Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активность и изоферментный спектр креатинкиназы в тканях и сыворотке крови крыс при токсическом действии этанола и ацетона

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Активность и изоферментный спектр креатинкиназы в тканях и сыворотке крови крыс при токсическом действии этанола и ацетона"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСШЙ ГОСУДАРСТВЕННА УНИВЕРСИТЕТ

На прозах рукописи

Ольга Николаевна

АКИВНХТЬ И ИЗОЭКК51НШ СПЕКТР КРЕАТИНКИНАЗЫ 3 ТКАНЯХ И СЫВОРОТКЕ ЬРОЕИ КРЫС ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ДЕЙСТЕКИ ЭТАНОЛА И АЦЕТОНА

03.00.04 - 6::охи."йя

Автореферат

. диссертации на'сокскшие ученой степени кандидата биологических наук

чу

. САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1993

/ V

9

2

у

работа выполнена на кафедре биохимии биолого-почвекного факультета Санкт-Петербургского государственного университета и в отделе фармакологии Института ькспериментальной медицины РосскПской академии медицинских наук.

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор ЛЫЗЛОВА С.Н.; доктор медицинских наук, профессор БОРОДКИН О,С.

Официальные оппоненты: академик- РАМН, доктор

биологических наук, профессор АШМАРКН И.П.; доктор биологических наук, профессор АРУТШШ A.B.

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский медицинский институт им. акад. И.П.Павлова

Загаита диссертации состоится " //" ^Р&Р199 3 г.

в /п час. на заседании специализированного совета К С63.57.09 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. д. 7/9, ауд. 90.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.¡.'.Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан " //

Ученый секретарь специализированного

совета, кандидат биологических наук МАРКОВ А.Г.

ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми. В настоящее время среди причин, вызывающих преждевременную смерть людей, алкоголизм и токсикомания стоят на одном из первых мест в мире наряду с сердечно-сосудистыми и онкологическими заболеваниями. Одним из самых тяжких и опасных последствий алкоголизма является его влияние на потомство. Комплекс возникающих при этом нарушений, названных алкогольным синдромом плода (АСП) _ одна из основных причин умственной отсталости дете;~1 (Кругликов Р.И., Майзелис М.Я., I9G7). В последнее время, наряду с этанолом, в целях достижения опьянения и эйфории, широко распространился среди молодкх люде", особый тип токсикоманий, а именно: ингаляции,органическими растворителями, такими как толуол, ацетон, бензин, хлороотрм и др. Кроме того, многие из этих соединении входят в состав прокшленньк газов, влияат_на окружающую среду, наносят врзд здоровью людей (Ковалевский Г.А. и др., 1985; Паткина H.A. л др., 1989). Высокая токсичность указанных соединений и связанная с их употреблением реальная угроза тяжелых порзлений различных органов и тканей определяют важность исследования биохимических изменений, происходящих при алкоголизме; АСП и токсикомании.

Известно,' что при нарушениях регуляции вегетативных функций, проявляющихся при устойчиьых патологических состояниях, происходит изменение тканевого энергетического обмена. Крсатпн-кинаэа (КК) (АТ<5: креатин- rf -фосфотрансфераза; 2.7.3.2) является одним из важнейших ферментов энергетического обмена в животной клетке, активность и изоферментный спектр которой могут быть показателями структурного и функционального состояния различных тканей многоклеточного организма (Лызлова С.Н., 1987). Таким образом, существует реальная возможность участия КК в механизмах клеточной адаптации, вызванной в. ответ на введение в организм высоких доз алкоголя и ацетона. Сравнительное исследование КК системы в энергообеспечении ЦНС, миокарда и мнац при ;\язлк ччьгс патологических состояниях," модолируеь:кх на животных, может !!...з?ь большое значение я расшифровке патогенеза хронического алкоголизма, алкогольного синдрома плода и токсикомании; позволит выявить об^ие закономерности влияния токсичес-

ких соединений на энергетический обмен различных тканей.

Кроме того, в настоящее время отсутствуют объективные биохимические критерии этих заболеваний. Следовательно, определение активности и изоферментного спектра КК в сыворотке крови может найти применение в клинической практике в качестве диагностического теста наследуемых заболеваний.

Цель к задачи исследования. Основной целью работы явилось сравнительное изучение токсических аффектов этанола и ацетона на активность и изоферментный с.пектр КК в тканях и в сыворотке крови крыс, а также исследование этих показателей у эмбрионов и потомства алкоголизированных кивотных. В соответствии с поставленной целью в задачи работы входило:

1) создание, экспериментальной установки для ингаляционной затравки животных различными органическими растворителями и моделирование хронической алкогольной и ацетоновой интоксикации крыс;

2) моделирование алкогольного синдрома плода (использовали методику, разработанную в отделе эмбриологии НИИЭМ PAf.ll);

3) исследование острого .и хронического воздействия этанола на динамику .активности КК мозга эмбрионов крыс, а также особенности формирования изоферментного спектра КК в мозге и сердце эмбрионов алкоголизированных крыс на разных стадиях внутриутробного развития; \

4) исследование динамики изменения активности и изоферментного спектра КК в мозге, сердце и сыворотке крови потомства крыс на разных стадиях постнатального развития;

5) изучение антиалкогольного действия фитоздаптогенов из семейства аралиевых: полисциас и элеутерококка - на некоторые показатели физического развития эмбрионов и потомства алкоголизированных крыс, а также на активность и изоферментный спект; КК в мозге, сердце, сыворотке-крови эмбрионов и потс.-.ства крыс с признаками АСП;

6) сравнительный анализ активности и изоферментного спектра КК в мозге, сердце, скелетных мышцах и сыворотке крови крыс Чсрел 2 суток и через I месяц после окончания хронической затравки .тивоткых этанолом и ацетоном;

7) исследование изоферментного спектра КК в мозге крыс,

потреблявших 15%-н этанол в качестве единственного источника питья в течение одного года;

8) разработка быстрого способа разделения изоформентов КК з тканевых экстрактах крыс с помоцыэ кодификации метода взрти- • кального электрофореза в полиакриламидном геле в пластинах.

Научная новизна работы. Впервые проведено исследование токсических эффектов этанола на активность и изоформентккЯ спектр КК в тканях, сыворотке крови эмбрионов и потомства крис с признакам»! АСП, а также дан сравнительной анализ этих :-.:о биохимических показателей при хроническо."; алкоголькоГ: и ацетоновой интоксикации половозрелых крыс.

Показано, что острое однократное воздействие этанола на беременны?: самок крыс приводит к снижению активности КК а мозге плода с последующим воссганоатенкем эначени,'? активности КК по мере снижения концентрации этанола в крови (кейрэтоксичес-коо действие этанола). " _ .

Впервые методом ионнообменной хроматографии на колонке с ДЭАЕ-сефадексом А-50 установлено, что наряду с ВВ-КК в мозге 20-дневных эмбрионов крыс.присутствуют в небольшом количестве Мь1- и МЗ-КК. Хроническая алкоголизация эмбрионов и потомства крыс в течение пренатального периода приводит к снижения активности всех трех изоферментов Ж.

Показано, что хроническая алкоголизация беременных самок крыс приводит к повышению активности КК .в сердце эмбрионов, а также з сердце и сцзсротке крови потомства крыс; изофзрмептныл спектр КК при этом сдвигается в сторону МВ- и ВЗ-КК, что мо'кет быть одним из доказательств задержки развития крысят с призна-, нами АСП. , '

Впервые установлено, что антиалкогольное действие нозого растительного адаптогена полисциас сопровождается нормализацией значения активности и изоферментного спектра КК в тканях эмбрионов, а также в тканях и сыворотке крови потомства ачкого-' лноирозаггньк крыс.' Влияние препарата полисциас на исследуемые к £-•.<;: г*иохк:'::пеские показатели сходно с действием элеутерококка.

показано принципиальное сходство ь деПстакя этанола i; аце-'л, на изоферментньй спектр КК в тканях и емворотке крови кркс при хронической алкогольной и ацетоново" интоксикации : в скелетных .мшцах крыс наряду с ÍÜÍ-16C псябл?:огс# LG- и -

ВЗ-КК, в сердце увеличивается доля МВ-КК (в случае ацетоновой интоксикации обнаруживается также повышенная активность ВВ-КК), в мозге, кроме нейроспецифнческого ЕЗ-КК, синтезируется 11 значительном количестве 1£М-изофермент КК.

Научно-практическое значение работы. Обнаруженные в работе существенные изменения активности и изоферментного спектра КК в тканях и сыворотке крови крыс при токсическом действии этанола и ацетона расширяют представления о молекулярных механизмах, лежких в основе патогенеза алкоголизма, алкогольного синдрома плода и токсикомании.

Практическая ценность работы определяется возможностью использования креатинкиназного теста в качестве дополнительного биохимического критерия при диагностике вышеупомянутых патологических состояний. Полученные в работе данные могут служить одной из рекомендаций- для практического применения препарата пслисциас в качестве антиалкогольного средства, предотвращающего развитие АСП. Кроме того, креатинкиназный тест может быть предложен в качестве высокочувствительного маркера для изучения действия лекарственных препаратов на энергетический обмен в клетке при различных патологических состояниях.

Разработанная ингаляционная установка для затравки животных и камере различными органическими растворителями может быть использована в научно-исследопатсльской работе при создании экспериментальных моделей хронической и острой интоксикации.

Предложенный быстрый и чувствительный способ разделения кзоферментов КК в тканевых экстрактах с помощью модифицированного нами метода вертикального электрофореза в полиакриламид-ном геле в пластинах может быть рекомендован для применения в экспериментальных и клинических лабораториях.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на соеместном научном семинаре СССР - Западный Берлин "ингаляционные токсикомании: клинико-экспериментаяьные аспекты" (Леиин-грс-д, 1969), на УШ Советско-Итальянском симпозиуме по нейропси-хос.армакологии (Ленинград, 1990), на конференции "Проблемы биологии и медицины сегодня и завтра", посвященной 100-летию Инс-ситута экспериментальной медицины (Ленинград, 1990), на конференции Физиологии ЛГУ "Доминантные механизмы поведенческой о,:;';г.':тщ;и" (Ленинград, 1930), заседаниях кафедры биохимии

СПбГУ, отдела .фармакологии ШИЭМ РАМН и кафедры биохимии СППМИ (1987-1991 ггЛ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано б работ.

Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, их обсуждение, выводы и библиографический указатель. Текст диссертации изложен на 186 стр. машинописного текста," иллюстрирован 13 таблицами и 27 рисунками. Библиографический указатель содержит 80 отечественных и 165 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССВДОВАНШ ■

Работа была выполнена на белых беспородных крысах-самцах и самках массой 200-240 г (питомник РАМН, "Рапполово'Ъ

При моделировании АСП самкам в период беременности давали 2056-й раствор этанола, что обеспечивало потребление этанола в среднесуточной дозе 10 - 11,6 г/кг (Котин A.M., 1986).

В параллельных экспериментах самкам, начиная с первого дйи беременности, в качестве единственного.источника питья давали' 20^-й раствор этанола совместно с препаратами- фитоадапто-pöböb: полйсциас и элеутерококком, которые добавляли в питьевой раствор этанола в соотношении I:'I25 до конечной концентраций

Контрольные животные в этой серии. экспериментов получали » качестве питья как воду, так и воду совместно с препаратами фшзадаптогенов в тех же концентрациях, что и в опыте.

Острое- однократное введение этанола самкам.крыс проводили, внутрижелудочио в дозах 1.и 3 г/кг на 14-й день беременности. Контрольной группе внутрижелудочно вводили эквивалентный объем воды. Шивотных брали в опыт через I, 3 часа и I сутки.

. В целях создания модели хронической алкогольной и ацетоновой интоксикации нами была разработана оригинальная установка для ингаляции животных органическими растворителями (Кашек О.Н. и др., 1991). Затравку кркс парата этанола осуществляли в ночное время по 12-14 часов ежедневно в течение 3-4 недель. Для этой серии окспериментов проводили отбор крыс с высокой алкогольной мотивацией по .длительности "алкогольного наркоза" (Буров П.В., Ведерникова H.H., 1985). Максимальная концентрация

6.

паров этанола в опытной камере была 60 мг/л. Ингаляции крыс парами ацетона проводили в течение 3-4 недель no I - 1,6 часа ежедневно. Максимальная концентрация ацетона в камере составляла 310 мг/л. Адекватность модели оценивали по следующим параметрам: уменьшение массы тела подопытных животных, увеличение толерантности крыс к этанолу и ацетону, по поведенческим реакциям крыс в тесте "открытое поле";

Цельный мозг и сердце эмбрионов, а также мозг, сердце и скелетные мышцы крыс промывали 0,1 М трис-HCI буфером (pH «• 7„4) и гомогенизировали в 'ом же буфере в соотношении 1:4 (вес/объем). Гомогенаты центрифуг' ровали при 18000 в 50 мин. Конечный супер-натант отбирали и и< пользовали для определения активности и изо-ферментного спектр.'/ КК. Концентрацию белка определяли микробиу-ретовым методом (Fсчетов Г„А., 1980). Активность креатинкиназы определяли в тканое и сыворотке крови колориметрическим методом по реакции образования креатина (Петрова Т,А., Лызлова С.Н., 1985), Изоферменти КК разделяли методом ионнообменной хроматографии на колонке с ДЭАЕ-сефадексом А-50 (ыогсег , 1974) в модификации (Yaenineh, Lewie, 1984) , а также с помощью модифицированного нами метода электрофореза в 7,5%-м полиакриламид-ном геле. После окончания электрофореза белки фиксировали в ТХУ и окрашивали куыасси по методу Ригетти и Чиллеми (Остер-ман Л.А., 1983). Гистохимическое прокрашивание гелей на активность осуществляли по методу (Trainer, Gruenlng, 1968).

Результаты экспериментов обрабатывали статистически, используя t-критерий Стьюдента.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТУ И ИХ 0БСУВДЕНИЕ

I. Влияние острой и хронической алкогольной интоксикации на активность и изоферментный спектр КК в мозге и сердце эмбрионов крыс. Предотвращение эффектов отанола с помощью фитоадап-тогенов из семейства аралиевых, полисциас и элеутерококка.

При изучении влияния хронической алкогольной интоксикации на активность и изоферментный спектр КК в мозге крыс нами установлено снижение активности КК в мозге эмбрионов на всех исследованных нами сроках внутриутробного развития (13-20 сутки) (рисЛ). Наибольшее различие между контрольными и опытными зна-

чениями отмечено в более ранние сроки антенатального развития (13-14 сутки). Это соответствует представлениям о том, что этанол оказывает -значительное влияние на ранние стадии развития зародыша, включающие "критические точки" внутриутробного развинтил, когда эмбрион наиболее чувствителен к неблагоприятным воздействиям (Кругликов Р.И., Майзелис М.Я., 1987).

А

Е/мг 16

12 8

13 15 19 21 (сутки)

РисЛ. Активность КК в мозге эмбрионов крысы при хронической антенатальной' алкоголизации.

(I - контроль, 2 - опыт).

-Нг

О I 2 3 4 "" 24 (часы)

Рис.2. Динамика активности КК в мозге 14-дневных эмбрионов крыс при остром однократном воздействии этанола. (----контроль,— - опыт)

Исследование острой алкогольной интоксикации на динамику активности КК в мозге 14-дневных эмбрионов показало, что через I час после однократного введения этанола в дозе I и 3 г/кг активность КК снижается на 25% относительно контрольных значений, через 3 часа активность КК возвращается к контрольному уровню, а через 24 часа - становится выше нормы на 36$ (рис.2). Эти данные согласуются с предположением Фишера о существовании двухфазного дозозависимого эффекта на синтез белков мозга ( ?1в-оЬег , 1985). ;

Анализ изоферментов КК в мозге 20-дневных эмбрионов с помогло метода ионнообменной хроматографии на колонке с ДЭАЕ-се-фадексом А- 1 показал, что в контрольной группе животных, наряду с нейроспецифическим изоферментом ВВ-КК, присутствуют в небольшом количестве ММ- и МВ-КК, Хроническая интоксикация этано-

ЯШ CfWumf уэдрряУШИв этих иэоферментов в мозге плодов крыс.

5 .эксперимента* до изучению антенательной алкоголизации од активность р сердце 20-дневных эмбрионов крыс нами пока-адно, что активность КК при хроническом воздействии этанола рчэрастает э Ij8 раза по сравнение с контрольными значениями. Прц исследования изоферыентного состава КК в сердце 20-дневных омЗршдеэ крыс обнаружено наличие всех трех изоферментов КК, Причем преобладающими формами являются ММ- 47% и MB - 49/5, а на дол» ВВ-КК приходится лишь от общей активности. Антенатальная алкоголизация приводит к значительному увеличению доли ВВ-КК в сердце зародышей крыс, до 23$ от общей активности КК. Увеличение содержания "эмбриональных" форм КК при такого рода воздействии является'одним из биохимических доказательств задержки развития алкоголизированного потомства. Кроме того, эти данные согласуются с нашими результатами по тератогенному влиянию этанЬла на показатели массы мозга и тела эмбрионов крыс.

Таким образом, изменение активности и изоферыентного спектра КК в клетках мозга и кавдиомиоцитах плода является проявлением эмбриотоксического действия этанола.

При изучении антиалкогольных свойств препарата полисциас нами установлено, что этот фитоадаптоген предотвращает эффекты этанола на активность КК в мозге 15-дневных эмбрионов сходным образом с элеутерококком, противоалкогольное действие которого описано в литературе (Чеботарь H.A. и др., 1986). Показано нормализующее действие полисциас на активность и изоферментный спектр КК в мозге и активность КК в сердце 20-дневных пренаталь-но алкоголизированных плодов. Кроме того можно отметить также тенденцию к нормализации изоферыентного спектра КК в сердечной мышце 20-дневных эмбрионов алкоголизированных крыс при потреблении беременными самками наряду с 20^-м этанолом раствора полисциас.

Полученные данные согласуются с предположением о том, что препарат полисциас, так же как элеутерококк, оказывает антитератогенное влияние на потомство алкоголизированных животных. Нормализующее действие фитоадаптогенов на активность и изоферментный спектр КК в мозге и сердце эмбрионов крыс указывает на возможность фармакологической коррекции нарушений энергетического обмена в мозговой и сердечной ткани плода, вызванных хроничес-

цоЯ антенатальной алкоголизацией,

П, Влияние хронической пренатальной алкоголизации на активность и изоферментный спектр КК в мозге, сердце и сыворотке крови потомства крыс с признаками АСП. Предотвращение эффектов этанола с помощью препарата полиспиас.'

Нами установлено, что активность КК в сыворотке крови пре-натально алкоголизированных крыс выше контрольного уровня на всех исследованных сроках постнатального развития <25, 50 и 70-е сутки) (табл.1). Анализ изоферментного спектра КК в сыворотке крови крысят показал, что преобладающим иэоферментом является ММ-КК как в контрольной, так и в опытной группе животных. Вместе с тем у. потомства с признаками АСП наблюдается повышенное содержание МВ- и ВВ-КК (см. рис.5), что является одним из доказательств токсического действия этанола на клеточные мембраны мозга и сердца. При изучении изоферментного спектра КК нами отмечено, что в мозге крыс, наряду с нейроспецифическим иэоферментом ВВ-КК, присутствуют в небольшом количестве ИМ- и МВ-КК. Хроническая алкоголизация сдвигает изоферментный спектр в сторону МВ-КК (рис.3). Этот факт свидетельствует о том, что одним из возможных источников повышенной активности МВ-КК в сыворотке крови может быть не только сердечная, но-также и мозговая ткань.

Исследование влияния хронической алкоголизации беременных самок на активность КК в сердце потомства крыс показало, что общая активность фермента несколько выше контрольного уровня на всех исследованных сроках постнатального развития, вместе с тем различия медду контролем и опытом не так выражены, как у эмбрионов (см. табл.1). Изучение изоферментного спектра I® в сердце пренатально алкоголизированных крыс показало наличие повышенной активности ВВ-КК, особенно на 8-е сутки постнатального развития (рис.4, А), что также является "одним из биохимических доказательств задержки развития животных с признаками АСП.

Препарат полисциас нормализует -значения активности КК на всех исследованных нами сроках в сыворотке крови Потомства алкоголизированных крыс (см. табл.1), а также изоферментный спектр КК к 70-му дню постнатального развития (рис.5, Б Ш). Кроме того, полисциас снижает уровень МВ-КК в мозге и ВВ-КК в сердечной мышце (рис.3 и 4, Б), Эти эксперименты также доказывают антиалкогольное действие препарата. Определение активности МВ- и ВВ-КК

Таблица I

Динамика активности КК в мозге, сердце и сыворотке крови потомства крыс в различные

возрастные периоды.

Ткань или биол. жидкость ■ ; ' Показатели активности КК

мозг (Е/ыг) сердце (Е/мг) сыворотка 1фови (Е/мл)

Возраст крысят в днях Группа животных 8 25 50 8 25 50 25 50 70

Контроль а - 10- 18,8+ 1,2" . 26,9+2,7 39,6+ 3,9 ~ 64,4+ 6,0 **' 171+15 -220+22 2,1+ 0,2 2,7+ 0,2~ . 2,9+ 0,2"

"Этанол" а= ю 12,7+* 1.3 22,9+2,4 35,8+ 3,2 ~ 72,5+ 7,0 194+20 260+26 3,5+ж 0,3 3,7+* 0,3 4,9+* 0,4-

"Этанол + полисциас" а= 10 13,9+* 24,8+2,9 38,8+ 3,9 ~ 65,5+ 6,2 ~ 210+20 260+20 2,5+ 0,2" 2,9+ 0,3*" 3,1+ 0,3

Примечание: л - число животных в каядой группе; ж - достоверность различий по сравнению с контролем (р^0,01).

А

100*

80 60

40 20

А

юо/.

80 60

40

20

I • п ш

Рис.3. Изоферментный спектр КК в мозге 35-дневного потомства крыс.

л ^ г! и

г. и

и.

г ■ 1 Г ц т

ш ш Ж

А I П Ш Б I ПШ

Рис.4» Изоферментный спектр КК в сердце 8 (А) и 50-дневного д потомства крыс (Б).,

1001.

80

60 40

20

Л,

Г1! ГП

гн

Ш ш Ш ....

А I П Ш Б I П Ш

Рис.5. Изоферментный спектр КК в сыворотке крови 25-дневного (А) и 70-дневного потомства крыс (Б).

. (На рис.3-5 обозначено: I - контроль; П -Чэтанольная группа; Ш - "этанол + полисциас"; □ - Ш-КН, Ш - МВ-КК, Н - ВВ-КК)

12.

в сыворотае крови может служить дополнительным биохимическим тестон при диагностике АСП.

П. Влияние хронической интоксотгадаи этанолом и ацетоном на активность и изоферментный спектр Ш в мозге, сердце, ске-' летают мшпах и сыворотке крови крыс»

Как показали наши исследования, активность- Ш « сыворотке крови крыс, подвергавшихся хроническому воздействию этганолои и ацетоном, значительно повышается. Анализ иэоферкентного состава КК в сыворотке крови показал,' что в ovaичяе vs контрольной группы, где активность представлена преимущественно Ш-КК, в группах ингалированных крыс наблюдается резкий сдвиг изофер-ментного спектра КК в сторону ЫВ- и ВВ-КК (рис,6> А), Причем через I месяц после прекращения ингаляции эти показатели- вв возвращаются к контрольному уровню (рис.6, что- указывает на довольно стойкие биохимические изменения, происходящие а организме при хронической алкогольной и ацетоновой интоксикацииг

А 100*

80 60 40 20

г*- Г*1

X ñ п

Ü - ш i»

А I П • Ш Б I . П Ш Рис.б. йзоферыентный спектр Ж в сыворотке крови крыс через

2 суток (А) и через I месяц (Б) после окончания хрони-. ческой интоксикации этанолом и ацетоном (здесь, а также на рис.7-9 обозначено: I - контроль, П - "этанольная группа", 1 - "ацетоновая группа"; □ - Ш-КК, Щ - МВ-КК, -В - ВВ-КК).

Как ухе было отмечено, значительное повышение активности МВ- и ВВ-КК а сыворотке крови может свидетельствовать о Поражении клеток мозга и сердца."Исследование активности КК в мозге "ин-галированныг"крыс каких-либо информативных данных не дало. Вместе с тем в мозге подопытных животных нами было обнаружено значи-

тельное содержание ММ-КК (до 10% от общей активности) (см. рис.7, А). Результаты проведенных исследований изоферментного профиля КК через I месяц после отмены этанола и ацетона свидетельствовали о том, что содержание ММ-КК в мозге крыс не только не снижалось, но даже увеличивалось, особенно в ацетоновой группе (до 43^ от общей активности КК) (рис.7, Б). Кроме того нами установлено, что в мозге крыс, которые в течение I года в качестве единственного источника питья получали только 15%-й этанол, содержание ММ-КК было в 2 раза выше, чем в контрольной группе животных того же возраста. Таким образом, можно предположить, что этанол и ацетон стимулируют синтез Ш-КК в мозге крыс, что указывает на необратимый характер воздействия указанных соединений на креатинкиназу в клетках мозга.

При исследовании изоферментного спектра КК в сердечной и скелетной мышцах хронически ингалированных крыс назад были обнаружены сходные изменения, а именно: изоферментный профиль едзи-гается в сторону МВ-КК при обоих типах воздействия (рис.8, 9). Кроме того, при токсическом действии ацетона возрастает также доля ВВ-КК в скелетных и сердечных мышцах крыс (рис.8 и 9, А). Появление повышенного содержания "эмбрионального" изофермента в скелетных и сердечных мышцах половозрелых крыс-, возможно, свидетельствует о дерепрессии гена, ответственного за синтез В-субъединицы КК. Наличие аналогичных изменений, обнаруженных Шапиро ( Зсйар1га , 1963) ' в изоферментном спектре КК в денер-вируекых скелетных мышцах животных, а также при мышечной дист-рофии'у людей, косвенно может свидетельствовать о сходных нарушениях, происходящих в мышцах при хронической интоксикации этанолом и ацетоном.

Результаты экспериментов показали, что через I месяц после прекращения ингаляции как этанолом, так и ацетоном.значения активности и изоферментный спектр КК в скелетных и сердечных мышцах воззращаются к контрольному уровню в отличие от мозга, где нормализации этих параметров не происходило. Следовательно, эти данные предполагают неодинаковую чувствительность различных клеток к токсическому действию исследуемых нами веществ.

Таким образом, на основании результатов нашей работы можно предположить сущсстгование общих механизмов нарушения энергетического обмена при алкоголизме и токсикомании. Изоферменти же

А I П Ш БГ П Ш

Рис.7. Изоферментный спектр КК в мозге крыс через 2 суток (А) и через I месяц (Б) после окончания хронической интоксикации этанолом и ацетоном.

А

100*

80

60 40

20

Рис. А

юо*

80 60 .

' 40

20.

Г*1 Г*1 Г1!

Г*1 1

% ц ц щ

/Ам 1 * ш ш, Ш-

А I П Ш Б I П III

8. Изоферментный спектр КК в сердце крыс.через 2 суток (А) и через I месяц (Б) после 'окончания хронической интоксикации этанолом, и ацетоном.

Г*1 Г*1 Г*- Г4-. Л-

-

ш ш

А I П . Ш • Б I П Ш

Рис.9. Изоферментный спектр КК в скелетной мышце крыс через 2 суток (А) и через I месяц (Б) после" окончания хронической интоксикации этанолом и ацетоном.

КК могут служить высокочувствительными маркерами морфофункцио-надьных нарушений тканей при изучаемых нами патологических состояниях.

ВЫВОДЫ '

1. Острое однократное введение этанола внутрижелудочно в дозах I и 3 г/кг самкам крыс на 14-й день беременности приводит к изменению активности КК в мозге эмбрионов: через I час после введения активность КК уменьшается на 25$, через 3 часа прибли-

- кается к контрольному уровни и через сутки увеличивается на 36%.

2. Хроническая алкоголизация беременных самок крыс приводит к снижению активности КК в мозге эмбрионов на всех исследованных сроках внутриутробного развития.

3. В мозге 20-дневных плодов крыс и 35-дневных крысят, наряду с ВВ-КК, присутствуют в небольшом количестве ММ- и МВ-КК. Активность всех трех изоферментов КК в мозге 20-дневных эмбрионов алкоголизироЕанных крыс снижается.

4. Хроническая антенатальная алкоголизация беременных самок крыс вызывает увеличение активности КК в сердце 20-дневных эмбрионов и потомства с признаками АСП, а также перераспределение изоферментного спектра в сторону MB- и ВЗ-КК.

5. Пренатальное воздействие этанола приводит к увеличению активности КК и сдвигу изоферментного спектра КК в сторону МЗ-и ВВ-КК в сыворотке крови потомства алкоголизированных животных; источниками повышенной активности MB- и ВЗ-КК в сыворотке крови могут быть как ткань мозга, тал' и сердечная мыпца.

6. Зитоадаптоген полисциас оказывает нормализующий эффект на активность и изоферментный спектр КК в мозге и сердце эмбрионов и потомства алкоголизированных крыс, а тагасе в-сыворотке крови животных с признаками АСП.'

7. Хроническая интоксикация этанолом и ацетоном приводит к сходным изменениям в активности и изоферментном спектре НК в тканях и сыворотке крови половозрелых крыс, а именно: а.ттивнос-ь КК в сыворотке крови и сердце возрастает при обоих типах воздействия, кзоферментнкй спектр КК в сыворотке крови и скелетных мышцах сдвигается в сторону MB- и ВВ-КК, в сердце повышается активность iV3-KK, в мозге - ММ-КК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ'

1. Машек О.Н. Активность и изоферментный спектр креатин-киназы в тканях и сыворотке крови крыс при хронической интоксикации этанолом и ацетоном // Доминантные механизмы поведенческих адаптаций:• Тез. докл. конф. Л., 1990. Вып.2. C.I4-I5.

2. Бородкин Ю.С., Усатенко М.С., Машек О.Н. и др. Биохимические маркеры алкоголизма // Тез. докл. УШ советско-итальянского симп. по нейрофармакологии. Л., 1990. С.II.

3. Шабанов П.Д., Усатенко М.С., Машек О.Н. и др. Диагностические критерии и основные принципы лечения алкоголизма // Проблемы медицины и биологии сегодня и завтра: Тез. докл. конф., посвященной 100-летию Института экспериментальной медицины

АМН СССР. Л., 1990. С. 126-127.

4. Машек О.Н., Лызлова С.Н., Бородкин Ю.С. и др. Влияние хронической интоксикации этанолом и ацетоном на активность и изоферментный спектр КК мозга, сердца и сыворотки крови крыс // Вестник ЛГУ. 1991. Сер.З, вып.1. С.64-68.

5. Бурмистров С.О., -Машек О.Н., Котин A.M. Действие острой алкогольной интоксикации на антиоксидантную систему'и активность креатинкиназы в мозге эмбрионов крыс // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1992. Т.55, №5. С.54-56.

6. Бурмистров С.О., Машек О.Н., Степанов И.И. Влияние ингаляции этанола и ацетона на показатели системы антиоксидант-ной защиты и перекисное окисление липидов ткани мозга и сыворотки крови крыс // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1992. Т.55, J®. С.56-58.