие фенилгилантоижтме 14xnr.1tx1.1HbH: аминокислот апалн.ицхивлн на нолклкпешкм к системе анализаторе феннлпиаптоиповых п|х)йзполных аминокислот I20A (Applied Biosystems, О HAL И in vitro iKciicpiiMoinax 110 спязыпанию Agl-lö с .1П1ЯК1 и ЛИПНИ аликвоты очищенных ЛИ 1шкуб|!|х)вали с биотин-А/ЗИО, после чего каждую ЛИ ф|«акпию нопторно тишали путём ВЖХ-гельфнльтрании и анализировали jia ипкорпо|1аш1ю бнотнновой метки в различные белковые полосы.

k'\.ii)i\|>a клеток. Человеческие клетки генатоб.исгомы HepGZ полученные от американской коллекции культуры клеток, вмдхнцивалн в минимальной среде ДМ1''Д1 г. |()°о фетальной телячей сыво[юткой ( Ф'1'C ) Н|)И 37°С в атмосфер 5%со2 и 93%о2 в культу|илы1ых чашках с площадью поверхности 75спА Метаболически: мочение клеточных белков проводили с течении Г7 ч С 200мкКи [ 'SI-мстионипа (1180 Ки/мМ, ICN, USA) в 7 мл/чашку ДМЕМ, лишешюй MiMiwitiiiia и (»держащей Ю% ФТС, отдиализовапной (I кДа) против буфера, содержащей) 15()мМ NaCl и ЮмМ NaH2P04, рН7ЛФЬС). Липиды же метили 7 ч имкорно^шией 75 чкКи/мл [14С]-ацетата ( 50 мК'и/мМ, ICN* USA ) в

4

углецодсрмные цепи и стцмлы. Клетки лизировали буфе(юч, содержащим 20() мМ октилглюшзида, а культурльную среду фракииошцюпали ульт|шцеитри-фут щхмшшеи, Itou полученные фикции характеризовали ПААГом, авто|Шно-цифиеп и иммуноблотом с различными антителами. Аликвоты Л/3 содержащих ф|>акний подтекали ульт|йфильт|)ации на 10 кДа фильтре фирмы "Миллипор" (OIlAt Мутцимл. (цишелвий и lie прошедший чцкз мембрану, анализщювали. имчунобююм с анти \/3 антик'лами. Концентршпо рЛ/3 оценивали методом

лгаи.итомецшц на денситометр» PDI ( PD! protein+DNA image Ware SystemsSM, USA ) г. Н|*ираммой Quantity One" при цивнении платности флуцю^имм иммуноокрашенного pA/J неизвестной концентрации с плотностью флуцюцяммы стандарта синтетического А/31-10. Меченные [14С]ацетатом липиды, ассоциированные с имму|юн)*;ци11ити)ю1и№1ым или иммуноафинно очищенным рА/3 кудьту|илиюй среди, экстрагировали смесью хдороформакпацолШ) и разделяли методом 1Щкзюц>й1к)Г| »[ущатоцафиц (ТГХ) ib пластинах Силика Геля О.

линнлцом окружении ¿и у/(т. ррконсг|^»фшанные депрогеинизированные JUIBI13 И JlfJOllJJ и фасфолипидкме везикулы фосфагидилхолииа (ФХХ фосфатиди.цоерина (ФС) и фсрфат1Шюй. кислоты (ФК) инкубировали с А/ЗМО в молярном (хютноивнииия! г ) белок-липиды. равном J:' 0.7; 1: 14 И 1 5/1 Ассоциацию А/3

с лищшыми везикулами цмаеряли не денатурирующей ВЖХгельфильтрацией и уль^мцешрифутрошниеМ. фибрилле*«!!« А/31-10 в каждой фикции

авизировали методом ЭН

1 • " * * •

|вбд|(ц* J. Мммуно*имическв« и электроинотиикроекопцчсскан

шмкТериЕТИШ очщцснныг дитхцхгтенипв илазны крм jaicttin"-."лпйп дпшв лг • : • лп № «13+ ifW

Ани» АиоЕ АпаА-} ■ Amu ЯАА * ■ + ♦+4- . +++ t . . + + +■ ++ * + ++

средний дйвйетр Ш-Шэд. им. .... (ЮЙО 30 в SJ3

' рЕЗУЖГАТи И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Baamnte (жЛкпв плазмы и СМЖ. тапиадвйптвуюших г. pAft

Идентификацию возможных физиологических лигандов для рА/З проводили п экспериментах по аффинной \|х)матопифии плазмы кропи или СМЖ здо|х)вых доно|хш на Л/31-10 Сефа|хм-, ПЛЛГ п не|х1дунируюншх условиях выявил основной компонент кислого элюента—белок и 80 кДа (Рис.1), две эквимолярные N-конненые аминокислотные последопателыкхл'и кото|х)го «хлвгплпопали. («гласно банку данных национального биомедицинского исследовательского фонда, США, N-коннам а- и /Зценеи белка AiioJ, что нолпк:рли;иг.ь и ичмуноблот-аналиэом с антителами против его а и /? цепей (PhcJC). Для оценки возможности взаимодействия рА/3 с AnoJ 'in vivo, аликвоты СМЖ имч.мющхжипитиропали с анти-Лпол(/3-цепь) антителами, а результирующий п|>ешшптаг анализировали на А/3 иммунореактивность. Как показано на |'ис2, р\0 осаждался с анти-AnoJ антителами, означая, что' наблюдаемое in vitro взаимодействие имеет место также in viva Кислая элюция обнаруживала в элюенте . и ряд других минорных белкоп: АноА-1, АгюА-4, АпоЕ, al ашн-химотрнпсин. пит|юнектии и человеческий сывороточный альбумин (ЧСА1

¡rio п|х)1х-рял(х.ь иммупоблот анализом И определением N-концевых аминокислотных иоследонателыкхлтат.

15 связи с имеющимися и литературе фактами гидрофобного взаимодействия AnoJ и АпоА-1 в плазме крови, представляло интерес проверить природу АпоА-1 элюции с Л/3 аффинного матрикса. Для этого элюцию пели гидрофобным дегерпшг-содержашим буфером, обнаружившей в основном АпоА-1, ЧСА и, в меньшей степени, Aiiolv AnoJ элюирооал позже в условиях кислой элюции. При обратном по|)ядке элюции описанный белковый паттерн шхранялся, что означает существование в плазме крови здоровых доноров гидрофобного по природе взаимодействия А/ЗМО- с АпоА-1. Напротив, взаимодейстеие А/3 с AnoJ,

устойчивое к действию гидрофобных агентов и разрушающееся в условиях кислой элюции, является ионным.

1х:лковый паттерн гидрофобной элюции с А/З-Сефарозы _ напоминал паттерн

апобелков ЛППП плазмы к|хжС, что привело к предположению о взаимодействии Л/3 с этим классом J1I1. Эту гипотезу тестировали в экспериментах in vitro lio локализации меченного биотипом А/31-40, инкубированного с плазмой крови здо-|х)вых доноров, в различных фракциях ЛП. Денатурирующая иммунопрецшштация с |мзличными антителами с последующим ПААГом и иммуноблот-анализом показала, что меченный пептид пе|хфаснределяется в ЛПШ13 и ЛПОВП, где он акх)шш|Х1па лся с AnoJ и. возможно, с АпоА-1. Малые количества пептида "в

6

1'нс. 1. Сшиышшие /\llOj пдизмы кропи здоровых лнпгц с Л/ГМО- Сефарозон. Хроютофафическую »люнию щхмыдили 1 М уксусной кислотой, р1125. Элкюпт анализировали ПААГом в нередуцирутоших условиях с последующим злект|х)лереносом белков то мемб|миу Ичмобилон I1 и её окраской раствором Кумаси. Л. (I) Маркёры молекулярных масс (Мк (2) Ошзавшийся с аффинным матриксом материал плазмы к|*)|1И аодюиого донци, элюи|юиаш1Ый в кислых условиях. Участок мемб|ины,

(кп1*-(ст.уш!Н1111 основному белку в 80 кДа (строчка енращ на Рис/1А), вырезали и подвергали определению Жсонневой аминокислотной гкхледователыюети, что в 19и последовательных ступенях выявило а- и Д- цепи /\iioj. С Аликпоты "кислого" элюента афишюй хроматографии плазмы (1 и 2) и СМЖ (3 и -I) анализировали иммуноблотом с антиюшми и|хяив от (I и 3) и /3- (2 и 4) цепей Ано-Т; М. марк^ы молекулярных масс.

м

«4

В1

"Щ-' Л 1»' 1 -IЫ :

и 110«)

12 3 4

и I

АноЛ ( о-цнп,) БЬМРРЗРУЕРЫМРНАМРОР белок в 80кД» БЬМРРвРУЕРЬКРНАМРОР

I

Апол ( (»цепь )0<2ТУ8ВЫЕИ}ВМ5ЫдС БКУ белок в 80кДа ООТУЗОЫЕЮЕМвКООЗКУ

«I

4630-

Рнс, 2. Иммунопреинпнгацил рА/3 из сшшцо-щозпчюй жидкости. Иммушч^ецинитаты анализировали ПААГом и иммумоблот анализом с последующей визуализацией рА0 с монокло-налымми ^СЙ антителами. рЛ/З пренинити|хшл из спиштюзговнй жидкости с антителами против 0-шяш А(юо(3) и не нериципитировал с антителами щхиив' АноШ) и ощени АполЦ^ Положительным шщюлац служил синтетический А(ЗИО (5мкг), Иммуткицшшпитирытнпый с анти-А/ЗИО антителами ( I ). Пшн.'цифнчеосая иммуно( «активность в области средних И высоких молекулярных масс обусловлена реакцией антител (легкие и тяжёлые' цени иммуноглобулинов ), шкышюваиных для иммунощшипитации.

I »34 .Л-Л-. 1Ц-: щ Аи! 1 • 4 .,4

и

. • 4 кО.

антн-ЛноА-I преципитате ф|нкнии ЛПВПЗ и J К 101)11. и значительно больший и практически одииакоими em пыход с анти-Д/31-28 и с. анги-AnoJ антителами

может быть гледсгвием присутствия детергентов в ичмунопртшпитационном бу<]н;|*\ денатурирующие условия кото|»то разрушают шл|х)ф(Л|юс взаимодействие А/3 с АпоА-1. но не с Anoj. С нелш обнаружения приемного рЛ/3 в J III |язличных классов их подперт ли педеиату|)ирук)|]||ей иммунопрсципитапии. Как и В in vitro экспериментах, натишшн рАД локализовался в ЛПВПЗ и JIllOlill (I'ltc-'iL Он 11|хжппитировал с анти-А0 И с анти-Лпол(/3-ш:ш>) антителами, лающими сходный белковый состав п|юнииитатов: основными белками, что подтверждено определением N-концевой аминокислотной последовательности, были Anoj, АпоА-1 и рА/3. Лсооииация рА/3 с ЛПВПЗ И

J IllOlill была показана и в ульпиструктурных И-ЭМ экспериментах непосредственной визуализацией Д/3 эннтопов на поверхности ЛП частиц (Рис. 41

Ассоциация р\/3 с ЛИВПЗ и JlIIOBll. доказанная ультраструктурно и определением амино-концепой послелопателыюсги Д/3, позволяет рассматривать последний как олив из минорных апобелков липопротсинов высокой плотности плазмы к|х)ви здоровых доноров.

Д/3 ассоциацию с апобелками ЛИВПЗ и JII101 III проверяли в in vitro экспериментах, в шщмх биотинилиронаниый А/3 инкубиропали с очищенными ЛИВПЗ и ЛИОИП с гкхпелующей очисткой ЛП натигаюй 1сльфильтраиией с целью избавления от непровзаимодействовапшего меченного пептида. Стандартом :шдгржки на колонке и негативным контролем служили интактиые ЛИЯ13 и ЛПОВП. Повторно очищенные ЛПВПЗ и ЛП0Ш1 анализировали ИААГом и иммуноблоюм. Опювнью биотип-положительные паюсы идентифицировали метолом 011|х;лелення N-концевой аминокислотной последовательности. Ими оказались АпоА-1 и AitoJ с ЧСА для ЛПВПЗ и ЛПОВП, соответственно. АпоА-2 в случае ЛПВПЗ, имеющий блокированную N-кониевую аминокислоту, был определён иммунологически. И в случае ЛПВПЗ, и ЛПОВП имело место минорное взаимодействие синтетического А/3 с рядом других белков.

Таким образом, синтетический Д/ЗНО взаимодействовал с несколькими

белками ЛПВПЗ и ЛПОВП, основными из которых были, АпоА-1 и Anoj. Минорное взаимодействие биотинилированного А/31-40 с рядом апобелков ЛПВПЗ

и ЛПОВП можно объяснить гидрофобпостью. молекул аполипопротеинов, являющейся одной из причин их олиго- и полимеризации в водных растворах. Однако такие белки, общим принципом строения которых^ является амфипашчноегь молекулы, увеличивают аюю а-спйралыюсть и не склонны к

в

I'm. .'I. !bi4.Yii<iii|x'nmiiirnuiiii

рЛД tu .lllIlH.l+.IIÎOlîll ll.ll>:t-

MÙ Kpimli ;i.ínjx4»M.\ iHiteií. K)

mi- пмлс.птмх JItl н.ш.тм k'IMimi и ИЛИИ 11|*1Ш1и1-

1И|*)1ИЛИ С НПЛНКЛОНаЛЫГЫМН

sgy 21.и антиА/з airnmvwMvi. ikjrurn чего нмм.мки1[*'ш1мнтаг14 ;тали.«ч*нили ИАЛГом И ИМмунп&ют аиалИ:юм г: мои» клоналышми антйА/9 igb антителами. \Á0 цтшнтиропал толыд» из фикции Л11Ш13+ J и lOtiíKD и не «(хжинитироиал из Л1ЮМГ1 ( t I. ЛИШ» ( 2 ). Л1ИЯШ) и ИЛПИГЛ 25 ir оштститсгкстт» neihnaa А/?МО

иашьэовам как положи-телшый контроль ( 6 I

1 2 3 4 5 6

©€ЭС

У-

-4кДа

Рис. 4. Ультра структурный

анялш .ижннпанип рЛ0 il ЛИВИ.1 и Л!КМИЬ Анализ прошили согласно изложен' ному в Главе "Эшгсримснтзль-пая часть" протоколу, окрашивая различные ЛИ на э:кжтрон-1Ю-микр0скопи'к.тки.х реигетках даноклональными аити- a/3/4g8

антителами с последующей их инкубацией с Г1|ют(жп&аологгом ( 5ни ) и визуализацией пол электронным микроскопом (\80000L А. фракции J II IUI 13 и ЛИОЙИ; а Л? Ю|1И, служащие отрицательным шщхыем.

I¿'"Yv^'• 'S^'V

У ¿ '-¿J vî-V:

iM.ut4<i>iiJaiuut на i-рапиие |Ш, le.ia шлрофобной il i п. ij ккрм. 1Ы юн фаз, 11|*'Д(.г.т.кч11юц нонерхпосшыч слоем фолпфапшило» ЛИ. ')io ицшкмлшю и для амилоидного белка ДА, (> П ыминш u.i • (наемного амилоида: п модельных экспериментах in vilrn ДА (ïj\|ïiiniJl а-спищлыкк.ть, Oy душ нст|к»:шшм и фи-фолинидние незнкулы. 1гли >|о nejaio и для Aß, iti, цозчожно. необходимым услшием д.ш исключающих фибриллщепел н|.*:ймун»!ствешю а-сни|>альнш

коифо|л1апно1ших аюйпв, мцаделиемих аминокислотной шиледолателыюсню

Л/3. является физико-химическое iuuimiдействие этого белка с мембрашь

подобным окружением, которым может служить фосфодипилний слой Jli). Aß

ашяшация с JIIIHII. тянущая и ЛА-амшюиду. а и um /3-а.милоид и |шрнд i,

системных. что может отбежать общие механизмы ами.юилогаюза. присущие им Для выявления важности лнпилноп фазы ЛИ и щдмотвращешш фибрнллои'иеза Aß были щюдедеиы in vi Ira экиа:римеити. в кодцш

|>ек(>нсф>н|>0нанпыс деп|хщ:ииизн|>о|1анные Jill и фосфолинидные )<J)JI) резикулы Iihk>6hi*hïuih с емщиги'ншы пептидом, полимеризацию котцюш ацалкицхчади :1лек11»)нио-мик|**жониче<жи. Нзаимодейсшк: пеппш с |ккш;труир;>11анньши Л1 II Dill. Jll К >1111 и Ф.! I «уикулами щхшсрлли иативной (г'льфцльт|ИЦЧей KOMii.K'KdHi и- их ф.ншнюнанием и|>и ульт|хшеш1н1фуги|х)ваиии. Через 2\ часа инкубации пептид. инкубщшшннмй без лищцов, имел структуру зрелых ФцПраи (l'iic. RAL в то ц*:мя как но иоех лишиттержащих цхйах фнбршущ оку кпноналк. fi lin ,шецюй динамике наиболее ны|>аженнцч иштйцхшнне Aß

фнб^ькнгне.и оказа.к»! и случае велнкул ФС (РисЭД, JUIlflKf и JUIOHIl lifм г * ни да как А/3. инк}би|Х1нанпый с те ми же везикулами ФС с г

ЧЬИ Pi к .ПО и г =И(Р|кДи щхмшлял (шличпую степень ншнмерцзации. It нребе ФС е. г =0.1 (РисДК HwjRi мосш иП|шиши№ необычных кцхлкнч фибрилл, 11|«ч^|а'шмчш<\ на двадцать о mi,мои день обычную мо|>фоло|ш4Ри<;5й. Наученные |.и'кт1*а1помик|)(«т;ошт1их1н.' данные um ютели.твуют, что Aß

фиГ)|я|. umciHM nui i tfîi tj )> i-i си его лншинич окружением, Ранее было подложено, чн1 <»4»Лии1ЦШН4. im amero щхмщеспи'шшка, Aß. екцх*: всего становится

.»жа.мдтаинич и мемб|иш> подобном окру жении, и в такш) окружении может Пижлцнщхччтм'л » цитичные участки «цнаннзма. Ьелково-лннидные комплексы, Л1ШШ и .tlHXäl. с мчцщчи в описываемых :»кснс|>име|тгах Aß ашлши|клип в nun*' кцхш зицчних пикрин, по imT нндимипи и н/хметавдиюг для рА/3 Окружение, 1»\«"хошчос д.hi его но i и-ржания в (юспкцлшои акши/альной

Pile. 5. (Ьучщип полпмгргааЦнн глптепмгекого netmua ЛД1-40 я присутствии везикул фосфатплшгрина меток«« ллгктрониой микроскопии ( \(¡0,000 ). См. обьяснпше в тексте.

Рис. в. Ллггора,1И(*1>афия Фракций культу ралыюй среды клеток HepGJ (Л) и локолкиiuiii в них рЛ/ЗСИХ лликвотн всгх получгнпых ф|ик||и|| культура лыюи среды и клеточный лизат метаболически меченных клеток апалпзнропали ПДАГгм с последующей авторалиографией (Л) и иммупоблотом с мгикжлопальнычн анпгД/З 6KI0 антителами (В) и последующей хемилюминиаеттпюй втуализа-цйей иммунорсактньиых понос. (1) « И, Нерс2 ЛПОИИ . и промежуточный слои, тответ-сгамю, первого ультрацентри-фупфопавии при (цшпталыкн) плотности культура плой феды (0.99—ЮОг/млЬ Ш флотируй шпй слой Л11 плотности 125 г/м^фЛШ (41 клеточный лизат; (5)t ивфрппатант плотности 125 г/ил; (6В), 5нг синтетического A/Sl-40 служили положительным контролем: М, стандарты молекулярных масс, кЛа. Иммупоюжшпсльныс паюсы 4 и б кДа отсутствовали ipi адсорбции антител избытком синтетического ЛИ что служит донолвигельным критерием их специфичности.

97 67 -

46 -

"30 -

А В

М12345 1 2345 6

2ь' йЩ

3 -

1

а

I-.

■j ■

I

•г'.;;;

11

Коль скчцк) Л/3 ашишщюшн с ЛП1Н13 и ЛПОНИ а (Лиона гелыю, может

быть охариктмммован как аиолнтхцхшпш. приставляло пппчсг. тегпцюишие и:к|<'шш р.\/3 га1атич1х.кими клетками, важнейшем <;<йте бп'х:ннлиа аиобедкон

п щя-атшо человека. Для лих целей бы.и ищии-юпаш кулыущ клеток тки^сипшн человека Нер02. шцхзко щшжмшццадгл для изучения бимиштоа лиш)1\|»т'шн)п и аиобелкоа в части.тн ДноЛ и ЛвоД I. Пиле меглбачическош »мнения клегочных белков с х>5-у"ПИопипом культуциьную цхму Ф|икииош11*)ШЛ1| >.'1Ы11ац|,1П1)11ф>г11)*>|итк:м при шнгикхди ЦК) г/мл, что давало • флотирующий с.'Шй, пампш^шый ЛНОЛП н-кимы к|хши (Иер02 Л1КШ11). 1цх>межу¡-очный глой н нпфраиапшг. (Кхиимщш ш,нн>жал пщкш'н'ш) 1*ш> белок культурлыюн цх:ды и !1|>и пощориом нент|нЦ>угн|хад-пни 11|»1 н. отшили расгвцы 12> г/мл, дацал ф.юшру юнше | (фЛИ) и инф|»нитант. Пш нолуичтые фрикиин дампировали п:лыл(.'К1|<4ц»'»)м,. »плчшмоцмфией (1'|и/>А) и иммутиЛдаш с различным» антителами. Диализ с аши Д/З ангип'лами обнаружил рЛ/З 111 ф|>акнии пнф^кгганга-ЦБгЛие волосы н 4 и 11(1 кДа. «иугнеппвуинтв: моиом^ню» и днмерний Щш'. щмутстм»-пали н|»!ме|>ш> и (мы»« ихщюшении при оцйод: с мшокжшлшими анти Дй (МО {Риг/М] и 4<зв аитшюами. щмуппшвал также в- кдерпдои лииге. но и|м'пм.\11их:|1»чик> в моннмерюЛ. 4 кДзфо|>ме.

Огненная тчкииме^»^') юнтггрвдм» ^ п . мфранаганте 125 1'/мл ттгашш Ш6 «кг/мл, Чк> ш«|1ггств>»гг рД/3 канщгцаиии в рач&ШМ)

культ»«лыки! Цхце СШ мкг/мл, цяшишимшЯ на дш порядку ши^аииые . ' Кошкшцтин р\/} в к°улыу|х1ль)шх цхмах ряда клеючных лншш. «лазмы И ОЬК. Слив, пышкнй урить р\0 а*|тн| гат^хстми кленами ЦсрШ тимианпи? участие доким В сисш$июй циодоим рЛй в ирготы»») чирклвд и

.. др.иог цичижйыч иикидоминне - :т>й клеточной ку/н>туры в »цхяаративж*? . нин'.и'нии р\/} для (различных биоминтжих акЬ^^мещии, ;

НччииГмпг анализ |«?х получ«Я1ных 4ник'1ин> сащтпг'.тш ершив Аноа. Л«»\-| и ЛниГС выяши бжю.в-мюр доэдцштде' иоркдкио в 4» Нср02.41НМ1|1 Лику) Г>ыл (р-дсгашеи (фитмуши.т'Ш» в» фракции ФЖ и в эиачнииню чи-пыних количествах в иф)<татантс Ий/мл. ед»и1СГвеш|ой фракини. ощужищ!-!! \iKia ;>ш |*мулыаты а«тв(псгнуюгг дашиам Д1)>тих научных гр>"» II об)Л151Я|опл схибычи ф|инк<>\пчич1хжими шк'клнами нез(х1лих вновь ^. . оишмцхишшмх Люлчхц^йкаимч лишцхппян^ («.»ржац'их также сдошне •.' .

ктхчотга Л|*>Л1 •''..■.••'■*

11

Д.1Я НЫП11КЧ1ИЯ МШКЦШЫХ КОЛИЧССТВ I>\Д IWJf IIO.I.VieilHUe ф|Х1К1ПП1 кулыуциыюи ч»\ш подвергали иммуншцхчшитанни с антпмами н|»тт АД,

кот|>мй (гажла.ни но только ш фракции пнфрашпанга 1.2Г> i/m.i. ми и из фЛИ. мин нфМа.имшаиш»: и тчя^ чиг.-иикк- на обшии оби"м фикции, колнчег ию р\Д

фЛИ бы.к) ничтожным И" сравнению г. первой Фикцией. Таким обозом {».ионной рАД содержащей .ф|як1шей культу|пл1.ной целы к.кчок HepG2 ймл

инф|инатант 12Г> г/ш

Именно ity фракшВо подвергали ла:кч; нативной имчутиицхчшпшанин. с ангиимамн щхтда о- и Днепей Aiioj, А110А I. АтГ, АпоА-1 и 'ПТ с целью ныяшения возможной исшниашш АД с ними белками. р\Д не только »(■¡епиттцхчяд г. анти-АД антителами (наюжигелыши концхиь). по и г. антитачами ii|*>nm Диенн Aiioj, AnoAl и ТГРО'ис.Т). К'он^чшниптии А/3 г AIkjA-I и AikiJ, 1ю ixii'i виличогги. означает агашиацию тшх белков и пхдаве тишь п1нп'.и1|х)юнны\ типическими к.пкачи .пикицхггеинон. Труднее ииг<1>и(*'-пцхтать рАД ашмишник» с TIT. ')гот Гимок 1гк|х:тируегся кликами печ(чн1 и

надставляет шбой г.1>шо|хггочнмн белок. пхлтоииий ii.i четырех идентичных су{н.сдншш с мо.гкуллрнон маний II к,la, одной ил отловных функции' k<m))x)ni является т] шил орт ти|хжсина и |*.Т1нюд-снязынаюшет белка. 'ПТ Изве<лсн как бе.юк, атн1ИИ|Х)ванный с: А/3 амилоидных отложений и. возможно. рАД СМЖ. Моз можно. что ассоциация АД и TIT п культу ралыюи qxue гепатических к.кгтк от|яжаег аегшиаиию югледвят г. Anoj -. и АД

содержащими ЛИ рематических к.кгтк. Нельзя, однако, исключить и бимодальное ¡)аа1|х:леЛение вновь пштелщхжашкит) А & п комп.гш: г, AnoJJIII и TIT.

Для пропажи гипотезы об апшиатш р\Д с вновь синте.шроваиными клеточными линидами, клеточный мошхлоО метаболически sctii.iii с "С-анетагом В условиях ишибировапйя синтеза НерС2-ЛИ()НП альбумин-» шержашей qxuoa После ф)икниомирования культу| ильной qx\iiJ ульпктетрифупцхттшк'М. 1«|франатанТ-1иГ>г/мл йммунонретннтцхинлн с , анти-АД ангиомами.

Альтернативно, исходную Культуралытую q«:;iy очинили на Hi

элюента аффшюй х|*>матографии к преципитата ж< 1|широналн лнниды, koiojhjc затем авализпровали методом ГСХ с постуюшей авгцы.вюпмфнен (Ри<Л). выявившей п1)исутствие метаболически меченных липилов вгях тюнных к;ш//ж в анализируемых препаратах рАД.

Результаты проведанных экеш^шментоп 'жиете-и/.твуют, что гепаигкчхие клетки llepG2 секретируют р\Д в uxriair белково-.тшвпньп комп.л'кал—

липонротеинов. В пользу stoivhi п|х>|хменн1.к: жсп^шм'игы по у. ил i»i филиппин

УЗ

Ml 2345678 .9 15- ~ "

6-

О .../

С

Vs J ' - 'i

з-

«

I'm. 7. rÍMiiriimirmu no ичч.\ Ш>11|М'ШШ11Ш1И \>\ß iu> .|,|Wkiniii ннф|ш-iiaiaiiiu l.'i.~)iAM к>.4,1}(wiuimi cjx-.iu k.kmik HepG'J с |wj.i)I41ILImií иитнмачн. Лликнош inii]>|«иагапга ü£> г/m.i k}.iu>huuii>ii i.|»mu к.ичок 11c()G2 (0.2fnti) iiiiiiv'ixa.iii iianiiuioiï имм>iuhij■ -iuunilaunit с антителами |||«Н1Ш рЛ0 (sgï2I3I линии I): AnoJ /anin- ai2\ И /Ш) цеии/; ДиоМ (I); Лж)Л1 (f>k \iio\l ((Л TIP (7k SAA (8k IIpeiuimiraiw аналишрнали ц:.и,-.ик'к'пшфцхмоч и iimu>ikíí.k>ixm t: моцоклональними амгир\0 (6MIÜ) аншимачи; 2Г)ш 1.иип'1нч1чм>н1 Л/31 10, ¡i.iiicu'miuu wiuxjx'.lf tikmiho на (v.и» i-o ли.in im. 1С1Ж|1|хм1,ным K'iiiii'i*).i('M((Jk M, Сшиларгы мол май-

I'm-К 'Г<ч1К1м .к ншан \рома1(Н]тфин лшнцон, ассоциирмщшых с: . и1111Г111|инш1шым K.it'iKUMil HepG*i f>.\ß. Ana.iHJ ii|xii»uiun шглагш oiiiii.iiiii(im\ h ivki u' ii|«iii)ko.i>. Jliiinuiiui; craii.iapru (нокаины <:ii|jana) Hii.i.sa.iiuusi.iii ii;i|ki\iii iio.ia: )\t» к|>ири mi.u■сирина; XC. холсси'рпн; Tl\ T111i. Ii и t< »« ii.i; Ol. I.i|h к jJ« i. и innii.i). a Mi'iafxi. iii'in.Kii меченные липиды, ai i mi in ll|X>IUlllll.ie (. НИЩИ, (•Ш11<\1П|»Н1ЛНН1,1Ч р.\/3

анпцкитищфпеи; (М- fr; К ~ Hjj-ЭХС

.ишп ш aiitnuiii|>>iiaii

nue с. iiju'iiiiiiiiiaioM

||)«'11ч.\инои цтшчми

анимпцщкои II (Г) I uo .... _■•"••

UHH'IUUM "и>г»*Г \ ; -ТГ

ич|ч1|«1,1Ы (oipiinaie.il. 111«' M4II|«UII 111.'НИ

фн'икк ink ( 2 hiiiiiiiiu.

атчшицжпши.' i. 9 ' ®

.мни W ! ) , г 3 4

H|>1Ullllll.t|ini И (Л и II IIISMII Ф|»1КНИИМИ IIHHI.1 |..Н,1(|н|>Н111КЧ1 \|»мл ищифпи.

-ФЛ

/V

р Содержащей <1>[*1кт|ии инф|ша|анга-1.25г/м.т на Ю кЛа фичл]»-: ни 6 к,la лимер ни 1 к.la eit> мономер не щхжо.шди че|*ч фиидр. под|шученая

au.....пшик) АД с комплектами Польшей молекулярной мани, I injur

.цхдонерными н »том плане являкпся (хмульташ жсперимеигон но натишюй |елЦч1лы|*1Нии р\(3<JMciv/Kanwiti инф|Ш1а raina 1.25г/ч.|(1'н(.')1.

20 30 40 50 . fraction number

kDa 1700 1000 700 200 70 25 10 molecular weight markers

Pur- !). Ге.п.фи.н.тряшш инфра-ИЛГЛН ra-t.'lSrAi.l к> .н>гу рвль-iii m qu'il J к.Н'Ток HepCJ Hfic.H! n.\ М1'та(н).1иче<*ого МГЧГШШ [«SI* UCTIIOUHHOM. It

ТХУ щх-нипитатах аликног каждой фракции. подученной ipt гсльфильтраиш! на каюнке Цмщхма ШШ отделили ралжпктитмп'и и nix.ie iiei*x> ' чёта на гу^трный оПы;м ф|*\к-нии. ci|xm.m х|»лип»цичму: |)о осл о|шшаг щхмстаигны .шлчепнл мст|яиванип :olMet) по вновь пшге.ш|х>нанпие белки ( срч xlO-1 ): Под (xjiio абпинг. приклеим молекулярные магам стандарта иснодьюганных л.чя калиб|*ткн К0.КИ1КИ: Скобкой обшначена Фракция, (».нажатая Anoj и р.\0.

Псе полученные х1юматопйфнч(Т,кие фрткппи иммунонртшштмхмиди с анти \0 антителами и аиал1Ш|х>нали иммутюб.юик!. Ока-илоа., что рАД и AnoJ. а также сле.кив*: количества АпоД 1. щшсутсп.укл и H<i«*)M ма.юм белконом пике с М0.|екуля|я10й мааш в 750900 кДа. что ахшхтстнуег опубликованным результатам о магкудярнт! mnv. Аноа-шдерлаших IlepG2- HL Гак<»: inciti«'деление в натигаюй ге.тьфц|ьпя>иш служит ещё одним лока.аге-п/пинч рА/3 оек|хшии генатическими клетками n ах rai«' дшющютииюп в kwilh-k«« с

аподшгоиротсинами J и А-1.

ИЫКШЫ

1. Растпоримая форма белка Ами.кнп бета ( Д0 I асг/иширогана в кличе цтм и спинномозговой жидктхгги здцхжых людей пигичхшеептио с Ai«)J и \im\l.

1S

Z llpii|xMa iuaii\io.ii'in:iiiitii |A/i <: iiiiiiiicyh'a.euiiiiJMii aiio.Tiiiion|)oii'iiiia\iH |ia.uiHiiaii: luuiiiaii .i.iii Alio j ii iii.i|»«|Hifiiiaii .1.111 AiioVI.

It. p\/3 iiiLiiii'it.ii ano.iimoii|ioinmo\i .iiuioii|«>iriiiioii hmuikoii tuoiiioi:iii 3 11

•Ullio|>oi<Tllioii o'li'llii iiijuikoii ii.i*<11li<m:iit I) ii.ia.mi' k|«)iiii ,i.nij»nii.i\ .uokil

1. (V noiuiMMii aiiofH'.iKaMii, . c KoiopuMii p Vi ani>tuiitji<*tiii . ii uciaia'

.llll|OII|IOII'IIIUlll IIMlDKOl'l II.IIIIIIICIII ii II .IIIIIOII|»l|('lll|OII (HK'lll, HWilWIII ll,|0|ll(»;il!. iiiliiikiicji AltOj ii AiioVI.

5. .Iiiiiiiinaii tjia.ia ¿mmiii|»jiriuiim iiumkoii iuoiiiocih 3 n .«hkhkmi'iiiioh omhii. iiijidkoh ii.ioiiio.tii. it ii >ia<ihm:tij <|«»<|huiiiiiui.i, iiihtk>m|>>x>r tji»if>jm.1.101 tniim ijinifiii'iifKiix aiia.ionm A/3 n ikuiepiiMi'inax m viiro.

fx p.\/j' ii|»).i.smiji.s«'it:a k.v.im>|>oii n'liani'ii'CKiix, k.'kmok HepG2 kak

aiKi.iiiiii)ii|»)n'iin ii aiaiiiiiaiuin ii|»'iiu\miirnn'iiiKi i: Anoj ii AiniA I.

¿^IIHDK JIM.JIUKAIIHH no

1 Cihiso, J., Malsubara, p., Koudinov, A , llo Choi-Miura, N.. Tomita, M., Wisniewski, T and Frangionc, B., The cerebrospinal-lluid soluble form of Alzheimer's amyloid beta is complexed to SP40.40 (apolipoprotein J)- an inhibitor of the complement membrane-attack complex < IW) // Biochem J. 293,27-30

2 Cihiso, J, Matsubara, I'., Koudinov, A., Wisniewski, T. and Frangione, B., The cetcWio-spinal fluid soluble form of amyloid beta is complexed to SP4Ö.40 (Apo J), an inhibitor of the complement membrane atlack complex // 23rd Annual Meeting, Society for Neuroscicnce Washington, DC, USA, (1993)nov7-12 Abstract>oök |9(l): 19..

J. Koudinov A , Malsubara, E., Wisnievviki, T , Frangione. B. and Dhiso, J., The soluble' form of Alzheimer's amyloid beta protein is complexed to High Density Lipoproteins 3 and Very High Density Lipoproteins in normal human plasma (1994). //, Biochem. Riophys Res Comm., vol 205, p

•ill- JIiiimi|ioi»'iiiiu.

. 11H>1111 — .'HI (firm. muk'iH'i ii.ioiiM.Tn.

. II It It I - Jill llll.lKOIt lUHIKXTll.

. II II U12 ii 3— .'III iu«i>k'oil ii.khihcih 2 H 3 k.iaan, uxriiKriTriU'iiiio,

.IHOIttl - ,UI twin. wa<i»K<*'t ii.iotiKK.Tiu

\»»J »I \im\ I ■■ Aintiiinoiiixin'HiiU J it A I. axinn-nTWiiiio.

txv-- tinix-topyfc'ooui kiif-kii-d.

The soluble form оГ amyloid beta protein is an apolipoprottin of High Density Lipoproteins 3 and Very High-Density Lipoproteins in normal human plasma

A.R.Koudinov, Neurochemistry Lab of National Center for Mental Health.

SUMMARY

Amyloid beta (A/3), a unique peptide of 39 to 44 amino acids long is the primary constituent of amyloid fibrils oF Alzheimer's, Down's and elderly people brain. A similar but soluble Afl (sAD) has been identified in plasma, cerebrospinal fluid and cell supernatants, indicating that it is a normal protein. We report here that sAB in normal human plasma is complexed to HDL3 and VHDL in association with ApoJ and ApoAI. This was assesed in immunoprecipitation experiments From purified plasma lipoproteins (LPs) and lipoprotein depleted plasma (LPDP) and confirmed by means of amino acid sequence analysis, blotinyfated synthetic peptide (ABt-40) was traced in normal human plasma in in vitro experiments. As in the case of sAB biotinySated'ABI-40 was specifically recovered in HDL3 and VHDL. We also tested the possible role of lipoprotein lipids in their binding to ABI-40. This was assesed in binding studies of ABI-40 with lipids ■ extracted from either HDL3 or VHDL. In the experimental conditions tested ABI-40' appeared to be associated with deproteinized lipoproteins and this interaction slow the fibriltogenesis of thepeptide. To determine the effect of phospholipids on AB1-40 binding, we tested the protein interaction with phosphatydylserine and phosphatide acid. There were • binding of Afl I-40 to both phospholipids, which slow fibrillogencsis at a molar ratio protein to lipid 1:5.6. sAB association with HDL3 and VHDL may be involved in maintaining the solubility of AB in biological fluids and points to a possible role of lipoproteins in the biology oFamyloidogenic peptides.

We »lso report here that HepG2 human hepatocellular carcinoma cells secrcte a significant amount of sA0 in association with a number of apolipoproteins and lipids suggesting that a fiver, rathe- than other organs that also express APP mRNA, is a source of this circulating pool of*A0.

- лз.АП. 1994г.-- - . Объём T п.л. Тир! Ъ/u. Зак. 551 Тип. РУДН Орджоишсцдзе 3