Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аллелопатическая функция фенольных соединений персика

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Аллелопатическая функция фенольных соединений персика"

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ ИИШОПШ РАСТЕНИЯ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

ГРАХОВ Владимир Павлович

АЛЖЛОПАТНЧШСАЛ ФУНКЦИЯ ФЕНОЛЬШХ «ГОЕЛИНЕШШ ПЕРСИКА

03.00.12 - Физиология растении

А Б то реферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев 1991

Работа выполнена в отделе плодовых растений Центрального республиканского ботанического сада АН Украины.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

МОРОЗ П. А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук СОЛОВЬЕВА М.А.,

доктор биологических наук ЯВОРСКАЯ В. К.

Ведуаая организация: Институт экспериментальной ботаники АН Беларуси .

на заседании Специализированного совета Д. 016.57.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора каук при Институте физиологии растений и генетики АН Украины по адресу: 252022, Киев, ул.Васильковская, 31/17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений и генетики АН Украины

Защита состоится

часов

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических

ТРУХАНОВ В. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМ!!. Развитие современного сельского хозяйства носит в значительной степени экстенсивный характер. • Увеличение энергозатрат на единицу продукции vi чрезмерное применение агрот.и-микатов приводят к резко отрицательным последствиям для окружающей среды н здоровья людей. Экстенсивный путь часто не учитывает внутренние закономерности поведения экосистем, растительных сообществ и агроФитоценозов.

За последние годы в экологии выделилась сравнительно молодая область - экологическая биохимия (ларборн,, 1935), изучающая физпо-лого-биохимические взаимодействия организмов в сообществах, которые реализуются посредством тех или иных биологически активных веществ (Райе, 1933). Такие взаимодействия осуществляются, например, между насекомыми с участием феСимонов. Между растениями и другими организмами, а также между самими растениями отношения обуславливаются аллелопатически активными соединениями, млн ялледопатпчее-кими агентами (Whittaker, 1971; 1373; Гролзпнский и др. ,1987; V,'aller, 1987 и др.). Изучение феромонов доведено в настоящее время до практического использования, чгго нельзя пока сказать об исследовании аллелопатичеоких агентов. Однако количество зарубежных публикаций по данной проблеме возросло за последнее десятилетие более, чем в пятнадцать раз, что свидетельствует о научной актуальности данного направления.

Многие стороны взаимодействия между растениями посредством ал-лелопатнчески активных веществ недостаточно изучены. Во многих случаях нэ понятен конкретный механизм явлений, публикуемые данные часто носят описательный характер. Наконец, не выясняется, при участии каких именно веществ осуществляется влияние и т.д.

Весьма интересной с этих позиций представляется проблема своеобразной самонепереносимости (в аллелопапш предложен термин "ау-тоинтолерэнтности" (Гродз1нський, 1973) ) ряда культурных растений: зерновых, технических и плодовых (Rice, 198-1). К ним относится и персик (Uisutani,19S0: Ohigashi et al.,1982; Мороз, 1988). Известно, что при повторной его посадке на тон же место, несмотря на соблюдешь всех требований агротехшпш, часто отмечаются неудовлетворительный рост, задержка плодоношения, з иногда и гибель саженцев (Gilmore,1963; Hirano,1964,1968; Israel et al.,1973; Мороз, 197Э). Показано, что такое вредное последействие в значительной степени кнзэано аллелопятпчееккм Фактором l Гродзшклкй и др., 1979;

Экспериментальная аллелопатия, 1987). Эффект последействия наиболее выравнен, если после персика производится повторная посалка именно персика, т. е. обладает ярко выраженной специфичностью. Вероятно, он. связан с формированием специфического состава аллелопа-•пгчески активных веществ в почве, источниками которых могут быть различные органы, остатки и опэд данного вида. Из .них подвижные соединения вымываются водой и поглощаются почвой. По -в1Шшому, некоторые из них достаточно медленно трансформируется под действием микроорганизмов и. следовательно, сохранится в почве длительное время, не включаясь в состав гумуса и ьызывая эфХект последействия (Гродзинский, 1979; Мороз, 1933; Грксов, 1983).

В отечественной и зарубежной литературе распространено мнение, что нршиной ухудшения роста саженцев персика, произрастающих на месте выкорчеванных старых деревьев, являются продукты распада ци-аногенных глнкозндов персика - пруназина и амигдалина .(Сопл, 1980), э частности синильная кислота и бензальдегид, поступзщие " в почву при разложении корневых .остатков (Ш.зигап1,1977). Однако ингибиторы роста обнаружены не только в корнях, где содержание ' ши-ногенннх гликозияов особенно ве.шшо, но п в опавших листьях, лепестках цветков, плодах и обрезанных побегах персика (. Мороз. 1979, 19-31). Аначиз литературных данных приводит к вызолу, что между отрицательным влиянием на тест-обьекты ксрней, опавших листьев и других остатков персика и количеством цианогенных глнкозндов в них не наблюдается прямой зависимости (1Вагй,Шгкее.1956: Mi.suts.iii, 1977, 1980). По-видимому, эффект последействия гораздо сложнее, и неоднозначность экспериментальных данных в этом случае можно объяснить участием других веществ.

Кроме амигдалина и пруназина в остатках персика содержатся фе- ' нольные соединения, тормозящие прорастание семян и рост проростков различных растений (Мороз, 1959; Гродз1нськин. 1973; Д979).

Они тете рассматриваются как возможные факторы аллелопатической аутоинтолерантности персика (СШзазМ еЬ а!.. 1932). Мы считаем, что отрицательный эффект бессменной культуры вряд ли можно объяснить действием одного или двух веществ - дерпватоз цианогенных глнкозндов или |$енолышх соединений. Вероятно, он обусловлен сложной смесью аллелопапгчески активных веществ этого растения, тем более, что ^еяолышэ соединения по активности вполне могут быть сравнимы с продуктами распада цианогенных гликозидоз - бензальдегидом и синильной кислотой.

Согласно теоретическим представлениям и экспериментальным данным источниками аллелопагичэсъи активных соединений могут быть прижизненные выделения. продукты разложения остатков и опала деревьев, например, корни, разлагающиеся в почве корневые остатки, опавшие листьл, обрезанные побеги, оп&д лепестков цветков и незрелых плодов (Rice, 1S3J; Экспериментальная аллелоттил, 1S87). Естественно, что реальное аллелоггатпческое воздействие может определяться эпгми источниками соЕместно,

ЦЕЛЬ Н ЗШ'-Ш И'ХЛЕДОВАШИ. Актуальных представляется конкретизировать понимание специфической роли фенольных соединений в ал-лелопатшеском последействии персика. Поэтому, задачи нашей работа заключались в следующем. Б0-ПЕРВЫХ, необходимо было провести детальное исследование видоспецнфпческой активности различных источников аллелопатичесгап. агентов персика: корней и перегнившие корневых остатков.'обрезанных побегов (персиковые деревья подЕегаитсл интенсивной обрезке;. опадз лепестков цветков, незрелых плодов и листьев. БО-БТОРНХ, показать касколкю Фенольные соединения могут определять видоспециф'ичеекое аллелопатическсе последействие персика. В-ТР2ГЫЕ. выделить из корней и опзда препараты Фенолов и также определить их видоспецифическув'' активность. В-ЧЕТВЕШХ. изучить и охарактеризовать под данным углом зрения различные группы фенольных соединений, содержащихся в персике и определить вещества, которые могут быть вовлечены в аллелопатпческоэ последействие персика. Далее, конкретизировать пути их поступления в почвенную среду. И, НАКОНЕЦ, провести поиск Фенольных факторов аллглопати-ческого последействия персика непосредственно в почве, продемонстрировав. что длительный эффект последействия определяется устойчивостью данных веществ к микробиологической деструкшга.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Ни.« впервые был разработан и предложен пригодный для адекватной оценки видоспеиифической аллелопатической активности биотест с использованием срезанных побегов персика прироста текущего года, который может применяться для оценки возможной устойчивости подвоев персика к его алле.попэтичзскому последействии в условиях монокультуры; разработаны методики обзорного хроматогра£ического анализа растительных экстрактов и гкетрактов почвы с помощью ВЭЖХ, а также методики анализа отдельных групп Ф»з-нольных сочинений, в частности ФеиолкарбоноЕых кислот; обнаружено, что ачле.попэтическое последействие персика в основном обусловлено одним из тзннинов корней, т.н. Фактором эллелопаппеского по-

следействия персика; обнаружено присутствие данного вещества в составе корневых выделений.

ВОЗМОЖНОСТИ ПРАКТШЕСКС'ГО ПРИМЕНЕНИЯ. Разработанный биотест на побегах может быть использован для оценки устойчивости селекционных форм подвоев персика к его аллелолатическому последействго, а анализ содержания фактора яллелопатичеекого последействия в • почве - для прогнозирования данного эффекта и изучения путей его регулирования.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы работы докладывались:

1. На конференции молодых ученых ЦРБС АН УССР. Киев, 1986 г.

2. На V республиканской конференции по проблемам аллелопатсш. Харьков, 1986 г.

3. На Пятом Всесоюзном симпозиуме по Фенолышм соединениям. Таллинн, 22-34 сентября 1937 г.

4. На VI Ме'жрегионачьной конференции молодых ученых "Актуальные вопросы физиологии растении и генетики". Киев, 1983 г.

5. На Всесоюзном совещании "Агрофптоценозы и экологические пути повышения их стабильности и продуктивности", Ижевск, 1933 г.

6. На конференции молодых ученых "Актуальные вопросы ботаники и . '' экологии". Канев, в-8 сентября, 1989 г.

7. На семинаре при Киевском областном отделении Украинского общества физиологов растений "Проблемы физиологи! растений" Киев, 3 июля 1989 Г.

8. На VII республиканской конференщш "Аллелопатил - резерв и основа будущего земледелия". Киев, 17-18 октября 1990 г.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ,. 2 находятся в печати.

СТРУКТУРА И ОБЬЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, выводов, заключения и списка использованной и цитируемой литературы (260 наименований). Работа изложена на 160 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы и 32 рисунка , включая копии хроматограым и других материалов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ. В работе использовались растительные материалы, собранные на участкам отдела плодовых растений .Центрального республиканского ботанического сада АН УССР, где произрастают разл!гчные сорта, подвиды, формы, сорта и гибриды персика, используемые и полученные в селекционной работе.

Образцы корней откалывали в период покоя у плодоносящих сеянцев^ "Печерский1') в ноябре-декабре 1985-1986 гг. Корневые выделения получали по разработанной нами методике в течение вегетационного периода с мая по октябрь 1987 г. также от плодоносящих сеянцев двух гибридных Форм, Перегнившие корневые остатки отбирались в 1985 г. от. срубленных под кор«нь двумя годами ранее сеянцев. Листья отбирались в период интенсивной вегетации в июне 1935-1986 гг. Опавшие листья - в октябре ~ ноябре, в марте - обрезанные побеги, в мае - спад после цветения и в июне - опал незрелых плодов, Еысу-шенный при комнатной температуре растительный материал измельчали. Почву (определяемую как темно-серая оподзолшшая) из горизонта 0-40 см отбирали на тех же участках, а также за пределами сада.

БЮТЕОТЫ. Теперь приведем краткую характеристику методов и методик исследования. Для оценки возможной аллэлопзтической активности использовался принцип биотестировання. С учетом видоспецн-фичности денотБня аллелопатическнх веществ перста в основном применяли разработанный нами биотест на побегах персика прироста текущего года, а также часто используемую биопробу на проростках кресс-салата (Lepidiira satiTiun (Гродз1нський, 1973).

Побега персика одшакозсп длины с развитыми листьями на верхушка срезали с плодоносящих сеянцев перста и до начала опыта .помещали в контрольный раствор - питательную смесь Гельригеля с микроэлементами по Хогленду (1/4 нормы) либо О, OlS-ный раствор Ca(N0o)o для предотвращения деформации клеточных стенок. В -олша-ковыэ пробирки вносили точные объемы контрольных и исследуемых растворов (5, 10 или 15.мл). У побегов удаляли большую часть листьев, оставляя на верхушке соответственно 2, 3 пли 4 развитых листа, с тем чтобы весь обьем раствора поглощался побегом максимум за 6 суток. Стремились к тому, чтобы площадь оставляемых листьев, оцениваемая визуально, была одинаковой на каждом побеге, что позволяет в значительной степени выравнять уровни траяспирашш и уменьшить варьирование поглощения растворов в каждом варианте. Концы побегов обрезали под углом 45° скальпелем и сразу помещали в подготовленную пробирку с раствором, прикрытую колпачком из алюминиевой фольги, где по диаметру побега сделано отверстие. В каждой Пробирке после установки отмечали уровень раствора, соответствен' topui исходному обьему. Штативы с пробирками устанавливали в лабораторном помещении (освещенность около 3000 лк, температура 20-25°С, Рляжност^ -50-70?). Через 2-4 суток Фиксировали высоту 'жидкости. Да-

- в -

лее при- обработке данных по формуле: V = VQ ('1 -H/HQ), где V - обьем раствора, поглощенного побегом, VQ - обьем исходного раствора, Н высота раствора в конце опыта, HQ - еысотэ исходного раствора, легко расчитать обьем раствора, поглощенного побегом. В случае ин-г'ибирующего влияния на водный режим он будет меньше, чем в контрольном варианте, и наоборот.

СТАТИСТ!МВСКАЯ ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ. Первичные количественные данные биотестов мы обрабатывали по схеме одно- н дшухфакторного дисперсионного анализа. В результате расчетов получали величины средних и HCPcgcr, позволяющие сравнивать данные по активности, проявляющейся в биотестах.

ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ФЕНОЛОВ I! РЯДА ИШВЮИДУАЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЯ. Препараты фенольных соединений были получены из растительных материалов по оригинальной методике описанной в диссерташш, а некоторые цианогенные гликозиды по (Trim, 19-55; Лазуревскнн А.Н. и др., 1966). ' .

ХРС'МАТОГРАФИЧЕОКИЕ МЕТОДЫ. Для сравнительного анализа состава фенольных соединений, идентификации и количественного определения отдельных компонентов, контроля хода препаративного выделения ал-лелопатического фактора последействия персика и некоторых других целей использовали обращенно-фазовув высокоэффективную жидкостную хроматографию на хроматографах "Милпхром-Д" и ХЖ-1311. Помимо этого, для качественной характеристики различных групп фенольных соединении дополнительно применяли двумерную бумажную хроматографию на хроматогра$ической бумаге FII-18. ■

Для исследования образцов методом ВЭЗКС пользовались тремя основными и рядом дополнительных методик их подготовки. Растительные материалы настаивали в воде при 20°0 около суток. Водные экстракты для осаждения полисахаридов вдвое разбавляли этанолом, оставляли на несколько часов и филировали через фторопластовый фильтр (поры 0,2 мкм). Препараты фенолов растворяли непосредственно в необходимом количестве метанола с последующей фильтрацией. Образцы почвы также экстрагировали метанолом в течение 10 суток с периодическим встряхиванием. Образш фенолкарбоновых кислот и нарингенина готовили по специально разработанным методикам.

Ллл элкирования в методе БЭЖХ применяли изократпческие и градиентные системы, в качестве водных фаз использовали 0,01% раствор ортофосфюрной кислоты HgPO^, 1 М раствор уксусной кислоты СНдСООН. Для разделения фенолокислот в последнюю Фазу еводплтт добавки аце-

татор аммония и тетргмешламмония (0,01 М).

Газделеш1е проводили на колонках 2 «62 мм, заполненных носителями Hucleoall-C^g ("Macherey-Nagel") и ЗНаэогЬ-С^д ("Chemapol") зернением 5 мкм (хроматограф "Мплихром-Ü'} и 0,5*300 мм, ' заполненных носителем Separon-Oig ("Chemapol") зернением 7,5 мкм (хроматограф ХЖ-1311). Летектирование в первом случае осуществляли в од-новолновом .либо в многоволновом режиме. Используемые длины волн 200, 230, 240, 260, 280, 290, 300, 320 и 360 HM В 'зависимости ОТ вида анализа и исследуемых веществ, во втором случае использовали обнаружение по флюоресценции с возбуждением при 230 roí и регистрацией з интервале 240-400 нм! ' -

ВЫДЕЛЕНИЕ ФАКТОРА ПОСЛЕДЕЙСТВИЯ. Предполагаемый фенольный фактор аллелопатического последействия выделяли о помощью крупномасштабной колоночной хроматографии на силинагеле L ("Chemapol") и очищали на сефадексе LH-20 ("Pharmacia").

ИДЕНТИФИКАЦИЯ. Выделенный компонент охарактеризован УФ-, ИК-, . ПМР- и масс-спектрами (ББА).

РЕЗУЛЬТАТЫ Г^рЕСУШЕНИБ.

АДЕКВАТНАЯ ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ - крайне важный, вопрос в аллелопатических исследованиях. В любом случае реальная актстность с большим или меньшим успехом моделируется в биотестах или тест-системах. И следует подчеркнуть, что рочь может идти только об адекватности тон или иной модели". В частности, аллелопати-ческое последействие старых деревьев персика на молодые, посаженные на том же месте, по-видимому, не может адекватно моделироваться биотестами на прорастание семян пли прирост корней, проростков капустных (крестоцветных), поскольку обладает ярко выраженной специфичностью. Более приемлемой моделью нам здесь представляется в качестве тест-обьекта только сам персик. Ранее для таких целей применялись различные модификации биотеста на проростках персика (Ал-лелопатическое почвоутомление, 1979). Но он обладает радом недостатков: необходимостью стратификации семян, трудностью использования большого ко.игчества однородных проростков, длительностью проведения и т. д. Эти трудности нам в значительной степени удалось преодолеть. В качестве тест-обьекта мы применяла срезанные побеги персика прироста текущего года, где, как нам представляется, Физиологические процессы протекают столь :ке интенсивно, как и в проростках.'Побеги помещали в контрольные и исследуемые растворы, от-

мечая расход "жидкости за определенное Бремя, который хорошо коррелирует с водным режимом побегов. По-видимому, этот принцип биотестирования можно использовать для различных целей, связанных с изучением аллэлопатических воздействии на другие древесные и кустарниковые виды.

Дашшй биотест также является физиологической моделью. Но нам представляется, что он позволяет в какой-то степени соотносить результаты лабораторных опытов и реальное последействие старых деревьев персика на молодые, посаженные на том же месте.

ЭФФЕКТ БОЛОРАСТБОРНМЫХ КОМПОНЕНТОВ. Мы оценивали возможную ал-лелопатическую активность водорастворимых веществ перепивших корневых остатков, корней, опавших листьев, обрезанных побегов, опала лепестков цветков и недозрелых плодов, а также смеси этих материалов в соотношении. 15:35:30:10: JJ: 5 соответственно, которая имитирует реально поступавшие в почву растительные остатки.

Лад характеристики возможной аллелопатической активности мы использовали величину относительной активности исследуемых растворов, проявляющуюся в биотесте: AQTH =( 1-P/PQ) -100S, где Р0 - расход раствора побегами контрольного варианта, а Р - опытного.' Если в опыте наблюдается полное подавление трансппрашш, то AQTH =100%; в случае отсутствия эф£екта Аотн =0. При стимуляции водного . -режима Aqth принимает отрицательный знак.

При соотношении растительного материала и воды для приготовлении вытяжек 1:50, 1:100 и 1:200 во всех вариантах опыта наблюдается ингибирование водного режима тест-объектов по сравнению с контролем з 2-4 раза (рис. 1). Значительную активность проявляют экстракты не только из корней и листьев, но и из других источников ал-лелопатически активных веществ - обрезанных побегов, опада лепестков цветков и недозрелых плодов, доля которых в общей массе растительных остатков, относительно мала. Вытяжки из перегнивших корневых остатков персика ингибируют водный режим побегов перста в той же степени, что и корни. Следовательно, разложение в почвенных условиях корневых остатков на протяжении 2-3 лет, по-видимому, не затрагивает аллелопатически активные компоненты. Этот iJíikt хорошо согласуется с длительностью явления последействия, поскольку известно, что оно наблюдается- в течение нескольких лет - после корчевания старых деревьев (Misutani, 1930: Rice, 1984; Мороз. 1988).

В то же время по отношению к другому тест-обьекту - кресс-салагу - у перегнивших корневых остатков ш отмечаем полное отсутсг-

Fue. I. Аллелопатическая активность корней и спада персика (тест-обь-ект: побеги персика прироста текущего года). Столбцы слева направо: вытяжки из корней, перегнивших корневых остатков, опавшзк листьев, обрезанных побегов, опавших незрелых пло-дое, лепестков цветков и модельной смеси растительных 'остатков. Для модельной смеси обозначена- активность, 'расчитанная по аддитивному принципу (адл. ).

вие аллелопатпческой активности (рис. 2). Более того, данные по rai-гнбирукщему эффекту вытяжек,. полученные на побегах персика с одной стороны, и проростках кресс-салата с другой, практически не коррелируют (рис.3). Это не только отражает видоспенифичность действия аллелопатически активных веществ'корней и опата персика, но и свидетельствует в пользу адекватности выбранного биотеста. Интересно, что ингибирущеэ влияние на прирост корней кресс-салата вытяжек из корней п опада пер:ика связано с содержанием в них суммы '{енольных соединений ( рис. 4). Проростки кресс-салата (как и, например, геиэ-шпш) наляются одним из тест-обьектов на неспеилФпческие ингибиторы роста, в частности, адгогие фенолыше соеяинешт (Кеф-ели, 197?; Harborn* 1980: Гродзинский, 1931). Но в случае персика мо:кно также

а? 100 90 8070" 605040302010

£ о о

X □

Н

а «

к

X

а

ы н х и

О X

I-□

к.

0 НСР95Х

¿7

¿Я

Л/

Ш адд.

!■■! 1 адд.

Рис. 2. Аллелопатаческая активность корней и опала персика (тест-обьект: проростки кресс-салата). Столбцы -слева • направо: вытяжки из корней, перегнивших корневых остатков, опавших листьев, обрезанных побегов, опавших незрелых плодов, лепестков цветков и модельной смеси растительных остатков.. Второй ряд: повышение активности экстрактов при их повторном тестировании через сутки. Для модельной смеси обозначена активность, расчитанная по аддитивному принципу (адд.).

предположить, что не все фенолыгые компоненты перста ответственны за видоспецифичность последействия, а отдельные группы или даже одно вещество.

Далее мы попытались оценить концентрационный предел активности модельной смеси водорастворимых: аллелопатически активных веществ корней и опада персика. Для этого определяли ингибпрование водного режима побегов вытяжками, приготовленными в интервале соотношений материала к контрольному раствору от 1:50 до 1:3000. Результаты графически представлена на рис. 5. Даже при соотношении 1:2000 еще наблюдаемся значительное ингибироваппэ тест-обьектов.

- и -

к К>0 *

В 80 I 70

60 50 40 30 20 10 0

г) й X

о ^

ш

и о X

V-□

СМЕСк РЙСТИТЕПЬНЫН КПЕРИЙЛО»

0ЛЛ6ШИЕ ПЕПЕСТКИ ЦВЕТКОВ

ОГМбШМЕ л стья

» ОБРЕЗДМНЫГ ПОБЕГИ

ОПДД НЕЗРЕЛЫЙ П/ТСДО»

ПЕРЕГНИВШИЕ КОРНЕВЫЕ ОСТЛТКИ

"Т-1-Г"

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Относительная активность, %

Рис. 3. Сопоставление активности водорастворимых веществ корней и' опада персика при использовании различных тест-обьектов. По оси абсцисс: тест-обьект - побеги персика прироста текущего года, по оси ординат: тест-объект - проростки кресс-салата. Прак-пгчески отсутствует какая-либо связь между показателями, определяемыми с помощьм различных тест-обьектов. Данные свидетельствуют о правомерности рассмотрения вопросов адекватности различных тест-обьектов, применяемых в аллелопатичес-ких исследованиях. .

СИНЕРГИЗМ ДЕПОТВИЯ ВЕЩЕСТВ. Для модельной смеси водорастворимых аллелопатотескн активных веществ персика следовало бы ожидать уровня активности, расчитанного исходя- из предположения об их- аддитивном действии. И действительно, ннгибирущее влияние ее на прирост корней кресс-салата (рис.2) является составным. Однако при переходе к другому тест-о"бьекту - побегам персика - отмечается усиление активности смеси веществ - синергизм (рис.1).' По -видимому, это явление достаточно распространено в аллелопатии. Мы предполагаем, что в аллелопатическом последействии персика такой механизм отнюдь не исключается. По крайней мере, этот эффект приводит к то-

5 10 15 20

Содержание фенолов,мг/л

Рис. 4. Корреляционная связь между относительной активностью водных экстрактов из корней и опада персика (1:100), проявляющейся в ингибировашш прироста корней кресс-салата, и содержанием фенольных соединений в них (определение фотометрически по Фолзшу-Чоккальте). Высокий коэффициент линейной корреляции Браве-Шрсона свидетельствует в пользу неспециФпчности физиологической реакшш кресс-салата к фенольным веществам различной природы и в то же время еысокой чувствительности к данному классу ингибиторов.

«1У, что какое -либо вещество проявляет свое действие именно в составе сложной смеси, т. к_ в изолированном состояшш актганость его была бы гораздо ниже.

Таким образом, одна из сторон аллелопатической ауто!штолерант-носта персика может быть смоделирована в лабораторных условиях. .Вместо биотеста на проростках персика перспективным при нзучешга явления алледопатичесхого последействия персика может быть использование в качестве тест-обьектов побегов персша прироста текущего года плодоносящих деревьев этого вша. Нсточшшами аплелопатически акттных компонентов выступачт не только корт! и листья, но и дру-

э? 100"

u о г н сэ

3 • I •

ü зо-;:

1 20";i

I м-:!

1:2000

Соотношение растительного натериала и воды при1 приготовлении вытяжек

Рис.5. Зависимость аллелопатической активности водорастворимых' веществ модельной смеси корней и опада перста для различных соотношений растительного материала и воды при -приготовлении экстрактов. Тест-обьект: побеги персика, Наблюдается существенное ингибирование транспирэшш побегов, помещенных—в -исследуемые растворы, вплоть до соотношений i:2000, что приблизительно соответствует содержанию отдельных веществ 10"^М

гие растительные остатки: обрезанные побеги, опавшие лепестки ' цветков и недозрелые плоды . Водорастворимые вещества всех этих растительных остатков и ' опада усиливают физиологическое действие друг друга. Благодаря этому, аллелопатически активные вещества персика могут оказывать последействие в значительно меньших количествах, вполне сопоставимых с естественными их концентрациями в почве, о чем будет сказано ниже. Проявление ингибирующего влияния в этом случае возможно благодаря синергизму« Тогда наблюдается своеобразное пролонгирование эффекта основных веществ вызывающих последействие.

ЭФФЕКТ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ И ПРЕПАРАТОВ ФЕНОЛОВ. В дальнейших экспериментах мы проводили сравнительна оценку возможной ал-

лелопатической активности ряда индивидуальных соединений персика: цианогенных гликозидов - амигдалина и пруназина; продуктов их деградации - синильной кислоты, бензальдегида и бензойной кислоты; некоторых фенольных соединений персика - катехшюв, нарннгешша, фе-нолкарбоновых кислот и флавонолов; а также препаратов активных соединений, экстрагируемых из растительного материала спиртом. Препараты представляли собой, главным образом, сумму фенольных соединений, выделенных из различных источников аллелопатически активных веществ перста: корней и перегнивших корневых остатков, опавши листьев, обрезанных побегов, олада лепестков цветков и незрелых плодов. Здесь мы также использовали разработанный нами биотест' на побегах перста. Концентрация веществ и препаратов составляла 1:3000, что для индивидуальных соединений примерно соответствует Ю^М и менее. Исключение составляли нарингешт и флавонолы кемп-ферол и кверцзтин, растворимость которых в воде несколько меньше: Ю'^М. Поэтому последние соединения тестировали в вше насыщенных растворов.

Параллельно, аналогично корням и опаду оценивали аллелопатк-ческую активность смеси равных количеств веществ и препаратов в той же суммарной концентрации. Этим мы также стремились в какой-то степени смоделировать реально воздействующий комплекс компонентов, сопоставимый с естественным. Результаты оценки возможной аллелопати-ческой активности представлены на рис. 6. Сади цианогенные глккози-ды амигдалин и пруназин не активны, что вполне согласуется с имеющимися сообщениями (Ой,Ко, 1977) и подтверждает пригодность срезанных побегов персика в качестве тест-обьекта. Синильная кислота (мы использовали раствор цианида калия) существенно ингибировала тран-спирацшо побегов, но бензальдепщ в таких малых концентрациях, наоборот, стимулировал расход раствора и увеличивал тургор. Активность бензойной кислота, как и некоторых фенольных соединений была невысокой.

__Другая, груша фенольных соедашений - катехины, нарингенин,

п-оксибензойная и п-кумэровая кислоты - оказывали значительное ин-гибирование: в той же степени, что и сшшльнал кислота. Однако, еще более высокую актиность обнаружили смеси веществ и препаратов фенольных соединений. Уровни ингибпрования, расчитанные исходя из представления об аддитивном действии, и получегаше экспериментально оказались достоверно различными. Здесь мы также обнаруживаем эф^кт усиления действия, но уже для выделенных препаратов феноль-

5ЕН»,Ц,.Д[ГИД

ХЛОРОГСНОВДЯ КИСЛОТЛ

СТИМУЛИРОВАНИЕ г

(ШИГДДШ

ПРУ1М5ИН

СИИИЛкИЛЯ кислом

ЕЕНМОММ кмо.вдд

ттпрм * ■ кммцтич +

(>).мм

<.).ОПИКЛ11)|!1Н =3 НЯРИНГЕНИН *

ЦИЛНОГ1НИЫ1

гликошды и и* псотеодныс

_ НЕКОТОРЫЕ

ичип »[НОЛЬНЫ! соединения

ПРЕГМРИТЫ

»вольны*

СОЕДИНЕНИЙ

П-0КСИ51Н10ЙНСЯ КИСЛОМ П-КУМЛРОЮТ кислот*

..II.111.1 ПРОТОКЙТИЮМЯ КИС|10Т4 ишвпшп кффеПндо кислота

НСР

3 5'/.

СМЕСЬ ЕЕЩЕСТВ

ПЕРЕГНИВШИХ КОРНЕШ» 0СТ4ТКМ !ЕЭ КОРН1Й ¡3 ОПЛЕШИ* (1ИСТЫ8

....... I 0ЕРЕ54ННЫ* ПОБЕГОВ

;........' , , 3 ОГМВИШ НЕ5РЕЛШ ПЛОДОВ

-1 ОГМеШП ЛЕПЕСТКОВ ЦЕЕТКОВ

. .,.,. ,. , скссь ПРЕЛЛРЛГОВ ТЕЧЛТО»

-.30 -20 -40 _О 10 20 30 -40 ОТНОСИТЕЛЬНА! АКТИВНОСТЬ , V,

ННГНБИР08ЙНИЕ 1

50

50

Рис. 6. Актиеиость ряда шиившуальньк веществ, препаратов, фенолов и их смесей, содержащихся в персике (тест-обьект побеги персика прироста текущего года). Концентрация веществ и препаратов - 1:3000. Вещества, отмеченные звездой * попользовались в концентрации 1:10000 ввиду малой растворимости в воде.

них соединений, а также для модельных-веществ - цианогенных глнко-зидов, их дериватов и фенольных соединений. С физиолого-биохимической точки зрения это возможно в том случае, когда физиологические механизмы влияния оказываются тесно связанными между собой. Важно подчеркнуть, что в этой серии опытов мы наблюдаем синергизм действия' аллелопатическн активных веществ, но уже на уровне препаратов фенол ьных соединений и индивидуальных веществ.

ОБУСЛОВЛЕННОСТЬ ЭФФЕКТА ФЕНОЛЫШИ СОЕДИНЕНИЯМИ. Далее МЫ проводили опыты, показывающие, что именно фенольные соединения вносят основной вклад в проявление видоспецифической аллелопатической активности водорастворимых веществ корней и спада персиковых деревьев. Экстракт из модельной смеси . источников аллелопатическн активных веществ, изучавшийся ранее, подвергали обработке различными ад-сорбентам^. Мы предполагали, что некоторые из адсорбентов будут из-

£ 30-

а *

х л

и н

20-

2 ,

НСР 95-/. 12

И

10

Л

13 14

_Г)_а_

О

Рис. 7, Влияние различны;': адсорбентов на аплелопатическую активность вытяжки 1:200 из молельной смеси корней и опала персика. Соотношение экстракта и адсорбента 1:20. Цифры над столбцами: 0- исходная вытяжка: после обработки: 1- целлюлозой; 2- КМ-целлюлозой; 3- диатомитом; 4- катионитом КБ-4: 5- внионитом АН-1; 6- анионитом АБ-16ГС; 7- сшшкагелем; 8-окисью алюминия; 9- контрольной почвой; 10- почвой из-под персика; И- катионитом КУ-1; 12- катионитом КУ-2-8; 13-капроном; 14- активированным углем ОУ-1.

бирательно поглощать из раствора отдельные' группы веществ, и что активные компоненты удастся таким образом избирательно удалить и на основе этих данных сделать соответствующие выводы о природе этих соедшений (рис. ?). Среди адсорбентов использовался ряд распространенных хроматографических материалов, включая и ионообменные смолы, а также образцы почвы. Несмотря на то, что материалы десятикратно отмывались ^-ным водим,I раствором фосфорной кислоты [настаивание в течение суток), в качестве контроля к каждому из них использовалась водная вытяжка из этого адсорбента. Для обработки гкстрпкта из смеси корней н опада персика применяли целлюлозу и КМ-

целлюлозу, диатомит, силикагель и окись алкминия, сильно и слабоосновные азшонообменшши, сильно- и слабокислые катионита, порошкообразный капрон, активированный уголь ОУ-1, а также, как уже сказано, два образца почв для сравнения: почвы из-под перста и почвы, взятая за пределами персикового сада. При обработке вытяжек ионообменными материалами чтобы избежать влияния на во.шый режим тест-обьектов изменений кислотности проводили контроль рН до и после обработки.

На рис. 7 показана относительная активность вытяжек, обработанных адсорбентами, по отношению к контрольным вытяжкам из адсорбентов для исключения влияния веществ, экстрзгаг-ованннх из этих материалов. Част* адсорбентов иу«ш1ч-гски не изменили ингибирующую активность модельной смеси водорастворимых аллелопатических агентов персика. Это целлюлоза, диатомит, силикагель, катионит КБ-4, анно-нит АН-1. Другая же часть несколько снизила активность: КМ-целлюлоза. аниошгс АВ-16, катиониты КУ-1 и КУ-2-8. Здесь, возможно, произошло поглощение части , ингибиторов пли веществ-синергистов. Примерно на столько же снизила активность еыгяжки и почва, взятая за пределами плодового сала, Такая почва, как и перечисленные адсорбенты, обладает близкой к ним поглотительной способностью.

К практически полному исчезновению" активности вытяжек привела 5К обработка активированным углем и капроном. Известно, что активированный уголь поглощает практически все органические соединения, в то время как капрон обладает высокой избирательностью в основном к фенольным соединениям. Крайне любопытным оказался и тот факт, что почва, отобранная из корнеобитаемого слоя персиковых деревьев, обладала более высокой поглотительной способностью по сравнен™ о почвой, взятой за пределами сада.

Таким образом, активность экстрактов из корней и опада персика в основном определяется фенольными соединениями.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ И ПОЧВУ. На ркс. 9 приведены хроматограммы экстрактов контрольной и опытной почвы. В. последней в значительном количестве появляется компонент средней полярности. Чтобы определить источники поступления данного вещества в почву, мы проводили сравнительный анализ хроматограчм родных извлечений растительных остатков. Обнаружено, что этот компонент содержится в основном в корнях. Небольшое количество его присутствует в опаде-листьев, побегах и незрелых плодах. Что касается перегнивших корневых остатков, то среди их экс-

- 18 -"А"

Рис,8. Хромагограммы экстрактов контрольной (А) и опытной (Б) почвы. Жидкостный хроматограф "Милихром-Г. Колонка 2х62мм, Зерагоп-С1а, 5 мчМ. А^ , А330 , А^ео 11 ~ огггичеокая плотность элтата при различных длинах волн детектирования. Вгагау - шкапа времени удерживания.

трагируемых веществ это соединение является основным.

Следует отметить, что другие фенольные вещества, зафиксированные нами в корнях, побегах и опаде методом ЕЭЖХ (фенолкарбоновые кислоты, простые катехпны, депеиды оксикоричных кислот, флавонолы, нарингенин и их гликозиды), обнаружить в почве после разложения остатков персика практически не удается. По-видимому, оли превращаются либо в гумусоподобные соединения, практически нерастворимые в метаноле, либо подвергаются полной микроорганизменной деструкшш до углекислого газа.

Обнару'живжщинсл в экстрактах опытной почвы и экстрактах из корней и опала персика компонент, очевидно, достаточно устойчив к микробиологическим трансформациям. Благодаря этому он может сохраняться в почве длительное время. Мы осуществили препаративное выделение этого вещества из опытной почвы, а затем из разлагающихся корневых остатков персика, Чистоту препарата контролировали с помощью БЭЖХ, на оснозаши известных авторам литературных данных и полученных характеристик (-7Ф-. ПК-, ПМР- и масс-спектры) соединение было окйиествлэяо о выделенным ранее из корней персика фенольннм ингибитором Pia (Ohigashi et al., 19-32).

Это вещество, принадлежащее я группе конденсированных флаванов' в биотестг проявляет активность при содержании до 1:50000 (20 мг/л, пли 5 ■ 10И (рис. 9) при 995-1юй достоверности различия. Водные зктржты перегнивши корневых остатков и растворы препарата с той ке концентрацией проявляют одинаковую активность. Это значит, что действие остатков скорее всего обусловлено именно этим веществом.

Мы считаем, что исследованное соединение является основным Фактором аллелопатического последействия персика (ФАЛЛ). Можно предположить, что накопление ФАЛЛ в почве персиковых насаждений - проявление своеобразного и малоизученного механизма регуляции роста, развития и возобновления на уровне растительного. сообщества. . Охарактеризованное нами вещество, как и флоризин яблони (Мороз, Буко-лова, 1977), можно рассматривать как специфический маркер произрастания персика на данном месте. Вероятно, на основе анализа содержания этого компонента можно будет прогнозировать эффект аллелопатического последействия персика и изучать пути его регулирования.

ВОЗМОЖНОСТЬ ОЦЕНКИ ТОЛЕРАНТНОСТИ ПОДБОЕВ ПЕРСИКА К-ЕГО АЛЛЕЛО-ПАТИЧВЖОМУ ГОСЛИШЙСТЕИЮ. Нами также была . изучена возможность применения разработанного биотеста'йа побегах для оценки устойчивости различных подвоев к аллелопатическому последействию персика.

Рис. 9. Активность очищенного Фактора последействия персика, перегнивших остатков корней и экстрактов почвы из-под персика. Столбцы слева направо: 1, 2 и 3- растворы выделенного фактора последействия соответственно 1: 2000, 1:10000 и 1: 50000; 4 и 5 -растворы препаратов (1:7500) подвижны/, веществ соответственно почвы из-под персика и контрольной; 6 и 7- растворы препарата фенолов из перегнивших корневых остатков персика соответственно 1:2000 и 1:10000.

ло может оказаться полезным в селекционной работе. Мы обнаружили

определенные различия в физиологической реакции побегов различных подвоев персика (алыча, абрикос, сеянцы различных сортов, подвидов

и гибридов персика» по отношению к подвижным веществам почвы из

под персика, Поэтому является перспективной разработка на основе данного биотеста методики скрининга селекционных форм персика по этому признаку.

- 21 -ВЫВОДЫ:

1. Установлено, что именно фенольнне соединения выступают основным фактором аллелопатического последействия персика.

3. Обнаружено, что эффект последействия может синерпгески усиливаться Есем комплексом Еодорастворимнх веществ корьевых остатков и опада персиковых деревьев, Еключая опаЕшие лестья, обрезанные побеги, опад лепестков и недозрелых плодов.

3. Доказано, что аллелопагнческое последействие персша в основном обусловлено одним из ташинов корней, т. н. фактором аллелопатического последействия персика (если пользоваться биохимической терминологией), который поступает в почву как в результате разложения остатков перста, так п в составе корневых выделений взросли деревьев,

4. Показана устойчивость данного вещества в условиях почем, что подтверждает возможность его длительного аллелопатического действия.

5. Фактор .аллелопатического;последействия препаративно выделен из корней и мочви. Его аллелопатическая активность подтверждена результатами лабораторного опыта.

6. Разработан пригодный для оценки видоспецифической аллелопати-ческой активности бпотест на срезанных побегах персика прироста текущего года, который может применяться для оценки толерантности подвоев персика к его аллелопатическому последействию этой культуры при бессменном выращивании.

7. Предложены новые подходы к использованию метода ВЭЖХ в аллело-патических исследованиях и разработаны методики подготовки и анализа экстрактов растительных остатков и почен.

8. По относительному количеству данного компонента, определяемого .методом ВЭЖХ, можно будет прогнозировать эффект аллелопатического последействия персика, а также изучать пути его регулирования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Результаты проведенных нами исследований экспериментально подтверждают как классические представления об аллелопатическом взаимодействии, так и предположения о последействии посредством всей совокупности экзометаболитов растений-доноров и развивают концепцию видоспецифического влияния с участием одного или нескольких аллело-патически активных веществ. Получены новые данные, демонстрирующие сшергическое взаимодействие Есего набора метаболитов корней и опа-

да персика, активно и пассивно поступающего в почву при выщелачива-нш и диффузии. Основной эффект последействия обусловлен одним веществом (конденсированным проантоцианиднном), способным, в отличие от других вкзомегаболитов, длительно сохраняться в почве. Принципиальна новым было обнаружение этого компонента в составе корневых эксудатов персика, что свидетельствует об активном его выделении во вне-нвю среду. Это позволяет предположить более сложный адаптивный биологический механизм последействия на уровне сообщества.

1. Грехов В,П., Безменов А. Я. Высокоэффективная жидкостная хроматография фенолкарбоновнх кислот персика //V Всес.симпоз.по фе-нольн.соед. Тез. докл. Б: Секц. хим.- Таллинн: Инст.эксп.биол., 1S87.- С.26-27.

2. Грахов В. П. Аллелопатическая функция фенольных соединений пер-оша //Всес. совещ. "Агрофцтоценозы и экол. пути повыш. их ста-бильн, и продуктнвн.". Тез. докл. - Ижевск: Изд-во Удм. гос. унта, lasa.- с.32-33.

2. Грахов В. П. Алелопатична роль фенольнлх сполук Peraica vulgaris ЫШ. //Укр.бот.журн, 1990,- 47, N4,- 0.S8-100.

4. Грахов В. П. Фенольные соединения и аллелопатическая аутоинтоле-рантность персика //VI Межрегиональная конференция молодых ученых "Актуальные вопросы физиологии растений и генетики". Киев, 1983 г. Сб.статей.- Киев,- 1991. (в печати).

5. Грахов В.П., Мороз П.А. О фенольном факторе аллелопатического последействия персика //Докл. АН УССР. Сер.Б, 1990,- 113.- 0.62-64.

6. Грахов В.П., Мороз П.А. К проблеме аллелопатического последействия персика //Круговорот аллелопатичееки активных веществ в биогеоценозах /Гудков H.H. и др.- Киев: Наук, думка.- 1991,- С. 46-56.

7. Грахов В.П.; Безменов А.¡7., Мороз П.А. Фенолкарбоновые кислот растительных остатков и опада персиковых деревьев //Физиол. и биохим, культ, раст.- 1991.-23. (а печати).

Подп. в печ. 14.10.91. Формат 60x84/16. Бумага тип. Офс.печать. Усл.печ.л, 1,39. Усл.кр.-отт. 1,39. Уч^изд.л. 1,0. Тираж 100 экз. Зак. V . Бесплатно.

Отпечатано в Институте математики АН Украины. 252601, КиеЕ 4. ГСП, у.1. Репина, 3

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАШИ.